KR20230012000A - 항체 약물 컨쥬게이트, 이의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

항체 약물 컨쥬게이트, 이의 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230012000A
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통통 쉬
징이 왕
쳉 왕
뎅니안 리우
치앙 티안
슈아이 송
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Abstract

항-CLDN 18.2 항체-약물 컨쥬게이트, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 항체-약물 컨쥬게이트 및 이의 조성물은 CLDN 18.2에 효과적으로 결합할 수 있고, Claudin 18.2 양성 종양의 성장을 억제할 수 있다. 추가로 항체-약물 컨쥬게이트 또는 조성물을 포함하는 약학 조성물, 및 종양 예방 및/또는 치료용 의약 제조에서의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

항체 약물 컨쥬게이트, 이의 제조 방법 및 이의 용도
본 출원은 2020 년 5 월 15 일의 출원일을 갖는 CN 출원 번호 202010410633.5를 기반으로 하고, 이에 대해 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 그 전체가 본 출원에 도입된다.
발명의 분야
본 발명은 특히 항-Claudin 18.2 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC) 및 ADC를 포함하는 조성물, 및 이의 용도에 관한 생물의학의 기술 분야에 속한다.
위암의 치료는 외과적 절제가 주를 이룬다. 절제불가능한 또는 재발성 위암의 경우, 화학요법이 주요 요법이지만, 최신 기술에서는 증상을 완화시키고, 생존을 연장시킬 수 있을 뿐이다. 현재, 진행성 위암에 대해 보편적으로 인정되는 표준 화학요법 양생법은 없다. 생체고분자 약물의 경우, 승인된 트라스투주맙, 라무시루맙, 펨브롤리주맙 등을 제외하고, 위암에 대한 대부분의 다른 표적화된 약물은 효험이 불만족스럽거나, 여전히 임상 연구의 초기 단계에 있다. 기존 약물의 핵심 약점은 비-수술적 치료의 미충족된 임상 수요, 진행성 또는 재발성 위암에 대한 매우 제한된 치료 옵션, 극히 불량한 예후, 및 높은 사망률을 포함한다. 위암의 높은 발병률로 인해, 현재 위암 약물에 대한 수요가 크다.
Claudin 18.2 (CLDN 18.2)는 Claudin 단백질 패밀리의 구성원이다. Claudin 패밀리 단백질은 세포 사이의 긴밀한 접합을 매개하는 단백질 유형이다. 상이한 Claudin 하위유형은 상이한 조직에서 발현되며, 상이한 유형의 암과 연관된다. 정상 조직에서 Claudin 18.2의 발현은 위 점막 세포에서 제한된다. Claudin 18.2는 원발성 위선암종 및 이의 전이의 70%에서 고도로 발현되며; 다른 암, 예컨대, 췌장암, 식도암, 및 비-소세포 폐암 (NSCLC)에서 또한 발현된다. 종양 조직에서 Claudin 18.2의 고도로 특이적인 발현은 Claudin 18.2를 종양 면역요법을 위한 매우 양호한 표적으로 만든다.
발명의 요약
본 출원의 발명자는 PCT/CN2019/126495에서 Claudin 18.2에 대해 높은 특이성 및 높은 친화도를 갖는 항체를 설명하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 원용되고, 본 출원의 일부가 된다. 대규모의 창조적인 작업을 통해, 본 출원의 발명자는 종양 치료를 위한 안전하고 효과적인 약물 옵션을 제공하는 Claudin 18.2 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 추가로 발명하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 링커를 통해 생체활성 분자에, Claudin 18.2에 특이적으로 결합하는 높은 친화도를 갖는 항체를 컨쥬게이션시켜, Claudin 18.2 표적화 ADC의 클래스 및 ADC를 포함하는 조성물을 수득하였다. ADC 또는 조성물은 Claudin 18.2에 의해 발현되는 일부 종양 세포에 대해 높은 살해 활성을 갖는다. 동물 실험 (인 비보)에서, ADC는 Claudin 18.2 양성 종양, 특히 위암 또는 위선암종의 성장을 효과적으로 억제할 수 있고, 사용하기에 매우 안전하다.
항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)
일 양태에서, 본 발명은 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합하는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 제공하며, 이의 구조는 하기 화학식 (I)로 표시된다:
(D-L)γ-A
화학식 (I)
여기서, D는 생체활성 분자의 단편이고; L은 링커이고;
γ는 1 내지 10의 정수이고; 바람직하게는, γ는 1 내지 8의 정수 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)이고;
A는 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편임.
일부 실시양태에서, 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(1) 다음의 3 개의 중쇄 CDR: 서열번호 13, 14 또는 23에 제시된 VH (중쇄 가변 영역)에 포함된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 및/또는
다음의 3 개의 경쇄 CDR: 서열번호 15 또는 24에 제시된 VL (경쇄 가변 영역)에 포함된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
또는
(2) 다음의 3 개의 중쇄 CDR: (1)에 기재된 CDR-H1 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (1)에 기재된 CDR-H2 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (1)에 기재된 CDR-H3 또는 아미노산 변이를 함유하는 이의 변이체; 및/또는
다음의 3 개의 경쇄 CDR: (1)에 기재된 CDR-L1 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, (1)에 기재된 CDR-L2 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (1)에 기재된 CDR-L3 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체를 포함하며,
여기서 (2)에 기재된 3 개의 중쇄 CDR 및/또는 3 개의 경쇄 CDR 중 하나 이상은 (1)의 상응하는 CDR과 비교하여 아미노산 돌연변이를 함유하고, 아미노산 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예컨대, 1, 2 또는 3 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)이고; 돌연변이를 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 여전히 CLDN 18.2, 바람직하게는 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합할 수 있고; 바람직하게는, 치환은 보존적 치환이다.
일부 실시양태에서, CDR은 IMGT 또는 AbM 넘버링 시스템에 따라 정의된다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 면역글로불린으로부터의 프레임워크 영역 (FR)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
(1-1) IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 다음의 3 개의 중쇄 CDR: 서열번호 1의 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 2 또는 21의 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDR-H3; 및/또는
IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 다음의 3 개의 경쇄 CDR: 서열번호 4의 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 5의 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDR-L3;
또는
(1-2) 다음의 3 개의 중쇄 CDR: (1-1)에 기재된 CDR-H1 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (1-1)에 기재된 CDR-H2 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (1-1)에 기재된 CDR-H3 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체; 및/또는
다음의 3 개의 경쇄 CDR: (1-1)에 기재된 CDR-L1 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (1-1)에 기재된 CDR-L2 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (1-1)에 기재된 CDR-L3 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체;
여기서
3 개의 중쇄 CDR 및/또는 3 개의 경쇄 CDR 중 하나 이상은 (1-1)의 상응하는 CDR과 비교하여 아미노산 돌연변이를 함유하고, 아미노산 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예컨대, 1, 2, 또는 3 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)이고; 돌연변이를 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 여전히 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합할 수 있고; 바람직하게는, 치환은 보존적 치환임;
또는
(2-1) AbM 넘버링 시스템에 의해 정의된 다음의 3 개의 중쇄 CDR: 서열번호 7의 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 8 또는 22의 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 9의 서열을 갖는 CDR-H3; 및/또는
AbM 넘버링 시스템에 의해 정의된 다음의 3 개의 경쇄 CDR: 서열번호 10의 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 11의 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 12의 서열을 갖는 CDR-L3;
또는
(2-2) 다음의 3 개의 중쇄 CDR: (2-1)에 기재된 CDR-H1 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (2-1)에 기재된 CDR-H2 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (2-1)에 기재된 CDR-H3 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체; 및/또는
다음의 3 개의 경쇄 CDR: (2-1)에 기재된 CDR-L1 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (2-1)에 기재된 CDR-L2 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체, 및 (2-1)에 기재된 CDR-L3 또는 아미노산 돌연변이를 함유하는 이의 변이체;
3 개의 중쇄 CDR 및/또는 3 개의 경쇄 CDR 중 하나 이상은 (2-1)의 상응하는 CDR과 비교하여 아미노산 돌연변이를 함유하고, 아미노산 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예컨대, 1, 2, 또는 3 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)이고; 돌연변이를 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 여전히 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합할 수 있고; 바람직하게는, 치환은 보존적 치환임;
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 면역글로불린으로부터의 프레임워크 영역 (FR)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
(1) 다음의 VH 및/또는 VL이되, 여기서 CDR은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의되며,
(1-1): 다음의 3 개의 CDR을 포함하는 VH: 서열번호 1의 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 2 또는 21의 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDR-H3; 및/또는
다음의 3 개의 CDR을 포함하는 VL: 서열번호 4의 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 5의 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDR-L3;
또는
(1-2): (1-1)에 기재된 VH 또는 VL과 비교하여, 하나 이상의 CDR이 돌연변이를 함유하며, 이는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 1, 2 또는 3 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합)이고; 바람직하게는, 치환은 보존적 치환이고; 돌연변이를 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 여전히 CLDN 18.2, 바람직하게는 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합할 수 있는, VH 및/또는 VL
또는
(2) 다음의 VH 및/또는 VL이되, 여기서 CDR은 AbM 넘버링 시스템에 따라 정의되며,
(2-1): 다음의 3 개의 CDR을 포함하는 VH: 서열번호 7의 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 8 또는 22의 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 9의 서열을 갖는 CDR-H3; 및/또는
다음의 3 개의 CDR을 포함하는 VL: 서열번호 10의 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 11의 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 12의 서열을 갖는 CDR-L3;
또는
(2-2): (2-1)에 기재된 VH 또는 VL과 비교하여, 하나 이상의 CDR은 돌연변이를 함유하며, 이는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 1, 2 또는 3 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합)이고; 바람직하게는, 치환은 보존적 치환이고; 돌연변이를 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편은 여전히 CLDN 18.2, 바람직하게는, 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합할 수 있는, VH 및/또는 VL.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 및/또는 VL은 인간 또는 뮤린 면역글로불린으로부터의 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(1) 서열번호 13 또는 14에 제시된 VH; 및/또는 서열번호 15에 제시된 VL;
또는
(2) (1)에 기재된 VH와 비교하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 포함된 VH가 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 갖는 VH; 및/또는 (1)에 기재된 VL과 비교하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 포함된 VL이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 갖는 VL;
또는
(3) (1)에 기재된 VH와 비교하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 포함된 VH가 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합)을 갖는, VH; (1)에 기재된 VL과 비교하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 포함된 VL이 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합)을 갖는 VL을 포함하며; 바람직하게는, 치환은 보존적 치환이다. 돌연변이를 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 여전히 CLDN 18.2, 바람직하게는, 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합할 수 있다.
위의 양태 중 임의의 것에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 포유동물 (예컨대, 뮤린 또는 인간) 면역글로불린 또는 이의 변이체로부터 유래된 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 다음을 포함할 수 있다:
(1) 인간 면역글로불린의 CH (중쇄 불변 영역) 또는 이의 변이체이되, 여기서 변이체가 이것이 유래된 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예를 들어, 최대 20 개, 최대 15 개, 최대 10 개, 또는 최대 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가; 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 포함하는, 인간 면역글로불린의 CH (중쇄 불변 영역) 또는 이의 변이체; 및/또는
(2) 인간 면역글로불린의 CL (경쇄 불변 영역) 또는 이의 변이체이되, 여기서 변이체가 이것이 유래된 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예를 들어, 최대 20 개, 최대 15 개, 최대 10 개, 또는 최대 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가; 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 포함하는, 인간 면역글로불린의 CL (경쇄 불변 영역) 또는 이의 변이체.
일부 실시양태에서, 불변 영역은 항-CLDN18.2 항체의 특성을 변형하기 위해 (예컨대, 다음의 특성 중 하나 이상을 변경하기 위해: Fc 수용체의 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 양, 이펙터 세포 또는 보체에 대한 기능) 변경, 예컨대, 돌연변이된다. 항체의 불변 영역 중 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능을 변경하기 위해 다른 것으로 대체될 수 있다. 예를 들어, 이펙터 기능은 이펙터 리간드 (예컨대, FcR 또는 보체 C1q)에 대한 항체 친화도를 변경함으로써 변경 (예컨대, 향상)될 수 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 보체-의존적 세포독성 (CDC), 및/또는 항체-의존적 세포성 식세포작용 (ADCP)을 변형시키기 위해 변경 (예컨대, 향상)된다.
일부 실시양태에서, CH는 IgG 중쇄 불변 영역, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중쇄 불변 영역이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 16에 제시된 CH, 또는 이의 변이체를 포함하며, 이는 서열번호 16과 비교하여 최대 20 개의 아미노산의 보존적 치환 (예컨대, 최대 15, 10 또는 5 개의 아미노산의 보존적 치환; 예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 보존적 치환)을 갖는다. 돌연변이를 함유하는 CH는 서열번호 16과 실질적으로 동일한 기능을 유지한다.
일부 실시양태에서, CL은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CL은 κ 경쇄 불변 영역 (예컨대, 인간 κ 경쇄)이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 17에 제시된 CL, 또는 이의 변이체를 포함하며, 이는 서열번호 17과 비교하여 최대 20 개의 아미노산의 보존적 치환 (예컨대, 최대 15, 10 또는 5 개의 아미노산의 보존적 치환; 예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 보존적 치환)을 갖는다. 돌연변이를 함유하는 CL은 서열번호 17과 실질적으로 동일한 기능을 유지한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 16에 제시된 CH 및/또는 서열번호 17에 제시된 CL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열번호 13에 제시된 서열의 VH 및 서열번호 16에 제시된 CH를 포함하는 중쇄; 및
서열번호 15에 제시된 서열의 VL 및 서열번호 17에 제시된 CL을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열번호 14에 제시된 서열의 VH 및 서열번호 16에 제시된 CH를 포함하는 중쇄; 및
서열번호 15에 제시된 서열의 VL 및 서열번호 17에 제시된 CL을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
(1) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄:
(1-1) 서열번호 18에 제시된 서열;
(1-2) 서열번호 18에 제시된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는
(1-3) 서열번호 18에 제시된 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 갖는 서열;
및
(2) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄:
(2-1) 서열번호 20에 제시된 서열;
(2-2) 서열번호 20에 제시된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는
(2-3) 서열번호 20에 제시된 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 갖는 서열.
일부 실시양태에서, 위의 (1-2) 및 (2-2)에 기재된 치환은 보존적 치환이다. 돌연변이를 함유하는 CH는 서열번호 16과 실질적으로 동일한 기능을 유지한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
(1) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄:
(1-1) 서열번호 19에 제시된 서열;
(1-2) 서열번호 19에 제시된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는
(1-3) 서열번호 19에 제시된 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 갖는 서열;
및
(2) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄:
(2-1) 서열번호 20에 제시된 서열;
(2-2) 서열번호 20에 제시된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는
(2-3) 서열번호 20에 제시된 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 갖는 서열.
일부 실시양태에서, (1-2) 및 (2-2)에 기재된 치환은 보존적 치환이다. 바람직하게는, 돌연변이 또는 동일성 서열을 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 여전히 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 scFv, Fab, Fab', (Fab')2, Fv 단편, 디설파이드 결합-연결된 Fv (dsFv), 디아바디, 이중특이적 항체, 및 다중특이적 항체로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, (D-L)γ-A의 구조는 하기 화학식 (II)로 표시된다:
{D-[L1-(L2)m1-(L3)m2-(L4)m3-E]}γ-A
화학식 (II)
여기서,
L1은
Figure pct00001
이고, 여기서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소), 할로겐, 카복실산 기, 설폰산 기, 시아노, C1-6 알킬, 할로겐화된 C1-6 알킬, 시아노-치환된 C1-6 알킬 (예컨대, -CH2CN), C1-6 알콕시, C2-10 알케닐 또는 C2-10 알키닐이고; Z1은 아미노산 또는 2-10 개의 아미노산으로 구성된 펩티드이고; x1 및 x2는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; L1은 위치 1에서 D에 연접되고, 위치 2에서 L2에 연접되며;
L2는
Figure pct00002
이고, 여기서 y1은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고; L2는 위치 1에서 L1에 연접되고, 위치 2에서 L3에 연접되며;
L3는 5-12 원 방향족 헤테로사이클로부터 선택되고;
L4는
Figure pct00003
이고, 여기서 Z2는 C1-6 알킬렌, C2-10 알케닐렌, C2-10 알키닐렌 및 C3-8 사이클로알킬렌으로부터 선택되고; R3는 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소) 및 C1-6 알킬로부터 선택되고; Z3는 존재하지 않거나, C1-6 알킬렌으로부터 선택되고; 대안적으로, R3 및 Z3는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 4-8 원 헤테로사이클릴을 형성하고; α는 0,1,2,3,4,5 또는 6이고, L4는 위치 2에서 E에 연접되고, 위치 1에서 L3에 연접되며;
E는
Figure pct00004
이고, 여기서 각각의 R4는 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소)이고, β는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고, E는 위치 2에서 A에 연접되고, 위치 1에서 L4에 연접되며;
m1, m2 및 m3는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
A, D 및 γ는 위에 정의된 바와 같음.
일부 실시양태에서, (D-L)γ-A의 구조는 하기 화학식 (III)에 나타낸 바와 같다:
{D-[(L1')m4-L1-(L5)m5-(L3)m2-(L4)m3-E]}γ-A
화학식 (III)
여기서,
L1'은
Figure pct00005
이고, 여기서 R5 및 R6는 각각 독립적으로 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소) 또는 C1-6 알킬이고; x3는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; L1'가 존재하는 경우, 위치 1에서 D와 연접하고, 위치 2에서 L1과 연접하며;
L1은
Figure pct00006
이고, 여기서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소), 할로겐, 카복실산 기, 설폰산 기, 시아노, C1-6 알킬, 할로겐화된 C1-6 알킬, 시아노-치환된 C1-6 알킬 (예컨대, -CH2CN), C1-6 알콕시, C2-10 알케닐 또는 C2-10 알키닐이고; Z1은 아미노산 또는 2-10 개의 아미노산으로 구성된 펩티드이고; x1 및 x2는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; L1은 위치 1에서 (L1'가 존재할 때) L1' 또는 위치 1에서 (L1'가 존재하지 않을 때) D에 연접되고; L1은 위치 2에서 L5에 연접되며;
L5는
Figure pct00007
이고, 여기서 R7은 수소 또는 C1-6 알킬이거나, R7은 이의 γ-C 상의 N 원자에 연접되어, 5-6 원 헤테로사이클릴을 형성하고; x4는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; y1은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고; L5는 위치 1에서 L1에 연접되고, 위치 2에서 L3에 연접되며;
L3는 5-12 원 방향족 헤테로사이클로부터 선택되고;
L4는
Figure pct00008
이고, 여기서 Z2는 C1-6 알킬렌, C2-10 알케닐렌, C2-10 알키닐렌 및 C3-8 사이클로알킬렌으로부터 선택되고; R3는 수소 (예컨대, 프로튬 및 중수소) 및 C1-6 알킬로부터 선택되고; Z3는 존재하지 않거나, C1-6 알킬렌으로부터 선택되거나; 또는, R3 및 Z3는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 4-8 원 헤테로사이클릭 라디칼을 형성하고; α는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; L4는 위치 2에서 E에 연접되고, 위치 1에서 L3에 연접되며;
E는
Figure pct00009
이고, 여기서 각각의 R4는 독립적으로 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소)이고, β는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며, E는 위치 2에서 A에 연접되고, 위치 1에서 L4에 연접되며;
m1, m2, m3 및 m4는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
A, D 및 γ는 위에 정의된 바와 같음.
일부 실시양태에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)으로 표시되는 ADC에서 L1은
Figure pct00010
이고, 여기서 Z1은 아미노산 또는 2-5 개의 아미노산으로 구성된 펩티드이고, 아미노산은 Lys, Cit, Val, D-Val, Phe, Leu, Gly, Ala 및 Asn으로부터 선택되며; 바람직하게는, Z1은 Cit, Lys, Cit-Val 및 Ala-Val로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, L1은
Figure pct00011
이다.
일부 실시양태에서, L1은
Figure pct00012
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (II)로 표시되는 ADC에서 L2는
Figure pct00013
이고, m1은 1이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)으로 표시되는 ADC에서 L3는 5-6 원 방향족 헤테로사이클이고, m2는 1이다.
일부 실시양태에서, L3는 트리아졸이고, m2는 1이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)으로 표시되는 ADC에서 L4는
Figure pct00014
이고, 여기서 Z2는 C1-6 알킬렌이고, Z3는 C1-6 알킬렌이고; m3는 1이다.
일부 실시양태에서, L4는
Figure pct00015
이고, m3는 1이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (III)으로 표시되는 ADC에서 L1'은
Figure pct00016
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (III)으로 표시되는 ADC에서 L5는
Figure pct00017
이고, 여기서 x4는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; y1은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (III)으로 표시되는 ADC에서 L5는
Figure pct00018
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I)로 표시되는 항체-약물 컨쥬게이트에서 D는
Figure pct00019
,
Figure pct00020
또는
Figure pct00021
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (II)로 표시되는 항체-약물 컨쥬게이트에서 D는
Figure pct00022
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (III)으로 표시되는 ADC에서 D는
Figure pct00023
또는
Figure pct00024
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (II)로 표시되는 ADC에서 D-[L1-(L2)m1-(L3)m2-(L4)m3-E]-는
Figure pct00025
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (III)으로 표시되는 ADC에서 D-[(L1')m4-L1-(L5)m5-(L3)m2-(L4)m3-E]-는
Figure pct00026
또는
Figure pct00027
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (II)로 표시되는 ADC의 구조는
Figure pct00028
이고, 여기서 γ는 1 내지 10의 정수로부터 선택되고, 예를 들어, γ는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, A는 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합하는 전술한 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (II)로 표시되는 ADC는 다음의 화학식으로 표시되며,
Figure pct00029
여기서, γ는 1 내지 10의 정수이고, 예를 들어, γ는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, A는 2C6.9-hz21이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (III)으로 표시되는 ADC의 구조는 하기와 같으며,
Figure pct00030
여기서, γ는 1 내지 10의 정수로부터 선택되고, 예를 들어, γ는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, A는 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합하는 전술한 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (III)으로 표시되는 ADC는 다음의 화학식으로 표시되며,
Figure pct00031
여기서, γ는 1 내지 10의 정수이고, 예를 들어, γ는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, A는 2C6.9-hz21이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (III)으로 표시되는 ADC의 구조는 하기와 같으며,
Figure pct00032
여기서, γ는 1 내지 10의 정수이고, 예를 들어, γ는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, A는 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합하는 전술한 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (III)으로 표시되는 ADC는 다음의 화학식으로 표시되며,
Figure pct00033
여기서, γ는 1 내지 10의 정수이고, 예를 들어, γ는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, A는 2C6.9-hz21이다.
본 발명은 또한 전술한 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC) 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공하며, 조성물에서 CLDN18.2 (즉, 화학식 (I)의 A)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 생체활성 분자 (화학식 (I)의 D)의 단편의 몰비 (DAR 값)는 1 내지 10의 소수 또는 정수 (예컨대, 1 내지 8의 소수 또는 정수, 예컨대, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.79, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 6.95, 7.0, 7.03, 7.1, 7.12, 7.2, 7.3, 7.40, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0)이다.
DAR 값은 각각의 항체에 부착된 (D-L)의 평균값 갯수를 지칭하는 약물-항체 비율로서 또한 알려져 있으며, 당업계에 알려진 방법에 의해 결정 및 계산될 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이션된 항체의 분자량 및 LC-MS, HIC 등에 의해 결정된 (D-L) 등에 의해, 상이한 갯수의 (D-L)로 컨쥬게이션된 경쇄 및 중쇄의 비율을 계산하고, DAR 값을 식 DAR (경쇄 DAR1*1+…+경쇄 DARn1*n1)*2+(중쇄 DAR1*1+…+DARn2*n2 )*2로 계산하였다. 식에서, DARn1은 경쇄에서 차지하는 n1 (D-L)과 컨쥬게이션된 경쇄의 비율을 의미하고, DARn2는 중쇄에서 차지하는 n2 (D-L)이 컨쥬게이션된 중쇄의 비율을 의미한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 전술한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 2C6.9-TL001을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2C6.9-TL001이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 2C6.9-TL002를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2C6.9-TL002이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 2C6.9-TL003을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2C6.9-TL003이다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 유도체화될 수 있으며, 예를 들어, 다른 분자 (예컨대, 다른 폴리펩티드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유도체화 (예컨대, 표지화)는 CLDN 18.2 (특히 인간 CLDN18.2)에 대한 결합에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 이러한 유도체화된 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
유도체화된 항체 (예컨대, 이중특이적 항체)의 일 유형은 (동일한 유형 또는 상이한 유형의) 2 개 이상의 항체를 가교함으로써 생산된다. 이중특이적 항체를 수득하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이의 예는 화학적 가교, 세포 조작 (하이브리드 하이브리도마) 또는 유전적 조작을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
유도체화된 항체의 다른 유형은 표지된 항체이다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출가능한 표지에 결찰된다. 본 발명의 검출가능한 표지는 형광, 분광, 광화학적, 생화학적, 면역학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 물질일 수 있다. 이러한 표지는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이 예는 효소 (예컨대, 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 우레아제, 글루코스 산화효소 등), 방사성핵종 (예컨대, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 형광 염료 (예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 플루오레세인, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 피코에리트린 (PE), 텍사스 레드, 로다민, 양자점 또는 시아닌 염료 유도체 (예컨대, Cy7, Alexa 750), 아크리디늄 에스테르, 자성 비드 (예컨대, Dynabeads®), 열량계 표지, 예컨대, 콜로이드 금 또는 착색된 유리 또는 플라스틱 (예컨대, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드, 및 위에-기재된 표지 변형된 아비딘 (예컨대, 스트렙타비딘)에 결합하기 위한 비오틴을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 마커의 사용을 교시하는 특허는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호, 및 제4,366,241호 (각각은 참조로 본원에 원용됨)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 위에 기재된 바와 같은 검출가능한 표지는 당업계에 알려진 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 방사성 표지는 사진 필름 또는 섬광 계수기를 사용하여 검출될 수 있고, 형광 표지는 광검출기를 사용하여 검출하여, 방출된 빛을 검출할 수 있다. 효소 표지는 전형적으로 효소에 기질을 제공하고, 기질에 대한 효소의 작용에 의해 생산된 반응 생성물을 검출함으로써 검출되며, 열-표지는 단순히 염색된 표지를 가시화함으로써 검출된다. 특정 실시양태에서, 이러한 마커는 면역학적 검정 (예컨대, 효소-연결된 면역검정, 방사선-면역검정, 형광 면역검정, 화학발광 면역검정 등)에 사용하기 위해 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 위에 기재된 바와 같은 검출가능한 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 링커에 의해 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 연결될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)에 포함된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전술한 유도체화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 하나 이상이다.
치료적 방법 및 약학 조성물
다른 양태에서, 본 발명은 또한 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 전술한 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC) 또는 조성물 중 하나 이상을 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 약학 조성물은 항-종양 활성을 갖는 다른 성분을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, ADC 또는 조성물 및 항-종양 활성을 갖는 기타 성분은 동일한 제형 유닛 또는 상이한 제형 유닛에 존재한다. 따라서, 본 발명의 ADC 또는 조성물 및 항-종양 활성을 갖는 기타 성분은 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-종양 활성을 갖는 기타 성분은 생체활성 폴리펩티드 또는 이의 활성 단편 또는 화학요법 약물이다. 일부 실시양태에서, 생체활성 폴리펩티드는 면역 체크포인트 억제제 (PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, LAG-3 항체 등), 또는 사이토카인 (인터페론, IL-2, IL-15, GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21 등)으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학요법 약물은 에피루비신, 옥살리플라틴, 카페시타빈, 5-플루오로우라실, 폴린산, 파클리탁셀, 및 알부민-결합된 파클리탁셀로부터 선택된 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 항-종양 활성을 갖는 기타 성분은 에피루비신, 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실의 조합, 또는 옥살리플라틴, 류코보린 및 5-플루오로우라실의 조합이다.
다른 양태에서, 대상체에 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물 중 ADC 또는 조성물은 다음을 수행하기에 충분하다:
(a) 종양 세포 (특히 위암 세포, 예컨대, 위 선암종 세포)의 아폽토시스의 유도;
(b) 종양 세포 (특히 위암 세포, 예컨대, 위 선암종 세포)의 증식의 억제;
(c) 보체 의존적 세포독성 (CDC)의 유도 및/또는 증가;
(d) 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC)의 유도 및/또는 증가;
(e) CLDN18.2의 발현 및 활성화의 억제;
(f) CLDN18.2-매개된 세포 시그널링 경로의 억제; 또는
(g) (a) 내지 (f)의 임의의 조합.
다른 양태에서, 본 발명은 종양의 예방 및/또는 치료 및/또는 보조 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 항체-약물 컨쥬게이트, 조성물 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양, 혈액상 악성종양, 및 암의 전이성, 불응성 또는 재발성 병변으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 종양 또는 암은 식도암, 위장관암, 위 선암종, 췌장암, 갑상선암, 결장직장암, 신장암, 폐암 (예컨대, 비-소세포 폐암, NSCLC), 간암, 위암, 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 생식세포 종양, 뼈암, 피부암, 흉선암, 담관암종, 담낭암, 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 육종, 교모세포종 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 종양은 위암, 위 선암종, 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 식도암, 위장관암, 췌장암 및 폐암 (예컨대, NSCLC)으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 종양은 위암, 위 선암종, 또는 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 예컨대, 위암, 위 선암종 또는 위식도 접합부 (GEJ) 선암종의 국소 진행성 절제불가능한 또는 전이성 종양이다.
일부 실시양태에서, 종양은 CLDN18.2 양성이고, 추가로 종양은 HER2 음성이다.
일부 실시양태에서, 종양은 HER2 음성이다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양 재발을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 방법은 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트, 조성물 또는 약학 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 위에 기재된 방법은 또한 대상체에 제2 요법을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 제2 요법은 수술, 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 유전자 요법, DNA 요법, RNA 요법, 나노요법, 바이러스 요법, 보조 요법, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제2 요법은 별도로 또는 위에 기재된 방법과 조합하여 적용될 수 있거나; 제2 요법은 위에 기재된 방법과 별도로, 조합하여, 동시에 또는 순차적으로 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 요법은 화학요법이다. 일부 실시양태에서, 화학요법 약물은 에피루비신, 옥살리플라틴, 카페시타빈, 5-플루오로우라실, 폴린산, 파클리탁셀, 및 알부민-결합된 파클리탁셀 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학요법 약물은 에피루비신, 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실의 조합, 또는 옥살리플라틴, 류코보린 및 5-플루오로우라실의 조합이다. 일부 실시양태에서, 옥살리플라틴, 류코보린 및 5-플루오로우라실의 조합된 투여량 양생법은 FOLFOX4, FOLFOX6 또는 mFOLFOX6으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제2 요법은 면역요법이다. 일부 실시양태에서, 면역요법을 위한 약물은 면역 체크포인트 억제제 (예컨대, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, 및 LAG-3 항체), 또는 사이토카인 (예컨대, 간섭 베지타리안(interference Vegetarian), IL-2, IL-15, GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-18 및 IL-21)으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양, 혈액상 악성종양, 및 암의 전이성, 불응성 또는 재발성 병변으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 종양 또는 암은 식도암, 위장관암, 위 선암종, 췌장암, 갑상선암, 결장직장암, 신장암, 폐암 (예컨대, NSCLC), 간암, 위암, 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 생식세포 종양, 뼈암, 피부암, 흉선암, 담관암, 담낭암, 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 육종, 교모세포종 및 백혈병으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 종양은 위암, 위 선암종, 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 식도암, 위장관암, 췌장암 및 폐암 (예컨대, NSCLC)으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 종양은 위암, 위 선암종, 또는 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 예컨대, 위암, 위 선암종 또는 위식도 접합부 (GEJ) 선암종의 국소 진행성 절제불가능한 또는 전이성 종양이다.
일부 실시양태에서, 종양은 CLDN18.2 양성이고, 추가로 종양은 HER2 음성이다.
일부 실시양태에서, 종양은 HER2 음성이다.
본 발명의 ADC, 조성물 또는 약학 조성물은 의학 분야에 알려진 임의의 약학 제형, 예컨대, 정제, 환제, 현탁액, 유화액, 용액, 겔, 캡슐, 파우더, 과립, 엘릭시르, 로젠지, 좌제, 주사제 (주사제, 주사용 멸균 분말 및 주사용 농축액 포함), 흡입제 또는 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 바람직한 투여량 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 용도에 따라 다르다. 본 발명의 약학 조성물은 제조 및 보관 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 바람직한 약학 제형은 주사제이다. 주사제는 멸균 주사 용액일 수 있다. 예를 들어, 다음의 방법을 사용하여, 멸균 주사 용액을 제조할 수 있다: ADC 또는 조성물의 필요한 투여량을 적절한 담체에, 임의로 다른 원하는 성분 (pH 조정제, 계면활성제, 아쥬반트, 이온성 강도 증강제, 등장화제, 보존제, 희석제 또는 이들의 임의의 조합)과 함께 분산시킨 다음, 여과 멸균화한다. 또한, 멸균 주사 용액을 사용하여, 멸균 동결건조된 분말을 (예컨대, 진공 건조 또는 동결건조함으로써) 제조하여, 보관 및 사용을 용이하게 할 수 있다. 멸균 동결건조된 분말은 사용 전에 적합한 담체, 예컨대, 멸균 발열원 없는 물에 분산될 수 있다.
게다가, 본 발명의 ADC는 투여를 용이하게 하기 위해 유닛 용량의 형태로 약학 조성물에 존재될 수 있다.
본 발명의 ADC, 조성물 또는 약학 조성물은 비제한적으로 경구, 협측, 설하, 안구, 국부, 비경구, 직장, 척추강내, 수조-내, 사타구니, 방광내, 국소 (예컨대, 분말, 연고 또는 점안액), 또는 비강 경로를 포함하는, 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 그러나, 많은 치료적 용도의 경우, 바람직한 투여 경로/방식은 비경구 (예컨대, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 당업자는 투여 경로 및/또는 방식이 의도된 목적에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약학 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 ADC 또는 조성물의 "치료적 유효 용량" 또는 "예방적 유효 용량"을 포함할 수 있다. "예방적 유효 용량"은 질환의 발병을 예방, 억제 또는 지연시키기에 충분한 양을 의미한다. "치료적 유효량"은 이미 질환을 앓고 있는 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 억제하기에 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 ADC 또는 조성물의 치료적 유효 용량은 치료할 질환의 중증도, 환자 자신의 면역계의 전반적인 상태, 환자의 일반적인 병태, 예컨대, 연령, 체중 및 성별, 및 약물의 투여뿐만 아니라 동시 투여를 위한 기타 치료 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에서, 투여량 양생법은 최적의 의도된 반응 (예컨대, 치료적 또는 예방적 반응)을 달성하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 투여로 투여될 수 있거나, 일정 기간에 걸쳐 다중 회 투여될 수 있거나, 치료의 긴급성에 따라 비례적으로 감소된 또는 증가된 투여량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 ADC 또는 조성물의 전형적인 비-제한적인 치료적 또는 예방적 유효 용량 범위는 0.02 내지 100 mg/kg, 예컨대, 0.1 내지 100 mg/kg, 0.1 내지 50 mg/kg, 또는 1 내지 50 mg/kg이다. 투여량은 치료할 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다. 더욱이, 임의의 특정 환자에 대해, 특정 투여량 양생법은 환자의 요구 및 의사의 전문적 평가에 따라 시간이 지남에 따라 조정되어야 한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이며; 본원에 제공된 투여량 범위는 단지 예시적 목적을 위한 것이며 본 발명의 약학 조성물의 용도 또는 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
본 발명에서, 대상체는 표유류, 예컨대, 인간일 수 있다.
약어
CDR 면역글로불린의 상보성-결정 영역
FR 항체의 프레임워크 영역: CDR 이외의 항체 가변 영역에 아미노산 잔기를 포함함
VH 항체 중쇄의 가변 영역
VL 항체 경쇄의 가변 영역
IgG 면역글로불린 G
AbM AbM CDR의 정의는 Martin의 관련 연구 (Martin ACR, Cheetham JC, Rees AR (1989) Modelling antibody hypervariable loops: A combined algorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272)에서 나온 것이며, 이 정의 방법은 Kabat 및 Chothia의 부분 정의를 통합한다.
Kabat Elvin A. Kabat가 제안한 면역글로불린 참조 및 넘버링 시스템 (예를 들어, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991 참고)
Chothia Chothia et al.가 제안한 면역글로불린 넘버링 시스템은 구조적 루프 영역의 위치에 기반하여 CDR 영역의 경계를 식별하는 고전적인 규칙이다. (예를 들어, Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883 참고)
IMGT Lefranc et al., See, Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003에서 개시된 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템 ® (IMGT)에 기반한 넘버링 시스템
mAb 단클론 항체
EC50 50% 효험 또는 결합이 생산되는 농도
HRP 홀스래디쉬 퍼옥시다제
CDR-H1 중쇄 가변 영역의 상보성-결정 영역 1
CDR-H2 중쇄 가변 영역의 상보성-결정 영역 2
CDR-H3 중쇄 가변 영역의 상보성-결정 영역 3
CDR-L1 경쇄 가변 영역의 상보성-결정 영역 1
CDR-L2 경쇄 가변 영역의 상보성-결정 영역 2
CDR-L3 경쇄 가변 영역의 상보성-결정 영역 3
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 더욱이, 세포 배양, 생화학, 핵산 화학, 면역학의 실험실 절차는 모두 상응하는 분야에서 널리 사용되는 일상적인 단계이다. 동시에, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해, 관련 용어에 대한 정의 및 설명은 아래에 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "ADC (항체-약물 컨쥬게이트)" 또는 "컨쥬게이트"는 상호교환가능하며, 링커를 통해 항체에 생체활성 분자를 컨쥬게이션함으로써 수득된 물질을 지칭한다.
링커는 다양한 화학 결합을 통해 항체에 연접될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 링커는 항체의 설프히드릴 기와 티오에테르 결합을 형성함으로써 연접된다. 일부 특이적 ADC 분자 (예컨대, 2C6.9-TL001, 2C6.9-TL002 또는 2C6.9-TL003 ADC 분자)의 구조식에서, -S-는 단순히 링커 및 항체의 설프히드릴 기에 의해 형성된 티오에테르 결합을 나타내며, -S-가 링커의 일부임을 의미하지는 않는다.
본 출원에서 ADC의 구조식은 (D-L)γ-A로 표시될 수 있으며, 여기서 D는 생체활성 분자 단편이고; L은 링커이고; A는 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고; 각각의 항체 분자에 부착된 (D-L)의 갯수를 지칭하는 γ는 1 내지 10의 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로부터 선택된다. 그러나, ADC 제조의 과정에서, 각각의 항체 분자는 상이한 갯수의 (D-L)로 연접될 수 있다. 따라서, ADC 생성물은 일반적으로 상이한 갯수의 (D-L)이 커플링된 항체의 조성물이다. 실제로, DAR은 항체에 연결된 (D-L)의 갯수의 평균값을 나타내는 데 자주 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 일반적으로 두 쌍의 폴리펩티드 쇄 (각각의 쌍은 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 가짐)로 구성된 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체 경쇄는 κ (카파) 및 λ (람다) 경쇄로 분류될 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 또는 ε 중쇄로 분류될 수 있으며, 따라서, 항체의 아이소타입은 각자, IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 정의된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12 개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연접되고, 중쇄는 또한 약 3 개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. 불변 도메인은 항체 및 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 구성요소 (C1q)를 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개하는 것과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. VH 및 VL 영역은 또한 보다 보존적인 영역 (프레임워크 영역 (FR)이라고 함)이 산재된 초가변 영역 (상보성 결정 영역 (CDR)이라고 함)으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 배열된 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 이루어진다: 아미노 말단에서 카복시 말단으로, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각각의 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역 (VH 및 VL)은 각자 항원 결합 부위를 형성한다. 각각의 영역 또는 도메인에서 아미노산의 할당은 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 또는 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196 :901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883, 또는 AbM, Martin의 관련 연구 (Martin ACR, Cheetham JC, Rees AR (1989) Modelling antibody hypervariable loops: A combined algorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272)의 정의를 따를 수 있다.
이러한 맥락에서, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 용어 "항체"가 지칭되는 경우, 온전한 항체뿐만 아니라 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 결합을 담당하는 항체 가변 영역에서의 아미노산 잔기를 지칭한다. 이들 아미노산 잔기의 정확한 경계는 당업계에 알려진 다양한 넘버링 시스템, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), Chothia 넘버링 시스템 (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883), IMGT 넘버링 시스템 ( Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003), 또는 Martin의 관련 연구의 정의 (Martin ACR, Cheetham JC, Rees AR (1989) Modelling antibody hypervariable loops: A combined algorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272)에 따라 정의될 수 있으며, 이 정의 방법은 Kabat 및 Chothia의 정의 부분을 통합하며, Oxford 분자 항체 모델링 소프트웨어 (Martin AC R. Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains[M] //Antibody engineering. Springer, Berlin, Heidelberg, 2010: 33-51.)에 처음 적용되었다. 주어진 항체에 대해, 당업자는 각각의 넘버링 시스템에 의해 정의된 CDR을 쉽게 식별할 것이다. 더욱이, 상이한 넘버링 시스템 간의 상응은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003 참고).
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 함유된 CDR은 당업계에 알려진 다양한 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 함유된 CDR은 바람직하게는 Kabat, Chothia, IMGT 또는 AbM 넘버링 시스템에 의해 결정된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 위에 정의된 바와 같은 CDR 잔기 이외의 항체의 가변 영역 중 아미노산 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 단편"은 항체 단편의 폴리펩티드, 예컨대, 전장 항체의 단편의 폴리펩티드를 지칭하며, 이는 전장 항체가 결합하는 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하고/하거나, 항원에 대한 특이적 결합에 대해 전장 항체와 경쟁하며, 이는 또한 "항원-결합 부분"이라고 한다. 일반적으로, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, NY (1989)를 참고하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 원용된다. 재조합 DNA 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단을 사용하여, 항체의 항원-결합 단편을 생산할 수 있다. 항원-결합 단편의 비-제한적인 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일 쇄 항체 (예컨대, scFv), 키메라 항체, 디아바디, 선형 항체, 나노바디 (Domantis로부터의 기술), 도메인 항체 (Ablynx로부터의 기술), 및 폴리펩티드에 특이적 항원 결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 함유하는 이러한 폴리펩티드를 포함한다. 조작된 항체 변이체는 Holliger et al., 2005; Nat Biotechnol, 23:1126-1136에 의해 검토된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전장 항체"는 2 개의 "전장 중쇄" 또는 "중쇄" 및 2 개의 "전장 경쇄" 또는 "경쇄"로 구성된 항체를 지칭하며, 여기서 "전장 중쇄" 또는 "중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 중쇄 가변 영역 (VH), 중쇄 불변 영역 CH1 도메인, 힌지 영역 (HR), 중쇄 불변 영역 CH2 도메인 및 중쇄 불변 영역 CH3 도메인으로 이루어진 폴리펩티드 쇄를 지칭하고; 전장 항체가 IgE 아이소타입인 경우, 이는 임의로 중쇄 불변 영역 CH4 도메인을 또한 포함한다. 바람직하게는, "전장 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3으로 구성된 폴리펩티드 쇄이다. "전장 경쇄" 또는 "경쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된 폴리펩티드 쇄이다. 전장 항체 쇄의 2 개의 쌍은 CL 및 CH1 사이의 디설파이드 결합 및 2 개의 전장 중쇄의 HR 사이의 디설파이드 결합에 의해 연접된다. 본 발명의 전장 항체는 단일 종, 예컨대, 인간에서 유래될 수 있으며; 이는 또한 키메라 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본 발명의 전장 항체는 각자 한 쌍의 VH 및 VL에 의해 형성된 2 개의 항원 결합 부위를 포함하고, 2 개의 항원 결합 부위는 동일한 항원을 특이적으로 인식/결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fd 단편"은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "dAb 단편"은 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고 (Ward et al., Nature 341:544 546 (1989)); 용어 "Fab 단편"은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "F(ab')2 단편"은 힌지 영역의 디설파이드 브릿지에 의해 연접된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭하고; 용어 "Fab' 단편"은 온전한 경쇄 및 중쇄 Fd 단편 (VH 및 CH1 도메인으로 이루어짐)으로 이루어진 F(ab')2 단편에서의 2 개의 중쇄 단편을 연접하는 디설파이드 결합을 감소시킴으로써 수득된 단편을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fv 단편"은 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다. Fv 단편은 일반적으로 완전한 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 가장 작은 항체 단편으로 간주된다. 이는 일반적으로 6 개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여할 수 있다고 여겨진다. 그러나, 가변 영역 (예컨대, 3 개의 항원-특이적 CDR만 함유하는 Fd 단편)도 항원을 인식하고 결합할 수 있지만, 이의 친화도는 완전한 결합 부위의 친화도보다 낮을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 단편"은 디설파이드 결합을 통한 결합되는, 항체의 제1 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역 및 제2 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역으로 형성된 항체 단편을 지칭한다. 항체의 Fc 단편은 많은 상이한 기능을 가지고 있지만, 항원 결합에는 참여하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "scFv"는 VL 및 VH 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 지칭하며, 여기서 VL 및 VH는 링커에 의해 연접된다 (예를 들어, Bird et al., Science 242:423 -426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); 및 Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Volume 113, edited by Roseburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 참고). 이러한 scFv 분자는 다음의 일반적인 구조를 가질 수 있다: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH. 선행 기술의 적합한 링커는 반복되는 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 이루어진다. 예를 들어, 아미노산 서열 (GGGGS)4를 갖는 링커가 사용될 수 있지만, 이의 변이체가 또한 사용될 수 있다 (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 링커는 Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 및 Roovers et al. (2001), Cancer Immunol에 의해 기재되어 있다. 일부 경우에, scFv의 VH 및 VL 사이에 디설파이드 결합이 또한 있을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "di-scFv"는 2 개의 scFv를 연결함으로써 형성된 항체 단편을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "디아바디"는 이의 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에서 발현되지만, 사용된 링커가 너무 짧아서, 동일한 쇄의 두 도메인 사이의 쌍형성을 허용하지 않아, 도메인이 강제로 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하고 2 개의 항원 결합 부위를 생성하는 것을 지칭한다 (예를 들어, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), 및 Poljak RJ et al., Structure 2:1121-1123 (1994) 참고).
전술한 항체 단편 각각은 전장 항체가 결합하는 동일한 항원에 특이적으로 결합하고/하거나, 항원에 대한 특이적 결합에 대해 전장 항체와 경쟁하는 능력을 유지한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이중특이적 항체"는 커플링 아암을 통해 제1 항체 (단편) 및 제2 항체 (단편) 또는 항체 모방체에 의해 형성된 컨쥬게이트를 지칭한다. 커플링 모드는 화학 반응, 유전자 융합, 단백질 융합, 폴리펩티드 융합 및 효소 반응을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "다중특이적 항체"는, 예를 들어, 삼중특이적 항체 및 사중특이적 항체를 포함하며, 여기서 전자는 3 개의 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 항체이고, 후자는 4 개의 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 항체이다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체 모방체"는 항체와 같이 항원에 특이적으로 결합하지만, 항체의 구조를 갖지 않는 물질을 지칭한다. 이들은 일반적으로 약 3 내지 20 kDa의 몰 질량을 갖는 인공 펩티드 또는 단백질, 예컨대, 안키린 반복 단백질 (DARPin) 및 파이노머(fynomer)이다. 설계된 안키린 반복 단백질 (DARPin)은 CN104341529A에서와 같이 IgG 항체, scFv-Fc 항체 단편 또는 이들의 조합에 연결된다. 항-IL-17a 파이노머는 WO2015141862A1에서와 같이 항-IL-6R 항체에 결합한다.
이러한 맥락에서, 항체의 항원-결합 단편 (예컨대, 위에-언급된 항체 단편)은 당업자에게 알려진 통상적인 기술 (예컨대, 재조합 DNA 기술 또는 효소적 또는 화학적 단편화 방법)을 사용하여 주어진 항체 (예컨대, 본 발명에 의해 제공되는 항체)로부터 수득될 수 있으며, 온전한 항체를 스크리닝하는 것과 동일한 방식으로 특이성에 대해 스크리닝될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단클론 항체" 및 "mAb"는 동일한 의미를 가지며, 상호교환적으로 사용되며, 이는 고도로 상동인 항체 분자의 그룹, 즉, 자발적으로 발생할 수 있는 자연 돌연변이를 제외하고 동일한 항체 분자의 그룹으로부터 유래된 항체 또는 항체의 단편을 지칭한다. 단클론 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대해 높은 특이성을 갖는다. 다클론 항체는 단클론 항체에 대해 언급되며, 일반적으로 적어도 2 개 이상의 상이한 항체를 포함하고, 이러한 상이한 항체는 일반적으로 항원 상의 상이한 에피토프를 인식한다. 또한, 수식어 "단클론"은 항체의 고도로 동종의 집단으로부터 수득되는 것으로서 항체의 특질을 나타낼 뿐이며, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 요구하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 단클론 항체는 다양한 기술, 예컨대, 하이브리도마 기술 (예를 들어, Kohler et al. Nature, 256:495, 1975 참고), 재조합 DNA 기술 (예를 들어, 미국 특허 출원 제4,816,567호), 또는 파지 항체 라이브러리 기술 (예를 들어, Clackson et al. Nature352:624-628, 1991, 또는 Marks et al. J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991 참고)에 의해 제조될 수 있다.
예를 들어, 단클론 항체는 다음과 같이 제조될 수 있다. 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물은 먼저 면역원으로 (필요한 경우 아쥬반트의 첨가와 함께) 면역화된다. 면역원 또는 아쥬반트의 주사의 방법은 일반적으로 다중-지점 피하 주사 또는 복강내 주사이다. 면역원은 숙주에서 항원의 면역원성을 향상시키기 위해 혈청 알부민 또는 대두 트립신 억제제와 같은 특정 알려진 단백질에 사전-커플링될 수 있다. 아쥬반트는 프로인트(Freund) 아쥬반트 또는 MPL-TDM 등일 수 있다. 동물이 면역화된 후, 신체는 면역원에 특이적으로 결합하는 항체를 분비하는 림프구를 생산할 것이다. 또한, 인 비트로 면역화에 의해 림프구를 또한 수득할 수 있다. 관심 림프구를 수집하고, PEG와 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합하여, 하이브리도마 세포를 수득한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996). 위에 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장을 억제할 수 있는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 접종될 수 있다. 예를 들어, 하이포잔틴 구아닌 포스포트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 모 골수종 세포의 경우, 배양 배지에 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티민 (HAT 배지)을 첨가하면 HGPRT-결함 세포의 성장을 억제할 것이다. 바람직한 골수종 세포는 높은 융합 속도, 안정적인 항체 분비 역량 및 HAT 배양 배지에 대한 민감성을 가져야 한다. 그 중, 뮤린 골수종은 MOP-21 또는 MC-11 마우스 종양-유래된 균주 (THE Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA), 및 SP-2/0 또는 X63-Ag8-653 세포주 (American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA)와 같은 골수종 세포에 대해 선호된다. 또한, 연구는 또한 인간 단클론 항체를 제조하기 위해 인간 골수종 및 인간-뮤린 이종 골수종 세포주의 사용을 또한 보고하였다 (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987). 하이브리도마 세포를 성장시키기 위한 배양 배지는 특이적 항원에 대한 단클론 항체의 생산을 검출하는 데 사용된다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성을 결정하는 방법은 예를 들어, 면역침전 또는 인 비트로 결합 검정, 예컨대, 방사성면역검정 (RIA), 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)을 포함한다. 예를 들어, 단클론 항체의 친화도는 Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980)에 의해 기재된 스캐차드 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 특이성, 친화도 및 반응성을 결정한 후, 관심 세포주는 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996에 기재된 표준 제한 희석 방법에 의해 서브클로닝될 수 있다. 적합한 배양 배지는 DMEM 또는 RPMI-1640 등일 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포는 또한 복수 종양의 형태로 동물에서 성장될 수 있다. 전통적인 면역글로불린 정제 방법, 예컨대, 단백질 A 아가로스 겔, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피를 활용하여, 서브클로닝된 세포에 의해 분비되는 단클론 항체는 세포 배양 배지, 복수 또는 혈청으로부터 단리될 수 있다.
단클론 항체는 또한 유전자 조작 재조합 기술에 의해 수득될 수 있다. 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 단클론 항체 중쇄 및 경쇄 유전자에 특이적으로 결합하는 핵산 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 하이브리도마 세포로부터 단리될 수 있다. 수득된 DNA 분자를 발현 벡터에 삽입한 다음, 숙주 세포 (예컨대, E. coli 세포, COS 세포, CHO 세포 또는 면역글로불린을 생산하지 않는 기타 골수종 세포)에 형질주입시켜, 적절한 조건 하에서 배양함으로써, 원하는 재조합 항체를 수득한다.
항체는 잘 알려진 기술, 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 후속적으로 또는 대안적으로, 특이적 항원 (항체에 의해 인식되는 표적 분자) 또는 이의 항원성 에피토프를 컬럼 상에 고정화할 수 있고, 면역특이적 항체를 면역친화도 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 면역글로불린의 정제는 예를 들어, D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia Pa., Vol. 14, No. 8 (Apr. 17, 2000), pp. 25-28)에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뮤린 항체"는 면역화된 마우스의 B 세포와 골수종 세포를 융합하고, 무기한 증식하여 항체를 분비할 수 있는 뮤린 하이브리드 융합 세포를 선택한 후, 스크리닝, 항체 제조 및 항체 정제를 거침으로써 제조된 항체; 또는 항원이 마우스 신체에 침입한 후 B 세포의 분화 및 증식에 의해 형성되는 형질 세포에 의해 분비되는 항체를 지칭한다. 특이적 항원의 자극 하에서 생산된 항체의 경우, 항체의 생산은 인체에 침입한 항원에 의해 유발된 다양한 면역 세포의 상호작용에 기인하여, B 세포의, 항체를 생산하고 분비할 수 있는 형질세포로의 분화 및 증식을 초래한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 이의 경쇄 또는/및 중쇄의 일부가 하나의 항체로부터 유래되고 (이는 특이적 종으로부터 유래되거나 특정 특이적 항체 클래스 또는 서브클래스에 속할 수 있음), 경쇄 또는/및 중쇄의 다른 부분이 다른 항체로부터 유래되지만 (이는 동일한 또는 상이한 종으로부터 유래되거나 동일한 또는 상이한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속할 수 있음), 그럼에도 불구하고 여전히 관심 항원에 대한 결합 활성을 유지하는 항체를 지칭한다 (USP 4,816,567 to Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)). 예를 들어, 용어 "키메라 항체"는 항체 (예컨대, 인간-뮤린 키메라 항체)를 포함할 수 있으며, 여기서 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 제1 항체 (예컨대, 뮤린 항체)로부터 유래되는 반면, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 제2 항체 (예컨대, 인간 항체)로부터 유래된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화된 항체"는 인간 항체의 서열에 대한 상동성을 증가시키도록 아미노산 서열이 변형된 유전자 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 일반적으로, 인간화된 항체의 CDR 영역의 전부 또는 일부는 비-인간 항체 (공여자 항체)로부터 유래되고, 비-CDR 영역 (예컨대, 가변 영역 FR 및/또는 불변 영역)의 전부 또는 일부는 인간 면역글로불린 (수용체 항체)로부터 유래된다. 인간화된 항체는 전형적으로 비제한적으로 항원 특이성, 친화도, 반응성, 면역 세포 활성을 증가시키는 능력 및 면역 반응을 향상시키는 능력 등을 포함하는 공여자 항체의 원하는 특성을 보유한다. 공여자 항체는 바람직한 특성 (예컨대, 항원 특이성, 친화도, 반응성, 면역 세포 활성을 증가시키고/시키거나 면역 반응을 향상시키는 능력)을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류 (예컨대, 시노몰구스)로부터의 항체일 수 있다.
인간화된 항체는 비-인간 공여자 항체 (예컨대, 뮤린 항체)의 예상되는 특성을 보유할 수 있을 뿐만 아니라 인간 대상체에서 비-인간 공여자 항체 (예컨대, 뮤린 항체)의 면역원성을 효과적으로 감소시킬 수 있으므로, 특히 유리하다. 그러나, 공여자 항체의 CDR 및 수용체 항체의 FR 사이의 매칭 문제로 인해, 인간화된 항체의 예상되는 특성 (예컨대, 항원 특이성, 친화도, 반응성, 면역 세포 활성을 개선하는 능력 및/또는 면역 반응을 향상시키는 능력)은 일반적으로 비-인간 공여자 항체 (예컨대, 뮤린 항체)의 특성보다 낮다.
따라서, 해당 분야의 연구자들이 항체의 인간화에 대한 심층 연구를 수행하고 일부 진전을 이루었지만 (예를 들어, Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992); 및 Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000) 참고), 선행 기술은 생산된 인간화된 항체가 가장 높은 수준의 인간화를 가질 뿐만 아니라, 가능한 한 최대한 공여자 항체의 예상되는 특성을 보유하도록 공여자 항체를 완전히 인간화하는 방법에 대한 상세한 가이던스를 제공하지 않는다. 기술자들은 특이적 공여자 항체에 대한 탐색, 조사 및 변형을 수행하고 높은 인간화 정도 (예를 들어, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 인간화 정도)를 가질 뿐만 아니라 특이적 공여자 항체의 예상되는 특성을 보유하는 인간화된 항체를 수득하기 위해 많은 창의적인 작업을 수행해야 한다.
본 발명에서, 인간화된 항체가 가능한 한 최대한 공여자 항체의 특성 (예를 들어, 항원 특이성, 친화도, 반응성, 면역 세포 활성을 개선하는 능력 및/또는 면역 반응을 향상시키는 능력을 포함함)을 유지하도록 하기 위해, 본 발명의 인간화된 항체의 프레임워크 영역 (FR)은 인간 수용체 항체의 아미노산 잔기 및 상응하는 비-인간 공여자 항체의 아미노산 잔기 둘 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 인간화된 항체는 위에 제조된 뮤린 단클론 항체의 서열에 기반하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 표적 뮤린 하이브리도마로부터 수득될 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-마우스 (예컨대, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.
키메라 항체를 제조하기 위해, 뮤린 면역글로불린의 가변 영역은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 인간 면역글로불린의 불변 영역에 연결될 수 있다 (예를 들어, Cabilly et al.의 미국 특허 제4,816,567호 참고). 예를 들어, VH를 코딩하는 DNA는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결되어, 전장 중쇄 유전자를 수득한다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있으며 (예를 들어, Kabat, EA et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 이러한 영역을 함유하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 일반적으로 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 예를 들어, VL을 코딩하는 DNA는 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결되어, 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)를 수득한다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있으며 (예를 들어, Kabat, EA et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고), 이러한 영역을 함유하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 불변 영역일 수 있지만, 일반적으로 바람직하게는 κ 불변 영역이다.
인간화된 항체를 제조하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용함으로써 인간 프레임워크 서열에 이식될 수 있다 (Winter의 미국 특허 제5,225,539호; Queen et al.의 미국 특허 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,693,762호, 및 제6,180,370호; 및 Lo, Benny, KC, editor, in Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004). 대안적으로, 면역화 후에 내인성 면역글로불린을 생산하지 않고 완전한 인간 항체 라이브러리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식-계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래하고, 이러한 생식-계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 공격시험(challenge) 시 인간 항체의 생산을 초래할 것으로 보고되었다 (예를 들어, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551; Jakobovits et al., 1993, Nature 362 : 255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in Immunology 7: 33; 및 Duchosal et al., 1992, Nature 355: 258 참고). 위에-언급된 트랜스제닉 동물의 비-제한적인 예는 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌(miniloci) 및 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 비활성화시키는 표적화된 돌연변이를 포함하는 HuMAb 마우스 (Medarex, Inc.) (예를 들어, Lonberg et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859 참고); 또는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 운반하는 "KM 마우스TM" (특허 출원 WO02/43478호 참고)를 포함한다. 항체를 인간화하는 다른 방법은 파지 디스플레이 기술을 포함한다 (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-597; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14: 309).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 정도"는 인간화된 항체에서 비-인간 아미노산 잔기의 수를 평가하기 위한 지표를 지칭한다. 인간화된 항체의 인간화 정도는 예를 들어, IMGT 웹사이트의 DomainGapAlign으로 인간 V 도메인에 대한 가변 영역 서열의 상동성을 예측함으로써 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상동 항체"는 그 안에 함유된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 서열과 상동인 항체의 변이체를 지칭하며, 변이체는 본 발명의 항-CLDN18.2 항체의 원하는 기능적 특성을 유지한다.
비교를 위한 서열 정렬의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 절차 및 정렬 알고리즘은 Smith TF and Waterman MS, Adv.Appl.Math., 2:482, 1981; Higgins DG 및 Sharp PM, CABIOS5:151, 1989에 기재되어 있다. Altschul SF et al., Nature Genet., 6:119, 1994는 서열 정렬 및 상동성 계산에 대한 상세한 아이디어를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 항체 및 이것이 지시되는 항원 사이의 반응과 같은 2 개의 분자 사이의 비-무작위 결합 반응을 지칭한다. 특이적 결합 상호작용의 강도 또는 친화도는 상호작용의 평형 해리 상수 (KD) 또는 반-최대 효과 농도 (EC50)로 표현될 수 있다.
2 개의 분자 사이의 특이적 결합 특성은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 한 가지 방법은 항원 결합 부위/항원 복합체의 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 포함한다. "결합 속도 상수" (ka 또는 kon) 및 "해리 속도 상수" (kdis 또는 koff) 둘 모두는 농도 및 회합 및 해리의 실제 속도로부터 계산될 수 있다 (Malmqvist M, Nature, 1993, 361: 186-187 참고). kdis/kon의 비율은 해리 상수 KD와 동일하다 (Davies et al, Annual Rev Biochem, 1990; 59: 439-473 참고). KD, kon 및 kdis 값은 임의의 효과적인 방법으로 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 해리 상수는 생물발광 간섭계 (예컨대, ForteBio Octet 방법)를 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 해리 상수는 표면 플라즈몬 공명 기술 (예를 들어, Biacore) 또는 Kinexa로 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성"은 2 개의 폴리펩티드 또는 2 개의 핵산 간의 매칭 정도를 지칭한다. 비교를 위한 2 개의 서열이 특정 부위에 염기 또는 아미노산의 동일한 단량체 서브-유닛을 가질 때 (예컨대, 2 개의 DNA 분자 각각은 특정 부위에 아데닌을 갖거나, 2 개의 폴리펩티드 각각은 특정 부위에 리신을 가질 때), 2 개의 분자는 그 부위에서 동일하다. 2 개의 서열 간의 퍼센트 동일성은 비교를 위한 총 부위 수에 대한 2 개의 서열이 공유하는 동일한 서열의 수의 함수 x 100이다. 예를 들어, 2 개의 서열의 10 개 부위 중 6 개가 매칭하는 경우, 이들 2 개의 서열은 60%의 동일성을 갖는다. 예를 들어, DNA 서열: CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 동일성을 공유한다 (6 개 부위 중 3 개가 매칭됨). 일반적으로, 2 개의 서열의 비교는 최대 동일성을 생산하는 방식으로 실시된다. 이러한 정렬은 Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)의 방법에 기반한 Align 프로그램 (DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 실시될 수 있다. 2 개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2 개의 아미노산 서열 간의 동일성의 백분율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)에 통합된 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))의 알고리즘에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 치환"은 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩티드의 예상되는 특성에 악영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 치환을 의미하고, 보존적 치환에 의해 수득된 항체 변이체는 이의 원래의 서열의 생물학적 활성, 예컨대, CLDN 18.2에 대한 특이적인 결합 을 보유한다. 예를 들어, 보존적 치환은 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기, 예를 들어, 상응하는 아미노산 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 (예컨대, 유사한 크기, 모양, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성하는 능력을 포함하는 화학적 특성, 등을 갖는) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예컨대, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비-극성 측쇄 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 발린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분지 측쇄 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 상응하는 아미노산 잔기를 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것이 바람직하다. 아미노산의 보존적 치환을 식별하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, Brummell et al, Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997)을 참고하며, 이는 본원에 참조로 원용됨).
본원에 포함된 20 개의 통상적인 아미노산은 일상적인 방식으로 발현된다. 예를 들어, Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))를 참고하며, 이는 본원에 참조로 원용된다. 본 개시내용에서, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 동일한 의미를 가지며, 상호교환적으로 사용된다. 또한, 본 개시내용에서, 아미노산은 일반적으로 당업계에 알려진 바와 같이 하나의 문자 및 3 개의 문자 약어로 표현된다. 예를 들어, 알라닌은 A 또는 Ala로 표현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제"는 대상체 및 활성 성분과 약리학적 및/또는 생리학적으로 양립가능한 담체 및/또는 부형제를 지칭하며, 이는 당업계에 잘 알려져 있으며 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참고), pH 조정제, 계면활성제, 아쥬반트, 이온 강도 증강제, 희석제, 삼투압을 유지하는 약제, 흡수를 지연시키는 약제, 보존제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pH 조정제는 포스페이트 완충액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 계면활성제는 Tween-80과 같은 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이온 강도 증강제는 소듐 클로라이드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보존제는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 삼투압을 유지하는 약제는 당 및 NaCl 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 흡수를 지연시키는 약제는 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 희석제는 물, 수성 완충액 (예컨대, 완충된 식염수), 및 알콜 및 폴리올 (예컨대, 글리세린) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보존제는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대, 티메로살, 2-페녹시에탄올, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 및 소르브산 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 안정화제는 소듐 글루타메이트, 젤라틴, SPGA, 당 (예컨대, 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 락토스, 덱스트란 또는 글루코스), 아미노산 (예컨대, 글루탐산, 글리신), 단백질 (예컨대, 건조 유청, 알부민 또는 카제인) 또는 이들의 분해 생성물 (예컨대, 락트알부민 가수분해물)을 비제한적으로 포함하여, 약물 내 활성 성분의 원하는 활성을 안정화시킬 수 있는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방"은 대상체에서 질환 또는 장애 또는 증상 (예컨대, 종양, 감염 또는 자가면역 질환)의 발생을 예방하거나 지연시키기 위해 수행되는 방법을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 유익하거나 원하는 임상 결과를 수득하기 위해 수행되는 방법을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 증상의 경감, 질환의 정도의 감소, 질환의 상태의 안정화 (즉, 더 이상 악화되지 않음), 질환의 발달의 지연 또는 저속화, 질환의 상태의 개선 또는 경감, 및 검출가능한 또는 검출할 수 없는 증상의 (부분적 또는 전체적) 경감을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 용어 "치료"는 또한 예상된 생존 시간 (치료를 받지 않는 경우)과 비교하여 생존 시간을 연장하는 것을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유류, 예컨대, 영장류 포유류, 예컨대, 인간을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 대상체 (예컨대, 인간)는 종양, 감염 또는 자가면역 질환을 앓고 있거나, 전술한 질환을 앓을 위험이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 원하는 효과를 수득하거나 적어도 부분적으로 수득하기에 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 질환 (예컨대, 종양, 감염 또는 자가면역 질환)을 예방하기 위한 유효량은 질환 (예컨대, 종양, 감염 또는 자가면역 질병)의 발생을 예방, 중지 또는 지연시키기에 충분한 양을 지칭하고; 질환을 치료하기 위한 유효량은 이미 질환을 앓고 있는 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 예방하기에 충분한 양을 지칭한다. 이러한 유효량을 결정하는 것은 완전히 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, 치료적 용도에 대한 유효량은 치료할 질환의 중증도, 환자 자신의 면역계의 전반적인 상태, 환자의 일반적인 병태, 예컨대, 연령, 체중 및 성별, 약물을 투여하는 방식, 및 동시에 투여된 다른 요법 등에 따라 달라질 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 조혈 기원을 갖고 면역 반응에서 역할을 하는 세포, 예를 들어, 림프구, 예컨대, B 세포 및 T 세포; 자연 살해 세포; 골수성 세포, 예컨대, 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구 및 과립구를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 면역 세포 (예컨대, 림프구, 항원-제시 세포, 식세포 또는 과립구) 및 면역 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (항체, 사이토카인 및 보체 포함)를 지칭하며, 이는 자가면역 또는 병리학적 염증의 맥락에서 침입성 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암 세포 또는 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 손상 또는 파괴, 또는 신체로부터 이들의 제거를 야기한다. 본 발명에서, 용어 "항원-특이적 T 세포 반응"은 T 세포가 T 세포 특이적 항원에 의해 자극될 때 생성되는 T 세포에 의해 생산되는 면역 반응을 지칭한다. 항원-특이적 자극 시 T 세포에 의해 생산되는 반응의 비-제한적인 예는 T 세포의 증식 및 사이토카인, 예컨대, IL-2의 생산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이펙터 기능"은 항체의 아이소타입에 따라 달라지는 항체의 Fc 영역 (자연 서열 또는 아미노산 서열 변이체의 Fc 영역)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 Fc 수용체 결합 친화도, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 보체 의존적 세포독성 (CDC), 항체-의존적 세포성 식세포작용 (ADCP), 세포 표면 수용체 (예컨대, B 세포 수용체)의 하향조절, B 세포 활성화, 사이토카인 분비, 및 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/클리어런스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체의 이펙터 기능을 변경하는 방법은 예를 들어, Fc 영역에 돌연변이를 도입함으로써 당업계에 알려져 있다.
용어 "암"과 "종양"은 상호교환적으로 사용되며, 신체의 비정상 세포의 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 대규모 질환 그룹을 지칭한다. 조절되지 않은 세포 분열은 악성 종양 또는 인접 조직을 침입하는 세포의 형성을 야기할 수 있으며, 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이될 수 있다. 암은 양성 및 악성 암뿐만 아니라 휴면 종양 또는 미세전이를 포함한다. 암은 또한 혈액암, 특히 혈액상 악성종양을 포함한다.
용어 "혈액상 악성종양" 또는 "혈액상 종양"은 림프종, 백혈병, 골수종 또는 림프성 악성종양, 뿐만 아니라 비장암 및 림프절 종양을 포함한다. 예시적인 림프종은 B-세포 림프종 및 T-세포 림프종을 포함한다. B-세포 림프종은 예를 들어, 호지킨 림프종을 포함한다. T 세포 림프종은 예를 들어, 피부 T 세포 림프종을 포함한다. 혈액상 악성종양은 또한 백혈병, 예컨대, 이차성 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병을 포함한다. 혈액상 악성종양은 또한 골수종 (예컨대, 다발성 골수종) 및 기타 혈액상 및/또는 B 세포 또는 T 세포 관련된 암을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 분자 자체, 분자 단편 또는 조성물이 동물 또는 인간에 적합하게 투여될 때, 이상 반응, 알레르기 반응 또는 기타 원하지 않은 반응을 생산하지 않는 것을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 이의 구성요소로서 사용될 수 있는 일부 물질의 구체적인 예는 당, 예컨대, 락토스, 전분, 셀룰로스 및 이들의 유도체, 식물성 오일, 젤라틴, 폴리올, 예컨대, 프로필렌 글리콜, 및 알긴산 등을 포함한다.
이러한 맥락에서, 병용 요법은 본 발명에 의해 커버되는 ADC, 또는 조성물, 또는 약학 조성물과 제2 요법의 하나 이상의 치료제 (예컨대, 화학요법제), 또는 다른 예방적 또는 치료적 양식 (예컨대, 방사선요법)의 조합의 사용을 포함한다.
제2 요법을 위한 예시적인 치료제는 화학요법제 (예컨대, 유사분열 억제제), 알킬화제 (예컨대, 질소 머스타드), 항대사물질 (예컨대, 폴레이트 유사체), 자연 생성물 (예컨대, 빈카 알칼로이드), 다양한 시약 (예컨대, 백금 조정 복합체), 호르몬 및 길항제 (예컨대, 부신 코르티코스테로이드), 면역조정제 (예컨대, 브로피리민, Upjohn) 등을 포함할 수 있다. 기타 항-암 치료제는 암 세포를 특이적으로 표적화하는 다른 항체를 포함한다.
이러한 유형의 병용 요법에서, 다양한 치료제는 종종 작용의 상이한 상보적 메커니즘을 가지며, 병용 요법은 상승작용적 효과를 초래할 수 있다. 병용 요법은 면역 반응에 영향을 미치는 (예컨대, 반응을 향상 또는 활성화시키는) 치료제 및 종양/암 세포에 영향을 미치는 (예컨대, 억제 또는 사멸시키는) 치료제를 포함한다. 병용 요법은 약물-저항성 암 세포의 발생 가능성을 감소시킬 수 있다. 병용 요법은 하나 이상의 약제와 연관된 이상 효과를 감소 또는 제거하기 위해 하나 이상의 약제의 투여량을 감소시킬 수 있다. 이러한 병용 요법은 잠재적인 질환, 장애 또는 병태에 대해 상승작용적 치료적 또는 예방적 효과를 가질 수 있다.
이러한 맥락에서, "조합"은 개별 투여를 위해 별도로 제형화되는 것과 같이 (예를 들어, 키트로 제공될 수 있는) 별도로 투여될 수 있는 요법 및 단일 제형 (즉, "공동-제형화")으로서 함께 투여될 수 있는 요법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC, 조성물 또는 약학 조성물은 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이들은 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 ADC는 하나 이상의 다른 (활성) 약제와 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
HER2 음성은 IHC 1+ 또는 IHC 2+/FISH 음성뿐만 아니라 IHC 0 내지 1+ 및 IHC 1+ 내지 2+의 범위를 포함하여, 세포 표면 상의 유의한 양의 HER2 단백질이 없음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "할로겐"은 플루오린, 클로린, 브로민 및 아이오딘을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C1-6 알킬"은 예를 들어, "C1-4 알킬" 및 "C1-3 알킬"을 포함하여, 1-6 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 (기)을 지칭한다. 구체적인 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 2-메틸부틸, 네오펜틸, 1-에틸프로필, n-헥실, 이소헥실, 3-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 3,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 및 1,2-디메틸프로필.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C1-6 알킬렌"은 예를 들어, "C1-4 알킬렌" 및 "C1-3 알킬렌"을 포함하여, 1-6 개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 알칸의 2 개의 수소 원자를 손실함으로써 수득되는 2 가 기를 지칭한다. 구체적인 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 메틸렌, 에틸렌, 프로프-1,3-일렌, 부트-1,4-일렌, 펜트-1,5-일렌, 및 헥스-1,6-일렌.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C2-10 알케닐"은 예를 들어, "C2-6 알케닐" 및 "C2-4 알케닐"을 포함하여, 하나 이상의 이중 결합 및 2-10 개의 탄소 수를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알케닐을 지칭한다. 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 비닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 1,3-부타디에닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 1,3-펜타디에닐, 1,4-펜타디에닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 1,4-헥사디에닐, 사이클로펜테닐, 1,3-사이클로펜타디에닐, 사이클로헥세닐, 및 1,4-사이클로헥사디에닐.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C2-10 알케닐렌"은 예를 들어, "C2-8 알케닐렌" 및 "C4-6 알케닐렌"을 포함하여, 2-10 개의 탄소 원자를 함유하는 올레핀의 2 개의 수소 원자를 손실함으로써 수득되는 2 가 기를 지칭한다. 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 펜텐-1,5-일렌, 2-펜텐-1,5-일렌 및 헥센-1,6-일렌.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C2-10 알키닐"은 예를 들어, "C2-6 알키닐" 및 "C2-4 알키닐"을 포함하여, 하나 이상의 삼중 결합 및 2-10 개의 탄소 수를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알키닐을 지칭한다. 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 에티닐, 프로피닐, 2-부티닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 4-메틸-2-펜티닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐 및 5-메틸-2-헥시닐.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C2-10 알키닐렌"은 예를 들어, "C2-8 알키닐렌" 및 "C4-6 알키닐렌"을 포함하여, 2-10 개의 탄소 원자를 함유하는 알킨의 2 개의 수소 원자를 손실함으로써 수득되는 2 가 기를 지칭한다. 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 펜틴-1,5-일렌, 2-펜틴-1,5-일렌 및 헥신-1,6-일렌.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C1-6 알콕시"는 C1-6 알킬-O-의 구조를 갖는 기를 지칭하며, 여기서 C1-6 알킬은 위에 정의된 바와 같다. 구체적인 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, tert-부톡시, 펜톡시 및 헥속시를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "5-12 원 헤테로아릴"은 5-12 개의 고리 원을 함유하는 방향족 사이클릭 기를 지칭하며, 이들 중 하나는 적어도 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로원자이다. 구체적인 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 5-10 원 헤테로아릴, 5-10 원 질소-함유 헤테로아릴, 및 5-6 원 산소-함유 헤테로아릴, 예컨대, 푸릴, 티에닐, 피롤릴, 티아졸릴, 이소티아졸, 티아디아졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 피리다지닐, 피라지닐, 1,2,3-트리아지닐, 1,3,5-트리아지닐, 및 1,2,4,5-테트라지닐.
본 발명은 본원에 기재된 구체적인 방법론, 프로토콜, 세포주, 벡터/담체 또는 시약으로 제한되지 않으며, 이들은 다양할 수 있다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 구체적인 실시양태를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명의 범주를 제한하기 위한 것이 아니다.
이러한 문맥 (명세서 및 청구범위)에서, 단수형 "(단수형)" 및 "상기"는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 이들의 복수형을 포함한다. 예를 들어, "숙주 세포"는 복수의 이러한 숙주 세포를 포함한다. 또한, 중국어에는 상응하는 영어의 단수형 및 복수형의 문법적 규칙이 없으며, 명사의 단수형 및 복수형은 문맥 또는 실제 상황에 따라 판단해야 한다. 따라서, 영어 번역에서, 명사의 접두사 "하나 이상"은 아마도 정확할 것이다.
도 1a는 유세포 분석법에 의한 HEK293T-Claudin18.2의 단클론 안정한 세포주의 검출을 도시한다.
도 1b는 유세포 분석법에 의한 L929-Claudin18.2의 단클론 안정한 세포주의 검출을 도시한다.
도 1c는 유세포 분석법에 의한 KATOIII-Claudin18.2의 단클론 안정한 세포주의 검출을 도시한다.
도 1d는 유세포 분석법에 의한 NCI-N87-Claudin18.2의 단클론 안정한 세포주의 검출을 도시한다.
도 1e는 웨스턴 블롯에 의한 HEK293T-Claudin18.1의 단클론 안정한 세포주의 검출을 도시한다.
도 2는 유세포 분석법에 의한 2C6.9-hz21 및 IMAB362의 친화도의 결정을 도시한다.
도 3은 L929-Claudin 18.2 세포에 대한 2C6.9-hz21 및 IMAB362 결합의 친화도의 결정을 도시한다.
도 4는 유세포 분석법에 의한 2C6.9-hz21의 특이성의 결정을 도시한다.
도 5는 HEK293T-Claudin18.2 세포에 대한 2C6.9-hz21 및 IMAB362의 CDC 살해 활성의 결정을 도시한다.
도 6은 HEK293T-Claudin18.2 세포에 대한 2C6.9-hz21 및 IMAB362의 ADCC 활성의 결정을 도시한다.
도 7은 2C6.9-TL001 (DAR: 3.79)의 HPLC-SEC 스펙트럼을 도시한다.
도 8은 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)의 HPLC-SEC 스펙트럼을 도시한다.
도 9는 세포막 표면 상의 Claudin 18.2에 대한 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)의 친화도의 테스트 결과를 도시한다.
도 10a는 HEK293T-Claudin 18.2에 대한 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)의 세포독성 효과의 테스트 결과를 도시한다.
도 10b는 HEK293T-Claudin 18.2에 대한 2C6.9-TL001 (DAR: 3.79)의 세포독성 효과의 테스트 결과를 도시한다.
도 10c는 HEK293T-Claudin 18.1에 대한 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)의 세포독성 효과의 테스트 결과를 도시한다.
도 10d는 HEK293T-Claudin 18.2에 대한 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003의 세포독성 효과의 테스트 결과를 도시한다.
도 10e는 HEK293T-Claudin 18.1에 대한 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003의 세포독성 효과의 테스트 결과를 도시한다.
도 11a는 NUGC-4 세포에 대한 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)의 세포독성 효과의 테스트 결과를 도시한다.
도 11b는 NUGC-4 세포에 대한 2C6.9-TL001 (DAR: 3.79)의 세포독성 효과의 테스트 결과를 도시한다.
도 11c는 NUGC-4 세포에 대한 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003의 세포독성 효과의 테스트 결과를 도시한다.
도 12a는 Balb/c 누드 마우스에서 피하 이식된 NCI-N87-Claudin18.2 세포 종양 모델에서 각각의 그룹의 마우스의 종양 부피 변화를 도시한다 (*: P<0.05; ****: P < 0.0001).
도 12b는 Balb/c 누드 마우스의 피하 이식된 NCI-N87-Claudin18.2 세포 종양 모델에서 각각의 그룹의 마우스의 체중 변화를 도시한다.
도 12c는 CDX 모델에서 2C6.9-TL001 및 2C6.9 mAb + 화학요법의 11-일 인 비보 효험의 비교를 도시한다 (****: P<0.0001).
도 12d는 CDX 모델에서 2C6.9-TL001 및 2C6.9 단클론 항체 + 화학요법의 21-일 인 비보 효험의 비교를 도시한다 (****: P < 0.0001).
도 12e는 CDX (NUGC-4) 모델에서 상이한 DAR 값을 갖는 2C6.9-TL001로 치료된 각각의 그룹에서 마우스의 21 일 이내의 종양 부피 변화를 도시한다 (****: P < 0.001).
도 12f는 CDX (NUGC-4) 모델에서 상이한 DAR 값을 갖는 2C6.9-TL001로 치료된 각각의 그룹에서 마우스의 21 일 이내의 체중 변화를 도시한다.
도 12 g는 Balb/c 누드 마우스의 피하 HuPrime® 위암 GA0006 PDX 모델에서의 각각의 그룹에서 마우스의 17 일 이내의 종양 부피 변화를 도시한다 (****: P < 0.0001).
도 12h는 Balb/c 누드 마우스의 피하 HuPrime® 위암 GA0006 PDX 모델에서의 각각의 그룹에서 마우스의 17 일 이내의 체중 변화를 도시한다.
도 12i는 Balb/c 누드 마우스의 피하 HuPrime® 위암 GA0006 PDX 모델에서의 각각의 그룹에서 마우스의 24 일 이내의 종양 부피 변화를 도시한다 (****: P < 0.0001).
도 12j는 Balb/c 누드 마우스의 피하 HuPrime® 위암 GA0006 PDX 모델에서의 각각의 그룹에서 마우스의 24 일 이내의 체중 변화를 도시한다.
도 12k는 Balb/c 누드 마우스의 피하 NCI-N87-Claudin18.2 세포 이식 종양 모델에서의 각각의 그룹에서 마우스의 종양 부피 변화를 도시한다 (***: P < 0.001; ****: P < 0.0001).
도 12l은 Balb/c 누드 마우스의 피하 NCI-N87-Claudin18.2 세포 이식 종양 모델에서의 각각의 그룹에서 마우스의 체중 변화를 도시한다.
도 12m은 Balb/c 누드 마우스의 피하 HEK293T-Claudin18.2 세포 이식 종양 모델에서의 각각의 그룹에서 마우스의 종양 부피 변화를 도시한다 (**: P < 0.01; ****: P < 0.0001).
도 12n은 Balb/c 누드 마우스의 피하 HEK293T-Claudin18.2 세포 이식 종양 모델에서의 각각의 그룹에서 마우스의 체중 변화를 도시한다.
도 12o는 Balb/c 누드 마우스의 피하 NUGC-4 세포 이식 종양 모델에서의 각각의 그룹에서 마우스의 종양 부피 변화를 도시한다 (****: P < 0.0001).
도 12p는 Balb/c 누드 마우스의 피하 NUGC-4 세포 이식 종양 모델에서의 각각의 그룹에서 마우스의 체중 변화를 도시한다.
도 13은 2C6.9-TL001 (DAR:7.40)의 HPLC-SEC 스펙트럼을 도시한다.
본 발명의 실시양태는 실시예를 참조하여 아래에 상세하게 설명될 것이나, 당업자는 다음의 실시예가 본 발명을 예시하기 위해서만 사용되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안 된다는 것을 이해할 것이다. 실시예에 표시되지 않은 구체적인 조건은 통상적인 조건 또는 제조업체가 제시하는 조건에 따른다. 임의의 제조업체를 표시하지 않고 사용되는 시약 또는 기기는 모두 상업적으로 이용가능한 통상적인 제품이다.
실시예 1. 생체활성 분자 (TOXIN-1)의 합성
Figure pct00034
메탄설포닐 클로라이드 (462 mg, 12.77 mmol, 약 70% 순도)를 벨로테칸 하이드로클로라이드 (3 g, 6.38 mmol) 및 트리에틸아민 (2.58 g, 25.54 mmol)의 디클로로메탄 (40 mL) 용액에 적가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 흡인 여과 후, 필터 케이크를 디클로로메탄 (3 mL)으로 3 회 세척하여, 2.2 g의 (S)-N-(2-(4-에틸-4-하이드록시-3,14-디온-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-11-일)에틸)-N-이소프로필 메탄 설폰아미드 (TOXIN-1)을 수득하였다.
구조적 특성화 데이터는 다음 같다:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.32 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.20 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1H), 7.93-7.84 (m, 1H), 7.79 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 5.44 (d, J = 9.2 Hz, 4H), 3.98 (p, J = 6.7 Hz, 1H), 3.50 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.42-3.35 (m, 2H), 3.00 (s, 3H), 1.93-1.82 (m, 2H), 1.15 (d, J = 6.7 Hz, 6H), 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
ESI-MS (m/z): 512.2 [M+H]+.
[α]D 20은 +28.19°이다 (c =0.101 g/100 mL, CH3CN).
실시예 2. 6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)-5-헥시노산 (화합물 3-4)의 합성
Figure pct00035
단계 1: 6-(2-(메틸티오)피리미딘-5-일)-5-헥시노산 메틸 에스테르 (화합물 3-2)의 합성
실온에서, 메틸 5-헥시노에이트 (500 mg, 3.97 mmol) 및 5-브로모-2-메틸티오피리미딘을 N,N-디메틸포름아미드 (3 mL)에 용해시키고, 트리에틸아민 (3 mL), 제1구리 아이오다이드 (75 mg, 0.4 mmol) 및 팔라듐 (II) 비스(트리페닐포스핀) 디클로라이드 (279 mg, 0.4 mmol)를 연속적으로 첨가하였다. 그 다음, 혼합물을 질소의 보호 하에서 95℃로 가열하고, 6 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응물을 물로 켄칭하였다. 반응물을 에틸 아세테이트 (20 mL x 3)로 추출하였다. 유기 상을 조합하고, 포화 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조시키고, 여과하여, 건조제를 제거하고, 진공에서 농축하고, 분취용 액체 크로마토그래피로 정제하여, 300 mg의 표제 화합물을 수득하였다. ESI-MS (m/z): 251.3 [M + H]+.
단계 2: 6-(2-(메틸티오)피리미딘-5-일)-5-헥시노산 (화합물 3-3)의 합성
실온에서, 화합물 3-2 (200 mg, 0.8 mmol)를 테트라하이드로퓨란 및 물의 혼합된 용액 (4 mL/4 mL)에 용해시키고, 리튬 하이드록시드 일수화물 (235 mg, 5.6 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하면서 반응시킨 후, 물로 희석하고, 에틸 아세테이트 (20 mL x 2)로 추출하고; 수성 상을 1 N 염산을 이용하여 pH = 3으로 조정하고, 에틸 아세테이트 (20 mL x 3)로 추출하고; 유기 상을 조합하고, 포화 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조시키고, 여과하여, 건조제를 제거하고, 진공에서 농축하여, 120 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
단계 3: 6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)-5-헥시노산 (화합물 3-4)의 합성
실온에서, 화합물 3-3 (20 mg, 0.085 mmol)을 디클로로메탄 (4 mL)에 용해시키고, m-클로로퍼옥시벤조산 (22 mg, 0.127 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하면서 반응시키고, 분취용 액체 크로마토그래피로 정제하여, 20 mg의 표제 화합물을 수득하였다. ESI-MS (m/z): 269.1 [M + H] +.
실시예 3. (4-((S)-2-(4-아미노부틸)-35-(4-((6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)헥스-5-인아미도)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-4,8-디옥소-6,12,15,18,21,24,27,30,33-노나옥사-3,9-디아자펜타트리아콘탄아미도)벤질)((S)-4-에틸-11-(2-(N-이소프로필메틸설폰아미도)에틸)-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-4-일)카보네이트 (화합물 TL001)
Figure pct00036
단계 1: 6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)-N-프로파길-헥스-5-인아미드 (화합물 3-5)의 합성
프로피닐아민 (189 mg, 3.4 mmol) 및 화합물 3-4 (800 mg, 2.83 mmol)를 25℃ 하에서 디클로로메탄 (10 mL)에 용해시킨 다음, N,N-디이소프로필에틸아민 (738 mg, 5.67 mmol) 및 O-(7-아자-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸 우레아 헥사플루오로포스페이트 (1.63 g, 4.25 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 용액을 진공에서 농축하고, 잔류물을 플래시 실리카 겔 컬럼 (에틸 아세테이트/석유 에테르 = 3/1)으로 정제하여, 700 mg의 표제 화합물을 수득하였다. ESI-MS (m/z): 306.1 [M + H] +.
단계 2: (4-((S)-35-아지도-2-(4-(((4-메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)부틸)-4,8-디옥소-6,12,15,18,21,24,27,30,33-노나옥사-3,9-디아자펜타트리아콘탄아미도)벤질)((S)-4-에틸-11-(2-(N-이소프로필메틸설폰아미도)에틸)-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-4-일)카보네이트 (화합물 33-1)의 합성.
TOXIN-1 (250 mg, 0.49 mmol)을 25℃에서 질소의 보호 하에서 디클로로메탄 (10 mL)에 용해시키고, 0℃로 냉각하고, 4-디메틸아미노피리딘 (478 mg, 3.91 mmol)의 디클로로메탄 (3 mL) 용액을 첨가한 후, 트리포스겐 (72 mg, 0.24 mmol)의 디클로로메탄 (10 mL) 용액을 천천히 적가하였다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 0℃에서 20 분 동안 교반하면서 반응시키고, 20 분 동안 질소로 퍼징하였다. 이어서, (S)-2-(32-아지도-5-옥소-3,9,12,15,18,21,24,27,30-노나옥사-6-아자-도트리아콘탄아미도)-N-(4-(하이드록시메틸)페닐)-6-(((4-메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)헥산아미드 (518 mg, 0.49 mmol)의 디클로로메탄 (7 mL) 용액을 첨가하고, 0℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 감압 하에서 농축하고, 잔류물을 분취용 액체 크로마토그래피로 정제하여, 500 mg의 표제 화합물을 수득하였다. ESI-MS (m/z): 1597.5 [M+H]+.
단계 3: ((S)-4-에틸-11-(2-(N-이소프로필메틸설폰아미도)에틸)-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-4-일)(4-((S)-2-(4-(((4-메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)부틸)-35-(4-((6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)헥스-5-인아미도)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-4,8-디옥소-6,12,15,18,21,24,27,30,33-노녹시-3,9-디아자펜타트리아콘탄아미도)벤질)카보네이트 (화합물 33-2)의 합성
실온에서, 화합물 33-1 (80 mg, 0.05 mmol) 및 단편 3-5 (23 mg, 0.075 mmol)를 디메틸 설폭사이드 및 물의 용액 (2.0 mL: 0.5 mL)에 용해시킨 후, 제1구리 브로마이드 (11 mg, 0.08 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1 시간 동안 교반하고, 분취용 고-성능 액체 크로마토그래피로 정제하여, 30 mg의 표제 화합물을 수득하였다. ESI-MS (m/z): 815.9 [(M-273)/2+H ]+.
단계 4: 4-((S)-2-(4-아미노부틸)-35-(4-((6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)헥스-5-인아미도)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-4,8-디옥소-6,12,15,18,21,24,27,30,33-노나옥사-3,9-디아자펜타트리아콘탄아미도)벤질)((S)-4-에틸-11-(2-(N-이소프로필메틸설폰아미도)에틸)-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-4-일)카보네이트 (화합물 TL001)의 합성.
화합물 33-2 (30 mg, 0.02 mmol)를 디클로로메탄 (1.0 mL)에 용해시킨 후, 트리플루오로아세트산 (0.2 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 30 분 동안 반응되도록 하고, 분취용 HPLC로 정제하여, 표제 화합물의 20.0 mg의 트리플루오로아세트산 염을 수득하였다. 구조는 다음과 같이 특성화된다:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.18 (s, 1H), 9.10 (s, 2H), 8.38 (t, J = 5.56 Hz, 1H), 8.32 (d, J = 8.40 Hz, 1H), 8.22 - 8.20 (m, 2H), 8.09 (t, J = 5.68 Hz, 1H), 7.91 - 7.87 (m, 2H), 7.82 - 7.78 (m, 1H), 7.69 (brs, 3H), 7.61 (d, J = 8.56 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.56 Hz, 2H), 7.06 (s, 1H), 5.56 (d, J = 16.96 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 16.96 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 19.28 Hz, 1H), 5.42 (d, J = 19.28 Hz, 1H), 5.14 (d, J = 12.20 Hz, 1H), 5.07 (d, J = 12.16 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 5.24 Hz, 2H), 4.46 - 4.43 (m, 1H), 4.29 (d, J = 5.60 Hz, 2H), 4.08 - 3.95 (m, 5H), 3.79 (t, J = 5.28 Hz, 2H), 3.51 - 3.43 (m, 32H), 3.40 (s, 3H), 3.39 - 3.35 (m, 2H), 3.30 - 3.26 (m, 2H), 3.00 (s, 3H), 2.82 - 2.74 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.08 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.36 Hz, 2H), 2.23 - 2.13 (m, 2H), 1.82 (p, J = 7.24 Hz, 2H), 1.78 - 1.63 (m, 2H), 1.61 - 1.49 (m, 2H), 1.42 - 1.27 (m, 2H), 1.15 (d, J = 6.80 Hz, 3H) , 1.13 (d, J = 6.76 Hz, 3H) , 0.90 (t, J = 7.32 Hz, 3H).
ESI-MS (m/z): 816.0[M/2+H]+.
[α]D 20은 -19.55°이다 (c =1.000 g/100 mL, CH3CN).
실시예 4. ((S)-4,11-디에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-9-일)(4-((S)-2-((S)-3-메틸-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)헥스-5-인아미도)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)부티라미도)프로피온아미도)벤질)에탄-1,2-디일 비스(메틸카바메이트)트리플루오로아세테이트 (TL002)의 합성
Figure pct00037
단계 1: (S)-(4,11-디에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-9-일(4-니트로페닐)카보네이트의 합성
(S)-4,11-디에틸-4,9-디하이드록시-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-3,14(4H,12H)-디온 (150 mg, 0.37 mmol)을 디클로로메탄 (15 mL)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (96.81 mg, 0.74 mmol)을 첨가한 다음, 디클로로메탄 (15 mL) 중 비스(4-니트로페닐)카보네이트 (127.92 mg, 0.41 mmol)의 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 3 시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 농축하여, 207 mg의 표제 화합물을 수득하고, 이를 다음 반응에 바로 사용하였다.
ESI-MS (m/z):558.1[M+H]+.
단계 2: (S)-tert-부틸(4,11-디에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-9-일)에탄-1,2-디일 비스(메틸카바메이트)의 합성
(S)-(4,11-디에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-9-일)(4-니트로페닐)카보네이트 (207 mg, 0.33 mmol)를 디클로로메탄 (10 mL)에 용해시키고, 디이소프로필 에틸아민 (130.87 mg, 1.00 mmol) 및 tert-부틸 N-메틸-N-[2-(메틸아미노)에틸]카바메이트 (71.34 mg, 0.37 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리제: 디클로로메탄/메탄올 = 9/1)로 정제하여, 207 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
ESI-MS (m/z):607.3[M+H]+.
단계 3: (S)-N-메틸-(4,11-디에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-9-일)(2-(메틸아미노)에틸)카바메이트 트리플루오로아세테이트의 합성
(S)-tert-부틸(4,11-디에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-9-일)에탄-1,2-디일 비스(메틸카바메이트) (207 mg, 0.19 mmol)를 디클로로메탄 (8 mL)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (2 mL)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 농축하여, 200 mg의 표제 화합물을 수득하고, 이를 다음 반응에 바로 사용하였다.
ESI-MS (m/z):507.2[M+H]+.
단계 4: 4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)-3-메틸부티라미도)프로피온아미도)벤질)((S)-4,11-디에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-9-일)에탄-1,2-디일비스(메틸카바메이트)의 합성
(4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)-3-메틸부티라미도)프로피온아미도)벤질) (4-니트로페닐)카보네이트 (150 mg, 0.12 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드 (3 mL)에 용해시키고, 1-하이드록시벤조트리아졸 (34.03 mg, 0.25 mmol) 및 디이소프로필 에틸아민 (48.82 mg, 0.37 mmol)을 첨가한 후, (S)-N-메틸-(4,11-디에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-9-일) (2-(메틸아미노)에틸)카바메이트 트리플루오로아세테이트 (102.11 mg, 0.12 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 분취용 HPLC로 정제하고, 수집된 분획을 동결건조하여, 44 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
ESI-MS (m/z):1400.7[M+H]+.
크로마토그래피 컬럼: Waters XBridge Prep C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm
이동상 A: 아세토니트릴; 이동상 B: 물 (0.05% 포름산)
Figure pct00038
단계 5: ((S)-4,11-디에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-9-일) (4-((S)-2-((S)-3-메틸-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)헥스-5-인아미도)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)부티라미도)프로피온아미도)벤질)에탄-1,2-디일 비스(메틸카바메이트)트리플루오로아세테이트의 합성
4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)-3-메틸부티라미도)프로피온아미도)벤질)((S)-4,11-디에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-9-일)에탄-1,2-디일 비스(메틸카바메이트) (44 mg, 0.30 mmol) 및 6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)-N-프로필)헥사미드 (14.09 mg, 0.045 mmol)를 디메틸 설폭사이드 (3 mL) 및 물 (0.75mL)의 용액에 용해시키고, 제1구리 브로마이드 (8.65 mg, 0.06 mmol)를 첨가하여, 생성된 혼합물을 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 분취용 HPLC로 정제하고, 수집된 분획을 동결건조한 다음, 디클로로메탄 (2 mL)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (0.2 mL)을 첨가하고, 25℃에서 0.5 시간 동안 교반하고, 분취용 HPLC로 정제하고, 수집된 분획을 동결건조하여, 16 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
ESI-MS (m/z): 853.6[M/2+H]+.
크로마토그래피 컬럼: Waters SunFire Prep C18 ODS 5 μm 19x50 mm
이동상 A: 아세토니트릴; 이동상 B: 물 (0.05% 트리플루오로아세트산)
Figure pct00039
실시예 5. (4-((S)-2-((S)-3-메틸-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(메틸설포닐)피리미딘)-5-일)헥스-5-인아미도)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)부티라미도)프로피온아미도)벤질)(2-((S)-4-에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-11-일)N-에틸-N-이소프로필카바메이트 트리플루오로아세테이트 (TL003)의 합성
Figure pct00040
단계 1: (S)-2-아미노-N-((S)-1-((4-(하이드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로프-2-일)-3-메틸부티라미드의 합성
실온에서, ((9H-플루오렌-9-일)메틸)(((S)-1-((S)-1-((4-(하이드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로프-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부트-2-일)카바메이트 (2.00 g, 3.88 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드 (12 mL)에 용해시키고, 피페리딘 (3 mL)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이어서, 반응 용액을 물에 부어, 고체를 침전시키고, 고체를 여과하고, 분취용 HPLC로 정제하였다. 수집된 분획을 동결건조하여, 810 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
ESI-MS (m/z): 294.0[M+H]+.
크로마토그래피 컬럼: Waters SunFire Prep C18 ODS 8 μm 45x450 mm
이동상 A: 아세토니트릴; 이동상 B: 물
Figure pct00041
단계 2: tert-부틸 4-(4-((S)-1-((S)-1-((4-(하이드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로프-2-일)아미노-3-메틸-1-옥소부트-2-일)아미노-4-옥소부틸)피페리딘-1-카복실레이트의 합성
실온에서, (S)-2-아미노-N-((S)-1-((4-(하이드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로프-2-일)-3-메틸부티라미드 (810 mg, 2.76 mmol), 4-(1-(tert-부톡시카보닐)피페리딘-4-일)부티르산 및 2-에톡시-1-에톡시카보-1,2-디하이드로퀴놀린을 디클로로메탄 (8 mL) 및 메탄올 (8 mL)에 용해시키고, 45℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 진공 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 컬럼 (용리제: 디클로로메탄/메탄올 = 15/1)으로 정제하여, 1.31 g의 표제 화합물을 수득하였다.
ESI-MS (m/z): 546.8[M+H]+.
단계 3: (S)-N-((S)-1-((4-(하이드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로프-2-일)-3-메틸-2-(4-(피페리딘)-4-일)부티릴 아미도)부티라미드 트리플루오로아세테이트의 합성
실온에서, tert-부틸-(4-((S)-1-((S)-1-((4-(하이드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소프로프-2-일)아미노-3-메틸-1-옥소부트-2-일)아미노-4-옥소부틸)피페리딘-1-포르메이트 (1.3 g, 2.14 mmol)를 디클로로메탄 (20 mL)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (5 mL)을 첨가하고, 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 감압 하에서 농축하고, 잔류물을 아세토니트릴 (30 mL)에 용해시키고, 포타슘 카보네이트 (1.22 g, 8.85 mmol)를 첨가하고, 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 흡인 여과하고, 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하고, 여과액을 수집하고, 감압 하에서 농축하여, 900 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
ESI-MS (m/z): 446.9[M+H]+.
단계 4: (S)-2-(4-(1-(26-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)-N-((S)-1-((4-(하이드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로프-2-일)-3-메틸부티라미드의 합성
실온에서, (S)-N-((S)-1-((4-(하이드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로프-2-일)-3-메틸-2-(4-(피페리딘-4-일)부티릴아미도)부티라미드 트리플루오로아세테이트 (487 mg, 0.78 mmol) 및 26-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐 p-톨루엔설포네이트 (619 mg, 0.94 mmol)를 아세토니트릴 (20 mL)에 용해시키고, 포타슘 카보네이트 (655 mg, 4.69 mmol)를 첨가하고, 16℃에서 6 시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 감압 하에서 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 컬럼 (용리제: 디클로로메탄/메탄올 = 8/1)으로 정제하여, 586 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
ESI-MS (m/z): 868.5[M+H]+.
단계 5: (4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)-3-메틸부티라미도)프로피온아미도)벤질)(4-니트로페닐)카보네이트의 합성
실온에서, (S)-2-(4-(1-(26-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)-N-((S)-1-((4-(하이드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로프-2-일)-3-메틸부티라미드 (585 mg, 0.64 mmol)를 디클로로메탄 (30 mL)에 용해시키고, N,N-디이소프로필 에틸아민 (334.31 mg, 2.56 mmol)을 첨가한 후, 디 (p-니트로벤젠)카보네이트 (602.35 mg, 1.92 mmol)의 디클로로메탄 (30 mL) 용액을 적가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 6 시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 감압 하에서 농축하고, 메틸 tert-부틸 에테르를 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 여과하여, 760 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
ESI-MS (m/z):1033.4[M+H]+.
단계 6: (4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)-3-메틸부티라미도)프로피온아미도)벤질)(N-(2-((S)-4-에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-11-일)에틸)-N-이소프로필)카바메이트의 합성
실온에서, (4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)-3-메틸부티라미도)프로피온아미도)벤질)(4-니트로페닐)카보네이트 (150 mg, 0.12 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드 (3 mL)에 용해시키고, 1-하이드록시벤조트리아졸 (34.03 mg, 0.25 mmol) 및 N,N-디이소프로필 에틸아민 (48.82 mg, 0.37 mmol)을 첨가한 다음, (S)-4-에틸-4-하이드록시-11- (2-(이소프로필아미노)에틸)-1,12-디하이드로-14H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-3,14 (4H)-디온 히드로클로라이드 (59.79 mg, 0.12 mmol)를 첨가하고, 반응 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음, 분취용 HPLC로 정제하고, 수집된 분획을 동결건조하여, 64 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
ESI-MS (m/z):1327.6[M+H]+.
단계 7: (4-((S)-2-((S)-3-메틸-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)헥스-5-인아미도)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)부티라미도)프로피온아미도)벤질)(2-((S)-4-에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-11-일)N-에틸-N-이소프로필카바메이트 트리플루오로아세테이트의 합성
실온에서, (4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코사닐)피페리딘-4-일)부티라미도)-3-메틸부티라미도)프로피온아미도)벤질)(N-(2-((S)-4-에틸-4-하이드록시-3,14-디옥소-3,4,12,14-테트라하이드로-1H-피라노[3',4':6,7]인도지노[1,2-b]퀴놀린-11-일)에틸)-N-이소프로필)카바메이트 (64 mg, 0.046 mmol) 및 6-(2-(메틸설포닐)피리미딘-5-일)-N-(프로프-2-인일)헥사미드 (21.63 mg, 0.069 mmol)를 디메틸 설폭사이드 (4 mL) 및 물 (1 mL)에 용해시키고, 제1구리 브로마이드 (13.27 mg, 0.092 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 분취용 HPLC로 정제하고, 수집된 분획을 동결건조하여, 35 mg의 표제 화합물을 수득하였다. ESI-MS (m/z):1632.8[M+H]+.
크로마토그래피 컬럼: Waters SunFire Prep C18 OBD 5 μm 19x150 mm
이동상 A: 아세토니트릴;
이동상 B: 물 (0.05% 트리플루오로아세트산)
Figure pct00042
실시예 6. 인간 Claudin 18.2를 표적화하는 단클론 항체의 제조
본 발명에서 인간 claudin 18.2를 표적화하는 단클론 항체는 2C6.9-hz11 및 2C6.9-hz21을 포함하는 인간화된 단클론 항체이며, 이들의 CDR, 가변 영역 서열 및 불변 영역 서열을 표 1에 도시되어 있다:
Figure pct00043
6.1 인간 Claudin18.2 및 인간 Claudin 18.1 과발현 세포주의 작제 및 식별
6.1.1 인간 Claudin18.2 및 인간 Claudin18.1 과발현 세포주의 작제
항-인간 Claudin18.2 항체의 특이성 및 기능을 결정하기 위해, 인간 Claudin18.2 (유전자 수탁 번호: NM_001002026.2, Nanjing Genscript Biotech Corporation에 의해 합성됨) 및 인간 Claudin18.1 (유전자 수탁 번호: NM_016369.3, Nanjing Genscript Biotech Corporation에 의해 합성됨)의 완전한 코딩 서열을 렌티바이러스 벡터 pLVX-IRES-puro에 클로닝하고, 바이러스를 공개된 방법 (Mohammadi Z etl., Mol Biotechnol. 2015 Sep;57(9):793-800.)에 따라 렌티바이러스 패키징 시스템으로 제조하였다. 수득된 바이러스를 사용하여, HEK293T, L929, KATOIII 및 NCI-N87 세포를 감염시켰다. HEK293T-Claudin 18.1, HEK293T-Claudin 18.2, L929-Claudin 18.2, KATOIII- Claudin 18.2 및 NCI-N87-Claudin 18.2의 단클론 안정한 세포주를 퓨로마이신 스크리닝 및 단일 클론 선택에 의해 수득하였다. BaF/3 세포 (DSMZ, Cat# ACC300)를 4D-뉴클레오펙터 X 형질주입 키트 (Lonza, Cat# V4XC-3012)를 사용하여 인간 Claudin18.2 또는 인간 Claudin18.1을 코딩하는 플라스미드로 형질주입시켰다. 형질주입 48 시간 후, 1.25 mg/mL 하이그로마이신 (Thermo Fisher Sci. Cat# 10687010)을 첨가하여 세포를 스크리닝하였다. 스크리닝 12 일 후 단일 클론을 선택하여, 단클론 세포주 BaF/3-Claud18.1 및 BaF/3-Claud18.2를 수득하였다.
6.1.2 인간 Claudin18.2 및 인간 Claudin18.1 과발현 세포주의 검출
웨스턴 블롯을 HEK293T-Claudin 18.1을 검출하는 데 사용하고 (검출 항체: Proteintech, 66167-1-Ig), FACS를 다른 세포주를 검출하는 데 사용하였다 (유세포 분석기: Beckman, CytoFlex; 검출 항체: IMAB362, 이의 서열은 특허 CN 101312989 B호로부터 유래됨). 특허: CN 101312989 B). 도 1a-1d에 도시된 바와 같이, FACS 결과는 높은 양성률 (100%에 가까움) 및 양호한 동질성을 갖는 HEK293T-Claudin 18.2, L929- Claudin 18.2, KATOIII- Claudin 18.2 및 NCI-N87- Claudin 18.2 단클론 세포주가 수득되고, 다음의 실험에 사용됨을 나타냈다. 웨스턴 블롯 결과 (도 1e)는 HEK293T-Claudin 18.1의 3 개의 안정한 세포주 모두가 인간 Claudin 18.1을 과발현했음을 보여주었으며, 여기서 HEK293T-Claudin 18.1-1C2의 단일 클론은 다른 것보다 더 높은 발현 수준을 보였고, 다음의 실험에 사용되었다.
6.2 마우스 항-인간 Claudin18.2 단클론 항체의 제조
DNA/세포 면역화를 야생형 마우스에서 수행하여, 마우스 항-인간 Claudin 18.2 단클론 항체를 생성하였다. 각각의 Balb/c 마우스에 꼬리 정맥을 통해 인간 Claudin 18.2의 완전한 코딩 서열을 함유하는 100 μg의 플라스미드를 주사하였다. 4 차 및 6 차 면역화 후, 혈청 역가를 FACS에 의해 결정하였다. 높은 혈청 역가를 갖는 마우스를 융합 3-5 일 전에 BaF/3-Claudin18.2 과발현 세포주로 부스팅하였다. 마우스 비장세포 및 마우스 골수종 세포주 Sp2/0 (ATCC, Cat# CRL-1581)의 PEG 매개된 융합을 표준 융합 프로토콜로 수행한 후, HAT 가압된 선택을 수행하였다. FACS 스크리닝을 융합 10-14 일 후에 수행하였다.
약 6000 개의 하이브리도마의 상층액을 유세포 분석법 (Model iQue Screener Plus로서 Sartorius로부터 이용가능함)을 사용하여 스크리닝하고, HEK293T-Claudin18.2 세포주에 결합하는 43 개의 양성 하이브리도마를 수득하고, 서브-클로닝하였다. 인간 Claudin18.2에 특이적으로 결합하지만 인간 Claudin18.1에는 결합하지 않는 14 개의 하이브리도마를 HEK293T-Claudin18.2 및 HEK293T-Claudin18.1 세포주를 사용하여 FACS에 의해 선택하였다. 제한된 희석 및 서브클론 선택에 의해 단일 클론을 수득하였다.
인간 위암 세포주 NUGC4 (일본 JCRB 세포 은행으로부터 구입함, 카탈로그 번호: JCRB0834)는 Claudin18.2를 내인성으로 발현하며, 항체 및 내인성 Claudin18.2 간의 결합을 평가하고 기능적 검정을 개발하는 데 널리 사용된다. NUGC4 세포를 사용하여, 후보 클론을 평가하고, 최종적으로 7 개의 서브-클론을 선택하였다. 추가의 친화도 검출 후, 가변 영역 증폭 및 인간화를 위해 2C6.9M을 선택하였다.
후보 하이브리도마 클론의 항체 서브타입을 검출하기 위해, Pierce Rapid 아이소타이핑 키트 (Thermo Fisher SCI.Cat #26179)를 사용하여, 2C6.9M을 식별하였다. 식별 결과는 중쇄가 IgG1 서브타입이고 경쇄가 카파 서브타입이었음을 나타냈다.
하이브리도마 세포를 확장하고, 약 8000 개의 세포를 수확하고 용해시켰다. 제1 cDNA 쇄를 cDNA 역전사 키트 (Thermo Fisher Sci. Cat# 18080-200)에 의해 합성하였다. VH 및 VK (VL 카파) 유전자를 프라이머를 사용하여 cDNA로부터 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 생성물을 DNA 정제 키트 (Qiagen, Cat#28104)로 정제하고, TOPO 벡터 (Thermo Fisher Sci. Cat#K457540)에 결찰하였다. 각각의 결찰 반응물로부터 약 12 개의 클론을 선별하고, 시퀀싱하였다. 그런 다음, 벡터 NTI 11.5 (Thermo Fisher Sci.) 및 Sequencer 5.4.6 (Genecodes)에 의해 서열을 분석하였다. 수득된 뮤린 항체 2C6.9M의 가변 영역 서열 및 CDR 서열을 표 2에 도시하였다.
Figure pct00044
6.3 2C6.9M 뮤린 항체의 인간화
CDR-이식 방법을 사용하여, 뮤린 (마우스) 항체 2C6.9M을 인간화하였다. 간단히 말해서, 인간화 과정은 다음의 단계에 포함되었다: 마우스 단클론 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 항체의 아미노산 서열과 정렬하여, 높은 상동성 및 양호한 물리-화학적 특성을 갖는 인간 생식계열 프레임워크를 식별하는 단계; HLA-DR에 대한 친화도를 결정한 다음, HLA-DR에 대한 낮은 친화도를 갖는 인간 생식계열 프레임워크를 선택하는 단계; 이어서, 마우스 항체의 6 개의 CDR 영역을 선택된 중쇄 및 경쇄 프레임워크에 이식하는 단계.
구체적으로, 마우스 항체 2C6.9M의 중쇄 및 경쇄 CDR을 상응하는 인간화 주형의 프레임워크 (FR)에 이식하였다. 2C6.9M의 중쇄 및 경쇄에 대한 인간화 주형은 각자 인간 생식계열 서열 IGHV4-59*01 (IMGT 참조 번호 AB019438) 및 IGKV4-1*01 (IMGT 참조 번호 Z00023)이다.
더욱이, 컴퓨터 시뮬레이션으로, 분자 도킹을 수행하여, 가변 영역 및 이의 주변 프레임워크 아미노산 서열을 분석하여, 항체의 공간적 입체 결합 모드를 결정하였다. 정전기력을 계산함으로써, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호작용 및 엔트로피, Claudin18.2와 상호작용하거나 마우스 항체의 아미노산 서열에서 공간적 구조를 유지할 수 있는 중요한 아미노산 잔기를 식별하였고, 이들 마우스 아미노산을 이식 후 유지하였다. 즉, 마우스 항체의 친화도가 인간화된 항체에서 최대 정도로 유지될 수 있도록 인간화 주형의 FR 영역 잔기에 일련의 역돌연변이를 취하였다.
마우스 항체 2C6.9M의 가변 영역 서열은 서열번호 23 및 서열번호 24에 도시되고, 이의 CDR 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 12에 도시되어 있다. 친화도에 영향을 미치지 않으면서 이성질체화의 발생을 피하기 위해, 2C6.9 CDR-H2의 아미노산 서열을 본 발명에서 변형시켰다. 변형된 서열은 서열번호 21 및 서열번호 22에 도시되어 있다. 마지막으로, 2 개의 인간화된 항체를 작제하고, 각자 2C6.9-hz11 및 2C6.9-hz21로서 명명하였다. 각각의 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 야생형 IgG1 중쇄 불변 영역 (서열번호 16)이고, 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 야생형 IgG1 κ 경쇄 불변 영역 (서열번호 17)이다.
각각의 2C6.9 항체의 가변 영역, 불변 영역 및 중쇄/경쇄 아미노산 서열을 표 1에 도시하였다.
2C6.9 인간화된 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열의 코돈 최적화된 cDNA를 합성하고, 플라스미드 pcDNA3.4에 결찰시켰다 (Nanjing Genscript Biotech Corporation 위탁에 의함). 중쇄 및 경쇄에 상응하는 pcDNA3.4를 Expi293F 세포 (Thermo사로부터 구입함)에 동시에 형질주입시키고, 세포 상층액을 단백질 A 친화도 컬럼 (MabSelect SuRe, GE)으로 정제하여, 2C6.9 인간화된 단클론 항체를 수득하였다.
6.4 인간화된 단클론 항체 2C6.9의 친화도 검출
HEK293T-Claudin 18.2 세포를 사용하여 세포막 상의 인간 Claudin 18.2에 대한 2C6.9-hz21의 친화도를 검출하였다. 구체적인 절차는 다음과 같다: HEK293T-Claudin 18.2 세포를 분리하여, 원심분리한 후, PBS로 2 회 세척하였다. 그런 다음, 세포를 1% BSA를 함유하는 PBS에 재현탁하고, 총 20 개의 웰에 대해 50 μl의 부피로 웰당 300000 개의 세포로 96-웰 팁 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 50 μl의 2C6.9-hz21 및 IMAB362 항체를 각각의 웰에 3-배 희석으로 1000 nM에서 시작하는 11 개의 농도로 개별적으로 첨가하였다. 인간 IgG는 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 반응물을 잘 혼합하고, 암흑에서 4℃에서 1 시간 동안 항온처리한 후, PBS로 3 회 세척하고, FITC-표지된 항-인간 Fc 2차 항체 (Biolegend, 409322)를 첨가하고, 암흑에서 4℃에서 0.5 시간 동안 항온처리하였다. 검출을 PBS로 3 회 세척한 후 유세포 분석기 (Beckman, Cytoflex)로 수행하였다.
도 2 및 표 3에 도시된 바와 같이, HEK293T-Claudin 18.2에 대한 2C6.9-hz21의 결합 친화도의 EC50 값은 IMAB362의 값보다 낮았고; 2C6.9-hz21의 최대 형광값은 IMAB362의 값보다 더 높았으며, 이는 세포막 상의 Claudin 18.2에 대한 2C6.9-hz21의 친화도가 IMAB362보다 강력함을 나타낸다.
Figure pct00045
6.5 인간화된 항체 2C6.9의 친화도 및 특이성의 결정
인간 Claudin18.2는 테트라스파닌 패밀리에 속하며, 복잡한 구조를 가지고 있다. 따라서, Claudin18.2의 구조를 유지하기 위해 세포 ELISA를 수행하였다. 6.1에서 작제된 안정한 세포주 L929-Claudin 18.2를 검출에 사용하였다. 구체적으로, L929-Claudin 18.2 점착성 세포를 2 mM EDTA 처리에 의해 분리하였다. 세포를 재현탁하고, 2 x 105 개/mL로 조정하고, 100 μL의 재현탁액을 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 플레이트를 PBS로 1 회 세척하였다. 100 μL/웰 4% 포름알데히드를 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 30 분의 항온처리 후, 포름알데히드를 제거하고, PBS로 2 회 세척하였다. 그런 다음, 차단 완충액 (2% BSA를 함유하는 PBS)을 플레이트에 100 μL/웰로 첨가하고, 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 차단 완충액을 제거한 후, 100 μL/웰의 연속 희석된 항체 (1 μM에서 시작하여, 총 11 개의 농도에 대해 4-배 희석)를 상응하는 웰에 첨가하고, 이후 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 250 μL의 PBST로 5 회 세척하고, 각각의 회차에 2 분 동안 방치하였다. PBS (2% BSA 함유)에서 1:10000으로 희석된 100 μL/웰의 홀스래디쉬 퍼옥시다제 표지된 항-인간 IgG 2차 항체 (HRP-항-인간 IgG, Jackson ImmunoResearch, 109-035-003)를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하고, 250 μL의 PBST로 6 회 세척하였고, 여기서 플레이트를 각각의 회차에 2 분 동안 방치하였다. 100 μL/웰의 TMB 용액 (Thermo, 34029)을 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 20 분 동안 항온처리하고, 50 μL의 2 mol/L H2SO4로 중지하였다. 플레이트 판독기 (MD, SpectraMax M2)에서 OD450 nm 흡광도 값을 수득하고, 그 결과를 Graphpad Prism으로 곡선 피팅하였다.
그 결과를 도 3 및 표 4에 도시하였으며, 이는 인간 Claudin 18.2에 대한 인간화된 항체 2C6.9-hz21의 친화도가 IMAB362의 친화도보다 유의하게 더 높음을 나타낸다. 동일한 실험에서, 인간화된 항체 2C6.9-hz11의 친화도는 항체 2C6.9-hz21의 친화도에 가까웠다 (결과는 생략됨).
Figure pct00046
후보 항체의 특이성을 FACS에 의해 검출하였다. 구체적인 절차는 다음과 같다: HEK293T, HEK293T-인간 Claudin 18.1 및 HEK293T-인간 Claudin18.2 세포를 분리한 다음, 원심분리하였다. PBS로 2 회 세척한 후, 세포를 1% BSA를 함유하는 PBS로 재현탁시켰다. 각각의 세포주에 대해 300000 개의 세포를 후보 항체와 함께 최종 농도 1000 nM로 첨가하고, 잘 혼합하고, 빛으로부터 보호된 4℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 세포를 PBS로 3 회 세척하고, FITC-표지된 항-인간 Fc 2차 항체 (BioLegend, 409322)를 첨가한 다음, 암흑에서 4℃에서 0.5 시간 동안 항온처리하였다. 검출은 PBS로 3 회 세척한 후 유세포 분석기 (Beckman, Cytoflex)로 수행하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 2C6.9-hz21은 인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합할 수 있지만 인간 Claudin 18.1에는 결합할 수 없다.
6.6 인간화된 항체 2C6.9의 보체 의존적 세포독성 (CDC)의 결정
2C6.9는 고전적 보체 경로를 효과적으로 활성화하고, 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 유도할 수 있는 IgG1 서브타입에 속한다. 보체가 풍부한 기니피그 혈청 (Zhengzhou Baiji로부터 구입함, 카탈로그 번호 S0001)을 본 연구에서 사용하여, 2C6.9의 CDC 활성을 결정하였다. 구체적인 절차는 다음과 같다: HEK293T-Claudin 18.2 세포를 수확하고, 원심분리한 후, 세포 밀도를 조정하였다. 5 × 104 개/웰의 세포를 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 항온처리하였다. 20% 기니피그 혈청을 함유하는 DMEM을 다음날 제조하고, 2C6.9 및 IMAB362를 희석하는 데 사용하였다. 20 μg/mL에서 시작하여, 2-배 희석으로 10 개의 농도를 제조하였다. HEK293T-Claudin 18.2 세포에 대한 원래의 세포 배양 배지를 제거하고, 항체 희석액을 상응하는 웰에 100 μL/웰로 첨가하였다. 10 μL/웰 용해 완충액을 양성 대조군으로서 제공하였다. 반응물을 37℃, 5% CO2의 항온처리기에 방치하고, 3 시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, CellTiter-Glo 발광 (CTG, Promega로부터 구입함, 품목 번호: G7573)을 50 μl/웰로 염색을 위해 첨가한 후, 30-초 동안 혼합하고, 실온에서 1 분 동안 방치하였다. 그런 다음, 형광 신호 값을 마이크로플레이트 판독기 (MD, SpectraMax M2)로 결정하고, 이의 결과를 곡선 피팅을 위해 Graphpad Prism으로 가져왔다.
도 5 및 표 6에 도시된 바와 같이, 2C6.9-hz21의 CDC 활성은 대조군 항체 IMAB362의 활성보다 더 강력하였다.
Figure pct00047
6.7 인간화된 항체 2C6.9의 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC)의 결정
2C6.9는 IgG1 서브타입에 속하며, 상대적으로 강력한 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC)을 갖는다. NK 세포 매개된 살해 검정을 사용하여, 2C6.9의 ADCC 활성을 결정하였다. 구체적인 절차는 다음과 같다: HEK293T-Claudin 18.2 세포를 수확하고, 원심분리한 후, 세포 밀도를 조정하였다. 1 × 104 개/웰의 세포를 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 항온처리하였다. 다음날 배지를 제거하였다. NK92MI-CD16a 세포 (Huabo Biopharm)를 원심분리하고, MEMA 배지에 재현탁하고, 1 × 106 개/mL로 조정한 다음, 50 μL/웰 세포를 상응하는 웰에 첨가하였다. 2C6.9-hz21 및 IMAB362 항체를 MEMA 배지로 희석하였다. HEK293T-Claudin18.2 세포의 경우, 5-배 희석으로 40 μg/mL부터 시작하여 10 개의 항체 농도를 테스트하였다. NUGC-4 세포의 경우, 5-배 희석으로 2 mg/mL부터 시작하여 11 개의 항체 농도를 테스트하였다. 50 μL/웰의 희석된 항체를 상응하는 웰에 첨가하고, 반응물을 37℃, 5% CO2의 항온처리기에 방치하고, 5.5 시간 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 용해 완충액을 양성 대조군 웰에 첨가하고, 추가 0.5 시간 동안 항온처리하였다. 50 μL/웰의 락테이트 탈수소효소 (LDH) 검출제 (DOJINDO LABORATORISE, CK12)를 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기 (MD, SpectraMax M2)에서 490 nm에서의 흡광도를 10 분마다 취하였다. 결과를 곡선 피팅을 위해 Graphpad Prism으로 가져왔다.
도 6 및 표 7에서 도시된 바와 같이, HEK293T-Claudin 18.2에 대한 2C6.9-hz21의 ADCC 활성은 IMAB362의 활성보다 더 강력하다.
Figure pct00048
실시예 7. 클라우딘 18.2 (2C6.9-ADC)를 표적화하는 ADC의 제조
2C6.9-TL001을 실시예 3에서 수득된 TL001을 인간화된 단클론 항체 2C6.9와 컨쥬게이션함으로써 제조하였다. 제조 방법은 다음과 같다:
(1) 컨쥬게이션: 30 mg의 2C6.9-hz21 항체에 20 mM PB + 105 mM NaCl + 100 mM 디소듐 에데테이트 용액 (pH 7.7)을 첨가하고, 2 M Tris 용액으로 pH를 7.7로 조정하고, 혼합물을 20 mM PB + 105 mM NaCl pH7.7로 희석(디소듐 에데테이트의 최종 농도는 5 mM이고, 항체의 최종 농도는 15 mg/mL였음)하고, 균일하게 혼합하고, 10 mM TCEP 용액을 첨가하여, 잘 혼합하고, 생성된 혼합물을 실온에서 잠시 (30 또는 90 분) 방치하고; 이어서 디메틸 설폭사이드에 용해된 TL001 (항체에 대한 몰비: 5:1 또는 9:1)을 첨가하고, 잘 혼합하고, 실온에서 2 시간 동안 방치하여, 컨쥬게이션된 샘플을 수득하였으며, 이를 2C6.9-TL001로서 명명하였다.
(2) 완충액 대체: 30 KDa 50-mL 한외여과 튜브 (Millipore)를 2C6.9-TL001의 완충액 교환에 사용하고, 대체 용액은 10 mM 히스티딘-하이드로클로라이드 히스티딘 + 8% 수크로스 (pH 6.0) 완충액이었고, 대체 배수는 15였으며; 샘플을 수집하고, 10% Tween-20을 첨가하였으며, 샘플 중 Tween-20의 최종 농도는 0.02% (M/V)였다.
(3) 테스트:
대체 후, 2C6.9-TL001을 다음의 조건 하에서 LC-MS 분자량 분석을 수행하였다.
크로마토그래피 결정 조건:
액체 크로마토그래피 컬럼: Thermo MAbPac RP 3.0*100 mm;
이동상 A: 0.1%FA/98%H2O/2%ACN;
이동상 B: 0.1%FA/2%H2O/98%ACN;
유량: 0.25 mL/분;
샘플 챔버의 온도: 8℃; 컬럼 온도: 60℃; 샘플 크기: 1 μL;
Figure pct00049
스위칭 밸브: 0-3 분에서 폐기, 3-22 분에서 MS, 22-30 분에서 폐기
질량 분석 조건:
질량 스펙트럼 모델: AB Sciex Triple TOF 5600+;
매개변수: GS1 35; GS2 35; CUR 30; TEM 350; ISVF 5500; DP 200; CE 10; m/z 600-4000; 합계 40에 대한 시간 빈.
TL001 및 2C6.9-hz21을 컨쥬게이션하여 수득된 2C6.9-TL001의 경쇄 및 중쇄의 이론적 분자량 및 측정된 분자량 (중쇄는 주요 당형(glycoform) G0F로 계산됨)은 아래 표에 도시되어 있다:
Figure pct00050
TL001 및 2C6.9-hz21 사이의 컨쥬게이션 공급 비율이 5:1인 경우, 항체 2C6.9-TL001의 경쇄 (LC)는 0 내지 1 개의 독소와 컨쥬게이션되고 (LC 및 DAR1의 비율은 각자 57.8% 및 42.2%임), 중쇄 (HC)는 0 내지 4 개의 독소와 컨쥬게이션된다 (HC, DAR1, DAR2, DAR3, 및 DAR4의 비율은 각자 22.5%, 30.3%, 25.0%, 21.9%, 및 0.3%임). 따라서, 독소-대-항체 비율 (DAR)은 3.79이고, 계산 공식은 다음과 같다: DAR = 경쇄 DAR1*2 + 중쇄 (DAR1*1+DAR2*2+DAR3*3+DAR4*4)*2.
TL001 및 2C6.9-hz21 사이의 컨쥬게이션 공급 비율이 9:1인 경우, 2C6.9-TL001의 항체 경쇄 (LC)는 0 내지 1 개의 독소와 컨쥬게이션되고 (LC 및 DAR1의 비율은 각자 7.5% 및 92.5%임), 중쇄 (HC)는 0 내지 4 개의 독소와 컨쥬게이션된다 (HC, DAR1, DAR2, DAR3 및 DAR4의 비율은 각자 2.5%, 10.2%, 9.8%, 76.4% 및 1.1%임). 따라서, 독소-대-항체 비율 (DAR)은 7.12이다.
TL001 및 2C6.9-hz21 사이의 컨쥬게이션 공급 비율이 9:1인 경우, 컨쥬게이션 및 양이온 크로마토그래피 후, 2C6.9-TL001의 경쇄는 0-1 개의 독소와 컨쥬게이션되고 (LC 및 DAR1 비율은 각자 1.5% 및 24.0%였음), 중쇄는 0-4 개의 독소와 컨쥬게이션된다 (HC, DAR1, DAR2, DAR3 및 DAR4 비율은 각자 0.7%, 2.1%, 14.3%, 54.5% 및 2.8%였음). 생성된 약물-대-항체 비율 (DAR)은 7.40으로서 계산되었다.
2C6.9-TL001의 ADC 분자 구조는 다음과 같으며,
Figure pct00051
여기서 γ는 1 내지 10의 정수이고, A는 2C6.9-hz21이다.
컨쥬게이트를 SEC-HPLC로 SEC 검출하였다.
크로마토그래피 조건:
액체 크로마토그래피 컬럼: TSKgel G3000SWxl, 300*7.8 mm, 5 μm;
이동상: 90 mmol/L Na2HPO4, 30 mmol/L NaH2PO4, 200 mM NaCl, 5% 아세토니트릴;
유량: 0.8 mL/분; 검출 파장: 280 nm; 컬럼 온도: 실온; 샘플 챔버의 온도: 8℃;
샘플 크기: 40 μL; 등용매 작동: 30 분.
2C6.9-TL001 (DAR: 3.79) 및 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)의 SEC 크로마토그램은 도 7-8에 도시되어 있고, 2C6.9-TL001 (DAR:7.40)의 SEC 크로마토그램은 도 13에 도시되어 있다. SEC의 체류 시간 및 피크 면적 비에 따르면, 주요 컨쥬게이팅 생성물의 분자량은 약 150 kd이며, 즉, TL001 및 2C6.9-hz21의 컨쥬게이션에 의해 수득된 2C6.9-TL001은 여전히 항체의 전체 구조를 유지한다.
동일한 제조 방법을 사용하여, 실시예 4 및 5에서 제조된 TL002 및 TL003을 인간화된 단클론 항체 2C6.9와 컨쥬게이션시켜, 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003을 제조하였으며, 제조 및 검출 방법은 위에 기재된 바와 같다. 수득된 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003의 DAR 값은 각자 6.95 및 7.03이다.
2C6.9-TL002의 ADC 분자 구조는 아래에 주어져 있으며,
Figure pct00052
여기서 γ는 1 내지 10의 정수이고, A는 2C6.9-hz21이다.
2C6.9-TL003의 분자 구조는 아래에 주어져 있으며,
Figure pct00053
여기서 γ는 1 내지 10의 정수이고, A는 2C6.9 항체이다.
실시예 8. 2C6.9-TL001의 친화도의 결정
세포막 표면 상의 Claudin 18.2에 대한 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)의 친화도를 결정하기 위해 세포-기반 ELISA 방법을 수행하였다. 구체적인 절차는 다음과 같다: L929-Claudin 18.2 점착성 세포주를 2 mM EDTA로 분리하고, 2*10^5 개의 세포/mL로 재현탁하고, 100 μL의 재현탁액을 96-웰 플레이트에 넣고, 37℃에서 밤새 항온처리하고; 다음날, 배지를 제거하고, 플레이트를 PBS로 1 회 세척하였다. 100 μL/웰 4% 포름알데히드를 실온에서 30 분 동안 플레이트에 첨가한 다음; 포름알데히드를 제거한 후, PBS로 2 회 세척하고, 100 μL PBS (2% BSA 함유)를 첨가하고, 2 시간 동안 항온처리하고; 차단 용액을 제거하고, 테스트할 2C6.9-TL001을 PBS (2% BSA 함유)로 9.375 μg/mL에서 시작하여 4-배 희석으로 총 9 개의 농도로 희석한 다음, 100 μL/웰로 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하고; 플레이트를 250 μL PBST로 5 회 세척하고, 각각의 회차에서 2 분 동안 방치하고; PBS (2% BSA)를 사용하여, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-표지된 항-인간 IgG 2차 항체 (HRP-항-인간 IgG, Jackson immunoresearch)를 1:10000의 비율로 희석하고, 희석액을 100 μL/웰로 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하고; 250 μL PBST로 6 회 세척한 후, 세포를 각각의 회차에서 2 분 동안 방치하고; 100 μL TMB 색소생산성 용액 (Thermo)을 상응하는 웰에 첨가하여, 37℃에서 20 분 동안 현상하고; 종결을 위해 50 μL 2 mol/L H2SO4를 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기 (MD)로 OD450 nm 흡광도 값을 수득하고, 곡선 피팅을 위해 값을 Graphpad Prism으로 가져왔다. 실험 결과는 도 9에 도시되어 있으며, 세포막 표면 상의 Claudin 18.2에 대한 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)의 친화도의 EC50 값은 39.94 ng/mL였다. 항체 2C6.9-hz21은 TL001과 컨쥬게이션된 후에도 여전히 우수한 Claudin 18.2 친화도를 가지고 있다.
실시예 9. Claudin18.2 고-발현 종양 세포주에 대한 2C6.9-ADC의 살해 활성의 검출
Claudin 18.2 고-발현 세포주에 대한 2C6.9-TL001의 살해 활성을 HEK293T-Claudin 18.2 및 HEK293T-Claudin 18.1 세포를 사용하여 검출하였다. 구체적인 실험 단계는 다음과 같다: 실험 전날, 세포를 DMEM+10% FBS로 희석하고, 현탁액을 플레이트에 100 μL/웰 및 1*10^4 개의 세포/웰로 넣어, 밤새 방치하고; 다음날, ADC 분자를 총 11 개의 농도에 대해 150 μg/mL (DAR:7.12) 또는 262.5 μg/mL (DAR:3.79)에서 시작하여 DMEM 염기성 배지로 4-배 희석하고, 희석액을 상응하는 웰에 최종 혈청 농도가 5%가 될 때까지 각각의 웰에 100 μL로 첨가하고; 세포를 37℃에서 5% CO2 항온처리기에서 48 시간 동안 항온처리한 다음; CCK8 (Rhinogen)을 첨가하고 (20 μL/웰), 세포를 37℃에서 0.5-2.5 시간 동안 5% CO2 항온처리기에 넣고, OD450 nm 흡광도 값을 30 분 마다 마이크로플레이트 판독기 (MD)에 의해 수득하고, 값을 곡선 피팅을 위해 Graphpad Prism으로 가져왔다.
도 10a, 10b 및 10c에 도시된 바와 같이, 2C6.9-TL001은 HEK293T-Claudin 18.2 세포를 효과적으로 살해시킬 수 있다. DAR 값이 7.12인 경우, EC50 값은 473 ng/mL이고; DAR 값이 3.79인 격우, EC50 값은 794.1 ng/mL이다. 한편, HEK293T-Claudin18을 살해시키기 위한 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)의 EC50은 3900 ng/mL이고, Claudin 18.2 세포에 대한 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)의 살해 활성은 Claudin 18.1 세포의 활성보다 유의하게 강력하며 (약 8 배 차이), 이는 2C6.9-TL001의 살해 효과가 Claudin 18.2에 대해 특이적임을 나타낸다.
HEK293T-Claudin 18.2 및 HEK293T-Claudin 18.1 세포에 대한 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003의 살해 활성을 위에 기재된 동일한 실험 방법에 의해 검출하였다. 도 10d 및 10e의 실험 결과는 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003이 HEK293T-Claudin 18.2 세포를 효과적으로 살해시킬 수 있고, EC50 값이 각자 628.9 ng/mL 및 540.2 ng/mL였음을 나타내고; HEK293T-Claudin18.1을 살해시키기 위한 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003의 EC50 값은 각자 30590 ng/mL 및 8258 ng/mL였다. HEK293T-Claudin 18.2 세포에 대한 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003의 살해 활성은 Claudin 18.1에 대한 활성보다 유의하게 더 강력하였으며, 이는 살해 효과가 Claudin 18.2 특이적이었음을 나타낸다.
실시예 10. 내인성으로 발현된 Claudin 18.2 세포주에 대한 2C6.9-ADC의 살해 활성의 검출
위암 세포주 NUGC-4를 선택하여, 내인성으로 발현된 Claudin 18.2 세포에 대한 2C6.9-TL001의 살해 활성을 검출하였다. 구체적인 실험 단계는 다음과 같다: 실험 전날, 세포를 RPMI 1640+10% FBS로 희석하고, 현탁액을 100 μL/웰 및 1*10^4 개의 세포/웰로 플레이트에 넣어, 밤새 방치하고; 다음날, 2C6.9-TL001을 총 11 개의 농도에 대해 1000 μg/mL (DAR 7.12) 또는 1750 μg/mL (DAR: 3.79)에서 시작하여 RPMI 1640 배지로 3-배 희석하고, 희석액을 상응하는 웰에 최종 혈청 농도는 5%에 도달할 때 까지 웰당 100 μL로 첨가하고; 세포를 72 시간 동안 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 항온처리한 다음; CCK8 (Rhinogen)을 20 μL/웰로 첨가하고, 세포를 37℃에서 5% CO2 항온처리기에서 0.5-2.5 시간 동안 항온처리하고, OD450 nm 흡광도 값을 30 분 마다 마이크로플레이트 판독기 (MD)로 수득하고, 값을 곡선 피팅을 위해 Graphpad Prism으로 가져왔다. 실험 결과는 도 11a 및 11b에 도시되어 있으며, 2C6.9-TL001은 NUGC-4 세포를 효과적으로 살해시킬 수 있으며: DAR 값이 7.12일 때, 이의 EC50 값은 2.383 μg/mL이고; DAR 값이 3.79일 때, 이의 EC50 값은 10.01 μg/mL이다.
NUGC-4 세포에 대한 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003의 살해 활성을 위에 기재된 방법과 유사한 실험 방법으로 검출하였다. ADC의 초기 농도는 총 11 개의 농도에 대해 4-배 희석된 500 μg/mL이다. 도 11c에 도시된 바와 같이, 2C6.9-TL002 및 2C6.9-TL003은 NUGC-4 세포를 효과적으로 살해시킬 수 있으며, EC50 값은 각자 54.92 μg/mL 및 123.94 μg/mL이다.
실시예 11. 2C6.9-hz21 항체 내재화의 검출
항체 2C6.9의 내재화 활성을 검출하기 위해 NUGC-4를 선택하였다. 구체적인 실험 단계는 다음과 같다: NUGC-4 세포를 트립신으로 소화하고, 계수하고, PBS (1% BSA 함유)에 재현탁하고, 세포 밀도를 3 × 106 개/mL로 조정하고; 100 μg/mL의 최종 농도를 갖는 2C6.9-hz21 항체를 100 μL의 재현탁된 세포에 첨가하고, 아이소타입의 인간 IgG를 음성 대조군으로서 설정하고, 얼음 위에서 1 시간 동안 항온처리하고; 항온처리 후, 세포를 사전냉각된 PBS로 3 회 세척하고, NUGC-4 세포 배양 배지 (1640+10% FBS)로 재현탁하고, 다음의 두 부분으로 나누고: 하나의 부분은 37℃에서 4 시간 동안 세포 항온처리기에서 항온처리함 (엔도사이토시스 그룹), 및 다른 부분은 얼음 위에서 4 시간 동안 항온처리함 (친화도 그룹); 항온처리 후, 세포를 사전냉각된 PBS로 3 회 세척하고, 50 uL PBS (1% BSA 함유)에 재현탁하고, 항-인간 형광 2차 항체 (Biolegend)를 첨가하고, 4℃에서 30 분 동안 항온처리하고; 항온처리 후, 세포를 사전냉각된 PBS로 3 회 세척하고, 유세포 분석법 (Beckman)에 의해 검출을 수행하고, 항체 내재화 비율을 다음의 식에 따라 계산하였다: 엔도사이토시스 (%)=[1-(MFI37℃ 항체 그룹-MFI37℃ 대조군)/ (MFI얼음 위의 항체 그룹 - MFI얼음 위의 대조군)] ×100%. 실험 결과에 따르면, NUGC-4 세포에 대한 2C6.9-hz21의 4-시간 내재화 비율은 37.79%였으며, 이는 2C6.9-hz21 컨쥬게이트가 약물을 세포로 내재화하고 종양 세포를 살해시킬 수 있는 가능성을 가짐을 나타낸다.
실시예 12. 2C6.9-ADC의 인 비보 효험의 검출
암 세포주-유래된 이종이식편 (CDX) 모델 및 환자-유래된 이종이식편 (PDX) 모델을 사용하여, ADC 분자의 항종양 효과를 평가하였다.
12.1 NCI-N87-Claudin18.2 + Balb/c 누드 마우스 CDX 모델
NCI-N87-Claudin18.2 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 지수 성장기의 세포를 수집하여, PBS에 재현탁한 다음, 암컷 Balb/c Nude 마우스 (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)에 마우스당 (0.1 mL PBS에 현탁된) 5 × 106 개의 세포의 양으로 피하 접종하여, 피하 이식 종양 모델을 확립하였다. 평균값 종양 부피가 70 내지 100 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 종양 부피에 따라 7 마리의 마우스/그룹으로 무작위로 그룹화하였다. 그룹화 날짜를 0 일차로서 기록하였으며, 그룹은 인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체 (음성 대조군) 그룹 (줄여서 IgG1), 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12) 1 mg/kg 그룹 및 3 mg/kg 그룹, 및 2C6.9-TL002 (DAR: 6.95) 1 mg/kg 그룹 및 3 mg/kg 그룹이었다. 모든 샘플을 꼬리 정맥을 통해 주 2 회 총 6 회 주사하였다.
투여 후, 주 2 회 버니어 캘리퍼스로 종양 직경을 측정하고, 다음 식에 따라 종양 부피를 계산하였으며: V = 0.5 a × b2, 여기서 a 및 b는 각자 종양의 장직경 및 단직경을 나타낸다. 매일 사멸을 관찰하고, 기록하였다.
종양 성장 억제율 TGI (%)를 항종양 효과를 평가하기 위해 다음의 식으로 계산하였다:
TGI (%) = [1-(VT종료-VT시작)/(VC종료-VC시작)]*100%
여기서,
VT종료: 치료 그룹에서 실험의 종료 시 평균 종양 부피
VT시작: 치료 그룹에서 투여의 시작 시 평균 종양 부피
VC종료: 음성 대조군에서 실험의 종료 시 평균 종양 부피
VC시작: 음성 대조군에서 투여의 시작 시 평균 종양 부피
상대적 종양 증식율 T/C (%)를 항종양 효과를 평가하기 위해 다음의 식으로 계산하였다:
T/C (%)(종양 부피)=(Tt/T 0 )/(C t /C 0 )Х100%
여기서,
T0: 초기 치료 그룹의 평균값 종양 부피 (즉, P0)
Tt: 각각의 측정에서 치료 그룹의 평균값 종양 부피
C0: 초기 음성 대조군의 평균값 종양 부피 (즉, P0)
Ct: 각각의 측정에서 음성 대조군의 평균값 종양 부피.
실험 결과를 표 8 및 도 12a 및 12b에 도시하였고, 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12)은 NCI-N87-Claudin18.2 위암 이식된 종양 모델의 종양 성장에 대해 용량-의존적 방식으로 유의한 억제 효과를 나타냈다. 음성 대조군과 비교하여, 6 회 용량 후 (21 일차), 2C6.9-TL001 1-mg/kg 그룹의 종양 억제율 (TGI)은 최대 96.03%였으며, 4 마리의 마우스는 부분적 종양 퇴행을 가졌던 반면; 3-mg/kg 그룹에서, TGI는 133.50%에 도달하였고, 3 마리의 마우스는 부분적 종양 퇴행을 가졌고, 4 마리의 마우스는 완전한 종양 퇴행을 가졌다. 2C6.9-TL002 3-mg/kg 그룹의 TGI는 40.11%였고, 1-mg/kg 그룹은 뚜렷한 항종양 효과를 갖지 않았다. 관찰 기간 동안 모든 치료 그룹에서 유의한 체중 손실이 보이지 않았으며, 동물은 잘 용인되었다.
Figure pct00054
12.2 CDX 모델에서 2C6.9-TL001 및 2C6.9 단클론 항체 + 화학요법의 인 비보 효험 비교
NCI-N87-Claudin18.2 피하 이식된 종양 모델을 실시예 12.1에 따라 확립하고, 그룹화하였다. 그룹화 날짜를 0 일차로 기록하였다. 그룹은 각자 인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체 (음성 대조군) 그룹 (줄여서 IgG1), 파클리탁셀 그룹 (알부민 결합 유형), 파클리탁셀 그룹과 조합된 2C6.9 mAb, 및 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12) 그룹이었습니다. 모든 샘플을 총 3주 동안 주 2 회 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 투여량은 표 9에 도시되어 있다.
실험 결과를 표 9 및 도 12c에 도시하였다. 음성 대조군과 비교하여, 3 개의 모든 투여 그룹은 약물 투여 11 일 후 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있으며, 특히 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12) 투여군이 그러하다. 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12) 그룹의 종양 억제율 (TGI)은 최대 121.68%이며, 7 마리의 마우스 중 6 마리가 부분적 종양 퇴행을 가지고 있다.
Figure pct00055
투여 21 일 후, 음성 대조군과 비교하여, 3 개의 모두 투여 그룹은 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있었고, 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12) 군이 가장 유의하였다. 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12) 그룹의 종양 억제율 (TGI)은 최대 125.73%였으며, 7 마리의 마우스 중 5 마리는 완전한 종양 퇴행을 가졌고, 2 마리는 부분적 종양 퇴행을 가졌다. 실험 결과를 표 10 및 도 12d에 도시하였다.
Figure pct00056
12.3 CDX 모델에서 상이한 DAR 값을 갖는 2C6.9-TL001의 인 비보 효험의 비교
NUGC-4 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 RPMI1640 배양 배지로 배양하였다. 지수 성장기의 세포를 수집하고, PBS에 재현탁하고, 암컷 Balb/c 누드 마우스 (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)에 (0.1 mL PBS에 현탁된) 5 × 106 개/마우스의 세포 부피로 피하 접종하여, 피하 이식 종양 모델을 확립하였다. 평균값 종양 부피가 약 70-100 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 종양 부피에 따라 각각의 그룹에 대해 7 마리의 마우스로 무작위로 그룹화하였다. 그룹화 날짜를 0 일차로서 기록하였으며, 그룹은 각자 인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체 (음성 대조군) 그룹 (줄여서 IgG1), 2C6.9-TL001 (DAR: 3.79) 5.25 mg/kg 그룹, 2C6.9-TL001 (DAR: 3.79) 17.5 mg/kg 그룹, 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12) 3 mg/kg 그룹, 및 2C6.9-TL001 (DAR: 7.12) 10 mg/kg 그룹이었다 (상이한 DAR 값을 갖는 ADC 약물을 동일한 독소 로딩으로 설계된 투여량으로 투여하였다). 모든 샘플을 총 3 주 동안 주 2 회 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 투여량을 표 11에 도시하였다.
실험 결과를 표 11 및 도 12e 및 12f에 도시하였다. 동일한 독소 로딩 하에서, 높은 DAR 값 (7.12)을 갖는 2C6.9-TL001의 효험은 기본적으로 약물 투여의 21 일 후 낮은 DAR 값 (3.79)을 갖는 것과 동등하다. 관찰 기간 동안 모든 치료 그룹에서 유의한 체중 손실이 보이지 않았으며, 동물은 잘 용인되었다.
Figure pct00057
12.4 HuPrime ® 위암 GA0006+ Balb/c 누드 마우스 PDX 모델
종양 조직을 HuPrime® 위암 이종이식 모델 GA0006 (Crown Bioscience (Taicang) Inc.; 57-세 여성 환자로부터의 고 발현 Claudin18.2 위 종양)에서 종양-보유 마우스로부터 수집하였으며, 이를 3×3×3 mm 직경 조각으로 절단하고, Balb/c 누드 마우스의 우측 전방 견갑골에 피하 접종하였다. 평균값 종양 부피가 약 150-250 mm3이었을 때, 마우스를 종양 크기에 따라 무작위로 3 개의 그룹, 그룹당 7 마리의 마우스로 나누었고, 그룹화 날짜를 0 일차로서 기록하였다. 인간 IgG1 호모타입 대조군 항체 (음성 대조군) 그룹 (IgG1 10 mg/kg), 2C6.9-TL001-DAR7.12 3 mg/kg 그룹 및 10-mg/kg 그룹의 3 개 그룹이 있었다. 모든 샘플을 꼬리 정맥에 주 2 회 총 5 회 주사하였다. 약물 투여 후, 마우스의 종양 부피 및 체중을 관찰하고, 실시예 12.1에 기재된 방식으로 정규적으로 측정하였다.
표 12 및 도 12g 및 12h의 실험 결과는 2C6.9-TL001-DAR7.12가 용량-의존적 방식으로 GA0006 위암 PDX 모델의 종양 성장에 대해 유의한 억제 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 음성 대조군과 비교하여, 3-mg/kg 그룹의 종양 억제율 (TGI)은 5 개의 용량 후 (17 일차) 최대 94.72%였으며, 4 마리 마우스의 종양은 부분적으로 누그러졌다(subsided). 10-mg/kg 그룹의 TGI는 124.49%로 높았고, 7 마리 마우스의 종양은 모두 누그러져, 2C6.9-TL001이 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. 관찰 기간 동안 모든 치료 그룹에서 유의한 체중 손실이 보이지 않았으며, 동물은 잘 용인되었다.
Figure pct00058
실험 결과를 표 13 및 도 12i 및 12j에 도시하였다. 투여 후 24 일차에, 2C6.9-TL001-DAR7.12는 GA0006 위암의 PDX 모델에서 종양 성장의 유의한 및 용량-의존적 억제를 나타내었다. 음성 대조군과 비교하여, 3-mg/kg 그룹의 종양 억제율 (TGI)은 최대 103.76%였으며, 6 마리 마우스의 종양은 부분적으로 퇴행하였으며: 10 mg/kg 그룹의 TGI는 113.70%에 도달하였고, 7 마리 마우스의 종양은 모두 퇴행하여, 2C6.9-TL001이 종양 성장을 효율적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. 관찰 기간 동안 모든 치료 그룹에서 유의한 체중 손실이 보이지 않았으며, 동물은 잘 용인되었다.
Figure pct00059
12.5 Balb/c 누드 마우스 CDX 모델에서 NCI-N87-Claudin18.2에 대한 인 비보 효험 평가
NCI-N87-Claudin18.2 피하 이식 종양 모델을 실시예 12.1의 방법에 따라 확립하였다. 평균값 종양 부피가 약 140 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 종양 부피에 따라 각각의 그룹에 대해 8 마리의 마우스로 무작위로 그룹화하였다. 그룹화 날짜를 0 일차로 기록하였으며, 그룹은 각자 인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체 (음성 대조군) 그룹 (줄여서 IgG1), 2C6.9-TL001 (DAR: 7.40) 0.3 mg/kg 그룹, 1 mg/kg 그룹 및 3 mg/kg 그룹이었다. 모든 샘플을 꼬리 정맥에 주 2 회, 총 6 회 주사하였으며, 투여량은 표 14에 도시하였다.
결과를 표 14 및 도 12k 및 12l에 도시하였다. 약물 중단 후 31 일차까지 관찰을 연장하였을 때, 음성대조군과 비교하여, 2C6.9-TL001 0.3 mg/kg 그룹의 종양억제율 (TGI)은 34.04%였던 반면, 1 mg/kg 및 3 mg/kg 그룹의 TGI는 각자 최대 122.57% (모든 마우스에서 부분적 종양 퇴행이 관찰됨) 및 184.22% (4 마리의 마우스에서 전체 종양 퇴행이 관찰되었고, 4 마리의 마우스에서 부분적 종양 퇴행이 관찰됨)였다. 관찰 기간 동안 모든 치료 그룹에서 유의한 체중 손실이 보이지 않았으며, 동물은 잘 용인되었다.
표 14: Balb/c 누드 마우스 CDX 모델에서 NCI-N87-Claudin18.2에 대한 인 비보 효능 평가
Figure pct00060
12.6 Balb/c 누드 마우스 CDX 모델에서 HEK293T-Claudin18.2에 대한 인 비보 효험 평가
HEK293T-Claudin18.2 세포 (인간 배아 신장 세포)를 3 μg/mL 퓨로마이신 및 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 DMEM 배지와 함께 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 지수 성장기의 세포를 수집하고, PBS에 재현탁하고, 암컷 Balb/c 누드 마우스 (Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology Co.,　Ltd.)에 (0.1 mL PBS에 현탁된) 1 × 107 개/마우스의 세포 부피로 피하 접종하여, 피하 이식 종양 모델을 확립하였다. 평균값 종양 부피가 약 120-140 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 종양 부피에 따라 각각의 그룹에 대해 8 마리의 마우스로 무작위로 그룹화하였다. 그룹화 날짜를 0 일차로서 기록하였으며, 그룹은 각자 인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체 (음성 대조군) 그룹 (IgG1로서 지칭됨), 2C6.9-TL001 (DAR: 7.40) 0.3 mg/kg 그룹, 1 mg/kg 그룹 및 3 mg/kg 그룹이였다. 모든 샘플을 꼬리 정맥에 주 2 회, 총 6 회 주사하였으며, 투여량은 표 15에 도시하였다.
결과를 표 15 및 도 12m 및 12n에 도시하였다. 음성 대조군과 비교하여, 2C6.9-TL001 (DAR: 7.40)은 6 개의 용량 후 (제1 용량 후 21 일차) HEK293T-Claudin18.2 인간 배아 신장 세포 이식 종양 모델에서 종양 성장의 유의한 및 용량-의존적 억제를 나타내었다. 2C6.9-TL001 0.3 mg/kg 그룹의 종양 억제율 (TGI)은 70.99% (총 종양 퇴행은 1 마리 마우스에서 관찰됨)였던 반면, 1 mg/kg 및 3 mg/kg 그룹의 TGI는 각자 94.98% (2 마리 마우스에서 부분적 종양 퇴행이 관찰됨) 및 182.81% (2 마리 마우스에서 부분적 종양 퇴행이 관찰되었고, 6 마리 마우스에서 전체 종양 퇴행이 관찰됨)였다.
Figure pct00061
12.7 Balb/c 누드 마우스 CDX 모델에서 NUGC-4에 대한 인 비보 효험 평가
NUGC-4 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 RPMI1640 배지로 배양하였다. 지수 성장기의 세포를 수집하고, PBS에 재현탁하고, 암컷 Balb/c 누드 마우스 (Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology Co.,　Ltd.)에 (0.1 mL PBS에 현탁된) 5 x 106 개/마우스의 세포 부피로 피하 접종하여, 피하 이식 종양 모델을 확립하였다. 평균값 종양 부피가 약 80 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 종양 부피에 따라 각각의 그룹에 대해 8 마리의 마우스로 무작위로 그룹화하였다. 그룹화 날짜를 0 일차로서 기록하였고, 그룹은 각자 인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체 (음성 대조군) 그룹 (IgG1로서 지칭됨), 2C6.9-TL001 (DAR: 7.40) 3 mg/kg 그룹, 10 mg/kg 그룹이었다. 모든 샘플을 꼬리 정맥에 주 2회, 총 6 회 주사하였으며, 투여량을 표 16에 도시하였다.
결과를 표 16 및 도 12o 및 12p에 도시하였다. 음성 대조군과 비교하여, 2C6.9-TL001 (DAR: 7.40)은 NUGC-4 위암 이식 종양 모델에서 6 개의 용량 후 (제1 용량 후 21 일차) 종양 성장의 유의한 및 용량-의존적 억제를 나타냈다. 2C6.9-TL001 3 mg/kg 그룹은 56.62%의 종양 억제율 (TGI)을 나타낸 반면, 10 mg/kg 그룹의 TGI는 90.28% (2 마리의 마우스에서 부분적 종양 퇴행이 관찰됨)였다.
Figure pct00062
결론적으로, 2C6.9-TL001은 CDX 모델 또는 PDX 모델에서 Claudin18.2 양성 종양의 성장을 용량 의존적으로 효과적으로 억제할 수 있으며, 사용하기에 안전하다.
본 발명의 실시양태가 상세하게 설명되었지만, 당업자는 모든 개시내용의 교시의 지침에 따라, 세부사항의 변형 및 변동이 이루어질 수 있고, 이러한 모든 변화는 모두 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 범주는 본원에 첨부된 청구범위 및 이의 임의의 등가물에 의해 주어진다.
SEQUENCE LISTING <110> SICHUAN KELUN-BIOTECH BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ANTIBODY DRUG CONJUGATE, PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF <130> IEC200155PCT <150> 202010410633.5 <151> 2020-05-15 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IMGT 2C6.9 CDR-H1 <400> 1 Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IMGT 2C6.9 CDR-H2 <400> 2 Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IMGT 2C6.9 CDR-H3 <400> 3 Ala Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IMGT 2C6.9 CDR-L1 <400> 4 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IMGT 2C6.9 CDR-L2 <400> 5 Trp Ala Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IMGT 2C6.9 CDR-L3 <400> 6 Gln Asn Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> artificial 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Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 117 <212> PRT <213> 훙묏埼죗 <220> <223> heavy chain variable region of humanized antibody 2C6.9-hz21 <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213> artificial <220> <223> light chain variable region of humanized antibody 2C6.9-hz11/2C6.9-hz21 <400> 15 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 16 <211> 330 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Human IgG1 heavy chain constant region <400> 16 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Human ┟ light chain constant region <400> 17 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 18 <211> 447 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Full length amino acid sequence of heavy chain of humanized antibody 2C6.9-hz11 <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 19 <211> 447 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Full length amino acid sequence of heavy chain of humanized antibody 2C6.9-hz21 <400> 19 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 20 <211> 220 <212> PRT <213> aritificial <220> <223> Full length amino acid sequence of light chain of humanized antibody 2C6.9-hz11/2C6.9-hz21 <400> 20 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IMGT 2C6.9 CDR-H2 (after modification) <400> 21 Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> AbM 2C6.9 CDR-H2 (after modification) <400> 22 Val Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr Asn 1 5 <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> heavy chain variable region of murine antibody 2C6.9M <400> 23 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Ser Phe Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 113 <212> PRT <213> artificial <220> <223> light chain variable region of murine antibody 2C6.9M <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Glu Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys

Claims (24)

  1. 구조가 하기 화학식 (I)로 표시되는, 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)로서,
    (D-L)γ-A
    화학식 (I)
    여기서, D는 생체활성 분자의 단편이고; L은 링커이고;
    γ는 1 내지 10의 정수이고; 바람직하게는, γ는 1 내지 8의 정수 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)이고;
    A는 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
    (1) 다음의 VH 및/또는 VL이되, 여기서 CDR은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의되며,
    (1-1): 다음의 3 개의 CDR을 포함하는 VH: 서열번호 1의 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 2 또는 21의 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDR-H3; 및/또는
    다음의 3 개의 CDR을 포함하는 VL: 서열번호 4의 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 5의 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDR-L3;
    또는
    (1-2): (1-1)에 기재된 VH 또는 VL과 비교하여, 하나 이상의 CDR이 돌연변이를 함유하며, 이는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 1, 2 또는 3 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합)이고; 돌연변이를 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 여전히 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합할 수 있는, VH 및/또는 VL
    또는
    (2) 다음의 VH 및/또는 VL이되, 여기서 CDR은 AbM 넘버링 시스템에 따라 정의되며,
    (2-1): 다음의 3 개의 CDR을 포함하는 VH: 서열번호 7의 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 8 또는 22의 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 9의 서열을 갖는 CDR-H3; 및/또는
    다음의 3 개의 CDR을 포함하는 VL: 서열번호 10의 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 11의 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 12의 서열을 갖는 CDR-L3;
    또는
    (2-2): (2-1)에 기재된 VH 또는 VL과 비교하여, 하나 이상의 CDR은 돌연변이를 함유하며, 이는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 1, 2 또는 3 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합)이고; 돌연변이를 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 여전히 인간 CLDN 18.2에 특이적으로 결합할 수 있는, VH 및/또는 VL
    을 포함하며;
    바람직하게는, 치환은 보존적 치환이고;
    바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 및/또는 VL은 인간 또는 뮤린 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR)을 포함하는,
    항체-약물 컨쥬게이트 (ADC).
  2. 제1항에 있어서,
    (1) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 13 또는 14에 제시된 VH; 및/또는 서열번호 15에 제시된 VL을 포함하거나;
    (2) (1)에 기재된 VH와 비교하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 포함된 VH가 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 갖고/갖거나; (1)에 기재된 VL과 비교하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 포함된 VL이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 갖거나;
    (3) (1)에 기재된 VH와 비교하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 포함된 VH가 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합)을 갖고/갖거나; (1)에 기재된 VL과 비교하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 포함된 VL이 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합)을 갖고; 바람직하게는, 치환이 보존적 치환인,
    ADC.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항체가
    (1) 인간 면역글로불린의 CH (중쇄 불변 영역) 또는 이의 변이체이되, 여기서 변이체가 이것이 유래된 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예를 들어, 최대 20 개, 최대 15 개, 최대 10 개, 또는 최대 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가; 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 포함하는, 인간 면역글로불린의 CH (중쇄 불변 영역) 또는 이의 변이체; 및/또는
    (2) 인간 면역글로불린의 CL (경쇄 불변 영역) 또는 이의 변이체이되, 여기서 변이체가 이것이 유래된 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예를 들어, 최대 20 개, 최대 15 개, 최대 10 개, 또는 최대 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가; 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 포함하는, 인간 면역글로불린의 CL (경쇄 불변 영역) 또는 이의 변이체
    를 포함하며,
    바람직하게는, CH가 IgG 중쇄 불변 영역, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역이고;
    바람직하게는, 항체가 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 항체가 서열번호 16에 제시된 CH, 또는 서열번호 16과 비교하여 최대 20 개의 아미노산의 보존적 치환 (예를 들어, 최대 15, 10 또는 5 개의 아미노산의 보존적 치환; 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 보존적 치환)을 갖는 이의 변이체를 포함하고;
    바람직하게는, CL이 경쇄 κ의 불변 영역이고;
    바람직하게는, 항체가 서열번호 17에 제시된 CL, 또는 서열번호 17과 비교하여 최대 20 개의 아미노산의 보존적 치환 (예를 들어, 최대 15, 10 또는 5 개의 아미노산의 보존적 치환; 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 보존적 치환)을 갖는 이의 변이체를 포함하고;
    보다 바람직하게는, 항체가 서열번호 16에 제시된 CH 및/또는 서열번호 17에 제시된 CL을 포함하는,
    ADC.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가
    (1) 서열번호 13에 제시된 서열의 VH 및 서열번호 16에 제시된 서열의 CH를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 15에 제시된 서열의 VL 및 서열번호 17에 제시된 서열의 CL을 포함하는 경쇄;
    또는
    (2) 서열번호 14에 제시된 서열의 VH 및 서열번호 16에 제시된 서열의 CH를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 15에 제시된 서열의 VL 및 서열번호 17에 제시된 서열의 CL을 포함하는 경쇄
    인, ADC.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이
    (1) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄:
    (1-1) 서열번호 18 또는 서열번호 19에 제시된 서열;
    (1-2) 서열번호 18 또는 서열번호 19에 제시된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는
    (1-3) 서열번호 18 또는 서열번호 19에 제시된 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 갖는 서열;
    및
    (2) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄:
    (2-1) 서열번호 20에 제시된 서열;
    (2-2) 서열번호 20에 제시된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는
    (2-3) 서열번호 20에 제시된 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 갖는 서열
    을 포함하며,
    바람직하게는, (1-2) 및 (2-2)에 기재된 치환이 보존적 치환인,
    ADC.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 ScFv, Fab, Fab', (Fab')2, Fv 단편, 디설파이드 결합-연결된 Fv (dsFv), 디아바디, 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체로부터 선택되는, ADC.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 화학식 (II)로 표시된 구조를 가지며,
    {D-[L1-(L2)m1-(L3)m2-(L4)m3-E]}γ-A
    화학식 (II)
    여기서,
    L1이
    Figure pct00063
    이고, 여기서 R1 및 R2가 각각 독립적으로 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소), 할로겐, 카복실산 기, 설폰산 기, 시아노, C1-6 알킬, 할로겐화된 C1-6 알킬, 시아노-치환된 C1-6 알킬 (예컨대, -CH2CN), C1-6 알콕시, C2-10 알케닐 또는 C2-10 알키닐이고; Z1이 아미노산 또는 2-10 개의 아미노산으로 구성된 펩티드이고; x1 및 x2가 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; L1이 위치 1에서 D에 연접되고, 위치 2에서 L2에 연접되며;
    L2가
    Figure pct00064
    이고, 여기서 y1이 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고; L2가 위치 1에서 L1에 연접되고, 위치 2에서 L3에 연접되며;
    L3이 5-12 원 방향족 헤테로사이클로부터 선택되고;
    L4가
    Figure pct00065
    이고, 여기서 Z2가 C1-6 알킬렌, C2-10 알케닐렌, C2-10 알키닐렌 및 C3-8 사이클로알킬렌으로부터 선택되고; R3이 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소) 및 C1-6 알킬로부터 선택되고; Z3이 존재하지 않거나, C1-6 알킬렌으로부터 선택되고; 대안적으로, R3 및 Z3이 이들이 부착된 질소 원자와 함께 4-8 원 헤테로사이클릴을 형성하고; α가 0,1,2,3,4,5 또는 6이고, L4가 위치 2에서 E에 연접되고, 위치 1에서 L3에 연접되며;
    E는
    Figure pct00066
    이고, 여기서 각각의 R4가 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소)이고, β가 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고, E가 위치 2에서 A에 연접되고, 위치 1에서 L4에 연접되며;
    m1, m2 및 m3이 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
    A가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고;
    D 및 γ가 제1항에 정의된 바와 같은,
    ADC.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 화학식 (III)으로 표시된 구조를 가지며,
    {D-[(L1')m4-L1-(L5)m5-(L3)m2-(L4)m3-E]}γ-A
    화학식 (III)
    여기서
    L1'가
    Figure pct00067
    이고, 여기서 R5 및 R6이 각각 독립적으로 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소) 또는 C1-6 알킬이고; x3이 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; L1'가 존재하는 경우, 위치 1에서 D와 연접하고, 위치 2에서 L1과 연접하며;
    L1이
    Figure pct00068
    이고, 여기서 R1 및 R2가 각각 독립적으로 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소), 할로겐, 카복실산 기, 설폰산 기, 시아노, C1-6 알킬, 할로겐화된 C1-6 알킬, 시아노-치환된 C1-6 알킬 (예컨대, -CH2CN), C1-6 알콕시, C2-10 알케닐 또는 C2-10 알키닐이고; Z1이 아미노산 또는 2-10 개의 아미노산으로 구성된 펩티드이고; x1 및 x2가 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; 위치 1에서, L1이 위치 1에서 (L1'가 존재할 때) L1' 또는 위치 1에서 (L1'가 존재하지 않을 때) D에 연접되고; L1이 위치 2에서 L5에 연접되며;
    L5가
    Figure pct00069
    이고, 여기서 R7이 수소 또는 C1-6 알킬이거나, R7이 이의 γ-C 상의 N 원자에 연접되어, 5-6 원 헤테로사이클릴을 형성하고; x4가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; y1이 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고; L5가 위치 1에서 L1에 연접되고, 위치 2에서 L3에 연접되며;
    L3이 5-12 원 방향족 헤테로사이클로부터 선택되고;
    L4가
    Figure pct00070
    이고, 여기서 Z2가 C1-6 알킬렌, C2-10 알케닐렌, C2-10 알키닐렌 및 C3-8 사이클로알킬렌으로부터 선택되고; R3이 수소 (예컨대, 프로튬 및 중수소) 및 C1-6 알킬로부터 선택되고; Z3이 존재하지 않거나, C1-6 알킬렌으로부터 선택되거나; 또는, R3 및 Z3이 이들이 부착된 질소 원자와 함께 4-8 원 헤테로사이클릭 라디칼을 형성하고; α가 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; L4가 위치 2에서 E에 연접되고, 위치 1에서 L3에 연접되며;
    E가
    Figure pct00071
    이고, 여기서 각각의 R4가 독립적으로 수소 (예컨대, 프로튬 또는 중수소)이고, β가 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며, E가 위치 2에서 A에 연접되고, 위치 1에서 L4에 연접되며;
    m1, m2, m3 및 m4가 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
    A가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고;
    D 및 γ가 제1항에 정의된 바와 같은,
    ADC.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    L1이
    Figure pct00072
    이고, 여기서 Z1이 아미노산 또는 2-5 개의 아미노산으로 구성된 펩티드이고, 아미노산이 Lys, Cit, Val, D-Val, Phe, Leu, Gly, Ala 및 Asn으로부터 선택되며; 바람직하게는, Z1이 Cit, Lys, Cit-Val 및 Ala-Val로부터 선택되고;
    바람직하게는, L1이
    Figure pct00073
    이고;
    바람직하게는, L1이
    Figure pct00074
    인,
    ADC.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    L2가
    Figure pct00075
    이고, m1이 1인, ADC.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    L3이 5-6 원 방향족 헤테로사이클이고, m2가 1이며; 바람직하게는, L3이 트리아졸이고, m2가 1인, ADC.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    L4가
    Figure pct00076
    이고, Z2가 C1-6 알킬렌이고, Z3이 C1-6 알킬렌이고; m3이 1이며;
    바람직하게는 L4가
    Figure pct00077
    이고, m3이 1인,
    ADC.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    L1'가
    Figure pct00078
    인, ADC.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    L5가
    Figure pct00079
    이고, 여기서 x4가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; y1이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이며;
    바람직하게는, L5가
    Figure pct00080
    인,
    ADC.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    D가
    Figure pct00081
    ,
    Figure pct00082
    또는
    Figure pct00083
    이며;
    바람직하게는, D가
    Figure pct00084
    인,
    ADC.
  16. 제7항에 있어서,
    상기 화학식 (II)의 D-[L1-(L2)m1-(L3)m2-(L4)m3-E]-가
    Figure pct00085
    인, ADC.
  17. 제8항에 있어서,
    상기 화학식 (III)의 D-[(L1')m4-L1-(L5)m5-(L3)m2-(L4)m3-E]-가
    Figure pct00086
    또는
    Figure pct00087
    인, ADC.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00088

    Figure pct00089

    Figure pct00090

    로부터 선택되며,
    여기서, γ가 1 내지 10의 정수이고; 예를 들어, γ가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인,
    ADC.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 표지를 갖고; 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 검출가능한 표지, 예컨대, 효소 (즉, 홀스래디쉬 퍼옥시다제), 방사성핵종, 형광 염료, 발광 물질 (예컨대, 화학발광 물질) 또는 비오틴을 갖는, ADC.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 ADC를 포함하고, CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 생체활성 분자의 단편의 몰비 (DAR 값)가 1 내지 10의 소수 또는 정수 (예를 들어, 3 내지 8의 소수 또는 정수, 예컨대, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.79, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 6.95, 7.0, 7.03, 7.1, 7.12, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0)인, 조성물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 ADC, 또는 제20항에 따른 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  22. 종양의 예방 및/또는 치료 및/또는 보조 치료용 의약의 제조에 있어서의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 ADC, 제20항에 따른 조성물, 또는 제21항에 따른 약학 조성물의 용도로서,
    임의로, 상기 의약은 추가적인 항-종양 활성 성분을 추가로 포함하고; 바람직하게는, ADC, 조성물 또는 약학 조성물은 추가적인 항-종양 활성 성분과 별도로, 동시에 또는 순차적으로 투여되고; 바람직하게는, 추가적인 항-종양 활성 성분은 생체활성 폴리펩티드 또는 이의 활성 단편, 또는 화학요법 약물이고; 보다 바람직하게는, 생체활성 폴리펩티드는 면역 체크포인트 억제제 (예컨대, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체 및 LAG-3 항체), 또는 사이토카인 (예컨대, 인터페론, IL-2, IL-15, GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-18 및 IL-21)로부터 선택되며; 바람직하게는, 화학요법 약물은 에피루비신, 옥살리플라틴, 카페시타빈, 5-플루오로우라실, 류코보린, 파클리탁셀 및 알부민-결합된 파클리탁셀로부터 선택된 하나 이상인,
    용도.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 종양이 고형 종양, 혈액 종양, 또는 암의 전이성, 불응성 또는 재발성 병변으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 종양 또는 암이 식도암, 위장관암, 췌장암, 갑상선암, 결장직장암, 신장암, 폐암 (예컨대, 비-소세포 폐암, NSCLC), 간암, 위암, 위 선암종, 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 생식세포 종양, 뼈암, 피부암, 흉선암, 담관암종, 담낭암, 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 육종, 교모세포종 및 백혈병으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 종양이 위암, 위 선암종, 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 식도암, 위장관암, 췌장암 및 폐암 (예컨대, NSCLC)으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 종양이 위암, 위 선암종 또는 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 예컨대, 위암, 위 선암종 또는 위식도 접합부 (GEJ) 선암종의 국소 진행성 절제불가능한 또는 전이성 종양이고;
    바람직하게는, 종양이 CLDN 18.2 양성이고, 더 바람직하게는 종양이 HER2 음성인,
    용도.
  24. 대상체에서 종양의 예방 및/또는 치료, 및/또는 종양 진행의 지연, 및/또는 종양 재발의 감소 또는 억제 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC), 제20항에 따른 조성물, 또는 제21항에 따른 약학 조성물의 유효량을 종양의 예방 및/또는 치료, 및/또는 종양 진행의 지연, 및/또는 종양 재발의 감소 또는 억제를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하며;
    임의로, 상기 방법은 대상체에 제2 요법을 적용하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제2 요법은 수술, 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 유전자 요법, DNA 요법, RNA 요법, 나노요법, 바이러스 요법, 보조 요법, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고; 방법 및 제2 요법은 별도로, 조합하여, 동시에 또는 순차적으로 적용되고;
    바람직하게는, 상기 면역요법은 생체활성 폴리펩티드의 투여를 포함하고, 보다 바람직하게는, 생체활성 폴리펩티드는 면역 체크포인트 억제제 (예컨대, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체 및 LAG-3 항체), 또는 사이토카인 (예컨대, 인터페론, IL-2, IL-15, GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-18 및 IL-21)로부터 선택되며;
    바람직하게는, 상기 화학요법은 에피루비신, 옥살리플라틴, 카페시타빈, 5-플루오로우라실, 폴린산, 파클리탁셀 및 알부민-결합된 파클리탁셀로부터 선택된 하나 이상이고;
    바람직하게는, 상기 종양은 고형 종양, 혈액 종양, 및 암의 전이성, 불응성 또는 재발성 병변으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 종양 또는 암은 식도암, 위장관암, 췌장암, 갑상선암, 결장직장암, 신장암, 폐암 (예컨대, NSCLC), 간암, 위암, 위 선암종, 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 생식세포 종양, 뼈암, 피부암, 흉선암, 담관암종, 담낭암, 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 육종, 교모세포종 및 백혈병으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 종양은 위암, 위 선암종, 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 식도암, 위장관암, 췌장암, 폐암 (예컨대, NSCLC)으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 종양은 위암, 위 선암종 또는 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 예컨대, 위암, 위 선암종 또는 위식도 접합부 (GEJ) 선암종의 국소 진행성 절제불가능한 또는 전이성 종양이고;
    바람직하게는, 종양은 CLDN 18.2 양성이고, 보다 바람직하게는 종양은 HER2 음성인,
    방법.
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