JP2023552327A - リボフラビン高産生を有するリモシラクトバチルス・ロイテリ株及びその使用 - Google Patents

リボフラビン高産生を有するリモシラクトバチルス・ロイテリ株及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規な単離された細菌株であるリモシラクトバチルス・ロイテリ株の同定に関し、該リモシラクトバチルス・ロイテリ株は、乳酸桿菌の他の既知の株と比較して、リボフラビン（ビタミンB2）の自然発生的な過剰産生を特徴とする。上記リモシラクトバチルス種の菌株は、受託番号LMGP-32020で寄託される。更なる態様において、上記L.ロイテリ株の使用も本明細書に開示される。特に、食品産業及び飼料産業、ヒト及び獣医学分野における健康、大規模なビタミン生産、化粧品並びに消費者ケア製品における上記菌株の使用が開示される。【選択図】図1

Description

本発明は、新規な単離された細菌株であるリモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillusreuteri）株の同定に関し、該リモシラクトバチルス・ロイテリ株は、乳酸桿菌（lactobacilli）の他の既知の株と比較して、リボフラビン（ビタミンB2）の自然発生的な過剰産生を特徴とする。上記リモシラクトバチルス種の菌株は、受託番号LMGP-32020で寄託される。更なる態様において、上記L.ロイテリ（L. reuteri）株の使用も本明細書に開示される。特に、食品産業及び飼料産業、ヒト及び獣医学分野における健康、大規模なビタミン生産、化粧品並びに消費者ケア製品における上記菌株の使用が開示される。
リボフラビン（ビタミンB2）は、多量栄養素及びエネルギー代謝（脂肪、タンパク質、及び炭水化物）に関与し、抗酸化機能を有し、葉酸及びピリドキシン等の他のビタミンを活性化する必須の水溶性黄緑色蛍光ビタミンである。リボフラビンは全ての生命体に必要とされており、ヒトでは生殖機能、授乳、妊娠の成功、子供の発達、及び適切なエネルギーレベルにとって重要である。現在の平均必要量は、欧州食品安全機関（EFSA、2017、EFSA-Q-2011-01222）によって定義されているように、子供では0.5mgリボフラビン／日～1.4 mgリボフラビン／日、成人では1.3 mg/日である。オレゴン州立大学によると、女性は、妊娠中は1日当たり1.4ミリグラム、授乳中は1日当たり1.6ミリグラムを摂るべきである（https://lpi.oregonstate.edu/mic/vitamins/riboflavin）。さらに、リボフラビン欠乏症は、皮膚の損傷、のどの痛み、口腔及び粘膜の浮腫、口唇症及び舌炎を引き起す可能性がある。リボフラビンの摂取は、これらの症状を逆転させ、黄色ブドウ球菌（Staphylococcusaureus）感染症等の一般的なウイルス及び細菌の感染性疾患に対する標準療法の効率を更に向上させることができる（非特許文献1）。EFSA Panel onDietetic Products, Nutrition and Allergies（NDA）（2010）の科学的見解に基づいて、リボフラビン源である食品のEU登録における認可された健康強調表示は、エネルギーを生み出す正常な代謝への寄与、正常な神経系機能の維持、正常な皮膚及び粘膜の維持、正常な赤血球の維持、正常な視力の維持、正常な鉄の代謝への寄与、酸化的損傷からのDNA、タンパク質及び脂質の保護、疲れ及び疲労の軽減を含む（2012年5月16日付け欧州委員会規則（EU）432/2012）。リボフラビンは、動物の健康を改善するために動物飼料にも使用されており、欧州では食品添加物E番号E101の食品着色料として使用されている。
大規模な産業環境では、リボフラビンは従来、化学合成によって製造されていた。しかしながら、ここ数十年の間に、経済的及び環境的配慮から、リボフラビンの微生物合成が実施されるようになってきている。リボフラビンは、天然の過剰産生微生物、主に糸状真菌及び酵母（エレモテシウム・アシュビイ（Eremotheciumashbyii）、アシビア・ゴシピイ（Ashbya gossypii）及びカンジダ・ファマタ（Candida famata））、及び枯草菌（Bacillussubtilis）変異体から得ることができる（非特許文献2、非特許文献3）。乳酸菌がリボフラビンを産生することは以前にも示されているが（非特許文献4）、これまでに報告された乳酸菌株は、例えば最大2.3μg/ml培養培地～3 μg/ml培養培地の範囲の限られた量のリボフラビンしか産生しない（非特許文献5、非特許文献6）。乳酸桿菌におけるリボフラビン産生の増加を刺激する方法が記載されている。しかしながら、これには規定された条件が必要であり、それでも5μg/mL培地～6 μg/mL培地のリボフラビン濃度しかもたらさなかった（非特許文献7）。ribG、ribB、ribA及びribHの遺伝子が過剰発現するように遺伝子改変された組換えラクトコッカス・ラクチス（Lactococcuslactis）NZ9000は、培地1 ml当たり24 μgものリボフラビンを産生することが示されたが、遺伝子改変乳酸桿菌の使用は、規制上の理由から、現在、ヒトが消費する食品製品には許可されていない。リボフラビン濃度は、典型的には、工業プロセスにおいて、例えばエレモテシウム・アシュビイで略26mg/mL～30 mg/mLである。それにもかかわらず、重要な懸念事項は、これらの濃度が糸状真菌及び酵母で得られるものの、ヒトにおいて好ましい安全性プロファイルを有する乳酸桿菌では得られないということである。乳酸菌は、すでに食品産業において、又はプロバイオティクス製剤として広く導入されている（例えば、リモシラクトバチルス・ロイテリRC-14及びラクチカゼイバチルス・ラムノーサス（Lacticaseibacillusrhamnosus）GG）。したがって、ビタミン産生を増強することができる乳酸桿菌は、食品、飼料及び様々なプロバイオティクス製剤、サプリメント、更には医薬品のビタミン強化にとって非常に興味深いものである。前述の乳酸桿菌における自然発生的なリボフラビン濃度は、子供及び成人の現在の平均必要量を考慮すると、大規模な工業生産又は食品発酵のニーズを満たすものではないと考えられる。
したがって、リボフラビンを自然に過剰産生する乳酸桿菌は、費用効果が高く安全な食品強化ソリューション、又はプロバイオティクス製品若しくはポストバイオティクス製品を提供することによって、ヒト及び動物におけるリボフラビン欠乏症を予防又は処置することができる。ヒト及び動物へのそれらの投与は、全身及び／又は粘膜免疫の健康、病原体に対する抵抗性、多量栄養素／エネルギー代謝及び抗酸化機能、並びに生殖及び子孫の健康を改善することができる。
Dey and Bishayi, 2016 Lim etal., 2001 Stahmann et al., 2000 Thakur et al, 2016 Thakur and Tomar, 2015 Jayashree et al., 2010 Juarez del Valle et al., 2017
本発明は、リボフラビンの産生の増加を示す新規なリモシラクトバチルス菌株の同定に基づく。特に本発明者らは、上記リモシラクトバチルス菌株がリボフラビン経路に関連する遺伝子の変化を有することを見出した。より具体的には、本発明は、リモシラクトバチルス・ロイテリ（L.ロイテリ）種の新規単離株の同定に基づく。該菌株は、2020年10月9日付けで受託番号LMGP-32020により、Belgian Co-ordinated Collection of Micro-Organisms（BCCM）（UniversiteitGent, K.L.Ledeganckstraat 35, 9000 Gent, Belgium）に寄託されており、本明細書では更に、L.ロイテリAMBV339又はAMBV339株とも示す。
通常、L.ロイテリ種のこの新規単離株は、ビタミンB2としても知られるリボフラビンの自然発生的な過剰産生を有する。特に、AMBV339株は、特に乳酸桿菌の他の既知の菌株と比較して、高レベルのリボフラビンを産生することができる。
したがって、第1の態様において、本出願はこのように、リボフラビンの自然発生的な過剰産生を有する1つ以上の単離されたリモシラクトバチルス細菌株に関する。特に、本出願は、リボフラビン産生経路に関連する1つ以上の遺伝子又は調節遺伝子配列における変化を有する1つ以上の単離されたリモシラクトバチルス細菌株を開示する。特定の実施の形態において、本発明の上記菌株は、その1つ以上の遺伝子又は上流調節配列において、リモシラクトバチルス・ロイテリタイプ株DSM20016の対応する遺伝子又はその調節配列と比較して変化を有する。別の特定の実施の形態において、上記遺伝子は、3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン4-リン酸合成酵素（EC4.1.99.12）及び／又はGTPシクロヒドロラーゼII（EC 3.5.4.25）、ジアミノヒドロキシホスホリボシルアミノピリミジンデアミナーゼ（EC3.5.4.26）及び／又は5-アミノ-6-（5-ホスホリボシルアミノ）ウラシルレダクターゼ（EC 1.1.1.193）、6,7-ジメチル-8-リビチルルマジン合成酵素（EC2.5.1.78）、リボフラビン合成酵素真正細菌／真核生物（EC 2.5.1.9）、FMNアデニリルトランスフェラーゼ（EC 2.7.7.2）及び／又はリボフラビンキナーゼ（EC2.7.1.26）、RibTタンパク質、リボフラビン生合成アセチルトランスフェラーゼ（GNAT）ファミリー、又はリボフラビンECFトランスポーターの基質特異的成分RibUに対する遺伝子から選択される。
特に、かかる調節遺伝子配列は、プロモーター、リボスイッチ、又はそれらが属する上記遺伝子又は遺伝子オペロンの上流にある他の調節配列から選択される。具体的な実施の形態において、本出願は、リボフラビン産生に関与する遺伝子又は遺伝子オペロン、特に、ribDとしても知られるジアミノヒドロキシホスホリボシルアミノピリミジンデアミナーゼ（EC3.5.4.26）及び／又は5-アミノ-6-（5-ホスホリボシルアミノ）ウラシルレダクターゼ（EC 1.1.1.193）、ribEとしても知られるリボフラビン合成酵素真正細菌／真核生物（EC2.5.1.9）、ribBAとしても知られる3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン4-リン酸合成酵素（EC 4.1.99.12）及び／又はGTPシクロヒドロラーゼII（EC3.5.4.25）、及び／又はribHとしても知られる6,7-ジメチル-8-リビチルルマジン合成酵素（EC 2.5.1.78）に対する遺伝子の上流にある調節領域において変化を有する1つ以上の単離されたリモシラクトバチルス細菌株を開示する。
非常に具体的な実施の形態において、本発明の上記菌株は、上記タイプ株のゲノムアセンブリNC_009513.1における塩基931824の変化を含み、特に該変化は、グアニンからチミンへの変化である。
より具体的には、リボフラビン産生経路に関連する1つ以上の遺伝子又は該遺伝子の上流にある調節配列における変化を示す、単離されたリモシラクトバチルス細菌株は、リモシラクトバチルス・ロイテリ（L.ロイテリ）種であり、該菌株は受託番号LMGP-32020でBCCMに寄託される。
更なる態様において、本出願は、リモシラクトバチルス・ロイテリ（L.ロイテリ）種の単離された細菌株を提供し、該菌株は受託番号LMGP-32020でBCCMに寄託される。
本出願の実施の形態によれば、単離された細菌株の細菌は、活性成分が破壊されない限り、懸濁液中に、凍結乾燥された状態で、噴霧乾燥された状態で、生存状態若しくは不活発（inanimate）／ポストバイオティクス形態で、又はプレバイオティクス製剤若しくはシンバイオティクス製剤中に存在する。
別の更なる実施の形態において、本出願は、受託番号LMG P-32020で寄託されたL.ロイテリ種の単離された細菌株を含む組成物を提供する。更なる実施の形態において、上記組成物は、1つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、着香剤、又は担体を含む。また更なる実施の形態において、上記組成物は、任意に、他のプロバイオティクス細菌を含むことができる。
本出願の実施の形態によれば、組成物は、組成物1グラム当たり103コロニー形成単位（CFU）～1011CFUの範囲の量の細菌を含む。
本出願は、単離された細菌株L.ロイテリAMBV339がリボフラビンの自然発生的な過剰産生を示すという知見に基づく。したがって、実施の形態において、本出願の単離された細菌株又は組成物は、対象におけるリボフラビンレベルの低下に関連する疾患の処置及び／又は予防における使用のためのものである。更なる態様において、リボフラビンレベルの低下に関連する上記疾患は、神経系の疾患、皮膚疾患、呼吸器疾患、赤血球レベルの低下に関連する疾患、眼疾患、鉄の代謝障害に関連する疾患、酸化ストレスに関連する疾患、全身疲労又は一般的な病気（generalillness）、泌尿生殖器疾患、代謝性疾患（例えば、ビタミンレベルの低下に関連する）、頭痛又は片頭痛、妊娠、胃腸疾患、免疫疾患、癌、並びに関連するウイルス性、真菌性及び細菌性の感染症を含む群から選択される。より具体的には、本発明の単離された細菌株又は組成物は、リボフラビンレベルの低下に関連する疾患の処置及び／又は予防における使用のためのものである。
或いは、本発明の上記菌株又は組成物は、腸内細菌叢ディスバイオシスの予防若しくは処置、腸内細菌叢の回復力の促進、及び／又は健康に関連する腸内分類群（guttaxa）の促進における使用に適している。
別の態様において、本発明による単離された細菌株又は組成物の非治療的使用は、全身疲労の予防及び／又は軽減について開示される。
更に別の態様において、本発明による単離された細菌株又は組成物の非治療的使用が、化粧品又はパーソナルケア製品において開示される。
別の実施の形態によれば、リボフラビンの製造方法における本発明による単離された細菌株又は組成物の使用が開示される。特に、該リボフラビンの製造方法は発酵プロセスである。
別の態様において、プロバイオティクス若しくはポストバイオティクスとして、又はプレバイオティクス若しくはシンバイオティクス製剤における、本発明の実施の形態のいずれかによる単離された細菌株又は組成物の使用が開示される。例えば、経口又は局所のプロバイオティクス製剤又はポストバイオティクス製剤で投与することができる。
更に別の態様において、食品産業又は飼料産業における、本発明の実施の形態のいずれかによる単離された細菌株又は組成物の使用が開示される。
別の態様において、食品産業若しくは飼料産業における着色剤として、又はスターター培養物としての、本発明の実施の形態のいずれかによる単離された細菌株又は組成物の使用が開示される。
別の実施の形態によれば、本出願は、リボフラビンの製造方法を提供する。該方法は、本出願の実施の形態による細菌株又は組成物を、リボフラビンの産生を可能にする条件下、水性媒体中でインキュベートすることを特徴とする。
更なる実施の形態において、上記リボフラビンの製造方法は、a）本発明の実施の形態による細菌株又は組成物を準備する工程と、b）リボフラビンの産生を可能にする条件下、水性培養培地中で該細菌株又は該組成物をインキュベートする工程と、任意に、c）水性培養培地からリボフラビンを単離及び精製する工程とを含む。
ここで図を具体的に参照すると、示される詳細は、例としてであり、本発明の異なる実施の形態の例証的な論考のみを目的としたものであることが強調される。それらは、本発明の原理及び概念的側面の最も有用かつ容易な説明であると考えられるものを提供するために提示される。この点に関して、本発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に本発明の構造的な詳細を示す試みはなされていない。説明は、図面と共に、本発明の幾つかの形態が実際にどのように具現化され得るかを当業者に明らかにするものである。
非リボフラビン過剰産生L.ロイテリ株AMBV336、AMBV337、AMBV368、AMBV369及びAMBV371、並びにタイプ株L.ロイテリDSM20016と比較した、リボフラビン過剰産生L.ロイテリAMBV339におけるグアニンからチミンへの変異を有するL.ロイテリのリボフラビンオペロン（ribD、ribE、ribBA及びribHの遺伝子）の上流にある調節遺伝子間領域の図である。 （同上） L.ロイテリAMBV339によるリボフラビン産生の評価の図である。（A）L.ロイテリAMBV339培養物、無細胞培養上清及び細胞ペレットで定量されたリボフラビンの蛍光特性を、他のL.ロイテリ株及び市販のプロバイオティクス株ラクチカゼイバチルス・ラムノーサスGG及びL.ロイテリRC-14の選択物と比較した。p<0.05は、他の全ての株と比較してAMBV339条件の統計的に有意に高いリボフラビン蛍光を示す。（B及びC）リボフラビン希釈物の標準曲線に対してプロットされた培養物の（B）蛍光及び（C）吸光度に基づくL.ロイテリAMBV339及び他の膣L.ロイテリAMBV336及びAMBV368、並びに市販のプロバイオティクスL.ロイテリRC-14及びL.ラムノーサスGGの培養物中のリボフラビン濃度の定量。MRSにおけるリボフラビン標準曲線の測定値は灰色の円として示され、対応するリボフラビン濃度はx軸に示される。L.ロイテリAMBV339（▲）、AMBV336（▼）、AMBV368（◆）、RC-14（■）及びL.ラムノーサスGG（黒六角形）の蛍光及び吸光度測定値は、リボフラビン標準曲線内にプロットされる。 L.ロイテリAMBV336及びL.ロイテリRC-14と比較した食品マトリックス中の（A）L.ロイテリAMBV339培養物の生育、及び（B）該培養物中において定量されたリボフラビンの蛍光特性。（C）スターターであるストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcusthermophilus）と共培養したL.ロイテリAMBV339において定量されたリボフラビンの蛍光特性。p<0.05は、生育培地条件と比較して、AMBV336、AMBV339又はRC-14条件のリボフラビン蛍光が統計的に有意に高いことを示す。 （A）異なるpHの胃液、又は（B）ヒト便細菌叢を接種した模擬胃腸管の異なる部分におけるL.ロイテリAMBV339の縦断的生存； （C）便条件におけるL.ロイテリAMBV339の微生物群落組成と糞便自体との間のBray-Curtis非類似度（0.9%NaCl及びココナッツミルク）。模擬胃腸管の場合、0.9% NaCl溶液（又は生理食塩水）中のL.ロイテリAMBV339、又はココナッツミルク中のL.ロイテリAMBV339培養物を添加した。データは標準偏差を伴って平均として表示される。
以下、本発明について更に説明する。以下の節においては、本発明の様々な態様をより詳細に定義する。そのように定義された各態様は、逆に明確に示されない限り、任意の単数又は複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利なものとして示される任意の特徴は、好ましい又は有利なものとして示される任意の他の単数又は複数の特徴と組み合わせることができる。
本発明の化合物を記載する場合、使用される用語は、文脈上別様に指示しない限り、以下の定義に従って解釈されるべきである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「a」、「an」、及び「the」は、文脈上別様に指示されない限り、複数の指示対象を含む。例として、「化合物（a compound）」は、1つの化合物又は2つ以上の化合物を意味する。
パラメーター、量、持続時間等の測定可能な値に言及する場合に本明細書において使用される「約（about）」又は「略（approximately）」という用語は、指定された値の+/-10%以下、好ましくは+/-5%以下、より好ましくは+/-1%以下、更により好ましくは+/-0.1%以下の変動を、そのような変動が開示された発明において実施するのに適切である限り、包含することを意味する。「約」又は「略」という修飾語が言及する値は、それ自体も具体的に、かつ好ましく開示されることが理解されるべきである。
本発明は、健康なヒト膣試料から単離された新規なL.ロイテリ株の同定に基づく。
この株は、リボフラビン産生経路に関連する1つ以上の遺伝子又は調節遺伝子配列の変化を特徴とする。新規に単離されたこの細菌株に特異的なことは、天然のリボフラビン過剰産生特性を示すことである。
本発明の文脈において、変化という用語は、本明細書に開示された他のAMBV株又はタイプ株等の比較株と比較したゲノム配列の改変であることを意味する。特に、かかる改変は、菌株のゲノム配列において、変異、欠失、挿入等を構成し得る。
特に、本発明者らは、L.ロイテリAMBV339株が、リボフラビン産生に必要なリボフラビン合成経路遺伝子を含むことを同定した。より具体的には、deMan-Rogosa-Sharpe（MRS）培地又は試験された食品マトリックスにおけるL.ロイテリAMBV339株の生育は、AMBV339培養物が、リボフラビンの存在に対して黄緑色の蛍光特性を呈したことを示し、これは試験された他のL.ロイテリ株には存在しなかった。L.ロイテリAMBV339株の上清中のリボフラビン濃度は、蛍光、吸光度、及びHPLC/UVベースの方法を使用して、略18μgリボフラビン/ml～40 μgリボフラビン/mlで定量した。乳酸菌によるリボフラビン産生に関する従来技術によれば、これらのリボフラビン濃度は、使用される検出方法に応じて、他の乳酸菌株について以前に報告された最大リボフラビン産生レベルよりも少なくとも3倍～20倍高い。
乳酸桿菌は、その発酵及びプロバイオティクスの特性により、食品／飼料用途及びサプリメントによく使用される。実際、L.ロイテリAMBV339株も安全性適格推定（QualifiedPresumption of Safety：QPS）ステータスを持っており、飼料、食品及び健康の用途に直接使用できることを示している。さらに、AMBV339株はまた、試験条件下、一晩で効率的に生育し、高バイオマスをもたらす。
本出願は、したがって、典型的には高レベルのリボフラビン産生を特徴とする、単離された細菌L.ロイテリAMBV339株を提供する。さらに、L.ロイテリAMBV339株を含む組成物も提供される。L.ロイテリAMBV339株は、2020年10月9日に受託番号LMGP-32020でBelgian Co-ordinated Collection of Micro-Organisms（BCCM）に寄託されている。単離されたAMBV339株又は該菌株を含む組成物は、したがって、リボフラビン又はビタミンB2を大量に生産することができる。
本発明の実施形態によれば、単離された細菌AMBV339株の細菌は、活性成分が不活性化されないという条件で、懸濁液中に、凍結乾燥された状態で、噴霧乾燥された状態で、生存状態又はポストバイオティクス、プレバイオティクス若しくはシンバイオティクス形態で提供され得る。本発明の文脈において、「生存状態」、「プロバイオティクス」及び「シンバイオティクス」形態という用語は、細菌が生きている形態について言及するものである。本発明の文脈において、「ポストバイオティクス形態」又は「プレバイオティクス形態」という用語は、細菌又はそれらの分子産物の不活発用途又は間欠滅菌されたものの場合等、細菌が生きていない形態について言及するものである。
本発明の文脈において、以下の定義が使用される:
プロバイオティクス＝適切な量で投与された場合、宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物
ポストバイオティクス＝宿主に健康上の利益をもたらす不活発な微生物及び／又はそれらの成分の調製物
プレバイオティクス＝宿主微生物によって選択的に利用され、健康上の利点をもたらす基質
シンバイオティクス＝宿主に健康上の利益をもたらす、生きた微生物及び宿主微生物によって選択的に利用される基質（複数の場合もある）を含む混合物
単離された細菌株AMBV339を含む組成物も提供される。本発明の組成物の調製は、細菌培養物を凍結乾燥又は噴霧乾燥し、いずれの乾燥した細菌も、水と懸濁状態で、又は更なる適切な賦形剤と共に、及び任意に更なる有効成分を添加して混合することによって実施することができる。
本明細書において使用される場合、「組成物」は、2つ以上の製品又は化合物（例えば、作用物質、モジュレーター、レギュレーター等）の任意の混合物を指す。組成物は、溶液、懸濁液、液体、粉末若しくはペースト、水性若しくは非水性の製剤、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。本発明の文脈において、組成物は、好ましくは、1つ以上の薬学的賦形剤、又は希釈剤、例えば適切な糖、コポリマーPEG/PPG、又は凍結保護剤を含む医薬組成物又は化粧品組成物である。
一実施形態において、上記組成物は、1つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、着香剤、又は担体を含む。かかる組成物において選択され得る賦形剤の例は、ゴム、キサンタン、カルボキシメチルセルロース、シリコーン、ワセリン、白色軟質パラフィン、ステアリン酸マグネシウム、マルトデキストリン、マンニトール、デンプン、グルコース、トレハロース、グリセリン、プロピレングリコール、ラクトース、及び類似のものである。
組成物はまた、タイム又は任意のその抽出物等の着香剤を含み得る。本発明の実施形態によれば、担体は、微生物のバイオアベイラビリティ、安定性及び／又は耐久性の改善を提供する。
組成物は、したがって、微生物のバイオアベイラビリティ、安定性及び耐久性を改善するために、1つ以上の担体を更に含み得る。担体はまた、適切な表面、例えば粘膜表面への細菌株の接着を改善し得る。かかる担体は、例えばS.サリバリウス（S.salivarius）又は乳酸桿菌によって産生される菌体外多糖であり得る。さらに、担体は、例えば温度を上昇させることによって、又は例えばGantrexによって、粘度、ひいては接着性を増加させることができる感熱性ポリマーであり得る。別の実施形態において、担体は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）であり得る。
本発明の実施形態よれば、組成物は、組成物1グラム当たり好ましくは103 CFU～1011CFUの間の範囲内にある量の細菌を含む。
更なる態様において、本発明は、ヒト又は獣医学分野における医薬としての使用のための、本発明による単離された細菌株AMBV339又は該菌株を含む組成物に関する。特に、本発明による単離された細菌株又は組成物は、対象におけるリボフラビンレベルの低下に関連する疾患の処置及び／又は予防における使用のためのものである。別の実施形態において、本発明の単離された細菌株又は組成物は、対象においてリボフラビンの増強が望ましい疾患の処置及び／又は予防における使用のためのものである。更なる態様において、リボフラビンレベルの低下に関連する疾患は、神経系の疾患、皮膚疾患、呼吸器疾患、赤血球レベルの低下に関連する疾患、眼疾患、鉄の代謝障害に関連する疾患、酸化ストレスに関連する疾患、全身疲労又は一般的な病気、泌尿生殖器疾患、代謝性疾患（例えば、ビタミンレベルの低下に関連する）、頭痛又は片頭痛、妊娠、胃腸疾患、免疫疾患、癌、並びに関連するウイルス性、真菌性及び細菌性の感染症を含む群から選択される。より具体的には、本発明の単離された細菌株又は組成物は、リボフラビンレベルの低下に関連する疾患の処置及び／又は予防における使用のためのものである。
別の態様において、本発明は、単離された細菌株AMBV339又は該菌株を含む組成物を対象に投与することによる、対象における疾患の処置方法に関する。特に、疾患は、リボフラビンの増強が望ましい疾患から選択することができる。更なる態様において、リボフラビンレベルの低下に関連する上記疾患は、神経系の疾患、皮膚疾患、呼吸器疾患、赤血球レベルの低下に関連する疾患、眼疾患、鉄の代謝障害に関連する疾患、酸化ストレスに関連する疾患、全身疲労又は一般的な病気、泌尿生殖器疾患、代謝性疾患（例えば、ビタミンレベルの低下に関連する）、頭痛又は片頭痛、妊娠、胃腸疾患、免疫疾患、癌、並びに関連するウイルス性、真菌性及び細菌性の感染症を含む群から選択される。より具体的には、本発明は、単離された細菌株AMBV339又は該菌株を含む組成物を対象に投与することによる、対象におけるリボフラビンレベルの低下に関連する疾患の処置方法に関する。
「処置（treatment）」、「処置すること（treating）」、「処置する（treat）」等の用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的な効果を得ることを指す。その効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという点で予防的なものであってもよく、及び／又は、疾患及び／又は疾患に起因する有害作用の部分的又は完全な安定化又は治癒という点で治療的なものであってもよい。「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる処置を対象とし、（a）疾患若しくは症状の素因があり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患若しくは症状が生じるのを防ぐこと、（b）疾患の症状を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、又は（c）疾患症状を緩和すること、すなわち疾患若しくは症状の退行を引き起こすことを含む。本発明の文脈において、「予防」等の用語は、疾患又は病態が起こるのを防ぐことを指す。本発明の文脈において、「免疫調節」という用語は、免疫応答を所望のレベル及び／又は方向に変化させるプロセスを指す。
更なる態様において、本発明の単離された細菌株又は組成物を、全身疲労の非治療的軽減及び／又は予防に使用することができる。したがって、本出願はまた、全身疲労又は全身衰弱の予防及び／又は軽減のための本発明の単離された細菌株又は組成物の非治療的使用を提供する。「非治療的」等の用語は、非疾患の状況において、したがって疾患の何らかの徴候が対象に存在する前に所望の生理学的効果を得ることを指す。別の態様において、本発明の単離された細菌株又は組成物の使用は、リボフラビンの補足摂取として開示される。
別の態様において、化粧品又はパーソナルケア製品における、本発明の単離された細菌株又は組成物の非治療的使用が開示される。具体的な実施形態において、化粧品における本発明の単離された細菌株又は組成物の非治療的使用が開示される。本発明の化粧品の形態は特に限定されず、エマルジョン、液体、クリーム、固形、又はペーストとして化粧品を提供することができる。化粧品はまた、薬剤、ゲル、粉末、ムース又はスプレーとして提供され得る。例えば、化粧品は、皮膚化粧品、メイクアップ又は整髪化粧品から選択され得る。皮膚化粧品としては、洗浄製品、蒸散防止製品、水分補給製品、耐紫外線製品等が挙げられ得る。整髪化粧品は、シャンプー、ヘアカラー製品、育毛を改善するための製品、ヘアリンス製品又はヘアコンディショニング製品等のヘアクリーニング製品を含み得る。化粧品はまた、クレンジングジェル、クレンジングクリーム、クリーニングフォーム、クリーニングローション、液体石鹸、ハンドソープ、バスオイル、シェービングクリームを含み得る。メイクアップ化粧品は、ファンデーションパウダー、フェイスパウダー、口紅、リップグロス、アイライナー、アイクリーム、マスカラ、ルージュ、マニキュアオイル及び他の製品、マニキュア液を含み得る。
具体的な実施形態において、パーソナルケア製品における本発明の単離された細菌株又は組成物の非治療的使用が開示される。該パーソナルケア製品としては、個人用の衛生製品及びクレンジング製品、練り歯磨き等のオーラルケア製品、アイケア製品、イヤーケア製品、サニタリー製品が挙げられ得るが、これらに限定されない。
本出願の一態様は、プロバイオティクス又はポストバイオティクスとしての本発明による単離された細菌株又は組成物の使用を開示する。プロバイオティクスは、適切な量で投与されたときに宿主に有益な効果を発揮する生きた微生物として定義される。本発明の文脈において、ポストバイオティクスについては、プロバイオティクスの代謝活性から生じる任意の因子、又は直接的若しくは間接的な方法で宿主に有益な効果をもたらすことができる、任意の放出分子が意図される。本発明の文脈において、「ポストバイオティクス」、「発酵製品」又は「発酵上清」という用語は、したがって、直接的又は間接的な方法で宿主に有益な効果をもたらすことができる、本発明の単離された細菌株の代謝活性から生じる任意の因子も含み得る。
更なる態様において、食品産業又は飼料産業における、特に、乳製品及び非乳製品の発酵製品、栄養補助食品、食事療法用の食品添加物及び／又は機能性食品の製造における、本発明による単離された細菌株又は組成物の使用が提供される。したがって、上記食品産業は、発酵食品製品（乳製品ベースの等価物（worth）、大豆）を包含し得る。上記食品産業はまた、食品製品の製造に使用されるバイオリアクター及び処理環境を含むことができ、本発明の細菌株又は組成物を、製造中に食品製品に添加することができる。
具体的な実施形態において、したがって、食物補給における本発明の単離された細菌株又は組成物の非治療的使用が開示される。それゆえ、単離された細菌株又は組成物を食品サプリメントとして提供することができ、或いは、食品産業又は飼料産業における着色剤として適切に使用することもできる。
更に別の態様において、リボフラビンの製造方法における、本発明の単離された細菌株又は組成物の使用が開示される。本発明の単離された細菌株は、その高レベルの自然発生的なリボフラビン産生について特徴付けられるため、リボフラビンの生産に非常に適している。
更なる実施形態において、本出願は、リボフラビンの製造方法も開示する。該方法では、開示された実施形態のいずれかによる細菌株又は組成物を、所与の基質からのリボフラビンの産生を可能にする条件下において水性媒体中でインキュベートする。水性培地は、典型的には、例えば塩、基質（複数の場合もある）、及び特定のpHを含む水性培地である。この培地は、生産培地とも呼ばれる。
したがって、本方法は、（a）開示された実施形態のいずれかによる細菌株又は組成物を準備する工程と、（b）リボフラビンの産生を可能にする条件下、水性培養培地中で上記細菌株又は上記組成物をインキュベートする工程と、任意に、（c）水性培養培地からリボフラビンを単離及び精製する工程とを含み得る。
本明細書において使用される場合、「発酵」又は「産生」又は「発酵プロセス」は、当業者に知られている培地、条件及び手順を用いて生育している細菌細胞の使用であり得る。
産生されたリボフラビンは、任意の適切な手段によって細胞から回収され得る。回収とは、例えば、産生されたリボフラビンを生産培地から分離し得ることを意味する。任意に、このようにして産生された発酵生成物は、更に処理、例えば精製されてもよい。
本発明による方法に関連して、細菌の生育工程は、水性培地、すなわち生育培地に、通常、好気的条件下で生育するための適切な栄養素を補充して行うことができる。培養は、例えば、回分式、流加式、半連続式、又は連続式で行われ得る。
「産生」又は「生産性」という用語は、当該技術分野で認識されており、所与の時間及び所与の発酵量で形成されるリボフラビンの濃度（例えば、1リットル当たり1時間当たりのkg生成物）を含む。「生産効率」という用語は、特定のレベルの生産が達成されるのに必要な時間を含む。「収率」という用語は、当該技術分野で認識されており、リボフラビン産生の効率を含む。
本発明による単離された細菌株又は組成物は、局所的に、経口的に、又は気道を通して投与するのに適した任意の形態であり得る。さらに、本発明による細菌株又は組成物は、限定されるものではないが、スプレー、クリーム、ローション、ゲル、軟膏、溶液、懸濁液、エマルジョン、カプセル、錠剤、粉末、顆粒、滴剤、吸入剤、歯磨き粉、マウスウォッシュから選択される医薬形態であり得る。細菌株又は組成物を、噴射剤と共に又は噴射剤なしで、ネブライザーによって気道を通して投与することができるように更に製剤化することができる。最後に、好ましい実施形態において、細菌株又は組成物を、膣内投与を介して投与することができるように製剤化することもできる。例えば、本発明の細菌株又は組成物を、膣洗浄液、膣石鹸、膣クリーム、タンポン、又は膣錠として提供することができる。
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、任意の生物を指す。したがって、対象は、哺乳動物、魚類又は鳥類であり得る。好ましくは、対象は、ヒト対象又は非ヒト哺乳動物を指す。更により好ましくは、対象はヒト対象である。別の特定の実施形態において、対象は、生産動物若しくは家畜、又はペットである。生産動物又は家畜は、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ、又はウサギを含む群から選択され得る。ペットはネコ又はイヌから選択され得る。
材料及び方法
L.ロイテリAMBV339株の全ゲノムシーケンシング及び遺伝子アノテーション
この株を、de Man-Rogosa-Sharpe（MRS）培地（Carl Roth、ドイツ国カールスルーエ）で一晩生育させた。二連で、1.5 mlの培養物を滅菌チューブに移し、アンピシリンを100μg/mlで添加した。37℃で1時間インキュベートした後、培養物を12000 gで3分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを滅菌NaCl-EDTA（0.5 Lの蒸留水中、NaCl0.8766 g及びEDTA 0.292 g）で3回洗浄し、100 μlのNaCl-EDTAに再懸濁した。次いで、100 μlのリゾチーム（10 mg/ml）及び1μlのRNase（20 mg/ml）を37℃で1時間添加した。次に、229 μlのNaCl-EDTA、50 μlの10% SDS及び20 μlのプロテイナーゼK（20mg/ml）を添加し、ボルテックスし、55℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、200 μlの低温タンパク質沈殿溶液（6 mlの5M CH3COOK、1.15mlの氷酢酸及び2.85 mlの蒸留水）を加え、最高速度で20秒間ボルテックスし、氷上で5分間インキュベートした。次いで、溶液を4℃及び12000 gで3分間遠心分離した。上清を清潔な1.5mlチューブに移し、4℃及び12000 gで3分間遠心分離した。得られた上清を清潔な1.5 mlチューブに移し、600 μlの氷冷イソプロパノールでDNAを沈殿させた。4℃及び12000gで3分間の遠心分離工程の後、上清を廃棄し、ペレットを600 μlの新しい70% EtOHで再懸濁した。4℃及び12000 gで3分間の遠心分離工程の後、上清を廃棄し、全てのエタノールが蒸発するまでペレットを風乾した。DNAペレットを50μlの蒸留水に溶解し、55℃で5分間インキュベートした。
全ゲノムシーケンシングは、Nextera XT DNA試料調製キット（Illumina、米国カリフォルニア州サンディエゴ）及びIlluminaMiSeqプラットフォームを使用して、2×250サイクルを用いて、医学微生物学研究所（Laboratory of Medical Microbiology）（アントワープ大学、ベルギー国アントワープ）で実施された。遺伝子アノテーションはPathosystemsResource Integration Center（PATRIC, www.patricbrc.org）により行い、リボフラビン遺伝子の存在を京都遺伝子ゲノム百科事典（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes：KEGG）パスウェイ（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）に基づいて決定した。
蛍光に基づくリボフラビン定量
蛍光に基づく培養培地中のリボフラビン産生の定量分析を前述の改変方法に従って行った。乳酸桿菌を生育培地としてのMRSブロス（Difco）に接種し、37℃で一晩静置インキュベートするか、又は市販の食品マトリックス（ココナッツミルク、豆乳、全乳及び低脂肪乳、バターミルク、リンゴジュース、又は対照としてのMRSブロス）に接種し、37℃で96時間静置インキュベートした。
無細胞培養上清を得るため、続いてMRSにおける細菌培養物を遠心分離（2486 g、10分間）し、上清をフィルター滅菌し（0.2μmフィルターに通す）、無細胞培養上清を得た。得られた細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、新しいMRSに再懸濁した。蛍光測定では、485/20励起フィルター及び520/20発光フィルターを備えたSynergyHTXマルチモードマイクロプレートリーダー（BioTek）を使用して、96ウェルプレートで100 μlの全細胞培養物、無細胞上清、又は細胞ペレットの蛍光を測定した。市販品として得られるMRS中のリボフラビン粉末の段階希釈物を用いて、定量の基準として標準曲線を得た。統計解析は二元配置分散分析（two-wayANOVA）を用いて行った。
吸光度に基づくリボフラビン定量
444 nmでの吸光度に基づく培養培地中のリボフラビン産生の定量分析を、Sauer et al.（1996）に従って行った。乳酸桿菌をMRS培地に接種し、37℃で一晩静置インキュベートした。続いて培養物を遠心分離し（2486g、10分）、上清をフィルター滅菌し（0.2 μmフィルターに通す）、無細胞培養上清を得た。次いで、0.8 mlの無細胞培養上清に0.2 mlの1M NaOHを加え、0.4mlの得られた溶液を1 mlの0.1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）で中和した。444 nmでの吸光度を、Synergy HTXマルチモードマイクロプレートリーダー（BioTek）を使用して96ウェルプレートで測定した。市販品として得られるMRS中のリボフラビン粉末の段階希釈物を用いて、定量の基準として標準曲線を得た。統計解析は二元配置分散分析を用いて行った。
HPLC-UVによるリボフラビン定量
無細胞培養上清試料中のリボフラビン濃度を、ビタミンB12に関する欧州薬局方による方法論に基づくHPLC-UVの標準的なアイソクラティック法で測定した。乳酸桿菌を生育培地としてのMRSブロス（Difco）に接種し、37℃で一晩静置インキュベートするか、又は市販の食品マトリックス（ココナッツミルク、バターミルク、又は対照としてのMRSブロス）に接種し、37℃で96時間静置インキュベートした。無細胞培養上清を得るために、続いて細菌培養物を遠心分離し（2486g、10分間）、上清を収集した。HPLC-UV測定では、試料を培地とHPLCからの移動相の両方で希釈し、2つの標準シリーズで二度繰り返して試験した。試料及び対照もリボフラビンでスパイクした。
細菌生育の定量
食品マトリックス中の細菌生育を、滅菌PBS中の細菌培養物の10倍段階希釈物を調製し、MRS寒天培地にプレーティングすることによって定量した。プレートを37℃で1日～2日間インキュベートし、続いて各段階希釈物に対応するコロニーをカウントした。細菌の生育を、コロニー形成単位（CFU）/ml培養物として表した。
模擬胃腸管系におけるL.ロイテリAMBV339の生存及びマイクロバイオーム調節試験
生きたL.ロイテリAMBV339を洗浄し、生理食塩水（0.9% NaCl）中に約1.5×109CFU/mlで再懸濁するか、又はココナッツミルク中で培養したL.ロイテリAMBV339を模擬ヒト胃腸系セットアップに加えた（Mortele et al.（2019）を参照されたい）。簡潔には、この系は胃（37℃、容量：34ml、pH 2～4、試薬添加：16 ml）、小腸（37℃、容量：50 ml、pH 7.5、試薬添加：15 ml）、及び大腸の様々な部分（37℃、嫌気性、容量：65ml、pH：5.8、添加試薬：55 ml）を表す容器で構成した。小腸及び大腸の部分にヒト便細菌叢を接種した。MRS寒天培地へのプレーティング（platingout）を介してL.ロイテリAMBV339の生存を評定し、16S rRNAシーケンシングを使用して便マイクロバイオーム組成を分析し、その後のRスタジオでのバイオインフォマティクス分析を行うために、試料を定期的に系から採取した。
結果
リボフラビン産生経路の遺伝子がリモシラクトバチルス・ロイテリAMBV339に存在する
L.ロイテリAMBV339株の全ゲノムが配列決定され、アノテーションが付けられた。リボフラビンの生産及びおそらく輸送に必要なリボフラビン合成経路の全ての遺伝子が、L.ロイテリAMBV339のゲノムで検出され、これらの遺伝子は以下に対するものを含んでいた：
3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン4-リン酸合成酵素（EC 4.1.99.12）/GTPシクロヒドロラーゼII（EC3.5.4.25）
ジアミノヒドロキシホスホリボシルアミノピリミジンデアミナーゼ（EC 3.5.4.26）/5-アミノ-6-（5-ホスホリボシルアミノ）ウラシルレダクターゼ（EC1.1.1.193）
6,7-ジメチル-8-リビチルルマジン合成酵素（EC 2.5.1.78）
リボフラビン合成酵素真正細菌／真核生物（EC 2.5.1.9）
FMNアデニリルトランスフェラーゼ（EC 2.7.7.2）/リボフラビンキナーゼ（EC 2.7.1.26）
RibTタンパク質、リボフラビン生合成アセチルトランスフェラーゼ（GNAT）ファミリー
リボフラビンECFトランスポーターの基質特異的成分RibU。
L.ロイテリAMBV336及びL.ロイテリAMBV337等の幾つかの他の非リボフラビン過剰産生L.ロイテリ分離株、並びにタイプ株L.ロイテリDSM20016と比較して、自然に存在する遺伝的変化が、菌株ゲノムのバイオインフォマティクスベースのアライメントを使用してL.ロイテリAMBV339で検出された。遺伝子変化は、図1に描かれるように、ジアミノヒドロキシホスホリボシルアミノピリミジンデアミナーゼ（EC3.5.4.26）/5-アミノ-6-（5-ホスホリボシルアミノ）ウラシルレダクターゼ（EC 1.1.1.193）、リボフラビン合成酵素真正細菌／真核生物（EC2.5.1.9）、3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン4-リン酸合成酵素（EC 4.1.99.12）/GTPシクロヒドロラーゼII（EC 3.5.4.25）、及び／又は6,7-ジメチル-8-リビチルルマジン合成酵素（EC2.5.1.78）に対する配列を含むリボフラビン合成を担う遺伝子クラスターの上流にある調節領域に特異的に存在することが判明した。L.ロイテリDSM20016株（この種のタイプ株;https://lpsn.dsmz.de/species/limosilactobacillus-reuteri）のゲノムアセンブリNC_009513.1（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_009513）では、この遺伝子変化の場所は塩基931824（L.ロイテリDSM20016のグアニンからL.ロイテリAMBV339のチミン）である。
リボフラビンはL.ロイテリAMBV339により実験用培地において高濃度で産生される
MRSで一晩生育させたL.ロイテリAMBV339全培養物及び対応する無細胞培養上清において、リボフラビンに特徴的な高レベルの蛍光（略440nmでの励起、及び略520nmでの発光）が観察された（図2A）。蛍光は細胞ペレットではるかに低く、リボフラビンがほとんど排泄されていることを示唆する。L.ロイテリAMBV339と比較して、同じ参加者から単離された他の膣L.ロイテリ株AMBV336、AMBV337、AMBV368、AMBV369及びAMBV371の選択物の全培養物、無細胞培養上清及び細胞ペレット、並びに市販のプロバイオティクス株L.ロイテリRC-14及びラクチカゼイバチルス・ラムノーサスGGで検出された蛍光はごくわずかであり、低レベルのリボフラビン産生を示すか、又はリボフラビン産生を全く示さなかった。
L.ロイテリAMBV339上清におけるリボフラビン産生の初期定量を、MRSにおける純粋なリボフラビンの段階希釈物に基づく標準曲線に対して行った。略440nmの励起と520 nmの発光を伴う溶液中のリボフラビンの蛍光ベースの検出、及び444 nmの吸光度を使用した溶液中のリボフラビンの定量分析の2つの補完的な方法を実施した。どちらの方法でも、L.ロイテリAMBV339上清中のリボフラビンは略40μg/mlで定量されたが、他の膣L.ロイテリAMBV336及びAMBV368、並びに市販のプロバイオティクスL.ロイテリRC-14及びL.ラムノーサスGGの培養上清中のリボフラビンレベルはゼロに近かった（図2B及び図2C）。
これらの結果は、ビタミン検出のための標準HPLC-UVを使用して検証され、MRSでの一晩L.ロイテリAMBV339培養物の上清中のリボフラビンは略18.7μg/mlで定量された。L.ラムノーサスGGの培養上清からはリボフラビンは検出されなかったが、試験した他のL.ロイテリは、一晩培養上清中に以下のリボフラビン濃度を有していた：L.ロイテリAMBV3360.933 μg/ml、L.ロイテリAMBV337 0.604 μg/ml、L.ロイテリL.ロイテリAMBV368 0.953 μg/ml、L.ロイテリAMBV3690.706 μg/ml、L.ロイテリAMBV370 0.953 μg/ml、L.ロイテリAMBV371 0.585 μg/ml、及びL.ロイテリRC-140.423 μg/ml。
L.ロイテリAMBV339は、様々な乳食品マトリックスで生育し、リボフラビンを産生する
L.ロイテリAMBV339の生育（図3A）、及びリボフラビン産生に対する読み出しとしての蛍光（図3B）を、商業的に入手できる多数の食品マトリックス（ココナッツミルク、豆乳、全乳及び低脂肪乳、バターミルク、リンゴジュース、又は対照としてMRSブロス）において評定し、L.ロイテリAMBV336及びL.ロイテリRC-14と比較した。
L.ロイテリ株はいずれもココナッツミルク、豆乳、全乳及び低脂肪乳、バターミルク、MRSで良好に生育し、リンゴジュースでは生育は無視できるほどのものであった（図3A）。L.ロイテリAMBV339は、ココナッツミルク（6.07E+10CFU/ml）、豆乳（5.00E+10 CFU/ml）、及び全乳（4.20E+10 CFU/ml）で最も高いコロニー形成単位（CFU）/mlに達し、続いてバターミルク（1.50E+08CFU/ml）、MRS（6.70E+08 CFU/ml）及び低脂肪乳（1.07E+07 CFU/ml）であった。したがって、食品マトリックスにおけるL.ロイテリAMBV339の生育は、特にココナッツミルク、豆乳及び全乳において、市販のプロバイオティクス株L.ロイテリRC-14の生育と同様であった。
リンゴジュースを除いて（おそらくリンゴジュースにおける生育の欠如に起因する）、全ての食品マトリックス（ココナッツミルク、豆乳、全乳及び低脂肪乳、バターミルク）中のL.ロイテリAMBV339培養物において、リボフラビン産生を反映する高レベルの蛍光が検出された。同じ食品マトリックス中のL.ロイテリAMBV336及びL.ロイテリRC-14の蛍光は有意に低く、リボフラビン産生レベルが低いか、又は産生しなかったことを示す。
ベースラインに対するL.ロイテリAMBV339による最も高いリボフラビン産生は、ココナッツミルクにおいて検出された（図3B）。対応する蛍光値はMRSの蛍光値と同様であったため、ココナッツミルク中のL.ロイテリAMBV339によるリボフラビン産生は18μg/ml～40 μg/mlの範囲にあると予想される。最も高い絶対蛍光は、バターミルク中のL.ロイテリAMBV339培養物で検出された。
また、L.ロイテリAMBV339を広く使用されている乳製品スターターであるストレプトコッカス・サーモフィルスとココナッツミルク中で共培養したところ、リボフラビン産生を示す高い蛍光値は保持された（図3C）。その結果、L.ロイテリAMBV339を単独でだけでなく、発酵食品中のリボフラビン産生のために他のスターター培養物と組み合わせて使用することも可能である。
0.9% NaCl溶液に再懸濁したL.ロイテリAMBV339細胞、又はココナッツミルク中のL.ロイテリAMBV339培養物も、模擬ヒト胃腸管に接種した。L.ロイテリAMBV339は、模擬ヒト胃腸管全体で生存した（図4A）。具体的には、図4Aに示すようにpH2、pH3及びpH4の胃液の条件下で90分間生存し、106CFU/ml～1011 CFU/mlとなった。これは、L.ロイテリAMBV339が胃の3つの異なる酸性条件で90分まで生存できることを示す。また、小腸及び大腸では、模擬胃腸管において72時間後にココナッツミルク中で送達された場合には平均105CFU/mlのL.ロイテリAMBV339が生存し、0.9% NaCl溶液中で送達された場合には平均して105 CFU/mlが生存した（図4B）。
模擬胃腸管へのL.ロイテリAMBV339の添加により便マイクロバイオーム組成の一貫した調節が観察され、便それ自体と比較すると、L.ロイテリAMBV339を添加した便マイクロバイオームの非類似性の増大が反映された（図4C）。L.ロイテリAMBV339のこのマイクロバイオーム調節効果は、L.ロイテリAMBV339のようなリボフラビン過剰産生株の添加から利益を得ることができる種に対して潜在的な有益な特性をもたらす可能性がある。
結論として、健康なヒト分離株L.ロイテリAMBV339によるリボフラビンの高産生は、実験室条件及び食品マトリックスにおいて実証された。L.ロイテリAMBV339のゲノム配列は、調節遺伝子配列に変異を有するリボフラビン合成経路の全ての遺伝子を含むことが示され、リボフラビンを過剰産生するその天然の能力を示唆する。リボフラビン標準曲線に対する蛍光、吸光度、及びHPLC-UVベースの測定では、L.ロイテリAMBV339培養物及び無細胞上清における天然リボフラビン産生が略18μg/ml～40 μg/mlで定量されたが、他の全ての試験されたL.ロイテリ株及びL.ラムノーサスGGの培養物におけるリボフラビンレベルはゼロに近かった。したがって、L.ロイテリAMBV339によるリボフラビン産生レベルは、文献で他の乳酸桿菌による天然産生について報告されたもの（2.3μg/ml～3 μg/ml）よりも有意に高い。さらに、L.ロイテリAMBV339は、市販のプロバイオティクスであるL.ロイテリRC-14に匹敵するレベルで、様々な食品マトリックス（ココナッツミルク、豆乳、全乳及び低脂肪乳、バターミルク）でよく生育した。これらの食品マトリックスの全てにおいて、L.ロイテリAMBV339による有意なリボフラビン産生が検出され、ココナッツミルクにおいて推定されるベースラインと比較して、最も高いリボフラビン産生は18μg/ml～40 μg/mlの範囲であり、バターミルクにおいて最も高いリボフラビン絶対レベルに到達した。最後に、L.ロイテリAMBV339は、ヒト胃腸管のシミュレートされた条件で生存し、便マイクロバイオーム調節を提供した。
参考文献
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図面訳
図1
Intergenic regulatory region 遺伝子間調節領域
（part 1: nucleotides 1 to 198） （1部：ヌクレオチド1～198）
（part 2; nucleotides 199 to 350） （2部；ヌクレオチド199～350）

図2
Riboflavin fluorescence （ex.485/20,em.528/20） リボフラビン蛍光（励起485/20、発光528/20）
corrected for medium background 培地バックグラウンドに対して補正
Whole culture 全培養物
Supernatant 上清
Pellet ペレット
L. reuteri L.ロイテリ
L. rhamnosus L.ラムノーサス
Riboflavin, μg/ml リボフラビン、μg/ml
Absorbance at 444 nm 444 nmでの吸光度

図3
Log 10 of colony-forming units/ml コロニー形成単位/mlのlog10
Coconut milk ココナッツミルク
Soy milk 豆乳
Cow milk whole 全乳
Cow milk semi-skimmed 低脂肪乳
Butter milk バターミルク
Apple juice リンゴジュース
L. reuteri L.ロイテリ
Riboflavin fluorescence （ex.485/em.528） リボフラビン蛍光（励起485/発光528）
Medium 培地
S. thermophilus S.サーモフィルス

図4
Gastric juice survival of L. reuteri AMBV339 L.ロイテリAMBV339の胃液生存
CFU/ml L. reuteri AMBV339 CFU/ml L.ロイテリAMBV339
pH level pHレベル
min 分
Sampling points サンプリング点
L. reuteri AMBV339 survival in gastrointestinal simulation model 胃腸管シミュレーションモデルにおけるL.ロイテリAMBV339の生存
(saline) （生理食塩水）
Coconut milk ココナッツミルク
Start stomach 胃の開始
After stomach 胃の後
Before pancreatic juice 膵液の前
After small intestine 小腸の後
Large intestine 大腸
L. reuteri AMBV339 in 0,9% NaCl (saline) 0.9％NaCl（生理食塩水）中のL.ロイテリAMBV339
Bray-Curtis dissimilarity Bray-Curtis非類似度
AMBV339+Feces AMBV339+糞便
Feces control 糞便対照
L. reuteri AMBV339 in coconut milk ココナッツミルク中のL.ロイテリAMBV339
寄託書

Claims (18)

  1. リモシラクトバチルス・ロイテリ（L.ロイテリ）種の単離された細菌株であって、該菌株が、その1つ以上の遺伝子又は上流調節配列において、リモシラクトバチルス・ロイテリタイプ株DSM20016の対応する遺伝子又は上流調節配列と比較して変化を有し、前記1つ以上の遺伝子が、以下、
    ジアミノヒドロキシホスホリボシルアミノピリミジンデアミナーゼ（EC 3.5.4.26）及び／又は5-アミノ-6-（5-ホスホリボシルアミノ）ウラシルレダクターゼ（EC 1.1.1.193）、
    リボフラビン合成酵素真正細菌／真核生物（EC 2.5.1.9）、
    3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン4-リン酸合成酵素（EC 4.1.99.12）及び／又はGTPシクロヒドロラーゼII（EC 3.5.4.25）、
    6,7-ジメチル-8-リビチルルマジン合成酵素（EC 2.5.1.78）、
    リボフラビンECFトランスポーターのRibU
    FMNアデニリルトランスフェラーゼ（EC 2.7.7.2）及び／又はリボフラビンキナーゼ（EC 2.7.1.26）、
    RibTリボフラビン生合成アセチルトランスフェラーゼ（GNAT）ファミリー、
    を含むリストから選択される遺伝子産物をコードする、単離された細菌株。
  2. 前記1つ以上の遺伝子が、以下、
    ジアミノヒドロキシホスホリボシルアミノピリミジンデアミナーゼ（EC 3.5.4.26）及び／又は5-アミノ-6-（5-ホスホリボシルアミノ）ウラシルレダクターゼ（EC 1.1.1.193）、
    リボフラビン合成酵素真正細菌／真核生物（EC 2.5.1.9）、
    3,4-ジヒドロキシ-2-ブタノン4-リン酸合成酵素（EC 4.1.99.12）及び／又はGTPシクロヒドロラーゼII（EC 3.5.4.25）、
    6,7-ジメチル-8-リビチルルマジン合成酵素（EC 2.5.1.78）、
    リボフラビンECFトランスポーターのRibU、
    を含むリストから選択される、請求項1に記載の単離された細菌株。
  3. 前記菌株が、前記タイプ株のゲノムアセンブリNC_009513.1中の塩基931824における変化を含み、特に該変化が、グアニンからチミンへの変化である、請求項1又は2に記載の単離された細菌株。
  4. 前記菌株が、受託番号LMG P-32020の下でBCCMに寄託されている、請求項1～3のいずれか一項に記載の単離された細菌株。
  5. 請求項1～4のいずれか一項に記載の単離された細菌株を含む、組成物。
  6. ヒト又は獣医学分野における医薬としての使用のための、請求項1～4のいずれか一項に記載の単離された細菌株、又は請求項5に記載の組成物。
  7. 対象におけるリボフラビンレベルの低下に関連する疾患の処置及び／又は予防における使用のための、請求項1～4のいずれか一項に記載の単離された細菌株、又は請求項5に記載の組成物。
  8. 前記リボフラビンレベルの低下に関連する疾患が、神経系の疾患、皮膚疾患、呼吸器疾患、赤血球レベルの低下に関連する疾患、眼疾患、鉄の代謝障害に関連する疾患、酸化ストレスに関連する疾患、泌尿生殖器の疾患又は感染症、胃腸疾患、全身疲労又は全身衰弱、代謝性疾患（例えば、ビタミンレベルの低下に関連する）、免疫疾患、頭痛又は片頭痛、妊娠、癌、並びに関連する、ウイルス性、細菌性及び真菌性の感染症を含む群から選択される、請求項7に記載の使用のための単離された細菌株又は組成物。
  9. 腸内細菌叢ディスバイオシスの予防及び処置、腸内細菌叢の回復力の促進、及び／又は特定の健康に関連する腸内分類群の促進における使用のための、請求項1～4のいずれか一項に記載の単離された細菌株、又は請求項5に記載の組成物。
  10. 全身疲労又は全身衰弱の予防及び／又は軽減のための、請求項1～4のいずれか一項に記載の単離された細菌株又は請求項5に記載の組成物の非治療的使用。
  11. 化粧品又はパーソナルケア製品における、請求項1～4のいずれか一項に記載の単離された細菌株又は請求項5に記載の組成物の非治療的使用。
  12. リボフラビンの産生方法における、請求項1～4のいずれか一項に記載の単離された細菌株又は請求項5に記載の組成物の使用。
  13. 前記リボフラビンの産生方法が発酵プロセスである、請求項12に記載の使用。
  14. プロバイオティクス、ポストバイオティクス、プレバイオティクス、又はシンバイオティクスとしての、請求項1～4のいずれか一項に記載の単離された細菌株又は請求項5に記載の組成物の使用。
  15. 食品産業又は飼料産業における、請求項1～4のいずれか一項に記載の単離された細菌株又は請求項5に記載の組成物の使用。
  16. 食品産業又は飼料産業における着色剤又はスターター培養物としての、請求項15に記載の単離された細菌株又は組成物の使用。
  17. リボフラビンの産生方法であって、請求項1～4のいずれか一項に記載の細菌株又は請求項5に記載の組成物を、リボフラビンの産生を可能にする条件下、水性培地中でインキュベートする、方法。
  18. a）請求項1～4のいずれか一項に記載の細菌株又は請求項5に記載の組成物を準備する工程と、
    b）前記細菌株又は前記組成物からのリボフラビンの産生を可能にする条件下、水性培地中で前記細菌株又は前記組成物をインキュベートする工程と、任意に、
    c）前記培養培地から前記リボフラビンを単離及び精製する工程と
    を含む、請求項17に記載の方法。
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