CN116194568A - 乳酸菌酵种、发酵乳的制造方法及发酵乳 - Google Patents

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Abstract

一种乳酸菌酵种，其含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和除德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)以外的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌。

Description

乳酸菌酵种、发酵乳的制造方法及发酵乳
技术领域
本发明涉及乳酸菌酵种、发酵乳的制造方法及发酵乳，更详细而言，涉及乳酸菌酵种、使用其的发酵乳的制造方法及由它们得到的发酵乳。
背景技术
发酵乳例如在日本的“关于乳及乳制品的成分标准等的省令(乳等省令)”中被定义为“用乳酸菌或酵母使乳或含有与其同等以上的非脂乳固体成分的乳等发酵而呈糊状或液状的物质或这些的冷冻物”，上述乳酸菌或酵母被称为用于制造发酵乳的酵种。作为所述发酵乳的代表例，可列举例如凝固型酸奶(固体状发酵乳)、软质酸奶(糊状发酵乳)及饮用型酸奶(液状发酵乳)等酸奶。
酸奶在国际社会共用的食品标准“Codex标准(FAO(联合国粮农组织)/WHO(世界卫生组织))”中被定义为“用德氏乳杆菌保加利亚亚种(保加利亚菌)及嗜热链球菌(嗜热菌)这2种进行乳酸发酵而得的物质”。所述酸奶以具有清爽的酸味及发酵香气为特征，一直以来，说到酸奶通常是使用该保加利亚菌及嗜热菌而得的。
例如，国际公开第2018/151249号(专利文献1)记载了一种发酵乳制造方法，其包括向原料混合物中添加乳酸菌酵种而得到发酵乳基材的工序、和使上述发酵乳基材在35～50℃下发酵的发酵工序，并且记载了上述乳酸菌酵种包含保加利亚菌及嗜热(thermophilus)菌。另外，例如日本特表2015-518374号公报(专利文献2)记载了特定的嗜热链球菌菌株及德氏乳杆菌(delbrueckii)保加利亚亚种菌株的、用于制造发酵乳制品的应用。
另一方面，使用了除保加利亚菌以外的乳酸菌的发酵乳在Codex标准中被定义为“培养物替代酸奶”。另外，也可以单独使用1种乳酸菌来制造发酵乳，进而世界各地还存在使用酵母的传统发酵乳。已知这些发酵乳具有与基于Codex标准的现有酸奶不同的、独特的风味，近年来随着消费者的偏好性、酸奶食用方法的多样化等，对于例如酸味弱、有乳感和甜味的温和(柔和)风味等的需求日益高涨，因此这些发酵乳受到了关注。作为上述培养物替代酸奶，例如株式会社明治正在制造、销售使用了与保加利亚菌同种但亚种不同的德氏乳杆菌的“十胜浓厚柔和酸奶”。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2018/151249号
专利文献2:日本特表2015-518374号公报
发明内容
发明要解决的问题
但是，本发明人们在对发酵乳及用于制造发酵乳的乳酸菌酵种进行研究时发现，单独使用1种乳酸菌而得的发酵乳虽然由于菌种特异性代谢产物谱而具有与使用保加利亚菌等德氏乳杆菌(L.delbrueckii)时不同的风味，但是通常未必可称之为优选风味。另外发现，单独使用1种乳酸菌时，与使用保加利亚菌及嗜热菌时相比到发酵完成为止更需要时间。例如，将德氏乳杆菌以外的属于乳杆菌科的乳酸菌单独用于发酵时，至发酵完成(例如pH达到4.5以下)更需要时间，最短也需要超过11小时的发酵时间，很多乳酸菌在24小时以内完不成发酵。在发酵乳的制造中，像这样到发酵完成为止需要过多时间时存在如下倾向：除了制造效率变差这一问题以外，还会产生污染风险变高而妨碍发酵乳的稳定制造或风味变差之类的问题。
本发明是鉴于上述现有技术所存在的课题作出的，目的在于，提供新的乳酸菌酵种、使用其的发酵乳的制造方法及利用它们得到的发酵乳，所述乳酸菌酵种能够在足够短的时间内完成发酵，并且能够稳定地制造具有与现有的发酵乳(优选酸奶)不同的风味特征“酸味弱、有乳感和甜味的温和(柔和)风味”的发酵乳。
用于解决问题的方案
本发明人们为了达到上述目的进行了深入研究，结果发现，通过将嗜热链球菌(嗜热菌)与除德氏乳杆菌以外的乳杆菌科乳酸菌组合，能够充分缩短至发酵完成为止的时间(优选为至pH达到4.5以下为止的时间)。还发现，利用该组合得到的发酵乳尤其具有不同于现有发酵乳的优选风味“酸味弱、有乳感和甜味的温和(柔和)风味”，从而完成了本发明。
基于所述发现而得到的本发明的方式如下所述。
[1]一种乳酸菌酵种，其包含嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和除德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)以外的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌。
[2]根据[1]所述的乳酸菌酵种，其中，上述嗜热链球菌为携带prtS基因的菌。
[3]根据[1]或[2]所述的乳酸菌酵种，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)乳酸菌、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)乳酸菌、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)乳酸菌、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)乳酸菌、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)乳酸菌、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)乳酸菌、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)乳酸菌、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)乳酸菌、片球菌属(Pediococcus)乳酸菌及明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌组成的组中的至少1种。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的乳酸菌酵种，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、副格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacilluskefiranofaciens)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei)、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、类植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusparaplantarum)、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)、可可液体乳杆菌(Liquorilactobacillus cacaonum)、红条液体乳杆菌(Liquorilactobacillussatsumensis)、清酒广布乳杆菌(Latilactobacillus sakei)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、类布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillusparabuchneri)、高加索迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri)、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、那幕尔促生乳杆菌(Levilactobacillus namurensis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)组成的组中的至少1种。
[5]一种发酵乳的制造方法，其包括下述发酵工序：将[1]～[4]中任一项所述的乳酸菌酵种添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
[6]一种发酵乳的制造方法，其包括下述发酵工序：将嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和除德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)以外的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
[7]根据[6]所述的发酵乳的制造方法，其中，上述嗜热链球菌为携带prtS基因的菌。
[8]根据[6]或[7]所述的发酵乳的制造方法，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)乳酸菌、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)乳酸菌、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)乳酸菌、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)乳酸菌、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)乳酸菌、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)乳酸菌、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)乳酸菌、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)乳酸菌、片球菌属(Pediococcus)乳酸菌及明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌组成的组中的至少1种。
[9]根据[6]～[8]中任一项所述的发酵乳的制造方法，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、副格氏乳杆菌(Lactobacillusparagasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lacticaseibacilluscasei)、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、类植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus paraplantarum)、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacilluspentosus)、可可液体乳杆菌(Liquorilactobacillus cacaonum)、红条液体乳杆菌(Liquorilactobacillus satsumensis)、清酒广布乳杆菌(Latilactobacillus sakei)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、类布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillusparabuchneri)、高加索迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri)、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、那幕尔促生乳杆菌(Levilactobacillus namurensis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)组成的组中的至少1种。
[10]一种发酵乳，其含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和除德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)以外的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌。
[11]根据[10]所述的发酵乳，其中，上述嗜热链球菌为携带prtS基因的菌。
[12]根据[10]或[11]所述的发酵乳，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)乳酸菌、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)乳酸菌、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)乳酸菌、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)乳酸菌、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)乳酸菌、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)乳酸菌、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)乳酸菌、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)乳酸菌、片球菌属(Pediococcus)乳酸菌及明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌组成的组中的至少1种。
[13]根据[10]～[12]中任一项所述的发酵乳，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、副格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacilluskefiranofaciens)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei)、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、类植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusparaplantarum)、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)、可可液体乳杆菌(Liquorilactobacillus cacaonum)、红条液体乳杆菌(Liquorilactobacillussatsumensis)、清酒广布乳杆菌(Latilactobacillus sakei)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、类布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillusparabuchneri)、高加索迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri)、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、那幕尔促生乳杆菌(Levilactobacillus namurensis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)组成的组中的至少1种。
[14]一种发酵乳的发酵促进方法，其包括下述发酵工序：将[1]～[4]中任一项所述的乳酸菌酵种添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
[15]一种发酵乳的发酵促进方法，其包括下述发酵工序：将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和除德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)以外的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
[16]一种发酵乳的风味改善方法，其包括下述发酵工序：将[1]～[4]中任一项所述的乳酸菌酵种添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
[17]一种发酵乳的风味改善方法，其包括下述发酵工序：将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和除德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)以外的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
[18]根据[15]或[17]所述的方法，其中，上述嗜热链球菌为携带prtS基因的菌。
[19]根据[15]、[17]或[18]所述的方法，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)乳酸菌、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)乳酸菌、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)乳酸菌、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)乳酸菌、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)乳酸菌、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)乳酸菌、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)乳酸菌、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)乳酸菌、片球菌属(Pediococcus)乳酸菌及明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌组成的组中的至少1种。
[20]根据[15]、[17]、[18]及[19]中任一项所述的方法，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、副格氏乳杆菌(Lactobacillusparagasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lacticaseibacilluscasei)、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、类植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus paraplantarum)、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacilluspentosus)、可可液体乳杆菌(Liquorilactobacillus cacaonum)、红条液体乳杆菌(Liquorilactobacillus satsumensis)、清酒广布乳杆菌(Latilactobacillus sakei)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、类布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillusparabuchneri)、高加索迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri)、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、那幕尔促生乳杆菌(Levilactobacillus namurensis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)组成的组中的至少1种。
发明的效果
根据本发明，能够提供在足够短的时间内完成发酵且能够稳定地制造具有与现有的发酵乳不同的风味特征“酸味弱、有乳感和甜味的温和(柔和)风味”的发酵乳的新的乳酸菌酵种、使用其的发酵乳的制造方法及利用它们得到的发酵乳。
附图说明
图1为分别示出关于表1中记载的除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌的、使用S.thermophilus prtS(-)时及使用S.thermophilus prtS(+)时的各发酵时间的图。
图2为示出在结果“(1)总水溶性成分和感官评价”中第1主要成分得分(PC1)与第2主要成分得分(PC2)的关系的图，为将使用S.thermophilus时与不使用S.thermophilus而用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时分别圈出的图。
图3为在图2中将对于乳杆菌科乳酸菌使用L.delbrueckii时和使用其以外时分别圈出的图。
图4为在结果“(1)总水溶性成分和感官评价”中与图2、3的各样品的标绘位置对应的总水溶性成分及感官评价项目的散点图。
图5为示出在结果“(1)总水溶性成分和感官评价”中关于使用除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌时总水溶性成分及感官评价值的、第1主要成分得分(PC1)与第2主要成分得分(PC2)的关系的图，为将使用S.thermophilus prtS(-)时和使用S.thermophilusprtS(+)时分别圈出的图。
图6为在结果“(1)总水溶性成分和感官评价”中与图5的各样品的标绘位置对应的总水溶性成分及感官评价项目的散点图。
图7为示出在结果“(2)香气成分和感官评价”中第1主要成分得分(PC1)与第2主要成分得分(PC2)的关系的图，为将使用S.thermophilus时与不使用S.thermophilus而用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时分别圈出的图。
图8为在图7中将对于乳杆菌科乳酸菌使用L.delbrueckii时和使用其以外时分别圈出的图。
图9为在结果“(2)香气成分和感官评价”中与图7、8的各样品的标绘位置对应的香气成分及感官评价项目的散点图。
图10为示出在结果“(2)香气成分和感官评价”中关于使用除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌时的香气成分及感官评价值的、第1主要成分得分(PC1)与第2主要成分得分(PC2)的关系的图，为将使用S.thermophilus prtS(-)时和使用S.thermophilus prtS(+)时分别圈出的图。
图11为在结果“(2)香气成分和感官评价”中与图10的各样品的标绘位置对应的香气成分及感官评价项目的散点图。
图12为分别示出对于表5所述的乳杆菌科乳酸菌使用S.thermophilus prtS(-)、使用S.thermophilus prtS(+)时及不使用S.thermophilus时的各发酵时间的图。
具体实施方式
以下根据优选实施方式对本发明进行详细说明。
＜乳酸菌酵种＞
本发明的乳酸菌酵种包含嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和除德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)以外的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌。本发明的乳酸菌酵种可以适宜用于下述本发明的发酵乳的制造方法、发酵乳的发酵促进方法及发酵乳的风味改善方法。
(嗜热链球菌)
作为本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus；本说明书中有时称为“S.thermophilus”或“嗜热菌”)，没有特别限制，可以单独使用1种，也可以将2种以上组合使用。本发明中通过使用S.thermophilus，从而即使使用下述除德氏乳杆菌以外的乳杆菌科乳酸菌，与例如单独使用除德氏乳杆菌以外的乳杆菌科乳酸菌时相比，能够显著缩短至发酵完成为止的时间，并且能够得到具有与现有的发酵乳不同的风味特征(例如酸味弱、有乳感和甜味的温和(柔和)风味)的发酵乳。
作为本发明的S.thermophilus，优选携带prtS基因的S.thermophilus。通过使用携带prtS基因的S.thermophilus(以下有时称为“S.thermophilus prtS(+)”)，具有能够进一步缩短至发酵完成为止的时间、进而能够进一步改善发酵乳的风味(例如，能够进一步降低酸味及涩味)的倾向。本发明中，“prtS基因”是指编码分解酪蛋白的细胞壁结合型丝氨酸蛋白酶的基因。另外，本发明中，可以通过下述实施例中记载的方法，使用由prtS基因保守性高的序列制作的下述引物对prtS基因的一部分进行扩增，通过是否得到期望的PCR产物来判定S.thermophilus是否携带prtS基因。
作为这样的S.thermophilus prtS(+)，可优选列举通过保藏号NITE BP-02875号来规定的S.thermophilus。由保藏号NITE BP-02875号规定的S.thermophilus为来自日本生乳的S.thermophilus prtS(+)。
由保藏号NITE BP-02875号规定的S.thermophilus以(1)识别标识：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)OLS4496、(2)保藏号：NITE BP-02875号、(3)保藏日：2019年2月5日、(4)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)(邮政编码292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)保藏于上述保藏机构。需要说明的是，作为由保藏号NITE BP-02875号规定的S.thermophilus，可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
(乳杆菌科乳酸菌)
本发明的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌为除德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)以外的、属于乳杆菌科的乳酸菌。
需要说明的是，本说明书中，乳杆菌科乳酸菌只要没有特别声明则基于Zheng etal.，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.2020；70；2782-2858而分类到各属中。即，只要没有特别声明，则本说明书中的乳杆菌科乳酸菌的名称为基于上述论文的分类名称。另一方面，本说明书中“旧分类”是指上述论文发表之前的分类，声明为“旧分类名”时是指为基于上述论文发表前的分类的名称。
上述德氏乳杆菌(本说明书中有时称为“L.delbrueckii”)为分类到乳杆菌属德氏种中的菌，已知有德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)(保加利亚菌)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、德氏乳杆菌印度亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.indicus)、德氏乳杆菌桑基亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.sunkii)、德氏乳杆菌雅各布森亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.jakobsenii)等亚种，本发明的L.delbrueckii中也包括这样的亚种。
作为本发明的乳杆菌科乳酸菌，只要在上述L.delbrueckii以外就没有特别限制，可以单独使用1种，也可以将2种以上组合使用。本发明中通过组合使用上述S.thermophilus，即使使用这样的除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌，也能够显著缩短至发酵完成为止的时间，并且能够得到具有与现有的发酵乳、进而与使用L.delbrueckii的发酵乳(优选为酸奶)不同的优异风味特征(例如酸味弱、有乳感和甜味的温和(柔和)风味)的发酵乳。
作为本发明的乳杆菌科乳酸菌，可列举乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌(其中不包括L.delbrueckii)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)乳酸菌、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)乳酸菌、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)乳酸菌、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)乳酸菌、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)乳酸菌、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)乳酸菌、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)乳酸菌、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)乳酸菌、片球菌属(Pediococcus)乳酸菌、明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌。
更具体而言，可列举格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、副格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens，包括马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种(Lactobacilluskefiranofaciens subsp.kefiranofaciens))、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei，包括副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lacticaseibacillus paracaseisubsp.paracasei))、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei)、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus)、类植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus paraplantarum)、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacilluspentosus)、可可液体乳杆菌(Liquorilactobacillus cacaonum)、红条液体乳杆菌(Liquorilactobacillus satsumensis)、清酒广布乳杆菌(Latilactobacillus sakei)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、类布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillusparabuchneri)、高加索迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri)、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、那幕尔促生乳杆菌(Levilactobacillus namurensis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、乳脂明串珠菌(Leuconostoc cremoris)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides，包括肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides))、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)等。
进而，在这些中，作为本发明的乳杆菌科乳酸菌，从与S.thermophilus组合时能够充分缩短至发酵完成为止的时间、进而有能够进一步改善发酵乳的风味(例如能够进一步降低酸味及涩味)的倾向的观点出发，优选选自由乳杆菌属乳酸菌(其中不包括L.delbrueckii)、乳酪杆菌属乳酸菌及乳植杆菌属乳酸菌组成的组中的至少1种。这些乳杆菌科乳酸菌均为属于旧分类的乳杆菌属(Lactobacillus)的乳酸菌、属于片球菌属(Pediococcus)的乳酸菌或属于明串珠菌属(Leuconostoc)的乳酸菌，更优选属于旧分类的乳杆菌属(Lactobacillus)的乳酸菌。
作为乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌(其中不包括L.delbrueckii)，更优选地，优选为选自由格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、副格氏乳杆菌(Lactobacillusparagasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)及植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)组成的组中的至少1种。进一步优选列举格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、副格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)。
作为这样的乳杆菌属乳酸菌，进一步优选列举例如格氏乳杆菌JCM 1131T株、格氏乳杆菌P2001801株、格氏乳杆菌P2001802株、瑞士乳杆菌JCM 1120T株、瑞士乳杆菌P2001803株、瑞士乳杆菌P2001804株、嗜酸乳杆菌JCM 1132T株、嗜淀粉乳杆菌JCM 1126T株、卷曲乳杆菌JCM 1185T株、约氏乳杆菌JCM 2012T株、马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种JCM 6985T株、副格氏乳杆菌JCM 5343T株。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
需要说明的是，本说明书中，菌株编号以JCM表示的菌株为可由理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(http：//jcm.brc.riken.jp/ja/)获得的菌株，以NBRC表示的菌株为可由国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(http：//www.nite.go.jp/nbrc/)获得的菌株，以NCIMB表示的菌株为可由英国微生物株保存机构NCIMB研究所获得的菌株。另外，本说明书中菌株编号以P20018开头的株为株式会社明治的明治技术革新中心(邮政编码192-0919日本国东京都八王子市七国1-29-1)所保管的菌株。
作为乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)乳酸菌，更优选列举副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei(旧分类名：Lactobacillus paracasei))、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus(旧分类名：Lactobacillus rhamnosus))、干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei(旧分类名：Lactobacillus casei))。
作为这样的乳酪杆菌属乳酸菌，进一步优选列举例如副干酪乳杆菌副干酪亚种NBRC 15889T(旧分类名：Lactobacillus paracasei subsp.paracasei NBRC 15889T)株、副干酪乳杆菌P2001805(旧分类名：Lactobacillus paracasei P2001805)株、副干酪乳杆菌NITE BP-02244(旧分类名：Lactobacillus paracasei NITE BP-02244)株、鼠李糖乳杆菌JCM 1136T(旧分类名：Lactobacillus rhamnosus JCM 1136T)株、鼠李糖乳杆菌P2001808(旧分类名：Lactobacillus rhamnosus P2001808)株、鼠李糖乳杆菌P2001809(旧分类名：Lactobacillus rhamnosus P2001809)株、干酪乳杆菌JCM 1134T(旧分类名：Lactobacillus casei JCM 1134T)株。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
需要说明的是，副干酪乳杆菌NITE BP-02244为由保藏号NITE BP-02244号规定的副干酪乳杆菌，以(1)识别标识：副干酪乳杆菌副干酪亚种OLL204220、(2)保藏号：NITE BP-02244号、(3)保藏日：2016年4月25日、(4)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)(邮政编码292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)保藏于上述保藏机构。
作为乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)乳酸菌，更优选列举植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum(旧分类名：Lactobacillus plantarum))、类植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus paraplantarum(旧分类名：Lactobacillusparaplantarum))、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacillus pentosus(旧分类名：Lactobacillus pentosus))。
作为这样的乳植杆菌属乳酸菌，进一步优选列举例如植物乳植杆菌NCIMB 11974T(旧分类名：Lactobacillus plantarum NCIMB 11974T)株、植物乳植杆菌P2001806(旧分类名：Lactobacillus plantarum P2001806)株、植物乳植杆菌P2001807(旧分类名：Lactobacillus plantarum P2001807)株、类植物乳植杆菌NCIMB 13579T株、戊糖乳植杆菌NCIMB 8026T株。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
作为广布乳杆菌属(Latilactobacillus)乳酸菌，更优选列举清酒广布乳杆菌(Latilactobacillus sakei(旧分类名：Lactobacillus sakei))。
作为这样的广布乳杆菌属乳酸菌，进一步优选列举例如清酒广布乳杆菌JCM1157T(旧分类名：Lactobacillus sakei JCM 1157T)株。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
作为液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)乳酸菌，更优选列举可可液体乳杆菌(Liquorilactobacillus cacaonum(旧分类名：Lactobacillus cacaonum))、红条液体乳杆菌(Liquorilactobacillus satsumensis(旧分类名：Lactobacillus satsumensis))。
作为这样的液体乳杆菌属乳酸菌，进一步优选列举例如可可液体乳杆菌P2001810(旧分类名：Lactobacillus cacaonum P2001810)株、红条液体乳杆菌(Liquorilactobacillus satsumensis JCM 12392T(旧分类名：Lactobacillussatsumensis JCM 12392T))。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
作为联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)乳酸菌，更优选列举唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius(旧分类名：Lactobacillus salivarius))。
作为这样的联合乳杆菌属乳酸菌，进一步优选列举例如唾液联合乳杆菌JCM1231T(旧分类名：Lactobacillus salivarius JCM 1231T)株。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
作为粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)乳酸菌，更优选列举发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum(旧分类名：Lactobacillus fermentum))、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri(旧分类名：Lactobacillus reuteri))。
作为这样的粘液乳杆菌属乳酸菌，进一步优选列举例如发酵粘液乳杆菌JCM1173T(旧分类名：Lactobacillus fermentum JCM 1173T)株、罗伊氏粘液乳杆菌JCM 1112T(旧分类名：Lactobacillus reuteri JCM 1112T)株。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
作为促生乳杆菌属(Levilactobacillus)乳酸菌，更优选列举短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis(旧分类名：Lactobacillus brevis))、那幕尔促生乳杆菌(Levilactobacillus namurensis(旧分类名：Lactobacillus namurensis))。
作为这样的促生乳杆菌属乳酸菌，进一步优选列举例如短促生乳杆菌JCM 1059T(旧分类名：Lactobacillus brevis JCM 1059T)株、那幕尔促生乳杆菌NBRC 107158T(旧分类名：Lactobacillus namurensis NBRC 107158T)株。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
作为迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)乳酸菌，更优选为布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri(旧分类名：Lactobacillus buchneri))、类布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus parabuchneri(旧分类名：Lactobacillus parabuchneri))、高加索迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri(旧分类名：Lactobacillus kefiri))。
作为这样的迟缓乳杆菌属乳酸菌，进一步优选列举例如布氏迟缓乳杆菌NCIMB8007T(旧分类名：Lactobacillus buchneri NCIMB 8007T)株、类布氏迟缓乳杆菌JCM12493T(旧分类名：Lactobacillus parabuchneri JCM 12493T)株、高加索迟缓乳杆菌JCM5818T(旧分类名：Lactobacillus kefiri JCM 5818T)株。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
作为片球菌属(Pediococcus)乳酸菌，更优选列举戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。
作为这样的片球菌属乳酸菌，进一步优选列举例如戊糖片球菌JCM 5890T株、乳酸片球菌JCM 8797T株。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
作为明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌，更优选列举乳明串珠菌(Leuconostoclactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)。
作为这样的明串珠菌属乳酸菌，进一步优选列举例如乳明串珠菌JCM 6123T株、肠膜明串珠菌肠膜亚种JCM 6124T株、假肠膜明串珠菌JCM 9696T。作为这些菌株，分别可以为该株的传代株或不抑制本发明效果的范围内的该株或其传代株的人工突变株、自然突变株、基因重组株或衍生株等。
这些中，作为本发明的乳杆菌科乳酸菌，更优选为选自由格氏乳杆菌、副格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及植物乳植杆菌组成的组中的至少1种。
作为本发明的乳酸菌酵种，可以为含有上述的S.thermophilus和乳杆菌科乳酸菌的组合物，也可以为含有上述的S.thermophilus和乳杆菌科乳酸菌的组合的物质。
本发明的乳酸菌酵种为上述组合物时，该组合物可以为液体，也可以为冷冻状态、干燥粉末等固体，可以还含有其它成分。作为上述其它成分，可列举例如作为乳酸菌(S.thermophilus、乳杆菌科乳酸菌)培养结束后的培养上清、培养基成分(乳或乳清等)等的培养物；上述培养物的浓缩物、稀释物、干燥物、冷冻物等；发酵促进物质(甲酸、核酸等)；保护剂(糖类糖)，可以为这些中的1种，也可以为2种以上的组合。
另外，本发明的乳酸菌酵种为上述组合物时，作为该组合物中的S.thermophilus的含量与乳杆菌科乳酸菌的含量的比(S.thermophilus：乳杆菌科乳酸菌(不包括L.delbrueckii))，以菌数(活菌数换算，以下同样)比计优选为1：0.1～1：100，更优选为1：1～1：10。另外，本发明的乳酸菌酵种为上述组合物时，该乳酸菌酵种中的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌(不包括L.delbrueckii)的合计含量没有特别限制，优选为0.01～100质量％，更优选为0.1～90质量％。进而，本发明的乳酸菌酵种为上述组合物时，该乳酸菌酵种中的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌(不包括L.delbrueckii)的合计含量没有特别限制，优选为1×107cfu/g以上，更优选为1×107～1×1011cfu/g，进一步优选为1×108～1×1010cfu/g。
本发明的乳酸菌酵种为上述组合的物质时，作为该组合的物质，可列举例如含有S.thermophilus的第1乳酸菌组合物与含有乳杆菌科乳酸菌(不包括L.delbrueckii)的第2乳酸菌组合物的组合，可以制成包含第1乳酸菌组合物及第2乳酸菌组合物的试剂盒。该情况下，第1乳酸菌组合物及第2乳酸菌组合物分别独立地可以为液体或冷冻状态、干燥粉末等固体，可以仅包含各乳酸菌，也可以还含有其它成分。作为上述其它成分，可列举与上述的乳酸菌酵种为组合物时所列举的其它成分同样的成分。
另外，第1乳酸菌组合物中的S.thermophilus的含量及第2乳酸菌组合物中的乳杆菌科乳酸菌(不包括L.delbrueckii)的含量没有特别限制，分别独立地优选为0.01～100质量％，更优选为0.1～90质量％。进而，第1乳酸菌组合物中的S.thermophilus的含量及第2乳酸菌组合物中的乳杆菌科乳酸菌(不包括L.delbrueckii)的含量没有特别限制，分别独立地优选为1×107cfu/g以上，更优选为1×107～1×1011cfu/g，进一步优选为1×108～1×1010cfu/g。作为所述第1乳酸菌组合物及第2乳酸菌组合物，优选以本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的比(S.thermophilus：乳杆菌科乳酸菌(不包括L.delbrueckii))按照菌数比计为1：0.1～1：100的方式使用，更优选按照以1：1～1：10的方式使用。
另外，本发明的乳酸菌酵种为上述试剂盒时，该试剂盒可以还包含用于制造发酵乳的添加剂(上述发酵促进物质、保护剂等)、容器、乳酸菌酵种的使用说明书等。
＜发酵乳的制造方法＞
本发明的发酵乳的制造方法包括下述发酵工序：将上述本发明的乳酸菌酵种添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。即包括下述发酵工序：将本发明的S.thermophilus和除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。通过使用本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的组合来发酵原料乳，从而在本发明的制造方法中至发酵完成为止的时间能够充分缩短，并且能够得到具有与现有的发酵乳、进一步而言使用L.delbrueckii的发酵乳(优选为酸奶)不同的风味特征“酸味弱、有乳感和甜味的温和(柔和)风味”的发酵乳。
(调制乳液体)
本发明的调制乳液体含有原料乳。作为上述原料乳，优选为含有乳糖的乳，可列举例如生乳(例如牛、水牛、绵羊、山羊等的乳)、杀菌乳、全脂乳、脱脂乳、乳清及这些的加工品(例如全脂奶粉、全脂浓缩乳、脱脂奶粉、脱脂浓缩乳、炼乳、乳清粉、酪乳、黄油、奶油、乳酪、乳清蛋白浓缩物(WPC)、分离乳清蛋白(WPI)、α-乳清蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg))，可以为这些中的1种，也可以为2种以上的混合物。
作为本发明的调制乳液体，可以仅包含上述原料乳，也可以为上述原料乳的水溶液、稀释液或浓缩液，除了上述原料乳以外可以根据需要还含有其它成分。作为这样的其它成分，可列举：水；豆乳、以砂糖为代表的糖类、甜味剂、香料、果汁、果肉、维生素、矿物质、油脂、神经酰胺、胶原蛋白、乳磷脂、多酚等食品、食品成分及食品添加剂；果胶、大豆多糖类、CMC(羧甲基纤维素)、琼脂、明胶、角叉菜胶、胶类等稳定剂、增稠剂及凝胶化剂，可以为这些中的1种或2种以上的混合物。上述调制乳液体可以通过根据需要一边加温和/或根据需要而均质化、一边对上述成分进行混合而制备。另外，作为上述调制乳液体，也可以使用经加热杀菌的调制乳液体。
(发酵)
作为向上述调制乳液体中添加上述本发明的乳酸菌酵种(即，本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的组合)而使其发酵的发酵工序，可以适宜采用现有公知的方法，没有特别限制。本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌可以进行混合后添加到上述调制乳液体中，也可以同时或各自分别添加，即，本发明的发酵酵种可以以含有本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的组合物形式添加于上述调制乳液体中，也可以将上述的含有S.thermophilus的第1乳酸菌组合物和含有乳杆菌科乳酸菌的第2乳酸菌组合物同时添加或各自分别添加。
上述发酵酵种(即，本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的组合)的添加量可以根据现有公知的发酵乳的制造方法所采用的添加量来适宜设定，例如，相对于上述调制乳液体的体积，以乳酸菌数(S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌(不包括L.delbrueckii)的合计菌数)换算计优选为1×107～5×109cfu/mL，更优选为1×108～2×109cfu/mL。
另外，添加于上述调制乳液体中的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的菌数比率(S.thermophilus：乳杆菌科乳酸菌(不包括L.delbrueckii))优选为1：0.1～1：100，更优选为1：1～1：10。
作为上述发酵的条件，可根据添加的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的生育条件、上述调制乳液体的量等适宜选择，没有特别限制，例如，优选在温度35～45℃、更优选温度38～43℃下在需氧或厌氧条件下静置或搅拌(优选静置)通常3～24小时、更优选3～8小时、进一步优选4～6小时，直至添加了本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的调制乳液体的pH为4.5以下、更优选4.0～4.5为止。根据本发明，即使使用除L.delbrueckii以外的本发明的乳杆菌科乳酸菌，也能够使发酵所需的时间充分缩短。另外，作为上述厌氧条件，可以采用例如通入氮气的条件下的发酵。
通过上述发酵，可以得到本发明的发酵乳。上述发酵工序后的发酵物可以直接作为本发明的发酵乳，或根据需要进行浓缩、稀释、干燥或冷冻等而制成本发明的发酵乳。另外，通过对上述发酵物中的乳酸菌进行破碎或加热处理等或根据需要对其进行浓缩、稀释、干燥或冷冻等，可以制成本发明的发酵乳。因此，作为本发明的发酵乳的制造方法，可以还包括这些工序(浓缩工序、稀释工序、干燥工序、冷冻工序、破碎工序、加热处理工序等)。
＜发酵乳＞
本发明的发酵乳含有上述的本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌，可以利用上述本发明的发酵乳的制造方法得到。
作为本发明的发酵乳，没有特别限定，可列举例如满足日本厚生劳动省关于乳及乳制品的成分标准等的省令(乳等省令)中的“发酵乳”标准的发酵乳(更具体而言，非脂乳固体成分的含量为8.0％以上、乳酸菌数或酵母数(优选为乳酸菌数(更优选为S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的合计数，以下同样))为1000万/mL以上者)。另外，本发明的发酵乳还包括：满足上述乳等省令中的“乳制品乳酸菌饮料”标准者(更具体而言，非脂乳固体成分的含量为3.0％以上、乳酸菌数或酵母数(优选为乳酸菌数)为1000万/mL以上者)；满足“乳酸菌饮料”标准者(更具体而言，非脂乳固体成分的含量小于3.0％、乳酸菌数或酵母数(优选为乳酸菌数)为100万/mL以上者)。需要说明的是，上述非脂乳固体成分是指总乳固体成分中减去脂肪成分而得到的残留成分(主要为蛋白质、乳糖及矿物质等)，在发酵乳经过杀菌的情况下，上述乳酸菌及酵母数可在该杀菌前利用上述乳等省令中规定的检査法来测定。
作为本发明的发酵乳，可以为上述发酵工序后的发酵物或对上述发酵物进行杀菌处理(粉碎处理、加热处理等)而得的物质或将这些浓缩、稀释、干燥或冷冻等而得的物质。需要说明的是，本发明中，上述发酵乳为进行了杀菌处理的发酵乳时，该发酵乳中的乳酸菌数(优选为S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌(不包括L.delbrueckii)的合计数)为活菌数换算数。本发明的发酵乳中包含的乳酸菌除了活菌以外还包括死菌、乳酸菌的破碎物及加热处理物、这些的浓缩物、稀释物、干燥物、冷冻物，作为本发明的发酵乳所含的乳酸菌，优选至少包含活菌。
作为本发明的发酵乳，可以在不抑制本发明效果的范围内含有除本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌以外的其它乳酸菌作为乳酸菌，另外可以还含有酵母。作为这些其它乳酸菌及酵母，可列举一直以来已知包含于发酵乳中的乳酸菌、酵母。
另外，作为本发明的发酵乳，此外可以还含有可包含于饮食品的各种成分。这样的成分没有特别限制，可列举例如水、糖类、糖醇类、矿物质类、维生素类、蛋白质、肽、氨基酸类、有机酸、pH调节剂、淀粉及加工淀粉、膳食纤维、果实/蔬菜及其加工品、动物及植物生药提取物、天然来源高分子(胶原蛋白、透明质酸、软骨素等)、油脂、增稠剂、乳化剂、溶剂、表面活性剂、凝胶化剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮化剂、粘稠剂、赋形剂、崩解剂、结合剂、流动化剂、保存剂、着色剂、香料、矫味剂、甜味剂等，可以单独含有这些中的1种，也可以组合含有2种以上。
作为这样的发酵乳，特别优选酸奶。作为上述酸奶，具体而言，可列举凝结酸奶等凝固型酸奶(固体状发酵乳)、软质酸奶(糊状发酵乳)及饮用型酸奶(液状发酵乳)，可以是使用这些作为材料的冷冻酸奶。另外，本发明的发酵乳也可以作为乳酪、发酵奶油、发酵黄油、开菲尔酸奶等发酵乳的材料来使用。
＜发酵乳的发酵促进方法、发酵乳的风味改善方法＞
通过使用本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的组合来发酵原料乳，能够使用于制造发酵乳的至发酵完成为止的时间充分缩短且得到具有与现有的发酵乳不同的风味特征“酸味弱、有乳感和甜味的温和(柔和)风味”的发酵乳。因此，本发明还分别提供发酵乳的发酵促进方法及发酵乳的风味改善方法，其包括下述发酵工序：将本发明的乳酸菌酵种(即，本发明的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌的组合)添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。作为上述发酵工序，如上述本发明的发酵乳的制造方法中所述。
根据本发明的发酵乳的发酵促进方法，与单独使用本发明的乳杆菌科乳酸菌进行发酵时相比，能够显著缩短至发酵完成为止的时间(本说明书中，优选为pH达到4.5以下为止的时间)，例如，在将单独用上述乳杆菌科乳酸菌发酵时的、至发酵完成为止的时间设为1时，能够使至发酵完成为止的时间缩短至0.7以下、更优选为0.1～0.7、进一步优选为0.1～0.5、特别优选为0.1～0.3。
另外，根据本发明的发酵乳的风味改善方法，与单独使用本发明的乳杆菌科乳酸菌进行发酵时相比，进而与使用L.delbrueckii的发酵乳(优选为酸奶)相比，能够将得到的发酵乳的风味改善为酸味更弱、有乳感和甜味的温和(柔和)风味。
进而，在使用携带prtS基因的S.thermophilus作为本发明的S.thermophilus时，有至发酵完成为止的时间能够进一步缩短的倾向，另外，能够将得到的发酵乳的风味改善为酸味和涩味更少的风味。
实施例
以下基于实施例及比较例更具体地说明本发明，但是本发明不受以下实施例限定。
(试验例1)
＜S.thermophilus＞
S.thermophilus使用下述表1所示的各菌株。表1中，
S.thermophilus prtS(-)：“S.thermophilus 1131”，为由明治保加利亚酸奶LB81(株式会社明治制)分离出的S.thermophilus。不携带prtS基因；
S.thermophilus prtS(+)：“S.thermophilus NITE BP-02875”，为由保藏号NITEBP-02875号规定的S.thermophilus(以(1)识别标识：嗜热链球菌OLS4496、(2)保藏号：NITEBP-02875号、(3)保藏日：2019年2月5日、(4)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)(邮政编码292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)保藏于上述保藏机构)。携带prtS基因。
需要说明的是，通过下述方法来确认各S.thermophilus中是否携带prtS基因。即，首先从NCBI数据库获得基因组序列已知的5株嗜热菌(S.thermophilus)的prtS基因序列，由保守性高的序列制作引物(正向引物：序列号1，反向引物：序列号2)。另外，使用InstaGeneMatrix(BioRad公司制)，从各菌株的M17培养液中提取基因组DNA。将提取的基因组DNA(模板)0.5μL、制作的引物(5μM)各1μL、Phusion高保真DNA聚合酶0.1μL、5×HF缓冲液2μL、2.5mM dNTP0.8μL及超纯水4.6μL混合(总计10μL)，将下述条件：98℃下30秒；98℃下5秒、63℃下20秒、72℃下20秒进行30个循环；72℃下5分钟；在4℃下静置，由此进行PCR。对得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将在684bp的位置确定到条带的菌株判定为携带prtS基因，将未确认到该条带的菌株判定为不携带prtS基因。
＜乳杆菌科乳酸菌＞
乳杆菌科乳酸菌使用下述表1所示的菌种的各菌株。表1中，
德氏乳杆菌2038：从明治保加利亚酸奶LB81(株式会社明治制)中分离出的L.delbrueckii；
德氏乳杆菌NITE BP-76：由保藏号NITE BP-76号规定的L.delbrueckii(以(1)识别标识：德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)OLL1255、(2)保藏号：NITE BP-76号、(3)保藏日(原保藏日)：2005年2月10日、(4)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)(邮政编码292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8)保藏于上述保藏机构)；
德氏乳杆菌NITE BP-02874：由保藏号NITE BP-02874号规定的L.delbrueckii(以(1)识别标识：德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)OLL204989、(2)保藏号：NITE BP-02874号、(3)保藏日：2019年2月5日、(4)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)(邮政编码292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号)保藏于上述保藏机构)；
副干酪乳杆菌NITE BP-02244：由保藏号NITE BP-02244号规定的副干酪乳杆菌(以(1)识别标识：副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei)OLL204220、(2)保藏号：NITE BP-02244号、(3)保藏日：2016年4月25日、(4)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)(邮政编码292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)保藏于上述保藏机构)。
另外，表1中，菌株编号以JCM表示的株可由理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(http：//jcm.brc.riken.jp/ja/)获得，以NBRC表示的菌株为可由国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(http：//www.nite.go.jp/nbrc/)获得，以NCIMB表示的株可由英国微生物株保存机构NCIMB研究所获得。另外，表1中，菌株编号以P20018开头的株为株式会社明治的明治技术革新中心(邮政编码192-0919日本国东京都八王子市七国1-29-1)所保管的菌株。
＜发酵时间测定＞
按照下述表1的组合(实施例：R4～R18、R22～R36、比较例：R1～R3、R19～R21、L1～L18)来使用上述的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌，分别测定发酵所需的时间。
[表1]
Figure BDA0004085177900000261
发酵中，向市售的牛乳中以各菌株为0.5％(0.5mL/100mL、以下同样)的方式添加，或以各菌株量分别为0.5％(总计1％)的方式添加其组合(S.thermophilus：乳杆菌科乳酸菌＝约1：1(菌数))，在43℃下发酵24小时(需氧、静置培养)，得到各发酵乳。分别测定添加菌株至pH达到4.5以下为止的时间，作为发酵所需的发酵时间。需要说明的是，对于添加菌株起24小时内pH未达到4.5者，将发酵时间设为24小时(1440分钟)，并结束发酵。
发酵时间测定的结果是，使用S.thermophilus时(R1～R36)，与不使用S.thermophilus而用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时(L1～L18)相比，确认到发酵时间缩短。特别是使用瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌时(R7～R9、R16～R18、R25～R27、R34～R36)，不论S.thermophilus是否携带prtS基因，发酵时间均充分缩短，t检验的结果是，与乳杆菌科乳酸菌单独时(L7～L9、L16～L18)相比，p值分别小于0.001。需要说明的是，使用L.delbrueckii时(R1～R3、R19～R21)也同样。下述表2分别示出使用携带prtS基因的S.thermophilus时(R19～R36)及用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时(L1～L13、L15～L18)的发酵时间(分钟)。
[表2]
Figure BDA0004085177900000271
另外，图1分别示出关于除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌分别使用不携带prtS基因的S.thermophilus时(prtS(-)、R4～R18(n＝15))及使用携带prtS基因的S.thermophilus时(prtS(+)、R22～R36(n＝15))的发酵时间(平均值，分钟)。t检验的结果是，prtS(+)的结果相对于prtS(-)的结果的p值小于0.001。由此确认，prtS(+)与prtS(-)相比更显著地缩短发酵时间。
＜发酵乳的评价＞
(水溶性成分分析)
对于在上述的发酵时间测定中使用表1所述的各组合的菌株得到的发酵乳中的水溶性成分，使用CE-TOFMS(毛细管电泳-飞行时间型质谱仪)按照下述方法进行了分析(Human Metabolome Technologies Inc.)。
〔预处理〕
向以内标物的浓度为10μM的方式制备的900μL的甲醇溶液中，添加100μL的发酵乳并搅拌。向其中加入1000μL的氯仿及400μL的超纯水并搅拌，进行离心分离(2300×g、4℃、5分钟)。离心分离后，将水层中的400μL转移到超滤管(Ultrafree MC PLHCC、HMT、离心式过滤器单元5kDa)。对其进行离心(9100×g、4℃、120分钟)，进行超滤处理。使滤液干固，再次溶解于50μL的超纯水，供于测定。
〔测定〕
按照以下的表3所示的条件进行阳离子模式、阴离子模式的测定。
[表3]
Figure BDA0004085177900000291
〔数据处理〕
对于CE-TOFMS中检测到的峰，使用自动积分软件MasterHands ver.2.17.1.11(庆应义塾大学开发)自动提取信号/噪声(S/N)比为3以上的峰，得到质荷比(m/z)、峰面积值、迁移时间(Migration time：MT)。使用下式：
相对面积值＝(目标峰的面积值)/(内标物的面积值×试样量)
将得到的峰面积值变换为相对面积值。另外，这些数据中包括了Na+、K+等加合离子及脱水、脱铵等的碎片离子，因此将这些分子量相关离子删除。但是，由于也存在物质特异性的加合、碎片，因此不能对全部均精细检查。对于经过精细检查的峰，基于m/z和MT的值进行各试样间的峰的对照·排列。
〔候选代谢物质检索〕
对于检测到的峰，基于m/z和MT的值与HMT代谢物质文库及Known-Unknown文库(Human Metabolome Technologies Inc.)中登录的全部物质进行对照、检索。关于用于检索的允许误差，MT情况下设为±0.5分钟、m/z情况下设为±10ppm(质量误差(ppm)＝(实测值-理论值)×106/实测值)。需要说明的是，当无法缩小候选范围、多个峰被赋予了同一候选代谢物质的情况下，标记副编号来记录。
〔对象代谢化合物的定量〕
对对象代谢化合物进行分析。关于标准曲线，使用利用内标物进行了校正的峰面积，并且对于各物质以100μM的单点检测量(内标物：200μM)形式计算浓度。
(香气成分分析)
对于在上述发酵时间测定中使用表1记载的各组合的菌株得到的发酵乳中的香气成分，使用作为试样的预处理的动态顶空及顶空固相微萃取法，利用GC/MS(气相色谱质谱)法按照下述方法进行分析。
〔分析方法〕
·试样：
向20mL的管型瓶中加入5g的发酵乳、5g的1mol/L-磷酸缓冲液(pH6.98)及作为内标的甲基异丁基酮及环辛醇并密封。
·动态顶空捕集装置(Gerstel公司制)：
使上述管型瓶保持25℃且用10mL的氮气对顶空进行置换，将氮气中的香气成分捕集到吸附剂(TENAX-TA)中。接着，在下述表4所示的条件下对上述吸附剂进行加热脱附，导入GC/MS进行分析。将检测到的峰的质谱与NIST质谱库对照，对检测化合物进行定性。进而，使用各化合物的特征离子对峰进行积分，作为检测量。
[表4]
加热脱附装置 TDU(Gerstel公司)
加热脱附温度 25℃(0.5min)→720℃/min→230℃(5min)
冷凝 -10℃(0.5min)→720℃/min→240℃(10min)
GCMS装置 6890GC/5975MS(安捷伦公司)
柱 DB-WAXUI内径0.25mm×膜厚0.25μm×长度30m
柱温箱 40℃(2.5min)→5℃/min→80℃→10℃/min→→120℃→20℃/min℃240℃(5min)
氦气 1mL/min
扫描范围 m/z33～300
·顶空固相微萃取法：
将上述管型瓶在60℃下加温后，保持40分钟，使顶空的香气成分吸附于固相(SUPELCO公司SPME、50/30μm DVB/CAR/PDMS)。GC/MS分析使用Agilent GC7890B、MS5977A(安捷伦科技公司)，柱使用DB-WAXUI(0.25mm×0.25μm×30M)(安捷伦科技公司)。作为GC/MS的分析条件，在40℃下保持5分钟后，以每分钟15℃升温到250℃，保持10分钟。
(感官评价)
对于在上述发酵时间测定中使用表1记载的各组合的菌株得到的发酵乳进行感官评价。即，将发酵后的发酵乳立即用冰冷却，请总计6名经过训练的小组成员进行感官评价。评价项目为下述10个项目：酸味、甜味、苦味、旨味、涩味·杂味、乳感、酸奶感(顶部的(首先感受到的)乙醛香)、乳酪感(奶油乳酪样)、脂肪感(黄油样等)、酸奶的清爽的后味，分别通过1～7的7阶段尺度法进行评价。将6名小组成员的评价结果的平均值作为感官评价值。
(有机酸分析)
[甲酸·乙酸]
用HPLC(高效液相色谱)按照下述方法测定在上述发酵时间测定中使用表1记载的各组合的菌株得到的发酵乳中的有机酸(甲酸、乙酸)量。
〔测定方法〕
将发酵乳用超纯水2倍稀释，使用Carrez试剂除蛋白。将除蛋白后的上清用过滤管型瓶(PVDF、0.2μm、1030-19022、THOMSON公司制)进行过滤，在下述条件下测定各发酵乳中的甲酸量及乙酸量(mM)。
保护柱：ICSep ICE ORH-801 4.0mm i.d.×20mm(东京化成工业株式会社制)
柱：有机酸分析用柱ICSep ICE ORH-801 6.5mm i.d.×300mm、Transgenomic公司制(东京化成工业株式会社制)，将2根连接
烘箱温度：55℃
流速：0.5mL/分钟
检测器：电导率检测器CDD-10AVvp(株式会社岛津制作所制)
注入量：10μL
流动相：7.5mM对甲苯磺酸
反应液：7.5mM对甲苯磺酸+150μM EDTA·2NA+30mM Bis Tris
[D/L-乳酸]
使用HPLC(高效液相色谱)按照下述方法测定在上述发酵时间测定中使用表1记载的各组合的菌株得到的发酵乳中的D-乳酸量及L-乳酸量。
〔测定方法〕
将发酵乳用超纯水2倍稀释，使用Carrez试剂除蛋白。将除蛋白后的上清用过滤管型瓶(PVDF、0.2μm、1030-19022、THOMSON公司制)过滤，在下述条件下测定各发酵乳中的D-乳酸量及L-乳酸量(mM)。
保护柱：SUMICHIRAL OA-5000 5μm 4mm i.d.×10mm(株式会社住化分析中心制)
柱：SUMICHIRAL OA-5000 4.6mm i.d.×150mm(株式会社住化分析中心制)
烘箱温度：40℃
流速：1.0mL/分钟
检测器：SPD-M20A(株式会社岛津制作所制)
注入量：10μL
流动相：2mM CuSO 4·5H 2O+5％异丙醇
(结果)
(1)总水溶性成分和感官评价
对于以表1记载的各组合使用各S.thermophilus和乳杆菌科乳酸菌而得到的发酵乳中的水溶性成分及感官评价值，进行主要成分分析(PCA)。这里的水溶性成分(总水溶性成分)使将上述的水溶性成分分析中得到的水溶性成分、上述的有机酸分析中得到的甲酸、乙酸、D-乳酸及L-乳酸相加而得的成分。图2及图3示出表示各发酵乳中的第1主要成分得分(PC1)与第2主要成分得分(PC2)的关系的图。图2为将使用S.thermophilus时(R1-R36)、不使用S.thermophilus而用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时(L1-L13、L15-L18)分别圈出的图，图3为将对于乳杆菌科乳酸菌使用L.delbrueckii时(R1-R3/R19-R21)和使用其以外时(R4-R18/R22-R36)分别圈出的图。进而，图4示出与图2及图3的各样品的标绘位置对应的总水溶性成分及感官评价项目的散点图。
如图2所示，将结果按照使用S.thermophilus(R1-R36)和不使用S.thermophilus而用乳杆菌科乳酸菌单独发酵(L1-L13、L15-L18)分为2种，表明是否与S.thermophilus组合对发酵乳中的总水溶性成分及感官评价值有明显影响。另外，如图3所示，将结果按照使用乳杆菌科乳酸菌中的L.delbrueckii时(R1-R3/R19-R21)和使用其以外时(R4-R18/R22-R36)分为2种，进一步表明为L.delbrueckii还是其以外的乳杆菌科乳酸菌的种类对发酵乳中的总水溶性成分及感官评价值也有影响。
进而，图4中为越往x轴的左侧酸奶感(顶部的(首先感受到的)乙醛香)、酸奶的清爽的后味(酸奶样)越强，而越往左上D-乳酸(D-Lac)量越多、酸味越强的结果。另外，为越往右上则乙酸越多、涩味、杂味强，而越往右下则乳感、甜味越强的结果。如图2及图4所示，不使用S.thermophilus而用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时(L1-L13、L15-L18)，较多标绘于x轴的右侧、特别是右上，大部分被评价为与未发酵牛乳(Blank(空白))同等、几乎没有发酵风味以及涩味、杂味强，而组合使用S.thermophilus和乳杆菌科乳酸菌时(R1-R36)，标绘于x轴左侧、左下至左上，被评价为酸奶感(顶部的乙醛香)、酸奶的清爽的后味强。另外，根据图3及图4，使用S.thermophilus和L.delbrueckii发酵而得的发酵乳(R1-R3/R19-R21)被标绘于酸味强的左上，与此相对地使用S.thermophilus和除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌发酵而得的发酵乳(R4-R18/R22-R36)则被标绘在原点至左下，被评价为与使用S.thermophilus和L.delbrueckii发酵而得的发酵乳相比酸味弱且乳感、甜味强。
进而对于使用除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌时(R4～R18、R22～R36)的总水溶性成分及感官评价值，也进行了主要成分分析(PCA)。图5示出表示各发酵乳中的第1主要成分得分(PC1)与第2主要成分得分(PC2)的关系的图。图5为将使用S.thermophilusprtS(-)时(R4-R18)与使用S.thermophilus prtS(+)时(R22-R36)分别圈出的图。进而，图6示出与图5的各样品的标绘位置对应的总水溶性成分及感官评价项目的散点图。
如图5所示，在S.thermophilus中将结果按照携带prtS基因时(prtS(+)：R22-R36)和不携带prtS基因时(prtS(-)：R4-R18)分为2种，表明S.thermophilus是否携带prtS基因也会进一步影响发酵乳中的总水溶性成分及感官评价值。
另外，图6为越往右则乳感、甜味越强，越往左则L-乳酸(L-Lac)量越多、酸奶感越强，越往左下则乙酸量和D-乳酸(D-Lac)量越多、酸味、涩味越强，但是根据图5及图6，使用不携带prtS基因的S.thermophilus时(prtS(-))，大部分样品存在于右下，一部分样品被标绘在左下方向。另一方面表明，使用携带prtS基因的S.thermophilus时(prtS(+))，被标绘在左上方向，prtS(+)相较于prtS(-)而言无酸味、涩味，为顶部的乙醛香强的、具有酸奶感的风味。
(2)香气成分和感官评价
对于以表1所述的各组合使用各S.thermophilus和乳杆菌科乳酸菌得到的发酵乳中的香气成分及感官评价值，也进行了主要成分分析(PCA)。图7及图8示出表示各发酵乳中的第1主要成分得分(PC1)与第2主要成分得分(PC2)的关系的图。图7为将使用S.thermophilus时(R1-R36)和不使用S.thermophilus而用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时(L1-L13、L15-L18)分别圈出的图，图8为将对于乳杆菌科乳酸菌使用L.delbrueckii时(R1-R3/R19-R21)和使用其以外时(R4-R18/R22-R36)分别圈出的图。进而，图9示出与图7及图8的各样品的标绘位置对应的香气成分及感官评价项目的散点图。
如图7所示，将结果按照使用S.thermophilus时(R1-R36)和不使用S.thermophilus而用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时(L1-L13、L15-L18)分为2种，表明是否与S.thermophilus组合明显影响发酵乳中的香气成分及感官评价值。另外，如图8所示，将结果按照使用乳杆菌科乳酸菌中的L.delbrueckii时(R1-R3/R19-R21)和使用其以外时(R4-R18/R22-R36)分为2种，进一步表明为L.delbrueckii还是为其以外的乳杆菌科乳酸菌的种类也会影响发酵乳中的香气成分及感官评价值。
图9为越往右上则酸味、乙醛、酸奶感(顶部的乙醛香)、酸奶的清爽的后味(酸奶感)越强，越往左上则涩味、杂味越强，越往左下则乳感、甜味越强的结果，如图7及图9所示，不使用S.thermophilus而用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时(L1-L13、L15-L18)被标绘在左下至左上，被评价为与未发酵牛乳(Blank)同等，几乎无发酵风味或涩味、杂味强。与此相对地，组合使用S.thermophilus和乳杆菌科乳酸菌时(R1-R36)，被标绘在右下至右上，涩味·杂味弱、酸奶感(顶部的乙醛香)、酸奶的清爽的后味强，被赋予了酸奶感。另外，根据图8及图9，使用S.thermophilus和L.delbrueckii发酵而得的发酵乳(R1-R3/R19-R21)被标绘在原点的右上，而使用S.thermophilus和除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌发酵而得的发酵乳(R4-R18/R22-R36)则被标绘在原点的右下且使用S.thermophilus和L.delbrueckii发酵而得的发酵乳的左下。即，使用S.thermophilus和除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌发酵而得的发酵乳被评价为与使用S.thermophilus和L.delbrueckii发酵而得的发酵乳相比酸味弱且乳感、甜味更强。
进而，对于使用除L.delbrueckii以外的乳杆菌科乳酸菌时(R4～R18、R22～R36)的香气成分及感官评价值，也进行了主要成分分析(PCA)。图10示出表示各发酵乳中的第1主要成分得分(PC1)与第2主要成分得分(PC2)的关系的图。图10为示出将使用S.thermophilus prtS(-)时(R4-R18)和使用S.thermophilus prtS(+)时(R22-R36)分别圈出的图。进而，图11为示出与图10的各样品的标绘位置对应的香气成分及感官评价项目的散点图。
如图10所示，在S.thermophilus中，将结果按照携带prtS基因时(prtS(+)：R22-R36)和不携带prtS基因时(prtS(-)：R4-R18)分为2种，表明S.thermophilus是否携带prtS基因也进一步影响发酵乳中的香气成分及感官评价值。
另外，图11中有如下倾向：越往x轴的左边则酸奶感越强，越往左下则乙醛越多，越往左上则酸味、涩味、杂味越强，越往右下则甜味、乳感越强，根据图10及图11，使用不携带prtS基因的S.thermophilus时(prtS(-))，一部分样品被标绘在左上方向，大部分样品存在于x轴的右侧，使用携带prtS基因的S.thermophilus时(prtS(+))，被标绘在x轴的左侧、特别是左下。由此表明，prtS(+)相较于prtS(-)而言为酸奶感强且酸味、涩味、杂味弱的风味。
(试验例2)
＜S.thermophilus＞
关于S.thermophilus，分别使用下述表5所示的、与试验例1中使用的各菌株(S.thermophilus prtS(-)：“S.thermophilus 1131”；S.thermophilus prtS(+)：“S.thermophilus NITE BP-02875”)相同的菌株。
＜乳杆菌科乳酸菌＞
乳杆菌科乳酸菌使用下述表5所示的菌种的各菌株。表5中，菌株编号以JCM表示的菌株为可由理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(http：//jcm.brc.riken.jp/ja/)获得的菌株，以NBRC表示的菌株为可由国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(http：//www.nite.go.jp/nbrc/)获得的菌株，以NCIMB表示的菌株为可由英国微生物株保存机构NCIMB研究所获得的菌株。
＜发酵时间测定＞
以下述表5的组合(实施例：R100～R159、比较例：L100～L129)用上述的S.thermophilus与乳杆菌科乳酸菌分别测定发酵所需的时间。
[表5]
Figure BDA0004085177900000371
发酵中，向在10％脱脂奶粉培养基中加入了0.1％酵母提取物的培养基中添加各菌株0.5％(0.5mL/100mL、以下同样)或以各菌株量分别为0.5％(总计1％)的方式添加其组合(S.thermophilus：乳杆菌科乳酸菌＝约1：1(菌数))，在37℃下发酵24小时(需氧、静置培养)，得到各发酵乳。分别测定添加菌株起至pH达到4.5以下为止的时间，作为发酵所需的发酵时间。需要说明的是，对于添加菌株起24小时内pH未达到4.5者，将发酵时间设为24小时(1440分钟)，并结束发酵。
发酵时间测定的结果是，使用S.thermophilus时(R100～R159)，不论是否携带prtS基因，与不使用S.thermophilus而用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时(L100～L129)相比，p值均小于0.01，确认发酵时间显著缩短。下述表6分别示出使用携带prtS基因的S.thermophilus时(R130～R159)及用乳杆菌科乳酸菌单独发酵时(L100～L129)的发酵时间(分钟)。
[表6]
组合No. 发酵时间[min] 组合No. 发酵时间[min]
R130 610 L100 1015
R131 520 L101 1440
R132 580 L102 1440
R133 525 L103 1440
R134 435 L104 675
R135 430 L105 1440
R136 510 L106 1440
R137 535 L107 1440
R138 460 L108 1440
R139 500 L109 1440
R140 580 L110 1130
R141 495 L111 1440
R142 535 L112 1055
R143 525 L113 1440
R144 555 L114 1440
R145 495 L115 1440
R146 440 L116 1440
R147 435 L117 1440
R148 535 L118 1440
R149 485 L119 1440
R150 450 L120 1440
R151 530 L121 1440
R152 615 L122 1440
R153 495 L123 1440
R154 595 L124 1440
R155 420 L125 1440
R156 565 L126 1440
R157 555 L127 1235
R158 455 L128 1440
R159 525 L129 1440
平均 513.0 平均 1370.3
SD 55.4 SD 176.8
另外，图12分别示出使用不携带prtS基因的S.thermophilus时(prtS(-)、R100～R129(n＝30))、使用携带prtS基因的S.thermophilus时(prtS(+)、R130～R159(n＝30))及不使用S.thermophilus时(无、L100～L129(n＝30))的发酵时间(平均值、分钟)。t检验的结果是，prtS(+)的结果相对于prtS(-)的结果的p值小于0.001。由此可确认，与试验例1同样地，prtS(+)相较于prtS(-)而言更显著地缩短发酵时间。
产业上的可利用性
如以上说明那样，根据本发明，能够提供能够在足够短的时间内完成发酵且能够稳定地制造具有与现有的发酵乳不同的风味特征“酸味弱、有乳感和甜味的温和(柔和)风味”的发酵乳的新的乳酸菌酵种、使用其的发酵乳的制造方法及利用它们得到的发酵乳。
保藏号
1.
(1)识别标识：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)OLS4496
(2)保藏号：NITE BP-02875
(3)保藏日：2019年2月5日
(4)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心
2.
(1)识别标识：副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei)OLL204220
(2)保藏号：NITE BP-02244
(3)保藏日：2016年4月25日
(4)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心
3.
(1)识别标识：德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubspecies bulgaricus)OLL1255
(2)保藏号：NITE BP-76
(3)原保藏日：2005年2月10日(转为基于布达佩斯条约的保藏的移管日：2009年4月1日)
(4)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心
4.
(1)识别标识：德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)OLL204989
(2)保藏号：NITE BP-02874
(3)保藏日：2019年2月5日
(4)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心
序列表自由文本
序列号：1
＜223＞正向引物
序列号：2
＜223＞反向引物
SEQUENCE LISTING
<110> 株式会社明治（Meiji Co., Ltd.）
<120> 乳酸菌酵种、发酵乳的制造方法及发酵乳
<130> IBPF21-524WO
<150> JP2020-139992
<151> 2020-08-21
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 1
gacttgaaga aacagcgcgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 2
taggtggagg cgttacagtg 20

Claims (13)

1.一种乳酸菌酵种，其包含嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和除德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)以外的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌酵种，其中，上述嗜热链球菌为携带prtS基因的菌。
3.根据权利要求1或2所述的乳酸菌酵种，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)乳酸菌、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)乳酸菌、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)乳酸菌、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)乳酸菌、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)乳酸菌、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)乳酸菌、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)乳酸菌、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)乳酸菌、片球菌属(Pediococcus)乳酸菌及明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌组成的组中的至少1种。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的乳酸菌酵种，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、副格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacilluskefiranofaciens)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei)、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、类植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusparaplantarum)、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)、可可液体乳杆菌(Liquorilactobacillus cacaonum)、红条液体乳杆菌(Liquorilactobacillussatsumensis)、清酒广布乳杆菌(Latilactobacillus sakei)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、类布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillusparabuchneri)、高加索迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri)、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、那幕尔促生乳杆菌(Levilactobacillus namurensis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)组成的组中的至少1种。
5.一种发酵乳的制造方法，其包括下述发酵工序：将权利要求1～4中任一项所述的乳酸菌酵种添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
6.一种发酵乳的制造方法，其包括下述发酵工序：将嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和除德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)以外的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌添加于含有原料乳的调制乳液体中而使其发酵，得到发酵乳。
7.根据权利要求6所述的发酵乳的制造方法，其中，上述嗜热链球菌为携带prtS基因的菌。
8.根据权利要求6或7所述的发酵乳的制造方法，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)乳酸菌、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)乳酸菌、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)乳酸菌、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)乳酸菌、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)乳酸菌、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)乳酸菌、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)乳酸菌、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)乳酸菌、片球菌属(Pediococcus)乳酸菌及明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌组成的组中的至少1种。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的发酵乳的制造方法，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、副格氏乳杆菌(Lactobacillusparagasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lacticaseibacilluscasei)、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、类植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus paraplantarum)、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacilluspentosus)、可可液体乳杆菌(Liquorilactobacillus cacaonum)、红条液体乳杆菌(Liquorilactobacillus satsumensis)、清酒广布乳杆菌(Latilactobacillus sakei)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、类布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillusparabuchneri)、高加索迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri)、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、那幕尔促生乳杆菌(Levilactobacillus namurensis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)组成的组中的至少1种。
10.一种发酵乳，其含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和除德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)以外的乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳酸菌。
11.根据权利要求10所述的发酵乳，其中，上述嗜热链球菌为携带prtS基因的菌。
12.根据权利要求10或11所述的发酵乳，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)乳酸菌、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)乳酸菌、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)乳酸菌、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)乳酸菌、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)乳酸菌、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)乳酸菌、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)乳酸菌、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)乳酸菌、片球菌属(Pediococcus)乳酸菌及明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸菌组成的组中的至少1种。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的发酵乳，其中，上述乳杆菌科乳酸菌为选自由格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、副格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)、干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei)、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、类植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusparaplantarum)、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)、可可液体乳杆菌(Liquorilactobacillus cacaonum)、红条液体乳杆菌(Liquorilactobacillussatsumensis)、清酒广布乳杆菌(Latilactobacillus sakei)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、类布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillusparabuchneri)、高加索迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri)、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、那幕尔促生乳杆菌(Levilactobacillus namurensis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)组成的组中的至少1种。
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