CN116829181A - 治疗性病毒疫苗 - Google Patents
治疗性病毒疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116829181A CN116829181A CN202280014965.9A CN202280014965A CN116829181A CN 116829181 A CN116829181 A CN 116829181A CN 202280014965 A CN202280014965 A CN 202280014965A CN 116829181 A CN116829181 A CN 116829181A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hsv
- receptor
- variant
- immunogenic fragment
- hsv2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 11
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 title description 2
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims abstract description 427
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 375
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 317
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims abstract description 310
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 110
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 226
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 226
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 169
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 117
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 92
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 92
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 92
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 87
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 claims description 61
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 claims description 48
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 46
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 40
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims description 40
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 36
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 19
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 17
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 16
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 claims description 15
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 15
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 claims description 13
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 12
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 claims description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 9
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 306
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 255
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 150
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 150
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 137
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 135
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 127
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 124
- 238000011748 CB6F1 mouse Methods 0.000 description 113
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 98
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 95
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 95
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 89
- 102000034354 Gi proteins Human genes 0.000 description 85
- 108091006101 Gi proteins Proteins 0.000 description 85
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 85
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 81
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 79
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 79
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 75
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 71
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 70
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 64
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 57
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 56
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 53
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 53
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 53
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 40
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 230000004044 response Effects 0.000 description 34
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 33
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 30
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 30
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 29
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 29
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 28
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 28
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 28
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 27
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 23
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 22
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 21
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 20
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 20
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 19
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 19
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 17
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 16
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 16
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 16
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 208000001688 Herpes Genitalis Diseases 0.000 description 14
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 14
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 13
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 13
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 11
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 10
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 10
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 10
- -1 QS21 or squalene) Chemical class 0.000 description 10
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 10
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 10
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 10
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 10
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 9
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 208000037952 HSV-1 infection Diseases 0.000 description 8
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 8
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 8
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 8
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 8
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 7
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 7
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 7
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 7
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 7
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 101100066433 Mus musculus Fcgr3 gene Proteins 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 6
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 6
- PYJNAPOPMIJKJZ-UHFFFAOYSA-N phosphorylcholine chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O PYJNAPOPMIJKJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 6
- 101000941029 Homo sapiens Endoplasmic reticulum junction formation protein lunapark Proteins 0.000 description 5
- 101000991410 Homo sapiens Nucleolar and spindle-associated protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 102100030991 Nucleolar and spindle-associated protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 5
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 5
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DFUSDJMZWQVQSF-XLGIIRLISA-N (2r)-2-methyl-2-[(4r,8r)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical class OC1=CC=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1 DFUSDJMZWQVQSF-XLGIIRLISA-N 0.000 description 4
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 208000004898 Herpes Labialis Diseases 0.000 description 4
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 206010067152 Oral herpes Diseases 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 4
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 4
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N (R)-1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N 0.000 description 3
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 241001529459 Enterovirus A71 Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 3
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 3
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 3
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 3
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 2
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 2
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 2
- CXUCKELNYMZTRT-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-2-benzimidazolinone Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)N(CC)C2=C1 CXUCKELNYMZTRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150014742 AGE1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 2
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- IELOKBJPULMYRW-NJQVLOCASA-N D-alpha-Tocopheryl Acid Succinate Chemical compound OC(=O)CCC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C IELOKBJPULMYRW-NJQVLOCASA-N 0.000 description 2
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 2
- 206010048461 Genital infection Diseases 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 101150101366 HSV2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000669402 Homo sapiens Toll-like receptor 7 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 101000807236 Human cytomegalovirus (strain AD169) Membrane glycoprotein US3 Proteins 0.000 description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 101100345675 Mus musculus Mixl1 gene Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100039390 Toll-like receptor 7 Human genes 0.000 description 2
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 2
- YGPZYYDTPXVBRA-RTDBHSBRSA-N [(2r,3s,4r,5r,6s)-2-[[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-[[(3r)-3-dodecanoyloxytetradecanoyl]amino]-6-(hydroxymethyl)-5-phosphonooxy-4-[(3r)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]oxyoxan-2-yl]oxymethyl]-3,6-dihydroxy-5-[[(3r)-3-hydroxytetradecanoyl]amino]oxan-4-yl] (3r)-3-hydr Chemical group O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](O)O1 YGPZYYDTPXVBRA-RTDBHSBRSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000007487 asymptomatic viral shedding Effects 0.000 description 2
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940042880 natural phospholipid Drugs 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 2
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 2
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 2
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NEZDNQCXEZDCBI-WJOKGBTCSA-N (2-aminoethoxy)[(2r)-2,3-bis(tetradecanoyloxy)propoxy]phosphinic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC NEZDNQCXEZDCBI-WJOKGBTCSA-N 0.000 description 1
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QFMZQPDHXULLKC-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(C=1C=CC=CC=1)CCP(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 QFMZQPDHXULLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 description 1
- FVXDQWZBHIXIEJ-LNDKUQBDSA-N 1,2-di-[(9Z,12Z)-octadecadienoyl]-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC FVXDQWZBHIXIEJ-LNDKUQBDSA-N 0.000 description 1
- MLKLDGSYMHFAOC-AREMUKBSSA-N 1,2-dicapryl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCC MLKLDGSYMHFAOC-AREMUKBSSA-N 0.000 description 1
- SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine zwitterion Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 0.000 description 1
- OZSITQMWYBNPMW-GDLZYMKVSA-N 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC OZSITQMWYBNPMW-GDLZYMKVSA-N 0.000 description 1
- PAZGBAOHGQRCBP-DDDNOICHSA-N 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PAZGBAOHGQRCBP-DDDNOICHSA-N 0.000 description 1
- 101800001779 2'-O-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- IJFVSSZAOYLHEE-UHFFFAOYSA-N 2,3-di(dodecanoyloxy)propyl 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCC IJFVSSZAOYLHEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRYZPFWEZHSTHD-HEFFAWAOSA-O 2-[[(e,2s,3r)-2-formamido-3-hydroxyoctadec-4-enoxy]-hydroxyphosphoryl]oxyethyl-trimethylazanium Chemical class CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](NC=O)COP(O)(=O)OCC[N+](C)(C)C LRYZPFWEZHSTHD-HEFFAWAOSA-O 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150116940 AGPS gene Proteins 0.000 description 1
- 241000511582 Actinomyces meyeri Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000222128 Candida maltosa Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241001481710 Cerambycidae Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N Dimethyl dicarbonate Chemical compound COC(=O)OC(=O)OC GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000214054 Equine rhinitis A virus Species 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010073931 Genital herpes simplex Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 241000700589 Herpes simplex virus (type 1 / strain 17) Species 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 101000878602 Homo sapiens Immunoglobulin alpha Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000669460 Homo sapiens Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000800483 Homo sapiens Toll-like receptor 8 Proteins 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 101000771764 Hyoscyamus muticus Vetispiradiene synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100038005 Immunoglobulin alpha Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001092142 Molina Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNACBKDVIYEXSL-LJQANCHMSA-N PE(8:0/8:0) Chemical compound CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC UNACBKDVIYEXSL-LJQANCHMSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001236817 Paecilomyces <Clavicipitaceae> Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101001000212 Rattus norvegicus Decorin Proteins 0.000 description 1
- 101100409194 Rattus norvegicus Ppargc1b gene Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 235000019774 Rice Bran oil Nutrition 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229940124614 TLR 8 agonist Drugs 0.000 description 1
- 241000249107 Teschovirus A Species 0.000 description 1
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000008233 Toll-Like Receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000008235 Toll-Like Receptor 9 Human genes 0.000 description 1
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100039357 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100033110 Toll-like receptor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108030003004 Triphosphatases Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N UNPD88870 Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)=CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- HDOVUKNUBWVHOX-QMMMGPOBSA-N Valacyclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCOC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C=N2 HDOVUKNUBWVHOX-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-UHFFFAOYSA-N Vitamin D2 Natural products C1CCC2(C)C(C(C)C=CC(C)C(C)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBNRGEMZNWHCGA-PDKVEDEMSA-N [(2r)-2-[(2r,3r,4s)-3,4-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]oxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC ZBNRGEMZNWHCGA-PDKVEDEMSA-N 0.000 description 1
- SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N [azido(phenoxy)phosphoryl]oxybenzene Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(=O)(N=[N+]=[N-])OC1=CC=CC=C1 SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000787 affinity precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000008349 antigen-specific humoral response Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008335 axon cargo transport Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940076810 beta sitosterol Drugs 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005312 bioglass Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005887 cellular phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000011266 cytolytic assay Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940099418 d- alpha-tocopherol succinate Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- BPHQZTVXXXJVHI-UHFFFAOYSA-N dimyristoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003724 dimyristoylphosphatidylcholine Drugs 0.000 description 1
- BIABMEZBCHDPBV-UHFFFAOYSA-N dipalmitoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC BIABMEZBCHDPBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- FVJZSBGHRPJMMA-UHFFFAOYSA-N distearoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC FVJZSBGHRPJMMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960002061 ergocalciferol Drugs 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004396 famciclovir Drugs 0.000 description 1
- GGXKWVWZWMLJEH-UHFFFAOYSA-N famcyclovir Chemical compound N1=C(N)N=C2N(CCC(COC(=O)C)COC(C)=O)C=NC2=C1 GGXKWVWZWMLJEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000285 follicular dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000002313 glycerolipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N medroxyprogesterone acetate Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](OC(C)=O)(C(C)=O)CC[C@H]21 PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000001844 prenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000008165 rice bran oil Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 239000010686 shark liver oil Substances 0.000 description 1
- 229940069764 shark liver oil Drugs 0.000 description 1
- 101150091813 shfl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 1
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- ALPWRKFXEOAUDR-GKEJWYBXSA-M sodium;[(2r)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)([O-])=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC ALPWRKFXEOAUDR-GKEJWYBXSA-M 0.000 description 1
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N stigmasterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N 0.000 description 1
- 229940032091 stigmasterol Drugs 0.000 description 1
- 235000016831 stigmasterol Nutrition 0.000 description 1
- BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N stigmasterol Natural products CCC(C=CC(C)C1CCCC2C3CC=C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 229940044616 toll-like receptor 7 agonist Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000005924 vaccine-induced immune response Effects 0.000 description 1
- 108010027510 vaccinia virus capping enzyme Proteins 0.000 description 1
- 229940093257 valacyclovir Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N vitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N 0.000 description 1
- 235000001892 vitamin D2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011653 vitamin D2 Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000010497 wheat germ oil Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及用于在受试者中产生针对HSV1的交叉反应性免疫应答的HSV2Fc受体或其免疫原性片段或变体。还提供了一种用于在向受试者施用时产生针对HSV2的交叉反应性免疫应答的HSV1Fc受体或其免疫原性片段或变体。
Description
技术领域
本发明涉及用于在受试者中治疗单纯疱疹病毒(HSV)感染的单纯疱疹病毒(包括HSV1和HSV2)Fc受体或其免疫原性片段或变体。特别地，本发明提供了能够在受试者中诱导针对HSV-1或HSV-2的交叉反应性免疫应答的HSV2或HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体。
背景技术
单纯疱疹病毒(HSV，包括HSV1和HSV2)是疱疹病毒科中甲型疱疹病毒(α-疱疹病毒)亚科的成员。其是有包膜的双链DNA病毒，含有至少74个编码功能性蛋白的基因。HSV1和HSV2感染粘膜上皮细胞，并且在支配发生原发性感染的粘膜的感觉神经元中建立终生持续感染。HSV1和HSV2都可以从神经元细胞体中建立的潜伏周期性地重新激活，导致唇疱疹(herpes labialis)(口唇疱疹(cold sores))或生殖器疱疹(GH)。
在15至49岁之间的个体中，生殖器疱疹的全球患病者估计为4.17亿，其中在非洲的疾病负担尤为严重。在资源丰富的国家，作为首次生殖器疱疹的病因，HSV1和HSV2大致一样常见。与HSV2生殖器感染相比，HSV1感染后的复发性感染较少见；因此，HSV2仍是生殖器疱疹复发的主要原因。一些感染者有严重且频繁爆发的生殖器溃疡，而另一些则有轻度或亚临床感染，但都有将生殖器疱疹传染给亲密伴侣的风险。
复发性GH是来自骶神经节的HSV2(以及在一定程度上是HSV1)重新激活的结果，随后病毒衣壳沿神经元轴突顺行迁移，导致病毒颗粒组装、细胞与细胞融合、病毒从生殖器粘膜传播和感染周围的上皮细胞。
抗病毒药，如阿昔洛韦；伐昔洛韦和泛昔洛韦用于治疗GH，无论是原发性感染还是复发性感染，且无论是HSV1还是HSV2来源。这些药物不会从宿主体内根除病毒，其生物学作用机制会阻断或干扰病毒复制机器。随机对照试验表明，在症状或临床复发迹象出现后早期开始使用这三种药物中的任何一种进行短期治疗时，症状复发的严重程度会降低以及持续时间会减少一到两天。然而，这种间歇性方案并没有减少每年的复发次数。
目前针对HSV复发的治疗选项存在局限性，包括抗病毒有效性不完全、短期有效性、对治疗方案的依从性、抗病毒耐药性的出现、治疗费用和副作用。目前，尚无已知的长期预防症状性复发的策略。
因此，本领域需要针对复发性疱疹病毒感染(特别是HSV2和HSV1)的改进治疗。
发明内容
本文提供了本发明的下述方面：
-一种HSV-2Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV-1的交叉反应性免疫应答。
-一种HSV-1Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV-2的交叉反应性免疫应答。
-一种药物组合物，其包含HSV-2Fc受体或其免疫原性片段或变体，来自HSV-2的结合伴侣或其片段，以及药学上可接受的载体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV-1的交叉反应性免疫应答。
-一种药物组合物，其包含HSV-1Fc受体或其免疫原性片段或变体，来自HSV-1的结合伴侣或其片段，以及药学上可接受的载体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV-2的交叉反应性免疫应答。
-一种在有需要的受试者中治疗疱疹病毒感染或疱疹病毒相关疾病的方法，其包括向所述受试者施用免疫有效量的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中在向受试者施用时所述HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体能够诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。
-一种在有需要的受试者中治疗疱疹病毒感染或疱疹病毒相关疾病的方法，其包括向所述受试者施用免疫有效量的HSV1Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中在向受试者施用时所述HSV1Fc受体或其免疫原性片段或变体能够诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。
附图说明
图1-在使用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式免疫后收集的血清样品中测量的总HSV-2 gE-或gI-特异性IgG抗体效价。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第14天(14PI)、第28天(14PII)和第42天(14PIII)，收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-2 gE-(图1A)或gI-(图1B)特异性IgG抗体效价。每个符号代表14PI(点)、14PII(菱形)或14PIII(三角形)的单个动物，而黑色条线代表每组的几何平均值(GM)。每组的GM和动物数(N)显示在x轴上。
图2-在CB6F1小鼠中第三次免疫后14天接种组和未接种组之间HSV-2 gE-或gI-特异性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-2 gE-(图2A)或gI-(图2B)特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图3-在CB6F1小鼠每个接种组中HSV-2 gE-或gI-特异性IgG抗体应答的时间点比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第14天(14PI)、第28天(14PII)和第42天(14PIII)，收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-2 gE-特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。两个时间点的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。图3A显示了PII相对于PI和图3B显示了PIII相对于PII的HSV2 gE-特异性应答，而图3C显示了PII相对于PI和图3D显示了PIII相对于PII的HSV2 gI-特异性应答。
图4-CB6F1小鼠第三次免疫后14天接种组之间HSV-2 gE-或gI-IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-2 gE-(图4A)或gI-(图4B)特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图5-在使用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式第三次免疫后14天收集的血清样品中测量的总HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体效价。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体效价。每个符号代表14PIII时的单个动物，而黑色条线代表每组的几何平均值(GM)。每组的GM和动物数(N)显示在x轴上。
图6-CB6F1小鼠第三次免疫后14天接种组和未接种组之间HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图7-CB6F1小鼠第三次免疫后14天接种组之间HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图8-在使用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式第三次免疫后14天收集的血清样品中测量的HSV-2MS-特异性中和抗体效价。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价针对HSV-2MS毒株的中和抗体效价(400TCID50)。图8A：每个点代表单个动物的效价。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(中和效价＝5)。各组小鼠的数量(N)和每组的几何平均值(GM)显示在图中x轴的下方。图8B：HSV-2-特异性中和抗体效价的具有95％置信区间(CI)的GMR。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图9-在使用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI异二聚体蛋白的不同突变形式第三次免疫后14天收集的血清样品中测量的HSV-1交叉反应性中和抗体效价。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价针对HSV-1VR1 789毒株的交叉中和抗体效价(400TCID50)。图9A：每个点代表单个动物的效价。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(中和效价＝5)。各组小鼠的数量(N)和每组的几何平均值(GM)显示在图中x轴的下方。图9B：HSV-1交叉反应性中和抗体效价的具有95％置信区间(CI)的GMR。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图10-在使用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式第三次免疫后14天评价疫苗特异性抗体在体外降低HSV-2 gE/gI抗原与人IgG Fc结合的能力。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体竞争和降低hIgG Fc与HSV-2 gE/gI蛋白结合的能力。每条曲线代表单只小鼠的数据。图10A：AS01/HSV-2 gE/gI V340W相对于NaCl；图10B：AS01/HSV-2 gE/gI A248T相对于NaCl；图10C：AS01/HSV-2 gE/gI A246W相对于NaCl；图10D：AS01/HSV-2 gE/gIP318I相对于NaCl；图10E：AS01/HSV-2 gE/gI A248T_V340W相对于NaCl。
图11-在使用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式第三次免疫后14天比较疫苗特异性抗体在体外降低HSV-2 gE/gI抗原与人IgG Fc结合的能力。在第0天、第14天和第28天时，使用在AS01中佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体蛋白肌内(i.m)免疫CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)(5μg/只)。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体竞争和降低hIgG Fc与HSV-2 gE/gI蛋白结合的能力。图11A：每个点代表来自单只小鼠的具有95％CI的ED50效价。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示。各组小鼠的数量(N)和每组的几何平均值(GM)显示在图中x轴的下方。图11B：具有95％置信区间(CI)的GMR。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图12-在与使用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式第三次免疫后14天的HSV-2 gE/gI阳性细胞孵育后评价HSV-2 gE/gI抗体结合和激活mFcγRIII的能力。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体结合HSV-2 gE/gI阳性3T3细胞和激活由修饰的Jurkat报告细胞表达的小鼠FcγRIII的能力。图12A-E的每条曲线显示了用不同AS01-HSV-2 gE/gI突变体免疫的2份小鼠血清混合物相对于NaCl的数据，而图12F显示了每个AS01-HSV-2 gE/gI接种组相对于NaCl的几何平均值。
图13-在用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式第三次免疫后14天在CB6F1小鼠中诱导的疫苗特异性CD4+/CD8+T细胞应答的百分比。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价脾脏中的疫苗特异性CD4+/CD8+T细胞应答。用涵盖HSV-2的gE或gI蛋白的总氨基酸序列的15mer肽混合物在6小时内离体刺激脾细胞。将β-肌动蛋白肽混合物刺激用于评价非特异性应答。通过胞内细胞因子染色测量分泌IL-2、IFN-γ和/或TNF-α的CD4+/CD8+T细胞频率。圆圈、三角和菱形代表针对每种抗原(HSV-2 gE或HSV-2 gI抗原，或人β-肌动蛋白)检测的单独的CD4+(图13A)/CD8+(图13B)T细胞应答％。黑线表示应答的几何平均值(GM)，黑色虚线表示盐水组中使用所有刺激获得的第95个百分位数(P95)。具有有效结果的动物的数量(N)/组和每组的GM显示在图下方。
图14-在CB6F1小鼠中第三次免疫后14天接种组和未接种组之间疫苗特异性CD4+/CD8+T细胞应答％的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，挑选小鼠以评价脾脏中的疫苗特异性CD4+/CD8+T细胞应答。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。图14A：HSV-2 gE CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图14B：HSV-2 gI特异性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图14C：HSV-2 gE特异性CD8+T细胞的具有95％CI的GMR。
图15-CB6F1小鼠第三次免疫后14天接种组之间疫苗特异性CD4+/CD8+T细胞应答％的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，挑选小鼠以评价脾脏中的疫苗特异性CD4/CD8+T细胞应答。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。图15A：HSV-2 gE-特异性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图15B：HSV-2 gI-特异性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图15C：HSV-2 gE-特异性CD8+T细胞的具有95％CI的GMR。
图16-在用脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM HSV-2 gE/gI载体免疫一次、两次或三次后收集的血清样品中测量的总HSV-2 gE-或gI特异性IgG抗体效价。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第21天(21PI)、第42天(21PII)和第63天(21PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-2gE-(图16A)或gI-(图16B)特异性IgG抗体效价。每个符号代表在21PI(点)、21PII(三角)或21PIII(菱形)时的各只动物，而黑色条线代表每组的几何平均值(GM)。每组的GM和动物数(N)显示在x轴上。
图17-在CB6F1小鼠中第三次免疫后21天接种组和未接种组之间的HSV-2 gE-或gI-特异性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-2gE-(图2A)或gI-(图2B)特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。图17A：HSV-2 gE-特异性抗体效价的具有95％CI的GMR(EU/mL)；图17B：HSV-2 gI-特异性抗体效价的具有95％CI的GMR(EU/mL)。
图18-CB6F1小鼠的每个LNP-SAM HSV-2 gE/gI接种组之间的HSV-2 gE-或gI-特异性IgG抗体应答的时间点比较。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第21天(21PI)、第42天(21PII)和第63天(21PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-2 gE-或gI-特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。两个时间点的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。图18A显示了PII相比于PI和图18B显示了PIII相比于PII的HSV-2 gE-特异性应答，而图18C显示了PII相比于PI和图18D显示了PIII相比于PII的HSV-2 gI-特异性应答。
图19-CB6F1小鼠第三次免疫后21天接种组之间HSV-2 gE-或gI-IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-2 gE-(图19A)或gI-(图19B)特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图20-在用脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同SAM HSV-2gE/gI突变体第三次免疫后21天收集的血清样品中测量的总HSV-1gE/gI交叉反应性IgG抗体效价。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体效价。每个符号代表21PIII时的各只动物，而黑色条线代表每组的几何平均值(GM)。每组的GM和动物数(N)显示在x轴上。
图21-在CB6F1小鼠中第三次免疫后21天接种组和未接种组之间的HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图22-CB6F1小鼠第三次免疫后21天接种组之间的HSV-1gE/gI交叉反应性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/grl-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图23-在用不同LNP配制的SAM-HSV-2 gE/gI突变体第三次免疫后21天收集的血清样品中测量的HSV-2MS-特异性中和抗体效价。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，从每只动物收集血清样品以评价中和抗体针对HSV-2MS毒株的效价(400TCID50)。图23A：每个符号代表每只动物的效价而每条误差线代表几何平均值(GM)+95％置信区间(CI)。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(中和效价＝5)。每组的小鼠数(N)和每组的GM显示在图中x轴的下方。图23B：黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图24-在用不同LNP配制的SAM-HSV-2 gE/gI突变体第三次免疫后21天收集的血清样品中测量的HSV-1交叉反应性中和抗体效价。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，从每只动物收集血清样品以评价中和抗体针对HSV-1VR1789毒株的效价(400TCID50)。图24A：每个符号代表每只动物的效价而每条误差线代表几何平均值(GM)+95％置信区间(CI)。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(中和效价＝5)。每组的小鼠数(N)和每组的GM显示在图中x轴的下方。图24B：黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图25-用不同LNP配制的SAM-HSV-2 gE/gI突变体第三次免疫后21天评价疫苗特异性抗体在体外减少HSV-2 gE/g I抗原与hIgG Fc结合的能力。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，收集每只动物的血清样品，以评价疫苗特异性抗体竞争和降低HSV-2 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。每条曲线代表单个小鼠。LNP/SAM-HSV-2 gE/gI V340W相比于NaCl组(图25A)；LNP/SAM-HSV-2 gE/gIA248T相比于NaCl组(图25B)；LNP/SAM-HSV-2 gE/gI A246W相比于NaCl组(图25C)；LNP/SAM-HSV-2 gE/gIP318I相比于NaCl组(图25D)；LNP/SAM-HSV-2 gE/gI A248T_V340W相比于NaCl组(图25E)；LNP/SAM-HSV-2 gE/gI插入ARAA相比于NaCl组(图25F)。
图26-在CB6F1小鼠中用不同LNP配制的SAM-HSV-2 gE/gI突变体第三次免疫后21天疫苗特异性抗体在体外减少HSV-2 gE/gI抗原与人IgG Fc结合的能力的比较。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，收集每只动物的血清样品，以评价疫苗特异性抗体竞争和降低HSV-2 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。每个点代表各只小鼠的具有95％CI的ED50效价。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(效价＝5)。每组的小鼠数(N)和每组的GM显示在图中x轴的下方。
图27-在用LNP配制的SAM-HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式三次免疫后21天在与HSV-2 gE/gI阳性细胞孵育后评价HSV-2 gE/gI抗体结合和激活mFcγRIII的能力。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体结合至HSV-2 gE/gI阳性3T3细胞和激活由修饰的Jurkat报告细胞表达的小鼠FcγRIII的能力。图27A-F：每条曲线显示了用不同LNP-SAMHSV-2 gE/gI突变体免疫的2份小鼠血清混合物相对于NaCl的数据，而图27G：显示了每个LNP-SAM HSV-2 gE/gI接种组相对于NaCl的几何平均值。
图28-用脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同SAM HSV-2 gE/gI突变体第三次免疫后21天在CB6F1小鼠中诱导的疫苗特异性或HSV-1 gE交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答的百分比。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，挑选小鼠以评价脾脏中HSV-2 gE和HSV-2 gI特异性或HSV-1 gE交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答。用涵盖HSV-2的gE或gI蛋白以及HSV-1的gE蛋白的总氨基酸序列的15mer肽混合物在6小时内离体刺激脾细胞。将人β-肌动蛋白肽混合物刺激用于评价非特异性应答。通过胞内细胞因子染色测量分泌IL-2、IFN-γ和/或TNF-α的CD4+(图28A)/CD8+(图28B)T细胞的频率。圆圈、三角、方块和菱形代表针对每种抗原(HSV-1或2 gE或HSV-2 gI抗原，或人β-肌动蛋白)检测到的CD4+/CD8+T细胞应答的个体％。黑线表示应答的几何平均值(GM)，黑色虚线表示当组合四种抗原(HSV-1或2 gE或HSV-2 gI抗原或人β-肌动蛋白)时在盐水组中获得的第95百分位数(P95)。具有有效结果的动物的数量(N)/组和每组的GM显示在图下方。
图29-在CB6F1小鼠中第三次免疫后21天接种组和未接种组之间的疫苗特异性CD4+T细胞应答的头对头比较。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，挑选小鼠以评价在脾脏中的HSV-2 gE(图29A)&HSV-2 gI(图29B)-特异性CD4+T细胞应答。黑色误差条表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图30-在CB6F1小鼠中第三次免疫后21天接种组和未接种组之间的HSV-2 gE-特异性或HSV-1 gE交叉反应性CD8+T细胞应答的头对头比较。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，挑选小鼠以评价在脾脏中的HSV-2gE-特异性(图30A)或HSV-1 gE交叉反应性(图30B)CD8+T细胞应答。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图31-在CB6F1小鼠中第三次免疫后21天接种组之间的疫苗特异性CD4+T细胞应答的头对头比较。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，挑选小鼠以评价在脾脏中的HSV-2 gE-(图31A)&HSV-2 gI-(图31B)特异性CD4+T细胞应答。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图32-在CB6F1小鼠中第三次免疫后21天接种组之间HSV-2gE-特异性或HSV-1 gE交叉反应性CD8+T细胞应答的头对头比较。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，挑选小鼠以评价在脾脏中的HSV-2 gE-特异性(图32A)或HSV-1gE交叉反应性(图32B)CD8+T细胞应答。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图33-在使用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式免疫后的血清样品中测量的抗HSV-1-特异性gE/gI IgG抗体应答。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第13天(13PI)、第27天(13PIII)和第42天(14PIII)时，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-1 gE/gI-特异性IgG抗体效价。每个形状代表不同时间点的单个动物(点＝13PI；三角13PII；菱形＝14PIII)，而黑色条线代表每组的几何平均值。每组的几何平均值(GM)和动物数(N)显示在x轴上。
图34-在CB6F1小鼠中第三次免疫后14天接种组和未接种组之间抗HSV-1-特异性gE/gI-特异性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-1 gE/gI-特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图35-在CB6F1小鼠的每个接种组中抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体应答的时间点比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第13天(13PI)、第27天(13PII)和第42天(14PIII)时，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-1 gE/gI-特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。两个时间点的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。图35A＝PII相比于PI和图35B＝PIII相比于PII。
图36-在CB6F1小鼠中第三次免疫后14天接种组之间的抗HSV-1 gE/gI-特异性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-1 gE/gI-特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图37-在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式免疫后的血清样品中测量的抗HSV-2 gE或HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-2 gE(图37A)或HSV-2 gI(图37B)交叉反应性IgG抗体效价。每个形状代表在时间点14PIII时的单个动物，而黑色条线代表每组的几何平均值。每组的几何平均值(GM)和动物数(N)显示在x轴上。
图38-在CB6F1小鼠中第三次免疫后14天接种组与未接种组之间的抗HSV-2 gE或HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-2 gE(图38A)或HSV-2 gI(图38B)交叉反应性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图39-在CB6F1小鼠中第三次免疫后14天接种组之间的抗HSV-2 gE或HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-2 gE(图39A)或HSV-2gI(图39B)交叉反应性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图40-在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式第三次免疫后14天收集的血清样品中测量的HSV-1-特异性中和抗体效价。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价针对HSV-1VR-1789毒株的中和抗体的效价(400TCID50)。图40A：每个点代表单个动物的效价。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(中和效价＝5)。各组小鼠的数量(N)和每组的几何平均值(GM)显示在图中x轴的下方。图40B：具有95％置信区间(CI)的GMR。黑色误差线代表每个GMR的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图41-在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式第三次免疫后14天收集的血清样品中测量的HSV-2交叉反应性中和抗体效价。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价针对HSV-2MS毒株的交叉反应性中和抗体效价(400TCID50)。每个点代表单个动物的效价。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(中和效价＝5)。各组小鼠的数量(N)和各组的几何平均值(GM)显示在图中x轴的下方。
图42-在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式第三次免疫后14天评价疫苗特异性抗体体外减少HSV-1 gE/gI抗原与hIgG Fc结合的能力。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体竞争和降低HSV-1 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。图42A＝AS01-HSV-1gE/gI未突变相比于NaCl；图42B＝AS01-HSV-1 gE_P319R/gI相比于NaCl；图42C＝AS01-HSV-1 gE_P321D/gI相比于NaCl；图42D＝AS01-HSV-1 gE_R322D/gI相比于NaCl；图42E＝AS01-HSV-1gE N243A_R322D/gI相比于NaCl；图42F＝AS01-HSV-1gE_A340G_S341G_V342G/gI相比于NaCl。
图43-在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式第三次免疫后14天比较疫苗特异性抗体体外减少HSV-1 gE/gI抗原与hIgG Fc结合的能力。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体竞争和降低HSV-1 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。图43A：每个点代表来自单个小鼠的ED50值，而每条误差线代表GMT+95％CI。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(ED50值＝5)。各组小鼠的数量(N)和每组的几何平均值(GM)显示在图中x轴的下方。图43B：hIgG Fc与HSV-1 gE/gI蛋白结合抑制的具有95％CI的GMR(ED50)。黑色误差线代表每个GMR的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图44-在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式第三次免疫后14天评价疫苗特异性抗体体外减少HSV-2 gE/gI抗原与hIgG Fc结合的能力。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体竞争和降低HSV-2 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。图44A＝AS01-HSV-1gE/gI未突变相比于NaCl；图44B＝AS01-HSV-1 gE_P319R/gI相比于NaCl；图44C＝AS01-HSV-1 gE_P321D/gI相比于NaCl；图44D＝AS01-HSV-1 gE_R322D/gI相比于NaCl；图44E＝AS01-HSV-1gE_N243A_R322D/gI相比于NaCl；图44F＝AS01-HSV-1gE_A340G_S341G_V342G/gI相比于NaCl。
图45-在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式第三次免疫后14天比较疫苗特异性抗体体外减少HSV-2 gE/gI抗原与hIgG Fc结合的能力。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体竞争和降低HSV-2 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。图45A：每个点代表来自单个小鼠的ED50值而每条误差线代表GMT+95％CI。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(ED50值＝5)。各组小鼠的数量(N)和每组的几何平均值(GM)显示在图中x轴的下方。图45B：hIgG Fc与HSV-2 gE/gI蛋白结合抑制的具有95％CI的GMR(ED50)。黑色误差线代表每个GMR的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图46-在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式第三次免疫后14天收集的HSV-2 gE/gI交叉反应性抗体在与HSV-2 gE/gI转染的细胞孵育后评价结合和激活小鼠FcγRIII的能力。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体在与HSV-2 gE/gI转染的3T3细胞孵育后交叉结合和激活修饰的Jurkat报告细胞表达的小鼠FcγRIII的能力。图46A-F：每条曲线显示了来自用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式免疫或用150mM NaCl溶液处理的2份小鼠血清混合物的数据。
图47-用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式第三次免疫后14天收集的HSV-2gE/gI交叉反应性抗体与HSV-2 gE/gI转染细胞孵育后结合至并激活小鼠FcγRIII的能力比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体在与HSV-2 gE/gI转染的3T3细胞孵育后交叉反应和激活修饰的Jurkat报告细胞表达的小鼠FcγRIII的能力。每个点代表2只单个小鼠的混合物并且以相对于对照阳性样品归一化的曲线下面积(AUC)的比率表示。
图48-在用AS01中佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白第三次免疫后14天在CB6F1小鼠中诱导的疫苗特异性或HSV-2 gE交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答的百分比。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，挑选小鼠以评价在脾脏中的HSV-1 gE和HSV-1 gI-特异性和HSV-2 gE交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答。用涵盖HSV-1的gE或gI蛋白以及HSV-2的gE蛋白的总氨基酸序列的15mer肽混合物在6小时内离体刺激脾细胞。将人β-肌动蛋白肽混合物刺激用于评价非特异性应答。通过胞内细胞因子染色测量分泌IL-2、IFN-γ和/或TNF-α的CD4+/CD8+T细胞的频率，结果如图48A和图48B所示。圆圈、三角、方块和菱形代表针对每种抗原(HSV-1或HSV-2 gE或gI抗原，或人β-肌动蛋白)检测到的CD4+/CD8+T细胞应答的个体％。黑线表示应答的几何平均值(GM)，黑色虚线表示盐水组中所有刺激获得的第95百分位数(P95)。具有有效结果的动物的数量(N)/组和每组的几何平均值(GM)显示在图下方。
图49-在CB6F1小鼠中第三次免疫后14天接种组和未接种组之间的疫苗特异性或HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，挑选小鼠以评价在脾脏中HSV-1 gE和HSV-1 gI-特异性和HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞应答。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。图49A：HSV-1 gE-特异性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图49B：HSV-2 gE-特异性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图49C：HSV-1 gI-特异性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR。黑色误差线代表每个GMR的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图50-在CB6F1小鼠中第三次免疫后14天接种组和未接种组之间的HSV-1 gI-特异性CD8+T细胞应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，挑选小鼠以评价在脾脏中HSV-1 gI-特异性CD8+T细胞应答。黑色误差线代表每个GMR的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图51-在CB6F1小鼠中第三次免疫后14天接种组之间的HSV-1gE-特异性或HSV-2gE交叉反应性CD4+T细胞应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，挑选小鼠以评价在脾脏中HSV-1 gE(图51A)-特异性和HSV-2 gE(图51B)交叉反应性CD4+T细胞应答。黑色误差线代表每个GMR的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图52-在CB6F1小鼠中第三次免疫后14天接种组之间的HSV-1gI-特异性CD4+T细胞应答的头对头比较。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，挑选小鼠以评价在脾脏中HSV-1gI-特异性CD4+T细胞应答。黑色误差线代表每个GMR的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图53-在用脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM HSV-1 gE/gI载体在第一次免疫后28天或第二次免疫后21天测量的抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体应答。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1 gE/gI载体肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第28天和第49天时(28PI和21PII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-1 gE/gI-特异性IgG抗体效价。每个形状代表不同时间点的单个动物(点＝28PI；三角＝21PII)，而黑色条线代表每组的几何平均值。每组的几何平均值(GM)和动物数(N)显示在x轴上。
图54-在CB6F1小鼠中第二次免疫后21天LNP/SAM HSV-1接种组和未接种组之间的抗HSV-1 gE/gI-特异性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1 gE/gI载体肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第28天和第49天时(28PI和21PII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-1gE/gI-特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图55-在用脂质纳米颗粒(LNP)中配制的SAM HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式在第一次免疫后28天和第二次免疫后21天测量的抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体应答的时间点比较。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1 gE/gI载体肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第28天和第49天时(28PI和21PII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-1 gE/gI-特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。两个时间点的几何平均值(GM)和GMR显示在图的右侧。
图56-在用脂质纳米颗粒(LNP)中配制的SAM HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式在第二次免疫后21天收集的血清中测量的抗HSV-1 gE/gI-特异性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAMHSV-1 gE/gI载体肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第28天和第49天时(28PI和21PII)，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-1 gE/gI-特异性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。两组的几何平均值(GM)和GMR显示在图的右侧。
图57-在用脂质纳米颗粒(LNP)中配制的SAM HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式第二次免疫后21天测量的抗HSV-2 gE或gI交叉反应性IgG抗体应答。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1gE/gI载体肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第49天(21PII)时，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-2 gE(图57A)或gI(图57B)交叉反应性IgG抗体效价。每个形状代表在时间点21PII时的单个动物，而黑色条线代表每组的几何平均值。每组的几何平均值(GM)和动物数(N)显示在x轴上。
图58-在CB6F1小鼠中第二次免疫后21天LNP/SAM HSV-1接种组和未接种组之间的抗HSV-2 gE或HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1 gE/gI载体肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第49天(21PII)时，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-2gE(图58A)或HSV-2 gI(图58B)交叉反应性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。
图59-在用脂质纳米颗粒(LNP)中配制的SAM HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式在第二次免疫后21天收集的血清样品中测量的抗HSV-2 gE或HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答的头对头比较。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1 gE/gI载体肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第49天(21PII)时，从每只动物收集血清样品以通过ELISA评价总抗HSV-2 gE(图59A)或HSV-2 gI(图59B)交叉反应性IgG抗体效价。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。两组的几何平均值(GM)和GMR显示在图的右侧。
图60-在用LNP配制的HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式第二次免疫后21天收集的血清样品中测量的HSV-1特异性中和抗体效价。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1 gE/gI载体肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝5/gr6)。在第49天(21PII)时，收集血清样品以评价针对HSV-1VR1 789毒株的中和抗体效价(病毒载量400TCID50)。图60A：每个点代表单个动物的效价，而白色误差线代表几何平均值(GM)+95％置信区间(CI)。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(中和效价＝5)。每组的小鼠数(N)和每组的GM显示在图中x轴的下方。图60B：具有95％置信区间(CI)的GMR。黑色误差线代表每个GMR的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图61-在用LNP配制的HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式第二次免疫后21天收集的血清样品中测量的HSV-2交叉反应性中和抗体效价。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1 gE/gI载体肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝5/gr6)。在第49天(21PII)时，收集血清样品以评价针对HSV-2MS毒株的交叉反应性中和抗体效价(病毒载量400TCID50)。每个点代表单个动物的效价，而白色误差线代表几何平均值(GM)+95％置信区间(CI)。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(中和效价＝5)。每组的小鼠数(N)和每组的GM显示在图中x轴的下方。
图62-在用LNP配制的SAM-HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式第二次免疫后21天评价疫苗特异性抗体在体外减少HSV-1 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1gE/gI载体肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝5/gr6)。在第49天(21PII)时，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体竞争和降低HSV-1 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。每条曲线代表单个小鼠。LNP/SAM-HSV-1gE_P319R/gI相比于NaCl(图62A)；LNP/SAM-HSV-1 gE_P321D/gI相比于NaCl(图62B)；LNP/SAM-HSV-1 gE_R322D/gI相比于NaCl(图62C)；LNP/SAM-HSV-1 gE_N243A_R322D/gI相比于NaCl(图62D)；LNP/SAM-HSV-1gE_A340G_S341G_V342G/gI相比于NaCl(图62E)。
图63-在用LNP配制的SAM HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式第二次免疫后21天疫苗特异性抗体在体外减少HSV-1 gE/gI抗原与人IgG Fc结合的能力的比较。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1gE/gI载体肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝5/gr6)。在第49天(21PII)时，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体竞争和降低HSV-1 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。图63A：每个点代表各只小鼠的具有95％CI的ED50效价。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(ED50效价＝5)。各组小鼠的数量(N)和每组的几何平均值(GM)显示在图中x轴的下方。图63B：具有95％置信区间(CI)的GMR。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图64-在用LNP配制的SAM-HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式第二次免疫后21天评价疫苗特异性抗体在体外减少HSV-2 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1gE/gI载体肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaC1150mM)，并用作阴性对照组(n＝5/gr6)。在第49天(21PII)时，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体竞争和降低HSV-2 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。每条曲线代表单个小鼠。LNP/SAM-HSV-1gE_P319R/gI相比于NaCl(图64A)；LNP/SAM-HSV-1 gE_P321D/gI相比于NaCl(图64B)；LNP/SAM-HSV-1 gE_R322D/gI相比于NaCl(图64C)；LNP/SAM-HSV-1 gE_N243A_R322D/gI相比于NaCl(图64D)；LNP/SAM-HSV-1gE_A340G_S341G_V342G/gI相比于NaCl(图64E)。
图65-在用LNP配制的SAM HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式第二次免疫后21天疫苗特异性抗体在体外减少HSV-2 gE/gI蛋白与人IgG Fc结合的能力的比较。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM HSV-1gE/gI载体肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝5/gr6)。在第49天(21PII)时，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体竞争和降低HSV-2 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。图65A：每个点代表各只小鼠的具有95％CI的ED50效价。阳性阈值对应于第一次样品稀释。阴性样品由第一次样品稀释度/2表示(ED50效价＝5)。各组小鼠的数量(N)和每组的几何平均值(GM)显示在图中x轴的下方。图65B：具有95％置信区间(CI)的GMR。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的GM和GMR如图右侧所示。
图66-在用LNP配制的SAM HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式第二次免疫后21天收集的HSV-2 gE/gI交叉反应性抗体在与HSV-2gE/gI转染的细胞孵育后结合和激活小鼠FcγRIII的能力评价。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同突变形式的SAM-HSV-1 gE/gI载体肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝5/gr6)。在第49天(21PII)时，收集血清样品以评价HSV-2gE/gI交叉反应性抗体在与HSV-2 gE/gI转染的3T3细胞孵育后结合和激活由修饰的Jurkat报告细胞表达的小鼠FcγRIII的能力。图66A-E：每条曲线显示了来自用不同突变形式的LNP/SAM-HSV-1gE/gI或用150mM NaCl溶液免疫的小鼠的2份血清混合物的数据。
图67-在用LNP中配制的不同突变形式的SAM HSV-1 gE/gI载体在CB6F1小鼠中第二次免疫后21天诱导的疫苗特异性和HSV-2gE交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答的百分比。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的1μg不同SAM-HSV-1 gE/gI突变体候选物进行肌内(i.m)免疫。将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第49天(21PII)时，挑选小鼠以评价在脾脏中的疫苗特异性和HSV_2 gE交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答。用涵盖HSV-1的gE或gI蛋白以及HSV-2的gE蛋白的总氨基酸序列的15mer肽混合物在6小时内离体刺激脾细胞。将人β-肌动蛋白肽混合物刺激用于评价非特异性应答。通过胞内细胞因子染色测定CD4+/CD8+T细胞分泌IL-2、IFN-γ和/或TNF-α的频率。圆圈、三角、方块和菱形代表针对每种抗原(HSV-1或HSV-2 gE或HSV-2 gI抗原或人β-肌动蛋白)检测到的CD4+(图67A)和CD8+(图67B)T细胞应答的个体％。黑线表示应答的几何平均值(GM)，黑色虚线表示盐水组中所有刺激获得的第95百分位数(P95)。具有有效结果的动物的数量(N)/组和每组的GM显示在图下方。
图68-在CB6F1小鼠中第二次免疫后21天在CB6F1小鼠中接种组和未接种组之间的疫苗特异性和HSV-2 gE交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答的头对头比较。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同SAM-HSV-1 gE/gI突变体候选物进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第49天(21PII)时，挑选小鼠以评价在脾脏中的疫苗特异性和HSV-2 gE交叉反应性CD4+和CD8+T细胞应答。黑色误差条表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。图68A：HSV-1gE特异性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图68B：HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图68C：HSV-1 gI特异性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图68D：HSV-1 gI特异性CD8+T细胞的具有95％CI的GMR。
图69-在CB6F1小鼠中第二次免疫后21天接种组之间的疫苗特异性和HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞应答的头对头比较。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同SAM-HSV-1 gE/gI突变体候选物进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第49天(21PII)时，挑选小鼠以评价在脾脏中的疫苗特异性和HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞应答。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。图69A：HSV-1 gE特异性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图69B：HSV-2 gE交叉反应性CD8+T细胞的具有95％CI的GMR。
图70-在CB6F1小鼠中第二次免疫后21天接种组之间的HSV-1gI特异性CD4+/CD8+T细胞应答的头对头比较。在第0天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用LNP中配制的1μg不同SAM HSV-1gE/gI突变体候选物肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝6/gr6)。在第49天(21PII)时，挑选小鼠以评价在脾脏中的抗HSV-1 gI特异性CD4+/CD8+T细胞应答。黑色误差线表示每个几何平均值比(GMR)的95％置信区间(CI)。比较的两组的几何平均值(GM)和GMR如图右侧所示。图70A：HSV-1 gI特异性CD4+T细胞的具有95％CI的GMR；图70B：HSV-1 gI特异性CD8+T细胞的具有95％CI的GMR。
图71-在用AS01佐剂化的HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式第三次免疫后14天评价HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体在体外减少HSV-1 gE/gI抗原与人IgG Fc结合的能力。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01中佐剂化的不同HSV-2gE/gI突变蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价HSV-1交叉反应性抗体竞争和降低HSV-1 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。每条曲线代表单个小鼠的数据。图71A：AS01/HSV-2 gE/gI V340W相比于NaCl；图71B：AS01/HSV-2 gE/gI A248T相比于NaCl；图71C：AS01/HSV-2 gE/gI A246W相比于NaCl；图71D：AS01/HSV-2gE/gIP3 18I相比于NaCl；图71E：AS01/HSV-2 gE/gI A248T_V340W相比于NaCl。
图72-在用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式第三次免疫后14天在与HSV-1 gE/gI阳性细胞孵育后评价HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体结合和激活mFcγRIII的能力。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-5)用AS01佐剂化的不同HSV-2 gE/gI突变体候选物(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr6)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体结合HSV-1 gE/gI阳性3T3细胞和激活由修饰的Jurkat报告细胞表达的小鼠FcγRIII的能力。图72A-E每条曲线显示了用不同的AS01-HSV-2 gE/gI突变体免疫的2份小鼠血清混合物相比于NaCl的数据，而图12F显示了每个AS01-HSV-2 gE/gI接种组相比于NaCl的几何平均值。
图73-在用不同LNP配制的SAM-HSV-2 gE/gI突变体第三次免疫后21天评价HSV-1gE/g I交叉反应性抗体在体外减少HSV-1gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用0.8μg在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的不同突变形式的SAM-HSV-2 gE/gI载体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第63天(21PIII)，收集每只动物的血清样品，以评价HSV-1交叉反应性抗体竞争和降低HSV-1gE/gI蛋白与hIgG-Fc结合的能力。每条曲线代表单个小鼠。LNP/SAM-HSV-2 gE/gI V340W相比于NaCl组(图73A)；LNP/SAM-HSV-2 gE/gI A248T相比于NaCl组(图73B)；LNP/SAM-HSV-2 gE/gI A246W相比于NaCl组(图73C)；LNP/SAM-HSV-2 gE/gIP318I相比于NaCl组(图73D)；LNP/SAM-HSV-2 gE/gIA248T_V340W相比于NaCl组(图73E)；LNP/SAM-HSV-2 gE/gI插入ARAA相比于NaCl组(图73F)。
图74-在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式第三次免疫后14天收集的HSV-1 gE/gI特异性抗体在与HSV-1 gI/gI转染的细胞孵育后结合和激活小鼠FcγRIII的能力的评价。在第0天、第14天和第28天时，CB6F1小鼠(n＝6/gr1-6)用AS01佐剂化的不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白(5μg/只)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，将另一组小鼠i.m注射生理盐水(NaCl 150mM)，并用作阴性对照组(n＝4/gr7)。在第42天(14PIII)，收集血清样品以评价疫苗特异性抗体在与HSV-1 gE/gI转染的3T3细胞孵育后结合和激活由修饰的Jurkat报告细胞表达的小鼠FcγRIII的能力。图74A-F：每条曲线显示了用不同形式的AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白免疫或用150mM NaCl溶液处理的2份小鼠血清混合物的数据。图74G：显示了每个AS01-HSV-1 gE/gI接种组相比于NaCl的几何平均值。
图75-HSV2 gE(UniprotKB：A7U881)和HSV1 gE(UniprotKB：Q703E9)的注释氨基酸序列。在使用GAP的EBIO上进行序列比对，空位权重：8；长度权重：2，相似性：78.68％，同一性：76.10％。下划线：信号肽(SP)；粗体下划线：跨膜结构域；斜体下划线：Fc结合区；粗体斜体；形成异二聚体复合物所需的区域。
图76-HSV2 gI(UniprotKB：A8U5L5)和HSV1 gI(UniprotKB：P06487)的注释氨基酸序列。在使用GAP的EBIO上进行序列比对，空位权重：8；长度权重：2，相似性：73.37％，同一性：70.38％。下划线：信号肽(SP)；粗体下划线：跨膜结构域；粗体斜体；形成异二聚体复合物所需的区域。
图77-HSV2 gE胞外域蛋白序列的比对。黑色/深灰色/浅灰色阴影：所有比对序列的相似性分别为100％/80％/60％。
图78-HSV2 gI胞外域蛋白序列的比对。黑色/深灰色/浅灰色阴影：所有比对序列的相似性分别为100％/80％/60％。
图79-表达SAM-gEgI构建体的RNA序列的质粒的DNA序列。大写字母：SAM骨架；小写字母：非SAM序列；下划线：SAM的5’UTR；粗体下划线：SAM的3’UTR；灰色阴影：编码gEgI异二聚体的插入序列。
图80-编码gEgI异二聚体的的若干ThHSV SAM载体的设计。在VEEV TC-83SAM载体(委内瑞拉马脑炎病毒减毒株)中进行克隆。还产生了HSV2 gE P317R突变体(Fc结合KO)形式。A)筛选驱动gI表达的不同调控元件。选择的调控元件是i)肠病毒71内部核糖体进入位点(EV71 IRES)，ii)两个2A肽序列(GSG-P2A：具有GSG接头的猪捷申病毒-1 2A，F2A：来自口蹄疫病毒的2A肽(F2A))和iii)26S RNA的启动子(26S prom)。显示了每个调控元件的大小(bp)。B)与A)中相同的构建体，在HSV2 gE和gI蛋白的C末端包含HA标签。
具体实施方式
本发明涉及HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体，特别是来自HSV1或HSV2的糖蛋白gE，单独或与其结合伴侣gI一起在针对HSV的治疗性疫苗中的用途，其中在向受试者施用时HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体诱导针对HSV1或HSV2的交叉反应性免疫应答。本发明人已经发现，用HSV2 Fc受体的胞外域(特别是gE/gI)或其具有减少或消除与人抗体的Fc部分结合的gE/gI突变的变体免疫小鼠，导致针对HSV1病毒或HSV1抗原的功能性交叉反应性免疫应答。还证明了用HSV1 Fc受体的胞外域(特别是gE/gI)或其具有减少或消除与人抗体结合的gE/gI突变的变体免疫小鼠，导致针对HSV2病毒或HSV2抗原的功能性交叉反应性免疫应答。HSV1 KOS株和HSV2 SD90e株的氨基酸序列比对显示，gE和gI蛋白的同一性/相似性分别为76.10％/67.4％和78.68％/75.5％。但是HSV-1和HSV-2gE/gI之间的功能性交叉反应性免疫应答是出乎意料的。即使抗原之间的序列相似性水平明显更高，这也不意味着功能性交叉反应性免疫应答。例如，一些流感病毒HA抗原(来自2009年以后的毒株)具有大约90％的氨基酸序列相似性，但没有表现出功能性交叉反应性免疫应答。因此，令人吃惊的是，施用编码第一HSV血清型的核酸将在不同HSV血清型的受试者中显示出交叉反应性并激发免疫应答。
因此，提供了一种HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV-1的交叉反应性免疫应答。还提供了一种HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV-2的交叉反应性免疫应答。HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体可以用于治疗HSV1和/或HSV2感染的受试者，优选地用作泛HSV疫苗。HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体可以用于治疗HSV1和/或HSV2感染的受试者，优选地用作泛HSV疫苗。本发明的HSV1或HSV2 Fc受体或免疫原性片段或变体可特别用于对抗HSV1和/或HSV2的复发性感染以及相关的临床和亚临床表现。
交叉反应性免疫应答
免疫应答是交叉反应性的，即HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体可以诱导针对其来源以外的HSV血清型的抗原的抗原特异性体液和/或细胞免疫应答，即其诱导交叉血清型应答。例如，在HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体的情况下，其能够诱导针对HSV1的体液和/或细胞免疫应答，在HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体的情况下，其能够诱导针对HSV2的体液和/或细胞免疫应答。因此，在一个实施方式中，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体诱导对HSV同源和异源血清型的体液和/或细胞免疫应答。因此，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体可以诱导针对其来源的HSV血清型和针对并非其来源的Fc受体的HSV另一血清型的免疫应答。由于HSV有两种血清型(HSV1和HSV2)，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体可诱导针对HSV1和HSV2的体液和/或细胞免疫应答。体液免疫应答可以包括产生抗体，所述抗体结合来自具有不同于HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体来源的血清型的HSV血清型的抗原。替代地，或除此之外，交叉反应性免疫应答可导致产生特异性T淋巴细胞细胞应答，例如CD4+T细胞应答和/或CD8+T细胞应答。
免疫应答可以是功能性的，例如不仅抗体与Fc受体抗原或抗原相关分子或细胞结合，而且启动有助于有效免疫应答的下游效应功能。在一个实施方式中，诱导功能性抗体应答。例如，功能性抗体应答可以包括补体、粒细胞和/或细胞毒性T细胞的激活、病毒颗粒的中和或抑制或固定HSV的其他手段或抑制HSV的免疫逃逸活性。作为交叉反应性功能性免疫应答，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体可以启动针对并非其来源的HSV血清型的下游效应功能(例如，补体、粒细胞和/或细胞毒性T细胞的激活、中和、或抑制或固定HSV的其他手段或抑制HSV的免疫逃逸活性)，即，产生跨血清型应答。优选地，功能性抗体应答包括抑制HSV的免疫逃逸活性。后者可以通过产生结合HSV Fc受体并抑制HSV Fc受体与人IgG结合的抗体来实现。以这种方式，功能性免疫应答可以包括抑制抗体双极桥接，例如，结合至HSV感染细胞表面的抗体的双极桥接。
产生例如结合HSV Fc受体的交叉反应性抗体可以通过本领域技术人员熟知的技术测量，例如，用于检测与并非其来源的Fc受体抗原的HSV血清型结合的交叉反应性抗体的ELISA或间接ELISA。例如，抑制免疫逃逸活性的能力可以通过竞争ELISA来测量，以评估疫苗特异性抗体在体外降低HSV Fc受体与人IgG Fc结合的能力。中和测定可以用于评估存在交叉中和抗体。中和抗体可以阻止HSV在允许的宿主细胞中的复制，这些细胞允许HSV的穿透和增殖。中和测定可以评估抗体中和病毒株的能力，例如通过在存在或不存在含有这种抗体的血清的情况下评估病毒感染的宿主细胞的细胞病变效应。
功能性免疫应答可以包括产生交叉反应性(例如，交叉血清型)T细胞应答。特异性T细胞应答的两个主要细胞效应物是CD4+辅助性T细胞和CD8+T淋巴细胞(或细胞毒性T淋巴细胞或CTL)。CD4+T细胞的激活导致其释放细胞因子，这些细胞因子影响很多细胞类型的活性，如B淋巴细胞、CTL和抗原呈递细胞(APC)。CD4+T细胞可进一步细分为产生Th1型细胞因子(如IL-2和IFN-γ)和Th2型细胞因子的Th1和Th2。CD4+T细胞的激活和细胞因子的分泌可以刺激免疫系统的细胞介导和抗体介导的分支。优选地，交叉反应性CD4+T细胞应答主要是Th1细胞介导的免疫应答，例如诱导IL-2和/或IFN-γ。CD8+T细胞(或细胞毒性T细胞(CTL))也可能参与T细胞介导的免疫反应，并且可诱导感染病毒的细胞死亡。在特异性抗原刺激激活后，CD8+T细胞能够产生细胞因子(例如，IFN-γ)。CD4+辅助性T细胞或CD8+T细胞激活后可以测量细胞因子的释放以评估和量化这种激活。本领域技术人员熟知的技术可用于测量与CD4+/CD8+T细胞激活相关的细胞因子应答，包括但不限于使用特异性ELISA或ELISPOT或流式细胞术，其设计用于测量细胞因子如IFN-γ、IL-2和/或其他。特别地，胞内细胞因子染色测定法可用于检测这些细胞中的胞内细胞因子，然后例如使用流式细胞术进行测量。细胞毒性可以使用例如体外溶细胞测定法来评估，其中抗原负载的靶细胞被接种或感染后在体内产生的特异性细胞毒性T细胞裂解。用于此的技术是本领域技术人员熟知的，并且包括例如铬释放测定法或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)生物测定法。当将膜表面抗原与特异性抗体结合时，细胞毒性途径被激活后，ADCC生物测定可以检测靶细胞的杀伤(例如，通过PBMC或NK细胞)。诸如Promega ADCC报告生物测定的替代测定可以检测稳定表达人FcyRIIIa诱导的荧光素酶的细胞系中FcyR介导的荧光素酶活性的激活。在与结合到靶细胞的相关抗体的Fc区接合后，表达FcyRIIIa的生物测定效应细胞转导胞内信号，从而产生能够容易量化的萤光素酶活性。在一个其他实施方式中，提供了一种在施用免疫有效量的HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体后确定受试者中的交叉反应性免疫应答的方法，包括从受试者获取组织(例如，血液)样品并进行体外测定以检测针对HSV2的交叉反应性免疫应答。在一个其他实施方式中，提供了一种在施用免疫有效量的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体后确定受试者中的交叉反应性免疫应答的方法，包括从受试者获取组织(例如，血液)样品并进行体外测定以检测针对HSV1的交叉反应性免疫应答。在一个实施方式中，将体外测定用于检测血液样品中的交叉反应性抗体。
在一个实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中交叉反应性免疫应答包括针对HSV1的交叉血清型抗体应答，优选用作泛HSV疫苗。在一个其他实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中交叉反应性免疫应答包括针对HSV2的交叉血清型抗体应答，优选地用作泛HSV疫苗。
在一个实施方式中，提供了一种HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对不同血清型的HSV的交叉反应性免疫应答。
在一个实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-交叉反应性免疫应答包括针对HSV1的交叉血清型抗体应答，和
-HSV2 Fc受体是与来自HSV的结合伴侣或其片段的异二聚体的一部分，优选地其中HSV2 Fc受体是HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体。
在一个其他实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV1Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-交叉反应性免疫应答包括针对HSV2的交叉血清型抗体应答，和
-HSV1 Fc受体是与来自HSV的结合伴侣或其片段的异二聚体的一部分，优选地其中HSV1 Fc受体是HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体。
在一个实施方式中，提供了一种HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答和用作泛HSV疫苗，其中：
-交叉反应性免疫应答是或者包括针对HSV1的交叉血清型抗体应答，和
-HSV2 Fc受体是与来自HSV的结合伴侣或其片段的异二聚体的一部分，优选地其中HSV2 Fc受体是HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体。
在一个其他实施方式中，提供了HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答和用作泛HSV疫苗，其中：
-交叉反应性免疫应答是或者包括针对HSV2的交叉血清型抗体应答，和
-HSV1 Fc受体是与来自HSV的结合伴侣或其片段的异二聚体的一部分，优选地其中HSV1 Fc受体是HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体。
在一个实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-交叉反应性免疫应答包括针对HSV1的交叉血清型抗体应答，和
-所述用途不包括与HSV2 gD2一起向受试者施用。
在一个其他实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV1Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-交叉反应性免疫应答是或者包括针对HSV2的交叉血清型抗体应答，和
-所述用途不包括与HSV1 gD1一起向受试者施用。
在一个实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中交叉反应性免疫应答包括交叉血清型抗体应答、交叉血清型细胞毒性抗体应答、交叉血清型T细胞应答和/或产生能够抑制HSV的免疫逃逸活性的抗体。
在一个其他实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV1Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中交叉反应性免疫应答包括交叉血清型抗体应答、交叉血清型细胞毒性抗体应答、交叉血清型T细胞应答和/或产生能够抑制HSV的免疫逃逸活性的抗体。
在一个实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-交叉反应性免疫应答包括产生能够抑制HSV的免疫逃逸活性的抗体，和
-所述用途不包括与HSV2 gD2或其包含免疫显性表位的片段一起向受试者施用。
在一个其他实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV1Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-交叉反应性免疫应答包括产生能够抑制HSV的免疫逃逸活性的抗体，和
-所述用途不包括与HSV1 gD1或其包含免疫显性表位的片段一起向受试者施用。
在一个实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-交叉反应性免疫应答包括交叉血清型T细胞应答，和
-所述用途不包括与HSV2 gD2或其包含免疫显性表位的片段一起向受试者施用。
在一个其他实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV1Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-交叉反应性免疫应答包括交叉血清型T细胞应答，和
-所述用途不包括与HSV1 gD1或其包含免疫显性表位的片段一起向受试者施用。
在一个实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-交叉反应性免疫应答包括交叉血清型T细胞应答，和
-所述用途不包括与HSV2 gD2或其包含免疫显性表位的片段一起向受试者施用。
在一个其他实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV1Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-交叉反应性免疫应答包括交叉血清型T细胞应答，和
-所述用途不包括与HSV1 gD1或其包含免疫显性表位的片段一起向受试者施用。
单纯疱疹病毒和免疫逃逸
甲型疱疹病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)，已经进化出特化的机制，使病毒能够在上皮和神经元组织中传播。原发性感染涉及进入粘膜上皮细胞，随后病毒在这些细胞之间快速传播。在病毒复制和传播的这一阶段，病毒通过病毒体(virion)包膜与神经元膜的融合进入感觉神经元，从而将衣壳递送到胞质中。衣壳在微管上向神经元细胞体或神经节中的细胞核逆轴突运输，在那里建立潜伏期。后来，在刺激神经元后，潜伏病毒重新激活，并产生病毒颗粒，这些病毒颗粒在微管上沿从细胞体到轴突尖端的顺行方向快速轴突运输。单纯疱疹病毒(HSV)和其他甲型疱疹病毒生命周期的一个基本阶段是从潜伏期重新激活然后从受感染的神经元传播到上皮组织的能力。这种传播至少涉及两个步骤：(i)顺行运输到轴突尖端，然后是(ii)胞吐作用和从轴突到上皮细胞的胞外传播。HSV gE/gI是由两种病毒膜糖蛋白gE和gI形成的异二聚体。HSV gE/gI异二聚体已被证明有助于病毒传播。(Howard,PaulW.等，"Herpes simplex virus gE/gI extracellular domains promote axonaltransport and spread from neurons to epithelial cells."Journal of virology88.19(2014):11178-11186.)
当HSV1或HSV2在受感染的细胞中重新激活时，病毒对免疫系统变得更加可见，因此更加脆弱。通常，宿主IgG识别病毒体或受感染细胞表面的病毒抗原，宿主IgG Fc结构域可通过与NK细胞、粒细胞和巨噬细胞上的Fcγ受体相互作用来介导重要的抗体效应活性，来触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并通过与巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞上的Fcγ受体相互作用来触发抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
HSV1或HSV2 gE可与HSV1或HSV2(分别)糖蛋白I(gI)形成非共价异二聚体复合物。gEgI异二聚体作为病毒Fcγ受体(FcγR)发挥作用，这意味着其具有与人IgG的Fc部分相互作用的能力。实际上，HSV1或HSV2 gE或gE/gI异二聚体，当展示在HSV感染的细胞的细胞表面上时，通过其Fc部分结合宿主IgG。与单独的gE相比，gE和gI之间的相互作用被认为可将Fc结合亲和性提高约100倍。这种相互作用与免疫逃逸机制有关。实际上，可以通过IgG Fab结构域结合病毒体或受感染细胞上的HSV1或HSV2抗原(例如gD)的人IgG也可以通过其Fc结构域结合病毒gE上的Fc结合结构域，通过网格蛋白介导的机制导致免疫复合物的内吞作用。这种机制被称为抗体双极桥接，被认为是与先天免疫细胞激活竞争的主要免疫逃逸策略。通过抗体Fc结合，病毒FcγR抑制IgG Fc介导的活性，包括补体结合和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，使病毒能够绕过免疫系统的识别。(Ndjamen,Blaise等，"The herpes virusFc receptor gE-gI mediates antibody bipolar bridging to clear viral antigensfrom the cell surface."PLoS pathogens 10.3(2014):e1003961.；Dubin,G.等，"Herpessimplex virus type 1Fc receptor protects infected cells from antibody-dependent cellular cytotoxicity."Journal of virology 65.12(1991):7046-7050.；Sprague,Elizabeth R.等，"Crystal structure of the HSV1 Fc receptor bound to Fcreveals a mechanism for antibody bipolar bridging."PLoS biology 4.6(2006):e148.)
HSV2预防性亚单位gD2疫苗在人体试验中未能有效预防HSV-2疾病或感染(Johnston,Christine,Sami L.Gottlieb和Anna Wald."Status of vaccine researchand development of vaccines for herpes simplex virus."Vaccine 34.26(2016):2948-2952)。另一种基于截短gD2和ICP4.2抗原并使用Matrix-M2佐剂化的HSV2候选疫苗在2期试验中降低了生殖器HSV2脱落率和损伤率(Van Wagoner,Nicholas等，"Effects ofdifferent doses of GEN-003,a therapeutic vaccine for genital herpes simplexvirus-2,on viral shedding and lesions:results of a randomized placebo-controlled trial."The Journal of infectious diseases 218.12(2018):1890-1899)。一种包含病毒进入分子(gD2)和两种阻断HSV2免疫逃逸的抗原(抑制补体的gC2和gE2)的三价佐剂疫苗在动物模型中显示出有效性(Awasthi,Sita等，"Blocking herpes simplexvirus 2 glycoprotein E immune evasion as an approach to enhance efficacy of atrivalent subunit antigen vaccine for genital herpes."Journal of virology88.15(2014):8421-8432.；Awasthi,Sita等，"An HSV2 trivalent vaccine isimmunogenic in rhesus macaques and highly efficacious in guinea pigs."PLoSpathogens 13.1(2017):e1006141.；Awasthi,Sita等，"A trivalent subunit antigenglycoprotein vaccine as immunotherapy for genital herpes in the guinea piggenital infection model."Human vaccines&immunotherapeutics 13.12(2017):2785-2793.；Hook,Lauren M.等，"A trivalent gC2/gD2/gE2 vaccine for herpes simplexvirus generates antibody responses that block immune evasion domains on gC2better than natural infection."Vaccine 37.4(2019):664-669)。
引导针对gE的Fc结合结构域的免疫应答可以防止或干扰上述免疫逃逸机制(抗体双极桥接)，允许对病毒蛋白，特别是免疫显性HSV1或HSV2-gD抗原的天然免疫变得更有效。通过疫苗接种特异性靶向gE或gE/gI异二聚体可以增强亚优势免疫应答，特别是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性胞吞作用(ADCP)，并将免疫系统重定向到保护机制。不希望受理论束缚，本发明人因此相信，通过单独接种gE或与其异二聚体结合伴侣gI联合接种来特异性地提高交叉反应性免疫应答，可以有效地治疗感染HSV1或HSV2的受试者，或者防止受试者感染HSV1或HSV2。在一些方面中，通过单独接种gE或与其异二聚体结合伴侣gI联合接种来特异性地提高交叉反应性免疫应答，可以有效地治疗受试者以减少或消除HSV1或HSV2的潜在病毒感染和/或治疗或减少由HSV1或HSV2的潜在病毒感染引起的急性感染。
对于已经被疱疹病毒感染的受试者(血清阳性受试者)的治疗，无论其处于有症状还是无症状阶段，本发明人假设没有必要在治疗组合物中包含诸如HSV gD的免疫显性抗原。事实上，gD是一种显性抗原，血清反应阳性的受试者，无论是有症状的还是无症状的，已经具有高水平的天然产生的针对gD的中和抗体(Cairns，Tina M.等，″Patient-specificneutralizing antibody responses to herpes simplexvirus are attributed toepitopes on gD，gB，or both and can be typespecific.″Journal of virology 89.18(2015)：9213-9231)。通过诱导针对病毒Fc受体如HSV gE或gE/gI的免疫应答，本发明人假设gE/gI免疫逃逸机制将被规避，天然免疫将更充分发挥其作用，特别是定向针对免疫显性抗原如gD的天然抗体应答。除了作用于免疫逃逸机制之外，gE或gE/gI抗原还可以诱导体液应答(抗gE或抗gE和gI抗体)，这将导致通过细胞毒性和/或吞噬机制(ADCC/ADCP)破坏受感染的细胞。在血清阳性受试者的情况下，ADCC和/或ADCP机制可能比中和抗体机制(如由显性HSV抗原gD驱动的应答)更有效地控制在早期病毒复制。最后，本发明人还假设用gE或gE/gI抗原诱导CD4+T细胞也将有助于抵抗复发性HSV感染。
Fc受体
在第一个方面中，本发明提供了一种HSV-2Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV-1的交叉反应性免疫应答。在第二个方面中，提供了一种HSV-1Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV-2的交叉反应性免疫应答。
如本文所用，“Fc受体”(或“FcR”)是在某些细胞表面发现的蛋白，其具有结合抗体Fc区域的能力。基于其识别的抗体类型对Fc受体进行分类。结合IgG(最常见的一类抗体)的Fc受体称为“Fc-γ受体”(或“FcγR”)，结合IgA的称为“Fc-α受体”(或“FcαR”)，结合IgE的称为“Fc-ε受体”(或“FcεR”)。在本文中，由于内源基因的表达而展示在来自给定多细胞生物体的细胞表面上的Fc受体被称为“宿主Fc受体”。宿主Fc受体尤其存在于宿主免疫效应细胞的表面，如B淋巴细胞、滤泡树突细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、人血小板和肥大细胞。宿主Fc受体与抗体的Fc区结合，这些抗体通过其Fab区与受感染细胞或入侵病原体结合，触发通过抗体介导的细胞吞噬作用(ADCP)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)对受感染细胞或入侵病原体的吞噬作用或破坏。
适宜地，FcR或其免疫原性片段是亚单位形式，这意味着其不是整个病毒的一部分。适宜地，FcR或其免疫原性片段是分离的。
一些病毒，特别是疱疹病毒，表达与宿主IgG的Fc部分结合的病毒Fc受体，从而阻止IgG与免疫效应细胞上的宿主Fc受体结合，并允许病毒逃避宿主ADCC或ADCP免疫应答。
在一个实施方式中，HSV Fc受体是FcγR。优选地，FcγR选自HSV2 gE2和HSV1gE1。
在本文中，“HSV2 gE2”(或“HSV2 gE”)是由HSV2基因US8编码并展示在受感染细胞表面上并作为病毒FcγR起作用的HSV2 gE糖蛋白。适宜地，HSV2 gE2选自表1中所示的HSV2gE糖蛋白，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
表1-HSV2 gE糖蛋白和胞外域
/>
在一个优选实施方式中，HSV2 gE2是来自HSV2 SD90e株(Genbank登录号AHG54732.1，UniProtKB登录号：A7U881)的gE，其具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
如本文所用，“变体”是在序列上与参考抗原序列不同但保留参考抗原的至少一种基本性质的肽序列。肽变体序列的变化可能是有限的或保守的，因此参考肽和变体的序列总体上非常相似，并且在很多区域中是相同的。变体和参考抗原可以通过任何组合的一个或多个替换、添加或缺失而在氨基酸序列上有所不同。抗原的变体可以是天然存在的，如等位基因变体，或者可以是已知的非天然存在的变体。可以通过诱变技术或通过直接合成来制备核酸和多肽的非天然存在的变体。在一个优选实施方式中，变体保留的必要性质是诱导免疫应答的能力，合适的是体液或T细胞应答，这与参考抗原诱导的免疫应答相似。适宜地，变体在小鼠中诱导的体液或T细胞应答比参考抗原诱导的免疫应答低不超过10倍，更合适地低不超过5倍，低不超过2倍或不低于参考抗原诱导的免疫应答。
在本文中，“HSV1 gE1”(或“HSV1 gE”)是由HSV1基因US8编码并展示在受感染细胞表面上的HSV1 gE糖蛋白，其作为病毒FcγR起作用。适宜地，HSV1 gE 1是来自HSV1 KOS321株(UniProtKB登录号：Q703E9)的gE，其具有SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
在一个实施方式中，使用HSV Fc受体的免疫原性片段。
如本文所用，“免疫原性片段”是指包含一个或多个表位(例如，线性的、构象的或两者)的参考抗原的片段，其能够刺激宿主的免疫系统以产生体液和/或细胞抗原特异性免疫应答(即，特异性识别天然存在的多肽(例如，病毒或细菌蛋白)的免疫应答)。“表位”是抗原中决定其免疫特异性的部分。T细胞和B细胞表位可以凭经验确定(例如，使用PEPSCAN或类似方法)。在一个优选实施方式中，免疫原性片段诱导免疫应答，适当地是体液或T细胞应答，其类似于参考抗原诱导的免疫应答。适宜地，该免疫原性片段在小鼠中诱导的体液或T细胞应答比参考抗原诱导的免疫应答低不超过10倍，更合适地低不超过5倍，低不超过2倍或不低于参考抗原诱导的免疫应答。
如本文所用，“HSV Fc受体的免疫原性片段”指至少10、15、20、30、40、50、60、100、200、300或更多个氨基酸的天然存在的病毒Fc受体的片段，或者具有与天然存在的病毒Fc受体(或与至少约10、15、20、30、40、50、60或更多个氨基酸的天然存在的病毒Fc受体的片段)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的氨基酸序列的肽。因此，抗原性病毒Fc受体的免疫原性片段可以是至少10个氨基酸的天然存在的病毒Fc受体的片段，并且可以包含一个或多个氨基酸替换、缺失或添加。
如果需要，任何编码的HSV Fc受体免疫原性片段可以另外包含起始甲硫氨酸残基。
适宜地，HSV Fc受体或其免疫原性片段不包含功能性跨膜结构域。适宜地，HSV Fc受体或其免疫原性片段不包含胞质结构域。优选地，HSV Fc受体或其免疫原性片段既不包含功能性跨膜结构域，也不包含胞质结构域。换言之，在一个优选实施方式中，HSV Fc受体或免疫原性片段由HSV FcR胞外域(或胞外结构域)组成。更优选地，HSV Fc受体或免疫原性片段包含或由HSV2 gE2胞外域或HSVl gE1胞外域组成。
在一个优选实施方式中，HSV FcR胞外域是HSV2 gE2胞外域，其包含或由以下组成：在SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-419)，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。适宜地，病毒FcR胞外域具有选自表1或图77中所示序列的序列。在一个优选实施方式中，病毒FcR胞外域是HSV2 gE2胞外域，其与SEQ ID NO:7至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％相同。
适宜地，相对于SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列，HSV2 Fc受体胞外域可以包含一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换、缺失或插入。
在另一个实施方式中，HSV2 FcR胞外域是HSV2 gE2胞外域，其包含或由以下组成：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-417的氨基酸序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。适宜地，与对应于SEQID NO:1的氨基酸残基1-417的氨基酸序列相比，HSV2 Fc受体胞外域可以包含一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换、缺失或插入。
在另一个实施方式中，HSV1 FcR胞外域是HSV1 gE1胞外域，其包含或由以下组成：在SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基1-421)，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。在一个优选实施方式中，HSV1 FcR胞外域是HSV1 gE1胞外域，其与SEQ ID NO:9至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％相同。
适宜地，相对于在SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列，HSV Fc受体HSV1胞外域可以包含一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换、缺失或插入。
在另一个实施方式中，HSV1 FcR HSV1胞外域包含或由以下组成：对应于SEQ IDNO:3的氨基酸残基1-419的氨基酸序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。适宜地，与对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基1-419的氨基酸序列相比，HSV1 Fc受体HSV1胞外域可以包含一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换、缺失或插入。
在另一个实施方式中，HSV1或HSV2 FcR的免疫原性片段包含或由HSV FcR的Fc结合结构域或其变体组成。
在一个实施方式中，HSV2 FcR的免疫原性片段包含或由以下组成：HSV2 gE的Fc结合结构域，例如，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基233-378的氨基酸序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。适宜地，与对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基233-378的氨基酸序列相比，病毒Fc受体HSV2 Fc结合结构域可以包含一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换、缺失或插入。
在一个实施方式中，HSV1 FcR的免疫原性片段包含或由以下组成：HSV1 gE的Fc结合结构域，例如，对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基235-380的氨基酸序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。适宜地，与对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基235-380的氨基酸序列相比，HSV1 Fc受体HSV1 Fc结合结构域可以包含一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换、缺失或插入。
在一个优选实施方式中，与相应天然HSV Fc受体相比，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体与人抗体Fc结构域结合的能力降低或消除。适宜地，与HSV Fc受体或其免疫原性片段的天然序列相比，HSV Fc受体或其免疫原性片段包含一个或多个氨基酸替换、缺失或插入，与天然HSV Fc受体相比，其降低或消除HSV FcR或其免疫原性片段或变体与抗体Fc结构域之间的结合亲和性。
HSV FcR或其免疫原性片段或变体与抗体Fc结构域之间的结合亲和性可以通过本领域技术人员熟知的方法确定。例如，通过BiLayer Interferometry确定结合速率(kon)、解离速率(koff)、平衡解离常数(D＝koff/kon)和平衡结合常数(KA＝1/KD＝kon/koff)。
在一个优选实施方式中，HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的kon低于相应的天然HSV FcR与人IgG之间的kon(慢结合剂)。
在一个优选实施方式中，HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的koff高于相应的天然HSV FcR与人IgG之间的koff(快速释放剂)。
在一个更优选的实施方式中，HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的kon低于对应的天然HSV FcR与人IgG之间的kon，并且HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的koff高于相应的天然HSV FcR与人IgG之间的koff(慢结合剂/快速释放剂)。
在一个优选实施方式中，HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的平衡解离常数(KD)高于相应的天然HSV FcR与人IgG之间的KD。
HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的相对亲和性可以通过将针对天然HSV FcR确定的KD除以针对HSV FcR或其免疫原性片段或变体确定的KD来确定。
在一个优选实施方式中，HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的相对亲和性低于相应天然HSV FcR和人IgG之间亲和性的100％，例如，低于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或10％。在一个更优选的实施方式中，HSV FcR或其免疫原性片段或变体和人IgG之间的相对亲和性低于相应天然HSV FcR和人IgG之间亲和性的15％、更优选地还低于10％。
在一个优选实施方式中，HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的平衡解离常数(KD)高于2x10-7M，优选地高于5x10-7M，更优选地高于1x10-6M。
或者，HSV Fc受体或其免疫原性片段与人抗体Fc结构域结合的能力可以通过测量在BiLayer Interferometry测定中的应答(以nm表示)来评估。
在一个优选实施方式中，在BiLayer Interferometry测定中对应于HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体和人IgG之间的结合的应答小于用相应的天然HSV Fc受体获得的应答的80％，适当地小于70％、60％、50％、40％。在一个优选实施方式中，在BiLayerInterferometry测定中对应于HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体和人IgG之间的结合的应答小于0.4nm，适宜地小于0.3nm、0.2nm或0.1nm。
适宜地，HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体在选自SEQ ID NO:1所示的HSV2 gE2序列的N241、H245、A246、A248、R314、P317、P318、P319、F322、R320、A337、S338或V340的位置处包含一个或多个突变(插入、替换或缺失)。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体和抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变包括(例如，至少一种)选自以下的SEQ ID NO:1中所示序列的单点替换突变：H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P和V340W。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV2 gE2或其免疫原性片段和抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括(例如，至少一种)选自以下的SEQ ID NO:1中所示序列的双点替换突变：H245A和P319A；H245A和P319R；H245A和P319G；H245A和P319K；H245A和P319T；N241A和R320D；N241A和P319D；A246W和P317K；A246W和P317F；A246W和P317S；A246W和R320D；A246W和R320G；A246W和R320T；A248K和V340R；A248K和V340M；A248K和V340W；A248T和V340R；A248T和V340M；A248T和V340W；A248G和V340R；A248G和V340M；A248G和V340W；A248K和F322A；A248K和F322I；A248K和F322P；A248T和F322A；A248T和F322I；A248T和F322P；A248G和F322A；A248G和F322I；A248G和F322P；H245A和R320D；H245A和R320G；H245A和R320T；H245G和R320D；H245G和R320G；H245G和R320T；H245S和R320D；H245S和R320G；H245S和R320T；H245A和P319G；H245A和P319L；H245G和P319G；H245G和P319L；H245S和P319G；H245S和P319L；R314G和P318R；R314G和P318D；R314G和P318I；R314L和P318R；R314L和P318D；R314L和P318I；R314P和P318R；R314P和P318D；R314P和P318I；R314G和F322A；R314G和F322I；R314G和F322P；R314L和F322A；R314L和F322I；R314L和F322P；R314P和F322A；R314P和F322I；R314P和F322P；R314G和V340R；R314G和V340M；R314G和V340W；R314L和V340R；R314L和V340M；R314L和V340W；R314P和V340R；R314P和V340M；R314P和V340W；P317K和V340R；P317K和V340M；P317K和V340W；P317F和V340R；P317F和V340M；P317F和V340W；P317S和V340R；P317S和V340M；P317S和V340W；P317K和S338G；P317K和S338H；P317K和S338L；P317F和S338G；P317F和S338H；P317F和S338L；P317S和S338G；P317S和S338H；P317S和S338L；P318R和S338G；P318R和S338H；P318R和S338L；P318D和S338G；P318D和S338H；P318D和S338L；P318I和S338G；P318I和S338H；P318I和S338L；P319G和V340R；P319G和V340M；P319G和V340W；P319L和V340R；P319L和V340M；P319L和V340W；P317R和P319D；P317R和R320D；P319D和R320D。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体和抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括在SEQ ID NO:1所示序列的位置P319和/或R320处的缺失突变，单独或与替换突变相结合；特别是选自以下的突变：P319缺失；R320缺失；P319缺失/R320缺失；P319缺失/R320缺失/P317G/P318G；P319缺失/R320缺失/P318E；P319缺失/R320缺失/P318G；P319缺失/R320缺失/P318K；P319缺失/R320缺失/P317R/P318E；P319缺失/R320缺失/P317R/P318G；P319缺失/R320缺失/P317R/P318K；P319缺失/R320缺失/P317G/P318K。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体和抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括(例如，至少一种)选自以下的插入突变：
·SEQ ID NO:1的氨基酸残基Y275和E276之间的肽序列LDIGE插入(275_插入_LDIGE)，
·SEQ ID NO:1的氨基酸残基S289和P290之间的肽序列ADIGL插入(289_插入ADIGL)，
·SEQ ID NO:1的氨基酸残基A337和S338之间的肽序列ARAA插入(337_插入_ARAA)，
·SEQ ID NO:1的氨基酸残基S338和T339之间的肽序列ARAA插入(338_插入_ARAA)，和
·SEQ ID NO:1的氨基酸残基H346和A347之间的肽序列ADIT插入(346_插入_ADIT)。
在一个优选实施方式中，HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体相对于SEQ ID NO:1中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：289_插入ADIGL；338_插入ARAA；H245K；P317R；P319R；P319G；P319K；H245A_P319R；H245A_P319G；H245A_P319K；H245A_P319T；P319D；S338D；R320D；N241A_R320D；A248K_V340M；P318Y；A248K_V340R；A248T_V340W；A248K_V340W；A246W_R320G；A246W_P317K；A246W_R320D；A246W_R320T；V340W；A248G_V340W；H245G_R320D；P318D；A246W_P317F；P319G_V340W；A248T_V340M；P317K_V340W；V340F；V340D；H245A_R320D；P317F_V340W；A246W_P317S；H245S_R320D；R314G_P318D；A248T；P318S；P317K；P317S_V340W；H245D；R314P_V340W；R314L_318D；P319L_V340W；P317F；P318D_S338G；R314G_V340W；P317K_S338H；R314L_V340W；P318R；P318Q；P317F_S338G；R314G_P318I；H245G_P319G；P317L；P318I；A248T_F322A；H245E；P318T；P318R_S338G；P318D_S338H；P317F_S338H；A248T_V340R；A248T_F322I；H245A_R320G；P318R_S338H；H245S_R320G；P317K_S338G；A248T_F322P；V340R；R314L_P318R；H245S_R320T；R314G_P318R；R320E；H245G_R320G；H245A_R320T；A246W；P318I_S338G；P317K_V340M；P317I；R320H；R314P_P318I；P318I_S338H；P317F_V340M；H245A_P319G；H245A_P319L；R320P；H245G_R320T；R314L_V340R；P319G_V340R；R314G_F322I；R314L_P318I；R320A；R314N；P317F_V340R；P318D_S338L；A248G_V340R；R314E；R314P_P318D；H245S_P319G；V340Q；A248K_F322I；R320G；H245S_P319L；R314F；P319L；P317K_S338L；P319L_V340M；P317G；R320S；R320Q；R314P_V340R；V340A；H245G_P319L；R320T；R314P_P318R；A248G_F322I；R320N；P317N；R314D；R314Y；R314P_F322I；P319G_V340M；P317S_V340R；R314V；P317R_P319D；P317R_R320D；P319D_R320D；Δ319_Δ320；P317G_P318G_Δ319_Δ320；P318E_Δ319_Δ320；P318G_Δ319_Δ320；P318K_Δ319_Δ320；P317R_P318E_Δ319_320；P317R_P318G_Δ319_Δ320和P317G_P318K_Δ319_Δ320(Δ指缺失的残基)。
在一个更优选的实施方式中，HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体相对于SEQ IDNO:1中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：338_插入ARAA；P317R；P319D；R320D；A248T_V340W；V340W；A248T；P318I和A246W。
其他HSV2 gE2序列(例如表1中列出的序列和图77中呈现的比对中所示的序列)中与上文列出的示例性替换、选择和插入突变相对应的突变也在本发明的范围内。
上文列出的示例性单和双替换突变和插入突变的所有可能组合也在本发明的范围内。
适宜地，HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体在选自SEQ ID NO:3中所示HSV1 gE1序列的H247、P319和P321位置处包含一个或多个突变(插入、替换或缺失)。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV1 gE1或其免疫原性片段和抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变包括在SEQ ID NO:3中所示序列的单点替换突变，所述突变选自：H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A和R322D，以及在SEQ ID NO:3中所示序列的双点替换突变，所述突变选自：H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G和A340G/S341G/V342G。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体和抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括(例如，至少一种)选自以下的插入突变：
·SEQ ID NO:3的氨基酸残基Y277和E278之间的肽序列LDIGE插入(277_插入_LDIGE)；
·SEQ ID NO:3的氨基酸残基S291和P292之间的肽序列ADIGL插入(291_插入ADIGL)；
·SEQ ID NO:3的氨基酸残基A339和S340之间的肽序列ARAA插入(339_插入_ARAA)；
·SEQ ID NO:3的氨基酸残基A340和S341之间的肽序列ARAA插入(340_插入_ARAA)；和
·SEQ ID NO:3的氨基酸残基D348和A349之间的肽序列ADIT插入(348_插入_ADIT)。
在一个优选实施方式中，HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体相对于SEQ ID NO:3中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：P321K；P321D；R322D；N243A_R322D；N243A_P321D；A340G_S341G_V342G；H247G_P319G；P321R；H247A_P321K；291_插入ADIGL；339_插入ARAA；P319R；P319G_P321G和H247A_P321R。
在一个更优选的实施方式中，HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体相对于SEQ IDNO:3中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：P319R、P321D、R322D、N243A_R322D或A340G_S341G_V342G。
其他HSV1 gE1序列中与上文列出的示例性单替换和双替换突变和插入突变相对应的突变也在本发明的范围内。
上文列出的示例性单和双替换突变和插入突变的所有可能组合也在本发明的范围内。
在一个优选实施方式中，当HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体是HSV FcR胞外域时，与天然HSV Fc受体相比，胞外域结合抗体Fc结构域的能力降低或消除。适宜地，与HSVFcR胞外域的天然序列相比，HSV FcR胞外域包含一个或多个氨基酸替换、缺失或插入，与天然HSV FcR相比，其降低或消除HSV FcR胞外域与抗体Fc域之间的结合亲和性。
可以通过上文所述的方法确定HSV FcR胞外域与抗体Fc结构域之间的结合亲和性。
在一个优选实施方式中，HSV FcR胞外域与人IgG之间的kon低于相应的天然HSVFcR胞外域与人IgG之间的kon(慢结合剂)。
在一个优选实施方式中，HSV FcR胞外域与人IgG之间的koff高于相应的天然HSVFcR胞外域与人IgG之间的koff(快速释放剂)。
在一个更优选的实施方式中，HSV FcR胞外域与人IgG之间的kon低于对应的天然HSV FcR胞外域与人IgG之间的kon，并且HSV FcR胞外域与人IgG之间的koff高于相应的天然HSV FcR胞外域与人IgG之间的koff(慢结合剂/快速释放剂)。
在一个优选实施方式中，HSV FcR胞外域与人IgG之间的平衡解离常数(KD)高于相应的天然HSV FcR胞外域与人IgG之间的KD。
在一个优选实施方式中，HSV FcR胞外域和人IgG之间的相对亲和性低于相应的天然HSV FcR胞外域和人IgG之间亲和性的100％，例如，低于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或10％。在一个更优选的实施方式中，HSV FcR胞外域和人IgG之间的相对亲和性低于相应的天然HSV FcR胞外域和人IgG之间亲和性的15％、更优选地还低于10％。
在一个优选实施方式中，HSV FcR胞外域和人IgG之间的平衡解离常数(KD)高于2x10-7M，优选地高于5x10-7M，更优选地高于1x10-6M。
或者，HSV FcR胞外域与人抗体Fc结构域结合的能力可以通过测量在BiLayerInterferometry测定中的应答(以nm表示)来评估。在一个优选实施方式中，在BiLayerInterferometry测定中对应于HSV FcR胞外域和人IgG之间的结合的应答小于用相应的天然HSV FcR胞外域获得的应答的80％，适当地小于70％、60％、50％、40％。在一个优选实施方式中，在BiLayer Interferometry测定中对应于病毒FcR胞外域和人IgG之间的结合的应答小于0.6nm，适宜地小于0.5nm、0.4nm、0.3nm或0.2nm。
适宜地，HSV2 gE2胞外域在选自SEQ ID NO:7所示的HSV2gE2胞外域序列的N241、H245、A246、A248、R314、P317、P318、P319、F322、R320、A337、S338或V340的位置处包含一个或多个突变(插入、替换或缺失)。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV2 gE2胞外域和抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变包括(例如，至少一种)选自以下的SEQ ID NO:7中所示序列的单点替换突变：H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P和V340W。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV2 gE2胞外域和抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括选自以下的SEQ ID NO:7中所示序列的双点替换突变：H245A和P319A；H245A和P319R；H245A和P319G；H245A和P319K；H245A和P319T；N241A和R320D；N241A和P319D；A246W和P317K；A246W和P317F；A246W和P317S；A246W和R320D；A246W和R320G；A246W和R320T；A248K和V340R；A248K和V340M；A248K和V340W；A248T和V340R；A248T和V340M；A248T和V340W；A248G和V340R；A248G和V340M；A248G和V340W；A248K和F322A；A248K和F322I；A248K和F322P；A248T和F322A；A248T和F322I；A248T和F322P；A248G和F322A；A248G和F322I；A248G和F322P；H245A和R320D；H245A和R320G；H245A和R320T；H245G和R320D；H245G和R320G；H245G和R320T；H245S和R320D；H245S和R320G；H245S和R320T；H245A和P319G；H245A和P319L；H245G和P319G；H245G和P319L；H245S和P319G；H245S和P319L；R314G和P318R；R314G和P318D；R314G和P318I；R314L和P318R；R314L和P318D；R314L和P318I；R314P和P318R；R314P和P318D；R314P和P318I；R314G和F322A；R314G和F322I；R314G和F322P；R314L和F322A；R314L和F322I；R314L和F322P；R314P和F322A；R314P和F322I；R314P和F322P；R314G和V340R；R314G和V340M；R314G和V340W；R314L和V340R；R314L和V340M；R314L和V340W；R314P和V340R；R314P和V340M；R314P和V340W；P317K和V340R；P317K和V340M；P317K和V340W；P317F和V340R；P317F和V340M；P317F和V340W；P317S和V340R；P317S和V340M；P317S和V340W；P317K和S338G；P317K和S338H；P317K和S338L；P317F和S338G；P317F和S338H；P317F和S338L；P317S和S338G；P317S和S338H；P317S和S338L；P318R和S338G；P318R和S338H；P318R和S338L；P318D和S338G；P318D和S338H；P318D和S338L；P318I和S338G；P318I和S338H；P318I和S338L；P319G和V340R；P319G和V340M；P319G和V340W；P319L和V340R；P319L和V340M；和P319L；V340W；P317R和P319D；P317R和R320D；P319D和R320D。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV2 gE2胞外域与抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括在SEQ ID NO:7所示序列的位置P319和/或R320处的缺失突变，单独或与替换突变相结合；特别是选自以下的突变：P319缺失；R320缺失；P319缺失/R320缺失；P319缺失/R320缺失/P317G/P318G；P319缺失/R320缺失/P318E；P319缺失/R320缺失/P318G；P319缺失/R320缺失/P318K；P319缺失/R320缺失/P317R/P318E；P319缺失/R320缺失/P317R/P318G；P319缺失/R320缺失/P317R/P318K；P319缺失/R320缺失/P317G/P318K。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV2 gE2胞外域与抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括(例如，至少一种)选自以下的插入突变：
·SEQ ID NO:7的氨基酸残基Y275和E276之间的肽序列LDIGE插入(275_插入_LDIGE)；
·SEQ ID NO:7的氨基酸残基S289和P290之间的肽序列ADIGL插入(289_插入ADIGL)；
·SEQ ID NO:7的氨基酸残基A337和S338之间的肽序列ARAA插入(337_插入_ARAA)；
·SEQ ID NO:7的氨基酸残基S338和T339之间的肽序列ARAA插入(338_插入_ARAA)；和
·SEQ ID NO:7的氨基酸残基H346和A347之间的肽序列ADIT插入(346_插入_ADIT)。
在一个优选实施方式中，HSV2 gE2胞外域相对于SEQ ID NO:7中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：289_插入ADIGL；338_插入ARAA；H245K；P317R；P319R；P319G；P319K；H245A_P319R；H245A_P319G；H245A_P319K；H245A_P319T；P319D；S338D；R320D；N241A_R320D；A248K_V340M；P318Y；A248K_V340R；A248T_V340W；A248K_V340W；A246W_R320G；A246W_P317K；A246W_R320D；A246W_R320T；V340W；A248G_V340W；H245G_R320D；P318D；A246W_P317F；P319G_V340W；A248T_V340M；P317K_V340W；V340F；V340D；H245A_R320D；P317F_V340W；A246W_P317S；H245S_R320D；R314G_P318D；A248T；P318S；P317K；P317S_V340W；H245D；R314P_V340W；R314L_318D；P319L_V340W；P317F；P318D_S338G；R314G_V340W；P317K_S338H；R314L_V340W；P318R；P318Q；P317F_S338G；R314G_P318I；H245G_P319G；P317L；P318I；A248T_F322A；H245E；P318T；P318R_S338G；P318D_S338H；P317F_S338H；A248T_V340R；A248T_F322I；H245A_R320G；P318R_S338H；H245S_R320G；P317K_S338G；A248T_F322P；V340R；R314L_P318R；H245S_R320T；R314G_P318R；R320E；H245G_R320G；H245A_R320T；A246W；P318I_S338G；P317K_V340M；P317I；R320H；R314P_P318I；P318I_S338H；P317F_V340M；H245A_P319G；H245A_P319L；R320P；H245G_R320T；R314L_V340R；P319G_V340R；R314G_F322I；R314L_P318I；R320A；R314N；P317F_V340R；P318D_S338L；A248G_V340R；R314E；R314P_P318D；H245S_P319G；V340Q；A248K_F322I；R320G；H245S_P319L；R314F；P319L；P317K_S338L；P319L_V340M；P317G；R320S；R320Q；R314P_V340R；V340A；H245G_P319L；R320T；R314P_P318R；A248G_F322I；R320N；P317N；R314D；R314Y；R314P_F322I；P319G_V340M；P317S_V340R；R314V；P317R_P319D；P317R_R320D；P319D_R320D；Δ319_Δ320；P317G_P318G_Δ319_Δ320；P318E_Δ319_Δ320；P318G_Δ319_Δ320；P318K_Δ319_Δ320；P317R_P318E_Δ319_320；P317R_P318G_Δ319_Δ320和P317G_P318K_Δ319_Δ320。
在一个更优选的实施方式中，HSV2 gE2胞外域相对于SEQ ID NO:7中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：338_插入ARAA；P317R；P319D；R320D；A248T_V340W；V340W；A248T；P318I和A246W。
其他HSV2 gE2胞外域序列(例如表1中列出的序列和图77中呈现的比对中所示的序列)中与上文列出的示例性替换、选择和插入突变相应的突变也在本发明的范围内。
上文列出的示例性单和双替换突变和插入突变的所有可能组合也在本发明的范围内。
适宜地，HSV1 gE1胞外域在选自SEQ ID NO:9中所示HSV1 gE1胞外域序列的H247、P319和P321位置处包含一个或多个突变(插入、替换或缺失)。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV1 gE1胞外域和抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变包括(例如，至少一种)在SEQ ID NO:9中所示序列的单点替换突变，所述突变选自以下：H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A和R322D，以及在SEQ ID NO:9中所示序列的双点替换突变，所述突变选自以下：H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G和A340G/S341G/V342G。
可以在本文中使用的以降低或消除HSV1 gE1胞外域与抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括(例如，至少一种)选自以下的插入突变：
·SEQ ID NO:9的氨基酸残基Y277和E278之间的肽序列LDIGE插入(277_插入_LDIGE)；
·SEQ ID NO:9的氨基酸残基S291和P292之间的肽序列ADIGL插入(291_插入ADIGL)；
·SEQ ID NO:9的氨基酸残基A339和A340之间的肽序列ARAA插入(339_插入_ARAA)；
·SEQ ID NO:9的氨基酸残基A340和S341之间的肽序列ARAA插入(340_插入_ARAA)；和
·SEQ ID NO:9的氨基酸残基D348和A349之间的肽序列ADIT插入(348_插入_ADIT)。
在一个优选实施方式中，HSV1 gE1胞外域相对于SEQ ID NO:9中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：P321K；P321D；R322D；N243A_R322D；N243A_P321D；A340G_S341G_V342G；H247G_P319G；P321R；H247A_P321K；291_插入ADIGL；339_插入ARAA；P319R；P319G_P321G和H247A_P321R。
在一个更优选的实施方式中，HSV1 gE1胞外域相对于SEQ ID NO:9中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：P321D；R322D；A340G_S341G_V342G和P319R。
其他HSV1 gE1胞外域序列中与上文列出的示例性单替换和双替换突变和插入突变相对应的突变也在本发明的范围内。
上文列出的示例性单和双替换突变和插入突变的所有可能组合也在本发明的范围内。
在一个优选实施方式中，HSV Fc受体或其免疫原性片段是与来自所述病毒的结合伴侣或其片段的异二聚体的一部分。
如本文所用，“结合伴侣”是与Fc受体或其免疫原性片段或变体形成非共价异二聚体复合物的病毒蛋白(或糖蛋白)或其片段。
在一个优选实施方式中，HSV Fc受体是HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体，结合伴侣是HSV2 gI2或其片段。在另一个实施方式中，HSV Fc受体是HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体，结合伴侣是HSV1 gI1或其片段。
在本文中，“HSV2 gI2”(或“HSV2 gI”)是由HSV2基因US7编码的HSV2 gI糖蛋白，并展示在受感染细胞的表面上，在此与HSV2 gE2结合形成异二聚体。适宜地，HSV2 gI2选自表2中所示的HSV2 gI糖蛋白，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
表2-HSV2 gI糖蛋白和胞外域
/>
/>
在一个优选实施方式中，HSV2 gI2是来自HSV2 SD90e株(Genbank登录号AHG54731.1，UniProtKB登录号：A8U5L5，SEQ ID NO:2)的gI，其具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
在另一个优选实施方式中，HSV Fc受体是HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体，结合伴侣是HSV1 gI1或其变体。在另一个实施方式中，HSV Fc受体是HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体，结合伴侣是HSV2 gI2或其变体。
在本文中，“HSV1 gI1”(或“HSV1 gI”)是由HSV1基因US7编码的HSV1 gI糖蛋白，并展示在受感染细胞表面上，在此与HSV1 gE1结合形成异二聚体。适宜地，HSV1 gI1是来自HSV1 17株(UniProtKB登录号：P06487，SEQ ID NO:4)的gI，其具有SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
在一个实施方式中，使用HSV FcR结合伴侣的片段。
如本文所用，应用于蛋白或肽的术语“片段”是指较大蛋白或肽的子序列。蛋白或肽的“片段”的长度是至少约10个氨基酸(作为连续氨基酸天然存在的氨基酸；例如，对于单个线形表位)；例如，长度至少约15、20、30、40、50、60、100、200、300或更多个氨基酸(以及其间的任何整数值)。
在一个优选实施方式中，HSV FcR结合伴侣片段是免疫原性片段。
如本文所用，“HSV FcR结合伴侣的片段”指至少10、15、20、30、40、50、60、100、200、300或更多个氨基酸的天然存在的HSV FcR结合伴侣的片段，或者具有与天然存在的HSVFcR结合伴侣(或与至少约10、15、20、30、40、50、60或更多个氨基酸的天然存在的HSV FcR结合伴侣的片段)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的氨基酸序列的肽。因此，HSV FcR结合伴侣的片段可以是至少10个氨基酸的天然存在的HSV FcR结合伴侣的片段，并且可以包含一个或多个氨基酸替换、缺失或添加。
如果需要，任何编码的HSV FcR结合伴侣片段可以另外包含起始甲硫氨酸残基。
跨膜蛋白是一种完整的膜蛋白，在正常培养条件下具有跨越细胞膜的能力。本文中的跨膜结构域是在正常培养条件下发现其自身位于细胞膜内的跨膜蛋白的区段。在本文中，胞质结构域是跨膜蛋白的区段，在正常培养条件下发现其自身位于细胞膜的胞质侧。在本文中，胞外域是在正常培养条件下发现其自身位于细胞膜外侧的跨膜蛋白的区段。
适宜地，HSV FcR结合伴侣或其片段不包含跨膜结构域。适宜地，HSV FcR结合伴侣或其免疫原性片段不包含胞质结构域。优选地，HSV FcR结合伴侣或其免疫原性片段既不包含跨膜结构域，也不包含胞质结构域。换言之，在一个优选实施方式中，HSV FcR结合伴侣或免疫原性片段由HSV FcR结合伴侣胞外域(或细胞外结构域)组成。更优选地，HSV FcR结合伴侣或其免疫原性片段选自HSV2gI2胞外域和HSV1 gI1胞外域。
在一个优选实施方式中，HSV FcR结合伴侣胞外域是HSV2 gI2胞外域，其包含或由以下组成：在SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-256)，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。适宜地，HSV FcR胞外域具有选自表2或图78中所示序列的序列。在一个优选实施方式中，HSV FcR胞外域是HSV2 gE2胞外域，其与SEQ ID NO:8至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％相同。
适宜地，与在SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列相比，HSV FcR结合伴侣HSV2 gI2胞外域可以包含一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换、缺失或插入。
在另一个实施方式中，HSV FcR结合伴侣是HSV2 gI2胞外域，其包含或由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-262的氨基酸序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。适宜地，与对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-262的氨基酸序列相比，HSV FcR结合伴侣HSV2 gI2胞外域可以包含一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换、缺失或插入。
在另一个实施方式中，HSV FcR结合伴侣胞外域是HSV1 gI1胞外域，其包含或由以下组成：在SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-270)，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。在一个优选实施方式中，HSV FcR胞外域是HSV1 gE1胞外域，其与SEQ ID NO:10至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％相同。
适宜地，与在SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列相比，HSV FcR结合伴侣HSV1 gI1胞外域可以包含一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换、缺失或插入。
在另一个实施方式中，HSV FcR结合伴侣是HSV1 gI1胞外域，其包含或由以下组成：对应于SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-276的氨基酸序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。适宜地，与对应于SEQ ID NO：4的氨基酸残基1-276的氨基酸序列相比，HSV FcR结合伴侣HSV1 g11胞外域可以包含一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替换、缺失或插入。
在感染HSV的受试者中检测到针对gD、gB和gC的抗体，并且在较小程度上检测到gH/gL。主要的中和应答是针对gD的(Cairns，Tina M.等，″Dissection of the antibodyresponse against herpes simplex virus glycoproteins in naturally infectedhumans.″Journal of virology 88.21(2014)：12612-12622)。
在一个实施方式中，所述HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体不与免疫显性HSV抗原(例如，gD1或gD2)联合施用于受试者。
免疫显性是一种免疫现象，其中免疫应答仅针对病原体产生的抗原肽的一个子集。已证明抗体介导和细胞介导的免疫具有免疫显性。如本文所用，“免疫显性抗原”是包含免疫显性表位的抗原。免疫显性病毒抗原是病毒来源的免疫显性抗原。相比之下，“亚显性抗原”是不包含免疫显性表位的抗原，或者换句话说，仅包含亚显性表位的抗原。如本文所用，“免疫显性表位”是与来自相同病原体的其他表位相比，在对病原体的免疫应答期间中和抗体主要靶向或靶向程度更高的表位。如本文所用，“亚显性表位”是与来自同一病原体的其他表位相比，在对病原体的免疫反应期间中和抗体未靶向或靶向程度较低的表位。例如，gD2是针对HSV2的免疫显性抗原和gD1是针对HSV1的免疫显性抗原。相比之下，gB2、gC2、gE2/gI2和gH2/gL2是HSV2的亚显性抗原，以及gB1、gC1、gE1/gI1和gH1/gL1异二聚体是HSVl的亚显性抗原。
适宜地，其中HSV Fc受体是HSV2 gE2或HSV1 gE1，Fc受体或其免疫原性片段或变体不与HSV2 gD2或HSV1 gD1或其包含免疫显性表位的片段一起施用于受试者。在一个特定实施方式中，其中HSV Fc受体是HSV2 gE2，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体不与HSV2gD2或其包含免疫显性表位的片段一起施用于受试者。在另一个特定实施方式中，其中HSVFc受体是HSV1 gE1，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体不与HSV1 gD1或其包含免疫显性表位的片段一起施用于受试者。
HSV1和HSV2的糖蛋白gC也通过抑制补体参与免疫逃逸机制(Awasthi,Sita等，"Blocking herpes simplex virus 2 glycoprotein Eimmune evasion as an approachto enhance efficacy of a trivalent subunit antigen vaccine for genitalherpes."Journal of virology 88.15(2014):8421-8432)。
在一个实施方式中，HSV Fc受体是HSV2 gE2，并且与HSV2 gC2或其免疫原性片段或变体一起向受试者施用。
在一个实施方式中，HSV Fc受体是HSV1 gE1，并且与HSV1 gC1或其免疫原性片段或变体一起向受试者施用。
在一个方面中，本发明提供了一种重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体，其中与相应的天然HSV Fc受体相比，HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人抗体Fc结构域结合的能力降低或消除。
适宜地，与HSV Fc受体或其免疫原性片段的天然序列相比，重组HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体包含一个或多个氨基酸替换、缺失或插入，与天然HSV Fc受体相比，其降低或消除HSV FcR或其免疫原性片段或变体与抗体Fc结构域之间的结合亲和性。
在一个优选实施方式中，重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的kon低于相应的天然HSV FcR与人IgG之间的kon(慢结合剂)。在一个优选实施方式中，重组HSVFcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的koff高于相应的天然HSV FcR与人IgG之间的koff(快速释放剂)。在一个更优选的实施方式中，重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的kon低于对应的天然HSV FcR与人IgG之间的kon，并且重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的koff高于相应的天然HSV FcR与人IgG之间的koff(慢结合剂/快速释放剂)。
在一个优选实施方式中，重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的平衡解离常数(KD)高于相应的天然HSV FcR与人IgG之间的KD。
在一个优选实施方式中，重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的相对亲和性低于相应天然病毒FcR和人IgG之间亲和性的100％，例如，低于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或10％。在一个更优选的实施方式中，重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体和人IgG之间的相对亲和性低于相应天然HSV FcR和人IgG之间亲和性的15％、更优选地还低于10％。
在一个优选实施方式中，重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的平衡解离常数(KD)高于2x10-7M，优选地高于5x10-7M，更优选地高于1x10-6M。
或者，HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人抗体Fc结构域结合的能力可以通过测量在BiLayer Interferometry测定中的应答(以nm表示)来评估。
在一个优选实施方式中，在BiLayer Interferometry测定中对应于HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的结合的应答小于用相应的天然HSV FcR获得的应答的80％，适当地小于70％、60％、50％、40％。在一个优选实施方式中，在BiLayerInterferometry测定中对应于HSV FcR或其免疫原性片段或变体与人IgG之间的结合的应答小于0.4nm，适宜地小于0.3nm、0.2nm或0.1nm。
在一个优选实施方式中，重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体是HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体。适宜地，重组HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体在选自SEQ ID NO:1所示的HSV2 gE2序列的N241、H245、A246、A248、R314、P317、P318、P319、F322、R320、A337、S338或V340的位置处包含一个或多个突变(插入、替换或缺失)。
可以在本文中使用的以降低或消除重组HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体和抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变包括(例如，至少一种)选自以下的在SEQ IDNO:1中所示序列的单点替换突变：H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P和V340W。
可以在本文中使用的以降低或消除重组HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体与抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括(例如，至少一种)选自以下的在SEQ IDNO:1中所示序列的双点替换突变：H245A和P319A；H245A和P319R；H245A和P319G；H245A和P319K；H245A和P319T；N241A和R320D；N241A和P319D；A246W和P317K；A246W和P317F；A246W和P317S；A246W和R320D；A246W和R320G；A246W和R320T；A248K和V340R；A248K和V340M；A248K和V340W；A248T和V340R；A248T和V340M；A248T和V340W；A248G和V340R；A248G和V340M；A248G和V340W；A248K和F322A；A248K和F322I；A248K和F322P；A248T和F322A；A248T和F322I；A248T和F322P；A248G和F322A；A248G和F322I；A248G和F322P；H245A和R320D；H245A和R320G；H245A和R320T；H245G和R320D；H245G和R320G；H245G和R320T；H245S和R320D；H245S和R320G；H245S和R320T；H245A和P319G；H245A和P319L；H245G和P319G；H245G和P319L；H245S和P319G；H245S和P319L；R314G和P318R；R314G和P318D；R314G和P318I；R314L和P318R；R314L和P318D；R314L和P318I；R314P和P318R；R314P和P318D；R314P和P318I；R314G和F322A；R314G和F322I；R314G和F322P；R314L和F322A；R314L和F322I；R314L和F322P；R314P和F322A；R314P和F322I；R314P和F322P；R314G和V340R；R314G和V340M；R314G和V340W；R314L和V340R；R314L和V340M；R314L和V340W；R314P和V340R；R314P和V340M；R314P和V340W；P317K和V340R；P317K和V340M；P317K和V340W；P317F和V340R；P317F和V340M；P317F和V340W；P317S和V340R；P317S和V340M；P317S和V340W；P317K和S338G；P317K和S338H；P317K和S338L；P317F和S338G；P317F和S338H；P317F和S338L；P317S和S338G；P317S和S338H；P317S和S338L；P318R和S338G；P318R和S338H；P318R和S338L；P318D和S338G；P318D和S338H；P318D和S338L；P318I和S338G；P318I和S338H；P318I和S338L；P319G和V340R；P319G和V340M；P319G和V340W；P319L和V340R；P319L和V340M；P319L和V340W；P317R和P319D；P317R和R320D；P319D和R320D。
可以在本文中使用的以降低或消除重组HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体与抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括(例如，至少一种)在SEQ ID NO:1所示序列的位置P319和/或R320处的缺失突变，单独或与替换突变相结合；特别是选自以下的突变：P319缺失；R320缺失；P319缺失/R320缺失；P319缺失/R320缺失/P317G/P318G；P319缺失/R320缺失/P318E；P319缺失/R320缺失/P318G；P319缺失/R320缺失/P318K；P319缺失/R320缺失/P317R/P318E；P319缺失/R320缺失/P317R/P318G；P319缺失/R320缺失/P317R/P318K；P319缺失/R320缺失/P317G/P318K。
可以在本文中使用的以降低或消除重组HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体与抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括(例如，至少一种)选自以下的插入突变：
·SEQ ID NO:1的氨基酸残基Y275和E276之间的肽序列LDIGE插入(275_插入_LDIGE)；
·SEQ ID NO:1的氨基酸残基S289和P290之间的肽序列ADIGL插入(289_插入ADIGL)；
·SEQ ID NO:1的氨基酸残基A337和S338之间的肽序列ARAA插入(337_插入_ARAA)；
·SEQ ID NO:1的氨基酸残基S338和T339之间的肽序列ARAA插入(338_插入_ARAA)；和
·SEQ ID NO:1的氨基酸残基H346和A347之间的肽序列ADIT插入(346_插入_ADIT)。
在一个优选实施方式中，HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体相对于SEQ ID NO:1中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：289_插入ADIGL；338_插入ARAA；H245K；P317R；P319R；P319G；P319K；H245A_P319R；H245A_P319G；H245A_P319K；H245A_P319T；P319D；S338D；R320D；N241A_R320D；A248K_V340M；P318Y；A248K_V340R；A248T_V340W；A248K_V340W；A246W_R320G；A246W_P317K；A246W_R320D；A246W_R320T；V340W；A248G_V340W；H245G_R320D；P318D；A246W_P317F；P319G_V340W；A248T_V340M；P317K_V340W；V340F；V340D；H245A_R320D；P317F_V340W；A246W_P317S；H245S_R320D；R314G_P318D；A248T；P318S；P317K；P317S_V340W；H245D；R314P_V340W；R314L_318D；P319L_V340W；P317F；P318D_S338G；R314G_V340W；P317K_S338H；R314L_V340W；P318R；P318Q；P317F_S338G；R314G_P318I；H245G_P319G；P317L；P318I；A248T_F322A；H245E；P318T；P318R_S338G；P318D_S338H；P317F_S338H；A248T_V340R；A248T_F322I；H245A_R320G；P318R_S338H；H245S_R320G；P317K_S338G；A248T_F322P；V340R；R314L_P318R；H245S_R320T；R314G_P318R；R320E；H245G_R320G；H245A_R320T；A246W；P318I_S338G；P317K_V340M；P317I；R320H；R314P_P318I；P318I_S338H；P317F_V340M；H245A_P319G；H245A_P319L；R320P；H245G_R320T；R314L_V340R；P319G_V340R；R314G_F322I；R314L_P318I；R320A；R314N；P317F_V340R；P318D_S338L；A248G_V340R；R314E；R314P_P318D；H245S_P319G；V340Q；A248K_F322I；R320G；H245S_P319L；R314F；P319L；P317K_S338L；P319L_V340M；P317G；R320S；R320Q；R314P_V340R；V340A；H245G_P319L；R320T；R314P_P318R；A248G_F322I；R320N；P317N；R314D；R314Y；R314P_F322I；P319G_V340M；P317S_V340R；R314V；P317R_P319D；P317R_R320D；P319D_R320D；Δ319_Δ320；P317G_P318G_Δ319_Δ320；P318E_Δ319_Δ320；P318G_Δ319_Δ320；P318K_Δ319_Δ320；P317R_P318E_Δ319_320；P317R_P318G_Δ319_Δ320和P317G_P318K_Δ319_Δ320。
在一个更优选的实施方式中，HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体相对于SEQ IDNO:1中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：338_插入ARAA；P317R；P319D；R320D；A248T_V340W；V340W；A248T；P318I和A246W。
其他HSV2 gE2序列(例如表1中列出的序列和图77中呈现的比对中所示的序列)中与上文列出的示例性单替换和双替换突变、选择和插入突变相应的突变也在本发明的范围内。
上文列出的示例性单和双替换突变和插入突变的所有可能组合也在本发明的范围内。
在一个优选实施方式中，重组HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体是如本文所述的重组HSV2 gE2胞外域。
在另一个实施方式中，重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体是重组HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体。适宜地，重组HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体在选自SEQ IDNO:3中所示HSV1 gE1序列的H247、P319和P321位置处包含一个或多个突变(插入、替换或缺失)。
可以在本文中使用的以降低或消除重组HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体与抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变包括选自以下的在SEQ ID NO:3中所示序列的单点替换突变：H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A和R322D，以及选自以下的在SEQ ID NO:3中所示序列的双点替换突变：H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G和A340G/S341G/V342G。
可以在本文中使用的以降低或消除重组HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体与抗体Fc结构域之间的结合亲和性的示例性突变还包括(例如，至少一种)选自以下的插入突变：
·SEQ ID NO:3的氨基酸残基Y277和E278之间的肽序列LDIGE插入(277_插入_LDIGE)；
·SEQ ID NO:3的氨基酸残基S291和P292之间的肽序列ADIGL插入(291_插入ADIGL)；
·SEQ ID NO:3的氨基酸残基A339和A340之间的肽序列ARAA插入(339_插入_ARAA)；
·SEQ ID NO:3的氨基酸残基A340和S341之间的肽序列ARAA插入(340_插入_ARAA)；和
·SEQ ID NO:3的氨基酸残基D348和A349之间的肽序列ADIT插入(348_插入_ADIT)。
在一个优选实施方式中，HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体相对于SEQ ID NO:3中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：P321K；P321D；R322D；N243A_R322D；N243A_P321D；A340G_S341G_V342G；H247G_P319G；P321R；H247A_P321K；291_插入ADIGL；339_插入ARAA；P319R；P319G_P321G和H247A_P321R。
在一个更优选的实施方式中，HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体相对于SEQ IDNO:3中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：P321D；R322D；A340G_S341G_V342G和P319R。
在一个实施方式中，提供了一种用于本文所述用途的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
-与相应的天然HSV Fc受体相比，其所述变体结合人抗体Fc结构域的能力降低或消除
-所述用途不包括与HSV2 gD2或其包含免疫显性表位的片段一起向受试者施用。
优选地，编码的Fc受体是gE2(任选地与其结合伴侣gI2组合)，并且其变体包含针对SEQ ID NO:1中所示序列的突变或突变组合，其选自：338_插入ARAA；P317R；P319D；R320D；A248T_V340W；V340W；A248T；P318I和A246W。
在一个其他实施方式中，提供了一种编码用于本文所述用途的HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体的核酸，其中：
-与相应的天然HSV Fc受体相比，其所述变体结合人抗体Fc结构域的能力降低或消除，和
-所述用途不包括与HSV1 gD1或其包含免疫显性表位的片段一起向受试者施用。
优选地，编码的Fc受体是gE1(任选地与其结合伴侣gI1组合)，并且其变体包含针对SEQ ID NO:3中所示序列的突变或突变组合，其选自：H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A和R322D、H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G和A340G/S341G/V342G。
其他HSV1 gE1序列中与上文列出的示例性单替换和双替换突变和插入突变相对应的突变也在本发明的范围内。
上文列出的示例性单替换和双替换突变和插入突变的所有可能组合也在本发明的范围内。
在一个优选实施方式中，重组HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体是如本文所述的重组HSV1 gE1胞外域。
在一个优选实施方式中，重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体是与来自所述病毒的结合伴侣或其片段的异二聚体的一部分。
在一个优选实施方式中，重组HSV Fc受体是重组HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体和结合伴侣是如本文所述的HSV2 gI2或其片段。
在另一个优选实施方式中，重组HSV Fc受体是重组HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体和结合伴侣是如本文所述的HSV1 gI1或其片段。
在另一个实施方式中，重组HSV FcR或其免疫原性片段或变体是与来自所述HSV病毒的结合伴侣或其片段的异二聚体的一部分。在一个其他实施方式中，HSV Fc受体是HSV2gE2和结合伴侣是HSV2 gI2。在另一个实施方式中，HSV Fc受体是HSV1 gE1和结合伴侣是HSV1 gI1。
治疗用途和组合物
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含HSV2Fc受体或其免疫原性片段或变体以及药学上可接受的载体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。在药物组合物的一个实施方式中，HSV2 Fc受体是HSV2 gE2和结合伴侣是HSV2 gI2。优选地，药物组合物用作泛HSV疫苗。
在本发明的一个进一步的方面中，提供了一种药物组合物，其包含HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体以及药学上可接受的载体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。在药物组合物的一个实施方式中，HSV1 Fc受体是HSV1 gE1和结合伴侣是HSV1 gI1。优选地，药物组合物用作泛HSV疫苗。
在另一个方面中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体以及药学上可接受的载体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。在一个其他方面中，提供了一种免疫原性组合物，其包含HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体以及药学上可接受的载体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。适宜地，可以通过将免疫原性组合物悬浮或溶解在药学或生理学可接受的载体中来制备用于施用的免疫原性组合物。优选地，本发明的免疫原性组合物适合用作治疗性疫苗。更优选地，免疫原性组合物用作泛HSV疫苗。
“药学上可接受的载体”包括任何本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的载体。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。此类载体是本领域普通技术人员熟知的。组合物还可以包含药学上可接受的稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌无热原的、磷酸盐缓冲生理盐水是典型的载体。合适的载体可能在很大程度上取决于施用途径。
适宜地，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体通过本领域已知的任何途径施用于受试者，包括肌内、阴道内、静脉内、腹膜内、皮下、表皮、皮内、鼻内、瘤内或口服施用。
在一个实施方式中，受试者是脊椎动物，如哺乳动物，例如，人、非人灵长类或兽用哺乳动物(家畜或伴侣动物)。在一个优选实施方式中，受试者是人。
在一个优选实施方式中，在使用HSV(HSV1或HSV2)FcR或其免疫原性片段或变体治疗前，受试者已被病毒感染(即，血清反应阳性)，病毒是例如HSV2和/或HSV1。在用HSV FcR或其免疫原性片段或变体治疗之前已经感染病毒的受试者可能已经表现出感染的临床症状(有症状的受试者)或可能没有表现出病毒感染的临床症状(无症状的受试者)。在一个实施方式中，随时间推移有症状的受试者已经具有几次具有感染临床症状的发作(复发)，这些发作被无临床症状的时期所分隔。
在一个方面中，本发明提供了一种HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV2 FcR或其免疫原性片段或变体的核酸，其用于i)在向受试者施用时诱导针对HSV-1的交叉反应性免疫应答和ii)用于治疗复发性疱疹感染，或用于预防受试者，优选人类受试者中复发性疱疹病毒感染或降低其频率的方法。在一个实施方式中，HSV2 Fc受体是HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体。在另一个实施方式中，HSV Fc受体是HSV2 gE2/gI2异二聚体或其免疫原性片段或变体。在一个其他实施方式中，用于本文所述用途的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体用作泛HSV疫苗。
在一个进一步的方面中，本发明提供了一种HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV1 FcR或其免疫原性片段或变体的核酸，其用于i)在向受试者施用时诱导针对HSV-2的交叉反应性免疫应答和ii)用于治疗复发性疱疹感染，或用于预防受试者，优选人类受试者中复发性疱疹病毒感染或降低其频率的方法。在一个实施方式中，HSV1Fc受体是HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体。在另一个实施方式中，HSV Fc受体是HSV1gE1/gI1异二聚体或其免疫原性片段或变体。在一个其他实施方式中，用于本文所述用途的HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体用作泛HSV疫苗。
在一个方面中，本发明提供了一种HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV2 FcR或其免疫原性片段或变体的核酸，如本文所述，其用于制备免疫原性组合物，在向受试者施用时所述免疫原性组合物诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。
在一个进一步的方面中，本发明提供了一种HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV1 FcR或其免疫原性片段或变体的核酸，如本文所述，其用于制备免疫原性组合物，在向受试者施用时所述免疫原性组合物诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。
在一个方面中，本发明提供了HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV2 FcR或其免疫原性片段或变体的核酸，如本文所述，在制备用于预防或治疗疱疹感染或疱疹相关疾病的药物中的用途，其中在向受试者施用时HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体能够诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。
在一个进一步的方面中，本发明提供了HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV1 FcR或其免疫原性片段或变体的核酸，如本文所述，在制备用于预防或治疗疱疹感染或疱疹相关疾病的药物中的用途，其中在向受试者施用时HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体能够诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。
在一个方面中，本发明提供了一种HSV2 gE2或gE2/gI2异二聚体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV2 gE2或其免疫原性片段或变体的核酸，如本文所述，其用于制备免疫原性组合物，其中在向受试者施用时所述免疫原性组合物能够诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。
在一个进一步的方面中，本发明提供了一种HSV1 gE1或gE1/gI1异二聚体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV1 gE1或其免疫原性片段或变体的核酸，如本文所述，其用于制备免疫原性组合物，其中在向受试者施用时所述免疫原性组合物能够诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。
在一个方面中，本发明提供了HSV2 gE2或gE2/gI2异二聚体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV2 gE2或gE2/gI2异二聚体或其免疫原性片段或变体的核酸，如本文所述，在制备用于预防或治疗i)HSV2感染或HSV2相关疾病和ii)HSV1感染或HSV1相关疾病的药物中的用途，其中在向受试者施用时HSV2 gE2或gE2/gI2异二聚体或其免疫原性片段或变体能够诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。
在一个进一步的方面中，本发明提供了HSV1 gE1或gE1/gI1异二聚体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV1 gE1或gE1/gI1异二聚体或其免疫原性片段或变体的核酸，如本文所述，在制备用于预防或治疗i)HSV1感染或HSV1相关疾病和ii)HSV2感染或HSV2相关疾病的药物中的用途，其中在向受试者施用时HSV1 gE1或gE1/gI1异二聚体或其免疫原性片段或变体能够诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。
在一个方面中，本发明提供了一种在有需要的受试者中预防或治疗疱疹病毒感染或疱疹病毒相关疾病的方法，其包括向受试者施用免疫学有效量的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV2 FcR或其免疫原性片段或变体的核酸，其中在向受试者施用时HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体能够诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。在一个实施方式中，疱疹病毒感染是HSV1感染和疱疹病毒相关疾病是HSV1相关疾病。在一个其他实施方式中，HSV2 Fc受体是HSV2 gE2或gE2/gI2异二聚体，或其免疫原性片段或变体。
在一个进一步的方面中，本发明提供了一种在有需要的受试者中预防或治疗疱疹病毒感染或疱疹病毒相关疾病的方法，其包括向受试者施用免疫学有效量的HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体，或者编码所述HSV1 FcR或其免疫原性片段或变体的核酸，其中在向受试者施用时HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体能够诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。在一个实施方式中，疱疹病毒感染是HSV2感染和疱疹病毒相关疾病是HSV2相关疾病。在一个其他实施方式中，HSV1 Fc受体是HSV1 gE1或gE1/gI1异二聚体，或其免疫原性片段或变体。
本发明的一个进一步的方面提供了一种治疗HSV1感染的受试者或在受试者中预防HSV1感染的方法，其包括向受试者施用免疫学有效量的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体和诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。
本发明的又一个进一步的方面提供了一种治疗HSV2感染的受试者或在受试者中预防HSV2感染的方法，其包括向受试者施用免疫学有效量的HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体和诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。
还提供了一种方法，其包括向受试者施用Fc受体，其是HSV2gE2或HSV1 gE1，并且不与免疫显性的病毒抗原(例如，HSV2 gD2或HVS1 gD1)一起施用。
还提供了一种方法，其包括以免疫学有效量向受试者施用HSVFc受体或其免疫原性片段或变体，以及HSV2 gC2或其免疫原性片段或HSV1 gC1或其免疫原性片段。
还提供了一种方法，其包括以免疫学有效量向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体以及药学上可接受的载体，并且在向受试者施用时诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。
还提供了一种方法，其包括以免疫学有效量向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含HSV1Fc受体或其免疫原性片段或变体以及药学上可接受的载体，并且在向受试者施用时诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。
如本文所用，术语“治疗(treat)”和“处理(treatment)”以及由此产生的词语，并不意味着对所有个体正在治疗的疾病的“治愈”，或在任何特定群体中100％有效治疗。而是，存在本领域普通技术人员认可具有一种或多种有益治疗效果的不同程度的治疗。在这方面，本发明的方法和用途可以在需要这种治疗的受试者中提供任何水平的疱疹病毒感染特别是HSV2和/或HSV1相关疾病的治疗，并且可以包括减少疱疹病毒感染以及特别是HSV2和/或HSV1相关疾病的一种或多种状况或症状随着时间的推移复发的严重程度、持续时间或次数。
如本文所用，“治疗性免疫接种”或“治疗性疫苗接种”是指将本发明的免疫原性组合物施用于受试者，优选人受试者，其在施用时已知感染了病毒如疱疹病毒，特别是HSV2和/或HSV1，以治疗病毒感染或病毒相关疾病。如本文所用，“预防性免疫接种”或“预防性疫苗接种”是指将本发明的免疫原性组合物施用于受试者，优选人受试者，其在施用时未感染病毒如疱疹病毒，特别是HSV2和/或HSV1，以预防病毒感染或病毒相关疾病。
为了本发明的目的，HSV感染的治疗旨在预防潜伏HSV感染状态的重新激活事件或在早期控制病毒复制以减少在原发性HSV感染之后发生的病毒脱落和临床表现(即，复发性HSV感染)。因此，治疗可以预防HSV有症状和/或无症状的重新激活(也称为复发性HSV感染)，包括无症状的病毒脱落。因此，治疗可降低有症状个体重新激活后HSV感染复发的严重程度、持续时间和/或发作次数。预防无症状的重新激活和从粘膜部位脱落也可以减少或预防感染传播给那些未接触过HSV病毒(即HSV2、HSV1或这两者)的个体。这包括预防通过性交传播HSV，特别是HSV2的传播，但也包括通过性交潜在的传播HSV1。因此，本发明的免疫原性构建体可以实现以下任何有用的目标：预防或减少无症状病毒脱落，减少或预防有症状疾病的复发，减少有症状疾病的持续时间或严重程度，降低复发频率，延长距复发的时间，增加在给定时间点无复发的受试者比例，减少抗病毒药物的使用，并预防性伴侣之间的传播。
特别地，在向受试者施用时用于诱导针对HSV-1的交叉反应性免疫应答的本文所述的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体和免疫原性组合物可用作治疗性疫苗，以治疗或预防需要此类治疗的受试者的复发性病毒感染。优选地，治疗性疫苗是泛HSV治疗性疫苗。优选地，受试者是人。
而且，在向受试者施用时用于诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答的本文所述的HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体和免疫原性组合物可用作治疗性疫苗，以治疗需要此类治疗的受试者的复发性病毒感染。优选地，治疗性疫苗是泛HSV治疗性疫苗。优选地，受试者是人。
泛HSV疫苗显示出针对HSV1和HSV2两者(即，HSV的这两种血清型)的体液和/或细胞免疫应答。因此，如本文所述的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体可以用作用于针对HSV的两种类型HSV1和HSV2的泛HSV疫苗。以这种方式，仅由一种类型的HSV制备的抗原的生产就足以产生针对所有HSV血清型的疫苗，而不需要额外的生产要求和用来自HSV的两种血清型的抗原生产疫苗的复杂性。
适宜地，本文所述的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体和免疫原性组合物不是预防性疫苗的一部分。
本文提供的使用方法可针对HSV2和HSV1感染(因此针对HSV2和HSV1相关疾病，即分别针对生殖器疱疹和唇疱疹)，或针对HSV2感染(因此主要针对生殖器疱疹的治疗)，或HSV1感染(因此主要针对唇疱疹的治疗)。
“免疫学有效量”旨在指以单剂量或作为一系列剂量的一部分向受试者施用的抗原(或包含抗原的免疫原性组合物)的量，该量对于在受试者中诱导针对所施用的抗原的可测量的免疫应答是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如，人类、非人类灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、组合物或疫苗的配方、主治医生对医疗状况的评估、疾病的严重程度、所施用的化合物的效力、施用方式和其他相关因素而变化。本文所公开的疫苗通常是治疗性的。在一些实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物可诱导针对疱疹病毒感染的有效免疫应答，即足以治疗或预防疱疹病毒感染如复发性HSV感染的应答。下文提供了包含如本文所述的核酸构建体的免疫原性组合物或疫苗的进一步用途。将容易理解，本文所述的HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体和免疫原性组合物适用于涉及出于治疗目的随时间重复递送HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体的方案。适宜地，可以使用初免-加强方案。初免-加强指在同一个体中激发两次分开的免疫应答：(i)免疫系统的初始启动，然后(ii)在初级免疫应答建立数周或数月后，进行免疫系统的二次启动或加强。优选地，在向受试者施用初免组合物后约2至约12周，例如，在施用初免组合物后约2、3、4、5或6周，施用加强组合物。在一个实施方式中，在施用初免组合物后一个月或两个月施用加强组合物。在一个实施方式中，第一加强组合物在初免组合物后一或两个月施用，第二加强组合物在第一加强组合物后一或两个月施用。
剂量将主要取决于诸如施用途径、所治疗的病症、受试者的年龄、体重和健康等因素，因此可能因受试者而异。例如，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体的治疗有效成人剂量可以包含1至250μg，例如，2至100μg HSV FcR或其免疫原性片段或变体，例如，约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg HSV FcR或其免疫原性片段或变体。
当将HSV FcR结合伴侣或其片段与HSV FcR或其免疫原性片段或变体一起施用于受试者时，治疗有效的成人剂量的HSV FcR结合伴侣或其片段可包含5至250μg，例如，10至100μg HSV FcR结合伴侣或其片段，例如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg HSVFcR结合伴侣或其片段。
在一个优选实施方式中，当将HSV FcR结合伴侣或其片段与HSv FcR或其免疫原性片段或片段一起施用于受试者时，HSV FcR免疫原性片段或变体和HSV FcR结合伴侣或其片段的化学计量比为约1:1。
在通常情况下，人剂量将在0.1ml至2ml之间的体积。因此，例如，本文所述的组合物可配制为每个个体或组合免疫原性组分约0.1、0.15、0.2、0.5、1.0、1.5或2.0ml人剂量的体积。
本领域技术人员可以根据施用途径和治疗受试者调整这些剂量。
可以监测针对HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体的治疗性免疫应答以确定是否需要加强(如果有的话)。评估免疫应答(例如，在血清中的CD4+T细胞应答、CD8+T细胞应答、抗体效价)后，可以施用可选的加强免疫接种。
适用于评估针对根据本发明的HSV Fc受体或其片段的免疫应答的体外或体内测试方法是本领域技术人员已知的。例如，可以测试HSV Fc受体或其片段或变体对特定目标淋巴细胞类型(例如，B细胞、T细胞、T细胞系和T细胞克隆)的增殖或效应功能的诱导作用。例如，可以分离来自免疫小鼠的脾细胞并且可以评估细胞毒性T淋巴细胞溶解含有根据本发明的HSV Fc受体或其片段的自体靶细胞的能力。此外，可以通过胞质细胞因子染色和流式细胞术分析测量CD4+T细胞中TH1(IL-2、TNF-α和IFN-γ)细胞因子的增殖或产生来分析T辅助细胞分化。还可以测试根据本发明的HSV Fc受体或其片段或变体诱导体液免疫应答的能力，正如所证明的，例如，通过研究引流淋巴结中B细胞的激活，通过测量B细胞产生的特异性针对血清中目标HSV抗原的抗体。这些测定可以使用例如来自免疫个体的外周B淋巴细胞进行。
核酸
在一个进一步的方面中，本发明提供了一种编码本发明的HSV 1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体的核酸。
术语“核酸”通常是指任何长度的核苷酸的聚合形式，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。其包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合物。还包括DNA或RNA类似物，如那些含有修饰骨架(例如，肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰碱基的类似物。因此，本公开的核酸包括mRNA、DNA、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体等。当核酸以RNA的形式出现时，其可能有也可能没有5’帽。如本文所公开的核酸分子可以采取多种形式(例如，单链、双链)。核酸分子可以是环状的或支链的，但通常是线形的。
本文所用的核酸优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其他核酸(例如，不含天然存在的核酸)，通常纯度至少约50％(按重量计)，以及通常至少约90％纯度。
本发明的核酸分子可以通过任何合适的方式生产，包括重组生产、化学合成或其他合成方式。适宜的生产技术是本领域众所周知的。通常，本发明的核酸将是重组形式，即在自然界中不存在的形式。例如，除了编码病毒Fc受体或其片段或异二聚体的核酸序列外，核酸还可以包含一个或多个异源核酸序列(例如，编码另一种抗原的序列和/或控制序列如启动子或内部核糖体进入位点)。与编码病毒Fc受体或其片段或异二聚体的天然存在的序列相比，可以修饰核酸的序列或化学结构。可以对核酸分子的序列进行修饰，例如，以增加核酸表达或复制的有效性，或提供额外的稳定性或抗降解性。
可以对编码HSV Fc受体或其片段或变体的核酸分子进行密码子优化。“密码子优化”意指关于密码子使用的修饰，其可以增加核酸的翻译效率和/或半衰期。聚腺苷酸尾(例如，约30个或更多的腺苷残基)可以连接到RNA的3’端以增加其半衰期。RNA的5’端可以用具有m7G(5’)ppp(5’)N结构(帽0结构)的修饰核糖核苷酸或其衍生物加帽，其可以在RNA合成过程中掺入或可以在RNA转录后酶促工程化(例如，通过使用由mRNA三磷酸酶、鸟苷酰转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶组成的牛痘病毒加帽酶(VCE)，其催化N7-单甲基化帽0结构的构建)。帽0结构在维持RNA分子的稳定性和翻译效率方面起着重要作用。RNA分子的5’帽可以被2’-O-甲基转移酶进一步修饰，这导致产生帽1结构(m7Gppp[m2’-O]N)，这可以进一步提高翻译效率。
在一个优选实施方式中，核酸编码的HSV2或HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体是与来自HSV的结合伴侣或其片段的异二聚体，其中HSV2或HSV1 FcR或其免疫原性片段或变体的表达在亚基因组启动子的控制下，适宜地为在SEQ ID NO：126中所示的26S亚基因组启动子，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
在一个优选实施方式中，核酸编码异二聚体，所述异二聚体包含i)HSV2或HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体和ii)来自HSV或其片段的结合伴侣，其中HSV2或HSV1 FcR或其免疫原性片段或变体的表达在亚基因组启动子的控制下，适宜地为在SEQ ID NO：126中所示的26S亚基因组启动子，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
在一个优选实施方式中，HSV1或HSV2 FcR或其免疫原性片段或变体和其结合伴侣或其片段由内部核糖体进入位点(IRES)序列所分隔。在一个优选实施方式中，IRES序列是IRES EV71序列。在一个优选实施方式中，IRES序列包含或由以下组成：在SEQ ID NO：127中所示的序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
在另一个实施方式中，编码HSV2或HSV1 FcR或其免疫原性片段或变体和其结合伴侣或其片段的序列由2A“自切割”肽序列所分隔。在一个实施方式中，2A“自切割”肽序列是GSG-P2A序列，适宜地包含或由以下组成：在SEQ ID NO：124中所示的序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。在一个实施方式中，2A“自切割”肽序列是F2A序列，适宜地包含或由以下组成：在SEQ ID NO：125中所示的序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
在又一个实施方式中，编码HSV2或HSV1 FcR或其免疫原性片段或变体和其结合伴侣或其片段的序列由亚基因组启动子所分隔。在一个实施方式中，亚基因组启动子是26S亚基因组启动子，适宜地包含或由以下组成：在SEQ ID NO：126中所示的序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
例如，用于本发明的核酸分子可以是RNA或DNA，如质粒DNA。在一个优选实施方式中，核酸分子是RNA分子。
载体，宿主细胞
本文描述了一种载体，其包含用于根据本发明用途的核酸。
载体可以是任何合适的核酸分子，包括裸DNA或RNA、质粒、病毒、粘粒(cosmid)、噬菌体载体如λ载体、人工染色体如BAC(细菌人工染色体)或附加体(episome)。或者，载体可以是用于无细胞体外转录或表达的转录和/或表达单位，如T7相容系统。载体可以单独使用或与其他载体如腺病毒序列或片段组合使用，或与来自非腺病毒序列的元件组合使用。适宜地，载体相对于野生型序列已经发生了实质性改变(例如，基因或功能区缺失和/或失活)，并且当被引入宿主细胞时复制并表达插入的多核苷酸序列。
本文还描述了一种细胞，其包含HSV2或HSV 1Fc受体或其片段或变体，或者编码其的核酸或载体。
用于根据本发明的用途的HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体、或HSV FcR结合伴侣或其片段适当地通过重组技术产生。“重组”指多核苷酸是克隆、限制性或连接步骤或产生不同于自然界中发现的多核苷酸的多核苷酸的其他程序中的至少一种的产物。重组载体是包含重组多核苷酸的载体。
在一个实施方式中，如本文所述的异二聚体由多顺反子载体表达。适宜地，异二聚体从单一载体表达，其中编码HSV FcR或其免疫原性片段或变体及其结合伴侣或其片段的核酸序列由内部核糖体进入位点(IRES)序列所分隔(Martin等，″IRESite：thedatabase of experimentally verified IRES structures(WWW.iresite.org).″Nucleic acids research 34.suppl_1(2006)：D125-D130)。在一个优选实施方式中，IRES是IRES EV71序列。在一个优选实施方式中，IRES包含或由以下组成：在SEQ ID NO：127中所示的序列，或与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的来自其的变体。
或者，这两个核酸序列可以被病毒2A或“2A样”序列分开，从而产生两个单独的多肽。2A序列已知来自各种病毒，包括口蹄疫病毒、马鼻炎A病毒、明脉扁刺蛾(Thoseaasigna)病毒和猪捷申病毒(theschovirus)-1。参见，例如，Szymczak等，NatureBiotechnology 22：589-594(2004)，Donnelly等，J Gen Virol.；82(Pt 5)：1013-25(2001)。
任选地，为便于表达和回收，HSV2或HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体和/或HSV FcR结合伴侣或其片段可以在N末端包含信号肽。信号肽可以选自本领域已知的众多信号肽，并且通常被选择以促进在选择用于重组表达的系统中的生产和加工。在一个实施方式中，信号肽是天然存在于天然HSV Fc蛋白或结合伴侣中的一种。来自毒株SD90e的HSV2gE的信号肽位于SEQ ID NO:1的残基1-20处。来自其他HSV毒株的gE蛋白的信号肽可以通过序列比对来识别。来自毒株SD90e的HSV2 gI的信号肽位于SEQ ID NO:2的残基1-20处。来自其他HSV毒株的gI蛋白的信号肽可以通过序列比对来识别。
任选地，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体和/或HSV FcR结合伴侣或其片段可包含添加构成标签的氨基酸序列，其可促进检测(例如，用于单克隆抗体检测的表位标签)和/或纯化(例如，多组氨酸标签以允许在镍螯合树脂上纯化)。在某个实施方式中，可以使用可切割的接头。这允许标签与纯化的复合物分离，例如通过添加能够切割接头的试剂。本领域技术人员公知很多不同的可切割接头。
当本文的宿主细胞在合适的条件下培养时，核酸可以表达HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体、HSV FcR结合伴侣或其片段，和/或异二聚体的这两种肽。然后可以从宿主细胞分泌HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体、HSV FcR结合伴侣或其片段和/或异二聚体。适宜宿主细胞包括，例如，昆虫细胞(例如，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、哺乳动物细胞(例如，人、非人灵长类、马、牛、羊、犬、猫和啮齿类(例如，仓鼠))、禽类细胞(例如，鸡、鸭和鹅)、细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌属(Streptococcusspp.))、酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenual polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、四膜虫细胞(例如，嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila))或其组合。适宜地，宿主细胞应该是具有介导糖基化的酶的细胞。细菌宿主一般不适合这种修饰蛋白，除非宿主细胞经过修饰引入糖基化酶；相反，应该使用真核宿主，如昆虫细胞、禽类细胞或哺乳动物细胞。
合适的昆虫细胞表达系统(如杆状病毒系统)是本领域技术人员公知的，参见例如，Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。适宜的昆虫细胞包括例如Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞和HighFive细胞(来自亲本粉纹夜蛾BTI-TN-5B1-4细胞系(Invitrogen)的克隆分离物)。
禽类细胞表达系统也是本领域技术人员公知的，参见例如，美国专利号5,340,740；5,656,479；5,830,510；6,114,168；和6,500,668；欧洲专利号EP 0787180B；欧洲专利申请号EP03291813.8；WO 03/043415；和WO 03/076601。适宜的禽类细胞包括例如鸡胚干细胞(例如，细胞)、鸡胚成纤维细胞、鸡胚生殖细胞、鸭细胞(例如，AGE1.CR和AGE1.CR.pIX细胞系(ProBioGen)，其描述在例如Vaccine 27:4975-4982(2009)和WO2005/042728中)、EB66细胞等。
优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如，人、非人灵长类、马、牛、羊、犬、猫和啮齿类(例如，仓鼠))。适宜的哺乳动物细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾细胞(HEK-293细胞，通常由剪切的5型腺病毒DNA转化)、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞、HeLa细胞、PERC.6细胞(ECACC保藏号96022940)、Hep G2细胞、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCC CCL-75)、胎儿恒河猴肺细胞(ATCC CL-160)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞、Madin-Darby犬肾(“MDCK”)细胞(例如，MDCK(NBL2)、ATCC CCL34；或MDCK 33016、DSMACC2219)、幼仓鼠肾(BHK)细胞，如BHK21-F、HKCC细胞等。
在某些实施方式中，编码HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体、HSV FcR结合伴侣或其片段和/或异二聚体的重组核酸被密码子优化以在选定的原核或真核宿主细胞中表达。
HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体、HSV FcR结合伴侣或其片段和/或异二聚体可通过本领域熟知的多种方法中的任一种从重组细胞培养物中回收和纯化，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和层析(例如，使用本文所述的任何标记系统)、羟基磷灰石层析和凝集素层析。根据需要，可以使用蛋白重折叠步骤来完成成熟蛋白的构型。最后，在最终纯化步骤中可以使用高效液相色谱(HPLC)。除了上面提到的参考文献以外，多种纯化方法在本领域中是众所周知的，包括，例如，在Sandana(1997)Bioseparation of Proteins，Academic Press，Inc.；和Bollag等，(1996)Protein Methods，第2版，Wiley-Liss，NY；Walker(1996)The ProteinProtocols Handbook Humana Press，NJ，Harris和Angal(1990)Protein PurificationApplications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，U.K.；Scopes(1993)Protein Purification：Principles and Practice，第3版，Springer Verlag，NY；Janson和Ryden(1998)Protein Purification：Principles，High Resolution Methodsand Applications，第2版，Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROMHumana Press，NJ中所示的那些。
术语“纯化(purification)”或“进行纯化(purifying)”是指从组合物或宿主细胞或培养物中去除不希望存在的成分的过程。纯化是一个相对术语，并不要求从组合物中去除所有痕量的不希望成分。在疫苗生产的背景下，纯化包括离心、透析、离子交换色谱和尺寸排阻色谱、亲和纯化或沉淀等过程。因此，“纯化”一词不需要绝对的纯度；相反，其是一个相对术语。可以纯化基本上纯的核酸或蛋白制剂，使得所需的核酸或蛋白占该制剂的总核酸含量的至少50％。在某些实施方式中，基本上纯的核酸或蛋白将占制剂总核酸或蛋白含量的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更多。未经过任何纯化步骤的免疫原性分子或抗原或抗体(即，在自然界中发现的分子)不适用于药物(例如，疫苗)用途。
适宜地，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体、HSV FcR结合伴侣或其片段和/或异二聚体的回收率高于2mg/升，优选高于5、10、15或20mg/升，更优选还高于25mg/升。
适宜地，HSV Fc受体或其免疫原性片段或变体、HSV FcR结合伴侣或其片段或变体和/或异二聚体的聚集水平低于20％，优选低于15或10％，更优选低于5％。
佐剂
在一个优选实施方式中，HSV2或HSV1 Fc受体或其片段或变体与佐剂一起向受试者施用。如本文所用，“佐剂”是指增强预期受试者(如人受试者)中对抗原的免疫应答的组合物。
适宜佐剂的实例包括但不限于无机佐剂(例如，无机金属盐，如磷酸铝或氢氧化铝)、有机佐剂(例如，皂苷，如QS21或角鲨烯)、油基佐剂(例如，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、水包油乳剂、细胞因子(例如，IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、颗粒佐剂(例如，免疫刺激复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解微球)、病毒微体(virosome)、细菌佐剂(例如，单磷酰脂质A，如3-去-O-酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)或胞壁酰肽)、合成佐剂(例如，非离子嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物或合成脂质A)、合成多核苷酸佐剂(例如，聚精氨酸或聚赖氨酸)、Toll样受体(TLR)激动剂(包括TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8和TLR-9激动剂)和含有未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸(“CpG”)。
在一个优选实施方式中，佐剂包含TLR激动剂和/或免疫学活性皂苷。仍优选地，佐剂可包含在脂质体制剂中的TLR激动剂和皂苷或由其组成。TLR激动剂与皂苷之比可以是5:1、4:1、3:1、2:1或1:1。
TLR激动剂在佐剂中的用途是本领域众所周知的，并且例如已由Lahiri等，(2008)Vaccine 26:6777进行了综述。可以被刺激以实现佐剂作用的TLR包括TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9。TLR2、TLR4、TLR7和TLR8激动剂，特别是TLR4激动剂，是优选的。
适宜的TLR4激动剂包括脂多糖，如单磷酰脂质A(MPL)和3-O-去酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。美国专利4,436,727公开了MPL及其制备。美国专利4,912,094和再审查证书B14,912,094公开了3D-MPL及其制备方法。另一种TLR4激动剂是吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)，这是一种合成的脂质A样分子(参见，例如，Fox等，(2012)Clin.Vaccine Immunol19:1633)。在一个进一步的实施方式中，TLR4激动剂可以是合成的TLR4激动剂，如合成的二糖分子，其结构类似于MPL和3D-MPL，或者可以是合成的单糖分子，如氨基烷基氨基葡萄糖磷酸酯(AGP)，例如，在WO9850399、WO0134617、WO0212258、W03065806、WO04062599、WO06016997、WO0612425、WO03066065和WO0190129中公开的。这种分子在科学和专利文献中也被描述为脂质A模拟物。脂质A模拟物与脂质A适当地共享一些功能和/或结构活性，并且在一个方面中被TLR4受体识别。如本文所述的AGP在现有技术中有时称为脂质A模拟物。在一个优选实施方式中，TLR4激动剂是3D-MPL。TLR4激动剂，如3-O-去酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)及其在疫苗中作为佐剂的用途，例如已在WO 96/33739和WO2007/068907中进行了描述，并在Alving等，(2012)Curr Opin in Immunol 24:310中综述。
适宜地，佐剂包含免疫活性皂苷，如免疫活性皂苷组分，如QS21。
在现有技术中已经描述了包含皂苷的佐剂。在以下中对皂苷进行了描述：Lacaille-Dubois和Wagner(1996)A review of the biological and pharmacologicalactivities of saponins,Phytomedicine vol 2:363。皂苷在疫苗中为佐剂。例如，Dalsgaard等，1974("Saponin adjuvants",Archiv.fur die gesamte Virusforschung,Vol.44,Springer Verlag,Berlin,243)描述了Quil A(来源于南美皂皮树(QuillajaSaponaria Molina)的树皮)具有佐剂活性。已通过HPLC分离了Quil A的纯化级分，其保留了佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性(Kensil等，(1991)J.Immunol.146:431)。在US 5,057,540和"Saponins as vaccine adjuvants",Kensil,C.R.,Crit Rev Ther DrugCarrier Syst,1996,12(1-2):1-55中也描述了Quil A级分。
适用于本发明的两种Quil A这样的级分是QS7和QS21(也称为QA-7和QA-21)。QS21是用于本发明的优选的免疫活性皂苷级分。在Kensil(2000)O’Hagan:Vaccine Adjuvants:preparation methods and research protocols,Homana Press,Totowa,New Jersey，第15章，中也对QS21进行了综述。例如，在WO 96/33739、WO 96/11711和WO2007/068907中描述了包含Quil A级分，如QS21和QS7，的颗粒佐剂系统。
除了其他组分，佐剂优选包含甾醇。甾醇的存在可以进一步降低包含皂苷的组合物的反应原性，参见例如，EP0822831。合适的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆固醇。胆固醇特别合适。适宜地，免疫学活性皂苷级分是QS21，QS21与甾醇的比例是从1:100至1:1w/w，如从1:10至1:1w/w，例如，从1:5至1:1w/w。
在一个优选实施方式中，佐剂包含TLR4激动剂和免疫学活性皂苷。在一个更优选的实施方式中，TLR4激动剂是3D-MPL和免疫学活性皂苷是QS21。
在一些实施方式中，佐剂以水包油乳液的形式存在，例如，包含角鲨烯、α-生育酚和表面活性剂(参见例如，WO95/17210)或以脂质体形式存在。脂质体呈递是优选的。
术语“脂质体”在本文中使用时是指封闭水性内部的单层或多层(特别是2、3、4、5、6、7、8、9或10个层，取决于形成的脂质膜的数量)脂质结构。脂质体和脂质体制剂是本领域众所周知的。脂质体呈递是例如在WO 96/33739和WO2007/068907中描述的。能够形成脂质体的脂质包括所有具有脂肪或脂肪样特性的物质。可以构成脂质体中的脂质的脂质可以选自下组，包括甘油脂、甘油磷脂、甘油磷酸鞘脂、甘油磷酸酯、硫脂、鞘脂、磷脂、异戊二烯脂(isoprenolide)、类固醇、硬脂、甾醇、古脂(archeolipid)、合成阳离子脂质和含碳水化合物的脂质。在本发明的特定实施方式中，脂质体包含磷脂。适宜的磷脂包括(但不限于)：磷酸胆碱(PC)，其是磷脂酰胆碱合成的中间体；天然磷脂衍生物：蛋磷酸胆碱、卵磷酸胆碱、大豆磷酸胆碱、氢化大豆磷酸胆碱、鞘磷脂作为天然磷脂；和合成磷脂衍生物：磷酸胆碱(二癸酰-L-a-磷脂酰胆碱[DDPC]、二月桂酰磷脂酰胆碱[DLPC]、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱[DMPC]、二棕榈酰磷脂酰胆碱[DPPC]、二硬脂酰磷脂酰胆碱[DSPC]、二油酰磷脂酰胆碱[DOPC]、1-棕榈酰,2-油酰磷脂酰胆碱[POPC]、二芥酰基(Dielaidoyl)磷脂酰胆碱[DEPC])、磷酸甘油(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[POPG])、磷脂酸(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕榈酰磷脂酸[DPPA]、二硬酯酰-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DSPE]、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸丝氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂。
脂质体的尺寸可以从30nm到几个μm不等，具体取决于磷脂组成和用于制备其的方法。在本发明的特定实施方式中，脂质体尺寸将在50nm至500nm范围内，并且在进一步的实施方式中，在50nm至200nm范围内。动态激光散射是本领域技术人员熟知的用于测量脂质体尺寸的方法。
在特别适宜的实施方式中，在本发明中使用的脂质体包含DOPC和甾醇，特别是胆固醇。因此，在一个特定的实施方式中，本发明的组合物包含脂质体形式的本文所述任何量的QS21，其中所述脂质体包含DOPC和甾醇，特别是胆固醇。
在一个更优选的实施方式中，佐剂在脂质体制剂中包含3D-MPL和QS21。
在一个实施方式中，佐剂在脂质体制剂中包含25至75，如35至65微克(例如，大约或正好50微克)3D-MPL和25至75，如35至65(例如，大约或正好50微克)的QS21。
在另一个实施方式中，佐剂在脂质体制剂中包含12.5至37.5之间，如20至30微克(例如，大约或正好25微克)3D-MPL和12.5至37.5，如20至30微克(例如，大约或正好25微克)的QS21。
在本发明的另一个实施方式中，佐剂包含或由水包油乳剂组成。适宜地，水包油乳剂包含可代谢油和乳化剂。特别适宜地可代谢油是角鲨烯。角鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是一种不饱和油，大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、小麦胚芽油、米糠油和酵母中。在一个实施方式中，可代谢油以组合物总体积的0.5％至10％(v/v)的量存在于免疫原性组合物中。特别适合的乳化剂是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(POLYSORBATE 80或TWEEN 80)。在一个实施方式中，乳化剂在免疫原性组合物中的量为组合物总体积的0.125至4％(v/v)。水包油乳剂可以任选地包含母育酚。母育酚是本领域熟知的，并且描述在EP0382271 B1中。适宜地，母育酚可以是α-生育酚或其衍生物，如α-生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯)。在一个实施方式中，母育酚在佐剂组合物中的量为免疫原性组合物总体积的0.25％至10％(v/v)。水包油乳剂还可任选地包含脱水山梨糖醇三油酸酯(SPAN 85)。
在水包油乳剂中，油和乳化剂应在水性载体中。例如，水性载体可以是磷酸盐缓冲液或柠檬酸。
特别地，用于本发明的水包油乳剂体系具有亚微米范围内的小油液滴尺寸。适当地，液滴尺寸将在120至750nm的范围内，更特别地，直径为120至600nm的尺寸。甚至更特别地，水包油乳剂含有油液滴，其至少70％的强度小于500nm直径，更具体地至少80％的强度小于300nm直径，更具体地至少90％的强度在120至200nm的直径范围内。
应当理解，HSV Fc受体或其片段或变体和佐剂可以分开储存并在施用给受试者之前(临用前)混合。HSV Fc受体或其片段或变体和佐剂也可以分开但同时施用于受试者。
在一个方面中，提供了一种试剂盒，其包含如本文所述的HSV2或HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体和佐剂或由其组成。
序列比较
为了比较两个密切相关的多核苷酸或多肽序列，可以使用比对程序计算第一序列和第二序列之间的“序列同一性”或“同一性％”，如(可在blast.ncbi.nlm.nih.gov上获得，上次访问时间为2016年9月12日)，使用标准设置。同一性百分比是相同残基的数量除以比对的长度，再乘以100。同一性的替代定义是相同残基的数量除以对齐的残基数量，再乘以100。替代方法包括使用有空位的方法，其中考虑了比对中的空位，例如一个序列相对于另一个序列的缺失。如果多肽或多核苷酸序列在其整个长度上共享100％的序列同一性，则称多肽或多核苷酸序列与其他多肽或多核苷酸序列相同。
两个序列之间的“差异”是指与一个序列相比，另一个序列的位置上的例如单个氨基酸残基的插入、缺失或替换。
为了比较第一参考多肽序列与第二比较多肽序列的目的，可以确定对第一序列进行的添加、替换和/或缺失的数量以产生第二序列。添加是将一个氨基酸残基添加到第一多肽的序列中(包括在第一多肽的任一末端添加)。替换是用一个不同的氨基酸残基替换第一多肽序列中的一个氨基酸残基。缺失是第一多肽序列中一个氨基酸残基的缺失(包括第一多肽任一末端的缺失)。
本发明序列中的适当替换可以是保守替换。保守替换包括用具有与被替换的氨基酸相似的物理化学性质的一种氨基酸替换另一种氨基酸(参见，例如，Stryer等，Biochemistry，第5版，2002，第44-49页)。优选地，保守替换是选自以下的替换：(i)碱性氨基酸被另一种不同碱性氨基酸替换；(ii)酸性氨基酸被另一种不同酸性氨基酸替换；(iii)芳香氨基酸被另一种不同芳香氨基酸替换；(iv)非极性脂肪族氨基酸被另一种不同非极性脂肪族氨基酸替换；和(v)极性不带电荷氨基酸被另一种不同极性不带电荷氨基酸替换。碱性氨基酸优选地选自以下：精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸优选天冬氨酸和谷氨酸。芳香氨基酸优选地选自以下：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性脂肪族氨基酸优选地选自以下：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。极性不带电荷氨基酸优选地选自以下：丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守氨基酸替换不同的是，非保守氨基酸替换是一种氨基酸用不属于上述保守替换(i)至(v)的任何氨基酸的交换。
术语
“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，在生物过程中充当模板用于合成其他聚合物和大分子，例如，肽或蛋白的合成。双链核苷酸分子的编码链(其序列通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为对肽或蛋白进行编码。除非另有说明，否则如本文所用，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
如本文所用，术语“表达(expression)”或“进行表达(expressing)”定义为由其可操作连接的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
除非在本公开内容的上下文中另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学常见术语的定义可以参见Benjamin Lewin，Genes V，由Oxford University Press出版，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等编著，The Encyclopedia of Molecular Biology，由BlackwellScience Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers 编著，MolecularBiology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代。类似地，除非上下文另有明确说明，否则“或”一词旨在包括“和”。术语“多个”是指两个或更多个。还应理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基尺寸或氨基酸尺寸，以及所有分子量或分子量值都是近似值，并提供用于描述。此外，关于物质(如抗原)的浓度或水平给出的数值限制旨在是近似值。因此，在指示浓度为至少(例如)200pg的情况下，意在将浓度理解为至少大约(或“约”或“～”)200pg。
术语“包含”指“包括”。因此，除非上下文另有要求，否则“包含”一词以及诸如“含有”和“包含有”的变体将被理解为暗示包括所述化合物或组合物(例如，核酸、多肽、抗原)或步骤，或者一组化合物或步骤，但不排除任何其他化合物、组合物、步骤或其组。
如本领域所公知的，本文提供的氨基酸序列由单字母或三字母命名法表示(参见，例如，Eur.J.Biochem.138：9-37(1984))。
尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但合适的方法和材料在下文描述。
现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1
本研究的总体目的是用五种新的重组HSV-2 gE/gI蛋白产生免疫原性数据，这些蛋白含有gE Fc结合结构域的突变，以降低对人免疫球蛋白G Fc的亲合力。
主要目的是与NaCl对照组比较，在第三次免疫后14天，由几种含有氨基酸序列突变的AS01佐剂化重组HSV-2 gE/gI蛋白诱导的抗HSV-2 gE特异性多克隆抗体(pAb)应答。
作为次要目的，在第三次免疫后14天，将由HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变体诱导的抗HSV-2 gI特异性多克隆抗体(pAb)应答和抗HSV-2 g E/gI特异性CD4+T细胞应答与NaCl对照组进行比较。此外，在第三次免疫后14天，对所有疫苗候选物进行抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI特异性IgG抗体应答和CD4+T细胞应答的头对头比较。
最后，探索性目的是评价在用HSV-2 gE/gI突变体免疫的不同组小鼠中，一次和两次免疫后的抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI特异性抗体应答，三次免疫后抗HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体应答，三次免疫后疫苗特异性和HSV-1 gE/gI交叉反应性多克隆抗体的功能以及三次免疫后抗HSV-2 gE-和抗HSV-2 gI特异性CD8+T细胞应答的水平。
前言
疱疹病毒进化出了多种免疫逃逸策略，以在其自然宿主中存活。人单纯疱疹病毒(HSV)即编码糖蛋白E(gE)，其靶向体液免疫系统。gE可以与糖蛋白I(gI)形成非共价异二聚体复合物，其功能为免疫球蛋白G(IgG)Fc受体(FcγR)。gE和gI之间的相互作用使人Fc结合亲和力增加约100倍。通过抗体结合，FcγR抑制IgG Fc介导的活性，包括补体结合和抗体依赖性细胞毒性。
先前在小鼠中进行的实验表明，人IgG可以与未突变的重组HSV-2 gE/gI蛋白的gEFc结合结构域结合，并掩盖与HSV-2 gE介导的免疫逃逸机制有关的保护性表位。这些结果表明，类似的情况可能在临床上发生，并对HSV-2疫苗的治疗效果产生负面影响。为了避免对人类的负面免疫学干扰，在HSV-2 gE/gI蛋白的Fc结合结构域内进行了点突变，以降低对hIgG Fc结构域的亲和力，并产生了HSV-2 gE-P317R/gI突变构建体。已经产生了包含gE Fc结合结构域突变的进一步构建体，并评估了其免疫原性。特别是，已经评估了在AS01中配制的五种不同的HSV-2 gE/gI突变蛋白在小鼠中的免疫原性。
研究设计
将来自Harlan实验室(OlaHsd)的6-8周龄雌性CB6F1近交系小鼠随机分配到研究组(n＝6gr1-5&n＝4/gr6)，并在指定的无病原体条件下饲养在机构动物实验室中。在第0天、第14天和第28天，使用5μg在AS01(5μg)中配制的不同HSV-2 gE/gI突变蛋白肌内(i.m)免疫CB6F1小鼠(gr1-5)。按照相同的免疫计划，另一组小鼠用生理盐水(NaCl 150mM)i.m注射，并作为阴性对照组(gr6)。
在初次免疫后第14天、第28天和第42天(14PI、14PII、14PIII)收集血清样品，以测量抗HSV-2 gE-和抗HSV-2 gI特异性和抗HSV-1gE/gI交叉反应性IgG抗体应答并且表征疫苗特异性和交叉反应性多克隆抗体的功能。在第三次免疫后14天(14PIII)收集脾脏，以评价针对HSV-2 gE和gI抗原的离体系统性CD4+/CD8+T细胞应答。每组的详细情况如表3中所示。
表3-研究设计和所检测的制剂的总结
材料和方法
本研究中使用的抗原是纯化的重组gE/gI突变蛋白的胞外域。该材料是使用ExpiCHOTM表达系统生产的，仅作为研究批次使用。
AS01是一种基于脂质体的佐剂系统(AS)，包含QS-21(一种从皂皮树树皮中纯化的三萜糖苷)和MPL(3-D单磷酰脂A)，脂质体作为这些免疫增强剂的载剂，包含NaCl的缓冲剂作为等渗剂。
AS01b佐剂系统的单个人体剂量(0.5mL)包含50μg QS-21和50μgMPL。在这项研究中，小鼠的注射体积是人体剂量的1/10，相当于每剂5μg QS-21和5μg MPL。
动物模型
人们普遍认为，小动物模型是研究新疫苗候选物免疫原性性质的有用工具。为了全面了解我们的疫苗候选物诱导T细胞免疫应答的能力，本研究使用了CB6F1小鼠(C57B1/6和Balb/C小鼠的杂交种)。
CB6F1小鼠已被证明在用各种类型的免疫原(包括佐剂化蛋白和病毒载体)接种后产生有效的CD4+/CD8+T细胞和体液免疫应答。然而，与人类的预期应答相比，在这些小鼠中产生的疫苗诱导的免疫应答的性质可能会受到与TLR表达、HLA背景和抗原呈递有关的一些差异的影响。然而，诱导CD4+/CD8+T免疫应答的能力在这些小鼠和人类之间显示出可比的趋势。
通过ELISA检测总抗HSV-2 gE&gI特异性IgG抗体
使用间接ELISA对总的抗gE或gI特异性IgG抗体进行定量。将来自HSV-2的重组gE(～51kDa)(BMP1049或BMP1291)或gI蛋白(～46kDa)(BMP1052b或BMP1292)作为包被抗原。使用ExpiHEK293FTM表达系统生产这些蛋白。
将聚苯乙烯96孔ELISA板(Nunc F96 Maxisorp目录号439454)用100μL/孔在碳酸盐/碳酸氢盐50mM pH 9.5缓冲液中以2μg/mL(gE)和1μg/mL(gI)的浓度稀释的抗原包被，并在4℃下孵育过夜。孵育后，除去包被溶液并用10％在PBS(封闭缓冲液)(ref 232100，Becton Dickinson，USA)中稀释的200μL/孔Difkomilk在37℃下封闭板1h。孵育后，除去封闭溶液，对每个血清样品进行三倍连续稀释(在PBS+0.1％吐温20+1％BSA缓冲液中)，并将其添加到包被板中，并在37℃下孵育1h。然后用PBS 0.1％吐温20(洗涤缓冲液)洗板四次，并将辣根过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(ref 115-035-003，Jackson，USA)用作二抗。将在PBS+0.1％吐温20+1％BSA缓冲液中以1：500的浓度稀释的二抗每孔100微升添加到每个孔中，并将板在37℃下孵育45min。
然后用洗涤缓冲液洗涤板4次，用去离子水洗涤板2次，并在RT(室温)下用100μL/孔的75％单组分TMB过氧化物酶ELISA底物(ref 172-1072，Bio-Rad，USA)在0.1M pH5.5的柠檬酸钠缓冲液中稀释的溶液中孵育15min。每孔用100μL 0.4N硫酸1M(H2SO4)终止酶促显色，并使用Versamax ELISA酶标仪在450/620nm的吸光度下读取板。
用SoftMaxPro GxP v5.3软件捕获和分析光密度(OD)。通过对参考标准品结果应用4参数逻辑回归拟合生成标准曲线(参考标准品抗gE＝20180011 14PIII-用AS01/gE免疫的1.1至1.20小鼠混合物(每只5μg/剂)；参考标准品抗gI＝20190021 14PII-用AS01/gI免疫的2.1至2.5小鼠混合物(每只5μg/剂))。通过标准曲线的插值计算样品中的抗体效价。样品的抗体效价是通过对落在标准曲线的20-80％动态范围内的稀释液的值进行平均而获得的。效价以EU/mL(ELISA单位/mL)表示。
通过ELISA检测总抗HSV-1 gE&gI交叉反应性IgG抗体
使用间接ELISA对总HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体进行定量。将来自HSV-1的重组gE/gI异二聚体蛋白(BMP1299)作为包被抗原。使用ExpiCHOTM表达系统生产该蛋白。
用100μL/孔的重组HSV-1 gE/gI异二聚体蛋白(该蛋白在碳酸盐/碳酸氢盐50mMpH 9.5缓冲液中以2μg/mL的浓度稀释)包被聚苯乙烯96孔ELISA板(Nunc F96 Maxisorp目录号439454)，并在4℃下孵育过夜。孵育后，除去包被溶液，用200μL/孔的Difkomilk在37℃下封闭1h，所述Difkomilk在PBS(封闭缓冲液)(ref 232100，Becton Dickinson，USA)中稀释为10％。孵育后，除去封闭溶液，对每个血清样品进行三倍连续稀释(在PBS+0.1％吐温20+1％BSA缓冲液中)，并将其添加到包被板中，并在37℃下孵育1h。然后用PBS 0.1％吐温20(洗涤缓冲液)洗板四次，并使用辣根过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(ref 115-035-003，Jackson，USA)作为二抗。将在PBS+0.1％吐温20+1％BSA缓冲液中以1：500的浓度稀释的二抗每孔100微升添加到每个孔中，并将板在37℃下孵育45min。
然后用洗涤缓冲液洗涤板4次，用去离子水洗涤板2次，并在RT(室温)下用100μL/孔的75％单组分TMB过氧化物酶ELISA底物(ref 172-1072，Bio-Rad，USA)在0.1M pH5.5的柠檬酸钠缓冲液中稀释的溶液中孵育15min。每孔用100μL 0.4N硫酸1M(H2SO4)终止酶促显色，并使用Versamax ELISA酶标仪在450/620nm的吸光度下读取板。
用SoftMaxPro GxP v5.3软件捕获和分析光密度(OD)。通过对参考标准品结果应用4参数逻辑回归拟合生成标准曲线(参考标准品＝2020002314PIII-用AS01-HSV-1 gE/gIHEK免疫的1.1至1.20小鼠混合物(每只5μg/剂))。通过标准曲线的插值计算样品中的抗体效价。样品的抗体效价是通过对落在标准曲线的20-80％动态范围内的稀释液的值进行平均而获得的。效价以EU/mL(ELISA单位/mL)表示。
通过ICS测定测量的抗-HSV-2 gE和gI特异性CD4+/CD8+T细胞应答
在用HSV-2 gE或gI肽混合物进行离体刺激后，在第三次免疫后14天收集的脾细胞中评价产生IL-2和/或IFN-γ和/或TNF-α的抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI特异性CD4+和CD8+T细胞的频率。
分离脾细胞
在第三次免疫接种后14天从个体小鼠收集脾脏，并置于补充有RPMI添加剂(谷氨酰胺、青霉素/链霉素、丙酮酸钠、非必需氨基酸和2-巯基乙醇)的RPMI 1640培养基(＝RPMI/添加剂)中。使用组织研磨机从每个脾脏制备细胞悬液。过滤脾细胞悬液(细胞筛100μm)，然后用40mL冷PBS-EDTA 2mM冲洗过滤器。离心后(335g，在4℃下10min)，将细胞重悬在7mL冷PBS-EDTA 2mM中。如前所述进行第二次洗涤步骤，最后将细胞重新悬浮在1mL补充有5％FCS(Capricorn scientific,FBS-HI-12A)的RPMI/添加剂中。然后将细胞悬浮液在PBS缓冲液(190μL)中稀释20x(10μL)用于细胞计数(使用MACSQuant分析仪)。计数后，将细胞离心(335g，室温下10min)并以107个细胞/mL重悬于补充有5％FCS的RPMI/添加剂中。
细胞制备
将新鲜脾细胞以106个细胞/孔(100μL)接种在圆底96孔板中。然后，以1μg/mL/孔的抗CD28(BD Biosciences，克隆37.51)和抗CD49d抗体(BD Biosciences，克隆9C10(MFR4.B))刺激细胞6小时(37℃，5％CO2)，每孔含有100μL下述任一：
-15mer重叠肽混合物，涵盖来自HSV2的gE蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)。
-15mer重叠肽混合物，涵盖来自HSV2的gI蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)。
-15mer重叠肽混合物，涵盖人β肌动蛋白蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)(无关刺激)。
-RPMI/添加剂培养基(作为测定的阴性对照)。
-PMA-离子霉素溶液(Sigma,P8139)，工作浓度分别为0,25μg/mL和2,5μg/mL(作为测定的阳性对照)。
在离体刺激2小时后，添加在补充有5％ FCS的RPMI/添加剂中1/200稀释的Brefeldin A(Golgi plug ref 555029,BD Bioscience)另外4小时，以抑制细胞因子分泌。然后将板转移到4℃下孵育过夜。
胞内细胞因子染色
在4℃下孵育过夜后，将细胞转移至V底96孔板中，离心(189g，在4℃下5min)并在250μl冷PBS+1％ FCS(流式缓冲液)中洗涤。在第二次离心(189g，在4℃下5min)后，将细胞重悬在50μL含抗CD16/32抗体(BD Biosciences，克隆2.4G2)(1/50稀释)的流式缓冲液中以封闭非特异性抗体结合(在4℃下10min)。然后，添加含小鼠抗CD4-V450抗体(BDBiosciences，克隆RM4-5，以1/100稀释)、抗CD8-PerCp-Cy5.5抗体(BD Biosciences，克隆53-6.7，以1/50稀释)和Live/DeadTM可固定黄色死细胞染料(Molecular probes，L34959，以1/500稀释)的50μL流式缓冲液，在4℃下在暗处30min。孵育后，将100μL流式缓冲液添加到每个孔中，然后将细胞离心(189g，在4℃下5min)。用200μL流式缓冲液进行第二次洗涤，离心后，在暗处加入200μL Cytofix-Cytoperm溶液(BD Biosciences,554722)20min，固定和透化细胞。将板离心(500g，在4℃下5min)后，使用200μl Perm/洗涤缓冲液(BDBiosciences,554723)洗涤细胞，离心(500g，在4℃下5min)并重悬在50μL Perm/洗涤缓冲液中，所述缓冲液含有小鼠抗IL2-FITC(BD Biosciences，克隆JES6-5H4，以1/400稀释)、抗IFN-γ-APC(BD Biosciences，克隆XMG1.2，以1/200稀释)和抗TNF-α-PE(BD Biosciences，克隆MP6-XT22，以1/700稀释)抗体，在4℃下在暗处1小时。孵育后，将100μL流式缓冲液添加到每个孔中，然后最终使用200μLPerm/洗涤缓冲液(500g离心，在4℃下5min)洗涤并在220μL PBS中重悬。
细胞采集和分析
使用LSRII流式细胞仪和FlowJo软件通过流式细胞仪分析染色的细胞。通过活/死染色鉴定活细胞，然后根据前向/侧向散射光(FSC/SSC)门控分离淋巴细胞。在约20.000个CD4+/CD8+T细胞事件上进行采集。在CD4+和CD8+T细胞群上计算产生IFN-γ+/-IL-2+/-和TNF-α+/-的细胞的百分比。对于每个样品，将培养基刺激后检测到的非特异性信号从肽混合物刺激后检测到的特异性信号中去除。
在与HSV-2或HSV-1 gE/gI转染的细胞孵育后评价多克隆血清结合和激活小鼠FcγRIII的能力(ADCC生物测定-Promega)
由Promega laboratory实验室开发的小鼠FcγRIII抗体依赖性细胞毒性(ADCC)报告基因生物测定(目录号M1201)是一种基于生物发光细胞的测定，可用于测量抗体特异性结合和激活由修饰的Jurkat报告细胞表达的小鼠FcγRIII的能力。
简言之，3T3细胞最初购自ATCC laboratories(克隆A31，ATCC ref CCL-163)，在DMEM+10％FBS去补体+1％L-谷氨酰胺2mM+1％青霉素/链霉素培养基中生长，并在实验的第0天在T175烧瓶中以2x106个细胞接种，以确保细胞在第二天处于最佳生长阶段。
在第1天，通过向每个孔中加入2mL生长培养基(DMEM(Prep Mil，Log377BA)、1％L-谷氨酰胺2mM(Prep Mil，Log010D)、10％超低IgG FBS(Gibco，A33819-01))来制备6孔板(每个电穿孔一个孔)。将板在37℃培养箱(5％CO2)中保温。制备电穿孔器(Gene Pulser，BIO-RAD)，以为4mm比色皿提供325V、350μF电容、无限电阻和1个脉冲。将生长期的3T3细胞收获到生长培养基中并使用细胞计数器(TC20，BIO-RAD)计数。对于每次电穿孔，使用5x105个3T3细胞(500μL细胞，1x106个细胞/mL)和20μgHSV-2 gE/gI或HSV-1 gE/gI质粒DNA(20μL，1μg/μL)。对于阴性对照，使用10μL水。将细胞和HSV-2或HSV-1 gE/gI质粒DNA混合物转移到4mm比色皿(Gene Pulser电穿比色皿，BIO-RAD)中，并使用上述参数立即进行一次电穿孔脉冲。电穿孔后，将所有比色皿合并以匀质细胞悬液，并将500μL细胞悬液/孔转移到2mL预热培养基中的6孔板中。在孵育之前，将6孔板前后和左右滑动数次，以均匀分布细胞，然后在37℃，5％CO2孵育48h。
孵育48h后，收集并混合来自不同6孔板的HSV-2或HSV-1gE/gI转染的3T3细胞(靶细胞(T))。将细胞悬液离心(10min，340g，在RT下)并重悬于Promega测定缓冲液(96％RPMI(G7080)+4％低IgG血清(G7110)；Promega)中进行细胞计数(TC20，BIO-RAD)。然后在Promega测定缓冲液中制备96.000个3T3细胞/mL的溶液，并在96孔板中加入25μL这种悬液(24.000个细胞/25μL/孔)。在圆底96孔板(Nunc，ref 168136)中，在Promega测定缓冲液中对每种小鼠血清样品(HSV-2初始稀释度1/500，HSV-1初始稀释度1/200)在200μL中进行3倍连续稀释，并将25μL的每种稀释液转移到已含有HSV-2或HSV-1 gE/gI转染的3T3细胞的相应孔中。最后，将25μL表达小鼠FcγRIII的基因工程化Jurkat细胞(效应细胞(E))以240.0000个细胞/mL(60.000个细胞/25μL/孔)的浓度添加到每个孔中(～E/T 2，5/1)，并将平板在37℃-5％CO2下孵育6h。
孵育后，将板置于RT下15min，并在每个孔中加入75μL Bio-Glow试剂。将板在RT下最终孵育20min，并使用光度计(BioTekSynergy H1)读取。
竞争ELISA法评估疫苗特异性抗体降低HSV-2 gE/gI蛋白与人IgG Fc结合的能力
通过竞争ELISA研究了在不同组小鼠中收集的多克隆血清体外降低重组HSV-2gE/gI蛋白与hIgG抗体结合的能力。将使用ExpiHEK293FTM表达系统生产的重组HSV-2 gE/gI(BMP 1063)蛋白作为包被抗原。
将聚苯乙烯96孔ELISA板(Nunc F96 Maxisorp目录号439454)用50μL/孔在游离钙/镁PBS缓冲液中以4μg/mL的浓度稀释的HSV-2 gE/gI蛋白包被，并在4℃下孵育过夜。孵育后，去除包被溶液，并用补充有0.1％吐温-20+1％BSA(封闭缓冲液)的100μL/孔PBS在37℃下封闭板1h。
在96孔透明V底聚丙烯微孔板(Falcon,ref 353263)中，在60μl/孔中制备每种血清的封闭缓冲液中两倍连续稀释物(初始稀释度1/10)，并与在封闭缓冲液中以0.7μg/mL预稀释的60μl/孔生物素化hIgG抗体(Invitrogen,ref 12000C)混合。
然后，用封闭缓冲液孵育1h后，从包被板中去除封闭溶液，将100μL含有hIgG和小鼠血清的混合物转移到相应的HSV-2 gE/gI包被孔中，并在37℃下孵育24h。测定的阳性对照是来自此前研究的抗HSV-2 gE/gI血清样品的混合物。测定的阴性对照是稀释1/1000并与hIgG混合的无关HPV血清样品混合物。
孵育24h后，用PBS 0.1％吐温20(洗涤缓冲液)洗板四次，并在孔上加入稀释2000x的50μL/孔的抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物酶AMDEX(Amersham,ref RPN4401V)，并在37℃下孵育板30min。然后用洗涤缓冲液洗板四次，并在室温下加入50μL/孔的含有75％单组分TMB过氧化物酶ELISA底物(ref 172-1072,Bio-Rad,USA)的溶液(该溶液在柠檬酸钠0.1M pH5.5缓冲液中稀释)10min。用50μL/孔的0.4N硫酸1M(H2SO4)终止酶促显色，并使用Versamax ELISA酶标仪在450/620nm的吸光度下读板。捕获光密度(OD)并在Excel程序中拟合在曲线中。
效价表示为通过样品稀释获得50％(即，ED50)信号的有效稀释度。
对于每个板并使用参考样品(即，无关血清)，使用以下公式估计参考ED50值：
ED50＝OD0％+0.5*(OD100％-OD0％)
其中OD100％是使用相似样品获得的最高OD和OD0％是能够获得的最低信号。对于每个板，前者通过平均6次重复(平均值)获得，而后者设置为零。
样品ED50效价是通过最接近板内ED50估计值的左右测量值之间的线性插值计算的。利用stats R基本包的approx函数，在未转换的OD和以10为底的对数转换的稀释液上获得近似值。
在下述情况下，未分配样品效价：
○在ED50之或之下没有可用的测量，
○曲线至少跨ED50的两倍，并且
○缺少最接近ED50的稀释步骤之一(左侧或右侧)
竞争ELISA法评价HSV-1交叉反应性抗体带低HSV-1 gE/gI蛋白与人IgG Fc结合的能力
通过竞争ELISA研究了在不同组小鼠中收集的多克隆血清降低体外重组HSV-1gE/gI蛋白结合hIgG抗体的能力。将使用ExpiCHOTM表达系统生产的重组HSV-1 gE/gI异二聚体蛋白(BMP 1299)用作包被抗原。
将聚苯乙烯96孔ELISA板(Nunc F96 Maxisorp目录号439454)用50μL/孔在游离钙/镁PBS缓冲液中以2μg/mL的浓度稀释的HSV-1 gE/gI蛋白包被，并在4℃下孵育过夜。孵育后，去除包被溶液，并用补充有0.1％吐温-20+1％BSA(封闭缓冲液)的100μL/孔PBS在37℃下封闭板1h。
在另一96孔透明V底聚丙烯微孔板(Falcon，ref 353263)中，在60μl/孔中制备每种血清的封闭缓冲液中两倍连续稀释物(初始稀释度1/10)，并与在封闭缓冲液中以0.7μg/mL预稀释的60μl/孔生物素化hIgG抗体(Invitrogen，ref 12000C)混合。
然后，用封闭缓冲液孵育1h后，从包被板中去除封闭溶液，将100μL含有hIgG和小鼠血清的混合物转移到相应的孔中，并在37℃下孵育24h。测定的阳性对照是抗HSV-1 gE/gI血清样品的混合物。测定的阴性对照是稀释1/1000并与和样品一起使用的相同浓度的hIgG混合的无关HPV血清样品混合物。
孵育1h后，用PBS 0.1％吐温20(洗涤缓冲液)洗板四次，并在孔上加入稀释2000x的50μL/孔的抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物酶AMDEX(Amersham，ref RPN4401V)，并在37℃下孵育板30min。然后用洗涤缓冲液洗板四次，并在室温下加入50μL/孔的含有75％单组分TMB过氧化物酶ELISA底物(ref 172-1072，Bio-Rad，USA)的溶液(该溶液在柠檬酸钠0.1M pH5.5缓冲液中稀释)10min。用50μL/孔的0.4N硫酸1M(H2SO4)终止酶促显色，并使用VersamaxELISA酶标仪在450/620nm的吸光度下读板。捕获光密度(OD)并在Excel程序中拟合在曲线中。
效价表示为通过样品稀释获得50％(即，ED50)信号的有效稀释度。
对于每个板并使用参考样品(即，无关血清)，使用以下公式估计参考ED50值：
ED50＝OD0％+0.5*(OD100％-OD0％)
其中OD100％是使用相似样品获得的最高OD和OD0％是能够获得的最低信号。对于每个板，前者通过平均6次重复(平均值)获得，而后者设置为零。
样品ED50效价是通过最接近板内ED50估计值的左右测量值之间的线性插值计算的。利用stats R基本包的approx函数，在未转换的OD和以10为底的对数转换的稀释液上获得近似值。
在下述情况下，未分配样品效价：
○在ED50之上或之下没有可用的测量，
○曲线至少跨ED50的两倍，并且
○缺少最接近ED50的稀释步骤之一(左侧或右侧)
体外HSV-2MS中和测定
开发了一种体外中和测定来检测和量化来自不同动物物种的血清样品中的HSV-2MS中和抗体效价。将血清(50μL/孔，初始稀释度1/10)在平底96孔板(Nunclon DeltaSurface，Nunc，Denmark，ref 167008)的HSV培养基(补充有1％新霉素和1％庆大霉素的DMEM)中进行2倍系列稀释。然后将血清与400TCID50/50μL/孔的HSV-2MS毒株(ref ATCCVR-540)在37℃下(5％CO2)孵育2h，所述毒株预先在在补充有2％豚鼠血清补体的HSV培养基中(Harlan，ref C-0006E)中稀释。不使用板的边缘，每个板的一列没有病毒和血清(TC)或有病毒但没有血清(TV)，分别用作感染的阴性或阳性对照。该测定的阳性对照血清是来自用不同剂量(0.22；0.66；2；6μg/剂量)的HSV-2 gD/AS01(2.5μg)免疫小鼠并在第二次(14PII)或第三次(14PIII)免疫接种后14天收集的合并血清样品。抗体-病毒混合物孵育后，将10.000个Vero细胞/100μL添加到每个板的每个孔中，并将板在37℃在5％CO2下孵育4天。感染后4天，从板中除去上清液，并使用在HSV病毒感染(revelation)培养基(补充有1％新霉素和1％庆大霉素+2％FBS的DMEM)中15x稀释的WST-1溶液(用于测量细胞活力的试剂，Roche，ref 11644807001)在37℃(5％CO2)下孵育细胞5h。
为计算中和抗体效价，根据“无病毒细胞”孔和“无血清细胞”孔(细胞病变效应(CPE)分别为0和100％)中WST-1光密度(O.D.)的平均值将数据集归一化。然后，稀释度i的CPE抑制百分比由下式给出：
抑制％＝(O.D.i-平均O.D.无血清细胞)/(平均O.D.无病毒细胞-平均O.D.无血清细胞)
然后使用Softmaxpro软件使用非线性回归外推使CPE降低50％的稀释度的倒数。
体外HSV-1中和测定
开发了一种体外中和测定来检测和量化来自不同动物物种的血清样品中的HSV-1交叉反应性中和抗体效价。将每个血清(50μL/孔，初始稀释1/10)在平底96孔板(NunclonDelta Surface，Nunc，Denmark，ref 167008)的HSV培养基(补充有1％新霉素和1％庆大霉素的DMEM)中进行2倍系列稀释。然后将血清与400TCID50/50μL/孔的HSV-1毒株(ref ATCCVR-1789)在37℃下(5％CO2)孵育2h，所述毒株预先在在补充有2％豚鼠血清补体的HSV培养基中(Harlan，ref C-0006E)中稀释。不使用板的边缘，每个板的一列没有病毒和血清(TC)或有病毒但没有血清(TV)，分别用作感染的阴性或阳性对照。该测定的阳性对照血清是来自用不同剂量(0.22；0.66；2；6μg/剂量)的HSV-2 gD/AS01(2.5μg)免疫小鼠并在第二次(14PII)或第三次(14PIII)免疫接种后14天收集的合并血清样品。抗体-病毒混合物孵育后，将10.000个Vero细胞/100μL添加到每个板的每个孔中，并将板在37℃在5％CO2下孵育4天。感染后4天，从板中除去上清液，并使用在HSV病毒感染培养基(补充有1％新霉素和1％庆大霉素+2％FBS的DMEM)中15x稀释的WST-1溶液(用于测量细胞活力的试剂，Roche，ref11644807001)在37℃(5％CO2)下孵育细胞5h。
为计算中和抗体效价，根据“无病毒细胞”孔和“无血清细胞”孔(细胞病变效应(CPE)分别为0和100％)中WST-1光密度(O.D.)的平均值将数据集归一化。然后，稀释度i的CPE抑制百分比由下式给出：
抑制％＝(O.D.i-平均O.D.无血清细胞)/(平均O.D.无病毒细胞-平均O.D.无血清细胞)
然后使用Softmaxpro软件使用非线性回归外推使CPE降低50％的稀释度的倒数。
统计学方法
假设每个响应的分布是对数正态的。
对于每个疫苗特异性IgG抗体应答(gE或gI)，在log10效价上拟合双因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)、时间点(第14天(14PI)、第28天(14PII)和第42天(14PIII))及其交互作用作为固定效应。NaCl组不包括在内，因为(几乎)没有观察到应答和变异。方差-协方差模型的选择基于AICC标准和个体数据图检查。
通过异质复合对称性针对时间点对gE特异性方差-协方差进行建模：
CSH-异质性CS
复合对称性考虑了时间点之间相同的相关性，异质性是指每个时间点假设不同的方差。对每个疫苗组建立了不同的方差-协方差矩阵模型，表明各组之间存在不同的方差和不同的时间点相关性。
通过异质一阶自回归ARH(1)结构针对时间点对gI特异性方差-协方差进行建模：
ARH(1)-异质性AR(1)
自回归结构认为相邻时间的相关性最高，并且随着时间点之间距离的增加，相关性系统地减小。异质性是指每个时间点假设不同的方差。对每个疫苗组建立了相同的方差-协方差矩阵模型，表明各组之间的方差相同。
几何平均值及其95％置信区间均来自这些模型。
尽管NaCl组不包括在ANOVA模型中，但与主要目的相关的比较计算如下：根据上述模型得出的接种组的几何平均值和95％CI除以在最后一个时间点给予所有NaCl接受者的gE效价或NaCl组的gI几何平均效价。所得比率应理解为几何平均值比及其相应的95％置信区间。
对于接种组(在最后一个时间点)的头对头比较和每组内的时间点比较(PII/PI、PIII/PII和PIII/PI)，所有几何平均值比及其95％置信区间均来自模型。
对于HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体应答，在log10效价上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)作为固定效应。NaCl组不包括在内，因为没有观察到应答和变异。没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。几何平均值及其95％置信区间均来自这些模型。为了比较接种组和NaCl组，根据上述模型得出的接种组的几何平均值和95％CI除以给予所有NaCl接受者的效价。所得比率应理解为几何平均值比及其相应的95％置信区间。对于接种组得头对头比较，所有几何平均值比及其95％置信区间均来自模型。
对于gE或gI特异性CD4+或CD8+T细胞应答的％，在log10频率上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(包括NaCl组的所有组)作为固定效应。没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。对于CD4+和CD8+T细胞应答％，NaCl阈值基于NaCl阴性对照组中刺激数据的P95。没有对gI特异性CD8+T细胞进行建模，因为所有疫苗组的应答都低于P95 NaCl阈值。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％CI)均来自这些模型。
为评价人IgG Fc与pAb的结合的解离，针对每个样品计算ED50应答。对此应答，在log10值上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)作为固定效应。对各组的不同方差进行建模。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％CI)均来自这些模型。
对于HSV-2MS特异性中和抗体效价，在log10值上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)作为固定效应。对各组的不同方差进行建模。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％CI)均来自这些模型。对于HSV-1交叉反应性中和抗体效价，使用相同的方法，只是假设不同组的方差相同(没有检测到明显的方差异质性)。
结果
使用HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式诱导抗HSV-2 gE&gI特异性和抗HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体
通过ELISA考察了抗HSV-2 gE&gI-疫苗特异性和抗HSV-1gE/gI交叉反应性IgG抗体应答。
与NaCl对照组相比，第三次接种后14天AS01佐剂化HSV-2gE/gI蛋白的所有突变形式均诱导了较高的抗HSV-2 gE或gI疫苗特异性IgG抗体应答(针对gE，所有GMR＞34.000，针对gI，所有GMR＞6000)(图1A、图1B、图2A、图2B)。与预期一致，在NaCl对照组中未观察到抗HSV-2 gE或gI应答(所有小鼠＜30EU/ml，除了在HSV-2 gI应答中一只小鼠的值为135EU/mL)。
在使用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI突变蛋白免疫小鼠的所有组中，与第一次(第14天(14PI))相比，第二次免疫(第28天(14PII))后，抗HSV-2 gE和gI特异性IgG抗体应答的水平升高，增加了5至63倍(图3A、图3C)。
对于所有HSV-2 gE/gI突变蛋白，与第二次(第28天(14PII))相比，第三次免疫(第42天(14PIII))后，还观察到了抗HSV-2 gE特异性抗体应答的加强效应(booster effect)，增加了2至4倍(具有不含1的CI)(图3B)。
仅在用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI A246W(第3组)和P318I(第4组)突变蛋白免疫小鼠的组中检测到了与第二次相比第三次免疫后对于抗HSV-2 gI特异性抗体应答的加强效应。值得注意的是，在A248T(第3组)中，一只动物的抗HSV-2 gI应答在两次免疫后与其他动物相比非常低，但在三次免疫后，与其他动物非常相似。这可能放大了在该组中观察到的加强效应。在三个其他组(＜2倍变化且CI含有1)中未观察到加强效应(图3D)。
总之，这些结果表明，在第三次免疫后14天，不同突变形式的HSV-2 gE/gI蛋白之间存在类似的抗HSV-2 gE-或抗HSV-2 gI特异性抗体应答。与V340W突变体(第1组)相比，仅P318I突变体(第4组)似乎诱导了更高的抗HSV-2 gE-和抗HSV-2 gI特异性抗体应答，增加了接近2倍(GMR分别为2.09和2.39，CI不含1)(图4A和图4B)。与A246W突变体(第3组)相比，P318I突变体(第4组)似乎也诱导了更高的抗HSV-2 gI特异性抗体应答，增加了2.42倍(具有不含1的CI)(图4B)。在突变体之间未观察到其他差异(GMR＜2倍变化和/或CI含有1)。
在NaCl对照组中未观察到抗HSV-1 gE/gI交叉反应性应答(针对所有小鼠＜20EU/mL)。在第三次免疫后14天并与NaCl对照比较，在用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式免疫小鼠的所有组中诱导了较高的抗HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体应答(所有GMR＞20.000)(图5、图6)。
在第三次免疫后14天，似乎观察到HSV-2 gE/gI突变候选物之间的一些差异。事实上，P318I(第4组)和A248T V340W(第5组)突变体诱导的交叉反应性应答似乎比V340W(第1组)和A248T(第3组)突变体诱导的交叉反应高出约三倍(第4组或第5组与第1组相比，GMR为3.1，CI不含1，第4组或第5组与第3组相比GMR为2.7，CI下限等于1)。在突变体之间未观察到其他差异(GMR＜2倍变化和/或CI含有1)(图7)。
所有重组HSV-2 gE/gI突变蛋白能够诱导抗HSV-2功能性gE/gI特异性和抗HSV-1gE/gI交叉反应性抗体
在该研究中，仅在第三次免疫后14天收集的血清中研究了抗HSV-2特异性和抗HSV-1交叉反应性抗体的功能。在这方面，研究了pAb中和HSV-2MS或HSV-1VR1789病毒的能力，在结合HSV-2或HSV-1 gE/gI转染的细胞后结合并激活Jurkat报告细胞系表达的小鼠FcγRIII的能力，以及降低HSV-2或HSV-1 gE/gI蛋白体外结合人IgG Fc的能力。
在用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式免疫的所有小鼠组中检测到针对HSV-2MS和HSV-1VR1789株的非常低但一致的中和(nAb)抗体应答。就抗HSV-2特异性nAb应答而言，未观察到HSV-2 gE/gI蛋白突变形式之间存在差异的明确证据(GMR≤2倍变化和所有CI含有1)。P318I(第4组)与V340W(第1组)和A246W(第3组)突变体之间的比较表明，2倍变化没有达到显著性(CI的下限略低于1)(图8A；图8B)。在针对HSV-1VR1789株的交叉反应性nAb应答方面，结果还表明HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式之间有相似的应答。与A246W突变体(第3组)相比，只有P318I突变体(第4组)似乎诱导了更高的应答，倍数增加接近2倍(GMR为2.06，CI不含1)。P318I(第4组)与V340W(第1组)突变体之间的比较表明，1.8倍变化没有达到显著性(CI的下限略低于1)。在突变体之间没有观察到其他差异(GMR＜2倍变化和CI含有1)(图9A和图9B)。
然后，通过竞争ELISA在体外评估用不同的HSV-2 gE/gI候选突变体免疫的小鼠的血清竞争和降低HSV-2或HSV-1 gE/gI蛋白与hIgG结合的能力。HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式引发疫苗特异性和HSV-1交叉反应性多克隆抗体应答，能够与HSV-2或HSV-1 gE/gI蛋白竞争结合hIgG(图10和图71)。hIgG Fc与HSV-2或HSV-1 gE/gI蛋白结合的解离曲线在小鼠的所有组之间非常相似。然而，与A248T突变体(第2组)相比，用A248T_V340W突变体(第5组)免疫的小鼠的多克隆抗体观察到hIgG Fc结合对HSV-2 gE/gI蛋白的抑制性应答更高的趋势，增加了1.96倍(CI几乎不包括1)(图11A；图11B)。
最后，在HSV-2和HSV-1 gE/gI转染的细胞上研究了第三次免疫后14天诱导的疫苗特异性或HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体应答结合和激活体外小鼠FcγRIII的能力。图12A-E和图72A-E中显示的数据表明，用AS01-HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式免疫的所有小鼠组都可以诱导HSV-2 gE/gI特异性和HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体应答，其能够特异性结合和激活表达FcγRIII的Jurkat报告细胞。与预期一致，使用未接种小鼠的血清未检测到FcγRIII激活。在用HSV-2或HSV-1 gE/gI转染的细胞孵育后，不同组的小鼠在FcγRIII激活方面没有观察到重大差异(图12F和图72F)。
总之，这些数据表明，AS01/HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式可以诱导功能性疫苗特异性和HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体，该抗体能够在与HSV-2或HSV-1 gE/gI转染的细胞孵育后结合并激活FcγRIII，以减少HSV-2或HSV-1 gE/gI蛋白与人IgG Fc的结合，并在低强度下中和HSV-2和HSV-1病毒。
重组HSV-2 gE/gI蛋白的所有突变形式能够诱导疫苗特异性CD4+和CD8+T细胞应答
与NaCl对照组相比，在用AS01佐剂化HSV-2 gE/gI蛋白的不同突变形式免疫的所有小鼠组中，在第三次免疫后14天检测到更高的抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI特异性CD4+T细胞应答和抗HSV-2 gE特异性CD8+T细胞应答(疫苗组和NaCl组之间＞16的倍数变化，CI不含1)。与NaCl对照组相比，在任何接种组中均未检测到抗HSV-2 gI特异性CD8+T细胞应答(图13和图14)。
在这项研究中，在不同的HSV-2 gE/gI突变候选物之间检测到类似的抗HSV-2 gE-或抗HSV-2 gI特异性CD4+T细胞应答。与A248T突变体(第2组)相比，只有A248T_V340W突变体(第5组)似乎诱导了更高的抗HSV-2 gE-和抗HSV-2 gI特异性CD4+T细胞应答，增加了近2倍(GMR分别为1.93和2.44，CI不含1)(图15A和图15B)。
类似地，对于抗HSV-2 gE特异性CD8+T细胞应答，与A248T突变体(第2组)相比，A248T_V340W突变体(第5组)似乎诱导了更高的应答，增加了2.66倍(以及CI不含1)。此外，A248T_V340W(第5组)的应答似乎高于A246W(第3组)，P318I(第4组)的应答似乎高于A246W(第3组)，分别增加了2.78和2.11倍(以及CI不含1)。与A248T(第2组)或A246W(第3组)相比，V340W(第1组)的应答有更高的趋势，与A248T(第2组)相比，P318I(第4组)的应答增加了2倍(以及CI几乎不含1)。突变体之间未观察到其他差异(GMR＜2的倍数变化和/或CI含有1)(图15C)。
总体结果表明，与使用A248T突变体免疫小鼠的组相比，使用A248T_V340W突变体免疫小鼠的组中疫苗特异性T细胞应答略高。
实施例2
目的
本实验的总体目的是评价六种不同脂质纳米颗粒(LNP)配制的自扩增mRNA(SAM)载体在小鼠中的免疫原性，所述载体表达HSV-2 gE/gI序列的新突变形式。
主要目的是与NaCl对照组相比在第三次免疫后21天由几种LNP配制的SAM HSV-2gE/gI突变体诱导的gE特异性多克隆抗体(pAb)应答。在第三次免疫后21天时，将由几种LNP配制的SAMHSV-2 gE/gI突变体诱导的抗HSV-2 gI特异性多克隆抗体应答以及抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI特异性CD4+T细胞应答与NaCl对照组比较。此外，在第三次免疫后21天，对所有疫苗候选物进行抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI特异性IgG抗体应答和CD4+T细胞应答的头对头比较。
最后，探索性目的是评价在不同LNP配制的SAM HSV-2 gE/gI突变体中，一次和两次免疫后的抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI特异性抗体应答，三次免疫后抗HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体应答，疫苗特异性或抗HSV-1 gE/gI交叉反应性多克隆抗体的功能以及抗HSV-2gE-和抗HSV-2 gI特异性CD8+T细胞应答的水平。最后，本研究还研究了三次免疫后诱导的疫苗特异性T细胞与HSV-1 gE抗原交叉反应的能力。
研究设计
将来自Harlan实验室(OlaHsd)的6-8周龄雌性CB6F1近交系小鼠随机分配到研究组(n＝6gr1-6&n＝4/gr7)，并在指定的无病原体条件下饲养在机构动物实验室中。在第0天、第21天和第42天，CB6F1小鼠(gr1-6)用在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的0.8μg不同形式的SAM HSV-2 gE/gI突变体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠用生理盐水(NaCl 150mM)i.m注射，并作为阴性对照组(gr7)。在整个研究中共使用了40只动物。
在初免后第21、42和63天收集血清样品(21PI、21PII、21PIII)，以测量抗HSV-2gE-和抗HSV-2 gI特异性和抗HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体应答，并表征疫苗特异性和HSV-1交叉反应性多克隆抗体的功能。在初免后第63天(21PIII)收集脾脏，以评价离体系统性CD4+/CD8+T细胞对HSV-2 gE和gI以及HSV-1 gE抗原的应答。每组的详细情况如表4中所示。
表4-研究设计和所检测的制剂的总结
材料和方法
研究产品
根据已建立的方案通过体外转录(IVT)产生SAM HSV-2 gE/gI突变体。根据已建立的方法制备LNP加SAM。在这种方法中，SAM-LNP是通过将脂质的乙醇溶液与含有SAM的水性缓冲液快速混合来制备的。快速混合导致与SAM离子配对的疏水成分过饱和。SAM/脂质复合物通过成核介导的沉淀冷凝和沉淀，产生小而窄分散的纳米颗粒。在该混合步骤之后，脂质纳米颗粒成熟以包埋RNA，然后通过缓冲液交换步骤转移到最终的Tris/蔗糖储存缓冲液中。然后对LNP溶液的尺寸、脂质含量、RNA包埋、最终SAM浓度和体外效力进行表征。在添加5％(w/v)蔗糖后，材料可以在-80℃下冷冻6个月。
通过ELISA测量总抗HSV-2 gE&gI特异性IgG抗体
如上述实施例1所述。
通过ELISA测量总抗HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体
如上述实施例1所述。
通过ICS测定测量HSV-2 gE-和gI特异性以及HSV-1gE交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答
如上述实施例1所述，除了在用HSV-1 gE肽混合物离体刺激后另外分析针对HSV-1gE抗原的交叉反应性CD4+和CD8+T细胞应答。为此，细胞制备部分的不同之处在于，用抗CD28(BD Biosciences，克隆37.51)和抗CD49d抗体(BD Biosciences，克隆9C10(MFR4.B))刺激细胞6小时(37℃，5％CO2)，每孔1μg/mL，每孔含有100μL下述任一：
-15mer重叠肽混合物，涵盖来自HSV2的gE蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)。
-15mer重叠肽混合物，涵盖来自HSV2的gI蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)。
-15mer重叠肽混合物，涵盖来自HSV-1的gE蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)。
-15mer重叠肽混合物，涵盖人β肌动蛋白蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)(无关刺激)。
-RPMI/添加剂培养基(作为测定的阴性对照)。
-PMA-离子霉素溶液(Sigma，P8139)，工作浓度分别为0,25μg/mL和2，5μg/mL(作为测定的阳性对照)。
在与HSV-2 gE/gI转染的细胞孵育后评价多克隆血清结合和激活小鼠FcγRIII的能力(ADCC生物测定-Promega)
如实施例1所述。
竞争ELISA以评价疫苗特异性抗体降低HSV-2 gE/gI蛋白与人IgG Fc结合的能力
如实施例1所述。
竞争ELISA以评价HSV-1交叉反应性抗体降低HSV-1 gE/gI蛋白与人IgG Fc结合的能力
如实施例1所述。
体外HSV-2中和测定
如实施例1所述。
体外HSV-1中和测定
如实施例1所述。
统计学方法
假设每个响应的分布是对数正态的。
对于每个疫苗特异性IgG抗体应答(gE或gI)，在log10效价上拟合双因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)、时间点(第21天(21PI)、第42天(21PII)和第63天(21PIII))及其交互作用作为固定效应。NaCl组不包括在内，因为没有观察到应答和变异。方差-协方差模型的选择基于AICC标准和个体数据图检查。
对于每种疫苗特异性应答，通过复合对称性矩阵针对时间点进行方差-协方差建模。
CS-复合对称性
复合对称性考虑了时间点之间相同方差和相同相关性。对每个疫苗组进行相同的方差-协方差矩阵建模，表明各组之间的方差相同。
几何平均值及其95％置信区间均来自这些模型。
尽管NaCl组不包括在ANOVA模型中，但与主要目的相关的比较计算如下：源自上述模型的接种组的几何平均值和95％CI除以在最后时间点给予所有NaCl接受者的效价。所得比率应理解为几何平均值比及其相应的95％置信区间。
对于接种组(在最后一个时间点)的头对头比较和每组内的时间点比较(PII/PI、PIII/PII和PIII/PI)，所有几何平均值比及其95％置信区间均来自模型。
对于gE/gI交叉反应性IgG抗体应答，在log10效价上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)作为固定效应。NaCl组不包括在内，因为没有观察到应答和变异。没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。几何平均值及其95％置信区间均来自该模型。为了比较接种组和NaCl组，根据上述模型得出的接种组的几何平均值和95％CI除以给予所有NaCl接受者的效价。所得比率应理解为几何平均值比及其相应的95％置信区间。对于接种组的头对头比较，所有几何平均值及其95％CI均来自该模型。
对于每种疫苗特异性或交叉反应性％的CD4+/CD8+T细胞应答(gE或gI)，在log10频率上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(包括NaCl组的所有组)作为固定效应。HSV-2 gE特异性CD4+T细胞应答的％没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。对于其他应答，对不同组的不同方差进行了建模。对于CD4+和CD8+T细胞应答的％，NaCl阈值基于NaCl阴性对照组中刺激数据的P95。没有对HSV-1 gE交叉反应性CD4+T细胞的％和HSV-2 gI特异性CD8+T细胞的％进行建模，因为所有疫苗组的应答低于P95 NaCl阈值。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％CI)来自这些模型。
对于HSV-2MS特异性中和抗体效价，在log10值上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组以外的所有组)作为固定效应。没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％CI)来自该模型。还对HSV-1交叉反应性中和抗体效价使用了相同模型。
结果
所有LNP/SAM HSV-2 gE/gI突变体诱导的疫苗特异性IgG抗体应答
值得注意的是LNP/SAM-HSV-2 gE/gI A248T_V340W组中的一个样品(样品4.5)在第二次免疫后21天没有通过ELISA评价，因为没有足够的血清可用。
通过ELISA考察了抗HSV-2 gE&gI-疫苗特异性和抗HSV-1gE/gI交叉反应性IgG抗体应答。
与预期一致，在NaCl对照组中未观察到抗HSV-2 gE特异性或抗HSV-2 gI应答(所有小鼠<20EU/mL)，而所有LNP配制的SAM HSV-2 gE/gI接种小鼠在最后一个时间点产生的应答高于30.000EU/mL(图16A和图16B)。在第三次免疫后21天和与NaCl对照组比较，在用LNP配制的SAM HSV-2 gE/gI载体的不同形式(突变和氨基酸插入)免疫的所有小鼠组中诱导高抗HSV-2 gE或抗HSV-2gI特异性IgG抗体应答(针对gE的所有GMR＞17.000，针对gI的所有GMR＞1.800)(图17A和图17B)。
在使用LNP配制的SAM HSV-2 gE/gI突变体免疫小鼠的所有组中，第二次免疫(第42天(21PII))后，抗HSV-2 gE和抗HSV-2gI特异性IgG抗体应答的水平比第一次免疫(21天(21PI))增加，增加了2至8倍(图18A和图18C)。
针对除A248T突变体(第2组)以外的所有HSV-2 gE/gI突变体，与第二次免疫(第42天(21PII))相比，在第三次免疫后21天(第63天(21PI II))也观察到对HSV-2 gE特异性抗体应答的加强作用，增加了2.46至4.49倍(CI不含1)。对于A248T突变体，观察到增加了1.77倍(CI不含1)(图18B)。
在第二剂和第三剂疫苗之间，仅在用LNP配制的SAM HSV-2gE/gI V340W(第1组)和插入ARAA(第6组)突变体免疫的小鼠组中检测到对HSV-2 gI特异性抗体应答水平的明显加强作用(增加2和2.3倍，CI不含1)。其他突变体也观察到较小的加强作用，增加了1.6-1.9倍(CI不含1)(图18D)。
总的来说，这些结果表明，在第三次免疫后21天，不同的HSV-2gE/gI突变候选物之间的HSV-2 gE特异性抗体应答相似(GMR接近1倍变化，CI包含1)(图19A)。相反，对于HSV-2gI特异性抗体应答，在第三次免疫后21天，似乎观察到HSV-2 gE/gI突变候选物之间的几个差异。事实上，A248T(第2组)和A248T_V340W(第5组)突变体诱导的应答似乎是V340W(第1组)、A246W(第3组)和P318I(第4组)突变体诱导的应答的两倍高(GMR为2，CI不含1，表明有影响，或CI几乎不含1，表明影响的趋势)。突变体之间未观察到其他差异(GMR＜2倍变化，CI包含1)(图19B)。
与预期一致，在NaCl对照组中未观察到抗HSV-1 gE/gI交叉反应性应答(所有小鼠为11EU/mL)。在第三次免疫后21天并与NaCl对照组比较，在用不同形式(突变和氨基酸插入)的LNP配制的SAMHSV-2 gE/gI载体免疫的所有小鼠组中诱导了高抗HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体应答(所有GMR＞11.000)(图20，图21)。总的来说，疫苗免疫小鼠组的头对头比较表明在第三次免疫后21天的类似的抗HSV-1 gE/gI交叉反应性IgG抗体应答(大多数GMR＜2倍变化，CI包含1)。与V340W突变体(第1组)相比，仅A246W突变体(第3组)似乎诱导了更高的应答，增加了2.28倍(CI不含1)(图22)。
不同LNP/SAM HSV-2 gE/gI突变体能够诱导功能性疫苗特异性和HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体应答
在该研究中，仅在第三次免疫后21天收集的血清中考察了疫苗HSV-2 gE/gI特异性&HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体功能。在这方面，研究了疫苗诱导的pAb中和HSV-2MS或HSV-1VR1789病毒的能力，在与HSV-2 gE/gI转染的细胞孵育后结合和激活Jurkat报告细胞系表达的mFcγRIII的能力，以及降低HSV-2或HSV-1 gE/gI蛋白体外结合人IgG-Fc的能力。
在用LNP配制的SAM-HSV-2 gE/gI载体的不同形式(突变和氨基酸插入)免疫的所有小鼠组中检测到针对HSV-2MS或HSV-1VR1 789株的极低特异性中和(nAb)抗体应答。结果表明，不同突变体之间的疫苗特异性或交叉反应性抗体中和活性没有明显差异(GMR≤2倍变化，所有CI含有1)。一些疫苗的比较(特别是A248T_V340W(第5组)与V340W(第1组))显示出2倍变化，但由于变异性大，未能达到显著性(图23A和图23B)。在针对HSV-1VR1789株的交叉反应性nAb应答方面，在不同的候选物之间没有观察到差异(参见图24A和图24B)。
然后，通过竞争ELISA在体外评估来自用不同LNP配制的SAM-HSV-2 gE/gI突变候选物免疫小鼠的血清竞争并降低HSV-2或HSV-1 gE/gI蛋白与hIgG结合的能力。所有LNP-SAM HSV-2 gE/gI突变体都引发了疫苗特异性多克隆抗体应答，该应答能够在体外与HSV-2或HSV-1 gE/gI蛋白竞争结合hIgG Fc。(图25和图73)。hIgG Fc与HSV-2 gE/gI蛋白结合的解离曲线在所有小鼠组之间非常相似，ED50的计算显示在小鼠组之间具有相似的应答(图26)。此外，hIgG Fc与HSV-1 gE/gI蛋白结合的解离曲线在所有小鼠组之间也非常相似，这表明突变体之间没有显著差异(图73)。
最后，研究了第三次免疫后14天诱导的疫苗特异性抗体应答在与HSV-2 gE/gI转染的细胞孵育后体外结合和激活小鼠FcγRIII的能力。在图27A-F上显示的数据提示，用不同的LNP-SAM HSV-2 gE/gI突变体免疫的所有小鼠组都可以诱导抗HSV-2 gE/gI特异性抗体应答，其能够特异性结合和激活表达FcγRIII的Jurkat报告细胞。与预期一致，使用来自未接种小鼠的血清未检测到FcγRIII的激活。在FcγRIII激活方面，不同组小鼠之间没有观察到重大差异(图27G)。
总之，这些数据表明，不同的LNP-SAM HSV-2 gE/gI突变体可以诱导疫苗特异性抗体，该抗体能够在与HSV-2 gE/gI转染的细胞孵育后结合并激活FcγRIII，减少HSV-2或HSV-1 gE/gI蛋白与人IgG Fc的结合，并在低强度下中和HSV-2MS和HSV-1 VR1789病毒。
所有LNP/SAM HSV-2 gE/gI突变体诱导抗HSV-2 gE特异性和抗HSV-1 gE交叉反应性CD8+T细胞并降低抗HSV-2 gI特异性CD4+T细胞的水平
在用不同的LNP-SAM HSV-2 gE/gI突变体进行第三次免疫后21天，当与基于NaCl对照组的P95阈值比较时，第3组(A246W)的所有小鼠，第1组(V340W)、第2组(A248T)和第4组(P318I)的大多数小鼠，来自第6组(插入ARAA)的一半小鼠和无来自第5组(A248T_V340W)的小鼠中检测到低水平的抗HSV-2 gE特异性CD4+T细胞应答(GM≤0.2％)(图28A；图29A)。与NaCl对照组相比，在使用不同LNP配制的SAM HSV-2 gE/gI突变体免疫小鼠的所有组中均检测到高的抗HSV-2 gI特异性CD4+T应答(约0.4％，所有小鼠均处于或高于P95阈值，NaCl的GMR范围为14至19，CI不含1)(图28A和图29B)。相比之下，与NaC1阴性对照组相比，在任何接种组中均未检测到HSV-1 gE交叉反应性CD4+T细胞应答(图28A)。
与NaCl对照组相比，在所有接种组中都检测到高水平的抗HSV-2 gE特异性和抗HSV-1 gE交叉反应性CD8+T细胞应答(GMR约为100，CI不含1)(图28B和图30)。与NaCl阴性对照相比，在任何接种组中均未检测到抗HSV-2 gI特异性CD8+T细胞应答(图28B)。
结果表明，LNP配制的SAM-HSV-2 gE/gI载体的不同突变形式在CD4+和CD8+T细胞应答方面都是可比较的(GMR＜2倍变化，大多数CI完全包含在[0.5，2]中和/或包含1)(图31和图32)。由于在A248T_V340W突变体(第5组)的抗HSV-2 gE特异性CD4+T细胞应答中未检测到应答，该组在该应答方面似乎与A246W(第3组)和P318I突变体(第4组)不同(减少2倍，CI不含1)(图31A)。
实施例3-在CB6F1小鼠中几种AS01佐剂化HSV-1 gE/gI抗原(未突变的和突变)的免疫评价
目的
本研究的总体目的是从不同的HSV-1 gE/gI蛋白中产生免疫原性数据，这些蛋白在gE Fc结合结构域中含有单点突变，以降低对人免疫球蛋白G Fc的亲合力。
与NaCl对照组相比，在第三次免疫后14天，在由几种AS01佐剂化HSV-1 gE/gI抗原(未突变或突变)诱导的抗HSV-1 gE/gI特异性多克隆抗体(pAb)应答之间进行比较。
第三次免疫后14天，将HSV-1 gE/gI蛋白的不同突变体诱导的疫苗特异性多克隆抗体(pAb)应答和抗HSV-1 gE/gI特异性CD4+T细胞应答与NaCl对照组进行比较。此外，在第三次免疫后14天，对所有疫苗候选物进行抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体应答以及抗HSV-1gE-和抗HSV-1 gI特异性CD4+T细胞应答的头对头比较。
最后，探索性目的是在用HSV-1 gE/gI突变体免疫的不同组小鼠中，评价一次和两次免疫后的抗HSV-1 gE/gI特异性抗体应答，三次免疫后抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI交叉反应性抗体应答，疫苗特异性和HSV-2 gE/gI交叉反应性多克隆抗体在三次免疫后的功能以及抗HSV-1 gE、抗HSV-1 gI特异性CD8+T细胞应答和抗HSV-2 gE交叉反应性T细胞应答在第三次免疫之后的水平。
研究设计
雌性CB6F1小鼠(n＝6gr1-6和n＝4/gr7)在第0天、第14天和第28天用5μg未突变的HSV-1 gE/gI(gr1)或在AS01中配制的不同突变形式的HSV-1 gE/gI蛋白(gr2-6)进行肌内(i.m)免疫(5μg)。按照相同的免疫计划，另一组小鼠肌内注射生理盐水(NaCl150mM)，并用作阴性对照组(gr7)。
在初免后第13天、第27天和第42天(13PI、13PII、14PIII)收集血清样品，以测量抗HSV-1 gE/gI特异性和抗HSV-2 gE以及抗HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答。在第三次免疫后14天收集的血清样品中，还研究了疫苗特异性抗体和HSV-2交叉反应抗体的功能。在第三次免疫后14天(14PIII)收集脾脏，以评价离体系统性CD4+和CD8+T细胞对HSV-1 gE、HSV-1gI和HSV-2 gE抗原的应答。
背景和科学依据
据估计，全球15至49岁人群中生殖器疱疹的患病者为4.17亿，非洲的疾病负担尤为严重。在资源丰富的国家，单纯疱疹病毒1型(HSV-1)与单纯疱疹病毒2型(HSV-2)作为首次感染生殖器疱疹的病因一样常见。HSV-1后的复发性感染相比于HSV-2生殖器感染较少见；因此，在资源丰富的国家，HSV-2仍然是复发性生殖器疱疹的主要原因，而在资源有限的国家，HSV-2感染的负担甚至更大。一些感染者有严重且频繁的生殖器溃疡爆发，而另一些人有轻微或亚临床感染，但所有人都有将生殖器疱疹传播给亲密伴侣的风险。在受感染的个体中，抗病毒治疗降低了生殖器病变复发的频率和将感染传染给伴侣的风险。然而，对通过接种疫苗来降低临床和亚临床生殖器疱疹复发频率的替代方法存在高需求。
正在开发治疗性疫苗候选物，以预防首次生殖器感染的HSV-2复发。此前的报道表明，由佐剂化重组HSV-2糖蛋白D(gD)构成的疫苗组合物可以减少豚鼠模型和生殖器疱疹患者(HSV-2阳性)生殖器疱疹再激活的50％。疱疹病毒进化出了多种免疫逃逸策略，以在其自然宿主中存活。HSV即编码糖蛋白E(gE)，其靶向体液免疫系统。gE可以与糖蛋白I(gI)形成非共价异二聚体复合物，其功能为免疫球蛋白G(IgG)Fc受体(FcγR)。gE和gI之间的相互作用使人FC结合亲和力增加约100倍。通过抗体结合，FcγR抑制IgG Fc介导的活性，包括补体结合和抗体依赖性细胞毒性。
在治疗性HSV-2的背景下，先前在小鼠中进行的实验表明，人IgG可以与未突变的重组HSV-2 gE/gI蛋白的gE Fc结合结构域结合，并掩盖与HSV-2 gE介导的免疫逃逸机制有关的保护性表位。这些结果表明，类似的情况可能发生在临床研究中，并对HSV-2疫苗的治疗效果产生负面影响。为了避免对人类的负面免疫学干扰，在HSV-2gE/gI蛋白的Fc结合结构域内进行点突变，以降低对hIgG Fc结构域的亲和力，并选择HSV-2 gE_P317R/gI突变构建体作为疫苗候选物。
由于HSV-1和-2病毒都使用这种免疫逃避机制，因此决定还用重组HSV-1 gE/gI蛋白的不同突变形式(gE Fc结合活性显著降低)生成免疫原性数据。
本实验的目的是评价在AS01中配制的五种不同HSV-1 gE/gI突变体在小鼠中的免疫原性。
研究设计
将来自Harlan实验室(OlaHsd)的6-8周龄雌性CB6F1近交系小鼠随机分配到研究组(n＝6gr1-6&n＝4/gr7)，并在指定的无病原体条件下饲养在机构动物实验室中。在第0天、第14天和第28天，CB6F1小鼠(gr1-6)用5μg未突变的(gr1)或在AS01中配制的HSV-1 gE/gI蛋白(gr2-6)的不同突变形式(5μg)肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠用生理盐水(NaCl 150mM)i.m注射，并作为阴性对照组(gr7)。
在初次免疫后第13天、第27天和第42天(13PI、13PII、14PIII)收集血清样品，以测量抗HSV-1 gE/gI特异性以及抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答。在第三次免疫后14天采集的血清样品中，还研究了疫苗特异性抗体和HSV-2交叉反应性抗体的功能。在第三次免疫后14天(14PIII)收集脾脏，以评价针对HSV-1 gE、HSV-1 gI和HSV-2 gE抗原的离体系统性CD4+/CD8+T细胞应答。每组的详细情况如表5中所示。
表5-研究设计和所检测的制剂的总结
材料和方法
研究产品
本研究中使用的抗原是纯化的重组gE/gI蛋白的不同形式(仅胞外域)。该材料仅作为研究批次在ExpiCHOTM细胞上表达。
AS01是一种基于脂质体的佐剂系统(AS)，包含QS-21(一种从皂皮树树皮中纯化的三萜糖苷)和MPL(3-D单磷酰脂A)，脂质体作为这些免疫增强剂的载剂，包含NaCl的缓冲剂作为等渗剂(变体3)。
AS01b佐剂系统的单个人体剂量(0.5mL)包含50μg QS-21和50μgMPL。在这项研究中，小鼠的注射体积是人体剂量的1/10，相当于每剂5μg QS-21和5μg MPL。
动物模型
人们普遍认为，小动物模型是研究新疫苗候选物免疫原性性质的有用工具。为了全面了解我们的疫苗候选物诱导T细胞免疫应答的能力，本研究使用了CB6F1小鼠(C57B1/6和Balb/C小鼠的杂交种)。
CB6F1小鼠已被证明在用各种类型的免疫原(包括佐剂化蛋白和病毒载体)接种后产生有效的CD4+/CD8+T细胞和体液免疫应答。然而，与人类的预期应答相比，在这些小鼠中产生的疫苗诱导的免疫应答的性质可能会受到与TLR表达、HLA背景和抗原呈递有关的一些差异的影响。然而，诱导CD4+/CD8+T免疫应答的能力在这些小鼠和人类之间显示出可比的趋势。
免疫学读取
通过ELISA测量总抗HSV-1 gE/gI特异性IgG结合抗体
使用间接ELISA对总的抗HSV-1 gE/gi特异性IgG抗体进行定量。将来自HSV-1的重组gE/gI异二聚体蛋白(BMP1299)作为包被抗原。使用ExpiCHOTM表达系统生产该蛋白。如实施例1中所述进行该ELISA的其他操作。
用SoftMaxPro GxP v5.3软件捕获和分析光密度(OD)。通过对参考标准品结果应用4参数逻辑回归拟合生成标准曲线(参考标准品＝2020002314PIII-用AS01-HSV-1 gE/gIHEK免疫的1.1至1.20小鼠混合物(每只5μg/剂))。通过标准曲线的插值计算样品中的抗体效价。样品的抗体效价是通过对落在标准曲线的20-80％动态范围内的稀释液的值进行平均而获得的。效价以EU/mL(ELISA单位/mL)表示。
通过ELISA测量总抗HSV-2 gE&gI交叉反应性IgG抗体
使用间接ELISA对总抗HSV-2 gE或gI交叉反应性IgG抗体进行定量。使用来自HSV-2的重组gE(～51kDa)(BMP1291)或gI蛋白(～46kDa)作为包被抗原。这些蛋白质是使用ExpiHEK293FTM表达系统产生的。根据在实施例1中针对该方法的描述进行该间接ELISA的其他步骤。
通过ICS测定测量抗HSV-1 gE和gI特异性以及HSV-2 gE交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答
在用HSV-1 gE或gI或者HSV-2 gE肽混合物离体刺激后在第三次免疫后14天收集的脾细胞中评价产生IL-2和/或IFN-γ和/或TNF-α的抗HSV-1 gE&抗HSV-1 gI特异性以及抗HSV-2 gE交叉反应性CD4+和CD8+T细胞的频率。
脾细胞的分离
如在实施例1中针对该方法所述。
细胞的制备
以106个细胞/孔(100μL)将新鲜脾细胞接种在圆底96孔板中。然后用抗CD28(BDbiosciences，克隆37.51)和抗CD49d抗体(BD Biocience，克隆9C10(MFR4.B))以1μg/mL/孔刺激细胞6小时(37℃，5％CO2)，每孔含有100μL下述任一：
-15mer重叠肽混合物，涵盖来自HSV-1的gE蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)。
-15mer重叠肽混合物，涵盖来自HSV-1的gI蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)。
-15mer重叠肽混合物，涵盖来自HSV-2的gE蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)。
-15mer重叠肽混合物，涵盖人β肌动蛋白蛋白序列(每孔每肽1μg/mL)(无关刺激)。
-RPMI/添加剂培养基(作为测定的阴性对照)。
-PMA-离子霉素溶液(Sigma，P8139)，工作浓度分别为0,25μg/mL和2，5μg/mL(作为测定的阳性对照)。
在离体刺激2小时后，添加在补充有5％FCS的RPMI/添加剂中1/200稀释的Brefeldin A(Golgi plug ref 555029，BD Bioscience)另外4小时，以抑制细胞因子分泌。然后将板转移到4℃下孵育过夜。
胞内细胞因子染色
如在实施例1中针对该方法所述。
细胞采集和分析
如在实施例1中针对该方法所述。
竞争ELISA法评价疫苗特异性抗体降低HSV-1 gE/gI蛋白与人IgG Fc结合的能力
通过竞争ELISA研究了在不同组小鼠中收集的多克隆血清在体外减少重组HSV-1gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。使用ExpiCHOTM表达系统生产的重组HSV-1 gE/gI蛋白(BMP1299)作为包被抗原。
将聚苯乙烯96孔ELISA板(Nunc F96 Maxisorp目录号439454)用50μL/孔在游离钙/镁PBS缓冲液中以2μg/mL的浓度稀释的HSV-1 gE/gI蛋白包被，并在4℃下孵育过夜。孵育后，去除包被溶液，并用补充有0.1％吐温-20+1％BSA(封闭缓冲液)的100μL/孔PBS在37℃下封闭板1h。
在另一个96孔透明V底聚丙烯微孔板(Falcon，ref 353263)中，在60μl/孔中制备每种血清的封闭缓冲液中两倍连续稀释物(初始稀释度1/10)，并与在封闭缓冲液中以0.7μg/mL预稀释的60μl/孔生物素化hIgG抗体(Invitrogen，ref 12000C)混合。
然后，用封闭缓冲液孵育1h后，从包被板中去除封闭溶液，将100μL含有hIgG和小鼠血清的混合物转移到相应的HSV-1 gE/gI包被孔中，并在37℃下孵育24h。测定的阳性对照是来自此前研究的抗HSV-2 gE/gI血清样品的混合物。测定的阴性对照是稀释1/1000并与hIgG混合的无关HPV血清样品混合物。
孵育24h后，用PBS 0.1％吐温20(洗涤缓冲液)洗板四次，并在孔上加入稀释2000x的50μL/孔的抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物酶AMDEX(Amersham，ref RPN4401V)，并在37℃下孵育板30min。然后用洗涤缓冲液洗板四次，并在室温下加入50μL/孔的含有75％单组分TMB过氧化物酶ELISA底物(ref 172-1072，Bio-Rad，USA)的溶液(该溶液在柠檬酸钠0.1M pH5.5缓冲液中稀释)10 min。用50μL/孔的0.4N硫酸1M(H2SO4)终止酶促显色，并使用Versamax ELISA酶标仪在450/620nm的吸光度下读板。捕获光密度(OD)并在Excel程序中拟合在曲线中。
效价表示为通过样品稀释获得50％(即，EDs0)信号的有效稀释度。
对于每个板并使用参考样品(即，无关血清)，使用以下公式估计参考ED50值：
ED50＝OD0％+0.5*(OD100％-OD0％)
其中OD100％是使用相似样品获得的最高OD和OD0％是能够获得的最低信号。对于每个板，前者通过平均6次重复(平均值)获得，而后者设置为零。
样品ED50效价是通过最接近板内ED50估计值的左右测量值之间的线性插值计算的。利用stats R基本包的approx函数，在未转换的OD和以10为底的对数转换的稀释液上获得近似值。
在下述情况下，未分配样品效价：
○在ED50之上或之下没有可用的测量，
○曲线至少跨ED50的两倍，并且
○缺少最接近ED50的稀释步骤之一(左侧或右侧)
竞争ELISA法评价HSV-2交叉反应性抗体降低HSV-2 gE/gI蛋白与人IgG Fc结合的能力
通过竞争ELISA研究了在不同组小鼠中收集的多克隆血清降低体外重组HSV-2gE/gI蛋白结合hIgG Fc的能力。使用ExpiHEK293FTM表达系统生产的重组HSV-2 gE/gI蛋白(BMP 1063)作为包被抗原。
将聚苯乙烯96孔ELISA板(Nunc F96 Maxisorp目录号439454)用50μL/孔在游离钙/镁PBS缓冲液中以4μg/mL的浓度稀释的HSV-2 gE/gI蛋白包被，并在4℃下孵育过夜。孵育后，去除包被溶液，并用补充有0.1％吐温-20+1％BSA(封闭缓冲液)的100μL/孔PBS在37℃下封闭板1h。
从包被板中除去封闭溶液，将60μL的两次连续稀释的个体小鼠血清(封闭缓冲液中的初始稀释度1/10)制备到96孔透明V底聚丙烯微孔板(Falcon，ref 353263)中，并与60μL/孔的封闭缓冲液中以0.7μg/mL预稀释的生物素化hIgG抗体(Invitrogen，ref 12000C)混合。去除HSV-2 gE/gI包被板的封闭缓冲液，然后将100μL混合物转移到相应的孔中，在37℃下孵育24h。该测定的阳性对照血清是来自先前研究的HSV-2血清样品混合物。测定的阴性对照血清是稀释1/100并与hIgG混合的无关HPV血清样品的混合物。
孵育后，用PBS+0.1％吐温20(洗涤缓冲液)洗板四次，并在孔上加入稀释2000x的50μL/孔的抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物酶AMDEX(Amersham，ref RPN4401V)，并在37℃下孵育板30min。孵育后，用洗涤缓冲液洗板四次，并在室温下加入50μL/孔的含有75％单组分TMB过氧化物酶ELISA底物(ref 172-1072，Bio-Rad，USA)的溶液(该溶液在柠檬酸钠0.1M pH5.5缓冲液中稀释)10min。用50μL/孔的0.4N硫酸1M(H2SO4)终止酶促显色，并使用Versamax ELISA酶标仪在450/620nm的吸光度下读板。捕获光密度(OD)并在Excel程序中拟合在曲线中。
效价表示为通过样品稀释获得50％(即，ED50)信号的有效稀释度。
对于每个板并使用参考样品(即，无关血清)，使用以下公式估计参考ED50值：
ED50＝OD0％+0.5*(OD100％-OD0％)
其中OD100％是使用相似样品获得的最高OD和OD0％是能够获得的最低信号。对于每个板，前者通过平均6次重复(平均值)获得，而后者设置为零。
样品ED50效价是通过最接近板内ED50估计值的左右测量值之间的线性插值计算的。利用stats R基本包的approx函数，在未转换的OD和以10为底的对数转换的稀释液上获得近似值。
在下述情况下，未分配样品效价：
○在ED50之上或之下没有可用的测量，
○曲线至少跨ED50的两倍，并且
○缺少最接近ED50的稀释步骤之一(左侧或右侧)
在与HSV-1或HSV-2 gE/gI转染的细胞孵育后评价HSV-1 gE/gI特异性和HSV-2gE/gI交叉反应性抗体结合和激活mFcγRIII的能力(小鼠FcγRIII ADCC生物测定-Promega)
由Promega laboratory实验室开发的小鼠FcγRIII抗体依赖性细胞毒性(ADCC)报告基因生物测定(目录号M1201)是一种基于生物发光细胞的测定，可用于测量抗体特异性结合和激活由修饰的Jurkat报告细胞表达的小鼠FcγRIII的能力。如实施例1中所述使用该方法。
小鼠ADCC样测定中的样品效价是通过曲线下面积(AUC)计算的，如Huang和Pang(Assay Drug Dev Technol.201210(1)：88-96)中所述，并稍作修改。简言之，对数转换应答(即，RLU)在log3转换的样品系列稀释液上拟合，针对板上每个样品使用5参数logistic模型。阴性对照样品(即，稀释1/1000的无关小鼠血清)用于评估每个平板中的背景信号阈值，即其几何平均值加上3个标准偏差(即，exp[平均值(logRLU)+3*sd(logRLU))。使用“R”软件中的“积分”函数计算每个样品拟合曲线下方和板背景上方的面积(即，AUC)。
体外HSV-1中和测定
开发了一种体外中和测定来检测和量化不同动物物种血清样品中HSV-1特异性中和抗体的效价。如实施例1中所述使用该方法。
体外HSV-2中和测定
如实施例1中所述使用该方法。
统计学方法
假设每个响应的分布是对数正态的。
对于抗HSV-1 gE/gI特异性抗体(pAb)，在log10效价上拟合双因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)、时间点(第13天(13PI)、第27天(13PII)和第42天(14PIII))及其交互作用作为固定效应。NaCl组不包括在内，因为没有观察到应答和变异。方差-协方差模型的选择基于AICC标准和个体数据图检查。
通过非结构化矩阵对时间点的方差-协方差进行建模：
UN-非结构化
非结构化矩阵考虑不同的方差，并估计每对时间点的唯一相关性。为每个疫苗组建模相同的方差-协方差矩阵，表明组之间的方差相同。
几何平均值及其95％置信区间均来自该模型。
尽管NaCl组不包括在ANOVA模型中，但与主要目的相关的比较计算如下：将源自上述模型的接种组的几何平均值和95％CI除以效价，并在最后一个时间点给予所有NaCl接受者。所得比率应理解为几何平均值比及其相应的95％置信区间。
对于接种组(在最后一个时间点)的头对头比较和每组内的时间点比较(PII/PI、PIII/PII和PIII/PI)，所有几何平均值比及其95％CI均来自该模型。
对于每个HSV-2 gE和gI交叉反应性IgG抗体应答，在log10效价上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)作为固定效应。NaCl组不包括在内，因为没有观察到应答和变异。对于gE交叉反应性IgG抗体效价，检测到方差的异质性，因此假设每组的方差不同。对于gI交叉反应性IgG抗体效价，没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。几何平均值及其95％置信区间均来自这些模型。为了比较接种组和NaCl组，根据上述模型得出的接种组的几何平均值和95％ CI除以所有NaCl接受者的效价。所得比率应理解为几何平均值比及其相应的95％置信区间。对于接种组的头对头比较，所有几何平均值比及其95％ CI均来自该模型。
对于每种疫苗特异性或交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答(gE或gI)的％，在log10频率上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(包括NaCl组在内的所有组)作为固定效应。没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。对于CD4+和CD8+T细胞应答的％，NaCl阈值基于NaCl阴性对照组中刺激数据的P95。没有对HSV-1 gE特异性CD8+T细胞的％和HSV-2 gE交叉反应性CD8+T细胞的％进行建模，因为所有疫苗组的应答都低于P95NaCl阈值。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％ CI)均来自这些模型。
为了评估pAb对人IgG Fc结合的解离，计算每个样品的ED50应答。对于每种应答(HSV-1或HSV-2)，在log10值上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)作为固定效应。没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％ CI)均来自这些模型。
对于HSV-1特异性中和抗体效价，在log10值上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)作为固定效应。没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％ CI)均来自这些模型。
结果
AS01-HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式能够诱导疫苗特异性和交叉反应性IgG抗体
通过ELISA考察了抗HSV-1 gE/gI-疫苗特异性和抗HSV-2 gE或抗HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答。
与预期一致，在NaCl对照组中未观察到抗HSV-1特异性gE/gI应答(针对所有小鼠<30EU/ml)，而在最后一个时间点，所有AS01佐剂化HSV-1 gE/gI接种小鼠(gr2-6)产生大于2.000.000EU/mL的应答。与NaCl对照组相比，在第三次免疫后14天在该研究中检测的所有AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白(未突变的和突变的形式)诱导较高抗HSV-1 gE/gI-疫苗特异性IgG抗体应答(所有GMR＞80.000)(图33和图34)。
在使用HSV-1 gE/gI蛋白的不同突变形式免疫小鼠的所有组中，与第一次免疫(第13天(13PI))比较，第二次免疫(第27天(13PII))后抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体应答增加，增加了68至145倍(图35A)。
对于所有HSV-1 gE/gI突变体候选物，与第二次免疫(第27天(13PII))比较，第三次免疫(第42天(13PIII))后观察到类似的抗HSV-1 gE/gI特异性抗体应答，增加了接近1倍(CI包含1)，表明第三剂无加强作用(图35B)。
总之，结果表明，在第三次免疫后14天，不同突变形式的HSV-1gE/gI突变候选物之间(GMR变化接近1倍，大多数CI完全包含在[0.5,2]中)以及不同突变形式和未突变形式的HSV-1 gE/gI蛋白之间的抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体应答非常相似(图36)。
与预期一致，在NaCl对照组中未观察到抗HSV-2 gE和抗HSV-2gI交叉反应性应答(针对所有小鼠17EU/mL)。在第三次免疫后14天并且与NaCl对照组相比，在用不同未突变和不同突变形式的AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白免疫小鼠的所有组中均诱导了较高的抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答(针对gE，所有GMR＞9.000，针对gI，所有GMR＞2.000)(图37，图38)。
在第三次免疫后14天，在抗-HSV-2 gE和抗-HSV-2 gI交叉反应性抗体应答上观察到未突变的HSV-1 gE/gI和突变候选物之间的几个差异。事实上，由未突变的疫苗蛋白(第1组)诱导的抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI交叉反应性应答似乎高于由P319R突变体(第2组)和N243A_R322D突变体(第5组)诱导的应答(变化倍数为2至7倍，CI不含1)。A340G_S341G_V342G突变体(第6组)的抗HSV-2HSV-2 gE和抗HSV-2 gI应答似乎也高于P319R突变体(第2组)(GMR分别为2.9和2.7，CI不含或几乎不含1)。此外，R322D突变体(第4组)诱导的抗HSV-2gE应答似乎是P319R突变体(第2组)诱导的应答的两倍高(CI不含1)。最后，P321D(第3组)、R322D(第4组)和A340G_S341G_V342G(第6组)突变体诱导的抗HSV-2 gI应答似乎高于N243A_R322D突变体(第5组)诱导的应答(变化倍数范围为2至5倍，CI不含1)。突变体之间似乎没有观察到其他差异(GMR＜2倍变化和/或CI含有1)(图39)。
AS01-HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式能够诱导功能性疫苗特异性和HSV-2 gE/gI交叉反应性抗体应答
在该研究中，仅在第三次免疫后14天收集的血清中考察了HSV-1特异性&HSV-2gE/gI交叉反应性抗体功能。在这方面，研究了疫苗诱导的pAb在与HSV-2或HSV-1 gE/gI阳性3T3细胞孵育后中和HSV-1和HSV-2病毒、降低HSV-1或HSV-2 gE/gI蛋白对人IgG Fc的体外结合以及交叉反应和激活修饰的Jurkat细胞上表达的mFcγRIII的能力。
在用不同形式的AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白免疫的所有小鼠组中检测到针对HSV-1VR-1789株的一致的中等水平的中和抗体(nAb)应答(图40A)。这些结果表明，不同组小鼠之间的HSV-1中和活性没有差异(GMR<2倍变化，且所有CI含有1)。然而，与P319R突变体相比，观察到未突变组的应答更高的趋势(GMR P319R/未突变＝0.55，CI的上限略高于1)(图40B)。相比之下，在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白免疫的任何组中，均未检测到针对HSV-2MS株的抗HSV-2交叉反应性nAb应答(图41)。
然后，通过竞争ELISA在体外评估用不同形式的HSV-1 gE/gI蛋白免疫小鼠的血清竞争和降低HSV-1或HSV-2 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的能力。所有HSV-1 gE/gI蛋白(突变和未突变)都能引发疫苗特异性和HSV-2交叉反应性多克隆抗体，这些抗体能够降低HSV-1或HSV-2 gE/gI蛋白与hIgG Fc的结合(图42；图44)。
在相同的血清稀释度下，hIgG Fc与HSV-1 gE/gI蛋白的结合水平在不同组的HSV-1 gE/gI免疫小鼠之间非常相似。ED50的计算表明，与未突变的突变体(第1组)相比，只有R322D(第4组)和A340G_S341G_V342G(第6组)突变体似乎诱导了更高的应答，分别增加了2.2和2.4倍(以及CI不含1)。在不同组之间未观察到其他差异(GMR＜2倍变化和CI含有1)(图43A；图43B)。
在相同的血清稀释度下，似乎观察到HSV-1 gE/gI免疫小鼠组之间在hIgG Fc与HSV-2 gE/gI蛋白的结合水平上的一些差异。事实上，由未突变蛋白(第1组)诱导的应答似乎高于由P319R(第2组)、P321D(第3组)、R322D(第4组)和N243A_R322D(第5组)突变体诱导的应答(倍数变化范围为2至3，且CI不含1)。还似乎观察到A340G_S341G_V342G突变体(第6组)的应答高于P319R突变体(第2组)的趋势(GMR为1.90，CI几乎不含1)。各组之间似乎没有观察到其他差异(GMR＜2倍变化，CI包含1)。(图45A和图45B)。
最后，在第三次免疫后14天，研究了HSV1 gE/gI特异性或HSV-2 gE/gI-交叉反应性抗体在体外与HSV-1或HSV-2 gE/gI转染的3T3细胞孵育后结合和激活小鼠FcγRIII的能力。图46、图47和图74所示的数据表明，用不同的HSV-1 gE/gI突变体候选物免疫的所有小鼠在与HSV-1或HSV-2 gE/gI转染的细胞孵育后，都可以诱导能够结合和激活表达FcγRIII的Jurkat报告细胞的疫苗特异性或HSV-2 gE/gI交叉反应性抗体。与预期一致，使用来自未接种疫苗的、NaCl对照小鼠的血清未检测到FcγRIII的激活(图46和图74)。所有这些数据表明，HSV-1 gE/gI蛋白的不同突变形式可以诱导针对HSV-1或HSV-2 gE/gI蛋白的功能性疫苗特异性或HSV-2 gE/gI交叉反应性抗体应答。
4S01-HSV-1 gE/gI蛋白的不同形式诱导抗HSV-1 gE/gI特异性和抗HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞应答
与NaCl对照组相比，在用AS01佐剂化HSV-1 gE/gI蛋白(未突变和突变形式)免疫的所有小鼠组中，在第三次免疫后14天检测到更高的抗HSV-1 gE和gI特异性和抗HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞应答(图48A)，接种组和NaCl组之间增加了11至63倍(CI不含1)(图49A、图49B和图49C)。然而，与NaCl对照组相比，仅在所有接种组中检测到抗HSV-1 gI特异性CD8+T细胞应答不一致(GMR范围为5至7，CI不含1)。从生物学角度来看，抗HSV-1gI特异性CD8+T细胞应答被认为是不相关的(0.1％-0.14％)(图49C和图50)。与NaCl对照组相比，在任何接种组中均未检测到抗HSV-1gE特异性或抗HSV-2 gE交叉反应性CD8+T细胞应答(数据未显示)。
总体而言，结果表明，不同突变形式的HSV-1 gE/gI蛋白与未突变的HSV-1 gE/gI候选蛋白之间的疫苗特异性和交叉反应性CD4+T细胞应答非常相似。与未突变的形式(第1组)相比，只有P321D突变体(第3组)似乎诱导了更高的CD4+T细胞应答，增加了接近2倍(抗HSV-1 gE特异性CD4+T细胞的GMR为1.9，HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞的GMR为2，抗HSV-1gI特异性CD4+T细胞的GMR为1.89，CI不含1)(图5IA和图52)。此外，与未突变的蛋白(第1组)相比，R322D突变体(第4组)也观察到更高的抗HSV-1 gE特异性CD4+T细胞应答的趋势(GMR为1.96，CI不含1)(图51B)。最后，与R322D突变体(第4组)相比，P321D突变体(第3组)观察到略高的抗HSV-1 gI特异性CD4+T细胞应答(几乎增加2倍，CI不含1)(图52)。在突变体之间未观察到其他差异(GMR<2倍变化和/或CI含有1)。
实施例4-在CB6F1小鼠中几种LNP膨制的SAM HSV-1 gE/gI突变体的免疫评价
目的
本研究的目的是从不同LNP配制的SAM-HSV-1 gE/gI构建体产生免疫原性数据，该构建体包含gE Fc结合结构域中的突变，以降低对人免疫球蛋白G Fc结构域的亲合力。
第二次免疫后21天，将LNP配制的SAM HSV-1 gE/gI构建体的不同突变体诱导的疫苗特异性多克隆抗体(pAb)应答和抗HSV-1gE/gI特异性CD4+T细胞应答与NaCl对照组进行比较。此外，在第二次免疫后21天，对所有疫苗候选物的抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体应答和抗HSV-1 gE-和抗HSV-1 gI特异性CD4+T细胞应答进行头对头比较。
最后，探索性目的是在用LNP配制的SAM HSV-1 gE/gI构建体的不同突变形式免疫小鼠的不同组中，评价一次免疫后抗HSV-1gE/gI特异性抗体应答、两次免疫后抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI交叉反应性抗体应答、疫苗特异性和HSV-2 gE/gI交叉反应性多克隆抗体在两次免疫后的功能、以及抗HSV-1 gE特异性和抗HSV-1 gI特异性CD8+T细胞应答和抗HSV-2gE交叉反应性T细胞应答在第二次免疫后的水平。
研究设计概述
将来自Harlan实验室(OlaHsd)的6-8周龄雌性CB6F1近交系小鼠随机分配到研究组(n＝6gr1-5；n＝6gr6)，并在指定的无病原体条件下饲养在机构动物实验室中。在第0天和第28天，CB6F1小鼠(gr1-5)用在脂质纳米颗粒(LNP)中配制的1μg不同形式的SAM HSV-1gE/gI突变体进行肌内(i.m)免疫。按照相同的免疫计划，另一组小鼠用生理盐水(NaCl150mM)i.m注射，并作为阴性对照组(gr6)。
在初免后第28和49天收集血清样品(28PI、21PII)，以测量抗HSV-1 gE/gI特异性和交叉反应性抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI IgG抗体应答。在第二次免疫后21天收集的血清样品中，还研究了疫苗特异性和抗HSV-1 gE/gI交叉反应性抗体的功能。在第二次免疫后21天(21PII)收集脾脏，以评价离体系统性CD4+和CD8+T细胞对HSV-1 gE、HSV-1 gI&HSV-2 gE抗原的应答。每组的详细情况如表6中所示。整个研究共使用了36只动物。
表6-研究设计和所检测的制剂的总结
材料和方法
研究产品
根据已建立的方案通过体外转录(IVT)产生SAM HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式。如下所示根据已建立的方法制备LNP加SAM。在这种方法中，LNP-SAM是通过将脂质的乙醇溶液与含有SAM的水性缓冲液快速混合来制备的。快速混合导致与SAM离子配对的疏水性成分过饱和。
SAM/脂质复合物通过成核介导的沉淀冷凝和沉淀，产生小而窄分散的纳米颗粒。在该混合步骤之后，脂质纳米颗粒成熟以包埋RNA，然后通过缓冲液交换步骤转移到最终的Tris/蔗糖储存缓冲液中。然后对LNP溶液的尺寸、脂质含量、RNA包埋、最终SAM浓度和体外效力进行表征。在添加5％(w/v)蔗糖后，材料可以在-80℃下冷冻6个月。
免疫学读取
通过ELISA测量，总抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体
如实施例3中所述进行。
通过ELISA测量，总抗HSV-2 gE&抗HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体
如实施例3中所述进行。
通过ICS测定测量抗HSV-1 gE和抗HSV-1 gI特异性以及抗HSV-2 gE交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答
如实施例3中所述进行。
竞争ELISA法评价疫苗特异性抗体降低HSV-1 gE/gI蛋白与人IgG Fc结合的能力
如实施例3中所述进行。
竞争ELISA法评价HSV-1交叉反应性抗体降低HSV-2 gE/gI蛋白与人IgG Fc结合的能力
如实施例3中所述进行。
评价HSV-2交叉反应性抗体与HSV-2 gE/gI转染的细胞孵育后结合和激活mFcγRIII的能力(小鼠FcγRIII ADCC生物测定-Promega)
如实施例3中所述进行。
体外HSV-1中和测定
如实施例3中所述进行。
体外HSV-2MS中和测定
如实施例3中所述进行。
统计学方法
假设每个响应的分布是对数正态的。
对于抗HSV-1 gE/gI特异性多克隆抗体(pAb)应答，在log10效价上拟合双因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)、时间点(第28天(28PI)和第49天(21PII))及其交互作用作为固定效应。NaCl组不包括在内，因为没有观察到应答和变异。方差-协方差模型的选择基于AICC标准和个体数据图检查。
通过复合对称性矩阵对时间点进行方差-协方差建模：
CS-复合对称性
复合对称性考虑了时间点之间相同方差和相同相关性。对每个疫苗组进行相同的方差-协方差矩阵建模，表明各组之间的方差相同。
几何平均值及其95％置信区间均来自该模型。
尽管NaCl组不包括在ANOVA模型中，但与主要目的相关的比较计算如下：源自上述模型的接种组的几何平均值和95％CI除以在最后时间点给予所有NaCl接受者的效价。所得比率应理解为几何平均值比及其相应的95％置信区间。
对于接种组(在最后一个时间点)的头对头比较和每组内的时间点比较(PII/PI)，所有几何平均值比及其95％置信区间均来自该模型。
对于每个HSV-2交叉反应性IgG抗体应答(gE或gI)，在log10效价上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组外的所有组)作为固定效应。NaCl组不包括在内，因为没有观察到应答和变异。没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。几何平均值及其95％置信区间均来自这些模型。为了比较接种组和NaCl组，根据上述模型得出的接种组的几何平均值和95％CI除以给予所有NaCl接受者的效价。所得比率应理解为几何平均值比及其相应的95％置信区间。对于接种组的头对头比较，所有几何平均值比及其95％ CI均来自该模型。
对于每种疫苗特异性或交叉反应性CD4+/CD8+T细胞应答(gE或gI)的％，在log10频率上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(包括NaCl组的所有组)作为固定效应。HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞应答的％没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。对于其他应答，对不同组的不同方差进行了建模。对于CD4+和CD8+T细胞应答的％，NaCl阈值基于NaCl阴性对照组中刺激数据的P95。没有对HSV-1 gE特异性或HSV-2 gE交叉反应性CD8+T细胞的％进行建模，因为所有疫苗组的大部分应答低于P95 NaCl阈值。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％CI)来自这些模型。
为了评价pAb(HSV-1或HSV-2)对人IgG Fc结合的解离，计算每个样品的ED50应答。对于每种应答(HSV-1或HSV-2)，在log10值上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组以外的所有组)作为固定效应。没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％CI)来自这些模型。
对于HSV-1特异性中和抗体效价，在log10值上拟合单因素方差分析(ANOVA)模型，通过包括组(除NaCl组以外的所有组)作为固定效应。没有检测到明显的方差异质性，因此假设不同组的方差相同。几何平均值和几何平均值比(及其相应的95％CI)来自该模型。
结果
不同LNP/SAM HSV-1 gE/gI突变体诱导疫苗特异性和抗HS V-2 gE和抗HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答
通过ELISA考察了抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体应答的水平。值得注意的是，由于缺乏可用血清，NaCl组中的一个样品(样品6.2)在第二次免疫后21天未进行评价。
第二次免疫后21天，与NaCl对照组相比，所有LNP/SAM-HSV-1gE/gI接种组出现了强抗HSV-1 gE/gI特异性抗体应答(应答大于600.000EU/mL；所有GMR＞18.000)(图53和图54)。与预期一致，在NaCl对照组中未观察到抗HSV-1 gE/gI特异性应答(针对所有小鼠<40EU/m1)。在使用LNP配制的SAM-HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式免疫小鼠的所有组中，与第一次免疫相比(第28天(28PI))，第二次免疫后(第49天(21PII))抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体应答增加，增加了12至16倍(图55)。
最后，所有疫苗免疫小鼠组的头对头比较表明，在第二次免疫后21天，LNP配制的SAM-HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式之间诱导了类似的抗HSV-1 gE/gI特异性IgG抗体应答(GMR变化接近1倍，大多数CI完全包含在[0.5，2]中，并且含有1)(图56)。
与预期一致，在NaCl对照组中未观察到抗HSV-2 gE和抗HSV-2gI交叉反应性应答(针对所有小鼠<30EU/mL)。在第二次免疫后21天并且与NaCl对照组比较，在用LNP配制的SAM-HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式免疫的所有小鼠组中诱导了高抗HSV-2 gE和抗HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答(针对gE的所有GMR＞2.000，针对gI的所有GMR＞600)(图57，图58)。总的来说，疫苗免疫小鼠组的头对头比较显示了在第二次免疫后21天类似的抗HSV-2gE或抗HSV-2 gI交叉反应性IgG抗体应答(大多数GMR＜2倍变化和/或CI含有1)。与R322D突变体(第3组)相比，只有A340G_S341G_V342G突变体(第5组)似乎诱导了更高的gE应答，增加了2.47倍(CI不含1)(图59)。
LNP/SAM HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式能够诱导功能性HSV-1gE/gI特异性和HS V-2 gE/gI交叉反应性抗体应答
在该研究中，仅在第二次免疫后21天收集的血清中研究了HSV-1特异性和HSV-2交叉反应性抗体功能。在这方面，针对每组小鼠研究了多克隆Ab在与HSV-2 gE/gI阳性3T3细胞孵育后，中和HSV-1或HSV-2病毒、在体外减少HSV-1或HSV-2 gE/gI蛋白对人IgG Fc的结合以及结合和激活修饰的Jurkat细胞上表达的mFcγRIII的能力。
值得注意的使，由于缺乏可用血清，NaCl组中的一个样品(样品6.2)未在HSV-1/HSV-2中和测定和HSV-1/HSV-2 gE/gI蛋白的hIgG竞争ELISA中进行评价。此外，出于相同原因，LNP/SAM-HSV-1gE_P321D/gI组中的一个额外的样品(样品2.3)也没有在HSV-2中和测定和HSV-1/HSV-2 gE/gI蛋白的hIgG竞争ELISA中进行评价。
在用LNP配制的SAM-HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式免疫的所有小鼠组中检测到针对HSV-1VR-1789株的较低但一致的疫苗特异性中和抗体(nAb)应答(图60A)。组比较后，未发现不同候选物引起的应答强度存在差异(GMR接近1，所有CI均含有1)(图60B)。然而，在任何接种组小鼠中未检测到针对HSV-2MS株的交叉反应性nAb应答(图61)。
然后，通过竞争ELISA评估来自用不同LNP配制的SAM-HSV-1gE/gI突变体免疫小鼠的血清在体外竞争和减少HSV-1或HSV-2gE/gI蛋白与hIgG-Fc结合的能力。所有LNP/SAMHSV-1 gE/gI突变体激发的疫苗特异性多克隆抗体应答能够减少hIgG Fc与HSV-1或HSV-2gE/gI蛋白的结合。在用不同LNP/SAM HSV-1 gE/gI突变体免疫小鼠中收集的多克隆血清中，未观察到HSV-1 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的解离曲线有明显差异(GMRs接近1，所有CI均含有1)，这表明所有候选物都诱导了能够抑制HSV-1 gE/gI蛋白结合hIgG Fc的疫苗特异性功能抗体(图62和图63)。此外，在用不同LNP/SAM HSV-1 gE/gI突变体免疫的小鼠中收集的多克隆血清中，未观察到HSV-2 gE/gI蛋白与hIgG Fc结合的解离曲线的显著差异(大多数GMR＜2倍变化和/或CI含有1)。与N243A_R322D突变体(第4组)相比，只有A340G_S341G_V342G突变体(第5组)似乎诱导了更高的交叉反应性HSV-2hIgG FC结合应答，增加了2.18倍(CI不含1)。还观察到A340G_S341G_V342G突变体(第5组)的应答似乎也高于R322D突变体(第3组)(GMR为1.86，CI几乎不含1)的趋势(图64，图65)。
最后，在第二次免疫后21天，研究了疫苗特异性pAb在与HSV-2gE/gI转染的3T3细胞孵育后体外结合和激活小鼠FcγRIII的能力。图66中的数据表明，所有用不同LNP-SAM-HSV-1 gE/gI突变体候选物免疫的小鼠在与HSV-2 gE/gI转染的细胞孵育后都可以诱导HSV-2交叉反应性抗体，该抗体能够特异性结合并激活表达FcγRIII的Jurkat报告细胞。与预期一致，未接种疫苗的、NaCl对照小鼠的血清中未检测到FcγRIII的激活(图66)。
总之，这些结果表明，LNP-SAM HSV-1 gE/gI的所有突变形式都可以在小鼠第二次免疫后21天诱导功能性疫苗特异性和交叉反应性多克隆抗体应答。
LNP/SAM HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式诱导疫苗特异性和交叉反应性T细胞应答
与NaCl对照组相比，在用LNP配制的SAM-HSV-1 gE/gI载体的不同突变形式免疫的所有小鼠组中，在第二次免疫后21天检测到更高的抗HSV-1 gE和抗HSV-1 gI特异性和HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞应答(图67A)。值得注意的是，仅观察到中等水平的抗HSV-1 gE特异性CD4+T细胞应答(约0.4％，与NaCl相比GMR约为25)(图67A；图68A)。与NaCl对照组相比，在所有接种组中也检测到交叉反应性HSV-2 gE CD4+T细胞应答(GMR范围为5-14，CI不含1)，但这种应答较低(约0.15％)(图67A；图68B)。与NaCl对照组相比，在用LNP配制的SAMHSV-1 gE/gI载体的不同突变形式免疫的所有小鼠组中检测到高抗HSV-1 gI特异性CD4+/CD8+T细胞应答(抗HSV-1 gI-CD4+T细胞约为1％，抗HSV-1gI-CD8+T细胞约为3％，与NaCl相比的GMR约为100)(图67A；图67B；图68C；图68D)。然而，与NaCl组相比，没有明确证据表明在任何疫苗组中检测到抗HSV-1 gE特异性或抗HSV-2 gE交叉反应性CD8+T细胞应答(大多数接种动物的应答低于P95 NaCl阈值)(图67B)。
不同LNP/SAM HSV-1 gE/gI突变体的头对头比较显示了类似的疫苗特异性和抗HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞应答以及抗HSV-1 gI特异性CD4+/CD8+T细胞应答。与其他突变体相比，只有N243A_R322D突变体(第4组)似乎诱导了更高的抗HSV-2 gE交叉反应性CD4+T细胞应答(图69B)。然而，这种差异似乎主要是由第4组中的一个极高应答者(0.82％)引发的。不同突变体之间未观察到疫苗特异性CD4+和CD8+T细胞应答强度的差异(GMR＜2倍变化，大多数CI完全包含在[0.5，2]中和/或含有1)(图69A；图70A；图70B)。
Claims (20)
1.一种HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。
2.一种HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其用于在向受试者施用时诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。
3.根据权利要求1或权利要求2所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中向受试者施用所述Fc受体或其免疫原性片段或变体以用于治疗感染HSV的受试者或用于在受试者中预防HSV感染，任选地其中向受试者施用所述Fc受体或其免疫原性片段或变体以用于治疗感染HSV1和/或HSV2的受试者或用于在受试者中预防HSV1和/或HSV2感染。
4.根据前述权利要求中任一项所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中所述交叉反应性免疫应答包括功能性交叉反应性免疫应答。
5.根据权利要求4所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中所述功能性交叉反应性免疫应答包括交叉血清型细胞毒性抗体应答、交叉反应性T细胞应答和/或产生能够抑制HSV的免疫逃逸活性的抗体，任选地其中所述能够抑制HSV的免疫逃逸活性的抗体抑制人IgG与所述HSV Fc受体的结合。
6.根据权利要求1或权利要求3至5中任一项所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中所述Fc受体或其免疫原性片段或变体来自HSV2 gE2胞外域。
7.根据权利要求2至5中任一项所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中所述Fc受体或其免疫原性片段或变体来自HSV1 gE1胞外域。
8.根据前述权利要求中任一项所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中所述Fc受体或其免疫原性片段或变体是与来自HSV的结合伴侣或其片段的异二聚体的一部分。
9.根据权利要求1、3至6或8中任一项所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中所述Fc受体或其免疫原性片段或变体是具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HSV2gE2胞外域或与其至少90％相同的变体。
10.根据权利要求6所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中所述Fc受体或其免疫原性片段或变体是与来自HSV的结合伴侣或其片段的异二聚体的一部分，优选地其中i)所述Fc受体是HSV2 gE2或其免疫原性片段，和所述结合伴侣是HSV2 gI2或其片段，和/或ii)其中所述结合伴侣或其片段是HSV2gI2胞外域。
11.根据权利要求7所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中所述Fc受体或其免疫原性片段或变体是与来自HSV的结合伴侣或其片段的异二聚体的一部分，优选地其中i)所述Fc受体是HSV1 gE1或其免疫原性片段，和所述结合伴侣是HSV1 gI1或其片段，和/或ii)所述结合伴侣或其片段是HSV1 gI1胞外域。
12.根据权利要求10所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中所述结合伴侣或其片段是具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的HSV2 gI2胞外域或与其至少90％相同的其变体。
13.根据前述权利要求中任一项所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
i)所述Fc受体或其免疫原性片段或变体与佐剂一起向所述受试者施用，优选地佐剂包含TLR4激动剂和免疫活性皂苷，更优选地佐剂包含在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21，和/或
ii)所述使用不包括向所述受试者施用免疫显性病毒抗原，特别地当所述Fc受体是HSV2 gE2或HSV1 gE1时，所述Fc受体或其免疫原性片段不与HSV2 gD2或HSV1 gD1(分别)或其包含免疫显性区域的片段一起向所述受试者施用，和/或
iii)所述Fc受体与HSV2 gC2或其免疫显性片段或者HSV1 gC1或其免疫显性片段一起向所述受试者施用。
14.根据权利要求1-8或10-13中任一项所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中所述Fc受体或其免疫原性片段或变体是重组Fc受体或其免疫原性片段或变体，并且与相应的天然病毒Fc受体相比，所述Fc受体或其免疫原性片段或变体结合人抗体Fc结构域的能力降低或消除。
15.根据权利要求1、3-6、8-10或12中任一项所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
(i)所述Fc受体或其免疫原性片段或变体是重组Fc受体或其免疫原性片段或变体；
(ii)与相应的天然病毒Fc受体相比，所述Fc受体或其免疫原性片段或变体结合人抗体Fc结构域的能力降低或消除；
(iii)所述重组Fc受体或其免疫原性片段或变体是HSV2 gE2或其免疫原性片段；和
(iv)所述HSV2 gE2或其免疫原性片段相对于SEQ ID NO:1中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：289_插入ADIGL；338_插入ARAA；H245K；P317R；P319R；P319G；P319K；H245A_P319R；H245A_P319G；H245A_P319K；H245A_P319T；P319D；S338D；R320D；N241A_R320D；A248K_V340M；P318Y；A248K_V340R；A248T_V340W；A248K_V340W；A246W_R320G；A246W_P317K；A246W_R320D；A246W_R320T；V340W；A248G_V340W；H245G_R320D；P318D；A246W_P317F；P319G_V340W；A248T_V340M；P317K_V340W；V340F；V340D；H245A_R320D；P317F_V340W；A246W_P317S；H245S_R320D；R314G_P318D；A248T；P318S；P317K；P317S_V340W；H245D；R314P_V340W；R314L_318D；P319L_V340W；P317F；P318D_S338G；R314G_V340W；P317K_S338H；R314L_V340W；P318R；P318Q；P317F_S338G；R314G_P318I；H245G_P319G；P317L；P318I；A248T_F322A；H245E；P318T；P318R_S338G；P318D_S338H；P317F_S338H；A248T_V340R；A248T_F322I；H245A_R320G；P318R_S338H；H245S_R320G；P317K_S338G；A248T_F322P；V340R；R314L_P318R；H245S_R320T；R314G_P318R；R320E；H245G_R320G；H245A_R320T；A246W；P318I_S338G；P317K_V340M；P317I；R320H；R314P_P318I；P318I_S338H；P317F_V340M；H245A_P319G；H245A_P319L；R320P；H245G_R320T；R314L_V340R；P319G_V340R；R314G_F322I；R314L_P318I；R320A；R314N；P317F_V340R；P318D_S338L；A248G_V340R；R314E；R314P_P318D；H245S_P319G；V340Q；A248K_F322I；R320G；H245S_P319L；R314F；P319L；P317K_S338L；P319L_V340M；P317G；R320S；R320Q；R314P_V340R；V340A；H245G_P319L；R320T；R314P_P318R；A248G_F322I；R320N；P317N；R314D；R314Y；R314P_F322I；P319G_V340M；P317S_V340R；R314V；P317R_P319D；P317R_R320D；P319D_R320D；Δ319_Δ320；P317G_P318G_Δ319_Δ320；P318E_Δ319_Δ320；P318G_Δ319_Δ320；P318K_Δ319_Δ320；P317R_P318E_Δ319_320；P317R_P318G_Δ319_Δ320和P317G_P318K_Δ319_Δ320。
16.根据权利要求2-5、7、8、11或13中任一项所述使用的HSV1或HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中：
(i)所述Fc受体或其免疫原性片段或变体是重组Fc受体或其免疫原性片段或变体；
(ii)与相应的天然病毒Fc受体相比，所述Fc受体或其免疫原性片段或变体结合人抗体Fc结构域的能力降低或消除；
(iii)所述重组Fc受体或其免疫原性片段或变体是HSV1 gE2或其免疫原性片段；和
(iv)所述HSV1 gE2或其免疫原性片段相对于SEQ ID NO:3中所示序列包含选自以下的突变或突变的组合：H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A和R322D、H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G、A340G/S341G/V342G。
17.一种药物组合物，其包含HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体、来自HSV2的结合伴侣或其片段、以及药学上可接受的载体，所述药物组合物用于在向受试者施用时诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。
18.一种药物组合物，其包含HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体、来自HSV1的结合伴侣或其片段、以及药学上可接受的载体，所述药物组合物用于在向受试者施用时诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。
19.一种在有需要的受试者中治疗疱疹病毒感染或疱疹病毒相关疾病的方法，其包括向所述受试者施用免疫有效量的HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中在向受试者施用时所述HSV2 Fc受体或其免疫原性片段或变体能够诱导针对HSV1的交叉反应性免疫应答。
20.一种在有需要的受试者中治疗疱疹病毒感染或疱疹病毒相关疾病的方法，其包括向所述受试者施用免疫有效量的HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体，其中在向受试者施用时所述HSV1 Fc受体或其免疫原性片段或变体能够诱导针对HSV2的交叉反应性免疫应答。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21152594.4 | 2021-01-20 | ||
| EP21152594.4A EP4032547A1 (en) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | Hsv1 fce derived fragements for the treatment of hsv |
| PCT/EP2022/051032 WO2022157155A2 (en) | 2021-01-20 | 2022-01-18 | Therapeutic viral vaccine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116829181A true CN116829181A (zh) | 2023-09-29 |
Family
ID=74194596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280014965.9A Pending CN116829181A (zh) | 2021-01-20 | 2022-01-18 | 治疗性病毒疫苗 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP4032547A1 (zh) |
| JP (1) | JP2024503140A (zh) |
| CN (1) | CN116829181A (zh) |
| CA (1) | CA3208129A1 (zh) |
| MX (1) | MX2023008596A (zh) |
| WO (1) | WO2022157155A2 (zh) |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4436727A (en) | 1982-05-26 | 1984-03-13 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Refined detoxified endotoxin product |
| US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
| ATE115862T1 (de) | 1989-02-04 | 1995-01-15 | Akzo Nobel Nv | Tocole als impfstoffadjuvans. |
| US5955088A (en) * | 1992-02-03 | 1999-09-21 | Cedars-Sinai Medical Center | Pharmaceutical compsition of herpes simplex virus type-1 (HSV-1), glycoproteins |
| US5340740A (en) | 1992-05-15 | 1994-08-23 | North Carolina State University | Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process |
| GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| AUPM873294A0 (en) | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
| FR2726003B1 (fr) | 1994-10-21 | 2002-10-18 | Agronomique Inst Nat Rech | Milieu de culture de cellules embryonnaires totipotentes aviaires, procede de culture de ces cellules, et cellules embryonnaires totipotentes aviaires |
| UA56132C2 (uk) | 1995-04-25 | 2003-05-15 | Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. | Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини |
| US6113918A (en) | 1997-05-08 | 2000-09-05 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors |
| US6303347B1 (en) | 1997-05-08 | 2001-10-16 | Corixa Corporation | Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors |
| PT1284740E (pt) | 2000-05-19 | 2008-07-09 | Corixa Corp | Tratamento profiláctico e terapêutico de doenças infecciosas, autoimunes e alérgicas com compostos à base de monossacáridos |
| ES2261453T3 (es) | 2000-08-04 | 2006-11-16 | Corixa Corporation | Nuevos compuestos inmunoefectores. |
| FR2832423B1 (fr) | 2001-11-22 | 2004-10-08 | Vivalis | Systeme d'expression de proteines exogenes dans un systeme aviaire |
| CN1301134C (zh) | 2002-02-04 | 2007-02-21 | 科里克萨有限公司 | 新的免疫效应化合物 |
| IL163305A (en) | 2002-02-04 | 2010-10-31 | Corixa Corp | Azacycloalkyl glucosaminide phosphate as immunoeffector compounds and pharmaceutical compositions for propylactic and therapeutic treatment of infectious and therapeutic treatment of infectious and other diseases comprising the same |
| FR2836924B1 (fr) | 2002-03-08 | 2005-01-14 | Vivalis | Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet |
| US7288640B2 (en) | 2002-07-08 | 2007-10-30 | Corixa Corporation | Processes for the production of aminoalkyl glucosaminide phosphate and disaccharide immunoeffectors, and intermediates therefor |
| ES2639812T3 (es) | 2003-01-06 | 2017-10-30 | Corixa Corporation | Ciertos compuestos de fosfato de aminoalquil glucosaminida y sus usos |
| US7960522B2 (en) | 2003-01-06 | 2011-06-14 | Corixa Corporation | Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use |
| EP1528101A1 (en) | 2003-11-03 | 2005-05-04 | ProBioGen AG | Immortalized avian cell lines for virus production |
| US20080089910A1 (en) * | 2004-06-29 | 2008-04-17 | Visalli Et Al | Attenuated Herpes Simplex Virus Type-2, Vectors Thereof and Immunogenic Compositions Thereof |
| TWI457133B (zh) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
| US20130028925A1 (en) * | 2006-12-28 | 2013-01-31 | Harvey Friedman | Herpes simplex virus combined subunit vaccines and methods of use thereof |
-
2021
- 2021-01-20 EP EP21152594.4A patent/EP4032547A1/en not_active Ceased
-
2022
- 2022-01-18 WO PCT/EP2022/051032 patent/WO2022157155A2/en active Application Filing
- 2022-01-18 MX MX2023008596A patent/MX2023008596A/es unknown
- 2022-01-18 CA CA3208129A patent/CA3208129A1/en active Pending
- 2022-01-18 JP JP2023543305A patent/JP2024503140A/ja active Pending
- 2022-01-18 EP EP22701356.2A patent/EP4281111A2/en active Pending
- 2022-01-18 CN CN202280014965.9A patent/CN116829181A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4281111A2 (en) | 2023-11-29 |
| CA3208129A1 (en) | 2022-07-28 |
| JP2024503140A (ja) | 2024-01-24 |
| WO2022157155A2 (en) | 2022-07-28 |
| WO2022157155A3 (en) | 2022-09-15 |
| WO2022157155A8 (en) | 2022-11-03 |
| EP4032547A1 (en) | 2022-07-27 |
| MX2023008596A (es) | 2023-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Petro et al. | Herpes simplex type 2 virus deleted in glycoprotein D protects against vaginal, skin and neural disease | |
| JP2023533772A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びインフルエンザ混合ワクチン | |
| US20150150960A1 (en) | Protection against dengue virus and prevention of severe dengue disease | |
| KR20130140009A (ko) | 사이토메갈로바이러스 ｇｂ 항원 | |
| KR20200117981A (ko) | 지카 백신 및 면역원성 조성물, 그리고 이를 이용하는 방법들 | |
| KR102508719B1 (ko) | 구제역 백신 | |
| Bernstein et al. | Effects of herpes simplex virus type 2 glycoprotein vaccines and CLDC adjuvant on genital herpes infection in the guinea pig | |
| WO2021014385A1 (en) | Modified human cytomegalovirus proteins | |
| US20220241401A1 (en) | Vaccines against genital herpes simplex infections | |
| CN114206909A (zh) | 治疗性病毒疫苗 | |
| EP3247391A1 (en) | Cmv antigens and uses thereof | |
| CN109078179A (zh) | Hendra和Nipah病毒G糖蛋白免疫原性组合物 | |
| Bonafé et al. | A recombinant West Nile virus envelope protein vaccine candidate produced in Spodoptera frugiperda expresSF+ cells | |
| CN116829181A (zh) | 治疗性病毒疫苗 | |
| WO2012178196A2 (en) | Protection against dengue virus and prevention of severe dengue disease | |
| US20240091345A1 (en) | Therapeutic Viral Vaccine | |
| KR20230058101A (ko) | 토코페롤-함유 스쿠알렌 에멀젼 아쥬반트를 갖는 covid-19 백신 | |
| CN116648257A (zh) | 含有含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的covid-19疫苗 | |
| TW202413635A (zh) | 複製缺陷型單純疱疹病毒第１型病毒疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |