JP2024037960A - 抗体薬物複合体、その調製方法、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】抗CLDN18.2抗体-薬物複合体、その調製方法、およびその使用を提供する。【解決手段】構造が、式(D-L)γ-Aに示される抗体-薬物複合体(ADC)であって、Dは、生物活性分子のフラグメントであり;Lは、リンカーであり;γは、1~10の整数であり;好ましくは、γは、1~8の整数であり;Aは、ヒトCLDN18.2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、複合体による。【選択図】図12A
Description
本出願は、2020年5月15日を出願日とする中国特許出願第202010410633.5号に基づき、その優先権を主張し、その開示は、本明細書によりその全体が本出願に組み込まれる。
本発明は、生物医学の技術分野に属し、具体的には、抗クローディン18.2抗体-薬物複合体(ADC)、および、そのADCを含む組成物、ならびにそれらの使用に関する。
胃がんの治療では、外科的切除が主流である。切除不能または再発性の胃がんの場合、化学療法が主な治療法であるが、現行の技術水準では、化学療法は症状を緩和し、生存期間を延ばすことしかできない。現在、進行胃がんのための広く認識されている標準的な化学療法レジメンは存在しない。生体高分子薬物に関しては、承認されているトラスツズマブ、ラムシルマブ、ペムブロリズマブなどを除いて、他の胃がん標的薬のほとんどは有効性が不十分であるか、依然として臨床研究の初期段階にある。既存の薬物の主要な弱点としては、非外科的治療の臨床的ニーズが満たされていないこと、進行胃がんまたは再発性胃がんの治療選択肢が非常に限られていること、予後が非常に悪いこと、および高い死亡率が挙げられる。胃がんの発生率は高いため、胃がん薬に対する現在の需要は大きい。
クローディン18.2(CLDN18.2)は、クローディンタンパク質ファミリーのメンバーである。クローディンファミリータンパク質は、細胞間のタイトジャンクションを媒介するタンパク質の一種である。異なるクローディンサブタイプが異なる組織で発現され、異なる種類のがんに関連する。胃粘膜細胞において、正常組織におけるクローディン18.2の発現は制限されている。クローディン18.2は、原発性胃腺がんおよびその転移の70%において高度に発現され、他のがん、例えば、膵臓がん、食道がん、および非小細胞肺がん(NSCLC)においても発現される。腫瘍組織におけるクローディン18.2の非常に特異的な発現により、クローディン18.2は、腫瘍免疫療法の非常に良好な標的となっている。
本出願の発明者は、クローディン18.2に対して高い特異性および高い親和性を有する抗体をPCT/CN2019/126495に記載しており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれ、本出願の一部となる。大規模な創造的研究により、本出願の発明者は、クローディン18.2抗体-薬物複合体(ADC)をさらに発明し、これは、腫瘍の治療のための安全で効果的な薬物の選択肢を提供する。
具体的には、本発明者らは、クローディン18.2を標的とする一連のADC、およびそのADCを含む組成物を得るために、クローディン18.2に特異的に結合する高親和性の抗体をリンカーを介して生物活性分子にコンジュゲートする。このADCまたは組成物は、クローディン18.2によって発現されるいくつかの腫瘍細胞に対して高い殺傷活性を有する。動物実験(インビボ)では、ADCは、クローディン18.2陽性腫瘍、特に胃がんまたは胃腺がんの増殖を効果的に阻害することができ、使用において非常に安全である。
抗体-薬物複合体(ADC) 一態様では、本発明は、ヒトCLDN18.2に特異的に結合し、その構造が式(I): (D-L)γ-A 式(I) に示される抗体-薬物複合体(ADC)を提供し、 式中、Dは生物活性分子のフラグメントであり;Lはリンカーであり; γは1~10の整数であり;好ましくは、γは1~8の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7または8)であり; Aは、ヒトCLDN18.2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態では、ヒトCLDN18.2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、 (1)以下の3つの重鎖CDR:配列番号13、14もしくは23に記載のVH(重鎖可変領域)に含まれるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3;ならびに/もしくは 以下の3つの軽鎖CDR:配列番号15もしくは24に記載のVL(軽鎖可変領域)に含まれるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3; または (2)以下の3つの重鎖CDR:(1)に記載のCDR-H1もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(1)に記載のCDR-H2もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(1)に記載のCDR-H3もしくはアミノ酸変異を含むその変異体;ならびに/もしくは 以下の3つの軽鎖CDR:(1)に記載のCDR-L1もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、(1)に記載のCDR-L2もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(1)に記載のCDR-L3もしくはアミノ酸変異を含むその変異体 を含み、 ここで、(2)に記載の3つの重鎖CDRおよび/または3つの軽鎖CDRの少なくとも1つは、(1)の対応するCDRと比較してアミノ酸変異を含み、このアミノ酸変異は、1個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加(例えば、1、2または3個のアミノ酸の置換、欠失または付加)であり;上記変異を含む抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてCLDN18.2、好ましくはヒトCLDN18.2に特異的に結合することができ、好ましくは、置換は保存的置換である。
いくつかの実施形態では、CDRは、IMGTまたはAbMナンバリングシステムに従って定義される。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域(FR)をさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む; (1-1)IMGTナンバリングシステムによって定義される、以下の3つの重鎖CDR:配列番号1の配列を有するCDR-H1、配列番号2もしくは21の配列を有するCDR-H2、および配列番号3の配列を有するCDR-H3;ならびに/もしくは IMGTナンバリングシステムによって定義される、以下の3つの軽鎖CDR:配列番号4の配列を有するCDR-L1、配列番号5の配列を有するCDR-L2、および配列番号6の配列を有するCDR-L3; もしくは (1-2)以下の3つの重鎖CDR:(1-1)に記載のCDR-H1もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(1-1)に記載のCDR-H2もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(1-1)に記載のCDR-H3もしくはアミノ酸変異を含むその変異体;ならびに/もしくは 以下の3つの軽鎖CDR:(1-1)に記載のCDR-L1もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(1-1)に記載のCDR-L2もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(1-1)に記載のCDR-L3もしくはアミノ酸変異を含むその変異体であって、 ここで、上記3つの重鎖CDRならびに/もしくは3つの軽鎖CDRの少なくとも1つは、(1-1)における対応するCDRと比較してアミノ酸変異を含み、上記アミノ酸変異は、1個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加(例えば、1、2または3個のアミノ酸の置換、欠失または付加)であり;上記変異を含む抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてヒトCLDN18.2に特異的に結合することができ、好ましくは、置換は保存的置換である、3つの重鎖CDRならびに/もしくは3つの軽鎖CDR; または (2-1)AbMナンバリングシステムによって定義される、以下の3つの重鎖CDR:配列番号7の配列を有するCDR-H1、配列番号8もしくは22の配列を有するCDR-H2、および配列番号9の配列を有するCDR-H3;ならびに/もしくは AbMナンバリングシステムによって定義される、以下の3つの軽鎖CDR:配列番号10の配列を有するCDR-L1、配列番号11の配列を有するCDR-L2、および配列番号12の配列を有するCDR-L3; もしくは (2-2)以下の3つの重鎖CDR:(2-1)に記載のCDR-H1もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(2-1)に記載のCDR-H2もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(2-1)に記載のCDR-H3もしくはアミノ酸変異を含むその変異体;ならびに/もしくは 以下の3つの軽鎖CDR:(2-1)に記載のCDR-L1もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(2-1)に記載のCDR-L2もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および(2-1)に記載のCDR-L3もしくはアミノ酸変異を含むその変異体であって; ここで、上記3つの重鎖CDRならびに/もしくは3つの軽鎖CDRの少なくとも1つは、(2-1)における対応するCDRと比較してアミノ酸変異を含み、そして、上記アミノ酸変異は、1個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加(例えば、1、2または3個のアミノ酸の置換、欠失または付加)であり;上記変異を含む抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてヒトCLDN18.2に特異的に結合することができ、好ましくは、置換は保存的置換である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域(FR)をさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、 (1)CDRがIMGTナンバリングシステムに従って定義される、以下のVHならびに/もしくはVL: (1-1)以下の3つのCDRを含むVH:配列番号1の配列を有するCDR-H1、配列番号2もしくは21の配列を有するCDR-H2、および配列番号3の配列を有するCDR-H3;ならびに/もしくは 以下の3つのCDRを含むVL:配列番号4の配列を有するCDR-L1、配列番号5の配列を有するCDR-L2、および配列番号6の配列を有するCDR-L3; もしくは (1-2):(1-1)に記載のVHもしくはVLと比較して、少なくとも1つのCDRが、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ(例えば、1、2もしくは3個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ)である変異を含み、好ましくは、上記置換は保存的置換であり、上記変異を含む上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてCLDN18.2、好ましくはヒトCLDN18.2に特異的に結合することができる; または (2)CDRがAbMナンバリングシステムに従って定義される、以下のVHならびに/もしくはVL: (2-1):以下の3つのCDRを含むVH:配列番号7の配列を有するCDR-H1、配列番号8もしくは22の配列を有するCDR-H2、および配列番号9の配列を有するCDR-H3;ならびに/もしくは 以下の3つのCDRを含むVL:配列番号10の配列を有するCDR-L1、配列番号11の配列を有するCDR-L2、および配列番号12の配列を有するCDR-L
3; もしくは (2-2):(2-1)に記載のVHもしくはVLと比較して、少なくとも1つのCDRが、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ(例えば、1、2もしくは3個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ)である変異を含み、好ましくは、上記置換は保存的置換であり、上記変異を含む上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてCLDN18.2、好ましくはヒトCLDN18.2に特異的に結合することができる、 を含む。
3; もしくは (2-2):(2-1)に記載のVHもしくはVLと比較して、少なくとも1つのCDRが、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ(例えば、1、2もしくは3個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ)である変異を含み、好ましくは、上記置換は保存的置換であり、上記変異を含む上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてCLDN18.2、好ましくはヒトCLDN18.2に特異的に結合することができる、 を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントのVHおよび/またはVLは、ヒトまたはマウス免疫グロブリン由来のフレームワーク領域(FR)を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む; (1)配列番号13もしくは14に記載のVH、および/または配列番号15に記載のVL; または (2)(1)に記載のVHと比較して、上記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるVHが、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは100%の同一性を有し、および/もしくは(1)に記載のVLと比較して、上記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるVLが、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは100%の同一性を有し、(1)に記載のVLもしくはVHに対して同一性を有する上記抗体またはその抗原結合フラグメントが、依然としてCLDN18.2、好ましくはヒトCLDN18.2に特異的に結合することができる; または (3)(1)に記載のVHと比較して、上記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるVHが、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ(例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ)を有し、および/もしくは(1)に記載のVLと比較して、上記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるVLが、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ(例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ)を有し、好ましくは、上記置換は保存的置換である。変異を含む抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてCLDN18.2、好ましくはヒトCLDN18.2に特異的に結合することができる。
上記態様のいずれにおいても、抗体またはその抗原結合フラグメントは、哺乳動物(例えば、マウスまたはヒト)免疫グロブリンに由来する定常領域またはその変異体をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、抗体は、以下を含み得る; (1)ヒト免疫グロブリンのCH(重鎖定常領域)もしくはその変異体であって、上記変異体が、それが由来する野生型配列と比較して、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加(例えば、最大20個、最大15個、最大10個、もしくは最大5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加)を含む、ヒト免疫グロブリンのCHもしくはその変異体;および/または (2)ヒト免疫グロブリンのCL(軽鎖定常領域)もしくはその変異体であって、上記変異体が、それが由来する野生型配列と比較して、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加(例えば、最大20個、最大15個、最大10個、もしくは最大5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加)を含む、ヒト免疫グロブリンのCLもしくはその変異体。
いくつかの実施形態では、定常領域を変化、例えば変異させて、抗CLDN18.2抗体の特性を改変する(例えば、以下の特性のうちの1以上を変化させる:Fc受容体の結合、抗体グリコシル化、システイン残基の量、エフェクター細胞または補体に対する機能)。抗体の定常領域中の少なくとも1つのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換して、機能を変化させることができる。例えば、エフェクターリガンド(例えば、FcRまたは補体C1q)に対する抗体親和性を変化させることによって、エフェクター機能を変化させる(例えば、強化する)ことができる。いくつかの実施形態では、定常領域を変化させて(例えば、強化して)、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、補体依存性細胞傷害性(CDC)および/または抗体依存性細胞貪食(ADCP)を改変する。
いくつかの実施形態では、CHは、IgG重鎖定常領域、例えばIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4重鎖定常領域である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトIgG1の重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号16に記載のCH、または、配列番号16と比較して最大20個のアミノ酸の保存的置換(例えば、最大15個、10個もしくは5個のアミノ酸の保存的置換、例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の保存的置換)を有するその変異体を含む。変異を含むCHは、配列番号16と実質的に同じ機能を保持する。
いくつかの実施形態では、CLは、κまたはλ軽鎖定常領域から選択される。
いくつかの実施形態では、CLは、κ軽鎖定常領域(例えば、ヒトκ軽鎖)である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号17に記載のCL、または、配列番号17と比較して最大20個のアミノ酸の保存的置換(例えば、最大15個、10個もしくは5個のアミノ酸の保存的置換、例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の保存的置換)を有するその変異体を含む。変異を含むCLは、配列番号17と実質的に同じ機能を保持する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号16に記載のCHおよび/または配列番号17に記載のCLを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号13に記載の配列のVHおよび配列番号16に記載のCHを含む重鎖と、 配列番号15に記載の配列のVLおよび配列番号17に記載のCLを含む軽鎖と を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号14に記載の配列のVHおよび配列番号16に記載のCHを含む重鎖と、 配列番号15に記載の配列のVLおよび配列番号17に記載のCLを含む軽鎖と を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む; (1)以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖: (1-1)配列番号18に記載の配列; (1-2)配列番号18に記載の配列と比較して、1個またはいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加(例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加)を有する配列;または (1-3)配列番号18に記載の配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する配列; および (2)以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖: (2-1)配列番号20に記載の配列; (2-2)配列番号20に記載の配列と比較して、1個またはいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加(例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加)を有する配列;または (2-3)配列番号20に記載の配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する配列。
いくつかの実施形態では、上記の(1-2)および(2-2)に記載の置換は、保存的置換である。変異を含むCHは、配列番号16と実質的に同じ機能を保持する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む; (1)以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖: (1-1)配列番号19に記載の配列; (1-2)配列番号19に記載の配列と比較して、1個またはいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加(例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加)を有する配列;または (1-3)配列番号19に記載の配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する配列; および (2)以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖: (2-1)配列番号20に記載の配列; (2-2)配列番号20に記載の配列と比較して、1個またはいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加(例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加)を有する配列;または (2-3)配列番号20に記載の配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する配列。
いくつかの実施形態では、(1-2)および(2-2)に記載の置換は、保存的置換である。好ましくは、変異もしくは同一性配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてヒトCLDN18.2に特異的に結合することができる。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fvフラグメント、ジスルフィド結合Fv(dsFv)、ダイアボディ、二重特異性抗体、および多重特異性抗体から選択される。
いくつかの実施形態では、(D-L)γ-Aの構造は、式(II): {D-[L1-(L2)m1-(L3)m2-(L4)m3-E]}γ-A 式(II) に示され、 式中、 L1は
でL2に接続され、 L2は
いくつかの実施形態では、(D-L)γ-Aの構造は、式(III): {D-[(L1’)m4-L1-(L5)m5-(L3)m2-(L4)m3-E]}γ-A 式(III)に示される通りであり、 式中、 L1’は
であり、ここで、R5およびR6は、それぞれ独立して水素(例えば、プロチウムもしくは重水素)またはC1-6アルキルであり;x3は、1、2、3、4、5または6であり;L1’は、存在する場合、1位でDと接続し、2位でL1と接続し; L1は
いくつかの実施形態では、式(II)または式(III)によって表されるADCにおけるL1は
であり、ここで、Z1は、アミノ酸、または2~5個のアミノ酸から構成されるペプチドであり、ここで、上記アミノ酸は、Lys、Cit、Val、D-Val、Phe、Leu、Gly、Ala、およびAsnから選択され;好ましくは、Z1は、Cit、Lys、Cit-Val、およびAla-Valから選択される。
いくつかの実施形態では、式(II)または式(III)によって表されるADCにおけるL3は5~6員芳香族複素環であり、m2は1である。
いくつかの実施形態では、L3はトリアゾールであり、m2は1である。
いくつかの実施形態では、式(II)によって表されるADCの構造は、
であり、ここで、γは1~10の整数から選択され、例えば、γは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、そして、Aは、ヒトCLDN18.2に特異的に結合する上述の抗体またはその抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態では、式(II)によって表されるADCは、以下の式:
に示され、ここで、γは1~10の整数であり、例えば、γは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、そして、Aは2C6.9-hz21である。
いくつかの実施形態では、式(III)によって表されるADCの構造は、
であり、ここで、γは1~10の整数から選択され、例えば、γは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、そして、Aは、ヒトCLDN18.2に特異的に結合する上述の抗体またはその抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態では、式(III)によって表されるADCは、以下の式:
で示され、ここで、γは1~10の整数であり、例えば、γは1、2、3、4、5、
6、7、8、9または10であり、そして、Aは、2C6.9-hz21である。
6、7、8、9または10であり、そして、Aは、2C6.9-hz21である。
いくつかの実施形態では、式(III)によって表されるADCの構造は、
であり、ここで、γは1~10の整数であり、例えば、γは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、そして、Aは、ヒトCLDN18.2に特異的に結合する上述の抗体またはその抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態では、式(III)によって表されるADCは、以下の式:
によって表され、ここで、γは1~10の整数であり、例えば、γは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、そして、Aは、2C6.9-hz21である。
本発明はまた、上記の抗体-薬物複合体(ADC)のうちの1以上を含む組成物を提供し、該組成物において、生物活性分子のフラグメント(すなわち、式(I)におけるD)とCLDN18.2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント(すなわち、式(I)におけるA)とのモル比(DAR値)は、1から10までの小数または整数(例えば、1から8までの小数または整数、例えば、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.79、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、6.95、7.0、7.03、7.1、7.12、7.2、7.3、7.40、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、または8.0)である。
DAR値は、薬物-抗体比(各抗体に結合した(D-L)の平均数を指す)としても公知であり、当該技術分野で公知の方法によって測定し計算することができる。例えば、LC-MS、HICなどによって測定した複合体抗体および(D-L)の分子量により、異なる数の(D-L)とコンジュゲートした軽鎖および重鎖の割合を算出し、そして、式DAR(軽鎖DAR1*1+...+軽鎖DARn1*n1)*2+(重鎖DAR1*1+...+DARn2*n2)*2からDAR値を算出した。式中、DARn1は、軽鎖に占めるn1個の(D-L)とコンジュゲートした軽鎖の割合を意味し、DARn2は、重鎖に占めるn2個の(D-L)とコンジュゲートした重鎖の割合を意味する。
いくつかの実施形態では、組成物は、上述の抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、2C6.9-TL001を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、2C6.9-TL001である。
いくつかの実施形態では、組成物は、2C6.9-TL002を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、2C6.9-TL002である。
いくつかの実施形態では、組成物は、2C6.9-TL003を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、2C6.9-TL003である。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、誘導体化することができ、例えば、別の分子(例えば、別のポリペプチドまたはタンパク質)に連結することができる。一般に、抗体またはその抗原結合フラグメントの誘導体化(例えば、標識)は、CLDN18.2(特にヒトCLDN18.2)へのその結合に悪影響を及ぼさない。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、そのような誘導体化形態を含むことが意図される。
ある種の誘導体化抗体(例えば、二重特異性抗体)は、(同じ種類または異なる種類の)2つ以上の抗体を架橋することによって産生される。二重特異性抗体を得るための方法は当該技術分野で周知であり、その例としては、化学的架橋、細胞工学(ハイブリッドハイブリドーマ)または遺伝子工学を含み、これらに限定されない。
別の種類の誘導体化抗体は、標識抗体である。例えば、本発明の本明細書における抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識にライゲーションされる。本発明の検出可能な標識は、蛍光、分光学的、光化学的、生化学的、免疫学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の物質であり得る。そのような標識は当該技術分野で周知であり、その例としては、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなど)、放射性核種(例えば、3H、125I、35S、14C、または32P)、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フルオレセイン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、フィコエリトリン(PE)、テキサスレッド、ローダミン、量子ドットまたはシアニン色素誘導体(例えば、Cy7、Alexa750)、アクリジニウムエステル、磁気ビーズ(例えば、Dynabeads(登録商標))、熱量測定標識、例えば、金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)ビーズ、および上述の標識修飾したアビジン(例えば、ストレプトアビジン)に結合するためのビオチンを含み、これらに限定されない。そのようなマーカーの使用を教示する特許としては、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号、および同第4,366,241号(それぞれ参照により本明細書に組み込まれる)を含み、これらに限定されない。上記のような検出可能な標識は、当該技術分野で公知の方法によって検出することができる。例えば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出することができ、そして、蛍光標識は、発光を検出するための光検出器を用いて検出することができる。酵素標識は、典型的には、その酵素の基質を用意し、その基質に酵素が作用することにより生じる反応生成物を検出することにより検出され、そして、熱標識は、染色された標識を単純に可視化することにより検出される。特定の実施形態では、そのようなマーカーは、免疫学的アッセイ(例えば、酵素結合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイなど)での使用に適合させることができる。いくつかの実施形態では、潜在的な立体障害を低減するために、上記の検出可能な標識を、様々な長さのリンカーによって本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに連結することができる。
特定の実施形態では、本発明の抗体-薬物複合体(ADC)に含まれる抗体またはその抗原結合フラグメントは、上述の誘導体化抗体またはその抗原結合フラグメントのうちの1以上である。
治療方法および医薬組成物 別の態様では、本発明はまた、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、上述の抗体-薬物複合体(ADC)または組成物のうちの1以上を含む。
いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体および/または賦形剤をさらに含む。
いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、抗腫瘍活性を有する他の成分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ADCまたは組成物と、抗腫瘍活性を有する他の成分とは、同じ製剤単位または異なる製剤単位に含まれる。したがって、本発明のADCまたは組成物と抗腫瘍活性を有する他の成分とは、同時に、別々に、または連続的に投与され得る。
いくつかの実施形態では、抗腫瘍活性を有する他の成分は、生物活性ポリペプチドもしくはその活性フラグメント、または化学療法薬である。いくつかの実施形態では、生物活性ポリペプチドは、免疫チェックポイント阻害剤(PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体など)またはサイトカイン(インターフェロン、IL-2、IL-15、GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21など)から選択される。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、エピルビシン、オキサリプラチン、カペシタビン、5-フルオロウラシル、フォリン酸、パクリタキセル、およびアルブミン結合パクリタキセルから選択される1以上である。いくつかの実施形態では、抗腫瘍活性を有する他の成分は、エピルビシン、オキサリプラチン、および5-フルオロウラシルの組み合わせ、または、オキサリプラチン、ロイコボリン、および5-フルオロウラシルの組み合わせである。
別の態様では、本発明の医薬組成物中のADCまたは組成物は、被験体に投与された場合、以下のことを行うのに十分である: (a)腫瘍細胞(特に胃がん細胞、例えば胃腺がん細胞)のアポトーシスを誘発する; (b)腫瘍細胞(特に胃がん細胞、例えば胃腺がん細胞)の増殖を阻害する; (c)補体依存性細胞傷害性(CDC)を誘発および/もしくは増加させる; (d)抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)を誘発および/もしくは増加させる; (e)CLDN18.2の発現および活性化を阻害する; (f)CLDN18.2媒介細胞シグナル伝達経路を阻害する;または (g)(a)~(f)の任意の組み合わせ。
別の態様では、本発明は、腫瘍の予防および/または治療および/または補助治療のための医薬の調製における、抗体-薬物複合体、組成物、または医薬組成物の使用を提供する。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、および、がんの転移性、難治性または再発性病変から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍またはがんは、食道がん、胃腸がん、胃腺がん、膵臓がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん、すなわちNSCLC)、肝臓がん、胃がん、胃食道接合部(GEJ)腺がん、頭頸部がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、胚細胞腫瘍、骨がん、皮膚がん、胸腺がん、胆管がん、胆嚢がん、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫(例えば、多発性骨髄腫)、肉腫、神経膠芽腫、および白血病からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、胃がん、胃腺がん、胃食道接合部(GEJ)腺がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、および肺がん(例えば、NSCLC)から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部(GEJ)腺がん、例えば、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部(GEJ)腺がんの局所進行切除不能腫瘍または転移性腫瘍である。
いくつかの実施形態では、腫瘍はCLDN18.2陽性であり、さらに、腫瘍はHER2陰性である。
いくつかの実施形態では、腫瘍はHER2陰性である。
別の態様では、本発明は、被験体において腫瘍を予防および/または治療する方法を提供する。別の態様では、本発明は、被験体において腫瘍進行を遅延させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、被験体において腫瘍再発を低減または阻害する方法を提供する。この方法は、有効量の本発明の抗体-薬物複合体、組成物、または医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む。
いくつかの実施形態では、上記の方法はまた、第2の療法を被験体に適用する工程を含み、ここで、第2の療法は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法、DNA療法、RNA療法、ナノ療法、ウイルス療法、補助療法、およびそれらの任意の組み合わせからな
る群から選択される。
る群から選択される。
いくつかの実施形態では、第2の療法は、上記の方法とは別々に、または組み合わせて適用することができ;あるいは、第2の療法は、上記の方法とは別々に、組み合わせて、同時に、または連続的に適用することができる。
いくつかの実施形態では、第2の療法は化学療法である。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、エピルビシン、オキサリプラチン、カペシタビン、5-フルオロウラシル、フォリン酸、パクリタキセル、およびアルブミン結合パクリタキセルのうちの1以上から選択される。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、エピルビシン、オキサリプラチン、および5-フルオロウラシルの組み合わせ、または、オキサリプラチン、ロイコボリン、および5-フルオロウラシルの組み合わせである。いくつかの実施形態では、オキサリプラチン、ロイコボリン、および5-フルオロウラシルの組み合わせ投与レジメンは、FOLFOX4、FOLFOX6、またはmFOLFOX6から選択される。
いくつかの実施形態では、第2の療法は免疫療法である。いくつかの実施形態では、免疫療法のための薬物は、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、およびLAG-3抗体)またはサイトカイン(例えば、interference Vegetarian、IL-2、IL-15、GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-18、およびIL-21)から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、および、がんの転移性、難治性、または再発性病変から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍またはがんは、食道がん、胃腸がん、胃腺がん、膵臓がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肺がん(例えば、NSCLC)、肝臓がん、胃がん、胃食道接合部(GEJ)腺がん、頭頸部がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、胚細胞腫瘍、骨がん、皮膚がん、胸腺がん、胆管がん、胆嚢がん、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫(例えば、多発性骨髄腫)、肉腫、神経膠芽腫、および白血病からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、胃がん、胃腺がん、胃食道接合部(GEJ)腺がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、および肺がん(例えば、NSCLC)から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部(GEJ)腺がん、例えば、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部(GEJ)腺がんの局所進行切除不能腫瘍または転移性腫瘍である。
いくつかの実施形態では、腫瘍はCLDN18.2陽性であり、さらに、腫瘍はHER2陰性である。
いくつかの実施形態では、腫瘍はHER2陰性である。
本発明のADC、組成物、または医薬組成物は、医療分野で公知の任意の医薬製剤、例えば、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、ロゼンジ剤、坐剤、注射剤(注射剤、注射用滅菌粉末、および注射用濃縮溶液を含む)、吸入剤、スプレー剤などに製剤化することができる。好ましい剤形は、意図される投与様式および治療用途によって決まる。本発明の医薬組成物は、製造および保存条件下で無菌かつ安定でなければならない。好ましい医薬製剤は注射剤である。注射剤は滅菌注射液であり得る。例えば、以下の方法を使用して滅菌注射液を調製することができる:必要な投与量のADCまたは組成物を、場合により他の所望の成分(pH調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、等張剤、防腐剤、希釈剤、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない)と共に適切な担体に分散させ、続いて濾過滅菌する。さらに、保存および使用を容易にするために、滅菌注射液を使用して(例えば、真空乾燥または凍結乾燥によって)、滅菌凍結乾燥粉末を調製することができる。滅菌凍結乾燥粉末は、使用前に滅菌パイロジェンフリー水などの適切な担体に分散させることができる。
さらに、本発明のADCは、投与を容易にするために、単位用量の形態で医薬組成物中に存在してもよい。
本発明のADC、組成物、または医薬組成物は、経口、口腔内、舌下、眼内、局所的、非経口、直腸、髄腔内、脳槽内、鼠径部、膀胱内、局所(例えば、粉末、軟膏、もしくは滴剤)または経鼻経路を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の適切な方法によって投与され得る。しかしながら、多くの治療用途について、好ましい投与経路/投与様式は非経口(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)である。当業者であれば、意図される目的に応じて投与経路および/または投与様式が異なることを理解するであろう。好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、医薬組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。
本発明の医薬組成物は、「治療有効用量」または「予防有効用量」の本発明のADCまたは組成物を含み得る。「予防有効用量」とは、疾患の発症を予防、阻害、または遅延させるのに十分な量を意味する。「治療有効量」は、すでに疾患に罹患している患者において、疾患およびその合併症を治癒させるか、または少なくとも部分的に阻害するのに十分な量を意味する。本発明のADCまたは組成物の治療有効用量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、患者の一般的な条件、例えば年齢、体重および性別、および薬物の投与、ならびに同時投与のための他の治療などの要素に応じて異なり得る。
本発明において、投与レジメンは、最適な意図した応答(例えば、治療応答または予防応答)が得られるように調整することができる。例えば、それは単回投与で投与されてもよく、ある期間にわたって複数回投与されてもよく、または治療の緊急性に応じて比例的に減少もしくは増加させた投与量で投与されてもよい。
本発明のADCまたは組成物の典型的な非限定的な治療有効用量または予防有効用量の範囲は、0.02~100mg/kg、例えば0.1~100mg/kg、0.1~50mg/kg、または1~50mg/kgである。投与量は、治療される症状の種類および重症度に応じて異なり得ることに留意されたい。さらに、当業者であれば、任意の特定の患者について、特定の投与レジメンが、患者のニーズおよび医師による専門的評価に従って経時的に調整されるべきであることを理解するであろう。本明細書に示される投与量範囲は、例示のみを目的としており、本発明の医薬組成物の使用または範囲を限定するものではない。
本発明において、被験体は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
本発明において、別段の記載がない限り、本明細書で用いる科学技術用語は、当業者が通常理解している意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、生化学、核酸化学、免疫学の実験手順は、すべて対応する分野で広く使用されている通常の工程である。同時に、本発明のよりよい理解のために、関連する用語の定義および説明を以下に提供する。
本明細書で使用される場合、「ADC(抗体-薬物複合体)」または「複合体」という用語は交換可能であり、生物活性分子を、リンカーを介して抗体にコンジュゲートすることによって得られる物質を指す。
リンカーは、様々な化学結合を介して抗体に接続することができる。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、抗体のスルフヒドリル基とチオエーテル結合を形成することによって接続される。いくつかの特定のADC分子(例えば、2C6.9-TL001、2C6.9-TL002、または2C6.9-TL003のADC分子)の構造式において、-S-は、リンカーと抗体のスルフヒドリル基とによって形成されるチオエーテル結合を表すにすぎず、-S-がリンカーの一部であることを意味しない。
本出願におけるADCの構造式は、(D-L)γ-Aで表すことができ、ここで、Dは生物活性分子フラグメントであり;Lはリンカーであり;Aは、ヒトCLDN18.2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり;各抗体分子に結合する(D-L)の数を指すγは、1~10の整数、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10から選択される。しかしながら、ADC調製の過程において、各抗体分子は、異なる数の(D-L)と接続され得る。したがって、ADC生成物は、一般に、異なる数の(D-L)と結合した抗体の組成物である。実務では、抗体に連結された(D-L)の数の平均値を表すために、DARがしばしば使用される。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、通常は2対のポリペプチド鎖(各対は、軽鎖(LC)と重鎖(HC)とを有する)から構成される免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖は、κ(カッパ)およびλ(ラムダ)軽鎖に分類することができる。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはε重鎖に分類することができ、したがって、抗体のアイソタイプは、それぞれIgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEと定義される。軽鎖および重鎖内では、可変領域と定常領域とは約12個以上のアミノ酸の「J」領域によって接続されており、重鎖はまた、約3個以上のアミノ酸の「D」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域(VH)および重鎖定常領域(CH)から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン(CH1、CH2、およびCH3)から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域(CL)から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLからなる。定常ドメインは、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示し、例えば、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第1の成分(C1q)を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。VH領域およびVL領域はまた、より保存的な領域(フレームワーク領域(FR)と呼ばれる)が間に入った超可変領域(相補性決定領域(CDR)と呼ばれる)に細分することができる。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で配置された3つのCDRおよび4つのFRからなる:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。各重鎖/軽鎖対の可変領域(VHおよびVL)は、それぞれ抗原結合部位を形成する。各領域またはドメインにおけるアミノ酸の割り当ては、Kabat、Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health、ベセスダ、メリーランド州(1987および1991))もしくはChothiaおよびLesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothiaら(1989)Nature342:878-883、またはAbM、Martinの関連研究(Martin ACR、Cheetham JC、Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:A combined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA86:9268-9272)の定義に従い得る。
これに関連して、文脈によってそうでないことが明確に示されない限り、「抗体」という用語に言及する場合、それはインタクトな抗体だけでなく、抗体の抗原結合フラグメントも含む。
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」または「CDR」という用語は、抗体可変領域内の抗原結合に関与するアミノ酸残基を指す。これらのアミノ酸残基の正確な境界は、当該技術分野で公知の様々なナンバリングシステムに従って、例えば、Kabatナンバリングシステム(Kab
atら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、ベセスダ、メリーランド州、1991)、Chothiaナンバリングシステム(ChothiaおよびLesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothiaら(1989)Nature342:878-883)、IMGTナンバリングシステム(Lefrancら、Dev.Comparat.Immunol.27:55-77、2003)またはMartinの関連研究(Martin ACR、Cheetham JC、Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:A combined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA86:9268-9272)の定義に従って定義することができ、Martinの定義方法は、KabatおよびChothiaの定義の一部を統合し、Oxford Molecular antibody modeling software(Martin AC R.Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains[M]//Antibody engineering.Springer,Berlin,Heidelberg、2010:33-51)において最初に適用された。所与の抗体について、当業者であれば、各ナンバリングシステムによって定義されるCDRを容易に同定するであろう。さらに、異なるナンバリングシステム間の対応は、当業者に周知である(例えば、Lefrancら、Dev.Comparat.Immunol.27:55-77、2003を参照されたい)。
atら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、ベセスダ、メリーランド州、1991)、Chothiaナンバリングシステム(ChothiaおよびLesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothiaら(1989)Nature342:878-883)、IMGTナンバリングシステム(Lefrancら、Dev.Comparat.Immunol.27:55-77、2003)またはMartinの関連研究(Martin ACR、Cheetham JC、Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:A combined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA86:9268-9272)の定義に従って定義することができ、Martinの定義方法は、KabatおよびChothiaの定義の一部を統合し、Oxford Molecular antibody modeling software(Martin AC R.Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains[M]//Antibody engineering.Springer,Berlin,Heidelberg、2010:33-51)において最初に適用された。所与の抗体について、当業者であれば、各ナンバリングシステムによって定義されるCDRを容易に同定するであろう。さらに、異なるナンバリングシステム間の対応は、当業者に周知である(例えば、Lefrancら、Dev.Comparat.Immunol.27:55-77、2003を参照されたい)。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるCDRは、当該技術分野で公知の様々なナンバリングシステムに従って決定することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるCDRは、好ましくは、Kabat、Chothia、IMGT、またはAbMナンバリングシステムによって決定される。
本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」または「FR」残基という用語は、抗体の可変領域内の、先に定義したCDR残基以外のアミノ酸残基を指す。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体フラグメントのポリペプチド、例えば全長抗体のフラグメントのポリペプチドであって、全長抗体が結合する同じ抗原に特異的に結合する能力を保持し、および/または、抗原への特異的結合について全長抗体と競合する能力を保持し、「抗原結合部」とも呼ばれるポリペプチドを指す。一般に、Fundamental Immunology、第7章(Paul,W.編、第2版、Raven Press、NY(1989)(これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。組換えDNA技術、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断を使用して、抗体の抗原結合フラグメントを産生することができる。抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb、および相補性決定領域(CDR)フラグメント、一本鎖抗体(例えば、scFv)、キメラ抗体、ダイアボディ、線状抗体、ナノボディ(その技術はDomantisより)、ドメイン抗体(その技術はAblynxより)、ならびにポリペプチドであって、特異的抗原結合能を該ポリペプチドに付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むものを含む。改変された抗体変異体は、Holligerら、2005;Nat Biotechnol、23:1126-1136に概説されている。
本明細書で使用される場合、「全長抗体」という用語は、2つの「全長重鎖」または「重鎖」と2つの「全長軽鎖」または「軽鎖」とから構成される抗体を指し、ここで、「全長重鎖」または「重鎖」は、N末端からC末端に向かって重鎖可変領域(VH)、重鎖定常領域CH1ドメイン、ヒンジ領域(HR)、重鎖定常領域CH2ドメイン、および重鎖定常領域CH3ドメインからなるポリペプチド鎖を指し;そして、全長抗体がIgEアイソタイプのものである場合、それは、重鎖定常領域CH4ドメインも含んでいてもよい。好ましくは、「全長重鎖」は、N末端からC末端に向かってVH、CH1、HR、CH2、およびCH3から構成されるポリペプチド鎖である。「全長軽鎖」または「軽鎖」は、N末端からC末端に向かって軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域(CL)から構成されるポリペプチド鎖である。2対の全長抗体鎖は、CLとCH1との間のジスルフィド結合と、2つの全長重鎖のHR間のジスルフィド結合とによって接続されている。本発明の全長抗体は、単一の種、例えばヒト由来であり得;全長抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。本発明の全長抗体は、VHとVLとの対によってそれぞれ形成される2つの抗原結合部位を含み、この2つの抗原結合部位は、同じ抗原を特異的に認識し、それに結合する。
本明細書で使用される場合、「Fdフラグメント」という用語は、VHドメインとCH1ドメインとから構成される抗体フラグメントを指し;「dAbフラグメント」という用語は、VHドメインから構成される抗体フラグメントを指し(Wardら、Nature341:544 546(1989));「Fabフラグメント」という用語は、VL、VH、CL、およびCH1ドメインから構成される抗体フラグメントを指し;「F(ab’)2フラグメント」という用語は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって接続された2つのFabフラグメントを含む抗体フラグメントを指し;「Fab’フラグメント」という用語は、インタクトな軽鎖と重鎖Fdフラグメント(VHドメインとCH1ドメインとからなる)とからなるF(ab’)2フラグメント中の2つの重鎖フラグメントを接続するジスルフィド結合を還元することによって得られるフラグメントを指す。
本明細書で使用される場合、「Fvフラグメント」という用語は、抗体の単一アームのVLドメインとVHドメインとから構成される抗体フラグメントを指す。Fvフラグメントは、一般に、完全な抗原結合部位を形成することができる最小の抗体フラグメントであると考えられている。6つのCDRは、抗体に抗原結合特異性を付与することができると一般に考えられている。しかし、可変領域(例えば、3つの抗原特異的CDRのみを含むFdフラグメント)であっても抗原を認識してそれに結合することができるが、その親和性は完全な結合部位の親和性よりも低くなり得る。
本明細書で使用される場合、「Fcフラグメント」という用語は、ジスルフィド結合を介して結合した抗体の第1重鎖の第2および第3定常領域と第2重鎖の第2および第3定常領域とで形成された抗体フラグメントを指す。抗体のFcフラグメントは多くの異なる機能を有するが、抗原結合には関与しない。
本明細書で使用される場合、「scFv」という用語は、VLドメインとVHドメインとを含む単一のポリペプチド鎖を指し、VLとVHとはリンカーを介して接続されている(例えば、Birdら、Science242:423-426(1988);Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988);ならびにPluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、RoseburgおよびMoore編、Springer-Verlag、New York、pp.269-315(1994)を参照されたい)。そのようなscFv分子は、一般構造:NH2-VL-リンカー-VH-COOHまたはNH2-VH-リンカー-VL-COOHを有し得る。先行技術の適切なリンカーは、反復するGGGGSアミノ酸配列またはその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列(GGGGS)4を有するリンカーを用いることができるが、その変異体を用いることもできる(Holligerら(1993)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。本発明で使用され得る他のリンカーは、Alfthanら(1995)、Protein Eng.8:725-731、Choiら(2001)、Eur.J.Immunol.31:94-106、Huら(1996)、Cancer Res.56:3055-3061、Kipriyanovら(1999)、J.Mol.Biol.293:41-56、およびRooversら(2001)、Cancer Immunol.に記載されている。場合によっては、scFvのVHとVLとの間にもジスルフィド結合が存在し得る。本明細書で使用される場合、「ジscFv」という用語は、2つのscFvを連結することによって形成される抗体フラグメントを指す。
本明細書で使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、そのVHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、使用されるリンカーが短すぎて同じ鎖の2つのドメイン間の対形成が可能にならず、その結果、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対形成せざるを得ず、2つの抗原結合部位を作り出すことを指す(例えば、Holliger P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)およびPoljak RJら、Structure2:1121-1123(1994)を参照されたい)。
上述の抗体フラグメントのそれぞれは、全長抗体が結合する同じ抗原に特異的に結合する能力を維持し、および/または、抗原への特異的結合について全長抗体と競合する。
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」は、カップリングアームを介して第1の抗体(フラグメント)と第2の抗体(フラグメント)または抗体模倣物とによって形成される複合体を指す。カップリングの様式としては、化学反応、遺伝子融合、タンパク質融合、ポリペプチド融合および酵素反応を含み、これらに限定されない。「多重特異性抗体」は、例えば、三重特異性抗体および四重特異性抗体を含み、ここで、前者は、3つの異なる抗原結合特異性を有する抗体であり、そして、後者は、4つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。
本明細書で使用される場合、「抗体模倣物」は、抗体のように抗原に特異的に結合するが、抗体の構造を有しない物質を指す。それらは、通常、約3~20kDaのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質、例えばアンキリンリピートタンパク質(DARPin)およびフィノマーである。設計されたアンキリンリピートタンパク質(DARPin)は、中国特許出願公開第104341529号におけるように、IgG抗体、scFv-Fc抗体フラグメント、またはそれらの組み合わせに連結される。抗IL-17aフィノマーは、国際公開第2015141862号におけるように、抗IL-6R抗体に結合する。
これに関連して、抗体の抗原結合フラグメント(例えば、上記の抗体フラグメント)は、当業者に公知の従来技術(例えば、組換えDNA技術、または酵素的もしくは化学的フラグメント化法)を使用して所与の抗体(例えば、本発明によって提供される抗体)から得ることができ、インタクトな抗体をスクリーニングするのと同じ様式で特異性についてスクリーニングすることができる。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」および「mAb」という用語は同じ意味を有し、互換的に使用され、高度に相同な抗体分子の群、すなわち、自発的に起こり
得る自然変異を除いて同一の抗体分子の群に由来する抗体または抗体のフラグメントを指す。モノクローナル抗体は、抗原上の単一エピトープに対して高い特異性を有する。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と比較して言及され、通常、少なくとも2つ以上の異なる抗体を含み、これらの異なる抗体は、通常、抗原上の異なるエピトープを認識する。加えて、修飾語「モノクローナル」は、非常に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示すにすぎず、いずれかの特定の方法によって抗体が産生されることを必要とすると解釈されるべきではない。
得る自然変異を除いて同一の抗体分子の群に由来する抗体または抗体のフラグメントを指す。モノクローナル抗体は、抗原上の単一エピトープに対して高い特異性を有する。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と比較して言及され、通常、少なくとも2つ以上の異なる抗体を含み、これらの異なる抗体は、通常、抗原上の異なるエピトープを認識する。加えて、修飾語「モノクローナル」は、非常に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示すにすぎず、いずれかの特定の方法によって抗体が産生されることを必要とすると解釈されるべきではない。
本発明のモノクローナル抗体は、様々な技術、例えば、ハイブリドーマ技術(例えば、Kohlerら、Nature、256:495、1975を参照されたい)、組換えDNA技術(例えば、米国特許出願第4,816,567号を参照されたい)またはファージ抗体ライブラリー技術(例えば、Clacksonら、Nature352:624-628、1991、もしくはMarksら、J.Mol.Biol.222:581-597、1991を参照されたい)によって調製することができる。
例えば、モノクローナル抗体は、以下のようにして調製することができる。マウスまたは他の適切な宿主動物を、最初に免疫原で(必要に応じてアジュバントを添加して)免疫する。免疫原またはアジュバントの注射方法は、通常、多点皮下注射または腹腔内注射である。免疫原は、宿主における抗原の免疫原性を高めるために、特定の公知のタンパク質、例えば、血清アルブミンまたは大豆トリプシン阻害剤に予め結合させることができる。アジュバントは、フロイントアジュバントまたはMPL-TDMなどであり得る。動物が免疫された後、身体は、免疫原に特異的に結合する抗体を分泌するリンパ球を産生する。また、リンパ球はインビトロ免疫により得ることもできる。目的のリンパ球を回収し、適切な融合剤、例えばPEGを使用して骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得る(Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、pp.59-103、Academic Press、1996)。上記で調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない親骨髄腫細胞の増殖を阻害することができる1以上の物質を好ましくは含む適切な培養培地に接種され得る。例えば、ヒポキサンチングアニンホスホトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く親骨髄腫細胞の場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミン(HAT培地)を培養培地に添加すると、HGPRT欠損細胞の増殖が阻害される。好ましい骨髄腫細胞は、高い融合速度、安定した抗体分泌能、およびHAT培養培地に対する感受性を有するべきである。これらの中でも、マウス骨髄腫、例えばMOP-21またはMC-11マウス腫瘍由来株(THE Salk Institute Cell Distribution Center、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)およびSP-2/0またはX63-Ag8-653細胞株(American Type Culture Collection、ロックビル、メリーランド州、米国)が、骨髄腫細胞に好ましい。さらに、研究により、ヒトモノクローナル抗体を調製するためのヒト骨髄腫およびヒト-マウス異種骨髄腫細胞株の使用も報告された(Kozbor、J.Immunol.、133:3001(1984);Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、pp51-63、Marcel Dekker,Inc.、ニューヨーク、1987)。ハイブリドーマ細胞を増殖させるための培養培地を使用して、特異的抗原に対するモノクローナル抗体の産生を検出する。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を測定するための方法としては、例えば、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を含む。例えば、モノクローナル抗体の親和性は、Munsonら、Anal.Biochem.107:220(1980)に記載されたScatchardアッセイを使用して測定することができる。ハイブリドーマによって産生された抗体の特異性、親和性、および反応性を測定した後、目的の細胞株を、Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、pp.59-103、Academic Press、1996に記載された標準的な限界希釈法によってサブクローニングすることができる。適切な培養培地は、DMEMまたはRPMI-1640などであり得る。さらに、ハイブリドーマ細胞は、腹水腫瘍の形態で動物において増殖させることもできる。伝統的な免疫グロブリン精製方法、例えば、プロテインAアガロースゲル、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーを利用して、サブクローン化細胞によって分泌されたモノクローナル抗体を、細胞培養培地、腹水、または血清から単離することができる。
モノクローナル抗体は、遺伝子工学の組換え技術によっても得ることができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖遺伝子をコードするDNA分子は、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖遺伝子に特異的に結合する核酸プライマーを用いたPCR増幅によって、ハイブリドーマ細胞から単離することができる。得られたDNA分子を発現ベクターに挿入した後、宿主細胞(例えば、大腸菌細胞、COS細胞、CHO細胞、または免疫グロブリンを産生しない他の骨髄腫細胞)にトランスフェクトし、適切な条件で培養することにより、所望の組換え抗体が得られる。
抗体は、周知の技術、例えばプロテインAまたはプロテインGを使用するアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。続いてまたは代わりに、特異的抗原(抗体によって認識される標的分子)またはその抗原性エピトープをカラムに固定化し、免疫特異的抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。免疫グロブリンの精製は、例えば、D.Wilkinson(The Scientist、The Scientist,Inc.、フィラデルフィア、ペンシルベニア州より出版、第14巻、No.8(2000年4月17日)、pp.25-28)に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「マウス抗体」という用語は、免疫したマウスのB細胞を骨髄腫細胞と融合させ、無限に増殖して抗体を分泌することができるマウスハイブリッド融合細胞を選択し、続いて、スクリーニング、抗体調製および抗体精製を行うことによって調製される抗体、または、抗原がマウスの体内に侵入した後に、B細胞の分化および増殖によって形成される形質細胞によって分泌される抗体を指す。特定の抗原の刺激下で産生された抗体の場合、抗体の産生は、抗原が人体に侵入することによって引き起こされる様々な免疫細胞の相互作用によるものであり、これはB細胞の形質細胞への分化および増殖をもたらし、これにより抗体が産生され分泌され得る。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、その軽鎖または/および重鎖の一部が1つの抗体(特定の種に由来し得るか、またはある種の特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る)に由来し、軽鎖または/および重鎖の別の一部が別の抗体(同じもしくは異なる種に由来し得るか、または同じもしくは異なる抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る)に由来するが、それにもかかわらず依然として目的の抗原に対する結合活性を保持している抗体を指す(Cabillyらによる米国特許第4,816,567号;Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6851 6855(1984))。例えば、「キメラ抗体」という用語は、抗体(例えば、ヒト-マウスキメラ抗体)を含むことができ、ここで、この抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、第1の抗体(例えば、マウス抗体)に由来し、一方で、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、第2の抗体(例えば、ヒト抗体)に由来する。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体の配列との相同性を増加させるようにアミノ酸配列が改変されている遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体のCDR領域の全部または一部は、非ヒト抗体(ドナー抗体)に由来し、非CDR領域(例えば、可変領域FRおよび/または定常領域)の全部または一部は、ヒト免疫グロブリン(受容体抗体)に由来する。ヒト化抗体は、典型的には、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を増加させる能力、免疫応答を増強する能力などを含むがこれらに限定されない、ドナー抗体の所望の特性を保持する。ドナー抗体は、望ましい特性(例えば、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を増加させるおよび/または免疫応答を増強する能力)を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル)由来の抗体であり得る。
ヒト化抗体は、非ヒトドナー抗体(例えば、マウス抗体)の予想される特性を保持することが可能なだけでなく、ヒト被験体において非ヒトドナー抗体(例えば、マウス抗体)の免疫原性を効果的に低下させることができ、したがって特に有利である。しかしながら、ドナー抗体のCDRと受容体抗体のFRとの間の適合問題のために、ヒト化抗体の予想される特性(例えば、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を改善する能力、および/または免疫応答を増強する能力)は、一般に、非ヒトドナー抗体(例えば、マウス抗体)の特性よりも低い。
したがって、当該分野における研究者らは、抗体のヒト化に関して徹底的な研究を行い、ある程度の進歩を遂げてきたが(例えば、Jonesら、Nature、321:522 525(1986);Reichmannら、Nature、332:323 329(1988);Presta、Curr.Op.Struct.Biol.、2:593 596(1992);およびClark、Immunol.Today21:397 402(2000)を参照されたい)、先行技術は、産生されたヒト化抗体が、最も高いヒト化度を有するだけでなく、ドナー抗体の予想される特性を可能な限り保持するようにドナー抗体を完全にヒト化する方法について詳細な助言を提供していない。技術者らは、特定のドナー抗体の探索、調査および改変を行い、高いヒト化度(例えば、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のヒト化度)を有するだけでなく、特定のドナー抗体の予想される特性も保持するヒト化抗体を得るために、多くの創造的な研究を行う必要がある。
本発明において、ヒト化抗体がドナー抗体の特性(例えば、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を改善する能力および/または免疫応答を増強する能力を含む)を可能な限り保持することができるように、本発明のヒト化抗体のフレームワーク領域(FR)は、ヒト受容体抗体のアミノ酸残基と、対応する非ヒトドナー抗体のアミノ酸残基の両方を含み得る。
本発明のヒト化抗体は、上記で調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖をコードするDNAを、標的マウスハイブリドーマから得て、標準的な分子生物学の技術を使用して非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。
キメラ抗体を調製するために、マウス免疫グロブリンの可変領域を、当該技術分野で公知の方法(例えば、Cabillyらによる米国特許第4
,816,567号を参照されたい)を使用してヒト免疫グロブリンの定常領域に連結することができる。例えば、VHをコードするDNAは、全長重鎖遺伝子を得るために、重鎖定常領域をコードする別のDNA分子に作動可能に連結される。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり(例えば、Kabat,EAら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH Publication No.91-3242を参照されたい)、これらの領域を含むDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、またはIgD定常領域であり得るが、一般に、好ましくはIgG1またはIgG4定常領域である。例えば、VLをコードするDNAは、全長軽鎖遺伝子(およびFab軽鎖遺伝子)を得るために、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に作動可能に連結される。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり(例えば、Kabat,EAら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、US Department of Health and Human Services、NIH Publication No.91-3242を参照されたい)、これらの領域を含むDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はκまたはλ定常領域であり得るが、一般に、好ましくはκ定常領域である。
,816,567号を参照されたい)を使用してヒト免疫グロブリンの定常領域に連結することができる。例えば、VHをコードするDNAは、全長重鎖遺伝子を得るために、重鎖定常領域をコードする別のDNA分子に作動可能に連結される。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり(例えば、Kabat,EAら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH Publication No.91-3242を参照されたい)、これらの領域を含むDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、またはIgD定常領域であり得るが、一般に、好ましくはIgG1またはIgG4定常領域である。例えば、VLをコードするDNAは、全長軽鎖遺伝子(およびFab軽鎖遺伝子)を得るために、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に作動可能に連結される。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり(例えば、Kabat,EAら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、US Department of Health and Human Services、NIH Publication No.91-3242を参照されたい)、これらの領域を含むDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はκまたはλ定常領域であり得るが、一般に、好ましくはκ定常領域である。
ヒト化抗体を調製するために、マウスCDR領域を、当該技術分野で公知の任意の方法(Winterによる米国特許第5,225,539号;Queenらによる米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,762号、および同第6,180,370号;ならびにLo,Benny,KC編、Antibody Engineering:Methods and Protocols、第248巻、Humana Press、ニュージャージー州、2004を参照されたい)を使用してヒトフレームワーク配列に移植することができる。あるいは、免疫後に内因性免疫グロブリンを産生することなく完全なヒト抗体ライブラリーを産生することができるトランスジェニック動物を使用することもできる。例えば、キメラ変異マウスおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらし、そのような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすことが報告されている(例えば、Jakobovitsら、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551;Jakobovitsら、1993、Nature362:255-258;Bruggermannら、1993、Year in Immunology7:33;およびDuchosalら、1992、Nature355:258を参照されたい)。上記のトランスジェニック動物の非限定的な例としては、再編成されていないヒト重鎖(μおよびγ)ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座と、内因性のμおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異とを有するHuMAbマウス(Medarex,Inc.)(例えば、Lonbergら(1994)Nature 368(6474):856-859を参照されたい);または、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保有する「KMマウス(商標)」(特許出願国際公開第02/43478号を参照されたい)を含む。抗体をヒト化する他の方法としては、ファージディスプレイ技術(Hoogenboomら、1991、J.Mol.Biol.227:381;Marksら、J.Mol.Biol.1991、222:581-597;Vaughanら、1996、Nature Biotech、14:309)を含む。
本明細書で使用される場合、「ヒト化度」という用語は、ヒト化抗体中の非ヒトアミノ酸残基の数を評価するために使用される指標を指す。ヒト化抗体のヒト化度は、例えば、IMGTウェブサイトのDomainGapAlignにより、ヒトVドメインに対する可変領域配列の相同性を予測することによって評価することができる。
本明細書で使用される場合、「相同抗体」という用語は、抗体の変異体を指し、該変異体に含まれる重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列と相同であり、そして、該変異体は、本発明の抗CLDN18.2抗体の所望の機能的特性を保持する。
比較のための配列アラインメントの方法は、当該技術分野で周知である。様々な手順およびアラインメントアルゴリズムが、Smith TFおよびWaterman MS、Adv.Appl.Math.、2:482、1981;Higgins DGおよびSharp PM、CABIOS5:151、1989に記載されている。Altschul SFら、Nature Genet.、6:119、1994は、配列アラインメントおよび相同性計算のための詳細な構想を提供している。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、2つの分子間の非無作為結合反応、例えば、抗体と該抗体が向けられる抗原との間の反応を指す。特異的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の平衡解離定数(KD)または最大半値有効濃度(EC50)で表すことができる。
2つの分子間の特異的結合特性は、当該技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。1つの方法は、抗原結合部位/抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを含む。「結合速度定数」(kaまたはkon)および「解離速度定数」(kdisまたはkoff)の両方は、濃度ならびに実際の会合および解離速度から計算することができる(Malmqvist M、Nature、1993、361:186-187を参照されたい)。kdis/konの比は、解離定数KDに等しい(Daviesら、Annual Rev Biochem、1990;59:439-473を参照されたい)。KD、konおよびkdis値は、任意の有効な方法で測定することができる。特定の実施形態では、解離定数は、生物発光干渉法(例えば、ForteBio Octet法)を使用して測定することができる。また、解離定数は、表面プラズモン共鳴法(例えば、Biacore)またはKinexaにより測定することができる。
本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、2つのポリペプチド間または2つの核酸間の一致度を指す。比較のための2つの配列が、特定の部位に塩基またはアミノ酸の同じモノマーサブユニットを有する(例えば、2つのDNA分子がそれぞれ特定の部位にアデニンを有するか、または2つのポリペプチドがそれぞれ特定の部位にリジンを有する)場合、これらの2つの分子は、その部位で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、比較のための部位の総数に対する、2つの配列によって共有される同一の部位の数×100の関数である。例えば、2つの配列の10個の部位のうち6個が一致する場合、これらの2つの配列は60%の同一性を有する。例えば、DNA配列:CTGACTとCAGGTTは、50%の同一性を共有する(6個の部位のうち3個が一致する)。一般に、2つの配列の比較は、最大の同一性をもたらすように行われる。このようなアラインメントは、Needlemanらの方法(J.Mol.Biol.48:443-453、1970)に基づくAlignプログラム(DNAstar,Inc.)のようなコンピュータプログラムを用いて行うことができる。2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を使用して、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれているE.MeyersおよびW.Millerのアルゴリズム(Comput.Appl.Biosci.、4:11-17(1988))を使用して決定することもできる。さらに、2つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、Blossum62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、および16、14、12、10、8、6または4のギャップ重量および1、2、3、4、5または6の長さ重量を使用して、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれたNeedlemanおよびWunschのアルゴリズム(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質/ポリペプチドの予想される特性に悪影響を及ぼさないか、または予想される特性を変化させないアミノ酸置換を意味し、保存的置換によって得られた抗体変異体は、CLDN18.2に特異的に結合するような、その元の配列の生物学的活性を保持する。例えば、保存的置換は、当該技術分野で公知の標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発によって導入することができる。保存的アミノ酸置換としては、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、対応するアミノ酸残基と物理的または機能的に類似する(例えば、共有結合または水素結合を形成する能力などを含めて、同様のサイズ、形状、電荷、化学的特性を有する)残基で置換される置換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下を有するアミノ酸を含む:塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに、芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)。したがって、対応するアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することが好ましい。アミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野で周知である(例えば、Brummellら、Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashiら、Protein Eng.12(10):879-884(1999);およびBurksら、Proc.Natl Acad.Set USA94:412-417(1997)を参照されたい(参照により本明細書に組み込まれる))。
本明細書に含まれる20個の従来のアミノ酸は、通常の様式で発現される。例えば、参照により本明細書に組み込まれるImmunology-A Synthesis(第2版、E.S.GolubおよびD.R.Gren編、Sinauer Associates、サンダーランド、マサチューセッツ州(1991))を参照されたい。本開示において、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同じ意味を有し、互換的に使用される。本開示においても、アミノ酸は、一般に、当該技術分野で知られているように一文字および三文字の略語によって表される。例えば、アラニンは、AまたはAlaで表され得る。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体およ
び/または賦形剤」という用語は、被験体および活性成分と薬理学的および/または生理学的に適合する担体および/または賦形剤を指し、これは当該技術分野で周知であり(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Gennaro AR編、第19版、ペンシルベニア:Mack Publishing Company、1995を参照されたい)、pH調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、希釈剤、浸透圧を維持する薬剤、吸収を遅延させる薬剤、防腐剤を含み、これらに限定されない。例えば、pH調整剤としては、リン酸緩衝液を含み、これらに限定されない。界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、またはTween-80などの非イオン性界面活性剤を含み、これらに限定されない。イオン強度増強剤としては、塩化ナトリウムを含み、これに限定されない。防腐剤としては、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含み、これらに限定されない。浸透圧を維持する薬剤としては、糖類、NaClなどを含み、これらに限定されない。吸収を遅延させる薬剤としては、モノステアレートおよびゼラチンを含み、これらに限定されない。希釈剤としては、水、水性緩衝液(例えば、緩衝生理食塩水)、アルコールおよびポリオール(例えば、グリセリン)などを含み、これらに限定されない。防腐剤としては、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばチメロサール、2-フェノキシエタノール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含み、これらに限定されない。安定剤は、当業者によって一般に理解される意味を有し、薬物中の活性成分の所望の活性を安定化することができ、グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、SPGA、糖類(例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、ラクトース、デキストランもしくはグルコース)、アミノ酸(例えば、グルタミン酸、グリシン)、タンパク質(例えば、乾燥ホエイ、アルブミンもしくはカゼイン)、またはそれらの分解産物(例えば、ラクトアルブミン加水分解物)を含み、これらに限定されない。
び/または賦形剤」という用語は、被験体および活性成分と薬理学的および/または生理学的に適合する担体および/または賦形剤を指し、これは当該技術分野で周知であり(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Gennaro AR編、第19版、ペンシルベニア:Mack Publishing Company、1995を参照されたい)、pH調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、希釈剤、浸透圧を維持する薬剤、吸収を遅延させる薬剤、防腐剤を含み、これらに限定されない。例えば、pH調整剤としては、リン酸緩衝液を含み、これらに限定されない。界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、またはTween-80などの非イオン性界面活性剤を含み、これらに限定されない。イオン強度増強剤としては、塩化ナトリウムを含み、これに限定されない。防腐剤としては、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含み、これらに限定されない。浸透圧を維持する薬剤としては、糖類、NaClなどを含み、これらに限定されない。吸収を遅延させる薬剤としては、モノステアレートおよびゼラチンを含み、これらに限定されない。希釈剤としては、水、水性緩衝液(例えば、緩衝生理食塩水)、アルコールおよびポリオール(例えば、グリセリン)などを含み、これらに限定されない。防腐剤としては、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばチメロサール、2-フェノキシエタノール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含み、これらに限定されない。安定剤は、当業者によって一般に理解される意味を有し、薬物中の活性成分の所望の活性を安定化することができ、グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、SPGA、糖類(例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、ラクトース、デキストランもしくはグルコース)、アミノ酸(例えば、グルタミン酸、グリシン)、タンパク質(例えば、乾燥ホエイ、アルブミンもしくはカゼイン)、またはそれらの分解産物(例えば、ラクトアルブミン加水分解物)を含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、被験体において疾患または障害または症状(例えば、腫瘍、感染症、または自己免疫疾患)の発生を予防または遅延させるために行われる方法を指す。本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果を得るために行われる方法を指す。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能であれ検出不能であれ、症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の状態の安定化(すなわち、それ以上悪化させないこと)、疾患の発症の遅延または引き延ばし、疾患の状態の改善または緩和、および(部分的または完全な)症状の緩和を含み、これらに限定されない。さらに、「治療」という用語は、(治療を受けていない場合の)予測生存期間と比較して生存期間を延長することも指し得る。
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、哺乳動物、例えば霊長類哺乳動物、例えばヒトを指す。特定の実施形態では、被験体(例えば、ヒト)は、腫瘍、感染症もしくは自己免疫疾患に罹患しているか、または上述の疾患に罹患するリスクがある。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を得るか、または少なくとも部分的に得るのに十分な量を指す。例えば、疾患(例えば、腫瘍、感染症、または自己免疫疾患)を予防するための有効量は、疾患(例えば、腫瘍、感染症、または自己免疫疾患)の発生を予防し、防止し、または遅延させるのに十分な量を指し、疾患を治療するための有効量は、疾患にすでに罹患している患者において、疾患およびその合併症を治癒させるか、または少なくとも部分的に予防するのに十分な量を指す。そのような有効量を決定することは、完全に当業者の能力の範囲内である。例えば、治療用途のための有効量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、患者の一般的な条件、例えば年齢、体重および性別、薬物の投与様式、ならびに同時に投与される他の治療法などに依存する。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、造血起源を有し、免疫応答において役割を果たす細胞、例えばリンパ球、例えばB細胞およびT細胞;ナチュラルキラー細胞;骨髄細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球を含む。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、免疫細胞(例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、または顆粒球)、および免疫細胞または肝臓によって産生される可溶性高分子(抗体、サイトカイン、および補体を含む)の影響を指し、これは、自己免疫または病理学的炎症に関連して、侵襲性病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞、もしくは正常なヒト細胞もしくは組織の選択的損傷もしくは破壊、またはそれらの身体からの除去をもたらす。本発明において、「抗原特異的T細胞応答」とは、T細胞がT細胞特異的抗原により刺激された場合に起こる、T細胞によって生じる免疫応答を指す。抗原特異的刺激時にT細胞によって生じる応答の非限定的な例としては、T細胞の増殖、およびIL-2などのサイトカインの産生を含む。
本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」という用語は、抗体のアイソタイプとともに変化する抗体のFc領域(天然配列またはアミノ酸配列変異体のFc領域)に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Fc受容体結合親和性、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、補体依存性細胞傷害性(CDC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)のダウンレギュレーション、B細胞活性化、サイトカイン分泌、抗体および抗原-抗体複合体の半減期/クリアランスなどを含み、これらに限定されない。抗体のエフェクター機能を変化させるための方法は、当該技術分野で公知であり、例えばFc領域に突然変異を導入することによる。
「がん」および「腫瘍」という用語は互換的に使用され、体内の異常細胞の制御されない増殖を特徴とする疾患の大きな群を指す。調節されない細胞分裂は、隣接組織に浸潤する悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得、リンパ系または血流を介して身体の遠位部分に転移し得る。がんには、良性および悪性のがん、ならびに休眠腫瘍または微小転移が含まれる。がんには、血液がん、特に血液悪性腫瘍も含まれる。
「血液悪性腫瘍」または「血液腫瘍」という用語は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、またはリンパ性悪性腫瘍、ならびに、脾臓がんおよびリンパ節腫瘍を含む。例示的なリンパ腫としては、B細胞リンパ腫およびT細胞リンパ腫を含む。B細胞リンパ腫としては、例えば、ホジキンリンパ腫を含む。T細胞リンパ腫としては、例えば、皮膚T細胞リンパ腫を含む。血液悪性腫瘍としては、白血病、例えば二次性白血病または急性リンパ性白血病をも含む。血液悪性腫瘍としては、骨髄腫(例えば、多発性骨髄腫)、ならびに他の血液および/またはB細胞もしくはT細胞関連がんも含む。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、分子自体、分子フラグメント、または組成物が動物またはヒトに適切に投与された場合、有害なアレルギー反応または他の不都合な反応を引き起こさないことを意味する。薬学的に許容される担体またはその成分として使用され得るいくつかの物質の具体例としては、ラクトース、デンプン、セルロースおよびそれらの誘導体などの糖類、植物油、ゼラチン、プロピレングリコールなどのポリオール、アルギン酸などを含む。
これに関連して、併用療法は、本発明によって包含されるADCまたは組成物または医薬組成物と、第2の療法の1つもしくは複数の治療剤(例えば、化学療法剤)または他の予防もしくは治療様式(例えば、放射線療法)との組み合わせの使用を含む。
第2の療法のための例示的な治療剤としては、化学療法剤(例えば、有糸分裂阻害剤)、アルキル化剤(例えば、窒素マスタード)、代謝拮抗物質(例えば、葉酸類似体)、天然産物(例えば、ビンカアルカロイド)、様々な薬剤(例えば、白金配位錯体)、ホルモンおよびアンタゴニスト(例えば、副腎コルチコステロイド)、免疫調節剤(例えば、ブロピリミン、Upjohn)などを含む。他の抗がん治療としては、がん細胞を特異的に標的化する他の抗体を含む。
この種の併用療法では、様々な治療剤が異なる相補的な作用機序を有することが多く、そして、併用療法は相乗効果をもたらし得る。併用療法には、免疫応答に影響を及ぼす(例えば、応答を増強または活性化する)治療剤、および腫瘍/がん細胞に影響を及ぼす(例えば、阻害または殺傷する)治療剤が含まれる。併用療法は、薬剤耐性がん細胞の発生可能性を低減することができる。併用療法は、薬剤のうち1つ以上に関連する有害作用を低減または排除するために、薬剤のうち1つ以上の投与量を低減することを可能にし得る。このような併用療法は、潜在的な疾患、障害、または症状に対して相乗的な治療効果または予防効果を有し得る。
これに関連して、「組み合わせ」には、別々に投与され得る治療法、例えば別々に投与するために別々に製剤化される(例えば、キットで提供され得る)治療法、および単一製剤として一緒に投与され得る治療法(すなわち、「共製剤」)が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のADC、組成物または医薬組成物は、連続的に投与され得る。他の実施形態では、それらは同時に投与され得る。本発明のADCは、少なくとも1つの他の(活性)薬剤との任意の組み合わせで使用され得る。
HER2陰性とは、IHC1+またはIHC2+/FISH陰性、ならびにIHC0~1+およびIHC1+~2+の範囲を含めて、細胞表面上に有意な量のHER2タンパク質が存在しないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を含む。
本明細書で使用される場合、「C1-6アルキル」という用語は、1~6個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル(基)を指し、例えば、「C1-4アルキル」および「C1-3アルキル」を含む。具体例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、2-メチルブチル、ネオペンチル、1-エチルプロピル、n-ヘキシル、イソヘキシル、3-メチルペンチル、2-メチルペンチル、1-メチルペンチル、3,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、および1,2-ジメチルプロピルを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「C1-6アルキレン」という用語は、1~6個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルカンの2個の水素原子を失うことによって得られる二価基を指し、例えば、「C1-4アルキレン」および「C1-3アルキレン」を含む。具体例としては、メチレン、エチレン、プロパ-1,3-イレン、ブタ-1,4-イレン、ペンタ-1,5-イレン、およびヘキサ-1,6-イレンを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「C2-10アルケニル」という用語は、少なくとも1つの二重結合および2~10の炭素数を有する直鎖または分岐鎖アルケニルを指し、例えば、「C2-6アルケニル」および「C2-4アルケニル」を含む。例としては、ビニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、1,3-ブタジエニル、1-ペンテニル、
2-ペンテニル、3-ペンテニル、1,3-ペンタジエニル、1,4-ペンタジエニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、1,4-ヘキサジエニル、シクロペンテニル、1,3-シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、および1,4-シクロヘキサジエニルを含み、これらに限定されない。
2-ペンテニル、3-ペンテニル、1,3-ペンタジエニル、1,4-ペンタジエニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、1,4-ヘキサジエニル、シクロペンテニル、1,3-シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、および1,4-シクロヘキサジエニルを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「C2-10アルケニレン」という用語は、2~10個の炭素原子を含むオレフィンの2個の水素原子を失うことによって得られる二価基を指し、例えば、「C2-8アルケニレン」および「C4-6アルケニレン」を含む。例としては、ペンテン-1,5-イレン、2-ペンテン-1,5-イレン、およびヘキセン-1,6-イレンを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「C2-10アルキニル」という用語は、少なくとも1つの三重結合および2~10の炭素数を有する直鎖または分岐鎖アルキニルを指し、例えば、「C2-6アルキニル」および「C2-4アルキニル」を含む。例としては、エチニル、プロピニル、2-ブチニル、2-ペンチニル、3-ペンチニル、4-メチル-2-ペンチニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、および5-メチル-2-ヘキシニルを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「C2-10アルキニレン」という用語は、2~10個の炭素原子を含むアルキンの2個の水素原子を失うことによって得られる二価基を指し、例えば、「C2-8アルキニレン」および「C4-6アルキニレン」を含む。例としては、ペンチン-1,5-イレン、2-ペンチン-1,5-イレン、およびヘキシン-1,6-イレンを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「C1-6アルコキシ」という用語は、C1-6アルキル-O-の構造を有する基を指し、ここで、C1-6アルキルは先に定義した通りである。具体例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、およびヘキソキシを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「5~12員ヘテロアリール」という用語は、5~12個の環員を含む芳香族環式基を指し、環員の1つは、N、O、およびSから選択される少なくともヘテロ原子である。具体例としては、5~10員のヘテロアリール、5~10員の窒素含有ヘテロアリール、ならびに5~6員の酸素含有ヘテロアリール、例えば、フリル、チエニル、ピロリル、チアゾリル、イソチアゾール、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、1,2,3-トリアジニル、1,3,5-トリアジニル、および1,2,4,5-テトラジニルを含み、これらに限定されない。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクター/担体、または試薬に限定されず、それらは異なり得る。さらに、本明細書で使用される用語は、本発明の範囲を限定するためではなく、特定の実施形態を記載する目的にのみ使用される。
本書(明細書および特許請求の範囲)において、単数形「a」、「an」、「the」、および「said」は、文脈上別段の明確な指定がない限り、それらの複数形を含む。例えば、「宿主細胞」は、複数の宿主細胞を含む。加えて、中国語には対応する英語の単数形および複数形の文法規則はなく、名詞の単数形および複数形は文脈または実際の状況に応じて判断されなければならない。したがって、英語への翻訳では、名詞に対する接頭辞「1つ以上」が正しいものと思われる。
以下、実施例を挙げて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者であれば、以下の実施例が本発明を例示するために使用されるにすぎず、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解するであろう。実施例に示されていない具体的な条件は、従来の条件または製造業者によって提案された条件に従う。製造業者を示さずに使用される試薬または機器は、すべて市販の従来の製品である。
[実施例1]生物活性分子(TOXIN-1)の合成
ベロテカン塩酸塩(3g、6.38mmol)およびトリエチルアミン(2.58g、25.54mmol)のジクロロメタン(40mL)溶液に、塩化メタンスルホニル(462mg、12.77mmol、純度約70%)を滴加し、得られた混合物を室温で2時間反応させた。吸引濾過後、濾過ケーキをジクロロメタン(3mL)で3回洗浄して、(S)-N-(2-(4-エチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオン-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-11-イル)エチル)-N-イソプロピルメタンスルホンアミド(TOXIN-1)2.2gを得た。
構造特性評価データは以下の通りである。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.32(d,J=8.4Hz,1H),8.20(dd,J=8.4,1.2Hz,1H),7.93-7.84(m,1H),7.79(t,J=7.6Hz,1H),7.35(s,1H),6.56(s,1H),5.44(d,J=9.2Hz,4H),3.98(p,J=6.7Hz,1H)
,3.50(t,J=8.0Hz,2H),3.42-3.35(m,2H),3.00(s,3H),1.93-1.82(m,2H),1.15(d,J=6.7Hz,6H),0.88(t,J=7.3Hz,3H). ESI-MS(m/z):512.2[M+H]+. [α]D 20は+28.19°(c=0.101g/100mL、CH3CN)である。
,3.50(t,J=8.0Hz,2H),3.42-3.35(m,2H),3.00(s,3H),1.93-1.82(m,2H),1.15(d,J=6.7Hz,6H),0.88(t,J=7.3Hz,3H). ESI-MS(m/z):512.2[M+H]+. [α]D 20は+28.19°(c=0.101g/100mL、CH3CN)である。
工程1:6-(2-(メチルチオ)ピリミジン-5-イル)-5-ヘキシン酸メチルエステル(化合物3-2)の合成 室温で、メチル5-ヘキシノエート(500mg、3.97mmol)および5-ブロモ-2-メチルチオピリミジンをN,N-ジメチルホルムアミド(3mL)に溶解し、トリエチルアミン(3mL)、ヨウ化第一銅(75mg、0.4mmol)およびパラジウム(II)ビス(トリフェニルホスフィン)ジクロリド(279mg、0.4mmol)を連続的に加えた。次いで、窒素保護下で混合物を95℃に加熱し、撹拌しながら6時間反応させた。反応を水でクエンチした。反応物を酢酸エチルで抽出した(20mL×3回)。有機相を合わせ、飽和ブラインで洗浄し(20mL×2回)、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、真空中で濃縮し、分取液体クロマトグラフィーで精製して、標記化合物300mgを得た。ESI-MS(m/z):251.3[M+H]+。
工程2:6-(2-(メチルチオ)ピリミジン-5-イル)-5-ヘキシン酸(化合物3-3)の合成 室温で、化合物3-2(200mg、0.8mmol)をテトラヒドロフランと水との混合溶液(4mL/4mL)に溶解し、水酸化リチウム一水和物(235mg、5.6mmol)を加え、得られた混合物を室温で撹拌しながら4時間反応させた後、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した(20mL×2回)。水相を1N塩酸でpH=3に調整し、酢酸エチルで抽出した(20mL×3回)。有機相を合わせ、飽和ブラインで洗浄し(20mL×2回)、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、真空中で濃縮して、120mgの標記化合物を得た。
工程3:6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)-5-ヘキシン酸(化合物3-4)の合成 室温で、化合物3-3(20mg、0.085mmol)をジクロロメタン(4mL)に溶解し、m-クロロ過安息香酸(22mg、0.127mmol)を加え、得られた混合物を室温で撹拌しながら一晩反応させ、そして、分取液体クロマトグラフィーで精製して、標記化合物20mgを得た。ESI-MS(m/z):269.1[M+H]+。
[実施例3](4-((S)-2-(4-アミノブチル)-35-(4-((6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)ヘキサ-5-インアミド)メチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-4,8-ジオキソ-6,12,15,18,21,24,27,30,33-ノナオキサ-3,9-ジアザペンタトリアコンタンアミド)ベンジル)((S)-4-エチル-11-(2-(N-イソプロピルメチルスルホンアミド)エチル)-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-4-イル)カーボネート(化合物TL001)
工程1:6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)-N-プロパルギル-ヘキサ-5-インアミド(化合物3-5)の合成 プロピニルアミン(189mg、3.4mmol)および化合物3-4(800mg、2.83mmol)を25℃でジクロロメタン(10mL)に溶解し、次いで、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(738mg、5.67mmol)およびO-(7-アザ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート(1.63g、4.25mmol)を連続的に加えた。得られた混合物を、撹拌しながら2時間反応させた。反応溶液を真空中で濃縮し、残渣をフラッシュシリカゲルカラム(酢酸エチル/石油エーテル=3/1)で精製して、標記化合物700mgを得た。ESI-MS(m/z):306.1[M+H]+。
工程2:(4-((S)-35-アジド-2-(4-(((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチル)アミノ)ブチル)-4,8-ジオキソ-6,12,15,18,21,24,27,30,33-ノナオキサ-3,9-ジアザペンタトリアコンタンアミド)ベンジル)((S)-4-エチル-11-(2-(N-イソプロピルメチルスルホンアミド)エチル)-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-4-イル)カーボネート(化合物33-1)の合成 TOXIN-1(250mg、0.49mmol)を、窒素保護下で25℃でジクロロメタン(10mL)に溶解し、0℃に冷却し、4-ジメチルアミノピリジン(478mg、3.91mmol)のジクロロメタン(3mL)溶液を加え、続いてトリホスゲン(72mg、0.24mmol)のジクロロメタン(10mL)溶液をゆっくり滴加した。添加後、得られた混合物を、0℃で20分間撹拌しながら反応させ、窒素で20分間パージした。次いで、(S)-2-(32-アジド-5-オキソ-3,9,12,15,18,21,24,27,30-ノナオキサ-6-アザ-ドトリアコンタンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-(((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチル)アミノ)ヘキサンアミド(518mg、0.49mmol)のジクロロメタン(7mL)溶液を加え、0℃で1時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣を分取液体クロマトグラフィーで精製して、標記化合物500mgを得た。ESI-MS(m/z):1597.5[M+H]+。
工程3:((S)-4-エチル-11-(2-(N-イソプロピルメチルスルホンアミド)エチル)-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-4-イル)(4-((S)-2-(4-(((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチル)アミノ)ブチル)-35-(4-((6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)ヘキサ-5-インアミド)メチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-4,8-ジオキソ-6,12,15,18,21,24,27,30,33-ノノキシ-3,9-ジアザペンタトリアコンタンアミド)ベンジル)カーボネート(化合物33-2)の合成 室温で、化合物33-1(80mg、0.05mmol)およびフラグメント3-5(23mg、0.075mmol)をジメチルスルホキシドと水との溶液(2.0mL:0.5mL)に溶解し、臭化第一銅(11mg、0.08mmol)を加えた。得られた混合物を1時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィーで精製して、標記化合物30mgを得た。ESI-MS(m/z):815.9[(M-273)/2+H]+。
工程4:4-((S)-2-(4-アミノブチル)-35-(4-((6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)ヘキサ-5-インアミド)メチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-4,8-ジオキソ-6,12,15,18,21,24,27,30,33-ノナオキサ-3,9-ジアザペンタトリアコンタンアミド)ベンジル)((S)-4-エチル-11-(2-(N-イソプロピルメチルスルホンアミド)エチル)-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-4-イル)カーボネート(化合物TL001)の合成 化合物33-2(30mg、0.02mmol)をジクロロメタン(1.0mL)に溶解し、続いてトリフルオロ酢酸(0.2mL)を加えた。得られた混合物を、室温で30分間反応させ、分取HPLCで精製して、標記化合物のトリフルオロ酢酸塩20.0mgを得た。この構造は以下のように特徴付けられる。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 10.18(s,1H),9.10(s,2H),8.38(t,J=5.56Hz,1H),8.32(d,J=8.40Hz,1H),8.22-8.20(m,2H),8.09(t,J=5.68Hz,1H),7.91-7.87(m,2H),7.82-7.78(m,1H),7.69(brs,3H),7.61(d,J=8.56Hz,2H),7.32(d,J=8.56Hz,2H),7.06(s,1H),5.56(d,J=16.96Hz,1H),5.51(d,J=16.96Hz,1H),5.47(d,J=19.28Hz,1H),5.42(d,J=19.28Hz,1H),5.14(d,J=12.20Hz,1H),5.07(d,J=12.16Hz,1H),4.48(t,J=5.24Hz,2H),4.46-4.43(m,1H),4.29(d,J=5.60Hz,2H),4.08-3.95(m,5H),3.79(t,J=5.28Hz,2H),3.51-3.43(m,32H),3.40(s,3H),3.39-3.35(m,2H),3.30-3.26(m,2H),3.00(s,3H),2.82-2.74(m,2H),2.56(t,J=7.08Hz,2H),2.29(t,J=7.36Hz,2H),2.23-2.13(m,2H),1.82(p,J=7.24Hz,2H),1.78-1.63(m,2H),1.61-1.49(m,2H),1.42-1.27(m,2H),1.15(d,J=6.80Hz,3H),1.13(d,J=6.76Hz,3H),0.90(t,J=7.32Hz,3H). ESI-MS(m/z):816.0[M/2+H]+. [α]D
20は、-19.55°(c=1.000g/100mL、CH3CN)である。
[実施例4]((S)-4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-9-イル)(4-((S)-2-((S)-3-メチル-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)ヘキサ-5-インアミド)メチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)ブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)エタン-1,2-ジイルビス(メチルカルバメート)トリフルオロアセテート(TL002)の合成
工程1:(S)-(4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-9-イル(4-ニトロフェニル)カーボネートの合成 (S)-4,11-ジエチル-4,9-ジヒドロキシ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-3,14(4H,12H)-ジオン(150mg、0.37mmol)を、ジクロロメタン(15mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(96.81mg、0.74mmol)を加え、続いてビス(4-ニトロフェニル)カーボネート(1
27.92mg、0.41mmol)のジクロロメタン(15mL)溶液を加え、得られた混合物を、25℃で3時間反応させた。反応溶液を濃縮して標記化合物207mgを得、これを次の反応に直接使用した。 ESI-MS(m/z):558.1[M+H]+。
27.92mg、0.41mmol)のジクロロメタン(15mL)溶液を加え、得られた混合物を、25℃で3時間反応させた。反応溶液を濃縮して標記化合物207mgを得、これを次の反応に直接使用した。 ESI-MS(m/z):558.1[M+H]+。
工程2:(S)-tert-ブチル(4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-9-イル)エタン-1,2-ジイルビス(メチルカルバメート)の合成 (S)-(4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-9-イル)(4-ニトロフェニル)カーボネート(207mg、0.33mmol)を、ジクロロメタン(10mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(130.87mg、1.00mmol)およびtert-ブチルN-メチル-N-[2-(メチルアミノ)エチル]カルバメート(71.34mg、0.37mmol)を加え、得られた混合物を、25℃で12時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:ジクロロメタン/メタノール=9/1)で精製して、標記化合物207mgを得た。 ESI-MS(m/z):607.3[M+H]+。
工程3:(S)-N-メチル-(4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-9-イル)(2-(メチルアミノ)エチル)カルバメートトリフルオロアセテートの合成 (S)-tert-ブチル(4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-9-イル)エタン-1,2-ジイルビス(メチルカルバメート)(207mg、0.19mmol)をジクロロメタン(8mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸(2mL)を加え、得られた混合物を25℃で2時間反応させた。反応溶液を濃縮して標記化合物200mgを得、これを次の反応に直接使用した。 ESI-MS(m/z):507.2[M+H]+。
工程4:4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)-3-メチルブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)((S)-4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-9-イル)エタン-1,2-ジイルビス(メチルカルバメート)の合成 (4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)-3-メチルブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)(4-ニトロフェニル)カーボネート(150mg、0.12mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(3mL)に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(34.03mg、0.25mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(48.82mg、0.37mmol)を加え、続いて(S)-N-メチル-(4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-9-イル)(2-(メチルアミノ)エチル)カルバメートトリフルオロアセテート(102.11mg、0.12mmol)を加え、得られた混合物を、25℃で16時間反応させた。反応溶液を分取HPLCで精製し、集めた画分を凍結乾燥して、標記化合物44mgを得た。 ESI-MS(m/z):1400.7[M+H]+。
クロマトグラフィーカラム:Waters XBridge Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm 移動相A:アセトニトリル;移動相B:水(0.05%ギ酸)
工程5:((S)-4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-9-イル)(4-((S)-2-((S)-3-メチル-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)ヘキサ-5-インアミド)メチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)ブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)エタン-1,2-ジイルビス(メチルカルバメート)トリフルオロアセテートの合成 4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)-3-メチルブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)((S)-4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-9-イル)エタン-1,2-ジイルビス(メチルカルバメート)(44mg、0.30mmol)および6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)-N-プロピル)ヘキサミド(14.09mg、0.045mmol)を、ジメチルスルホキシド(3mL)と水(0.75mL)との溶液に溶解し、臭化第一銅(8.65mg、0.06mmol)を加え、得られた混合物を25℃で1時間反応させた。反応溶液を、分取HPLCで精製し、集めた画分を凍結乾燥し、次いでこれをジクロロメタン(2mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸(0.2mL)を加え、25℃で0.5時間撹拌し、分取HPLCで精製し、そして、集めた画分を凍結乾燥して、標記化合物16mgを得た。 ESI-MS(m/z):853.6[M/2+H]+。
クロマトグラフィーカラム:Waters SunFire Prep C18 ODS 5μm 19×50mm 移動相A:アセトニトリル;移動相B:水(0.05%トリフルオロ酢酸)
[実施例5](4-((S)-2-((S)-3-メチル-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)ヘキサ-5-インアミド)メチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)ブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)(2-((S)-4-エチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-11-イル)N-エチル-N-イソプロピルカルバメートトリフルオロアセテート(TL003)の合成
工程1:(S)-2-アミノ-N-((S)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパ-2-イル)-3-メチルブチルアミドの合成 室温で、((9H-フルオレン-9-イル)メチル)(((S)-1-((S)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパ-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタ-2-イル)カルバメート(2.00g、3.88mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(12mL)に溶解し、ピペリジン(3mL)を加え、得られた混合物を25℃で2時間反応させた。次いで、反応溶液を、水に注ぎ入れて固体を沈殿させ、固体を濾過し、分取HPLCで精製した。集めた画分を凍結乾燥して、標記化合物810mgを得た。 ESI-MS(m/z):294.0[M+H]+。
クロマトグラフィーカラム:Waters SunFire Prep C18 ODS 8μm 45×450mm 移動相A:アセトニトリル;移動相B:水
工程2:tert-ブチル4-(4-((S)-1-((S)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパ-2-イル)アミノ-3-メチル-1-オキソブタ-2-イル)アミノ-4-オキソブチル)ピペリジン-1-カルボキシレートの合成 室温で、(S)-2-アミノ-N-((S)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパ-2-イル)-3-メチルブチルアミド(810mg、2.76mmol)、4-(1-(tert-ブトキシカルボニル)ピペリジン-4-イル)酪酸、および2-エトキシ-1-エトキシカルボ-1,2-ジヒドロキノリンを、ジクロロメタン(8mL)およびメタノール(8mL)に溶解し、45℃で2時間反応させた。反応溶液を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーカラム(溶離液:ジクロロメタン/メタノール=15/1)で精製して、標記化合物1.31gを得た。 ESI-MS(m/z):546.8[M+H]+。
工程3:(S)-N-((S)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパ-2-イル)-3-メチル-2-(4-(ピペリジン-4-イル)ブチリルアミド)ブチルアミドトリフルオロアセテートの合成 室温で、tert-ブチル4-(4-((S)-1-((S)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-1-オキソプロパ-2-イル)アミノ-3-メチル-1-オキソブタ-2-イル)アミノ-4-オキソブチル)ピペリジン-1-ホルメート(1.3g、2.14mmol)を、ジクロロメタン(20mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸(5mL)を加え、25℃で2時間反応させた。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣をアセトニトリル(30mL)に溶解し、炭酸カリウム(1.22g、8.85mmol)を加え、25℃で2時間反応させた。反応混合物を吸引濾過し、濾過ケーキをアセトニトリルで洗浄し、濾液を回収し、減圧下で濃縮して、標記化合物900mgを得た。 ESI-MS(m/z):446.9[M+H]+。
工程4:(S)-2-(4-(1-(26-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)-N-((S)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパ-2-イル)-3-メチルブチルアミドの合成 室温で、(S)-N-((S)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパ-2-イル)-3-メチル-2-(4-(ピペリジン-4-イル)ブチリルアミド)ブチルアミドトリフルオロアセテート(487mg、0.78mmol)および26-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニルp-トルエンスルホネート(619mg、0.94mmol)を、アセトニトリル(20mL)に溶解し、炭酸カリウム(655mg、4.69mmol)を加え、16℃で6時間反応させた。反応溶液を、減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーカラム(溶離液:ジクロロメタン/メタノール=8/1)で精製して、標記化合
物586mgを得た。 ESI-MS(m/z):868.5[M+H]+。
物586mgを得た。 ESI-MS(m/z):868.5[M+H]+。
工程5:(4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)-3-メチルブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)(4-ニトロフェニル)カーボネートの合成 室温で、(S)-2-(4-(1-(26-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)-N-((S)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパ-2-イル)-3-メチルブチルアミド(585mg、0.64mmol)を、ジクロロメタン(30mL)に溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(334.31mg、2.56mmol)を加え、続いて、ジ(p-ニトロベンゼン)カーボネート(602.35mg、1.92mmol)のジクロロメタン(30mL)溶液を滴加し、得られた混合物を25℃で6時間反応させた。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣にメチルtert-ブチルエーテルを加え、混合物を濾過して、標記化合物760mgを得た。 ESI-MS(m/z):1033.4[M+H]+。
工程6:(4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)-3-メチルブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)(N-(2-((S)-4-エチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-11-イル)エチル)-N-イソプロピル)カルバメートの合成 室温で、(4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)-3-メチルブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)(4-ニトロフェニル)カーボネート(150mg、0.12mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(3mL)に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(34.03mg、0.25mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(48.82mg、0.37mmol)を加え、続いて、(S)-4-エチル-4-ヒドロキシ-11-(2-(イソプロピルアミノ)エチル)-1,12-ジヒドロ-14H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-3,14(4H)-ジオン塩酸塩(59.79mg、0.12mmol)を加え、反応溶液を室温で一晩撹拌し、次いで、分取HPLCで精製し、集めた画分を凍結乾燥して、標記化合物64mgを得た。 ESI-MS(m/z):1327.6[M+H]+。
工程7:(4-((S)-2-((S)-3-メチル-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)ヘキサ-5-インアミド)メチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)ブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)(2-((S)-4-エチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-11-イル)N-エチル-N-イソプロピルカルバメートトリフルオロアセテートの合成 室温で、(4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサニル)ピペリジン-4-イル)ブチルアミド)-3-メチルブチルアミド)プロピオンアミド)ベンジル)(N-(2-((S)-4-エチル-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドジノ[1,2-b]キノリン-11-イル)エチル)-N-イソプロピル)カルバメート(64mg、0.046mmol)および6-(2-(メチルスルホニル)ピリミジン-5-イル)-N-(プロパ-2-イニル)ヘキサミド(21.63mg、0.069mmol)を、ジメチルスルホキシド(4mL)および水(1mL)に溶解し、臭化第一銅(13.27mg、0.092mmol)を加え、得られた混合物を、25℃で1時間反応させた。反応溶液を分取HPLCで精製し、集めた画分を凍結乾燥して、標記化合物35mgを得た。ESI-MS(m/z):1632.8[M+H]+。
クロマトグラフィーカラム:Waters SunFire Prep C18 OBD 5μm 19×150mm 移動相A:アセトニトリル; 移動相B:水(0.05%トリフルオロ酢酸)
[実施例6]ヒトクローディン18.2を標的とするモノクローナル抗体の調製 本発明におけるヒトクローディン18.2を標的とするモノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であり、2C6.9-hz11および2C6.9-hz21を含み、それらのCDR、可変領域配列、および定常領域配列を表1に示す。
6.1 ヒトクローディン18.2およびヒトクローディン18.1過剰発現細胞株の構築および同定6.1.1 ヒトクローディン18.2およびヒトクローディン18.1過剰発現細胞株の構築 抗ヒトクローディン18.2抗体の特異性および機能を測定するために、ヒトクローディン18.2(遺伝子受託番号:NM_001002026.2、Nanjing Genscript Biotech Corporationにより合成)およびヒトクローディン18.1(遺伝子受託番号:NM_016369.3、Nanjing Genscript Biotech Corporationにより合成)の完全なコード配列をレンチウイルスベクターpLVX-IRES-puroにクローニングし、公開された方法(Mohammadi Zら、Mol Biotechnol.2015年9月;57(9):793-800)に従ってレンチウイルスパッケージングシステムによってウイルスを調製した。得られたウイルスを使用して、HEK293T、L929、KATOIII、およびNCI-N87細胞を感染させた。HEK293T-クローディン18.1、HEK293T-クローディン18.2、L929-クローディン18.2、KATOIII-クローディン18.2、およびNCI-N87-クローディン18.2のモノクローナル安定細胞株を、ピューロマイシンスクリーニングおよび単一クローンの選択によって得た。BaF/3細胞(DSMZ、カタログ番号ACC300)を、4D-Nucleofector Xトランスフェクションキット(Lonza、カタログ番号V4XC-3012)を使用して、ヒトクローディン18.2またはヒトクローディン18.1をコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、1.25mg/mLのハイグロマイシン(Thermo Fisher Sci.カタログ番号10687010)の添加によって細胞をスクリーニングした。12日間のスクリーニング後に単一クローンを選択し、それによってモノクローナル細胞株BaF/3-Claud18.1およびBaF/3-Claud18.2を得た。
6.1.2 ヒトクローディン18.2およびヒトクローディン18.1過剰発現細胞株の検出 ウエスタンブロットを使用してHEK293T-クローディン18.1を検出し(検出抗体:Proteintech、66167-1-Ig)、FACSを使用して他の細胞株を検出した(フローサイトメーター:Beckman、CytoFlex;検出抗体:IMAB362、その配列は中国特許出願公告第101312989号からのものである)。図1A~図1Dに示すように、FACSの結果から、HEK293T-クローディン18.2、L929-クローディン18.2、KATOIII-クローディン18.2、およびNCI-N87-クローディン18.2モノクローナル細胞株が高い陽性率(100%に近い)および良好な均一性で得られたことが実証され、以下の実験で使用された。ウエスタンブロットの結果(図1E)から、HEK293T-クローディン18.1の3つの安定な細胞株のすべてがヒトクローディン18.1を過剰発現したことが実証され、ここで、HEK293T-クローディン18.1-1C2の単一クローンは、他のものよりも高い発現レベルを示し、以下の実験で使用された。
6.2 マウス抗ヒトクローディン18.2モノクローナル抗体の調製 DNA/細胞免疫を野生型マウスで実施して、マウス抗ヒトクローディン18.2モノクローナル抗体を作製した。各Balb/cマウスに、ヒトクローディン18.2の完全なコード配列を含むプラスミド100μgを尾静脈を介して注射した。4回目および6回目の免疫後、血清力価をFACSによって測定した。高い血清力価を有するマウスを、融合の3~5日前にBaF/3-クローディン18.2過剰発現細胞株で追加免疫した。マウス脾細胞およびマウス骨髄腫細胞株Sp2/0(ATCC、カタログ番号CRL-1581)のPEG媒介融合を、標準的な融合プロトコルで行い、続いてHAT加圧選択を行った。融合の10~14日後にFACSスクリーニングを行った。
約6000個のハイブリドーマの上清を、フローサイトメトリー(SartoriusからModel iQue Screener Plusとして入手可能)を使用してスクリーニングし、HEK293T-クローディン18.2細胞株に結合した43個の陽性ハイブリドーマを得て、サブクローニングした。HEK293T-クローディン18.2およびHEK293T-クローディン18.1細胞株を使用したFACSによって、ヒトクローディン18.2に特異的に結合したがヒトクローディン18.1には結合しなかった14個のハイブリドーマを選択した。限界希釈およびサブクローン選択によって単一クローンを得た。
ヒト胃がん細胞株NUGC4(日本のJCRB細胞バンクより購入、カタログ番号:JCRB0834)は、クローディン18.2を内因的に発現し、抗体と内因性クローディン18.2との間の結合を評価し、機能アッセイを開発するために広く使用されている。NUGC4細胞を使用して候補クローンを評価し、最終的に7つのサブクローンを選択した。さらなる親和性検出の後、可変領域の増幅およびヒト化のために2C6.9Mを選択した。
候補ハイブリドーマクローンの抗体サブタイプを検出するために、Pierce Rapid Isotyping Kit(Thermo Fisher SCI.カタログ番号26179)を使用して2C6.9Mを同定した。同定結果から、重鎖がIgG1サブタイプであり、軽鎖がカッパサブタイプであることが示された。
ハイブリドーマ細胞を増殖させ、約8000個の細胞を採取し、溶解した。最初のcDNA鎖を、cDNA逆転写キット(Thermo Fisher Sci.カタログ番号18080-200)によって合成した。VHおよびVK(VLカッパ)遺伝子を、プライマーを使用してcDNAからPCRによって増幅した。PCR産物をDNA精製キット(Qiagen、カタログ番号28104)で精製し、TOPOベクター(Thermo Fisher Sci.カタログ番号K457540)にライゲーションした。各ライゲーション反応物から約12個のクローンを採取し、配列決定した。次いで、配列をVec
tor NTI11.5(Thermo Fisher Sci.)およびSequencer5.4.6(Genecodes)によって分析した。得られたマウス抗体2C6.9Mの可変領域配列およびCDR配列を表2に示した。
tor NTI11.5(Thermo Fisher Sci.)およびSequencer5.4.6(Genecodes)によって分析した。得られたマウス抗体2C6.9Mの可変領域配列およびCDR配列を表2に示した。
6.3 2C6.9Mマウス抗体のヒト化 CDR移植法を使用して、マウス抗体2C6.9Mをヒト化した。簡潔に言えば、ヒト化プロセスは以下の工程に含まれた:マウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系抗体のアミノ酸配列とアラインメントして、高い相同性および良好な物理化学的特性を有するヒト生殖細胞系フレームワークを同定した;HLA-DRに対する親和性を測定し、次いで、HLA-DRに対する親和性が低いヒト生殖細胞系フレームワークを選択した;次いで、マウス抗体の6つのCDR領域を、選択された重鎖および軽鎖フレームワークに移植した。
具体的には、マウス抗体2C6.9Mの重鎖および軽鎖CDRを、対応するヒト化の鋳型のフレームワーク(FR)に移植した。2C6.9Mの重鎖および軽鎖のヒト化の鋳型は、それぞれヒト生殖細胞系配列IGHV4-59*01(IMGT参照番号AB019438)およびIGKV4-1*01(IMGT参照番号Z00023)である。
さらに、コンピュータシミュレーションにより、分子ドッキングを行って可変領域およびその周囲のフレームワークのアミノ酸配列を分析し、抗体の空間立体結合形態を決定した。静電気力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、およびエントロピーを計算することによって、マウス抗体のアミノ酸配列においてクローディン18.2と相互作用し得るか、または空間構造を維持し得る重要なアミノ酸残基を同定し、これらのマウスアミノ酸を移植後に維持した。換言すれば、マウス抗体の親和性をヒト化抗体において最大限に保つことができるように、一連の復帰突然変異をヒト化の鋳型のFR領域残基に取り込んだ。
マウス抗体2C6.9Mの可変領域配列を配列番号23および配列番号24に示し、そのCDR配列を配列番号1~配列番号12に示す。親和性に影響を与えることなく異性化の発生を回避するために、2C6.9 CDR-H2のアミノ酸配列を本発明において改変した。改変された配列を配列番号21および配列番号22に示す。最後に、2つのヒト化抗体を構築し、それぞれ2C6.9-hz11および2C6.9-hz21と命名した。各抗体の重鎖定常領域はヒト野生型IgG1重鎖定常領域(配列番号16)であり、そして、抗体の軽鎖定常領域はヒト野生型IgG1κ軽鎖定常領域(配列番号17)である。
各2C6.9抗体の可変領域、定常領域、および重鎖/軽鎖アミノ酸配列を表1に示す。
2C6.9ヒト化抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列のコドン最適化されたcDNAを合成し、プラスミドpcDNA3.4(Nanjing Genscript Biotech Corporationより受託)にライゲーションした。重鎖および軽鎖に対応するpcDNA3.4をExpi293F細胞(Thermo社より購入)に同時にトランスフェクトし、細胞上清をプロテインAアフィニティーカラム(MabSelect SuRe、GE)により精製して、2C6.9ヒト化モノクローナル抗体を得た。
6.4 ヒト化モノクローナル抗体2C6.9の親和性検出 細胞膜上でのヒトクローディン18.2に対する2C6.9-hz21の親和性を、HEK293T-クローディン18.2細胞を用いて検出した。具体的な手順は以下の通りであった:HEK293T-クローディン18.2細胞を剥離し、遠心分離した後、PBSで2回洗浄した。次いで、細胞を1%BSAを含有するPBSに再懸濁し、96ウェルの先端底プレートに、合計20ウェルについて50μlの体積に1ウェルあたり300000個の細胞を播種した。次いで、50μlの2C6.9-hz21およびIMAB362抗体を、別々に1000nMから開始して3倍希釈して、11個の濃度で各ウェルに添加した。ヒトIgGを陰性対照として用いた。反応物をよく混合し、暗所で4℃で1時間インキュベートした後、PBSで3回洗浄し、FITC標識抗ヒトFc二次抗体(Biolegend、409322)を添加し、暗所で4℃で0.5時間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、フローサイトメトリー(Beckman、Cytoflex)で検出を行った。
図2および表3に示すように、HEK293T-クローディン18.2に対する2C6.9-hz21の結合親和性のEC50値は、IMAB362のEC50値よりも低く、また、2C6.9-hz21の最大蛍光値は、IMAB362の最大蛍光値よりも高く、このことは、細胞膜上でのクローディン18.2に対する2C6.9-hz21の親和性がIMAB362の親和性よりも強かったことを示している。
6.5 ヒト化抗体2C6.9の親和性および特異性の測定 ヒトクローディン18.2は、テトラスパニンファミリーに属し、複雑な構造を有する。したがって、クローディン18.2の構造を維持するために細胞ELISAを行った。6.1で構築された安定な細胞株L929-クローディン18.2を検出に使用した。具体的には、L929-クローディン18.2接着細胞を、2mMのEDTA処理によって剥離した。細胞を再懸濁し、2×105/mLに調整し、再懸濁液100μLを96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、プレートをPBSで1回洗浄した。100μL/ウェルの4%ホルムアルデヒドをプレートに添加した。室温で30分間インキュベートした後、ホルムアルデヒドを除去し、続いてPBSで2回洗浄した。次いで、ブロッキング緩衝液(2%BSAを含有するPBS)を100μL/ウェルでプレートに添加し、37℃で2時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去した後、100μL/ウェルの連続希釈抗体(1μMから開始して4倍希釈して、合計11個の濃度)を対応するウェルに添加し、その後37℃で2時間インキュベートした。プレートを250μLのPBSTで5回洗浄し、毎回2分間静置した。PBS(2%BSAを含有)で1:10000に希釈した100μL/ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG二次抗体(HRP-抗ヒトIgG、Jackson ImmunoResearch、109-035-003)をプレートに添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートし、250μLのPBSTで6回洗浄し、ここで、プレートは毎回2分間静置した。100μL/ウェルのTMB溶液(Thermo、34029)を添加した。反応物を37℃で20分間インキュベートし、50μLの2mol/LのH2SO4で停止した。OD450nm吸光度値をプレートリーダー(MD、SpectraMax M2)で得て、結果をGraphpad Prismによるカーブフィッティングに供した。
結果を図3および表4に示し、これらは、ヒト化抗体2C6.9-hz21のヒトクローディン18.2に対する親和性が、IMAB362の親和性よりも有意に高いことを示している。同じ実験において、ヒト化抗体2C6.9-hz11の親和性は、抗体2C6.9-hz21の親和性に近かった(結果は省略した)。
候補抗体の特異性をFACSによって検出した。具体的な手順は以下の通りであった:HEK293T、HEK293T-ヒトクローディン18.1、およびHEK293T-ヒトクローディン18.2細胞を剥離し、次いで遠心分離した。PBSで2回洗浄した後、細胞を1%BSAを含有するPBSに再懸濁した。各細胞株の300000個の細胞に1000nMの最終濃度で候補抗体を添加し、よく混合し、4℃で1時間インキュベートし、光から保護した。次いで、細胞をPBSで3回洗浄し、FITC標識抗ヒトFc二次抗体(BioLegend、409322)を添加し、続いて暗所で4℃で0.5時間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、フローサイトメトリー(Beckman、Cytoflex)で検出を行った。
図4に示すように、2C6.9-hz21は、ヒトクローディン18.2に特異的に結合することができるが、ヒトクローディン18.1には特異的に結合することができない。
6.6 ヒト化抗体2C6.9の補体依存性細胞傷害性(CDC)の測定 2C6.9はIgG1サブタイプに属し、これは古典的補体経路を効果的に活性化し、そして、補体依存性細胞傷害性(CDC)を誘発し得る。本発明者らの研究では、2C6.9のCDC活性を測定するために、補体を多く含むモルモット血清(Zhengzhou Baijiより購入、カタログ番号S0001)を使用した。具体的な手順は以下の通りである:HEK293T-クローディン18.2細胞を採取し、遠心分離した後、細胞密度を調整した。5×104個/ウェルの細胞をプレートに播種し、一晩インキュベートした。20%のモルモット血清を含有するDMEMを翌日調製し、そして、2C6.9およびIMAB362を希釈するために使用した。20μg/mLから開始して、2倍希釈して10個の濃度を調製した。HEK293T-クローディン18.2細胞の元の細胞培養培地を除去し、そして、抗体希釈物を100μL/ウェルで対応するウェルに添加した。10μL/ウェルの溶解緩衝液を陽性対照として提供した。反応物を37℃、5%CO2のインキュベーター内に静置し、そして、3時間インキュベートした。その後、染色のためにCellTiter-Glo Luminescent(CTG、Promegaより購入、品番:G7573)を50μl/ウェルで添加し、続いて30秒間混合し、室温で1分間静置した。次いで、蛍光シグナル値をマイクロプレートリーダー(MD、SpectraMax M2)によって測定し、その結果をカーブフィッティングのためにGraphpad Prismにインポートした。
図5および表6に示すように、2C6.9-hz21のCDC活性は、対照抗体IMAB362のCDC活性よりも強かった。
6.7 ヒト化抗体2C6.9の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)の測定 2C6.9はIgG1サブタイプに属し、比較的強い抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)を有する。NK細胞媒介殺傷アッセイを使用して、2C6.9のADCC活性を測定した。具体的な手順は以下の通りであった:HEK293T-クローディン18.2細胞を採取し、遠心分離した後、細胞密度を調整した。1×104個/ウェルの細胞をプレートに播種し、一晩インキュベートした。翌日、培地を除去した。NK92MI-CD16a細胞(Huabo Biopharm)を遠心分離し、MEMA培地に再懸濁し、そして、1×106/mLに調整し、次いで、50μL/ウェルの細胞を対応するウェルに添加した。2C6.9-hz21およびIMAB362抗体をMEMA培地で希釈した。HEK293T-クローディン18.2細胞について、40μg/mLから開始して5倍希釈して、10個の抗体濃度を試験した。NUGC-4細胞について、2mg/mLから開始して5倍希釈して、11個の抗体濃度を試験した。50μL/ウェルの希釈抗体を対応するウェルに添加し、そして、反応物を、37℃、5%CO2のインキュベーター内に静置し、5.5時間インキュベートした。次いで、溶解緩衝液を陽性対照ウェルに添加し、さ
らに0.5時間インキュベートした。50μL/ウェルの乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)検出剤(DOJINDO LABORATORISE、CK12)をウェルに添加し、490nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(MD、SpectraMax M2)によって10分ごとに得た。結果をカーブフィッティングのためにGraphpad Prismにインポートした。
らに0.5時間インキュベートした。50μL/ウェルの乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)検出剤(DOJINDO LABORATORISE、CK12)をウェルに添加し、490nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(MD、SpectraMax M2)によって10分ごとに得た。結果をカーブフィッティングのためにGraphpad Prismにインポートした。
図6および表7に示すように、HEK293T-クローディン18.2に対する2C6.9-hz21のADCC活性は、IMAB362の活性よりも強い。
[実施例7]クローディン18.2を標的とするADC(2C6.9-ADC)の調製 2C6.9-TL001は、実施例3で得られたTL001をヒト化モノクローナル抗体2C6.9とコンジュゲートすることによって調製される。調製方法は以下の通りである。
(1)コンジュゲーション:30mgの2C6.9-hz21抗体に20mM PB+105mM NaCl+100mM エデト酸二ナトリウム溶液(pH7.7)を加え、2M Tris溶液でpHを7.7に調整し、混合物を20mM PB+105mM NaCl pH7.7溶液で希釈し(エデト酸二ナトリウムの最終濃度は5mMであり、抗体の最終濃度は15mg/mLであった)、均一に混合し、10mM TCEP溶液を加えてよく混合し、得られた混合物を室温でしばらく(30または90分間)静置した;その後、ジメチルスルホキシド(抗体に対するモル比:5:1または9:1)に溶解したTL001を添加し、よく混合し、室温で2時間静置して複合体試料を得て、これを2C6.9-TL001と命名した。
(2)緩衝液置換:30KDaの50ml限外濾過チューブ(Millipore)を、2C6.9-TL001の緩衝液交換に使用し、置換溶液は、10mMヒスチジン-塩酸ヒスチジン+8%スクロース(pH6.0)緩衝液であり、置換倍数は15であった。試料を回収し、10% Tween-20を添加し、ここで、試料中のTween-20の最終濃度は0.02%(M/V)であった。
(3)試験: 置換後、以下の条件で2C6.9-TL001をLC-MS分子量分析に供した。 クロマトグラフィー測定条件: 液体クロマトグラフィーカラム:Thermo MAbPac RP 3.0*100mm; 移動相A:0.1% FA/98% H2O/2% ACN; 移動相B:0.1% FA/2% H2O/98% ACN; 流速:0.25mL/分; 試料室温度:8℃;カラム温度:60℃;試料サイズ:1μL;
切換弁:0~3分 排液、3~22分 MS、22~30分 排液 質量分析条件: 質量スペクトルモデル:AB Sciex Triple TOF 5600+; パラメータ:GS1 35;GS2 35;CUR 30;TEM 350;ISVF 5500;DP 200;CE 10;m/z 600~4000;Time bins to sum値40。
TL001と2C6.9-hz21とのコンジュゲーションによって得られた2C6.9-TL001の軽鎖および重鎖の理論分子量および測定分子量(重鎖は主要グリコフォームG0Fによって計算される)を、以下の表に示す。
TL001と2C6.9-hz21との間のコンジュゲーションの供給比が5:1である場合、抗体2C6.9-TL001の軽鎖(LC)は、0~1つの毒素とコンジュゲートされ(LCおよびDAR1の割合はそれぞれ57.8%および42.2%である)、そして、重鎖(HC)は、0~4つの毒素とコンジュゲートされる(HC、DAR1、DAR2、DAR3、およびDAR4の割合はそれぞれ22.5%、30.3%、25.0%、21.9%、および0.3%である)。したがって、毒素抗体比(DAR)は3.79であり、計算式は、DAR=軽鎖DAR1*2+重鎖(DAR1*1+DAR2*2+DAR3*3+DAR4*4)*2である。
TL001と2C6.9-hz21との間のコンジュゲーションの供給比が9:1である場合、2C6.9-TL001の抗体軽鎖(LC)は、0~1つの毒素とコンジュゲートされ(LCおよびDAR1の割合はそれぞれ7.5%および92.5%である)、そして、重鎖(HC)は、0~4つの毒素とコンジュゲートされる(HC、DAR1、DAR2、DAR3、およびDAR4の割合はそれぞれ2.5%、10.2%、9.8%、76.4%、および1.1%である)。したがって、毒素抗体比(DAR)は、7.12である。
TL001と2C6.9-hz21との間のコンジュゲーションの供給比が9:1である場合、コンジュゲーションおよびカチオンクロマトグラフィーの後、2C6.9-TL001の軽鎖は、0~1つの毒素とコンジュゲートされ(LCおよびDAR1の比率はそれぞれ1.5%および24.0%であった)、そして、重鎖は、0~4つの毒素とコンジュゲートされる(HC、DAR1、DAR2、DAR3、およびDAR4の比率はそれぞれ0.7%、2.1%、14.3%、54.5%、および2.8%であった)。得られた薬物抗体比(DAR)は、7.40と算出された。
複合体をSEC-HPLCによるSEC検出に供した。 クロマトグラフィー条件: 液体クロマトグラフィーカラム:TSKgel G3000SWxl、300*7.8mm、5μm; 移動相:90mmol/LのNa2HPO4、30mmol/LのNaH2PO4、200mMのNaCl、5%アセトニトリル; 流速:0.8mL/分;検出波長:280nm;カラム温度:室温;試料室温度:8℃; 試料サイズ:40μL;アイソクラティック操作:30分。
2C6.9-TL001(DAR:3.79)および2C6.9-TL001(DAR:7.12)のSECクロマトグラムを図7~図8に示し、2C6.9-TL001(DAR:7.40)のSECクロマトグラムを図13に示す。SECの保持時間およびピーク面積比によると、主要なコンジュゲート生成物の分子量は約150kdであり、すなわち、TL001と2C6.9-hz21とのコンジュゲーションによって得られた2C6.9-TL001が、依然として抗体の全体構造を維持していることが確認される。
同じ調製方法を用いて、実施例4および5で調製したTL002およびTL003をヒト化モノクローナル抗体2C6.9とコンジュゲートして、2C6.9-TL002および2C6.9-TL003を調製した。調製および検出方法は上記の通りである。得られた2C6.9-TL002および2C6.9-TL003のDAR値は、それぞれ6.95および7.03である。
[実施例8]2C6.9-TL001の親和性の測定 細胞ベースのELISA法を実施して、細胞膜の表面上でのクローディン18.2に対する2C6.9-TL001(DAR:7.12)の親和性を測定した。具体的な手順は以下の通りであった:L929-クローディン18.2接着細胞株を2mMのEDTAによって剥離し、2×105細胞/mLまで再懸濁し、再懸濁液100μLを96ウェルプレートに入れ、37℃で一晩インキュベートした;翌日、培地を除去し、プレートをPBSで1回洗浄した。100μL/ウェルの4%ホルムアルデヒドを、室温で30分間プレートに添加した;次いで、ホルムアルデヒドを除去した後、PBSで2回洗浄し、100μLのPBS(2%BSAを含有)を添加し、2時間インキュベートした;ブロッキング溶液を除去し、試験する2C6.9-TL001を、PBS(2%BSAを含有)で9.375μg/mLから開始して4倍希釈して、合計9個の濃度に希釈し、次いで100μL/ウェルでプレートに添加し、37℃で2時間インキュベートした;プレートを250μLのPBSTで5回洗浄し、毎回2分間静置した;PBS(2%BSA)を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗ヒトIgG二次抗体(HRP-抗ヒトIgG、Jackson immunoresearch)を1:10000の比で希釈し、希釈物を100μL/ウェルでプレートに添加し、37℃で1時間インキュベートした;250μLのPBSTで6回洗浄した後、細胞を毎回2分間静置した;100μLのTMB発色性溶液(Thermo)を対応するウェルに添加して、37℃で20分間発色させた;50μLの2mol/LのH2SO4を添加して終了させ、OD450nmの吸光度値をマイクロプレートリーダー(MD)によって得て、その値をカーブフィッティングのためにGraphpad Prismにインポートした。実験結果を図9に示し、細胞膜表面上でのクローディン18.2に対する2C6.9-TL001(DAR:7.12)の親和性のEC50値は39.94ng/mLであった。抗体2C6.9-hz21は、TL001とコンジュゲートした後、依然として優れたクローディン18.2親和性を有する。
[実施例9]クローディン18.2高発現腫瘍細胞株に対する2C6.9-ADCの殺傷活性の検出 クローディン18.2高発現細胞株に対する2C6.9-TL001の殺傷活性を、HEK293T-クローディン18.2およびHEK293T-クローディン18.1細胞を使用して検出した。具体的な実験工程は以下の通りであった:実験の前日、細胞をDMEM+10%FBSで希釈し、懸濁液を100μL/ウェルで1×104細胞/ウェルでプレートに入れて一晩静置した;翌日、ADC分子を、150μg/mL(DAR:7.12)または262.5μg/mL(DAR:3.79)から開始してDMEM塩基性培地で4倍希釈して合計11個の濃度とし、最終血清濃度が5%になるまで、希釈物を1ウェルあたり100μLで対応するウェルに添加した;細胞を、5%CO2インキュベーター内で37℃で48時間インキュベートした;次いで、CCK8(Rhinogen)を添加し(20μL/ウェル)、細胞を、5%CO2インキュベーター内に37℃で0.5~2.5時間入れ、OD450nm吸光度値をマイクロプレートリーダー(MD)によって30分ごとに得て、そして、値をカーブフィッティングのためにGraphpad Prismにインポートした。
図10A、図10B、および図10Cに示すように、2C6.9-TL001は、HEK293T-クローディン18.2細胞を効果的に殺傷することができる。DAR値が7.12の場合、そのEC50値は473ng/mLであり;DAR値が3.79の場合、そのEC50値は794.1ng/mLである。一方、HEK293T-クローディン18を殺傷するための2C6.9-TL001(DAR:7.12)のEC50は39
00ng/mLであり、そして、クローディン18.2細胞に対する2C6.9-TL001(DAR:7.12)の殺傷活性は、クローディン18.1細胞の場合の殺傷活性よりも有意に強く(約8倍差)、このことは、2C6.9-TL001の殺傷効果がクローディン18.2に特異的であることを示している。
00ng/mLであり、そして、クローディン18.2細胞に対する2C6.9-TL001(DAR:7.12)の殺傷活性は、クローディン18.1細胞の場合の殺傷活性よりも有意に強く(約8倍差)、このことは、2C6.9-TL001の殺傷効果がクローディン18.2に特異的であることを示している。
HEK293T-クローディン18.2およびHEK293T-クローディン18.1細胞に対する2C6.9-TL002および2C6.9-TL003の殺傷活性を、上記と同じ実験方法によって検出した。図10Dおよび図10Eの実験結果は、2C6.9-TL002および2C6.9-TL003がHEK293T-クローディン18.2細胞を効果的に殺傷することができ、EC50値がそれぞれ628.9ng/mLおよび540.2ng/mLであったこと;そして、HEK293T-クローディン18.1を殺傷するための2C6.9-TL002および2C6.9-TL003のEC50値が、それぞれ30590ng/mLおよび8258ng/mLであったことを示している。HEK293T-クローディン18.2細胞に対する2C6.9-TL002および2C6.9-TL003の殺傷活性は、クローディン18.1に対する殺傷活性よりも有意に強く、このことは、殺傷効果がクローディン18.2特異的であることを示している。
[実施例10]内因的に発現されたクローディン18.2細胞株に対する2C6.9-ADCの殺傷活性の検出 胃がん細胞株NUGC-4を選択して、内因的に発現されたクローディン18.2細胞に対する2C6.9-TL001の殺傷活性を検出した。具体的な実験工程は以下の通りであった:実験の前日、細胞をRPMI 1640+10% FBSで希釈し、懸濁液を100μL/ウェルで1×104細胞/ウェルでプレートに入れて一晩静置した;翌日、2C6.9-TL001を、1000μg/mL(DAR 7.12)または1750μg/mL(DAR:3.79)から開始してRPMI 1640培地で3倍希釈して合計11個の濃度とし、希釈物を1ウェルあたり100μLで対応するウェルに添加し、最終血清濃度は5%に達した;細胞を、5%CO2インキュベーター内で37℃で72時間インキュベートした;次いで、CCK8(Rhinogen)を20μL/ウェルで添加し、細胞を5%CO2インキュベーター内で37℃で0.5~2.5時間インキュベートし、OD450nm吸光度値をマイクロプレートリーダー(MD)によって30分ごとに得て、値をカーブフィッティングのためにGraphpad Prismにインポートした。実験結果を図11Aおよび図11Bに示し;2C6.9-TL001は、NUGC-4細胞を効果的に殺傷することができる;DAR値が7.12である場合、そのEC50値は2.383μg/mLであり;DAR値が3.79である場合、そのEC50値は10.01μg/mLである。
NUGC-4細胞に対する2C6.9-TL002および2C6.9-TL003の殺傷活性を、上記の方法と同様の実験方法によって検出した。ADCの初期濃度は500μg/mLであり、4倍希釈して、合計11個の濃度である。図11Cに示すように、2C6.9-TL002および2C6.9-TL003は、NUGC-4細胞を効果的に殺傷することができ、そして、EC50値は、それぞれ54.92μg/mLおよび123.94μg/mLである。
[実施例11]2C6.9-hz21抗体内在化の検出 NUGC-4を選択して、抗体2C6.9の内在化活性を検出した。具体的な実験工程は以下の通りであった:NUGC-4細胞をトリプシンで消化し、計数し、PBS(1%BSAを含有)に再懸濁し、細胞密度を3×106/mLに調整した;100μg/mLの最終濃度で2C6.9-hz21抗体を再懸濁した細胞100μLに添加し、アイソタイプのヒトIgGを陰性対照として設定し、氷上で1時間インキュベートした;インキュベーション後、細胞を予冷PBSで3回洗浄し、NUGC-4細胞培養培地(1640+10% FBS)に再懸濁し、2つの部分に分けた:一方の部分を細胞インキュベーター内で37℃で4時間インキュベートし(エンドサイトーシス群)、他方の部分を、氷上で4時間インキュベートした(親和性群);インキュベーション後、細胞を予冷PBSで3回洗浄し、50μLのPBS(1%BSAを含有)に再懸濁し、抗ヒト蛍光二次抗体(Biolegend)を添加し、4℃で30分間インキュベートした;インキュベーション後、細胞を予冷PBSで3回洗浄し、フローサイトメトリー(Beckman)によって検出を行い、抗体内在化比を以下の式に従って計算した:エンドサイトーシス(%)=[1-(MFI37℃抗体群-MFI37℃対照群)/(MFI氷上の抗体群-MFI氷上の対照群)]×100%。この実験結果は、NUGC-4細胞に対する2C6.9-hz21の4時間の内在化比が37.79%であったことを示し、このことは、2C6.9-hz21複合体が、細胞内に薬物を内在化し、腫瘍細胞を殺傷する可能性を有することを示している。
[実施例12]2C6.9-ADCのインビボ有効性の検出 がん細胞株由来異種移植片(CDX)モデルおよび患者由来異種移植片(PDX)モデルを使用して、ADC分子の抗腫瘍効果を評価する。12.1 NCI-N87-クローディン18.2+Balb/cヌードマウスCDXモデル NCI-N87-クローディン18.2細胞を、10%ウシ胎児血清を含有するRPMI 1640培地中、37℃、5%CO2で培養した。対数増殖期の細胞を回収し、PBSに再懸濁し、その後、雌Balb/cヌードマウス(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd.)に5×106細胞/マウスの量(0.1mLのPBSに懸濁)で皮下接種し、皮下移植腫瘍モデルを確立した。平均腫瘍体積が70~100mm3に達したとき、マウスを、腫瘍体積によって無作為に群分けした(7匹のマウス/群)。群分けの日を0日目として記録し、そして、群を、ヒトIgG1アイソタイプ対照抗体(陰性対照)群(略してIgG1)、2C6.9-TL001(DAR:7.12)1mg/kg群および3mg/kg群、ならびに2C6.9-TL002(DAR:6.95)1mg/kg群および3mg/kg群とした。すべての試料を週に2回、合計6回、尾静脈を介して注射した。
投与後、腫瘍径を週2回ノギスで測定し、腫瘍体積を以下の式に従って計算した:V=0.5a×b2(式中、aは腫瘍の長径、bは腫瘍の短径を示す)。死亡を観察し、毎日記録した。
下記式により腫瘍増殖阻害率TGI(%)を算出し、抗腫瘍効果を評価した。 TGI(%)=[1-(VTend-VTstart)/(VCend-VCstart)]*100% ここで、 VTend:治療群における実験終了時の平均腫瘍体積 VTstart:治療群における投与開始時の平均腫瘍体積 VCend:陰性対照群における実験終了時の平均腫瘍体積 VCstart:陰性対照群における投与開始時の平均腫瘍体積、である。
下記式により相対腫瘍増殖率T/C(%)を算出し、抗腫瘍効果を評価した。 T/C(%)(腫瘍体積)=(Tt/T0)/(Ct/C0)×100% ここで、 T0:初期(すなわち、P0)の治療群の平均腫瘍体積 Tt:各測定時の治療群の平均腫瘍体積 C0:初期(すなわち、P0)の陰性対照群の平均腫瘍体積 Ct:各測定時の陰性対照群の平均腫瘍体積、である。
実験結果を表8ならびに図12Aおよび図12Bに示し、2C6.9-TL001(DAR:7.12)は、NCI-N87-クローディン18.2胃がん移植腫瘍モデルの腫瘍増殖に対して用量依存的に有意な阻害効果を示した。陰性対照群と比較して、6回投与後(21日目)、2C6.9-TL001 1mg/kg群の腫瘍阻害率(TGI)は最大96.03%であり、そして、4匹のマウスが部分的な腫瘍退縮を示していた;一方、3mg/kg群では、TGIは133.50%に達し、そして、3匹のマウスが部分的な腫瘍退縮を示し、4匹のマウスが完全な腫瘍退縮を示した。2C6.9-TL002 3mg/kg群のTGIは40.11%であり、そして、1mg/kg群では明らかな抗腫瘍効果はなかった。観察期間中、すべての治療群で有意な体重減少は見られず、動物に対する忍容性は高かった。
12.2 CDXモデルにおける2C6.9-TL001および2C6.9モノクローナル抗体+化学療法のインビボ有効性の比較 NCI-N87-クローディン18.2皮下移植腫瘍モデルを実施例12.1に従って確立し、群分けした。群分けした日を0日目として記録した。各群は、それぞれヒトIgG1アイソタイプ対照抗体(陰性対照)群(略してIgG1)、パクリタキセル群(アルブミン結合型)、パクリタキセルと組み合わせた2C6.9mAb群、および2C6.9-TL001(DAR:7.12)群であった。すべての試料を、週に2回、合計3週間、尾静脈を介して注射した。投与量を表9に示す。
実験結果を表9および図12Cに示す。陰性対照群と比較して、3つの投与群のすべて、特に2C6.9-TL001(DAR:7.12)群は、11日間の薬物投与後に腫瘍増殖を有意に阻害することができる。2C6.9-TL001(DAR:7.12)群の腫瘍阻害率(TGI)は最大121.68%であり、そして、7匹のマウスのうち6匹が部分的な腫瘍退縮を示す。
21日間の投与の後、陰性対照群と比較して、3つの投与群のすべてが腫瘍増殖を有意に阻害することができ、そして、2C6.9-TL001(DAR:7.12)群が最も有意であった。2C6.9-TL001(DAR:7.12)群の腫瘍阻害率(TGI)は最大125.73%であり、そして、7匹のマウスのうち5匹が完全な腫瘍退縮を示し、2匹のマウスが部分的な腫瘍退縮を示した。実験結果を表10および図12Dに示す。
12.3 CDXモデルにおける異なるDAR値を有する2C6.9-TL001のインビボ有効性の比較 NUGC-4細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)を含有するRPMI 1640培養培地を用いて37℃、5%CO2で培養した。対数増殖期の細胞を回収し、PBSに再懸濁し、そして、雌Balb/cヌードマウス(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd.)に5×106/マウスの細胞体積(0.1mLのPBSに懸濁)で皮下接種し、皮下移植腫瘍モデルを確立した。平均腫瘍体積が約70~100mm3に達しとき、マウスを腫瘍体積によって無作為に群分けした(7匹のマウス/群)。群分けの日を0日目として記録し、群をそれぞれヒトIgG1アイソタイプ対照抗体(陰性対照)群(略してIgG1)、2C6.9-TL001(DAR:3.79)5.25mg/kg群、2C6.9-TL001(DAR:3.79)17.5mg/kg群、2C6.9-TL001(DAR:7.12)3mg/k
g群、および2C6.9-TL001(DAR:7.12)10mg/kg群とした(DAR値が異なるADC薬物を同じ毒素負荷量で設計投与量で投与した)。すべての試料を、週に2回、合計3週間、尾静脈を介して注射した。投与量を表11に示した。
g群、および2C6.9-TL001(DAR:7.12)10mg/kg群とした(DAR値が異なるADC薬物を同じ毒素負荷量で設計投与量で投与した)。すべての試料を、週に2回、合計3週間、尾静脈を介して注射した。投与量を表11に示した。
実験結果を表11ならびに図12Eおよび図12Fに示す。同じ毒素負荷量では、高いDAR値(7.12)を有する2C6.9-TL001の有効性は、21日間の薬物投与後に低いDAR値(3.79)を有する2C6.9-TL001の有効性と基本的に同等である。観察期間中にすべての治療群で有意な体重減少は見られず、動物に対する忍容性は高かった。
12.4 HuPrime(登録商標)胃がんGA0006+Balb/cヌードマウスPDXモデル HuPrime(登録商標)胃がん異種移植モデルGA0006(Crown Bioscience(Taicang)Inc.;57歳の女性患者由来の高発現クローディン18.2胃腫瘍)において、腫瘍担持マウスから腫瘍組織を採取し、それを3×3×3mmの直径の小片に切断し、そして、Balb/cヌードマウスの右前肩甲骨の皮下に接種した。平均腫瘍体積が約150~250mm3となったとき、マウスを腫瘍サイズによって3つの群(7匹のマウス/群)に無作為に分け、群分けの日を0日目として記録した。3つの群:ヒトIgG1ホモタイプ対照抗体(陰性対照)群(IgG1 10mg/kg)、2C6.9-TL001-DAR7.12 3mg/kg群、および10mg/kg群が存在した。すべての試料を週に2回、合計5回、尾静脈に注射した。薬物投与後、マウスの腫瘍体積および体重を観察し、実施例12.1に記載の方法で定期的に測定した。
表12ならびに図12Gおよび図12Hの実験結果は、2C6.9-TL001-DAR7.12が、GA0006胃がんPDXモデルの腫瘍増殖に対して用量依存的に有意な阻害効果を有することを示している。陰性対照群と比較して、3mg/kg群の腫瘍阻害率(TGI)は、5回投与後(17日目)に最大94.72%であり、4匹のマウスの腫瘍は部分的に消失した;10mg/kg群のTGIは124.49%と高く、そして、7匹のマウスの腫瘍はすべて消失し、このことは、2C6.9-TL001が腫瘍増殖を効果的に阻害できることを示している。観察期間中にすべての治療群で有意な体重減少は見られず、動物に対する忍容性は高かった。
実験結果を表13ならびに図12Iおよび図12Jに示す。投与後24日目に、2C6.9-TL001-DAR7.12は、GA0006胃がんのPDXモデルにおいて腫瘍増殖の有意かつ用量依存的な阻害を示した。陰性対照群と比較して、3mg/kg群の腫瘍阻害率(TGI)は最大103.76%であり、そして、6匹のマウスの腫瘍は部分的に退縮した。10mg/kg群のTGIは113.70%に達し、そして、7匹のマウスの腫瘍はすべて退縮した;このことは、2C6.9-TL001が腫瘍増殖を効率的に阻害できることを示している。観察期間中にすべての治療群で有意な体重減少は見られず、動物に対する忍容性は高かった。
12.5 Balb/cヌードマウスCDXモデルにおけるNCI-N87-クローディン18.2に対するインビボ有効性の評価 NCI-N87-クローディン18.2皮下移植腫瘍モデルを、実施例12.1の方法に従って確立した。平均腫瘍体積が約140mm3に達したとき、マウスを腫瘍体積によって無作為に群分けした(8匹のマウス/群)。群分けの日を0日目として記録し、各群をそれぞれヒトIgG1アイソタイプ対照抗体(陰性対照)群(略してIgG1)、2C6.9-TL001(DAR:7.40)0.3mg/kg群、1mg/kg群、および3mg/kg群とした。すべての試料を、週に2回、合計6回、尾静脈に注射し、投与量を表14に示した。
結果を表14ならびに図12Kおよび図12Lに示す。観察を休薬後31日目まで延長すると、陰性対照群と比較して、2C6.9-TL001 0.3mg/kg群の腫瘍阻害率(TGI)は34.04%であったが、1mg/kg群および3mg/kg群のTGIはそれぞれ最大122.57%(腫瘍の部分的退縮がすべてのマウスで観察された)、および、184.22%(腫瘍の完全退縮が4匹のマウスで観察され、腫瘍の部分的退縮が4匹のマウスで観察された)であった。観察期間中にすべての治療群で有意な体重減少は見られず、動物に対する忍容性は高かった。
12.6 Balb/cヌードマウスCDXモデルにおけるHEK293T-クローディン18.2に対するインビボ有効性の評価 HEK293T-クローディン18.2細胞(ヒト胎児腎臓細胞)を、3μg/mLのピューロマイシンおよび10%ウシ胎児血清(FBS)を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2で培養した。対数増殖期の細胞を回収し、PBSに再懸濁し、そして、雌Balb/cヌードマウス(Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd.)に1×107/マウスの細胞体積(0.1mLのPBSに懸濁)で皮下接種し、皮下移植腫瘍モデルを確立した。平均腫瘍体積が約120~140mm3に達したとき、マウスを腫瘍体積によって無作為に群分けした(8匹のマウス/群)。群分けの日を0日目として記録し、そして、各群をそれぞれヒトIgG1アイソタイプ対照抗体(陰性対照)群(IgG1と呼ぶ)、2C6.9-TL001(DAR:7.40)0.3mg/kg群、1mg/kg群、および3mg/kg群とした。すべての試料を、週に2回、合計6回、尾静脈に注射し、投与量を表15に示した。
結果を表15ならびに図12Mおよび図12Nに示す。陰性対照群と比較して、2C6.9-TL001(DAR:7.40)は、HEK293T-クローディン18.2ヒト胎児腎臓細胞移植腫瘍モデルにおいて、6回の投与後(初回投与後21日目)に腫瘍増殖の有意かつ用量依存的な阻害を示した。2C6.9-TL001 0.3mg/kg群の腫瘍阻害率(TGI)は70.99%(完全な腫瘍退縮が1匹のマウスで観察された)であったが、一方、1mg/kg群および3mg/kg群のTGIはそれぞれ94.98%(部分的な腫瘍退縮が2匹のマウスで観察された)、および、182.81%(部分的な腫瘍退縮が2匹のマウスで観察され、完全な腫瘍退縮が6匹のマウスで観察された)であった。
12.7 Balb/cヌードマウスCDXモデルにおけるNUGC-4に対するインビボ有効性の評価 NUGC-4細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)を含有するRPMI 1640培地を用いて37℃、5%CO2で培養した。対数増殖期の細胞を回収し、PBSに再懸濁し、そして、雌Balb/cヌードマウス(Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd.)に5×106/マウスの細胞体積(0.1mLのPBSに懸濁)で皮下接種し、皮下移植腫瘍モデルを確立した。平均腫瘍体積が約80mm3に達したとき、マウスを腫瘍体積によって無作為に群分けした(8匹のマウス/群)。群分けの日を0日目として記録し、各群をそれぞれヒトIgG1アイソタイプ対照抗体(陰性対照)群(IgG1と呼ぶ)、2C6.9-TL001(DAR:7.40)3mg/kg群、および10mg/kg群とした。すべての試料を、週に2回、合計6回、尾静脈に注射し、投与量を表16に示した。
結果を表16ならびに図12Oおよび図12Pに示す。陰性対照群と比較して、2C6.9-TL001(DAR:7.40)は、NUGC-4胃がん移植腫瘍モデルにおいて、6回の投与後(初回投与後21日目)に腫瘍増殖の有意かつ用量依存的な阻害を示した。2C6.9-TL001 3mg/kg群は56.62%の腫瘍阻害率(TGI)を示したが、一方、10mg/kg群のTGIは、90.28%であった(2匹のマウスで部分的な腫瘍退縮が観察された)。
結論として、2C6.9-TL001は、CDXモデルまたはPDXモデルのいずれかにおいてクローディン18.2陽性腫瘍の増殖を用量依存的に効果的に阻害することができ、使用するのに安全である。
本発明の実施形態を詳細に説明したが、当業者であれば、すべての開示の教示による助言に従って、詳細に対する修正および変更を行うことができ、これらのすべての変更点が本発明の範囲内に含まれることを理解するであろう。本発明の範囲は、本明細書に添付の特許請求の範囲およびその均等物によって与えられる。
Claims (24)
- その構造が、式(I): (D-L)γ-A 式(I) に示される抗体-薬物複合体(ADC)であって、 式中、Dは、生物活性分子のフラグメントであり;Lは、リンカーであり; γは、1~10の整数であり;好ましくは、γは、1~8の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7または8)であり; Aは、ヒトCLDN18.2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、そして、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、 (1)CDRがIMGTナンバリングシステムに従って定義される、以下のVHならびに/もしくはVL: (1-1)以下の3つのCDRを含むVH:配列番号1の配列を有するCDR-H1、配列番号2もしくは21の配列を有するCDR-H2、および配列番号3の配列を有するCDR-H3;ならびに/もしくは 以下の3つのCDRを含むVL:配列番号4の配列を有するCDR-L1、配列番号5の配列を有するCDR-L2、および配列番号6の配列を有するCDR-L3; もしくは (1-2):(1-1)に記載のVHもしくはVLと比較して、少なくとも1つのCDRが、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ(例えば、1、2もしくは3個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ)である変異を含み、前記変異を含む前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてヒトCLDN18.2に特異的に結合することができる; または (2)CDRがAbMナンバリングシステムに従って定義される、以下のVHならびに/もしくはVL: (2-1):以下の3つのCDRを含むVH:配列番号7の配列を有するCDR-H1、配列番号8もしくは22の配列を有するCDR-H2、および配列番号9の配列を有するCDR-H3;ならびに/もしくは 以下の3つのCDRを含むVL:配列番号10の配列を有するCDR-L1、配列番号11の配列を有するCDR-L2、および配列番号12の配列を有するCDR-L3; もしくは (2-2):(2-1)に記載のVHもしくはVLと比較して、少なくとも1つのCDRが、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ(例えば、1、2もしくは3個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ)である変異を含み、前記変異を含む前記抗体またはその抗原結合フラグ
メントは、依然としてヒトCLDN18.2に特異的に結合することができる;を含み、 好ましくは、前記置換は保存的置換であり; 好ましくは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントのVHならびに/もしくはVLは、ヒトまたはマウス免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)を含む、ADC。 - 前記ADCが、 (1)前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号13もしくは14に記載のVH、および/または配列番号15に記載のVLを含む; (2)(1)に記載のVHと比較して、前記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるVHは、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは100%の同一性を有し、および/もしくは(1)に記載のVLと比較して、前記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるVLが、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは100%の同一性を有する; または (3)(1)に記載のVHと比較して、前記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるVHが、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ(例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ)を有し、および/もしくは(1)に記載のVLと比較して、前記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるVLは、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ(例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ)を有し、好ましくは、前記置換は保存的置換である、である、請求項1に記載のADC。
- 前記抗体が、 (1)ヒト免疫グロブリンのCH(重鎖定常領域)もしくはその変異体であって、ここで、前記変異体は、それが由来する野生型配列と比較して、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加(例えば、最大20個、最大15個、最大10個、もしくは最大5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加)を含む、ヒト免疫グロブリンのCHもしくはその変異体;および/または (2)ヒト免疫グロブリンのCL(軽鎖定常領域)もしくはその変異体であって、ここで、前記変異体は、それが由来する野生型配列と比較して、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加(例えば、最大20個、最大15個、最大10個、もしくは最大5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加)を含む、ヒト免疫グロブリンのCLもしくはその変異体;を含み、 好ましくは、前記CHは、IgG重鎖定常領域、例えばIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4重鎖定常領域であり; 好ましくは、前記抗体は、ヒトIgG1の重鎖定常領域を含み; 好ましくは、前記抗体は、配列番号16に記載のCH、または配列番号16と比較して最大20個のアミノ酸の保存的置換(例えば、最大15個、10個もしくは5個のアミノ酸の保存的置換、例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の保存的置換)を有するその変異体を含み; 好ましくは、前記CLは、軽鎖κの定常領域であり; 好ましくは、前記抗体は、配列番号17に記載のCL、または配列番号17と比較して最大20個のアミノ酸の保存的置換(例えば、最大15個、10個もしくは5個のアミノ酸の保存的置換、例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の保存的置換)を有するその変異体を含み; より好ましくは、前記抗体は、配列番号16に記載のCHおよび/または配列番号17に記載のCLを含む、 請求項1または2に記載のADC。
- 前記抗体が、 (1)配列番号13に記載の配列のVHおよび配列番号16に記載の配列のCHを含む重鎖、ならびに、配列番号15に記載の配列のVLおよび配列番号17に記載の配列のCLを含む軽鎖; または (2)配列番号14に記載の配列のVHおよび配列番号16に記載の配列のCHを含む重鎖、ならびに、配列番号15に記載の配列のVLおよび配列番号17に記載の配列のCLを含む軽鎖;である、請求項1~3のいずれか一項に記載のADC。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、 (1)以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖: (1-1)配列番号18または配列番号19に記載の配列; (1-2)配列番号18または配列番号19に記載の配列と比較して、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加(例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加)を有する配列;または (1-3)配列番号18または配列番号19に記載の配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する配列; および (2)以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖: (2-1)配列番号20に記載の配列; (2-2)配列番号20に記載の配列と比較して、1個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加(例えば、1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加)を有する配列;または (2-3)配列番号20に記載の配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する配列;を含み、 好ましくは、(1-2)および(2-2)に記載の前記置換は保存的置換である、 請求項1~4のいずれか一項に記載のADC。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ScFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fvフラグメント、ジスルフィド結合Fv(dsFv)、ダイアボディ、二重特異性抗体、および多重特異性抗体から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載のADC。
- 式(II): {D-[L1-(L2)m1-(L3)m2-(L4)m3-E]}γ-A 式(II)に示される構造を有し、 式中、 L1は
- 式(III):{D-[(L1’)m4-L1-(L5)m5-(L3)m2-(L4)m3-E]}γ-A 式(III)に示される構造を有し、 式中、 L1’は
は、1位でL1に接続され、2位でL3に接続され; L3は、5~12員芳香族複素環から選択され; L4は
- L3が5~6員芳香族複素環であり、そして、m2が1であり、 好ましくは、L3はトリアゾールであり、そして、m2は1である、請求項7~10のいずれか一項に記載のADC。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが標識を有し、好ましくは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識、例えば、酵素(すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼ)、放射性核種、蛍光色素、発光物質(例えば、化学発光物質)またはビオチンを有する、請求項1~18のいずれか一項に記載のADC。
- 請求項1~19のいずれか一項に記載のADCを含み、前記生物活性分子の前記フラグメントとCLDN18.2に特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合フラグメントとのモル比(DAR値)が、1から10までの小数または整数(例えば、3から8までの小数または整数、例えば、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.79、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、6.95、7.0、7.03、7.1、7.12、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、または8.0)である、組成物。
- 請求項1~19のいずれか一項に記載のADC、または請求項20に記載の組成物と、薬学的に許容される担体および/または賦形剤とを含む医薬組成物。
- 腫瘍の予防および/または治療および/または補助治療のための医薬の調製における、請求項1~19のいずれか一項に記載のADC、請求項20に記載の組成物、または請求項21に記載の医薬組成物の使用であって、 前記医薬は、さらなる抗腫瘍活性成分をさらに含んでいてもよく、好ましくは、前記ADC、前記組成物、または前記医薬組成物は、前記さらなる抗腫瘍活性成分と別々に、同時に、または連続的に投与され、好ましくは、前記さらなる抗腫瘍活性成分は、生物活性ポリペプチドもしくはその活性フラグメント、または化学療法薬であり、より好ましくは、前記生物活性ポリペプチドは、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、およびLAG-3抗体)またはサイトカイン(例えば、インターフェロン、IL-2、IL-15、GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-18、およびIL-21)から選択され;好ましくは、前記化学療法薬は、エピルビシン、オキサリプラチン、カペシタビン、5-フルオロウラシル、ロイコボリン、パクリタキセル、およびアルブミン結合パクリタキセルから選択される1つまたは複数である、使用。
- 前記腫瘍が、固形腫瘍、血液腫瘍、またはがんの転移性、難治性、もしくは再発性病変から選択され、 好ましくは、前記腫瘍またはがんは、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん、すなわちNSCLC)、肝臓がん、胃がん、胃腺がん、胃食道接合部(GEJ)腺がん、頭頸部がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、胚細胞腫瘍、骨がん、皮膚がん、胸腺がん、胆管がん、胆嚢がん、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫(例えば、多発性骨髄腫)、肉腫、神経膠芽腫、および白血病から選択され、 好ましくは、前記腫瘍は、胃がん、胃腺がん、胃食道接合部(GEJ)腺がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、および肺がん(例えば、NSCLC)から選択され、 好ましくは、前記腫瘍は、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部(GEJ)腺がん、例えば、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部(GEJ)腺がんの局所進行切除不能腫瘍または転移性腫瘍であり、 好ましくは、前記腫瘍はCLDN18.2陽性であり、より好ましくは、前記腫瘍はHER2陰性である、 請求項22に記載の使用。
- 被験体において腫瘍を予防および/もしくは治療する、ならびに/または腫瘍進行を遅延させる、ならびに/または腫瘍再発を低減もしくは阻害する方法であって、前記方法は、有効量の請求項1~19のいずれか一項に記載の抗体-薬物複合体(ADC)、請求項20に記載の組成物、または請求項21に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含み、 前記方法は、第2の療法を前記被験体に適用する工程をさらに含んでいてもよく、ここで、前記第2の療法は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法、DNA療法、RNA療法、ナノ療法、ウイルス療法、補助療法、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、前記方法および前記第2の療法は、別々に、組み合わせて、同時に、または連続的に適用され、 好ましくは、前記免疫療法は、生物活性ポリペプチドの投与を含み、より好ましくは、前記生物活性ポリペプチドは、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、およびLAG-3抗体)またはサイトカイン(例えば、インターフェロン、IL-2、IL-15、GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-18、およびIL-21)から選択され、 好ましくは、前記化学療法は、エピルビシン、オキサリプラチン、カペシタビン、5-フルオロウラシル、フォリン酸、パクリタキセル、およびアルブミン結合パクリタキセルから選択される1以上であり、 好ましくは、前記腫瘍は、固形腫瘍、血液腫瘍、およびがんの転移性、難治性、または再発性病変から選択され、 好ましくは、前記腫瘍またはがんは、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肺がん(例えば、NSCLC)、肝臓がん、胃がん、胃腺がん、胃食道接合部(GEJ)腺がん、頭頸部がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、胚細胞腫瘍、骨がん、皮膚がん、胸腺がん、胆管がん、胆嚢がん、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫(例えば、多発性骨髄腫)、肉腫、神経膠芽腫、および白血病から選択され、 好ましくは、前記腫瘍は、胃がん、胃腺がん、胃食道接合部(GEJ)腺がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、肺がん(例えば、NSCLC)から選択され、 好ましくは、前記腫
瘍は、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部(GEJ)腺がん、例えば、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部(GEJ)腺がんの局所進行切除不能腫瘍または転移性腫瘍であり、 好ましくは、前記腫瘍は、CLDN18.2陽性であり、より好ましくは、前記腫瘍はHER2陰性である、 前記方法。
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