CN117187144B - 一株罗伊氏粘液乳杆菌zf625及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体公开了一株罗伊氏粘液乳杆菌ZF625及其应用。本发明提供的罗伊氏粘液乳杆菌ZF625具有抑制细菌和霉菌效果，可用于大豆制品的发酵。本发明还提供了一种蛋白粉的制备方法，工艺简单，成本较低，通过罗伊氏粘液乳杆菌ZF625和米曲霉的共同发酵，使得豆粕中的蛋白质被充分释放出来，制备的蛋白粉具有较高含量的游离氨基酸、小肽和有机酸，不含有抗营养因子，具有较好的鲜香味，且香气强烈持久，完全掩盖了蛋白粉的豆腥味，且产品本身具有很好的抑菌作用，更有利于延长蛋白粉的保质期和使用周期，提高了蛋白粉的品质，具有较好的实际应用价值。

Description

一株罗伊氏粘液乳杆菌ZF625及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一株罗伊氏粘液乳杆菌ZF625及其应用。

背景技术

大豆含有丰富的蛋白质，是重要的植物蛋白来源。大豆经过不同的生产工艺制备成不同的产品，如：组织蛋白、浓缩蛋白、分离蛋白、豆粉、豆粉豆粕、饲料等等。这其中有一类植物蛋白产品-大豆蛋白粉，饱受人们的青睐，其通过对大豆不断进行加工提取，使蛋白质含量大大提高，满足人们对蛋白质的营养性和功能性需求。

市场上比较常见的大豆蛋白粉主要包含大豆粉、大豆浓缩蛋白、大豆分离蛋白、大豆组织蛋白和大豆水解蛋白粉。一般都是通过物理和化学手段获得，提取工艺较为复杂，成本较高，蛋白得率不高，造成了蛋白质资源的严重浪费，同时缺失的蛋白质致使各氨基酸失衡，大大降低了蛋白质的营养价值。还有一类是通过微生物如乳酸菌的发酵作用方式来制备蛋白粉，包含但不限于大豆蛋白粉。崔宪,刘容旭,姜帆,等发表于食品工业科技(2016,37(3):5)的《植物乳杆菌发酵对大豆分离蛋白功能性质影响研究》一文中是以低温脱脂豆粕为原料，经植物乳杆菌液态发酵，通过碱溶液法提取大豆蛋白，研究发酵过程对大豆蛋白的结构和性质的影响。该方法蛋白提取率不高，且利用碱溶液处理极有可能造成蛋白变性失活。

大豆中含有一些抗营养因子，有些甚至含有毒性，如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白等，因此在生产加工过程中必须将此类有害物质除去或使之失去活性。较为普遍的方法是加热法或酸碱法等，采用这类方法极易导致蛋白质的变性、溶解度降低，从而影响蛋白质的功能特性发挥。此外，目前市场上部分大豆蛋白粉，还存在生产过程中未脱腥或者脱腥不彻底，产品有豆腥味的现象，严重影响了产品的口感和品质。还有需要引起重视的地方就是大豆蛋白粉从原料到生产加工为成品的过程中，很容易受到各种细菌和霉菌等杂菌的污染。大豆原料本身携带的杂菌在原料阶段未被处理干净，加工阶段的不同原料前后交叉污染、设备污染和车间生产环境与存储环境中的过高杂菌，以及运输过程中的破袋和使用过程中敞口暴露等问题，均会造成大豆蛋白粉的质量和品质下降而无法正常使用。

发明内容

基于以上技术问题，本发明的主要目的在于克服上述背景技术的不足之处，提供了一株罗伊氏粘液乳杆菌ZF625，该菌株具有抑制细菌和霉菌效果，可用于大豆制品的发酵。该菌株用于制备大豆蛋白粉，工艺简单，成本较低，制备的蛋白粉具有较高含量的游离氨基酸、小肽和有机酸，不含有抗营养因子，具有较好的鲜香味，且香气强烈持久，完全掩盖了蛋白粉的豆腥味，提高了其品质。

为实现上述目的，发明人进行了深入研究，并经重复多次研究论证而完成获得本发明方案，具体如下：

第一方面，本申请实施例提供了一株罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusreuteri)ZF625，其特征在于，所述罗伊氏粘液乳杆菌ZF625的保藏编号为GDMCC No:63787。

该菌株在MRS培养基上的菌落为白色或乳白色，菌落较为规则，圆形，凸起，表面光滑，不透明，边缘整齐，直径约0.6～1.8mm，革兰氏染色呈阳性，菌体呈现短杆和长杆形态。

第二方面，本申请实施例提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包含上述罗伊氏粘液乳杆菌ZF625。

第三方面，本申请实施例提供了上述罗伊氏粘液乳杆菌ZF625或发酵菌剂在大豆制品发酵中的应用。

第四方面，本申请实施例提供了上述罗伊氏粘液乳杆菌ZF625或发酵菌剂在制备蛋白粉中的应用。

第五方面，本申请实施例提供了一种蛋白粉的制备方法，包含以下步骤：

(1)将大豆粕、麸皮、水混合，灭菌，待冷却后，接种米曲霉和上述的罗伊氏粘液乳杆菌ZF625，33-37℃厌氧发酵20-28h后，再在28-32℃发酵44-52h；

(2)上一步发酵完的物料加水混合后，升温至42-48℃搅拌发酵14-18h，得到发酵液；

(3)按发酵液质量的0.2-0.3％加入外源碱性和中性蛋白酶，调节pH至中性，控制温度50-56℃，搅拌酶解8-12h，得到酶解液；

(4)将酶解液离心后取上清进行干燥，得到蛋白粉。

第六方面，本申请实施例提供了一种蛋白粉，所述蛋白粉由本发明所述的方法制备而成。

第七方面，本申请实施例提供了一种食品添加剂，所述食品添加剂包含本发明所述的蛋白粉。

第八方面，本申请实施例提供了所述食品添加剂在肉汤或骨汤中的应用，优选的所述肉汤或骨汤中中蛋白粉的添加量为0.6-1％(w/w)。其中，肉汤包括但不限于使用猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鱼肉等肉类作为原料烹制而成，骨汤包括但不限于使用猪骨、牛骨头、羊骨、鸡骨等骨头作为原料烹制而成。

第九方面，本申请实施例提供了一种抑菌剂，所述抑菌剂包含上述罗伊氏粘液乳杆菌ZF625。

本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本发明提供的一株罗伊氏粘液乳杆菌ZF625，具有抑制细菌和霉菌效果，可用于大豆制品的发酵，使产品本身具有很好的抑菌效果，有利于延长产品的保质期和使用周期，提高产品品质。

2、本发明提供的一株罗伊氏粘液乳杆菌ZF625可用于制备大豆蛋白粉，还提供了蛋白粉的制备方法，从工艺上来讲，采用微生物发酵法替代物理化学法，不仅工艺简单，成本较低，更为重要的是提高了大豆中蛋白质的利用率，避免了浪费；从产品风味上看，去除了其中的抗营养因子，而且还解决了产品存在的风味隐患的问题，且具有独特的持久鲜香味特征。

3、本发明提供的蛋白粉制备方法，通过罗伊氏粘液乳杆菌ZF625和米曲霉的共同发酵，使得豆粕中的蛋白质被充分释放出来，提高了蛋白质的含量和利用率，充分保证了蛋白粉的营养价值。

4、本发明制备的蛋白粉中含有大量的游离氨基酸、小肽和酸性物质(乳酸、乙酸等)，极易被人体吸收利用，营养价值高。

附图说明

图1为罗伊氏粘液乳杆菌ZF625菌落形态图；

图2为罗伊氏粘液乳杆菌ZF625显微镜下形态图；

图3为鸡汤中添加大豆蛋白粉的鉴评结果示意图；

本发明提供的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)ZF625，已于2023年9月12日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:63787；该菌株于2023年9月12日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2023年9月12日检测为存活菌株。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规食品级试剂、方法和设备。

本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1目标菌株筛选

1.菌株初筛

称取1g发酵蔬菜样品到装有10mL无菌水的无菌离心管中，充分震荡混匀后转接入100mL的液体MRS培养基(含10％NaCl)中，37℃厌氧条件培养48h后，取少量培养液梯度稀释到10^-1、10^-2、10^-3后分别吸取100μL菌液涂布于MRS固体培养基(含10％NaCl)上，37℃厌氧环境培养48h，挑选单菌落(菌落形状较为规则，圆形，凸起，表面光滑)接种到液体MRS培养基(含10％NaCl)中37℃厌氧条件培养48h，分别测定吸光值(OD₆₀₀)和乳酸含量，以吸光值(OD₆₀₀)和乳酸均较高的菌株作为初筛菌株，共获得6株菌株，编号分别为：LR02、LR09、LR15、LR26、LR30、LR32。初筛菌株吸光值(OD₆₀₀)和乳酸含量的检测结果见下表1。乳酸含量测定：参考GB5009.157-2016食品中有机酸的测定。

表1初筛菌株的吸光值和乳酸含量

菌株名称	LR02	LR09	LR15	LR26	LR30	LR32
							OD600	0.77	0.75	0.66	0.62	0.81	0.70
乳酸含量(g/L)	82.32	76.51	68.45	79.72	67.62	96.83

2.菌株复筛

对于初筛得到的耐盐菌株LR02、LR09、LR15、LR26、LR30、LR32，采用牛津杯法进行复筛。挑取上述单菌落接种于MRS培养基(含10％NaCl)中，37℃培养48h后收集上清液，与指示菌开展抑菌测试进行复筛，挑选抑菌效果最好的菌株作为目标菌株。

(1)对细菌的抑制测试

a.将大肠杆菌(Escherichia coli)K599(实验室保藏)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)H2.1201(实验室保藏)分别接种到LB培养基中，150rpm/min，37℃培养24h，分别获得大肠杆菌K599种子液和地衣芽孢杆菌H2.1201种子液备用；

b.将培养好的指示菌大肠杆菌K599种子液、地衣芽孢杆菌H2.1201种子液按照5000CFU/mL的量均匀涂布于LB培养基平板上，待平板干燥后用无菌镊子放置已灭菌的牛津杯于平板上，再取准备好的初筛菌株发酵液0.2mL加入牛津杯内；

c.37℃条件培养24h后测量平板的抑菌圈直径大小，结果记录于表2中。

(2)对霉菌的抑制测试

a.将霉菌(Aspergillus)SZY(实验室保藏)接种到麦芽汁固体培养基中30℃，培养48h，获得生长旺盛的霉菌菌板；

b.从培养好的指示菌霉菌SZY平板上取菌丝体加入无菌水中稀释，按照5000CFU/mL的量均匀涂布于麦芽汁培养基平板上，待平板干燥后用无菌镊子放置已灭菌的牛津杯于平板上，再取准备好的初筛菌株发酵液0.2mL加入牛津杯内；

c.30℃条件培养48h后测量平板的抑菌圈直径大小，结果记录于表2中。

表2复筛菌株的抑菌圈测定结果

如表2结果所示，菌株LR32的抑菌能力最强，为目标菌株，该菌株菌落重复分离纯化3次以上后，在MRS培养基上的菌落为白色或乳白色，菌落较为规则，圆形，凸起，表面光滑，不透明，边缘整齐，直径约0.6～1.8mm，革兰氏染色呈阳性，菌体呈现短杆和长杆形态。菌落形态和革兰氏染色结果分别如图1和图2所示。

3.菌株鉴定与保藏

将上述筛选得到的菌株LR32送广东省微生物分析检测中心进行菌种鉴定，鉴定结果为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，将其命名为罗伊氏粘液乳杆菌ZF625，于2023年9月12日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:63787。

实施例2罗伊氏粘液乳杆菌ZF625用于制备蛋白粉

1.固体发酵：

将大豆粕、麸皮、水按照质量比100：1：120混合均匀，放入发酵罐中，121℃、0.1MPa蒸汽灭菌1h。灭菌结束后冷却物料，分成3组。第一组单独接种米曲霉孢子粉；第二组单独接种罗伊氏粘液乳杆ZF625菌液，第三组同时接种米曲霉孢子粉和罗伊氏粘液乳杆ZF625菌液。接种前的米曲霉孢子数为3*10¹¹CFU/g，罗伊氏粘液乳杆菌ZF625活菌数为3*10¹⁰CFU/g，接种量分别为物料质量的0.05％和2％。接种后混合均匀物料，摊开成长方形的曲堆，盖上一层薄膜，保持厌氧环境，温度控制35℃，厚度控制在3cm，24h翻动一次物料，除去薄膜，温度降至30℃，继续发酵至48h；

2.液体发酵：

将上一步发酵完的物料混合均匀，按照物料与水的质量比1:10的比例加入水，升温到45℃，持续搅拌发酵16h；

3.外源蛋白酶解：

步骤2发酵完的发酵液，按照其质量0.25％的比例加入外源碱性和中性蛋白酶，用NaOH调节发酵液的pH 7.2，温度控制53℃，继续搅拌10h充分酶解；

4.离心处理：

将酶解结束的酶解液通过高速离心机5000rpm离心处理，保留上清液备用；

5.喷雾干燥：

将获得的上清液加入辅料淀粉、盐吸附，利用喷雾干燥设备获得干燥成品，其中进风温度180℃，出风温度60℃；

6.成品的检测分析：

取制备好的蛋白粉样品1g加水稀释10倍，震荡溶解，用0.45μm的滤膜过滤后，测定蛋白粉中氨基酸态氮、全氮、小肽分子量、总酸、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白(上海酶联生物科技有限公司检测试剂盒)含量，并按实施例1中方法测试对细菌和霉菌的抑制效果。检测结果记录于表3中。

表3不同菌株发酵的蛋白粉的指标测定结果

如表3结果所示，第三组混合米曲霉和罗伊氏粘液乳杆菌ZF625共同发酵制备的蛋白粉，与单独用混合米曲霉或者罗伊氏粘液乳杆菌ZF625相比，蛋白粉的氨基酸态氮、全氮、分子量小于2 KD的小肽、总酸及抑菌效果指标均得到了显著性提升，抗营养因子几乎被完全去除。这可能是因为在制备蛋白粉的过程中引入罗伊氏粘液乳杆菌ZF625进行发酵，产生了一些分解豆粕的蛋白酶，将大分子蛋白分解成更小分子的蛋白，同时使得豆粕的糖类和脂类物质被降解地更加彻底，抗营养因子被分解，另外在发酵过程中可能提高了原有抑菌物质生成比例或者代谢生成了新的抑菌物质。

实施例3蛋白粉在鸡汤中的应用测试

参考韩辉、贺稚非等人在2018年发表的文章《响应面法优化高压即食鸡汤熬煮工艺》，按照文章中的鸡汤加工制备工艺，本次测试是在鸡汤的熬制过程外源添加实施例2中第三组制备的蛋白粉，添加量分别为0.5％、1％、1.5％(w/w)，并测定最终鸡汤的全氮、氨基酸态氮、总酸含量，检测结果见表4。

表4不同比例的蛋白粉添加到鸡汤中的指标检测

蛋白粉添加量％	氨基酸态氮％	全氮％	总酸％
				0	0.12	0.29	＜0.01
0.5	0.15	0.33	0.035
				1	0.18	0.37	0.071
1.5	0.20	0.42	0.11

本实施例还召集10名有丰富经验的鉴评人员对鸡汤进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括体态、色泽、香气、鲜味、酸味和咸味，分值为0～10分，分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果总结见表5及图3。

表5不同比例的蛋白粉添加到鸡汤中的感官鉴评结果

从表4的结果中可以看出，与不添加蛋白粉的对照组相比，在鸡汤制备过程中添加实施例2制备的蛋白粉使得鸡汤中氨基酸态氮、全氮和总酸含量显著提高，且随着蛋白粉的添加量增加，氨基酸态氮、全氮和总酸三项指标含量随之增加。

从表5和图3感官鉴评结果显示，在鸡汤的熬制过程中添加一定量的实施例2制备的蛋白粉可显著改善鸡汤的风味和口感，但是添加量过高反而影响了风味和口感，其中添加量1％最适宜，风味上香气愉悦、醇厚、持久性好，口感上鲜味浓郁，回味性好。

实施例4蛋白粉在牛骨高汤中的应用测试

参考刘姣在2019年发表的文章《牛骨高汤的研制》，按照文章中的牛骨高汤加工制备工艺，本次测试是在高汤的熬制过程外源添加实施例2中第三组制备的蛋白粉，添加量分别为0.3％、0.6％、1％(w/w)，并测定最终高汤的全氮、氨基酸态氮、总酸含量，检测结果见表6。

表6不同比例的蛋白粉添加到牛骨高汤中的指标检测

蛋白粉添加量％	氨基酸态氮％	全氮％	总酸％
				0	0.22	1.86	0.20
0.3	0.23	1.88	0.22
				0.6	0.25	1.91	0.24
1	0.28	1.93	0.27

本实施例还召集10名有丰富经验的鉴评人员对牛骨高汤进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括体态、色泽、香气、鲜味、酸味和咸味，分值为0～10分，分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果总结见表7。

表7不同比例的蛋白粉添加到牛骨高汤中的感官鉴评结果

从表6的结果中可以看出，与不添加蛋白粉的对照组相比，在牛骨高汤制备过程中添加实施例2制备的蛋白粉使得高汤中氨基酸态氮、全氮和总酸含量均有所提高，且随着蛋白粉的添加量增加，氨基酸态氮、全氮和总酸三项指标含量随之增加。

从表7的感官鉴评结果显示，在牛骨高汤的熬制过程中添加一定量的实施例2制备的蛋白粉可改善高汤的各项感官指标，尤其是香气和鲜味显著提升，但是添加量过高反而不利于风味和口感的保持，其中添加量0.6％最适宜，风味上香气怡人、浓厚、持久，口感上鲜味独特突出，回味无穷。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一株罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）ZF625，其特征在于，所述罗伊氏粘液乳杆菌ZF625的保藏编号为GDMCC No:63787。

2.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包含权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌ZF625。

3.如权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌ZF625或权利要求2所述的发酵菌剂在大豆制品发酵中的应用，所述大豆制品为蛋白粉。

4.一种蛋白粉的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）将大豆粕、麸皮、水混合，灭菌，待冷却后，接种米曲霉和权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌ZF625，33-37℃厌氧发酵20-28 h后，再在28-32℃发酵44-52 h；

（2）步骤（1）发酵完的物料加水混合后，升温至42-48℃搅拌发酵14-18h，得到发酵液；

（3）按发酵液质量的0.2-0.3%加入外源碱性和中性蛋白酶，调节pH至中性，控制温度50-56℃，搅拌酶解8-12 h，得到酶解液；

（4）将酶解液离心后取上清进行干燥，得到蛋白粉。

5.一种蛋白粉，其特征在于，所述蛋白粉由权利要求4所述的方法制备而成。

6.一种食品添加剂，其特征在于，所述食品添加剂包含权利要求5所述的蛋白粉。

7.如权利要求6所述的食品添加剂在肉汤或骨汤中的应用，所述肉汤中蛋白粉的添加量为0.5%（w/w）或0.6-1.0%（w/w），所述骨汤中蛋白粉的添加量为0.3%（w/w）或0.6%（w/w）。

8.一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂包含权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌ZF625，所述抑菌为抑制大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、霉菌。