CN117222745A - 高产核黄素的罗伊氏粘液乳杆菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型分离的细菌菌株罗伊氏粘液乳杆菌菌株的鉴定，与其它已知的乳杆菌属的菌株相比，所述菌株的特征在于核黄素(维生素B2)天然存在的过量产生。所述粘液乳杆菌属的种的菌株以保藏号LMG P‑32020保藏。另一方面，本文还公开了所述罗伊氏粘液乳杆菌菌株的用途。特别地，公开了所述菌株在食品和饲料工业、人和兽医学健康、大规模维生素生产、化妆品和消费者护理产品中的用途。

Description

高产核黄素的罗伊氏粘液乳杆菌菌株及其应用
发明领域
本发明涉及新型分离的细菌菌株罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusreuteri)菌株的鉴定，与其它已知的乳杆菌属菌株相比，该菌株的特征在于天然存在的核黄素(维生素B2)过量产生。将粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)的种的所述菌株以保藏号LMG P-32020保藏。另一方面，本文还公开了所述罗伊氏粘液乳杆菌菌株的用途。特别地，公开了所述菌株在食品和饲料工业、人和兽医健康、大规模维生素生产、化妆品和消费者护理产品中的用途。
发明背景
核黄素(维生素B2)是必需的水溶性黄绿色荧光维生素，其参与大量营养素和能量代谢(脂肪、蛋白质和碳水化合物)，具有抗氧化功能，并激活诸如叶酸和吡哆醇等其它维生素。核黄素是所有生命形式所必需的，在人中，其对于生殖功能、哺乳、成功妊娠结果、儿童发育和足够的能量水平是非常重要的。根据欧洲食品安全局(EFSA，2017年，EFSA-Q-2011-01222)的定义，目前儿童的平均需求为0.5-1.4mg核黄素/天，成人为1.3mg/天。根据俄勒冈州立大学的说法，在妊娠期间，女性每天应该有1.4mg，母乳喂养时，每天1.6mg(https:// lpi.oregonstate.edu/mic/vitamins/riboflavin)。此外，核黄素缺乏会导致皮肤损伤、咽喉痛、口腔和粘膜水肿、唇裂和舌炎。核黄素的摄入可以逆转这些症状，并进一步提高针对常见病毒和细菌感染性疾病诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染的标准疗法的效率(Dey和Bishayi，2016)。根据欧洲食品安全局饮食产品、营养和过敏小组(NDA)(2010年)的科学意见，欧盟登记中对核黄素来源食品的授权健康要求包括对正常的产能代谢的贡献、神经系统正常功能的维持、正常皮肤和粘膜的维持、正常红细胞的维持、正常视力的维持、对铁的正常代谢的贡献、DNA的保护、蛋白质和脂质免受氧化损伤、减少疲劳和疲劳的减少(欧盟委员会法规(EU)432/2012，2012年5月16日)。核黄素也用于动物饲料中，以改善动物健康，在欧洲，其被用作食品着色剂，食品添加剂E号为E101。
在大规模工业场景中，核黄素是通过化学合成常规生产的。然而，在过去的几十年中，出于经济和环境的考虑，核黄素的微生物合成得到越来越多地实施。核黄素可以从天然的过量生产性微生物(主要是丝状真菌和酵母(阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)和无名假丝酵母(Candida famata))和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)突变体(Lim等人，2001；Stahmann等人，2000)中获得。虽然以前也显示乳酸菌产生核黄素(Thakur等人，2016)，但是迄今为止报道的乳酸菌菌株仅产生有限量的核黄素，例如在最大2.3-3μg/ml的培养基的范围内(Thakur和Tomar，2015；Jayashree等人，2010)。已经描述了刺激乳酸杆菌属(lactobacilli)的核黄素产量增加的方法。然而，这需要确定的条件，并且仍然仅导致5-6μg/mL培养基的核黄素浓度(Juarez del Valle等人，2017)。尽管已显示经遗传修饰而过表达ribG、ribB、ribA和ribH基因的重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000可产生多达24μg核黄素/ml培养基，但出于监管原因，目前不允许在人消费的食品中使用经遗传修饰的乳酸杆菌。在利用例如阿舒假囊酵母的工业过程中，核黄素的浓度通常约为26–30mg/mL。然而，一个重要的考虑因素是，这些浓度是用丝状真菌和酵母获得的，而不是用对人具有良好安全特征的乳杆菌获得的。乳酸菌已经在食品工业中广泛应用，或者作为益生菌制剂应用(例如罗伊氏粘液乳杆菌RC-14和鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus GG)。因此，能够提高维生素产量的乳杆菌对于食品、饲料和各种益生菌制剂、补充剂以及甚至药物的维生素强化具有重要意义。考虑到目前儿童和成人的平均需求，前述乳杆菌中天然存在的核黄素浓度不能满足大规模工业生产或食品发酵的需要。
因此，天然过量产生核黄素的乳杆菌可以通过提供成本有效且安全的食品强化溶液，或益生菌或后生元产品来预防或治疗人和动物的核黄素缺乏症。它们向人和动物的施用可以改善全身和/或粘膜免疫健康、对病原体的抗性、大量营养/能量代谢和抗氧化功能，以及生殖和后代健康。
发明简述
本发明基于对显示核黄素产量增加的新型粘液乳杆菌属菌株的鉴定。特别地，本发明人发现所述粘液乳杆菌属菌株在与核黄素途径相关的基因上有改变。更具体地说，本发明基于罗伊氏粘液乳杆菌(L.reuteri)的种的新型分离菌株的鉴定。所述菌株已于2020年10月9日保藏在比利时微生物联合保藏中心(Belgian Co-ordinated Collection ofMicro-Organisms)(BCCM)，Universiteit Gent,K.L.Ledeganckstraat 35,9000Gent,Belgium)，保藏号为LMG P-32020，在本文中也称为罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339或AMBV339菌株。
罗伊氏粘液乳杆菌的种的这种新型分离菌株的典型特征是，其天然产生过量的核黄素，也称为维生素B2。特别地，AMBV339菌株能够产生高水平的核黄素(尤其是与其它已知的乳杆菌属的菌株相比)。
因此，在第一方面，本申请因此涉及一种或多种分离的粘液乳杆菌属细菌菌株，其具有天然存在的核黄素过量产生。特别地，本申请公开了一种或多种分离的粘液乳杆菌属细菌菌株，其在与核黄素产生途径相关的一种或多种基因或调控基因序列中具有改变。在具体的实施方案中，与罗伊氏粘液乳杆菌模式菌株DSM20016的一个或多个基因或其上游调节序列相比，本发明的所述菌株在所述基因或调控序列中具有改变。在另一个具体实施方案中，所述基因选自3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶(EC 4.1.99.12)和/或GTP环化水解酶II(EC 3.5.4.25)、二氨基羟基磷酸核糖基氨基嘧啶脱氨酶(EC 3.5.4.26)和/或5-氨基-6-(5-磷酸核糖基氨基)尿嘧啶还原酶(EC 1.1.1.193)、6,7-二甲基-8-核糖醇基2,4-二氧四氢喋啶合酶(EC 2.5.1.78)、核黄素合酶真细菌/真核生物(EC 2.5.1.9)、FMN腺苷酰基转移酶(EC 2.7.7.2)和/或核黄素激酶(EC 2.7.1.26)、RibT蛋白、核黄素生物合成乙酰基转移酶(GNAT)家族或核黄素ECF转运蛋白的底物特异性组分RibU的基因。
特别地，此类调控基因序列选自启动子、核糖开关(riboswitches)或它们所属的所述基因或遗传操纵子上游的其它调控序列。在具体的实施方案中，本申请公开了一种或多种分离的粘液乳杆菌属细菌菌株，其在核黄素产生中涉及的基因或遗传操纵子上游的调控区中具有改变,特别是二氨基羟基磷酸核糖基氨基嘧啶脱氨酶(EC 3.5.4.26)和/或5-氨基-6-(5-磷酸核糖基氨基)尿嘧啶还原酶(EC 1.1.1.193)(也称为ribD)、核黄素合酶真细菌/真核生物(EC 2.5.1.9)(也称为ribE)，3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶(EC 4.1.99.12)和/或GTP环化水解酶I I(EC 3.5.4.25)(也称为ribBA)和/或6,7-二甲基-8-核糖醇基2,4-二氧四氢喋啶合酶(EC 2.5.1.78)(也称为ribH)的基因。
在非常具体的实施方案中，本发明的所述菌株在所述模式菌株的基因组组装体(genome assembly)NC_009513.1中的碱基931,824处包含改变，特别是所述改变是鸟嘌呤至胸腺嘧啶的改变。
更具体地说，在与核黄素产生途径相关的一个或多个基因或所述基因上游的调控序列中显示出改变的分离的粘液乳杆菌属细菌菌株是罗伊氏粘液乳杆菌(L.reuteri)的种，所述菌株保藏在BCCM，保藏号为LMG P-32020。
另一方面，本申请提供了罗伊氏粘液乳杆菌(L.reuteri)的种的分离的细菌菌株，所述菌株保藏在BCCM，保藏号为LMG P-32020。
根据本申请的实施方案，分离的细菌菌株的细菌呈悬浮的、冻干的、喷雾干燥的、活的或无生命的/后生元的形式，或者存在于益生元或合生元制剂中，只要活性组分未被破坏。
在另一个进一步的实施方案中，本申请提供了包含以保藏号LMG P-32020保藏的罗伊氏粘液乳杆菌的种的分离的细菌菌株的组合物。在进一步的实施方案中，所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、芳化剂或载体。在更进一步的实施方案中，所述组合物可以任选地包含其它益生菌。
根据本申请的实施方案，对于每克组合物，组合物包含在103至1011个菌落形成单位(CFU)的范围内的细菌量。
本申请基于这样的发现：分离的细菌菌株罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339显示天然存在的核黄素过量产生。因此，在实施方案中，本申请的分离的细菌菌株或组合物用于治疗和/或预防受试者的与核黄素水平降低相关的疾病。另一方面，所述与核黄素水平降低相关的疾病选自神经系统疾病、皮肤病、呼吸道疾病、与红细胞水平降低相关的疾病、眼病、与铁代谢紊乱相关的疾病、与氧化应激相关的疾病、全身性疲劳或全身性疾病、泌尿生殖系统疾病、代谢性疾病(例如与维生素水平降低相关的疾病)、头痛或偏头痛、妊娠、胃肠疾病、免疫疾病、癌症以及相关的病毒、细菌和真菌感染。更具体地，本发明的分离的细菌菌株或组合物用于治疗和/或预防与核黄素水平降低相关的疾病。
或者，本发明的所述菌株或组合物适用于预防或治疗肠道微生物群系生态失调、促进肠道微生物群系复原力和/或促进健康相关的肠道分类群。
另一方面，公开了根据本发明的分离的细菌菌株或组合物用于预防和/或减轻全身性疲劳的非治疗性用途。
另一方面，在化妆品或个人护理产品中公开了根据本发明的分离的细菌菌株或组合物的非治疗性用途。
根据另一个实施方案，公开了根据本发明的分离的细菌菌株或组合物在核黄素生产过程中的用途。特别地，用于生产核黄素的所述方法是发酵方法。
另一方面，公开了根据本发明任一实施方案的分离的细菌菌株或组合物作为益生菌或后生元的用途，或者在益生菌或合生元制剂中的用途。例如，其可以以口服或局部益生菌或后生元制剂的形式施用。
在又一另外的方面，公开了根据本发明的任何实施方案的分离的细菌菌株或组合物在食品或饲料工业中的用途。
另一方面，公开了根据本发明的任何实施方案的分离的细菌菌株或组合物在食品或饲料工业中作为着色剂或作为发酵剂的用途。
根据另一个实施方案，本申请提供了生产核黄素的方法。所述方法的特征在于：在允许核黄素产生的条件下，将根据本申请的实施方案的细菌菌株或组合物在水性介质中孵育。
在进一步的实施方案中，所述生产核黄素的方法包括以下步骤：a)提供根据本发明的实施方案的细菌菌株或组合物，b)在允许产生核黄素的条件下，在水性培养基中孵育所述细菌菌株或所述组合物；以及任选地c)从水性培养基中分离和纯化核黄素。
附图说明
现在具体参考附图，要强调的是，所示的细节是示例性的，并且仅仅是为了说明性地论述本发明的不同实施方案。它们是为了提供被认为是对本发明的原理和概念方面最有用和最容易地描述的内容而提出的。在这方面，除了对本发明的基本理解所必需的之外，没有试图更详细地示出本发明的结构细节。结合附图的描述使本领域技术人员清楚如何在实践中实施本发明的几种形式。
图1：与非过量产生核黄素的罗伊氏粘液乳杆菌菌株AMBV336、AMBV337、AMBV368、AMBV369和AMBV371以及模式菌株罗伊氏粘液乳杆菌DSM20016相比，过量产生核黄素的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339中具有鸟嘌呤至胸腺嘧啶突变的罗伊氏粘液乳杆菌的核黄素操纵子(ribD、ribE、ribBA和ribH基因基因)上游的调控基因间区域。
图2：罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339的核黄素产量的估计。
(A)与选择的其它罗伊氏粘液乳杆菌菌株和商业益生菌菌株鼠李糖乳杆菌GG和罗伊氏粘液乳杆菌RC-14相比，罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339培养物、无细胞培养物上清液和细胞沉淀中定量的核黄素的荧光特性；p<0.05表明与所有其它菌株相比，AMBV339条件的核黄素荧光在统计上显著更高。(B和C)基于(A)荧光和(B)对照核黄素稀释物的标准曲线绘制的培养物的吸光度，对罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339和其它阴道罗伊氏粘液乳杆菌AMBV336和AMBV368以及商业益生菌罗伊氏粘液乳杆菌RC-14和鼠李糖乳杆菌GG的培养物中的核黄素浓度的定量。将MRS中核黄素标准曲线的测量值描绘为灰色圆圈，相应的核黄素浓度描绘于x轴上。罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339(▲)、AMBV336(▼)、AMBV368(◆)、RC-14(■)和鼠李糖乳杆菌GG的荧光和吸光度测量值绘制在核黄素标准曲线内。
图3：与罗伊氏粘液乳杆菌AMBV336和罗伊氏粘液乳杆菌RC-14相比，在食品基质中罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339培养物中定量的核黄素的(A)生长和(B)荧光特征；(C)在与起始嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)共培养的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339中定量的核黄素的荧光特性。p<0.05表明与生长培养基条件相比，AMBV336、AMBV339或RC-14条件的核黄素荧光在统计学上显著更高。
图4：罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在(A)不同pH的胃液中，或(B)接种了人粪便微生物群的模拟胃肠道的不同部分中的纵向存活率(Longitudinal survival)；(C)粪便条件与粪便本身(0.9％ NaCl和椰子汁)中的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339的微生物群落组成之间的Bray-Curtis差异。对于模拟胃肠道，加入0.9％ NaCl溶液(或盐水)中的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339或椰子汁中的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339培养物。数据表示为具有标准偏差的平均值。
发明详述
现在将进一步描述本发明。在下面的段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与一个或多个任何其它方面相结合，除非明确指出相反的情况。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的一个或多个任何其它特征相结合。
当描述本发明的化合物时，除非上下文另有说明，否则所用术语应根据以下定义来解释。
如说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。举例来说，“一种化合物”是指一种化合物或一种以上的化合物。
本文所用的术语“约”或“大约”当指诸如参数、量、持续时间等可测量的值时，意味着包括指定值的和相对于指定值的+/-10％或更小，优选+/-5％或更小，更优选+/-1％或更小，还更优选+/-0.1％或更小的变化，只要此类变化适于在所公开的发明中进行。应该理解的是，修饰语“约”或“大约”所指的值本身也是具体地、优选地公开的。
本发明基于从健康人阴道样品中分离的新型罗伊氏粘液乳杆菌菌株的鉴定。
该菌株的特征在于与核黄素产生途径相关的一个或多个基因或调控基因序列的改变。对于新型分离的细菌菌株特异的是其表现出天然的核黄素过量产生特性。
在本发明的说明书中，术语改变意指为与本文公开的比较菌株诸如另外的AMBV菌株或模式菌株相比，基因组序列的修饰。特别地，这种修饰可以在菌株的基因组序列中构成突变、缺失、插入……。
特别地，本发明人鉴定出罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339菌株包含核黄素产生所需的核黄素合成途径基因。更具体地说，罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339菌株在de Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基或测试的食品基质中的生长表明AMBV339培养物显示出存在核黄素的黄绿色荧光特征，这不存在于测试的其它罗伊氏粘液乳杆菌菌株中。使用基于荧光、吸光度和HPLC/UV的方法，将罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339菌株上清液中的核黄素浓度定量为约18-40μg核黄素/ml。根据与乳酸菌的核黄素产生相关的现有技术，这些核黄素浓度为先前报道的其它乳酸菌菌株的最大核黄素产生水平的至少3-20倍，这取决于所用的检测方法。
由于其发酵和益生菌特性，乳酸杆菌经常用于食品/饲料应用和补充。事实上，罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339菌株也具有安全资格认证(Qualified Presumption of Safety)(QPS)状态，表明其可直接用于饲料、食品和健康应用。此外，AMBV339菌株也在测试条件下有效生长并在一夜之间产生高生物量。
因此，本申请提供了分离的细菌罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339菌株，其典型特征在于高水平的核黄素产生。另外，还提供了包含罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339菌株的组合物。罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339菌株已于2020年10月9日保藏在比利时微生物协调保藏中心(BCCM)，保藏号为LMG P-32020。因此，分离的AMBV339菌株或包含所述菌株的组合物能够大量产生核黄素或维生素B2。
根据本发明的实施方案，可以以活的形式或后生元形式、益生菌形式或合生元形式在冻干的、喷雾干燥的悬浮液中提供分离的细菌AMBV339菌株的细菌，条件是活性成分没有失活。在本发明的说明书中，术语“活的形式”、“益生菌”和“合生元”形式是指其中细菌是活的形式。在本发明的说明书中，术语“后生元形式”或“益生元形式”是指其中细菌不是活的形式，诸如在无生命应用或细菌或其分子产物的标准化形式的情况下。
在本发明的说明书中，使用了以下定义：
益生菌＝当以足够的量施用时，赋予宿主健康益处的活微生物
后生元＝赋予宿主健康益处的无生命微生物和/或其组分的制剂益生元＝被宿主微生物选择性利用的赋予健康益处的底物
合生元＝包含活微生物和宿主微生物选择性利用的一种或多种底物的混合物，其可赋予宿主健康益处
还提供了包含分离的细菌菌株AMBV339的组合物。本发明组合物的制备可以通过冷冻干燥或喷雾干燥细菌培养物，将干燥的均在悬浮液中的细菌与水或其它合适的赋形剂混合，以及任选地加入其它活性成分来实现。
中本文中所用，“组合物”是指两种或更多种产品或化合物(例如剂、调制剂、调节剂等)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末或糊剂、水性或非水性制剂或其任意组合。在本发明的说明书中，组合物优选为药物组合物或化妆品组合物，包含一种或多种药物赋形剂或稀释剂，诸如合适的糖、PEG/PPG共聚物或防冻剂。
在一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、芳化剂或载体。可以在此类组合物中选择的赋形剂的实例是橡胶、黄原胶、羧甲基纤维素、硅酮、凡士林、白色软石蜡、硬脂酸镁、麦芽糖糊精、甘露醇、淀粉、葡萄糖、海藻糖、甘油、丙二醇、乳糖等。
组合物还可包含芳化剂；诸如百里香或其任何提取物。根据本发明的实施方案，载体提高了微生物的生物利用度、稳定性和/或耐性。
因此，组合物还可包含一种或多种载体，以提高微生物的生物利用度、稳定性和耐性。载体还可提高细菌菌株对合适表面例如粘膜表面的粘附。这种载体可以是例如唾液链球菌(S.salivarius)或乳杆菌属产生的胞外多糖(exopolysaccharides)。另外，载体可以是例如能够通过升高温度来增加粘度并因此增强粘附性的热敏聚合物，或Gantrex。在另一个实施方案中，载体可以是羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
根据本发明的实施方案，对于每克组合物，组合物包含优选在103至1011CFU的范围内的细菌量。
另一方面，本发明涉及分离的细菌菌株AMBV339或包含根据本发明的所述菌株的组合物，其用作人医学或兽医学中的药物。特别地，根据本发明的分离的细菌菌株或组合物用于治疗和/或预防受试者的与核黄素水平降低相关的疾病。在另一个实施方案中，本发明的分离的细菌菌株或组合物用于治疗和/或预防受试者的对于其需要核黄素增加的疾病。另一方面，与核黄素水平降低相关的疾病选自神经系统疾病、皮肤病、呼吸道疾病、与红细胞水平降低相关的疾病、眼病、与铁代谢紊乱相关的疾病、与氧化应激相关的疾病、全身性疲劳或全身性疾病、泌尿生殖系统疾病、代谢性疾病(例如与维生素水平降低相关的疾病)、头痛或偏头痛、妊娠、胃肠疾病、免疫疾病、癌症以及相关的病毒、细菌和真菌感染。更具体地，本发明的分离的细菌菌株或组合物用于治疗和/或预防与核黄素水平降低相关的疾病。
另一方面，本发明涉及通过向受试者施用分离的细菌菌株AMBV339或包含所述菌株的组合物来治疗受试者的疾病的方法。特别地，疾病可以选自对于其需要核黄素增加的疾病。另一方面，所述与核黄素水平降低相关的疾病选自神经系统疾病、皮肤病、呼吸道疾病、与红细胞水平降低相关的疾病、眼病、与铁代谢紊乱相关的疾病、与氧化应激相关的疾病、全身性疲劳或全身性疾病、泌尿生殖系统疾病、代谢性疾病(例如与维生素水平降低相关的疾病)、头痛或偏头痛、妊娠、胃肠疾病、免疫疾病、癌症以及相关的病毒、细菌和真菌感染。更具体地说，本发明涉及通过向受试者施用分离的细菌菌株AMBV339或包含所述菌株的组合物来治疗受试者的与核黄素水平降低相关的疾病的方法。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全稳定或治愈疾病和/或由该疾病引起的副作用而言，该效果可以是治疗性的。“治疗(Treatment)”包括对哺乳动物特别是人的疾病的任何治疗，包括：(a)预防可能易患该疾病或症状但尚未被诊断为患有该疾病或症状的受试者发生该疾病或症状；(b)抑制疾病症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病症状，即引起疾病或症状的消退。在本发明的说明书中，术语“预防”等是指防止疾病或疾患发生。在本发明的说明书中，术语“免疫调节”是指将免疫反应改变到所需水平和/或方向的过程。
另一方面，本发明的分离的细菌菌株或组合物可用于全身性疲劳的非治疗性减轻和/或预防。因此，本申请还提供了本发明的分离的细菌菌株或组合物用于预防和/或减轻全身疲劳或虚弱的非治疗性用途。术语“非治疗性”等是指在非疾病背景下，从而在受试者出现疾病的任何体征之前获得所需的生理效果。另一方面，公开了本发明的分离的细菌菌株或组合物作为核黄素补充摄入的用途。
另一方面，公开了本发明的分离的细菌菌株或组合物在化妆品或个人护理产品中的非治疗性用途。在具体的实施方案中，公开了本发明的分离的细菌菌株或组合物在化妆品中的非治疗性用途。本发明的化妆品的形式不受特别限制，并且可以以乳液、液体、霜剂、固体或糊剂的形式提供化妆品。还可以以剂、凝胶、粉末、摩丝或喷雾剂的形式提供化妆品。例如，化妆品可以选自皮肤化妆品、彩妆(makeup)或美发化妆品(hairdressingcosmetics)。皮肤化妆品可包括清洁产品、抗蒸腾产品、水合产品、抗紫外线产品等。美发化妆品可包括头发清洁产品，诸如香波、染发产品、促进头发生长的产品、头发冲洗产品或头发调理产品。化妆品还可包括清洁凝胶、清洁霜、清洁泡沫、清洁洗液、液体肥皂、洗手液、沐浴油、美容霜(saving cream)。彩妆化妆品(Makeup cosmetics)可包括粉底粉、扑面粉、口红、唇膏、唇彩、眼线笔、眼霜、睫毛膏、胭脂、美甲油和其它产品、指甲油。
在具体的实施方案中，公开了本发明的分离的细菌菌株或组合物在个人护理产品中的非治疗性用途。所述个人护理产品可包括但不限于个人卫生和清洁产品、口腔护理产品诸如牙膏、眼部护理产品、耳部护理产品、卫生产品。
本申请的一个方面公开了根据本发明的分离的细菌菌株或组合物作为益生菌或后生元的用途。益生菌被定义为当以足够的量施用时对宿主产生有益效果的活微生物。在本发明的说明书中，对于益生菌，旨在指由益生菌的代谢活性产生的任何因子或能够以直接或间接方式赋予宿主有益效果的任何释放的分子。因此，在本发明的说明书中，术语“后生元”、“发酵产物”或“发酵上清液”也可包括由本发明的分离的细菌菌株的代谢活性产生的任何因子，其能够以直接或间接的方式赋予宿主有益的效果。
另一方面，提供了根据本发明的分离的细菌菌株或组合物在食品或饲料工业中，特别是在乳制品和非乳制品发酵产品、膳食补充剂、膳食食品添加剂和/或营养制品的生产中的用途。因此，所述食品工业可以包括发酵食品(乳制品(dairy-based worth)、大豆)。所述食品工业还可包括用于食品生产的生物反应器和加工环境，其中可将本发明的细菌菌株或组合物在生产过程中加入到食品中。
在具体的实施方案中，因此公开了本发明的分离的细菌菌株或组合物在食物补充中的非治疗性用途。因此，分离的细菌菌株或组合物可以作为食品补充剂提供，或者其可以适合地用作食品或饲料工业中的着色剂。
在又一另外方面，公开了本发明的分离的细菌菌株或组合物在核黄素生产过程中的用途。因为本发明的分离的细菌菌株的特征在于其高水平的天然存在的核黄素产生，所以其非常适合于核黄素的生产。
在进一步的实施方案中，本申请还公开了生产核黄素的方法。在所述方法中，在允许从给定底物产生核黄素的条件下，将根据任何公开的实施方案的细菌菌株或组合物在水性培养基中孵育。水性培养基通常是包含例如盐、一种或多种底物和一定pH值的水性培养基。该培养基也称为生产培养基。
因此，该方法可包括以下步骤：(a)提供根据任何公开的实施方案的细菌菌株或组合物，(b)在允许产生核黄素的条件下，在水性培养基中孵育所述细菌菌株或所述组合物；以及任选地(c)从水性培养基中分离和纯化核黄素。
本文所用的“发酵”或“生产”或“发酵方法”可以是使用技术人员已知的培养基、条件和程序来培养细菌细胞。
可以通过任何合适的方法从细胞中回收产生的核黄素。回收意味着例如可将产生的核黄素从生产培养基中分离出来。任选地，可进一步加工(例如纯化)由此产生的发酵产物。
关于根据本发明的方法，细菌的生长步骤可以在补充有用于通常在需氧条件下生长的适当营养物的水性培养基(即生长培养基)中进行。培养可以例如以分批、补料分批、半连续或连续方式进行。
术语“产量”或“生产率”是本领域公认的，包括在给定的时间和给定的发酵体积下形成的核黄素的浓度(例如，kg产物/小时/升)。术语“生产效率”包括达到特定生产水平所需的时间。术语“产率”是本领域公认的，包括核黄素生产的效率。
根据本发明的分离的细菌菌株或组合物可呈适于局部、口服或通过呼吸道施用的任何形式。另外，根据本发明的细菌菌株或组合物可呈选自但不限于喷雾剂、霜剂、洗剂、凝胶、软膏、溶液、混悬剂、乳液、胶囊、片剂、粉末、颗粒剂、滴剂、吸入剂、牙膏、漱口剂的药物形式。细菌菌株或组合物可以进一步以这样的方式配制，即其可以用喷雾器，利用或不用喷射剂通过呼吸道施用。最后，在优选实施方案中，细菌菌株或组合物也可以以可通过阴道施用来施用其的方式配制。例如，本发明的细菌菌株或组合物可以作为阴道洗液、阴道皂、阴道乳膏、棉塞或阴道药丸提供。
如本文中所用，术语“受试者”指任何活的生物体。因此，受试者可以是哺乳动物、鱼或鸟。优选地，其是指人受试者或非人哺乳动物。甚至更优选地，受试者是人受试者。在另一个具体实施方案中，受试者是生产性动物或农场动物或宠物。生产性动物或农场动物可选自猪、绵羊、山羊、牛、马、鸡、鹅、火鸡或兔。宠物可以选自猫或狗。
实施例
材料和方法
罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339菌株的全基因组测序及基因注释
将菌株在de Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基(Carl Roth,Karlsruhe,Germany)中生长过夜。以一式两份，将1.5ml培养物转移到无菌试管中，并以100μg/ml加入氨苄青霉素。在37℃孵育1h后，以12.000g离心培养物3分钟。用无菌NaCl-EDTA(于0.5L蒸馏水中的0.8766g NaCl和0.292g EDTA)洗涤所得细胞沉淀三次，并将其重新悬浮在100μl NaCl-EDTA中。然后，在37℃下加入100μl溶菌酶(10mg/ml)和1μl RNA酶(20mg/ml)，持续1h。接着，加入229μl NaCl-EDTA、50μl 10％ SDS和20μl蛋白酶K(20mg/ml)，涡旋并在55℃下孵育1h。孵育后，加入200μl冷蛋白质沉淀溶液(6ml 5M CH3COOK、1.15ml冰醋酸和2.85ml蒸馏水)，以最大速度涡旋20秒，并在冰上孵育5min。然后，将溶液在4℃和12.000g下离心3min。将上清液转移到干净的1.5ml试管中，并在4℃和12.000g下离心3分钟。将所得上清液转移到干净的1.5ml试管中，用600μl冰冷的异丙醇沉淀DNA。在4℃和12.000g下离心3min后，弃去上清液，并用600μl新鲜的70％ EtOH重悬沉淀。在4℃和12.000g下离心3min后，弃去上清液，将沉淀风干，直至所有乙醇蒸发。将DNA沉淀溶解在50μl蒸馏水中，并在55℃孵育5min。
在医学微生物学实验室(University of Antwerp,Antwerp,Belgium)使用Nextera XT DNA样品制备试剂盒(Illumina,San Diego,CA,USA)和Illumina MiSeq平台，使用2x250个循环进行全基因组测序。使用Pathosystems Resource Integration Center(PATRIC,www.patricbrc.org)进行基因注释，并基于京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)(KEGG)途径(https://www.genome.jp/kegg/ pathway.html)确定核黄素基因的存在。
基于荧光的核黄素定量
根据前面描述的改进方法进行基于荧光的培养基中核黄素产量的定量分析。将乳杆菌接种在作为生长培养基的MRS肉汤(Difco)中，并在37℃下静态孵育过夜，或者接种在商业获得的食品基质(椰子汁、豆浆、全脂和半脱脂牛奶、酪乳、苹果汁或作为对照的MRS肉汤)中，并在37℃下静态孵育96小时。
为了获得无细胞培养上清液，随后将MRS中的细菌培养物离心(2486g，10分钟)，并将上清液过滤灭菌(通过0.2μm过滤器)以获得无细胞培养上清液。将所得细胞沉淀在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，并重新悬浮在新鲜MRS中。对于荧光测量，使用具有485/20激发滤光片和520/20发射滤光片的Synergy HTX多模式酶标仪(BioTek)在96孔板中测量100μl全细胞培养物、无细胞上清液或细胞沉淀的荧光。商业获得的核黄素粉末在MRS中的系列稀释物用于获得标准曲线作为定量的参考。用双因素方差分析进行统计分析。
基于吸光度的核黄素定量
根据Sauer等人(1996)进行基于444nm处的吸光度的培养基中核黄素产量的定量分析。将乳杆菌接种在MRS培养基中，并在37℃下静态孵育过夜。随后将培养物离心(2486g，10min)，并将上清液过滤灭菌(通过0.2μm过滤器)以获得无细胞培养物上清液。然后，将0.2ml的1M NaOH加入到0.8ml的无细胞培养上清液中，并用1ml的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)中和0.4ml的所得溶液。使用Synergy HTX多模式酶标仪(BioTek)在96孔板中测量444nm处的吸光度。商业获得的核黄素粉末在MRS中的系列稀释物用于获得标准曲线作为定量的参考。用双因素方差分析进行统计分析。
用HPLC-UV定量核黄素
根据欧洲药典维生素B12方法，用HPLC-UV的标准等度方法测量无细胞培养上清液样品中的核黄素浓度。将乳杆菌接种在作为生长培养基的MRS肉汤(Difco)中，并在37℃下静态孵育过夜，或者接种在商业获得的食品基质(椰子汁、酪乳或作为对照的MRS肉汤)中，并在37℃下静态孵育96小时。为了获得无细胞培养物上清液，随后将细菌培养物离心(2486g，10min)并收集上清液。对于HPLC-UV测量，将将样品用培养基和来自HPLC的流动相稀释，用2个标准系列一式两份进行测试。样品和对照也掺入了核黄素。
细菌生长的定量
通过在无菌PBS中制备连续10倍稀释的细菌培养物，并将其涂布在MRS琼脂上，对食品基质中的细菌生长进行定量。将平板在37℃孵育1-2天，随后计数对应于每个系列稀释度的菌落。细菌生长表示为菌落形成单位(CFU)/ml培养物。
罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在模拟的胃肠道系统中的存活率和微生物群系调节测试
将经洗涤并以～1.5x10^9CFU/ml重悬于盐水(0.9％ NaCl)中的活的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339或在椰子汁中培养的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339加入到模拟的人胃肠系统装置cfr中。Mortelé等人(2019)。简言之，该系统由代表胃(37℃，体积：34ml，pH 2-4，添加的剂:16ml)、小肠(37℃，体积：50ml，pH 7.5，添加的剂：15ml)和大肠的不同部分(37℃，厌氧，体积：65ml，pH:5.8，添加的剂：55ml)的容器组成。小肠和大肠部分接种了人类粪便微生物群。在有规律的时间点从系统中取样，以通过在MRS琼脂上铺板来评估罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339的存活率，并使用16S rRNA测序和随后在R studio中的生物信息学分析来分析粪便微生物群系的组成。
结果
核黄素产生途径中的基因存在于罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339中
罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339菌株的全基因组已经被测序和注释。已经在罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339的基因组中检测到核黄素产生和可能的转运所需的核黄素合成途径的所有基因，包括以下的那些基因：
·3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶(EC 4.1.99.12)和/或GTP环化水解酶II(EC3.5.4.25)
·二氨基羟基磷酸核糖基氨基嘧啶脱氨酶(EC 3.5.4.26)和/或5-氨基-6-(5-磷酸核糖基氨基)尿嘧啶还原酶(EC 1.1.1.193)
·6,7-二甲基-8-核糖醇基2,4-二氧四氢喋啶合酶(EC 2.5.1.78)
·核黄素合酶真细菌/真核生物(EC 2.5.1.9)
·FMN腺苷酰基转移酶(EC 2.7.7.2)和/或核黄素激酶(EC 2.7.1.26)
·RibT蛋白，核黄素生物合成乙酰基转移酶(GNAT)家族
·核黄素ECF转运蛋白的底物特异性组分RibU
使用基于生物信息学的菌株基因组比对，在罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339中检测到了与几种其它非过量产生核黄素的罗伊氏粘液乳杆菌分离株诸如罗伊氏粘液乳杆菌AMBV336和罗伊氏粘液乳杆菌AMBV337以及模式菌株罗伊氏粘液乳杆菌DSM20016相比的天然存在的基因改变。发现基因改变具体位于负责核黄素合成的基因簇上游的调控区，所述基因簇包含如图1所示的二氨基羟基磷酸核糖基氨基嘧啶脱氨酶(EC 3.5.4.26)/5-氨基-6-(5-磷酸核糖基氨基)尿嘧啶还原酶(EC 1.1.1.193)、真细菌/真核生物的核黄素合酶(EC2.5.1.9)、3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶(EC 4.1.99.12)/GTP环化水解酶II(EC3.5.4.25)和/或6,7-二甲基-8-核糖醇基2,4-二氧四氢喋啶合酶(EC 2.5.1.78)的序列。在罗伊氏粘液乳杆菌菌株DSM20016(该种的模式菌株；https://lpsn.dsmz.de/species/ limosilactobacillus-reuteri)的基因组组装体NC_009513.1(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_009513)中，该基因改变的位置在碱基931,824处(罗伊氏粘液乳杆菌DSM20016中的鸟嘌呤至罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339中的胸腺嘧啶)。
罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在实验室培养基中以高浓度产生核黄素
在MRS和相应的无细胞培养上清液中过夜生长的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339全培养物中观察到核黄素的高水平荧光特征(大约在440nm处激发，大约在520nm处发射)(图2A)。细胞沉淀中的荧光低得多，表明核黄素主要被分泌。与罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339相比，在从同一参与者分离的其它阴道罗伊氏粘液乳杆菌菌株AMBV336、AMBV337、AMBV368、AMBV369和AMBV371的选择以及商业益生菌菌株罗伊氏粘液乳杆菌RC-14和鼠李糖乳杆菌GG的全培养物、无细胞培养物上清液和细胞沉淀中检测到的荧光是可忽略的，表明低水平核黄素产生或无核黄素产生。
罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339上清液中核黄素产量的初始定量是根据基于MRS中纯核黄素的系列稀释物的标准曲线进行的。实施了两种互补的方法：基于荧光的溶液中核黄素的检测(其中在大约440nm处激发以及在520nm处发射)，以及使用444nm处的吸光度进行的溶液中核黄素的定量分析。使用这两种方法，罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339上清液中的核黄素被定量为大约40μg/ml，而其它阴道罗伊氏粘液乳杆菌AMBV336和AMBV368以及商业益生菌罗伊氏粘液乳杆菌RC-14和鼠李糖乳杆菌GG的培养物上清液中的核黄素水平接近于零(图2B及图2C)。
使用用于维生素检测的标准HPLC-UV对这些结果进行了验证，所述标准HPLC-UV将MRS中过夜罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339培养物的上清液中的核黄素定量为约18.7μg/ml。在鼠李糖乳杆菌GG的培养物上清液中未检测到核黄素，而其它测试的罗伊氏粘液乳杆菌在其过夜培养物上清液中具有以下核黄素浓度：罗伊氏粘液乳杆菌AMBV3360.933μg/ml、罗伊氏粘液乳杆菌AMBV337 0.604μg/ml、罗伊氏粘液乳杆菌AMBV368 0.953μg/ml、罗伊氏粘液乳杆菌AMBV369 0.706μg/ml、罗伊氏粘液乳杆菌AMBV370 0.953μg/ml、罗伊氏粘液乳杆菌AMBV371 0.585μg/ml和罗伊氏粘液乳杆菌RC-14 0.423μg/ml。
罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在各种乳制食品基质中生长并产生核黄素
在许多商购可得的食品基质：椰子汁、豆浆、全脂和半脱脂牛奶、酪乳、苹果汁或作为对照的MRS肉汤中评估罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339的生长(图3A)和作为核黄素产量的读出的荧光(图3B)，并将其与罗伊氏粘液乳杆菌AMBV336和罗伊氏粘液乳杆菌RC-14进行比较。
所有罗伊氏粘液乳杆菌菌株在椰子汁、豆浆、全脂和半脱脂牛奶、酪乳和MRS中生长良好，并且它们在苹果汁中的生长可以忽略不计(图3A)。罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在椰子汁(6,07E+10CFU/ml)、豆浆(5,00E+10CFU/ml)和全脂牛奶(4,20E+10CFU/ml)中达到最高的菌落形成单位(CFU)/ml，其次是酪乳(1,50E+08CFU/ml)、MRS(6,70E+08CFU/ml)和半脱脂牛奶(1,07E+07CFU/ml)。因此，罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在食品基质中的生长类似于商业益生菌菌株罗伊氏粘液乳杆菌RC-14的生长，尤其是在椰子汁、豆浆和全脂牛奶中的生长。
在所有食品基质(椰子汁、豆浆、全脂和半脱脂牛奶、酪乳)中的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339培养物中检测到反映核黄素产量的高水平荧光，但苹果汁除外，这可能是由于在苹果汁中缺乏生长。在相同的食品基质中，罗伊氏粘液乳杆菌AMBV336和罗伊氏粘液乳杆菌RC-14的荧光显著较低，表明低水平的核黄素产生或无核黄素产生。
在椰子汁中检测到罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339相对于基线的最高核黄素产量(图3B)。相应的荧光值与MRS中的荧光值相似，因此罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在椰子汁中的核黄素产量预计在18-40μg/ml的范围内。在酪乳中的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339培养物中检测到最高的绝对荧光。
此外，当罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在椰子汁中与广泛使用的乳品发酵剂嗜热链球菌共培养时，其保留了其指示核黄素产量的高荧光值(图3C)。因此，不仅可以使用罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339本身，而且可以与其它发酵剂组合用于在发酵食品中生产核黄素。
还将重悬浮于0.9％ NaCl溶液中的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339细胞或椰子汁中的罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339培养物接种到模拟的人胃肠道中。罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在整个模拟的人类胃肠道中存活(图4A)。具体来说，其在pH值为2、3和4的胃液条件下存活了90分钟，如图4A所示，产生106–1011CFU/ml。这表明罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339可在胃的三种不同酸性条件下存活长达90分钟。同样在小肠和大肠中，当在模拟的胃肠道中72小时后在椰子汁中递送时，平均105CFU/ml罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339存活，当在0.9％ NaCl溶液中递送时，平均105CFU/ml存活(图4B)。
由于将罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339加入到模拟的胃肠道中，因而观察到粪便微生物群系组成的一致调节，这反映在与粪便本身相比，加入罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339的粪便的微生物群系的差异增加(图4C)。罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339的这种微生物群系调节作用可对可从添加过量产生核黄素的菌株诸如罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339中获益的种具有潜在的有益特性。
总之，在实验室条件和食品基质中证实了健康人分离株罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339高产核黄素。罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339的基因组序列经显示含有核黄素合成途径的所有基因(所述基因在调控基因序列中具有突变)，表明其过量产生核黄素的天然能力。针对核黄素标准曲线的基于荧光、吸光度和HPLC-UV的测量将罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339培养物和无细胞上清液中的天然核黄素产量定量为大约18-40μg/ml，而所有其它测试的罗伊氏粘液乳杆菌菌株和鼠李糖乳杆菌GG的培养物中的核黄素水平接近于零。因此，罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339的核黄素产生水平显著高于文献中报道的其它乳杆菌的天然产生水平(2.3-3μg/ml)。此外，罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在一系列食品基质(椰子汁、豆浆、全脂和半脱脂牛奶、酪乳)中生长良好，其水平与商业益生菌罗伊氏粘液乳杆菌RC-14相当。在所有这些食品基质中，检测到罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339的显著核黄素产生，其中在椰子汁中估计的相对于基线的最高核黄素产量在18-40μg/ml的范围内，并且在酪乳中达到最高的核黄素绝对水平。最后，罗伊氏粘液乳杆菌AMBV339在模拟的人类胃肠道条件下存活，并提供粪便微生物群系调节。
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<223> DSM20016 - 基因间调控区
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PCT/RO/134表

Claims (18)

1.一种罗伊氏粘液乳杆菌(L.reuteri)的种的分离的细菌菌株，与罗伊氏粘液乳杆菌模式菌株DSM20016的一个或多个基因或其上游调控序列相比，所述菌株在所述基因或其上游调控序列中具有改变；其中所述一个或多个基因编码选自包含以下列表的遗传产物：
-二氨基羟基磷酸核糖基氨基嘧啶脱氨酶(EC 3.5.4.26)和/或5-氨基-6-(5-磷酸核糖基氨基)尿嘧啶还原酶(EC 1.1.1.193)，
-核黄素合酶真细菌/真核生物(EC 2.5.1.9)，
-3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶(EC 4.1.99.12)和/或GTP环化水解酶II(EC3.5.4.25)，
-6,7-二甲基-8-核糖醇基2,4-二氧四氢喋啶合酶(EC2.5.1.78)，
-核黄素ECF转运蛋白的RibU，
-FMN腺苷酰基转移酶(EC 2.7.7.2)和/或核黄素激酶(EC2.7.1.26)，
-RibT核黄素生物合成乙酰基转移酶(GNAT)家族。
2.如权利要求1中定义的分离的细菌菌株；其中所述一个或多个基因选自包括以下的列表：
-二氨基羟基磷酸核糖基氨基嘧啶脱氨酶(EC 3.5.4.26)和/或5-氨基-6-(5-磷酸核糖基氨基)尿嘧啶还原酶(EC 1.1.1.193)，
-核黄素合酶真细菌/真核生物(EC 2.5.1.9)，
-3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶(EC 4.1.99.12)和/或GTP环化水解酶II(EC3.5.4.25)，
-6,7-二甲基-8-核糖醇基2,4-二氧四氢喋啶合酶(EC2.5.1.78)，
-核黄素ECF转运蛋白的RibU。
3.如权利要求1或2的任一项中定义的分离的细菌菌株，其中所述菌株在所述模式菌株的基因组组装体NC_009513.1中的碱基931,824处包含改变，特别是所述改变是鸟嘌呤到胸腺嘧啶的改变。
4.如权利要求1-3的任一项中定义的分离的细菌菌株；其中所述菌株保藏在BCCM，保藏号为LMG P-32020。
5.一种组合物，其包含根据权利要求1-4的任一项所述的分离的细菌菌株。
6.如权利要求1-4的任一项所述的分离的细菌菌株或权利要求5所述的组合物，其用作人医学或兽医学中的药物。
7.如权利要求1-4的任一项所述的分离的细菌菌株或权利要求5所述的组合物，其用于治疗和/或预防受试者的与核黄素水平降低相关的疾病。
8.如权利要求7中定义的供使用的分离的细菌菌株或组合物，其中与核黄素水平降低相关的疾病选自包括以下各项的疾病：神经系统疾病、皮肤病、呼吸道疾病、与红细胞水平降低相关的疾病、眼病、与铁代谢紊乱相关的疾病、与氧化应激相关的疾病、泌尿生殖系统疾病或感染、胃肠疾病、全身性疲劳或虚弱、代谢性疾病(例如与维生素水平降低相关的疾病)、免疫疾病、头痛或偏头痛、妊娠、癌症以及相关的病毒、细菌和真菌感染。
9.如权利要求1-4的任一项所述的分离的细菌菌株或如权利要求5所述的组合物，其用于预防和治疗肠道微生物群系生态失调、促进肠道微生物群系复原力和/或促进特定健康相关的肠道分类群。
10.如权利要求1-4的任一项述的分离的细菌菌株或如权利要求5所述的组合物用于预防和/或减轻全身性疲劳或虚弱的非治疗性用途。
11.如权利要求1-4的任一项所述的分离的细菌菌株或如权利要求5所述的组合物在化妆品或个人护理产品中的非治疗性用途。
12.如权利要求1-4的任一项所述的分离的细菌菌株或如权利要求5所述的组合物在用于生产核黄素的方法中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中用于生产核黄素的所述方法是发酵方法。
14.如权利要求1-4的任一项所述的分离的细菌菌株或根据权利要求5所述的组合物作为益生菌、后生元、益生元或合生元的用途。
15.如权利要求1-4的任一项所述的分离的细菌菌株或根据权利要求5的组合物在食品或饲料工业中的用途。
16.如权利要求15中定义的分离的细菌菌株或组合物在食品或饲料工业中作为着色剂或发酵剂的用途。
17.一种用于生产核黄素的方法，其中将权利要求1-4的任一项的细菌菌株或权利要求5的组合物在允许产生核黄素的条件下于水性培养基中孵育。
18.如权利要求17所述的方法，其包括以下步骤：
a)提供根据权利要求1-4的任一项的细菌菌株或根据权利要求5的组合物；
b)在允许核黄素从其产生的条件下，在水性培养基中孵育所述细菌菌株或所述组合物，以及任选地
c)从所述培养基中分离和纯化核黄素。
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