KR20230129163A - 리보플라빈 생산성이 높은 리모실락토바실러스 류테리균주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다른 공지된 락토바실러스 균주와 비교하여 리보플라빈(비타민 B2)의 천연 발생 과생산을 특징으로 하는 신규 단리된 박테리아 균주, 리모실락토바실러스 류테리(Limosilactobacillus reuteri) 균주의 식별에 관한 것이다. 리모실락토바실러스 종의 상기 균주는 기탁 번호 LMG P-32020 하에 기탁되어 있다. 추가 양태에서, 상기 엘. 류테리(L. reuteri) 균주의 용도가 또한 본원에 개시된다. 특히, 식품 및 사료 산업, 인간 및 동물 건강, 대규모 비타민 생산, 화장품 및 소비자 관리 제품에서 상기 균주의 용도가 개시된다.

Description

리보플라빈 생산성이 높은 리모실락토바실러스 류테리 균주 및 이의 용도
본 발명은 다른 공지된 락토바실러스 균주와 비교하여 리보플라빈(비타민 B2)의 천연 발생 과생산을 특징으로 하는 신규 단리된 박테리아 균주, 리모실락토바실러스 류테리(Limosilactobacillus reuteri) 균주의 식별에 관한 것이다. 리모실락토바실러스 종의 상기 균주는 기탁 번호 LMG P-32020 하에 기탁되어 있다. 추가 양태에서, 상기 엘. 류테리(L. reuteri) 균주의 용도가 또한 본원에 개시된다. 특히, 식품 및 사료 산업, 인간 및 동물 건강, 대규모 비타민 생산, 화장품 및 소비자 관리 제품에서의 상기 균주의 용도가 개시된다.
리보플라빈(비타민 B2)은 다량영양소(macronutrient) 및 에너지 대사(지방, 단백질 및 탄수화물)에 참여하며 항산화제 기능을 갖고 엽산 및 피리독신과 같은 다른 비타민을 활성화시키는 필수 수용성 황녹색 형광 비타민이다. 리보플라빈은 모든 생물에 필요하며, 인간의 경우 이는 생식 기능, 수유, 성공적인 임신 성과, 아동의 발달 및 적절한 에너지 수준에 중요하다. 현재 평균 요구량은 유럽 식품 안전청(EFSA, 2017, EFSA-Q-2011-01222)에 의해 정의된 바와 같이 아동의 경우 0.5 내지 1.4 mg 리보플라빈/일 및 성인의 경우 1.3 mg/일이다. 오레건 주립 대학교에 따르면, 임신 중 여성은 일일 1.4 밀리그램을 섭취해야 하며, 수유 시에는 일일 1.6 밀리그램을 섭취해야 한다(https://lpi.oregonstate.edu/mic/vitamins/riboflavin). 더욱이, 리보플라빈 결핍은 피부 손상, 인후염(sore throat), 구강 및 점막의 부종, 구순구각염(cheilosis) 및 설염(glossitis)을 유발할 수 있다. 리보플라빈 섭취는 이들 증상을 역전시킬 수 있으며, 일반적인 바이러스 및 박테리아 감염 질환(Dey 및 Bishayi, 2016), 예컨대 스타필로콕커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 감염에 대한 표준 치료법의 효율을 더 향상시킬 수 있다. 식이 제품, 영양 및 알레르기(NDA: nutrition and allergies)에 관한 EFSA 패널의 과학적 견해(2010)에 기초하여, 리보플라빈 공급원인 식품에 대한 EU 등록부에서 승인된 건강 정보는 정상적인 에너지-산출 대사에 대한 기여, 신경계의 정상 기능의 유지, 정상 피부 및 점막의 유지, 정상 적혈구의 유지, 정상 시력의 유지, 철의 정상 대사에 대한 기여, 산화적 손상으로부터 DNA, 단백질 및 지질의 보호, 권태 및 피로의 감소를 포함한다(2012년 5월 16일자 위원회 규정(EU) 432/2012). 리보플라빈은 또한 동물 건강을 향상시키기 위해 동물 사료에 사용되며, 유럽에서는 식품 첨가제 E 번호 E101과 함께 식용 색소로 사용된다.
대규모 산업 환경에서, 리보플라빈은 전통적으로 화학적 합성에 의해 생산되었다. 그러나, 지난 수십 년 동안 경제적 및 환경적 고려 사항으로 인해 리보플라빈의 미생물 합성이 점점 더 많이 시행되고 있다. 리보플라빈은 천연 과생산자 미생물, 대부분 사상균(filamentous fungi) 및 효모(에레모테시움 아쉬비이(Eremothecium ashbyii), 아쉬비아 고시피(Ashbya gossypii) 및 칸디다 파마타(Candida famata)) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 돌연변이체로부터 수득될 수 있다(Lim 등, 2001; Stahmann 등, 2000). 젖산균은 이전에도 리보플라빈을 생산하는 것으로 밝혀졌지만(Thakur 등, 2016), 현재까지 보고된 젖산균 균주는 제한된 양, 예를 들어 최대 2.3 내지 3 μg/ml의 배양 배지 범위의 리보플라빈만을 생산한다(Thakur 및 Tomar, 2015; Jayashree 등, 2010). 락토바실러스에서 리보플라빈 생산 증가를 자극하는 방법이 기재되었다. 그러나, 이를 위해서는 정의된 조건이 필요하며, 여전히 5 내지 6 μg/mL 배지의 리보플라빈 농도만을 발생시켰다(Juarez del Valle 등, 2017). ribG, ribB, ribA 및 ribH 유전자의 과발현을 위해 유전적으로 변형된 재조합 락토콕커스 락티스(Lactococcus lactis) NZ9000은 24 μg 리보플라빈/ml 배지를 생산하는 것으로 제시된 한편, 유전적으로 변형된 락토바실러스의 사용은 현재 규제 이유로 인간 소비용 식품에는 허용되지 않는다. 리보플라빈 농도는 전형적으로 예를 들어 에레모테시움 아쉬비이를 이용하는 산업 공정에서 약 26 내지 30 mg/mL이다. 그렇지만 중요한 고려 사항은 이들 농도가 사상균 및 효모에서 수득되고 인간에서 선호할 만한 안전성 프로파일을 갖는 락토바실러스에서는 수득되지 않는다는 점이다. 젖산균은 이미 식품 산업에서 또는 프로바이오틱 제형(예를 들어 리모실락토바실러스 류테리 RC-14 및 락티카세이바실러스 람노수스(Lacticaseibacillus rhamnosus) GG)으로서 광범위하게 구현되고 있다. 따라서, 비타민 생산을 증강시킬 수 있는 락토바실러스는 식품, 사료 및 다양한 프로바이오틱 제형, 보조제 및 심지어 의약의 비타민 농축(enrichment)에 큰 관심을 받고 있다. 이전에 기재된 락토바실러스에서 천연 발생하는 리보플라빈 농도는 아동과 성인의 현재 평균 요구량을 고려할 때 산업 생산 또는 대규모 식품 발효의 요구를 충족시키지 않을 것이다.
그러므로, 리보플라빈을 천연적으로 과생산하는 락토바실러스는 비용-효율적이고 안전한 식품 강화 솔루션, 또는 프로바이오틱 또는 포스트바이오틱 제품을 제공함으로써 인간 및 동물의 리보플라빈 결핍을 예방하거나 치료할 수 있다. 인간 및 동물에 대한 이의 투여는 전신 및/또는 점막 면역 건강, 병원체에 대한 저항성, 다량영양소/에너지 대사 및 항산화 기능, 생식 및 자손 건강을 향상시킬 수 있다.
본 발명은 리보플라빈의 증가된 생산을 보여주는 신규 리모실락토바실러스 균주의 식별에 기초한다. 특히 발명자들은 상기 리모실락토바실러스 균주가 리보플라빈 경로와 연관된 유전자에 변경(alternation)이 있음을 발견하였다. 더 구체적으로, 본 발명은 리모실락토바실러스 류테리(엘. 류테리) 종의 신규 단리된 균주의 식별에 기초한다. 상기 균주는 2020년 10월 9일자로 벨기에 헨트 9000, 케이. 엘. 레데간크스트라트 35(K.L. Ledeganckstraat 35, 9000 Gent, Belgium) 소재의 헨트 대학교(Universiteit Gent)의 벨기에 협력 미생물 보관소(BCCM: Belgian Co-ordinated Collection of Micro-Organisms)에 기탁 번호 LMG P-32020으로 기탁되었고, 본원에서 추가로 엘. 류테리 AMBV339 또는 AMBV339 균주로도 제시되었다.
엘. 류테리 종의 이러한 신규 단리된 균주의 전형적인 특징은, 이러한 균주가 비타민 B2로도 알려진 리보플라빈의 천연 발생 과생산을 갖는다는 것이다. 특히, AMBV339 균주는 특히 다른 공지된 락토바실러스 균주와 비교하여 높은 수준의 리보플라빈을 생성할 수 있다.
따라서, 제1 양태에서, 본 출원은 리보플라빈의 천연 발생 과생산을 갖는 하나 이상의 단리된 리모실락토바실러스 박테리아 균주에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 리보플라빈 생산 경로와 연관된 하나 이상의 유전자 또는 조절 유전자 서열에 변경이 있는 하나 이상의 단리된 리모실락토바실러스 박테리아 균주를 개시한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 균주는 리모실락토바실러스 류테리 유형 균주 DSM20016의 하나 이상의 유전자 또는 조절 서열과 비교하여 하나 이상의 유전자 또는 이의 업스트림 조절 서열에 변경이 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 유전자는 3,4-디하이드록시-2-부타논 4-포스페이트 신타제(EC 4.1.99.12) 및/또는 GTP 사이클로하이드롤라제(cyclohydrolase) II(EC 3.5.4.25), 디아미노하이드록시포스포리보실아미노피리미딘 데아미나제(EC 3.5.4.26) 및/또는 5-아미노-6-(5-포스포리보실아미노)우라실 리덕타제(reductase)(EC 1.1.1.193), 6,7-디메틸-8-리비틸루마진 신타제(EC 2.5.1.78), 리보플라빈 신타제 진정세균/진핵생물(EC 2.5.1.9), FMN 아데닐릴트랜스퍼라제(EC 2.7.7.2) 및/또는 리보플라빈 키나제(EC 2.7.1.26), RibT 단백질, 리보플라빈 생합성 아세틸트랜스퍼라제(GNAT) 계열(family), 또는 리보플라빈 ECF 수송체의 기질-특이적 구성요소 RibU에 대한 유전자로부터 선택된다.
특히, 이러한 조절 유전자 서열은 상기 유전자 또는 이 유전자가 속하는 유전자 오페론(operon)의 업스트림의 프로모터, 리보스위치 또는 다른 조절 서열로부터 선택된다. 구체적인 구현예에서, 본 출원은 리보플라빈 생산에 관여하는 유전자 또는 유전자 오페론, 특히 ribD로도 알려진 디아미노하이드록시포스포리보실아미노피리미딘 데아미나제(EC 3.5.4.26) 및/또는 5-아미노-6-(5-포스포리보실아미노)우라실 리덕타제(EC 1.1.1.193), ribE로도 알려진 리보플라빈 신타제 진정세균/진핵생물(EC 2.5.1.9), ribBA로도 알려진 3,4-디하이드록시-2-부타논 4-포스페이트 신타제(EC 4.1.99.12) 및/또는 GTP 사이클로하이드롤라제 II(EC 3.5.4.25) 및/또는 ribH로도 알려진 6,7-디메틸-8-리비틸루마진 신타제(EC 2.5.1.78)에 대한 유전자의 업스트림 조절 영역에 변경이 있는 하나 이상의 단리된 리모실락토바실러스 박테리아 균주를 개시한다.
매우 구체적인 구현예에서, 본 발명의 상기 균주는 상기 유형 균주의 게놈 어셈블리 NC_009513.1 내 염기 931,824에 변경을 포함하고, 특히 상기 변경은 구아닌으로부터 티민으로의 변경이다.
더 구체적으로, 리보플라빈 생산 경로와 연관된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자의 업스트림 조절 서열에 변경을 보이는 단리된 리모실락토바실러스 박테리아 균주는 리모실락토바실러스 류테리(엘. 류테리) 종이며, 상기 균주는 기탁 번호 LMG P-32020 하에 BCCM에 기탁되어 있다.
추가 양태에서, 본 출원은 리모실락토바실러스 류테리(엘. 류테리) 종의 단리된 박테리아 균주를 제공하며, 상기 균주는 기탁 번호 LMG P-32020 하에 BCCM에 기탁되어 있다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 단리된 박테리아 균주의 박테리아는 현탁액, 동결-건조, 분무-건조, 생(live) 또는 무생물(inanimate)/포스트바이오틱 형태, 또는 프리바이오틱 또는 신바이오틱(symbiotic) 제형에 존재하며, 단, 활성 구성요소는 방해(disrupted)되지 않는다.
또 다른 추가 구현예에서, 본 출원은 기탁 번호 LMG P-32020 하에 기탁된 엘. 류테리 종의 단리된 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 구현예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 방향제(aromatizing agent) 또는 담체를 포함한다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 조성물은 선택적으로 다른 프로바이오틱 박테리아를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 조성물은 상기 조성물 그램당 103 내지 1011 콜로니-형성 단위(CFU) 범위의 양의 박테리아를 포함한다.
본 출원은 단리된 박테리아 균주 엘. 류테리 AMBV339이 리보플라빈의 천연 발생 과생산을 보여준다는 발견에 기초한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 출원의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물은 대상체에서 감소된 리보플라빈 수준과 연관된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 추가 양태에서, 상기 감소된 리보플라빈 수준과 연관된 질환은 신경계 질환, 피부 질환, 호흡기 질환, 감소된 적혈구 수준과 연관된 질환, 안 질환(eye disease), 방해된 철 대사와 연관된 질환, 산화 스트레스와 연관된 질환, 일반 피로 또는 일반 질병(general illness), 비뇨생식기 질환, 대사 질환(예를 들어 감소된 비타민 수준과 연관됨), 두통 또는 편두통, 임신, 위장 질환, 면역 질환, 암 및 연관된 바이러스, 진균류 및 박테리아 감염을 포함하는 군으로부터 선택된다. 더 구체적으로, 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물은 감소된 리보플라빈 수준과 연관된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
대안적으로, 본 발명의 상기 균주 또는 조성물은 장 미생물군유전체 장내 세균 불균형(gut microbiome dysbiosis)의 예방 또는 치료, 장 미생물군유전체 회복력(gut microbiome resilience)의 촉진, 및/또는 건강-관련 장 분류군(gut taxa)의 촉진에 사용하기에 적합하다.
또 다른 양태에서, 일반 피로의 예방 및/또는 감소를 위한 본 발명에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 비(非)치료적 용도가 개시된다.
더욱 또 다른 양태에서, 화장품 또는 개인 관리 제품에서의 본 발명에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 비치료적 용도가 개시된다.
또 다른 구현예에 따르면, 리보플라빈 생산 방법에 있어서 본 발명에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 용도가 개시된다. 특히, 상기 리보플라빈 생산 방법은 발효 공정이다.
또 다른 양태에서, 프로바이오틱 또는 포스트바이오틱으로서 또는 프리바이오틱 또는 신바이오틱 제형의 본 발명의 임의의 구현예에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 용도가 개시된다. 예를 들어, 이는 경구 또는 국소 프로바이오틱 또는 포스트바이오틱 제형으로 투여될 수 있다.
더욱 또 다른 양태에서, 식품 또는 사료 산업에 있어서 본 발명의 임의의 구현예에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 용도가 개시된다.
또 다른 양태에서, 식품 또는 사료 산업에서 착색제로서 또는 종균 배양(starter culture)으로서 본 발명의 임의의 구현예에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 용도가 개시된다.
또 다른 구현예에 따르면, 본 출원은 리보플라빈 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 출원의 일 구현예에 따른 박테리아 균주 또는 조성물이 리보플라빈 생산을 가능하게 하는 조건 하의 수성 배지에서 인큐베이션되는 것을 특징으로 한다.
추가 구현예에서, 상기 리보플라빈 생산 방법은: a) 본 발명의 일 구현예에 따른 박테리아 균주 또는 조성물을 제공하는 단계, b) 리보플라빈 생산을 가능하게 하는 조건 하의 수성 배양 배지에서 상기 박테리아 균주 또는 상기 조성물을 인큐베이션하는 단계; 및 선택적으로 c) 리보플라빈을 수성 배양 배지로부터 단리하고 정제하는 단계를 포함한다.
이제 도면을 구체적으로 참조하여, 제시된 특정 사항은 단지 본 발명의 상이한 구현예의 예이고 예시적인 논의를 위한 것임을 강조한다. 이는 본 발명의 원리 및 개념 양태의 가장 유용하고 쉬운 설명이라고 생각되는 것을 제공하기 위해 제시된다. 이와 관련하여, 본 발명의 구조적 세부사항을 본 발명의 근본적인 이해에 필요한 것보다 더 상세히 나타내려는 시도는 하지 않는다. 도면과 함께 취해진 설명은 당업자에게 본 발명의 여러 형태가 실제로 구현될 수 있는 방법을 명확히 한다.
도 1: 비(非)-리보플라빈 과생산 엘. 류테리 균주 AMBV336, AMBV337, AMBV368, AMBV369 및 AMBV371, 및 유형 균주 엘. 류테리 DSM20016과 비교하여 리보플라빈-과생산 엘. 류테리 AMBV339에서 구아닌으로부터 티민으로의 돌연변이가 있는 엘. 류테리 ( ribD , ribE , ribBA 및 ribH 유전자)의 리보플라빈 오페론의 업스트림의 조절 유전자간 영역이다.
도 2: 엘. 류테리 AMBV339에 의한 리보플라빈의 생산의 추정이다.
(a) 다른 엘. 류테리 균주 및 상업적인 프로바이오틱 균주 락티카세이바실러스 람노수스(Lacticaseibacillus rhamnosus) GG 및 엘. 류테리 RC-14 의 선택물(selection)과 비교하여 엘. 류테리 AMBV339 배양물, 세포-무함유 배양 상등액 및 세포 펠릿에서 정량화된 리보플라빈의 형광 특징이며; p<0.05는 모든 다른 균주와 비교하여 AMBV339 조건의 리보플라빈 형광이 통계적으로 유의한 더 높음을 나타낸다. (b 및 c) 리보플라빈 희석 표준 곡선에 대해 플로팅된 배양물의 형광(A) 및흡광도(B)를 기반으로 하는 롯화된 엘. 류테리 AMBV339 및 다른 질내(vaginal) 엘. 류테리 AMBV336과 AMBV368, 및 상업적인 프로바이오틱스 엘. 류테리 RC-14와 엘. 람노수스 GG의 배양물에서의 리보플라빈 농도의 정량화이다. MRS에서 리보플라빈 표준 곡선에 대해 측정된 값은 x-축 상에 도시된 상응하는 리보플라빈 농도와 함께 회색 원형으로서 도시된다. 엘. 류테리 AMBV339(▲), AMBV336(▼), AMBV368(◆), RC-14(■) 및 엘. 람노수스 GG(●)의 형광 및 흡광도 측정은 리보플라빈 표준 곡선 내에서 플로팅된다.
도 3. 엘. 류테리 AMBV336 및 엘. 류테리 RC-14와 비교하여 식품 매트릭스에서 엘. 류테리 AMBV339 배양물에서 정량화된 리보플라빈의 (a) 성장 및 (b) 형광 특징;(c) 종균 스트렙토콕커스 서모필루스(Streptococcus thermophilus) 와 함께 공동배양된 엘. 류테리 AMBV339에서 정량화된 리보플라빈의 형광 특징이다. p<0.05는 성장 배지 조건과 비교하여 AMBV336, AMBV339 또는 RC-14 조건의 리보플라빈 형광이 통계적으로 유의하게 더 높음을 나타낸다.
도 4. (a) 상이한 pH의 위액에서, 또는 (b) 인간 대변 미생물군(fecal microbiota)이 접종된 모의 위장관의 상이한 부분에서 엘. 류테리 AMBV339의 종단 생존율(longitudinal survival); (c) 대변 조건 및 대변 자체(0.9% NaCl 및 코코넛 밀크)에서 엘. 류테리 AMBV339의 미생물 커뮤니티 조성물 사이의 브레이-커티스 비유사성(Bray-Curtis dissimilarity)이다. 모의 위장관의 경우, 0.9% NaCl 용액(또는 식염수) 중 엘. 류테리 AMBV339 또는 코코넛 밀크 중 엘. 류테리 AMBV339 배양물을 첨가하였다. 데이터는 평균과 표준 편차로서 제시된다.
본 발명은 이제 더 설명될 것이다. 하기 단락에서, 본 발명의 상이한 양태는 더 상세히 정의된다. 그렇게 정의된 각각의 양태는 분명하게 달리 지시되지 않는 한 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 발명의 화합물을 설명할 때, 사용된 용어는 문맥상 달리 지시하지 않는 한, 하기 정의에 따라 간주되어야 한다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥상 달리 분명하게 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 예로서, "화합물"은 하나의 화합물 또는 하나 초과의 화합물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약" 또는 "대략"은 측정 가능한 값, 예컨대 파라미터, 양, 시간적 연속기간 등을 지칭할 때, 명시된 값의 그리고 값으로부터 +/-10% 이하, 바람직하게는 +/-5% 이하, 더 바람직하게는 +/-1% 이하, 더욱 더 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 변동을, 이러한 변동이 개시된 발명에서 수행하기에 적절한 한, 포괄하는 것으로 의미된다. 수식어 "약" 또는 "대략"이 지칭하는 값은 그 자체가 또한 구체적으로 그리고 바람직하게 개시되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 건강한 인간 질내 샘플로부터 단리된 신규 엘. 류테리 균주의 식별에 기초한다.
이러한 균주는 리보플라빈 생산 경로와 연관된 하나 이상의 유전자 또는 조절 유전자 서열에서의 변경을 특징으로 한다. 신규 단리된 박테리아 균주에 특정한 점은 이것이 천연 리보플라빈-과생산 특성을 나타낸다는 점이다.
본 발명과 관련하여, 변경이라는 용어는 다른 AMBV 균주 또는 유형 균주와 같은 본원에 개시된 비교 균주와 비교하여 게놈 서열의 변형을 의미한다. 특히, 이러한 변형은 균주의 게놈 서열에서의 돌연변이, 결실, 삽입 등으로 이루어질 수 있다.
특히, 본 발명자들은 엘. 류테리 AMBV339 균주가 리보플라빈 생산에 필요한 리보플라빈 합성 경로 유전자를 포함함을 확인하였다. 더 구체적으로, 드 망-로고사-샤르페(MRS: Man-Rogosa-Sharpe) 배지 또는 시험된 식품 매트릭스에서의 엘. 류테리 AMBV339 균주의 성장은 AMBV339 배양물이 리보플라빈의 존재에 대해 황녹색 형광 특징을 나타내었음을 보여주었고, 상기 형광 특징은 시험된 다른 엘. 류테리 균주에는 존재하지 않았다. 엘. 류테리 AMBV339 균주의 상등액 내 리보플라빈 농도는 형광-기초, 흡광도-기초 및 HPLC/UV-기초 방법을 사용하여 대략 18 내지 40 μg 리보플라빈/ml로 정량화되었다. 젖산균에 의한 리보플라빈 생산과 관련된 선행 기술에 따르면, 이들 리보플라빈 농도는 사용된 검출 방법에 따라 다른 젖산균 균주에 대해 이전에 보고된 최대 리보플라빈 생산 수준보다 적어도 3배 내지 20배 더 높다.
락토바실러스는 이의 발효 및 프로바이오틱 특성으로 인해 종종 식품/사료 적용 및 보조제에 사용된다. 실제로, 또한 엘. 류테리 AMBV339 균주는 안전성 정성 추정(QPS: Qualified Presumption of Safety) 상태를 가지며, 이는 상기 균주가 사료, 식품 및 건강 적용에 직접 사용될 수 있음을 나타낸다. 더욱이, AMBV339 균주는 또한 시험된 조건 하에 밤새 효율적으로 성장하고 높은 바이오매스를 산출하고 있다.
그러므로, 본 출원은 전형적으로 높은 수준의 리보플라빈 생산을 특징으로 하는 단리된 박테리아 엘. 류테리 AMBV339 균주를 제공한다. 나아가, 또한 엘. 류테리 AMBV339 균주를 포함하는 조성물이 제공된다. 엘. 류테리 AMBV339 균주는 2020년 10월 9일에 벨기에 협력 미생물 보관소(BCCM)에 기탁 번호 LMG P-32020으로 기탁되었다. 그러므로, 단리된 AMBV339 균주 또는 상기 균주를 포함하는 조성물은 리보플라빈 또는 비타민 B2를 다량으로 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단리된 박테리아 AMBV339 균주의 박테리아는 살아 있는 형태 또는 포스트바이오틱, 프리바이오틱 또는 신바이오틱 형태로 현탁액, 동결-건조, 분무-건조된 상태로 제공될 수 있으며, 단, 활성 구성요소는 비활성화되지 않는다. 본 발명과 관련하여, 용어 "살아 있는 형태", "프로바이오틱" 및 "신바이오틱" 형태란, 박테리아가 살아 있는 형태를 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "포스트바이오틱 형태" 또는 "프리바이오틱 형태"란, 무생물(inanimate) 적용 또는 틴달화된(tyndalized) 버전의 박테리아 또는 이의 분자 생성물의 경우와 같이 박테리아가 살아 있지 않는 형태를 지칭한다.
본 발명과 관련하여, 하기 정의가 사용된다:
프로바이오틱 = 적절한 양으로 투여된 경우 숙주에 건강 이익을 부여하는 살아 있는 미생물
포스트바이오틱 = 숙주에 건강 이익을 부여하는 무생물 미생물 및/또는 이의 구성요소의 조제물
프리바이오틱스 = 건강 이익을 부여하는 숙주 미생물에 의해 선택적으로 활용되는 기질
신바이오틱 = 숙주에 건강 이익을 부여하는 숙주 미생물에 의해 선택적으로 활용되는 기질(들)과 살아 있는 미생물을 포함하는 혼합물.
또한, 단리된 박테리아 균주 AMBV339를 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물의 제조는 박테리아 배양물을 동결-건조하거나 분무-건조하는 단계, 건조된 박테리아를 둘 다 현탁액에서 물과 함께 또는 추가의 적합한 부형제와 함께 그리고 선택적으로 추가의 활성 성분(principle)의 첨가와 함께 혼합하는 단계에 의해 구현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "조성물"은 2개 이상의 생성물 또는 화합물(예를 들어 제제, 조정제(modulator), 조절제 등)의 임의의 혼합물을 지칭한다. 조성물은 용액, 현탁액, 액체, 파우더 또는 페이스트, 수성 또는 비(非)수성 제형 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 본 발명과 관련하여, 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 약학적으로 부형제, 또는 희석제, 예컨대 적합한 당, 공중합체 PEG/PPG, 또는 동결보호제(cryoprotectant)를 포함하는 약학적 또는 화장품 조성물이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 방향제 또는 담체를 포함한다. 이러한 조성물에서 선택될 수 있는 부형제의 예에는 고무, 잔탄, 카르복시메틸 셀룰로스, 실리콘, 바셀린, 화이트 소프트 파라핀(white soft paraffin), 마그네슘 스테아레이트, 말토덱스트린, 만니톨, 전분, 글루코스, 트레할로스, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 락토스 및 유사한 것들이 있다.
조성물은 또한 방향제; 예컨대 백리향(thyme) 또는 이의 임의의 추출물을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 담체는 미생물의 생체이용률, 안정성 및/또는 지구력(endurance)의 향상을 제공한다.
그러므로, 조성물은 미생물의 생체이용률, 안정성 및 지구력을 향상시키기 위해 하나 이상의 담체를 추가로 포함할 수 있다. 담체는 또한, 적합한 표면, 예를 들어 점막 표면에의 박테리아 균주의 접착을 향상시킬 수 있다. 이러한 담체는 예를 들어 에스. 살리바리우스 또는 락토바실러스에 의해 생산되는 엑소다당류(exopolysaccharide)일 수 있다. 나아가, 담체는 예를 들어 온도 또는 간트렉스(Gantrex)를 증가시킴으로써 점도와 따라서 접착성(adhesiveness)을 증가시킬 수 있는 열-민감성 중합체일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 담체는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 조성물은 바람직하게는 조성물의 각 그램에 대해 103 내지 1011 CFU 범위의 양의 박테리아를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 인간 또는 동물 의학에서 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 박테리아 균주 AMBV339 또는 상기 균주를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 조성물은 대상체에서 감소된 리보플라빈 수준과 연관된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물은 대상체에서 리보플라빈의 증가(boost)가 요망되는 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 추가 양태에서, 감소된 리보플라빈 수준과 연관된 질환은 신경계 질환, 피부 질환, 호흡기 질환, 감소된 적혈구 수준과 연관된 질환, 안 질환, 방해된 철 대사와 연관된 질병, 산화 스트레스와 연관된 질환, 일반 피로 또는 일반 질환, 비뇨생식기 질환, 대사 질환(예를 들어 감소된 비타민 수준과 연관됨), 두통 또는 편두통, 임신, 위장 질환, 면역 질환, 암 및 연관된 바이러스, 진균류 및 박테리아 감염을 포함하는 군으로부터 선택된다. 더 구체적으로, 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물은 감소된 리보플라빈 수준과 연관된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서의 질환의 치료 방법에 관한 것이며, 단리된 박테리아 균주 AMBV339 또는 상기 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계에 의한 것이다. 특히, 질환은 리보플라빈의 증가가 요망되는 질활들로부터 선택될 수 있다. 추가 양태에서, 상기 감소된 리보플라빈 수준과 연관된 질환은 신경계 질환, 피부 질환, 호흡기 질환, 감소된 적혈구 수준과 연관된 질환, 안 질환, 방해된 철 대사와 연관된 질환, 산화 스트레스와 연관된 질환, 일반 피로 또는 일반 질병, 비뇨생식기 질환, 대사 질환(예를 들어 감소된 비타민 수준과 연관됨), 두통 또는 편두통, 임신, 위장 질환, 면역 질환, 암 및 연관된 바이러스, 진균류 및 박테리아 감염을 포함하는 군으로부터 선택된다. 더 구체적으로, 본 발명은 대상체에서의 감소된 리보플라빈 수준과 연관된 질환의 치료 방법에 관한 것이며, 단리된 박테리아 균주 AMBV339 또는 상기 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계에 의한 것이다.
용어 "치료", "치료하는", "치료하다" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환으로 인한 부작용(adverse effect)에 대한 부분적 또는 완전한 안정화 또는 치유의 측면에서 치료적일 수 있다. "치료"는 포유류, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 망라하고: (a) 질환 또는 증상의 소인이 있을 수 있으나 이를 갖는 것으로 아직 진단된 적이 없는 대상체에서 질환 또는 증상이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환 증상을 저해하는 것, 즉, 이의 발증을 억제시키는 것; 또는 (c) 질환 증상을 완화시키는 것, 즉, 질환 또는 증상의 퇴행(regression)을 야기하는 것을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "예방" 등은 질환 또는 병태가 발생하는 것을 예방하는 것을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "면역조절"은 면역 반응을 원하는 수준 및/또는 방향으로 변경시키는 과정을 지칭한다.
추가 양태에서, 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물은 일반 피로의 비치료적 감소 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 그러므로, 본 출원은 또한 일반 피로 또는 허약의 예방 및/또는 감소를 위한 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 비치료적 용도를 제공한다. 용어 "비치료적" 등은 비(非)질환 맥락에서, 그러므로 질환의 임의의 징후가 대상체에 나타나기 전에 원하는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 용도는 리보플라빈의 보충 섭취로서 개시된다.
또 다른 양태에서, 화장품 또는 개인 관리 제품에 있어서 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 비치료적 용도가 개시된다. 구체적인 구현예에서, 화장품에서 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 비치료적 용도가 개시된다. 본 발명의 화장품 형태는 특별히 제한되지 않으며, 화장품을 에멀젼, 액체, 크림, 고체 또는 페이스트로서 제공하는 것이 가능하다. 화장품은 또한 제제, 젤, 파우더, 무스 또는 스프레이로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 화장품은 피부 화장품, 메이크업 또는 헤어드레싱 화장품으로부터 선택될 수 있다. 피부 화장품은 클렌징 제품, 땀배출 방지 제품(anti-transpiration product), 보습 제품, UV 저항 제품 등을 포함할 수 있다. 헤어드레싱 화장품은 헤어 클렌징 제품, 예컨대 샴푸, 헤어 염색 제품, 헤어-성장을 향상시키기 위한 제품, 헤어 린스 제품 또는 헤어 컨디셔닝 제품을 포함할 수 있다. 화장품은 또한 클렌징 젤, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 액체 비누, 핸드 비누, 배쓰 오일, 면도 크림을 포함할 수 있다. 메이크업 화장품은 파운데이션 파우더, 페이스 파우더, 립스틱, 립글로스, 아이라이너, 아이크림, 마스카라, 루즈, 매니큐어 오일 및 다른 제품, 네일 폴리쉬(nail polish)를 포함할 수 있다.
구체적인 구현예에서, 개인 관리 제품에서 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 비치료적 용도가 개시된다. 상기 개인 관리 제품은 개인 위생 및 클렌징 제품, 구강 관리 제품, 예컨대 치약, 눈 관리 제품, 눈 관리 제품, 위생 제품을 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태는 프로바이오틱 또는 포스트바이오틱으로서 본 발명에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 용도를 개시한다. 프로바이오틱스는 적절한 양으로 투여되는 경우 숙주에 유익한 효과를 발휘하는 살아 있는 미생물로서 정의된다. 본 발명과 관련하여, 포스트바이오틱스의 경우 숙주에 직접 또는 간접 방식으로 유익한 효과를 부여할 수 있는 프로바이오틱 또는 임의의 방출된 분자의 대사 활성으로부터 비롯되는 임의의 인자인 것으로 의도된다. 그러므로, 본 발명과 관련하여 용어 "포스트바이오틱", "발효 생성물" 또는 "발효 상등액"은 또한 숙주에 직접 또는 간접 방식으로 유익한 효과를 부여할 수 있는 본 발명의 단리된 박테리아 균주의 대사 활성으로부터 비롯되는 임의의 인자를 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 식품 또는 사료 산업에서 본 발명에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 용도가 제공되며; 특히 낙농 및 비(非)낙농 발효 제품, 식이요법 보조제, 식이요법 식품 첨가제 및/또는 영양제의 생산에 있어서의 용도가 제공된다. 그러므로, 상기 식품 산업은 발표 식품(유제품, 대두)을 포괄할 수 있다. 상기 식품 산업은 또한 식품 생산에 사용되는 생물반응기 및 가공 환경을 포함할 수 있으며, 여기서 본 발명의 박테리아 균주 또는 조성물은 생산 중 식품에 첨가될 수 있다.
그러므로 구체적인 구현예에서, 식품 보조제에서 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 비치료적 용도가 개시된다. 그러므로, 단리된 박테리아 균주 또는 조성물은 식품 보조제로서 제공될 수 있으며, 대안적으로 이는 식품 또는 사료 산업에서 착색제로서 적합하게 사용될 수 있다.
더욱 또 다른 양태에서, 리보플라빈 생산 방법에 있어서 본 발명의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 용도가 개시된다. 본 발명의 단리된 박테리아 균주가 높은 수준의 천연 발생 리보플라빈 생산을 특징으로 하기 때문에, 이는 리보플라빈 생산에 매우 적합하다.
추가 구현예에서, 본 출원은 또한 리보플라빈 생산 방법을 개시한다. 상기 방법에서 임의의 개시된 구현예에 따른 박테리아 균주 또는 조성물은 주어진 기질로부터 리보플라빈의 생산을 가능하게 하는 조건 하의 수성 배지에서 인큐베이션된다. 수성 배지는 전형적으로 예를 들어 염, 기질(들) 및 특정한 pH를 포함하는 수성 배지이다. 배지는 또한 생산 배지로 지칭된다.
그러므로, 방법은 (a) 임의의 개시된 구현예에 따른 박테리아 균주 또는 조성물을 제공하는 단계; (b) 리보플라빈 생산을 가능하게 하는 조건 하의 수성 배양 배지에서 상기 박테리아 균주 또는 상기 조성물을 인큐베이션하는 단계; 및 선택적으로 (c) 리보플라빈을 수성 배양 배지로부터 단리하고 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "발효", "생산" 또는 "발효 과정"은 당업자에게 알려진 배지, 조건 및 절차를 사용하여 박테리아 세포를 성장시키는 용도일 수 있다.
생산된 리보플라빈은 임의의 적합한 수단에 의해 세포로부터 회수될 수 있다. 회수는 예를 들어 생산된 리보플라빈이 생산 배지로부터 분리될 수 있음을 의미한다. 선택적으로, 이렇게 생산된 발효 생성물은 추가로 가공, 예를 들어 정제될 수 있다.
본 발명에 따른 방법과 관련하여, 박테리아의 성장 단계는 수성 배지, 즉, 호기성 조건 하에 정상적으로 성장하기 위한 적절한 영양소가 보충된 성장 배지에서 수행될 수 있다. 배양은 예를 들어 회분식, 유기식(fed-batch), 반연속식 또는 연속식 모드로 실시될 수 있다.
용어 "생산" 또는 "생산성"은 당업계에 인식되어 있고, 주어진 시간 및 주어진 발효 부피로 형성된 리보플라빈의 농도(예를 들어 리터당 시간(hour)당 생성물 kg)를 포함한다. 용어 "생산 효율"은 특정한 수준의 생산이 달성되는 데 필요한 시간을 포함한다. 용어 "수율"은 당업계에 인식되어 있고, 리보플라빈의 생산 효율을 포함한다.
본 발명에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 조성물은 국소적으로, 경구로 또는 호흡기관(respiratory tract)을 통해 투여되기에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 박테리아 균주 또는 조성물은 스프레이, 크림, 로션, 젤, 연고, 용액, 현탁액, 에멀젼, 캡슐, 정제, 파우더, 과립, 점적액, 흡입제, 치약, 구강세척제로부터 선택되지만 이로 제한되지 않는 약학적 형태일 수 있다. 박테리아 균주 또는 조성물은 이것이 프로펠런트(propellant)와 함께 또는 프로펠런트 없이 네뷸라이저에 의해 호흡기관을 통해 투여될 수 있는 방식으로 추가로 제형화될 수 있다. 마지막으로 그리고 바람직한 구현예에서, 박테리아 균주 또는 조성물은 또한 이것이 질내 투여를 통해 투여될 수 있는 방식으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 박테리아 균주 또는 조성물은 질 세척액, 질 비누, 질 크림, 탐폰 또는 질 알약으로서 제공될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 살아 있는 유기체를 지칭한다. 그러므로, 대상체는 포유류, 어류 또는 조류일 수 있다. 바람직하게는 대상체는 인간 대상체 또는 비인간 포유류를 지칭한다. 더욱 더 바람직하게는, 대상체는 인간 대상체이다. 또 다른 특정 구현예에서, 대상체는 생산물 또는 농장 동물, 또는 애완 동물이다. 생산물 또는 농장 동물은 돼지, 양, 염소, 소, 말, 닭, 거위, 칠면조 또는 토끼를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 애완 동물은 고양이 또는 개 중에서 선택될 수 있다.
실시예
재료 및 방법
엘. 류테리 AMBV339 균주 및 유전자 주석(annotation)의 전체-게놈 시퀀싱
균주를 드 망-로고사-샤르페(MRS) 배지(Carl Roth, 독일 카를스루에 소재)에서 밤새 성장시켰다. 2벌에서, 1.5 ml의 배양물을 멸균 튜브로 옮기고, 앰피실린을 100 μg/ml로 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 배양물을 12,000 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 생산된 세포 펠릿을 멸균 NaCl-EDTA(0.5 L 증류수 중 0.8766 g의 NaCl 및 0.292 g의 EDTA)로 3회 세척하고, 100 μl의 NaCl-EDTA에 재현탁시켰다. 그 후에, 100 μl의 리소자임(10 mg/ml) 및 1 μl의 RNase(20 mg/ml)를 37℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 다음, 229 μl의 NaCl-EDTA, 50 μl의 10% SDS 및 20 μl의 프로테이나제 K(20 mg/ml)를 첨가하고, 볼텍싱(vortex)하고, 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 200 μl의 냉각(cold) 단백질 침전 용액(6 ml의 5 M CH3COOK, 1.15 ml의 빙초산 및 2.85 ml의 증류수)을 첨가하고, 최대 속도에서 20초 동안 볼텍싱하고, 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 용액을 4℃ 및 12,000 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 상등액을 깨끗한 1.5 ml 튜브로 옮기고, 4℃ 및 12,000 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 생산된 상등액을 깨끗한 1.5 ml 튜브로 옮기고, DNA를 600 μl의 빙냉 이소프로판올로 침전시켰다. 4℃ 및 12,000 g에서 3분의 원심분리 단계 후, 상등액을 버리고, 펠릿을 600 μl 신선한 70% EtOH로 재현탁시켰다. 4℃ 및 12,000 g에서 3분의 원심분리 단계 후, 상등액을 버리고, 모든 에탄올이 증발할 때까지 펠릿을 공기-건조되게 하였다. DNA 펠릿을 50 μl 증류수에 용해시키고, 55℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
의학 미생물학 실험실(앤트워프 대학교, 벨기에 앤트워프 소재)에서 2 x 250 사이클을 사용하는 Nextera XT DNA 샘플 제조 키트(Illumina, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 Illumina MiSeq 플랫폼을 사용하여 전체-게놈 시퀀싱을 수행하였다. 병태계 자원 통합 센터(PATRIC: Pathosystems Resource Integration Center, www.patricbrc.org)를 사용하여 유전자 주석을 수행하고, 리보플라빈 유전자의 존재를 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)에 기초하여 결정하였다.
형광에 기초한 리보플라빈 정량화
형광에 기초한 배양 배지에서의 리보플라빈 생산의 정량적 분석을 이전에 기재된 변형된 방법에 따라 수행하였다. 락토바실러스를 성장 배지(Difco)로서 MRS 배양액에 접종하고 37℃에서 밤새 정적으로 인큐베이션하거나, 시판되는 식품 매트릭스(코코넛 밀크(coconut milk), 두유(soy milk), 전지유(cow milk whole), 반탈지유(cow milk semi-skimmed), 버터 밀크(butter milk), 사과 주스(apple juice) 또는 대조군으로서 MRS 배양액)에 접종하고 37℃에서 96시간 동안 정적으로 인큐베이션하였다.
세포-무함유 배양 상등액을 수득하기 위해, MRS 중 박테리아 배양물을 후속적으로 원심분리(2486 g, 10분)하고, 상등액을 (0.2 μm 필터를 통해) 필터 멸균하여 세포-무함유 배양 상등액을 수득하였다. 생산된 세포 펠릿을 포스페이트-완충 식염수(PBS)로 2회 세척하고, 신선한 MRS에 재현탁시켰다. 형광 측정을 위해, 100 μl의 전체 세포 배양물, 세포-무함유 상등액 또는 세포 펠릿의 형광을 96-웰 플레이트에서 485/20 여기 필터 및 520/20 방출 필터와 함께 Synergy HTX Multi-모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 측정하였다. 시판되는 MRS 중 리보플라빈 파우더의 연속 희석물을 사용하여 정량화를 위한 기준으로서의 표준 곡선을 수득하였다. 통계적 분석을 이원 ANOVA(two-way ANOVA)로 수행하였다.
흡광도에 기초한 리보플라빈 정량화
444 nm에서의 흡광도에 기초한 배양 배지에서의 리보플라빈 생산의 정량적 분석을 Sauer 등(1996)에 따라 수행하였다. 락토바실러스를 MRS 배지에 접종하고 37℃에서 밤새 정적으로 인큐베이션하였다. 배양물을 후속적으로 원심분리(2486 g, 10분)하고, 상등액을 (0.2 μm 필터를 통해) 필터 멸균하여 세포-무함유 배양 상등액을 수득하였다. 그 후에, 0.2 ml의 1 M NaOH를 0.8 ml의 세포-무함유 배양 상등액에 첨가하고, 0.4 ml의 생산된 용액을 1 ml의 0.1 M 포타슘 포스페이트 완충액(pH 6.0)으로 중화시켰다. 444 nm에서의 흡광도를 96-웰 플레이트에서 Synergy HTX Multi-모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 측정하였다. 시판되는 MRS 중 리보플라빈 파우더의 연속 희석물을 사용하여 정량화를 위한 기준으로서의 표준 곡선을 수득하였다. 통계적 분석을 이원 ANOVA로 수행하였다.
HPLC-UV를 이용한 리보플라빈 정량화
비타민 B12에 대한 유럽 약전 방법론에 기초하여 HPLC-UV에 대한 표준 등용매 방법(isocratic method)으로 세포-무함유 배양 상등액 샘플에서 리보플라빈 농도를 측정하였다. 락토바실러스를 성장 배지(Difco)로서 MRS 배양액에 접종하고 37℃에서 밤새 정적으로 인큐베이션하거나, 시판되는 식품 매트릭스(코코넛 밀크, 버터 밀크 또는 대조군으로서 MRS 배양액)에 접종하고 37℃에서 96시간 동안 정적으로 인큐베이션하였다. 세포-무함유 배양 상등액을 수득하기 위해, 박테리아 배양물을 후속적으로 원심분리(2486 g, 10분)하고, 상등액을 수집하였다. HPLC-UV 측정을 위해, 샘플을 배지와 HPLC로부터의 이동상 둘 다로 희석시키고, 2개의 표준 시리즈를 이용하여 2벌로 시험하였다. 샘플 및 대조군 둘 다에 리보플라빈을 스파이크(spike)하였다.
박테리아 성장의 정량화
멸균 PBS에서 박테리아 배양물의 연속의 10배 희석물을 제조하고 이를 MRS 한천 상에 평판배양함으로써 식품 매트릭스에서의 박테리아 성장을 정량화하였다. 플레이트를 37℃에서 1일 내지 2일 동안 인큐베이션하고, 각각의 연속의 희석물에 상응하는 콜로니를 후속적으로 카운팅하였다. 박테리아 성장을 배양물 ml당 콜로니-형성 단위(CFU)로서 표현하였다.
모의 위장관 시스템에서 엘. 류테리 AMBV339의 생존율 및 미생물군유전체 조절 시험
살아 있는 엘. 류테리 AMBV339를 세척하고, 식염수(0.9% NaCl)에 약 1.5x10^9 CFU/ml로 재현탁시키거나 코코넛 밀크에서 배양된 엘. 류테리 AMBV339를 모의 인간 위장 시스템 설정에 첨가하였다. Mortele 등 (2019)을 참조한다. 간략하게는, 시스템은 위(37℃, 부피: 34 ml, pH 2 내지 4, 첨가된 시약: 16 ml), 소장(37℃, 부피: 50 ml, pH 7.5, 첨가된 시약: 15 ml) 및 대장의 상이한 부분(37℃, 혐기성, 부피: 65 ml, pH: 5.8, 첨가된 시약: 55 ml)을 나타내는 용기로 구성되었다. 소장 및 대장 부분에 인간 대변 미생물군을 접종하였다. 정기적인 시점에서 시스템으로부터 샘플을 취하고 MRS 한천 상에 평판배양함으로써 엘. 류테리 AMBV339 생존율을 평가하고, R 스튜디오에서의 후속적인 생물정보학 분석과 함께 16S rRNA 시퀀싱을 사용하여 대변 미생물군유전체 조성물을 분석하였다.
결과
리보플라빈 생산 경로의 유전자는 리모실락토바실러스 류테리 AMBV339에 존재한다
엘. 류테리 AMBV339 균주의 전체 게놈을 시퀀싱하고 주석을 달았다. 리보플라빈 생산 및 가능하게는 수송에 필요한, 하기를 포함한 리보플라빈 합성 경로의 모든 유전자를 엘. 류테리 AMBV339의 게놈에서 검출하였다:
· 3,4-디하이드록시-2-부타논 4-포스페이트 신타제(EC 4.1.99.12)/GTP 사이클로하이드롤라제 II(EC 3.5.4.25)
· 디아미노하이드록시포스포리보실아미노피리미딘 데아미나제(EC 3.5.4.26)/5-아미노-6-(5-포스포리보실아미노)우라실 리덕타제(EC 1.1.1.193)
· 6,7-디메틸-8-리비틸루마진 신타제(EC 2.5.1.78)
· 리보플라빈 신타제 진정세균/진핵생물(EC 2.5.1.9)
· FMN 아데닐릴트랜스퍼라제(EC 2.7.7.2)/리보플라빈 키나제(EC 2.7.1.26)
· RibT 단백질, 리보플라빈 생합성 아세틸트랜스퍼라제(GNAT) 계열
· 리보플라빈 ECF 수송체의 기질-특이적 구성요소 RibU.
여러 다른 비-리보플라빈-과생산 엘. 류테리 단리물, 예컨대 엘. 류테리 AMBV336 및 엘. 류테리 AMBV337, 뿐만 아니라 유형 균주 엘. 류테리 DSM20016과 비교하여 천연적으로 존재하는 유전자 변경을 엘. 류테리 AMBV339에서 균주 게놈의 생물정보학-기초 정렬을 사용하여 검출하였다. 유전자 변경은 도 1에 도시된 바와 같이 디아미노하이드록시포스포리보실아미노피리미딘 데아미나제(EC 3.5.4.26)/5-아미노-6-(5-포스포리보실아미노)우라실 리덕타제(EC 1.1.1.193), 리보플라빈 신타제 진정세균/진핵생물(EC 2.5.1.9), 3,4-디하이드록시-2-부타논 4-포스페이트 신타제(EC 4.1.99.12)/GTP 사이클로하이드롤라제 II(EC 3.5.4.25) 및/또는 6,7-디메틸-8-리비틸루마진 신타제(EC 2.5.1.78)에 대한 서열을 포함하는 리보플라빈 합성을 담당하는 유전자 클러스터의 업스트림의 조절 영역에 특이적으로 존재하는 것으로 발견되었다. 균주 엘. 류테리 DSM20016(종의 유형 균주; https://lpsn.dsmz.de/species/limosilactobacillus-reuteri)의 게놈 어셈블리 NC_009513.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_009513)에서, 이러한 유전자 변경의 위치는 염기 931,824(엘. 류테리 DSM20016에서 구아닌으로부터 엘. 류테리 AMBV339에서 티민으로)에 있다.
리보플라빈은 실험실 배지에서 엘. 류테리 AMBV339에 의해 고농도로 생산된다
리보플라빈의 높은 수준의 형광 특징(대략 440 nm에서의 여기 및 대략 520 nm에서의 방출)을 MRS에서 밤새 성장된 엘. 류테리 AMBV339 전체 배양물 및 상응하는 세포-무함유 배양 상등액에서 관찰하였다(도 2a). 형광은 세포 펠릿에서 훨씬 더 낮았으며, 이는 리보플라빈이 대체로 배출됨을 시사한다. 엘. 류테리 AMBV339와 비교하여, 동일한 참가자로부터 단리된 다른 질내 엘. 류테리 균주 AMBV336, AMBV337, AMBV368, AMBV369 및 AMBV371의 선택물, 및 상업적인 프로바이오틱 균주 엘. 류테리 RC-14와 락티카세이바실러스 람노수스 GG의 전체 배양물, 세포-무함유 배양 상등액 및 세포 펠릿에서 검출된 형광은 무시할 만하였으며, 이는 낮은 수준의 리보플라빈 생산, 또는 리보플라빈 생산 없음을 나타낸다.
엘. 류테리 AMBV339 상등액에서의 리보플라빈 생산의 초기 정량화를 MRS 내 순수한 리보플라빈의 연속의 희석물에 기초한 표준 곡선에 대해 수행하였다. 2개의 보완 방법을 실시하였다: 대략 440 nm에서의 여기 및 520 nm에서의 방출을 이용하는 용액 내 리보플라빈의 형광-기초 검출 및 444 nm에서의 흡광도를 사용하는 용액 내 리보플라빈의 정량적 분석. 두 방법을 모두 이용하여, 엘. 류테리 AMBV339 상등액 내 리보플라빈을 대략 40 μg/ml로 정량화하였으며, 한편 다른 질내 엘. 류테리 AMBV336과 AMBV368, 및 상업적인 프로바이오틱스 엘. 류테리 RC-14와 엘. 람노수스 GG의 배양 상등액 내 리보플라빈 수준은 0에 가까웠다(도 2b 및 도 2c).
이들 결과를 비타민 검출을 위한 표준 HPLC-UV를 사용하여 확증하였고, MRS 중 밤새 엘. 류테리 AMBV339 배양물의 상등액 내 리보플라빈을 대략 18.7 μg/ml에서 정량화하였다. 엘. 람노수스 GG의 배양 상등액에서는 어떠한 리보플라빈도 검출되지 않은 반면, 한편 시험된 다른 엘. 류테리는 이의 밤새 배양 상등액에서 하기 리보플라빈 농도를 가졌다: 엘. 류테리 AMBV336 0.933 μg/ml, 엘. 류테리 AMBV337 0.604 μg/ml, 엘. 류테리 엘. 류테리 AMBV368 0.953 μg/ml, 엘. 류테리 AMBV369 0.706 μg/ml, 엘. 류테리 AMBV370 0.953 μg/ml, 엘. 류테리 AMBV371 0.585 μg/ml 및 엘. 류테리 RC-14 0.423 μg/ml.
엘. 류테리 AMBV339는 다양한 유제품 매트릭스에서 성장하고 리보플라빈을 생산한다
엘. 류테리 AMBV339의 성장(도 3a) 및 리보플라빈 생산에 대한 판독물로서의 형광(도 3b)을 다수의 시판되는 식품 매트릭스: 코코넛 밀크, 두유, 전지유, 반탈지유, 버터 밀크, 사과 주스 또는 음성 대조군으로서 MRS 배양액에서 평가하였고, 엘. 류테리 AMBV336 및 엘. 류테리 RC-14와 비교하였다.
모든 엘. 류테리 균주는 코코넛 밀크, 두유, 전지유, 반탈지유, 버터 밀크 및 MRS에서 양호하게 성장하였고, 이의 성장은 사과 주스에서는 무시할 만하였다(도 3a). 엘. 류테리 AMBV339는 코코넛 밀크(6,07E+10 CFU/ml)에서 최고 콜로니-형성 단위 (CFU)/ml에 도달하였고, 두유(5,00E+10 CFU/ml), 및 전지유(4,20E+10 CFU/ml), 뒤이어 버터 밀크(1,50E+08 CFU/ml), MRS(6,70E+08 CFU/ml) 및 반탈지유(1,07E+07 CFU/ml)였다. 그러므로, 식품 매트릭스에서의 엘. 류테리 AMBV339의 성장은 특히 코코넛 밀크, 두유 및 전지유에서 상업적인 프로바이오틱 균주 엘. 류테리 RC-14의 성장과 유사하였다.
리보플라빈 생산을 반영하는 높은 형광 수준은, 사과 주스에서의 성장 결여로 인한 것일 가능성이 있는 사과 주스를 제외한, 모든 식품 매트릭스(코코넛 밀크, 두유, 전지유, 반탈지유, 버터 밀크) 중 엘. 류테리 AMBV339 배양물에서 검출되었다. 동일한 식품 매트릭스에서 엘. 류테리 AMBV336 및 엘. 류테리 RC-14의 형광은 유의하게 더 낮았으며, 이는 낮은 수준의 리보플라빈 생산, 또는 리보플라빈 생산 없음을 나타낸다.
베이스라인에 비해 엘. 류테리 AMBV339에 의한 가장 많은 리보플라빈 생산량은 코코넛 밀크에서 검출되었다(도 3b). 상응하는 형광값은 MRS에서의 형광값과 유사하였으며, 따라서 코코넛 밀크에서의 엘. 류테리 AMBV339에 의한 리보플라빈 생산량은 18 내지 40 μg/ml 범위에 있을 것으로 예상된다. 가장 높은 절대 형광값은 버터 밀크 중 엘. 류테리 AMBV339 배양물에서 검출되었다.
또한, 엘. 류테리 AMBV339가 광범위하게 사용되는 낙농 종균 스트렙토콕커스 서모필루스와 함께 코코넛 밀크에서 공동배양된 경우, 이는 리보플라빈 생산을 나타내는 높은 형광값을 보유하였다(도 3c). 결과적으로, 엘. 류테리 AMBV339를 그 자체로 사용하는 것뿐만 아니라 발효 식품에서의 리보플라빈 생산을 위한 다른 종균 배양물과 조합하여 사용하는 것이 가능하다.
0.9% NaCl 용액에 재현탁된 엘. 류테리 AMBV339 세포 또는 코코넛 밀크 내 엘. 류테리 AMBV339 배양물을 또한 모의 인간 위장관에 접종하였다. 엘. 류테리 AMBV339는 모의 인간 위장관 전체에 걸쳐 생존하였다(도 4a). 구체적으로, 이는 도 4a에 도시된 바와 같이 pH 2, 3 및 4의 위액 조건에서 90분 동안 생존하였으며, 106 내지 1011 CFU/ml로 나타났다. 이는 엘. 류테리 AMBV339가 위(stomach)의 3개의 상이한 산성 조건에서 최대 90분 동안 생존할 수 있음을 나타낸다. 또한 소장 및 대장에서, 엘. 류테리 AMBV339는 모의 위장관에서 72시간 후 코코넛 밀크로 전달된 경우 평균 105 CFU/ml이 생존하였고, 0.9% NaCl 용액으로 전달된 경우 평균 105 CFU/ml이 생존하였다(도 4b).
모의 위장관에의 엘. 류테리 AMBV339의 첨가로 인해 대변 미생물군유전체 조성물이 일관되게 조절되는 것이 관찰되었으며, 이는 대변 그 자체와 비교하여 엘. 류테리 AMBV339가 첨가된 대변의 미생물군유전체의 비유사성이 증가되었음을 반영하였다(도 4c). 엘. 류테리 AMBV339의 이러한 미생물군유전체 조절 효과는 리보플라빈-과생산 균주, 예컨대 엘. 류테리 AMBV339의 첨가로부터 이익을 얻을 수 있는 종에 잠재적인 유익한 특성을 가질 수 있었다.
결론적으로, 건강한 인간 단리물 엘. 류테리 AMBV339에 의한 리보플라빈의 다량 생산은 실험실 조건 및 식품 매트릭스에서 실증되었다. 엘. 류테리 AMBV339의 게놈 서열은 조절 유전자 서열에 돌연변이가 있는 리보플라빈 합성 경로의 모든 유전자를 함유하는 것으로 나타났으며, 이는 리보플라빈을 과생산하는 이의 타고난 능력을 시사한다. 리보플라빈 표준 곡선에 대한 형광-기초, 흡광도-기초 및 HPLC-UV-기초 측정은 엘. 류테리 AMBV339 배양물 및 세포-무함유 상등액에서 천연적인 리보플라빈 생산을 대략 18 내지 40 μg/ml로 정량화된 반면, 한편 모든 다른 시험된 엘. 류테리 균주 및 엘. 람노수스 GG의 배양물 내 리보플라빈 수준은 0에 가까웠다. 그러므로, 엘. 류테리 AMBV339에 의한 리보플라빈 생산 수준은 문헌에서의 다른 락토바실러스에 의한 천연적인 생산에 대해 보고된 수준(2.3 내지 3 μg/ml)보다 유의하게 더 높다. 더욱이, 엘. 류테리 AMBV339는 광범위한 식품 매트릭스(코코넛 밀크, 두유, 전지유, 반탈지유, 버터 밀크)에서 상업적인 프로바이오틱 엘. 류테리 RC-14와 비슷한 수준으로 양호하게 성장하였다. 모든 이들 식품 매트릭스에서, 엘. 류테리 AMBV339에 의한 유의한 리보플라빈 생산이 검출되었으며, 베이스라인에 비해 가장 많은 리보플라빈 생산량은 코코넛 밀크에서 18 내지 40 μg/ml 범위로 추정되었고, 리보플라빈의 가장 많은 절대 수준은 버터 밀크에서 도달되었다. 마지막으로, 엘. 류테리 AMBV339는 인간 위장관의 모의 조건에서 생존하였고, 대변 미생물군유전체 조절을 제공하였다.
참조 문헌
BCCM Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) Laboratorium voor Microbiologie - Bacterienverzameling (LMG) BCCMLMGP-32020 20201009
SEQUENCE LISTING <110> Universiteit Antwerpen <120> Limosilactobacillus reuteri strain with high riboflavin production and uses thereof <130> UNA-050 <150> EP20210606.8 <151> 2020-11-30 <160> 7 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 350 <212> DNA <213> Lactobacillus <220> <223> AMBV339 - Intergenic Regulatory Region <400> 1 ctaatttatt gtttacaaaa ataatgtgaa gagttaaact atgtgtaaac ttaacaatct 60 aaattttctt cggggcagtg tgaaattccc aaccgacggt aacaagtacg cttggagtcc 120 gtgacccgtt agcatttatg ttaacggttg aaccagtgaa aatctggtac cgacagtata 180 gtctggatgg gagaagaaaa ctaaaaatga cacaatcagt ttaaacgtaa agccccggat 240 agcagtgatg ttatccggtt ttattttgcc gagctgtttt ttaggtaacc atttaacgcc 300 ccgagagaaa atcttagggc gtttttattt tggaaaggat ggttagagtg 350 <210> 2 <211> 350 <212> DNA <213> Lactobacillus <220> <223> AMBV371 - Intergenic Regulatory Region <400> 2 ctaatttatt gtttacaaaa ataatgtgaa gagttaaact atgtgtaaac ttaacaatct 60 aaattttctt cggggcaggg tgaaattccc aaccgacggt aacaagtacg cttggagtcc 120 gtgacccgtt agcatttatg ttaacggttg aaccagtgaa aatctggtac cgacagtata 180 gtctggatgg gagaagaaaa ctaaaaatga cacaatcagt ttaaacgtaa agccccggat 240 agcagtgatg ttatccggtt ttattttgcc gagctgtttt ttaggtaacc atttaacgcc 300 ccgagagaaa atcttagggc gtttttattt tggaaaggat ggttagagtg 350 <210> 3 <211> 350 <212> DNA <213> Lactobacillus <220> <223> AMBV369 - Intergenic Regulatory Region <400> 3 ctaatttatt gtttacaaaa ataatgtgaa gagttaaact atgtgtaaac ttaacaatct 60 aaattttctt cggggcaggg tgaaattccc aaccgacggt aacaagtacg cttggagtcc 120 gtgacccgtt agcatttatg ttaacggttg aaccagtgaa aatctggtac cgacagtata 180 gtctggatgg gagaagaaaa ctaaaaatga cacaatcagt ttaaacgtaa agccccggat 240 agcagtgatg ttatccggtt ttattttgcc gagctgtttt ttaggtaacc atttaacgcc 300 ccgagagaaa atcttagggc gtttttattt tggaaaggat ggttagagtg 350 <210> 4 <211> 350 <212> DNA <213> Lactobacillus <220> <223> AMBV368 - Intergenic Regulatory Region <400> 4 ctaatttatt gtttacaaaa ataatgtgaa gagttaaact atgtgtaaac ttaacaatct 60 aaattttctt cggggcaggg tgaaattccc aaccgacggt aacaagtacg cttggagtcc 120 gtgacccgtt agcatttatg ttaacggttg aaccagtgaa aatctggtac cgacagtata 180 gtctggatgg gagaagaaaa ctaaaaatga cacaatcagt ttaaacgtaa agccccggat 240 agcagtgatg ttatccggtt ttattttgcc gagctgtttt ttaggtaacc atttaacgcc 300 ccgagagaaa atcttagggc gtttttattt tggaaaggat ggttagagtg 350 <210> 5 <211> 350 <212> DNA <213> Lactobacillus <220> <223> AMBV337 - Intergenic Regulatory Region <400> 5 ctaatttatt gtttacaaaa ataatgtgaa gagttaaact atgtgtaaac ttaacaatct 60 aaattttctt cggggcaggg tgaaattccc aaccgacggt aacaagtacg cttggagtcc 120 gtgacccgtt agcatttatg ttaacggttg aaccagtgaa aatctggtac cgacagtata 180 gtctggatgg gagaagaaaa ctaaaaatga cacaatcagt ttaaacgtaa agccccggat 240 agcagtgatg ttatccggtt ttattttgcc gagctgtttt ttaggtaacc atttaacgcc 300 ccgagagaaa atcttagggc gtttttattt tggaaaggat ggttagagtg 350 <210> 6 <211> 350 <212> DNA <213> Lactobacillus <220> <223> AMBV336 - Intergenic Regulatory Region <400> 6 ctaatttatt gtttacaaaa ataatgtgaa gagttaaact atgtgtaaac ttaacaatct 60 aaattttctt cggggcaggg tgaaattccc aaccgacggt aacaagtacg cttggagtcc 120 gtgacccgtt agcatttatg ttaacggttg aaccagtgaa aatctggtac cgacagtata 180 gtctggatgg gagaagaaaa ctaaaaatga cacaatcagt ttaaacgtaa agccccggat 240 agcagtgatg ttatccggtt ttattttgcc gagctgtttt ttaggtaacc atttaacgcc 300 ccgagagaaa atcttagggc gtttttattt tggaaaggat ggttagagtg 350 <210> 7 <211> 349 <212> DNA <213> Lactobacillus <220> <223> DSM20016 - Intergenic Regulatory Region <400> 7 aatttgctgt ttacaaaaag aaagtgaaga gttacactat atgtaaattt aacaatctaa 60 ttttcttcgg ggcagggtga aattcccaac cgacggtaac aagtacgctt ggagtccgtg 120 acccgttagc atttatgtta acggttgaac cagtgaaaat ctggtaccga cagtatagtc 180 tggatgggag aagaaaacta aaaatgacac aatcagttta aacgtaaagc cccggatagc 240 agtgatgtta tccggtttta tttttgccga gctgtttttt taagttaact atttaacgtc 300 ccgagagaaa tcttaggacg tttttatttt ggaaaggatg gttagagtg 349

Claims (18)

  1. 리모실락토바실러스 류테리(Limosilactobacillus reuteri)(엘. 류테리(L. reuteri)) 종의 단리된 박테리아 균주로서,
    상기 균주는 리모실락토바실러스 류테리 유형 균주 DSM20016의 하나 이상의 유전자 또는 업스트림 조절 서열과 비교하여 상기 유전자 또는 업스트림 조절 서열에 변경을 가지며; 상기 하나 이상의 유전자는 하기를 포함하는 목록으로부터 선택되는 유전자 생성물을 인코딩하는, 단리된 박테리아 균주:
    - 디아미노하이드록시포스포리보실아미노피리미딘 데아미나제(EC 3.5.4.26) 및/또는 5-아미노-6-(5-포스포리보실아미노)우라실 리덕타제(EC 1.1.1.193),
    - 리보플라빈 신타제 진정세균/진핵생물(EC 2.5.1.9),
    - 3,4-디하이드록시-2-부타논 4-포스페이트 신타제(EC 4.1.99.12) 및/또는 GTP 사이클로하이드롤라제 II(EC 3.5.4.25),
    - 6,7-디메틸-8-리비틸루마진 신타제(EC 2.5.1.78),
    - 리보플라빈 ECF 수송체의 RibU,
    - FMN 아데닐릴트랜스퍼라제(EC 2.7.7.2) 및/또는 리보플라빈 키나제(EC 2.7.1.26),
    - RibT 리보플라빈 생합성 아세틸트랜스퍼라제(GNAT) 계열.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 유전자는 하기를 포함하는 목록으로부터 선택되는, 단리된 박테리아 균주:
    - 디아미노하이드록시포스포리보실아미노피리미딘 데아미나제(EC 3.5.4.26) 및/또는 5-아미노-6-(5-포스포리보실아미노)우라실 리덕타제(EC 1.1.1.193),
    - 리보플라빈 신타제 진정세균/진핵생물(EC 2.5.1.9),
    - 3,4-디하이드록시-2-부타논 4-포스페이트 신타제(EC 4.1.99.12) 및/또는 GTP 사이클로하이드롤라제 II(EC 3.5.4.25),
    - 6,7-디메틸-8-리비틸루마진 신타제(EC 2.5.1.78),
    - 리보플라빈 ECF 수송체의 RibU.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 균주는 상기 유형 균주의 게놈 어셈블리 NC_009513.1 내 염기 931,824에 변경을 포함하고, 특히 상기 변경은 구아닌으로부터 티민으로의 변경인, 단리된 박테리아 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 균주는 기탁 번호 LMG P-32020 하에 BCCM에 기탁된, 단리된 박테리아 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 단리된 박테리아 균주를 포함하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 또는 제5항에 있어서,
    인간 또는 동물 의학에서 약제로서 사용하기 위한, 단리된 박테리아 균주 또는 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 또는 제5항에 있어서,
    대상체에서 감소된 리보플라빈 수준과 연관된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 단리된 박테리아 균주 또는 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    감소된 리보플라빈 수준과 연관된 질환은 신경계 질환, 피부 질환, 호흡기 질환, 감소된 적혈구 수준과 연관된 질환, 안 질환(eye disease), 방해된 철 대사와 연관된 질환, 산화 스트레스와 연관된 질환, 비뇨생식기 질환 또는 감염, 위장 질환, 일반 피로 또는 허약, 대사 질환(예를 들어 감소된 비타민 수준과 연관됨), 면역 질환, 두통 또는 편두통, 임신, 암 및 연관된 바이러스, 박테리아 및 진균류 감염을 포함하는 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 단리된 박테리아 균주 또는 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 또는 제5항에 있어서,
    장 미생물군유전체 장내 세균 불균형(gut microbiome dysbiosis)의 예방 및 치료, 장 미생물군유전체 회복력(gut microbiome resilience)의 촉진, 및/또는 건강-관련 장 분류군(gut taxa)의 촉진에 사용하기 위한, 단리된 박테리아 균주 또는 조성물.
  10. 일반 피로 또는 허약의 예방 및/또는 감소에 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단리된 박테리아 균주 또는 제5항의 조성물의 비치료적 용도.
  11. 화장품 또는 개인 관리 제품에 있어서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단리된 박테리아 균주 또는 제5항의 조성물의 비치료적 용도.
  12. 리보플라빈 생산 방법에 있어서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단리된 박테리아 균주 또는 제5항의 조성물의 용도.
  13. 제12항에 있어서,
    리보플라빈 생산 방법은 발효 공정인, 용도.
  14. 프로바이오틱, 포스트바이오틱, 프리바이오틱 또는 신바이오틱으로서의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 단리된 박테리아 균주 또는 제5항에 따른 조성물의 용도.
  15. 식품 또는 사료 산업에 있어서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단리된 박테리아 균주 또는 제5항의 조성물의 용도.
  16. 제15항에 있어서,
    식품 또는 사료 산업에 있어서 착색제 또는 종균 배양(starter culture)으로서의 단리된 박테리아 균주 또는 조성물의 용도.
  17. 리보플라빈 생산 방법으로서,
    리보플라빈의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 박테리아 균주 또는 제5항의 조성물을 수성 배지에서 인큐베이션하는, 리보플라빈 생산 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 균주 또는 제5항에 따른 조성물을 제공하는 단계;
    b) 리보플라빈 생산을 가능하게 하는 조건 하에 수성 배양 배지에서 상기 박테리아 균주 또는 상기 조성물을 인큐베이션하는 단계; 및 선택적으로
    c) 리보플라빈을 배양 배지로부터 단리하고 정제하는 단계
    를 포함하는, 리보플라빈 생산 방법.
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