JP2023533182A - 食品着色料（ｆｏｏｄ ｃｏｌｏｒｓ）としてのアトロロシン（ａｔｒｏｒｏｓｉｎ） - Google Patents

食品着色料（ｆｏｏｄ ｃｏｌｏｒｓ）としてのアトロロシン（ａｔｒｏｒｏｓｉｎ） Download PDF

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Abstract

本発明は、新規に同定されたアトロロシン顔料、この顔料、レーキ、及び染料を含む組成物を生成するスケーラブルな方法、並びに乳製品、代替肉、又はキャンディなどの食品を着色するためのその使用を提供する。

Description

発明の分野：
本発明は、乳製品、代替肉、又はキャンディ(candy)などの食品を着色するための、タラロマイセス・アトロロセウス(Talaromyces atroroseus)由来の新規に同定された顔料、アトロロシンを使用することに関する。
本発明は、さらに、改良されたアトロロシン食品着色組成物を調製するための方法、及びこうした組成物の使用に関する。
背景：
食品中の着色剤は、合成又は天然起源のものであり、また、着色料が所与の基質にどのように統合されるか／統合されるかどうかに応じて、染料又は顔料であり得る。染料は、基質に溶解し、懸濁によって着色するのに対して、顔料は、基質に不溶であり、分散によって着色する。一般に、食品産業では、染料は水溶性であり、顔料は、水に不溶性である。
食品着色剤は、天然、ネイチャーアイデンティカル(nature identical)、又は合成に分類することができる。天然着色剤は、生きている生物によって生合成された、自然界に見られる顔料又は染料である。これは、主として植物抽出物であるが、昆虫からの抽出物である可能性もある１。ネイチャーアイデンティカル着色剤は、βカロテンなどの、自然界に見られるものと同一の化学構造を有する、化学的に 合成された又は半合成された顔料である着色料である。合成着色料は、完全に化学的に合成された着色料、典型的には、アゾカップリングを含有する及び石油をベースにする有機化合物である２。
過去１０年間に、消費者向けの化学が関心の焦点となってきている。これには、食品及び非食品製品中の芳香、フレーバー、及び着色剤が含まれる。食品では、大抵の会社は、既に合成着色剤から天然着色剤に切り替えている２、３。なぜなら、天然着色剤は、より健康的で、安全で、信頼できるとされるからである。食品、化粧品、及びホームケアなどの産業部門における、高性能の天然着色剤への、市場からの強力な引きが存在する。赤色は、食品の中で最も広い適用範囲を有する着色剤であり、市場シェアの最大５５％を占める。産業的に使用される天然の赤色着色剤は、主として、天然源、例えばベタニン（ビートルート、テンサイ(Beta vulgaris)、抽出物）、リコペン（トマト(Solanum lycopersicum)抽出物）、又はカルミン酸（昆虫コチニールカイガラムシ(Dactylopius coccus)の雌から抽出される））から直接抽出される。これらは、ｐＨ及び温度安定性並びに溶解度に関する性能における様々な限界、又はコーシャ、ハラール、若しくはベジタリアン／ビーガン食にとって不適切となる昆虫由来のカルミン酸などの起源の問題を有する。特定の原料への依存は、費用構造の問題を引き起こす可能性がある。これには、収穫物（例えば、サボテン上の昆虫）の量／質の季節変動及び変化によって引き起こされる変動しやすい価格設定、並びに価格を上げる抽出方法（トマトからのリコペン）に起因する高い価格設定が含まれる４。
ベタニン及びカルミンは、使用される２つの最も豊富な赤色の天然の食品着色剤である。ベタニンは、ビートルートから抽出される。ベタニンと関連する２つの欠点が存在する：ａ）非常に良くない温度安定性及びｂ）特徴的な異味。温度安定性は、多くの製造プロセスにとって重要であり、４０℃超での安定性の欠如は、ベタニンにとって重要な問題である５、６。食品製造会社は、着色剤の過飽和によって、安定性の欠如を回避しようと試みている７。しかし、これは、望ましくない異味を増大させる。ベタニンの温度安定性の欠如によって、その代替肉への適用が不適切となる。なぜなら、製造プロセスにおける又は後の最終消費者による加熱処理が含まれるからである。
カルミン酸は、昆虫コチニールカイガラムシ(Dactylopius coccus)から抽出される８。カルミン酸は、優れた温度安定性を有し、９０℃で２０分間加熱された後でさえ高い色濃度を保持する。カルミン酸の１つの欠点は、そのｐＨ感受性である。これは、カルミン酸が、基質のｐＨに応じてその色を変化させることを意味する。カルミン酸は、ｐＨ４未満で橙／黄色、ｐＨ４～６で赤色、ｐＨ６超で紫／赤色である。カルミン酸は、カルミン酸をアルミニウムに結合させて水に不溶にすることによって、レーキ顔料にすることができる。しかし、カルミンレーキは、ｐＨ６超のアルカリ溶液でのみ安定である。しかし、カルミン酸／カルミンでの最も大きい問題は、その抽出源（昆虫）である。これは、カルミンの変動しやすい価格の理由であり、また、コーシャ、ハラール、若しくはベジタリアン／ビーガン食に適している食品からカルミンが取り除かれる。これは、さらに、カルミンを、植物由来食品の食品部分に使用することができないことを意味する９。
したがって、この産業における、熱及びｐＨ安定性であり、鮮やかな濃い色を提供する、改良された安全な着色剤の必要性が存在する。この必要性は、植物由来代替肉において特に強い。
タラロマイセス・アトロロセウス(Talaromyces atroroseus)は、アトロロシンと呼ばれる新規のクラスの顔料を生合成する。アトロロシンは、「モナスカス(Monascus)」様の顔料であり、カルボン酸基Ｃ－１を有する、橙色のモナスカス(Monascus)顔料ＰＰ－Ｏと類似のアザフィロン(azaphilone)骨格を有するが、イソクロメン系へのアミノ酸の組み込みが独特である。アトロロシンは、赤色顔料であり、その産生は、マイコトキシンを含まない。これによって、アトロロシンは、モナスカス(Monascus)顔料（これは、腎毒性、肝毒性、及び細胞毒性作用を含めた様々な毒性作用をもたらすシトリニンを含有することが公知であり、それにより西側諸国では産業目的での使用が排除されている）と明確に区別される。国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号特許によれば、アトロロシンは、ギ酸と水酸化アンモニウムで調整された酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で抽出し、さらにＣ１８カラムを使用するセミ分取ＨＰＬＣで分離することができる。この方法は、比較的簡単であるが、分取ＨＰＬＣが、食品着色剤の工業製品価格と比較してかなり費用がかかる単位操作であるので、処理量と費用の両方に関してスケーラビリティの問題がある可能性が高い。食品添加物については、組成物の純度及び一貫性が、重要な要件である。純度の具体的な程度を決定することが必要である。これは、組成物の純度プロファイルを得ることによって行うことができる。このプロファイルでは、活性成分と不純物の比が決定される。国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号特許に記載された通りの発酵及び抽出方法における不純物には、典型的には、タンパク質、ペプチド、及び有機酸を含めた、宿主生物のいくらかの副産物が含まれることとなる。不純物は、増殖培地からの炭水化物残留物であり得、また、活性成分の異性体であり得る。食品製造者にとって、安全性を確実にするために、不純物を含まずに又は非常に低い割合の不純物を含み、高純度を得ることが望ましい。
産業的観点から、アトロロシンは、食品用途のためのベタニン及びカルミン酸／カルミンレーキ（これらが産業的要件を満たすことができない場合）に代わるものとしての役割を果たす可能性がある。
しかし、低コストで、大量に、高度に純粋なアトロロシン組成物を提供するための方法の必要性が存在する。本発明は、純粋な組成物を産生するこうした方法及び該組成物を使用する方法を提供する。
発明の概要：
本発明の目的は、安全であり、ｐＨ及び熱に対する高い安定性を有し、強い赤色色調で食品を着色することが可能である、食品を着色するための着色剤としてアトロロシンを含む、改良された組成物を提供することである。
本発明は、少量のトランス－アトロロシンしか伴わない且つ有機抽出溶媒及び分取ＨＰＬＣの使用を必要としない、高純度のアトロロシンレーキ又はアトロロシン染料を含有するアトロロシン食品着色組成物を製造するためのスケーラブルな方法を提供することによって、この問題を解決する。この組成物は、少しの痕跡量の有機抽出溶媒もＨＰＬＣ調製からの他の化学物質も含まない。
本発明は、発酵ブロスからアトロロシン食品着色組成物を調製するための方法であって、次のステップ：
ａ．膜濾過によってバイオマス及び他の巨大サイズの構成物を除去することと
ｂ．１ｋＤａ～２０ｋＤａ、例えば１ｋＤａ～１００ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜を通した限外濾過によって、タンパク質、ペプチド、及び他の構成物を除去することと
ｃ．ステップｂの透過液のアトロロシンの酸沈殿と
ｄ．（１μｍ未満の孔径を有する膜を用いる）膜濾過によって、ステップｃの沈殿を濾過することと
を含む方法を提供する。
大規模合成目的で、及び食品中での組成物の使用を可能にするための高度に純粋な組成物を提供する目的で、アトロロシンのための新規の精製方法が開発される必要があった。驚いたことに、こうした純粋なアトロロシン組成物を、巨大サイズの構成物、タンパク質、及びペプチドを除去するための最初の膜濾過及び限外濾過ステップ、並びに主としてアトロロシンからなる高度に純粋な沈殿を提供するためのその後の酸沈殿によって製造することができることが、本発明者らによって発見された。
本発明は、さらに、アトロロシン塩と緩衝液の塩とを含む水溶性のアトロロシン粉末を製造するための方法を提供する。こうした粉末は、染料及びレーキを製造するのに有用である。上記のステップｄ．の沈殿をベースにする、水溶性のアトロロシン粉末を製造するための方法は：
ｅ．ｐＨを沈殿のアトロロシンのｐＫａ超に増大させてその水溶性を高めるために、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液）を添加することと
ｆ．アトロロシンの塩組成物と緩衝液の塩とを含むアトロロシン粉末を製造するために水を除去するための乾燥ステップと
を含む。
本発明の方法によって提供されるアトロロシン粉末、沈殿、又は組成物は、以前から知られている方法によって提供されるアトロロシンとは、２つ以上の重要なパラメータが異なる。本発明の方法によって提供されるアトロロシン粉末、沈殿、又は組成物は、有意な量のトランス－アトロロシンを含まず、また、タンパク質、ペプチド、及び有機酸、又は増殖培地からの炭水化物残留物を含まない。したがって、本発明は、本発明の方法によって製造される新規の組成物を提供する。
本発明は、食品、非食品製品、及び化粧品のいずれか一つのための、着色因子としての及び／又は保存剤目的でのアトロロシンを含む、本発明の組成物の使用をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、食品、非食品製品、及び化粧品などの、アトロロシン顔料を含む製品を提供する。いくつかの実施形態では、キットは、製品を着色するための及び／又は保存するためのものであり、ここでは、キットは、本発明による少なくとも１種のアトロロシン顔料を含み、顔料は、容器中に供給され、製品は、食品、非食品、及び化粧品から選択される。いくつかの実施形態では、食品は、乳製品、又は油脂と混合される食品、又は低ｐＨを有するもの、又は食品が加熱されることとなる、若しくは食べる前に加熱するように作られる場合である。いくつかの実施形態では、食品は、代替肉又は飲料である。
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法によって製造される組成物によって製造されるレーキ又は染料を提供する。これらすべての実施形態及び使用では、本発明のアトロロシンレーキ又は染料は、組成物が、長時間の高温、低ｐＨ、光線曝露下で使用されることとなるか、長時間保管されることとなるかにかかわらず、好都合な安定性特性を有する。
図：
本発明の方法のステップｆ．において生成された、実施例２に記載された通りの粉末。 国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号のＨＰＬＣ方法によって調製されたアトロロシンと比較した場合の、本発明のアトロロシン（「新規発明」と表示されている）の改良された純度プロファイル。ＢＰＣが、試料のすべての構成成分を検出する基準ピーククロマトグラムであるのに対して、ＵＶ／ＶＩＳ（５２０ｎｍ）は、５２０ｎｍでの発光を有する構成成分のみを検出する。この実験におけるアトロロシン－Ｅは、ここではメタノールとアセトニトリルの溶液中であるので、ピークは４９０ｎｍから５２０ｎｍにシフトしている。分取ＨＰＬＣでは、明らかに酢酸エチル抽出物からの他の構成物が結合するのに対して、濾過ステップと酸沈殿を伴う本発明では、ＨＰＬＣに結合するほとんどの不純物が除去される。トランス－異性体のレベルは、分取ＨＰＬＣ方法によって作製される組成物では、酸性条件と比較して、かなり高い。 ＤＰＰＨ分析によって測定されるアトロロシンＥの抗酸化活性。 ステップｆのアトロロシン粉末のｐＨ安定性試験。ステップ０は、アトロロシン無しであり、ステップ１～３は、アトロロシンを含む。ステップ１はｐＨ１．５であり、ステップ２はｐＨ１０であり、ステップ３はｐＨ５である。
発明の詳細な説明：
本発明は、高度に純粋なアトロロシン組成物を生成するための方法を提供する。本発明の方法は、低コストでアトロロシンを含む組成物を製造するためのスケーラブルな方法である。本発明は、さらに、この方法によって製造されるアトロロシンを含む組成物、並びにその組成物、その組成物を含む製品及びキットの使用を提供する。好ましい実施形態では、製品は、食品、非食品、及び化粧品である。
現在の他の市販されている着色組成物は、市場需要に関する欠点を有する。なぜなら、これらは、ビーガンでもなく、４０°超で熱安定性でもなく、低ｐＨで安定でもなく、非効率的な生成方法が、継続的に低コストで高体積を提供できないことを意味するからである。本発明の方法によって提供されるアトロロシン組成物は、これらのすべての基準を満たす。
いくつかの実施形態では、本発明によって提供される組成物の使用は、酸性又は加熱条件、又はその両条件下となる。いくつかの実施形態では、この組成物は、食品製品、例えばすなわち乳製品又は代替肉中の着色剤としての使用のためのものである。多くの乳製品は、酸性であり、外観を改善するために食品中で使用される着色剤が、低ｐＨでも安定であることが、消費者にとって重要である。さらに、使用前に、多くの食品が加熱される。こうした食品には、代替肉が含まれる。したがって、こうした食品の発色を改善するために使用されるあらゆる着色剤が、加熱された場合にも安定であることも重要である。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって提供される組成物は、食品、非食品、及び化粧品中の着色因子としての使用のためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、レーキ又は染料として配合される。本発明の組成物は、高度に純粋である、すなわち、これは、ＨＰＬＣによって精製されたアトロロシンと対照的に、低レベルのトランス－アトロロシンしか含まない。さらに、本発明の組成物は、有意な量の、タンパク質、ペプチド、及び有機酸、又は増殖培地からの炭水化物残留物を含まない。
本発明の発明者らは、本発明のアトロロシン組成物が抗酸化剤であることを発見し、したがって、本発明は、抗酸化剤としての本発明の組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、抗酸化剤の使用は、食品又は化粧品のための保存剤としてのものである。いくつかの実施形態では、使用は、抗酸化剤が有益である場合の、化粧品使用のための医薬品としての、アンチエイジング組成物としての、癌、心疾患を予防するための、又は放射線損傷を改善するための、又は疾患又は状態を予防するための、本発明に記載のアトロロシンの使用である。
用語：
着色剤：染料又は顔料である、着色を与える物質（分子）。
染料：染料は、それに混合される液体／媒体に溶解する、着色を与える物質（分子）である。一般に、染料は、水溶性である。
顔料：顔料は、それと混合される液体／媒体に溶解しない、着色を与える物質（分子）である。一般に、顔料は、水に不溶性である。
アトロロシン：化学式ＣＱ３ＨＱ４０６ＮＲ（式中、ＮＲは、アミノ酸などの、第一級アミンを含有する化合物であり、炭素２と３との間の二重結合の立体配置は、シスである）を有する着色剤である。
いくつかの実施形態では、アトロロシンは、式Ｉの構造：
を有し、式中、Ｎ－Ｒは、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び第一級アミンからなる群から選択され、炭素２と３との間の二重の５つの結合の立体配置は、ｃ／ｓである。
いくつかの実施形態では、アトロロシン顔料は、式Ｉのものであり、式中、Ｎ－Ｒは、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び第一級アミンから選択され、５つの炭素２と３との間の二重結合の立体配置は、ｃ／ｓであり、ここでは、前記アミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌシステイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、及びＬ－オルニチンからなる群のうちの一つから選択される。
一実施形態によれば、本発明は、上で定義した通りの式Ｉの構造を有する、アトロロシン顔料、又はアトロロシンを含む組成物若しくはキットを提供し、ここでは、本発明の方法は、この組成物を製造するプロセスの一部である。
国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号は、アトロロシン顔料を製造及び精製するための方法を示している。しかし、国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号の方法によって提供される組成物は、製造するのに費用がかかり、十分にスケーラブルではない。さらに、国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号の方法は、大量のトランス－アトロロシンを含めた、望ましくない夾雑化合物を含む組成物を生成する。したがって、以前から知られている方法と比較して改善された純度を有するアトロロシンを含む組成物を製造することが可能である、改良されたスケーラブルな方法が必要とされる。本発明の方法は、国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号の方法ほど、精製のための使用における費用がかからず、改善された純度のアトロロシン食品着色組成物を調製するためのスケーラブルな方法を提供する。この方法は、５リットルの培養回分からの、並びに５０リットルの回分からの、アトロロシンの精製について試験されており、すべてのパラメータに関して良好な結果を得ている。実施例１及び２に記載される結果は、それぞれ、この方法が、増大させたサイズの回分からのアトロロシンの精製のために良好に機能することを示す。本発明の方法は、食品成分として使用するのに適した組成物を製造するためにその除去が必要とされる、発酵ステップに起因する望ましくない巨大サイズの構成物、タンパク質、及びペプチドを除去するための手段を提供する。さらに、国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号のＨＰＬＣ精製方法とは異なり、本発明の方法は、トランス－アトロロシンの形成をほとんど引き起こさない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、重量で２０％未満のトランス－アトロロシン、例えば重量で１０％未満のトランス－アトロロシン、例えば重量で５％未満のトランス－アトロロシンを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、アトロロシンは、アトロロシンＥ、例えば、重量で２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満がトランス－アトロロシンＥであるアトロロシンＥである。本発明の方法は、さらに、重量で１０％未満がタンパク質又はペプチドである、例えば５％未満、例えば４％未満又は３％未満又は２％未満又は１％未満がタンパク質又はペプチドである組成物を提供する。
この方法は、発酵ブロスから高度に純粋なアトロロシン食品着色組成物を調製するためのステップであって：
ａ．膜濾過によってバイオマス及び他の巨大サイズの構成物を除去することと
ｂ．１ｋＤａ～２０ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜を通した限外濾過によって、タンパク質、ペプチド、及び他の構成物を除去することと
ｃ．ステップｂの透過液のアトロロシンの酸沈殿と
ｄ．（１μｍ未満の孔径を有する膜を用いる）膜濾過によって、ステップｃの沈殿を濾過することと
ｅ．ｐＨを沈殿のアトロロシンのｐＫａ超に増大させてその水溶性を高めるために、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液）を添加することと
ｆ．アトロロシンの塩組成物と緩衝液の塩とを含むアトロロシン粉末を製造するために水を除去するための乾燥ステップと
を含むステップを含む。
国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号に記載されている方法に従って産生することができる、タラロマイセス・アトロロセウス(Talaromyces atroroseus)の培養から得られる発酵ブロスから開始して、ブロスのバイオマス及び他の巨大サイズの構成物を、１～４０μｍの孔径を有する従来の膜濾過を使用する濾過ステップによって除去する。次いで、得られた透過液を、１ｋＤａ～２０ｋＤａ、例えば１ｋＤａ～１００ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜を通して濾過して、タンパク質、ペプチド、及び他の構成物を除去する。次いで、得られた透過液中のアトロロシンを、強酸を用いて、透過液のｐＨを、アトロロシンのｐＫａよりも低く低下させることによって、酸沈殿させることができる。いくつかの実施形態では、アトロロシンは、アトロロシン－Ｅであり、ｐＨは、ｐＨ１，７未満、例えば１，７～０，５に低下される。強酸は、溶液中で実質的に１００％電離している酸を意味する。いくつかの実施形態では、沈殿ステップに有用な酸は、約３未満、例えば約２，５未満、例えば約２，３未満のｐＫａを有する。沈殿ステップに有用な酸には、限定はされないが、塩酸、硝酸、リン酸、及び硫酸が含まれる。次いで、次の沈殿を、もう１つの膜濾過ステップによって収集する。この沈殿は、１～５μｍのサイズを有するので、この粒径未満の膜フィルターが、収集ステップに有用である。収集された沈殿は、低ｐＨを有し、水に溶解可能ではないが、これは、ｐＨをｐｋａよりも高く上昇させることによって溶解させることができる。食品については、クエン酸緩衝液が十分に認められており、ｐＨ６の低緩衝液が、すべてのアトロロシン沈殿を溶解することとなる。多数の緩衝液が、食品及び化粧品に使用するのに適している。こうした緩衝液には、限定はされないが、リン酸緩衝液：（５０％ １Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４ ＆ ５０％ １Ｍ ＫＨ２ＰＯＨ４）、リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ（８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０，２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１，４４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０，２４ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４）及び酒石酸～緩衝液が含まれる。さらなる適切な緩衝液は、過度の負担を伴わずに当業者によって容易に特定することができ、これは本発明の範囲によって包含される。次いで、溶解されたアトロロシンを含む得られた液体と、緩衝液を、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥、蒸発などによって水を除去することによって粉末にすることができる。得られる粉末は、アトロロシンと、例えばクエン酸ナトリウムとで構成されるアトロロシン塩である。本発明のもう１つの利点は、塩の純度プロファイルが、酢酸エチル抽出及び分取ＨＰＬＣ後よりもかなり優れていることである。公知のＨＰＬＣ調製方法と比較すると、本発明の方法は、かなり少ない望ましくない不純物を有するアトロロシン組成物を提供し、トランス－異性体のレベルは、本発明ではかなり低い。ＨＰＬＣで精製されたアトロロシンを含む組成物のトランス－アトロロシン含有量を、本発明を用いて精製されたアトロロシンを含む組成物と比較するデータを、実施例３に示す。
本発明の方法を使用して、有機抽出 溶媒及び分取ＨＰＬＣを使用せずに、食品成分製造施設に既に実行されている安価な単位操作だけで、得られるアトロロシン粉末が製造される。この方法は、国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号特許の抽出方法よりも、速く、大きい労働力を必要とせず、安い。
いくつかの実施形態では、ステップａ．の濾過は、１μｍ～４０μｍの孔径を有するフィルターを使用して行われる。いくつかの実施形態では、フィルターの孔径は、１～２０μｍであり、いくつかの実施形態では、孔径は、２０～４０μｍである。
いくつかの好ましい実施形態では、ステップｃ．における酸沈殿は、透過液のｐＨを、アトロロシンのｐＫａよりも低く低下させることによって行われる。したがって、本発明は、発酵プロセスからの、及びアトロロシンを単離するためのその後の沈殿ステップにおける、巨大構成物を除去するための手段を提供する。本発明者らは、本発明の方法を使用して、精製が以前から知られているＨＰＬＣ精製方法によるものであったならば最終組成物中に存在していたであろう、トランス－アトロロシンの形成を伴わずに且つ有機溶媒の使用を伴わずに、アトロロシンの精製を行うことができることを発見した。実施例３は、本発明の方法によって製造された組成物のトランス－アトロロシン含有量に関して、ＨＰＬＣで精製されたアトロロシン組成物と比較した場合の純度の増大を示すデータを示す。
ステップｃ．のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｂ．からの透過液のｐＨを、アトロロシンのｐＫａ未満であるように低下させることによって、アトロロシンを沈殿させ、これは、透過液への、塩酸、硝酸、リン酸、又は硫酸などの強酸の添加によって行われる。
ステップｃ．のいくつかの実施形態では、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）、過塩素酸（ＨＣｌＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）、塩素酸（ＨＣｌＯ３）、硫酸（１）（Ｈ２ＳＯ４）、硝酸（ＨＮＯ３）、ヒドロニウムイオン（Ｈ３Ｏ＋）、ヨウ素酸（ＨＩＯ３）、シュウ酸（１）（Ｈ２Ｃ２Ｏ４）、亜硫酸（１）（Ｈ２ＳＯ３）、硫酸（２）（ＨＳＯ４－）、亜塩素酸（ＨＣｌＯ２）、及びリン酸（１）（Ｈ３ＰＯ４）のリストから選択される酸の添加によって、ステップｂ．からの透過液のｐＨを、アトロロシンのｐＫａ未満であるように低下させることによって、アトロロシンを沈殿させる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、酸沈殿を単離するための濾過ステップ、それに続く、沈殿の水溶性を増大させるために緩衝液を用いてｐＨを上昇させるためのステップを含む。一実施形態では、ステップｅ．の緩衝液は、クエン酸緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、食品及び化粧品製品に使用するのに適した緩衝液である。いくつかの実施形態では、ステップｅ．の可溶化されたアトロロシンを乾燥させて、アトロロシン粉末が製造される。いくつかの実施形態では、乾燥は、凍結乾燥、噴霧乾燥、又は蒸発によるものである。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、次のステップ：
ａ．フィルターサイズ１～４０μｍを有するフィルターを使用する膜濾過によってバイオマス及び他の巨大サイズの構成物を除去することと
ｂ．１ｋＤａ～２０ｋＤａ、例えば１ｋＤａ～１００ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜を通した限外濾過によって、タンパク質、ペプチド、及び他の構成物を除去することと
ｃ．塩酸、硝酸、リン酸、又は硫酸のいずれかから選択される酸などの強酸を使用することによって、ｐＨを、アトロロシンのｐＫａ未満であるように低下させることによる、ステップｂの透過液のアトロロシンの酸沈殿と
ｄ．（１μｍ未満の孔径を有する膜を用いる）膜濾過によって、ステップｃの沈殿を濾過することと
ｅ．ｐＨを沈殿のアトロロシンのｐＫａ超に、例えば１０未満のｐＨ、例えば５～１０のｐＨ、例えば５～８のｐＨ、例えば約ｐＨ７に増大させてその水溶性を高めるために、緩衝液（緩衝液は、この実施形態では、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液：（５０％ １Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４ ＆ ５０％ １Ｍ ＫＨ２ＰＯＨ４）、リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ（８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０，２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１，４４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０，２４ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４）、及び酒石酸緩衝液、又は当業者によって容易に選択される別の適切な緩衝液のいずれか１つから選択することができる）を添加することと
ｆ．アトロロシンの塩組成物と緩衝液の塩とを含むアトロロシン粉末を製造するために水を除去するための、凍結乾燥、噴霧乾燥の使用による又は蒸発による乾燥ステップと
を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、ステップａ～ｄに従う方法によって入手可能なアトロロシン塩を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法に従う方法によって、すなわちステップａ～ｆによって入手可能な粉末を提供する。いくつかの好ましい実施形態では、アトロロシンは、Ｎ－ＲがＬ－グルタミン酸であるアトロロシン－Ｅである。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の塩又は粉末は、アトロロシン－Ｅであるアトロロシンを含む。いくつかの実施形態では、本発明のアトロロシンは、Ｎ－Ｒが、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、及びＬ－オルニチンからなる群の１つから選択されるアミノ酸である、アトロロシンである。
食品添加物、及び化粧品のための成分は、一貫性があり再現性のある高純度を有する必要があり、したがって、その生成のための方法は、製造される製品の品質の再現性に関して信頼できるものでなければならない。さらに、こうした化合物を生成するための方法は、魅力的な価格設定での必要とされるあらゆる量の生成を可能にするために、スケーラブルでなければならない。食品添加物としての又は化粧品中での使用に対する、化合物又は組成物の適合性の評価には、エンドユーザーに対する潜在的な有害作用のリスクの評価が含まれる。遺伝毒性、経口バイオアベイラビリティ、並びに温度及びｐＨ安定性の特性決定も、この評価に含まれる。着色剤などの食品及び化粧品添加剤は、遺伝毒性無しであり、低い経口バイオアベイラビリティを有し、様々な温度及びｐＨで安定でなければならない。こうしたデータを信頼できるようにするために、化合物又は組成物は、すべての回分を通して一貫性がある必要がある。本発明の方法は、非常に高純度のアトロロシンの一貫性がある生成を可能にする。いくつかの実施形態では、本発明に記載の組成物は、少なくとも８０重量％のシス－アトロロシンと、２０％未満のトランス－アトロロシンで構成される。好ましい実施形態では、アトロロシンは、少なくとも８０％がシス－アトロロシン－Ｅであるアトロロシン－Ｅである。いくつかの実施形態では、少なくとも８０重量％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％又は９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９重量％が、シス－アトロロシン－Ｅなどのシス－アトロロシンである。いくつかの実施形態では、重量で１５％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満、例えば４％、３％、２％未満、又は１％未満が、トランス－アトロロシン－Ｅなどのトランス－アトロロシンである。いくつかの実施形態では、タンパク質又はペプチドなどの不純物は、本発明の方法によって除去され、その結果、組成物は、１０重量％未満、例えば５％未満、例えば４％未満又は３％未満又は２％未満又は１％未満のタンパク質又はペプチドを含む。
アトロロシン塩は、炭水化物、タンパク質、又はオリゴ糖と共に、例えば、非限定的な例では、マルトデキストリン、スクロース、ショ糖、セルロース、シクロデキストリン、ペクチン、デンプン、キチン、ラクトース、若しくはマルトースと共に、又は、非限定的な例ではダイズタンパク質若しくは乳清タンパク質などのタンパク質と共に、染料に容易に配合することができる。実施例７は、アトロロシンをマルトデキストリンと混合することによる、染料へのアトロロシン塩の配合を示す。実施例７は、アトロロシン染料のマルトデキストリンとの配合を説明している。これと同様に、他の炭水化物、タンパク質、又はオリゴ糖を使用して、アトロロシン染料を製造することができる。顔料レーキは、アトロロシン塩から、アトロロシン塩を、アルミニウム又は他の金属、例えばカルシウム、バリウム、亜鉛、ナトリウム、又は銅に結合させることによって製造することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、レーキを生成するための、本発明による塩、粉末、又は組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、アトロロシン塩、粉末、又は組成物は、金属に結合させることによってレーキを生成するために使用される。いくつかの実施形態では、レーキを生成することは、アトロロシン塩、粉末、又は組成物を、アルミニウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、ナトリウム、又は銅のいずれかに結合させることによるものである。実施例８は、アルミニウムを用いるレーキ形成を示す。他の金属を用いるレーキ形成は、実施例８に説明したのと同様の方式であり得る。いくつかの実施形態では、レーキは、アトロロシン－Ｅを含む。
いくつかの実施形態では、レーキは、アトロロシンと媒染剤（金属）とを、１：１～１：２０（ここでは１がアトロロシンであり２０が媒染剤である）の範囲内の重量対重量関係で混合することによって製造される。好ましい実施形態では、アトロロシン：媒染剤の関係は、１：３～１：６ｗ／ｗの範囲内である。実施例８で生成されたレーキは、１：６のアトロロシン：媒染剤の関係を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、アトロロシンを含む塩、粉末、又は組成物を含む染料を提供する。いくつかの実施形態では、染料は、糖又は他の炭水化物とのアトロロシン配合物である。いくつかの実施形態では、先の実施形態の炭水化物は、マルトデキストリン、スクロース、ショ糖、セルロース、シクロデキストリン、ペクチン、デンプン、キチン、ラクトース、又はマルトースのいずれかであるか、又は染料は、非限定的な例ではダイズタンパク質又は乳清タンパク質などのタンパク質と共に配合される。いくつかの実施形態では、染料の炭水化物は、マルトデキストリン、シクロデキストリン、又はペクチンのいずれかである。いくつかの実施形態では、染料は、アトロロシン－Ｅを含む。
本発明のアトロロシンは、低ｐＨ及び高温で高度に安定である。実施例９は、様々なｐＨでのアトロロシンの安定性を実証する。実施例１０は、高温での安定性を実証する。これらの実施例におけるデータから、アトロロシンが、カルミン酸と比較した場合の優れたｐＨ安定性、及びベタインと比較した場合の６０～８０℃の範囲での優れた温度安定性を示すことが明らかである。
本発明は、さらに、食品、非食品製品、及び化粧品を着色するための染料及びレーキ組成物を製造するための、高度に純粋な、熱及びｐＨ安定性のアトロロシン組成物、沈殿、又は粉末の使用を提供する。ｐＨ及び温度安定性は、アトロロシン染料及びレーキの企図される産業使用にとって重要である。ｐＨ及び温度安定性に関する実施例において提供されるデータは、水性緩衝液中のものであり、したがって、食品中での企図される使用に適していた。
抗酸化特性は、着色組成物にとって有益である。抗酸化剤は、酸化プロセスを防止又は阻害し、心臓病及び癌に関連する健康上の利益と、特に脂肪又は油と混合された場合の食品の貯蔵寿命を延長させる保存効果の両方を有すると考えられる。本発明のアトロロシン組成物の抗酸化活性を実証するために、ＤＰＰＨ阻害を使用した。実施例１１は、アトロロシンの抗酸化効果を示すデータを示す。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、食品、非食品製品、及び化粧品のいずれか一つのための、着色因子としての及び／又は抗酸化剤としての、及び／又は保存剤目的での、塩、粉末、染料、又はレーキなどの本発明によるアトロロシン顔料の使用を提供する。いくつかの実施形態では、化粧品は、口紅である。口紅の使用者は、唇に適用された口紅のいくらかを経口摂取しており、口紅を着色するために使用される染料又はレーキが、経口的に与えられた場合に非常に低いバイオアベイラビリティしか有しないことが好都合である理由である。抗酸化剤は、しばしば、アンチエイジング目的の、また、保存のための、口紅及び他の化粧品の構成成分である。したがって、アトロロシンが、経口的に投与された場合に非常に低いバイオアベイラビリティを有するという本発明者らの発見（実施例１１参照）は、アトロロシンを口紅などの化粧品に使用するのに特に適したものにする大きな利点である。アトロロシンが遺伝毒性ではないという発見（実施例１２）も、食品及び口紅などの化粧品中でのその使用をさらに支持する重要な発見である。いくつかの実施形態では、本発明のアトロロシン又はアトロロシン組成物は、アンチエイジング化粧品製品などのアンチエイジング組成物に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明のアトロロシン組成物は、心疾患又は癌の予防のための、又は放射線損傷の改善又は治療のための、健康製品に使用するためのものである。
さらなる実施形態では、本発明は、非限定的な例では口紅又は化粧品使用のためのアンチエイジング組成物などの、食品、非食品製品、及び化粧品から選択される、本発明によるアトロロシン顔料を含む製品を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、製品を着色するための及び／又は保存するための、及び／又は口紅又はアンチエイジング組成物などの化粧品を製造するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本発明による少なくとも１種のアトロロシン顔料を含み、ここでは、顔料は、使用のための説明書をさらに含む容器中に供給され、製品は、食品、非食品、及び化粧品から選択される。
乳製品は、しばしば、ジャム又は果実などの成分を含み、魅力的な色を有する製品を提供するために、いくらかの追加の着色料を添加することが、時として好都合であり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、製品が食品であり食品が乳製品である、本発明のアトロロシン顔料の使用、アトロロシン顔料を含む製品、又は本発明によるキットを提供する。本発明のアトロロシンのｐＨ安定性は、乳製品に使用するために、乳製品が低ｐＨを有する場合であっても、十分に適合される。
いくつかの実施形態では、本発明による使用、製品、又はキットは、製品が、乳製品などの食品である場合である。いくつかの実施形態では、本発明による使用、製品、又はキットは、製品が、油脂と混合された食品である場合である。
多くの乳製品又は他の食品製品は、酸性であり、本発明のアトロロシンの優れたｐＨ安定性特性に起因して、こうした製品中での本発明の組成物の使用が、好ましい使用の一つである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明による使用、製品、及びキットは、７未満のｐＨ、例えば６未満のｐＨ、例えばｐＨ５未満、例えば４未満、例えば３未満を有する食品である食品製品のためのものである。
本発明のアトロロシンはまた、優れた熱安定性を有し、組成物の着色成分は、非毒性である。提示される発明は、アトロロシンが、遺伝毒性でもないし、ラットに対するいかなる有害作用も有しないことを記載している（実施例１２の結果を参照のこと）。アトロロシン－Ｅは、非常に低いバイオアベイラビリティ（０．３％）を有し、中程度の血漿クリアランス（１６±２ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ）を有し、わずか１．３±０．６時間の半減期を有し、したがって、加熱される食品又は他の製品に使用するために十分に適合される。いくつかの実施形態では、本発明は、製品が、アトロロシン顔料の添加後に加熱するための食品である、本発明による使用、製品、及びキットを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明によるアトロロシンは、少なくとも５０℃、例えば少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は少なくとも２００℃に加熱される食品に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、その使用は、代替肉、例えば、非限定的な例ではバーガーパティを着色するためのものである。いくつかの実施形態では、その使用は、飲料である製品を着色するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明は、食品、非食品、又は化粧品である、本発明のアトロロシンによって着色された製品を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のアトロロシン組成物、粉末、又は塩、レーキ又は染料を含む、代替肉又は飲料などの食品を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、製品が酸性であり、且つ加熱するためのものである、本発明によるアトロロシンの使用、本発明によるキット又は製品を提供する。
いくつかの実施形態では、アトロロシン組成物は、他の顔料、抗酸化剤、又は保存剤と共に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明は、他の顔料、抗酸化剤、又は保存剤と組み合わせてアトロロシンを含む、食品、非食品、又は化粧品などの製品を提供する。
レーキ化の説明：
顔料レーキは、有機染料が金属塩に固定されて不溶性となった顔料である。金属塩は、典型的には無色であるので、有機成分の色が、沈殿レーキの色を決定することとなる。食品については、最も一般的に使用される金属塩は、アルミナ水和物（水酸化アルミニウム）である。有色レーキ顔料は、有機染料と比較して、様々な技術的特性を有することとなり、それらの多くは、それに結合される金属塩に起因する。レーキは、不溶性となること以外に、改良されたｐＨ安定性、温度安定性、又は酸化安定性も有することができる。ＦＤ＆Ｃレーキ（ＵＳ ＦＤＡによって承認されたレーキ）は、油分散性であるが、油溶性でないことで、染料相当物が可能ではないであろう、これらを油脂と混合させることに有用となる。レーキは、レーキ化プロセにおける染料及び染料の量に応じて、固有の濃度であり得る。
いくつかの実施形態では、レーキは、アトロロシンと媒染剤（金属塩）とを、１：１～１：２０（ここでは１がアトロロシンであり２０が媒染剤である）の範囲内の重量対重量関係で混合することによって製造される。好ましい実施形態では、アトロロシン：媒染剤の関係は、１：３～１：６ｗ／ｗの範囲内である。実施例８で生成されたレーキは、１：６のアトロロシン：媒染剤の関係を有する。
カプセル化の説明：
マイクロカプセル化は、固体及び液体が、ナノメートルからミリメートルのサイズの密閉カプセルに梱包される、定義された技術である。カプセル化基質は、酸化、温度に対する安定性などのある種の技術的性能を改善する、又は顔料の水中での分散性を改善することができる。梱包される材料は、活性材料と呼ばれるのに対し、梱包する材料は、シェルと呼ばれる。マイクロカプセル化は、活性材料とシェルの外側環境との間に物理的な障壁を作り出し、それによって、周囲条件に対する安定性を潜在的に増大させる。マイクロカプセル化させるための多くの技術が存在するが、主な技術は、噴霧乾燥、凍結乾燥、コアセルベーション、及びエマルションである。最も使用されるシェル材料は、アラビアゴムのようなゴム、マルトデキストリンのような低分子量炭水化物、ショ糖、デキストリン、セルロース、ゼラチン、脂質、及びダイズタンパク質のようなタンパク質である。
代替肉及び人工肉の説明：
代替肉は、特定の種類の肉の美学（食感、フレーバー、外観など）に近づけた食品である。これは、典型的には、ダイズベース（豆腐、テンペ）、グルテンベース、又はエンドウマメベースのものなどの、ベジタリアン又はビーガン成分から作られたタンパク質ベースを有する。したがって、ベジタリアン及びビーガン添加物のみを使用することが、ますますとなっている。持続可能な食事に対する増大しつつある関心の焦点及び需要により、代替肉はエマージング・マーケットとなりつつある。多くの代替肉製造者にとっての課題は、調理前と調理後の両方の、本物の肉とできる限り近い代替の肉の外見及び味を作ることである。ベタニン及びアントシアニンは、現在、複合混合物で使用されているが、その色は、調理前には、よりピンクがかっており、調理後にはほとんど失われる。
人工肉又は培養肉は、動物細胞のインビトロ細胞培養物である。これの成長及び増殖は、研究室内で、バイオリアクター内で起こり、その後、肉を回収する。ヘムタンパク質は、細胞の増殖にとっても重要であるが、通常の肉により似せるための色変化を誘発するためにも使用される。
期待される純度要件：
本発明に記載されるプロセスに基づくと、組成物は、９０％シスアトロロシン－Ｅとなり、３％未満のトランスアトロロシン－Ｅを含む。組成物は、発酵培地からの残存する５％未満の炭水化物、例えばスクロース、グルコース、及びフルクトースを有することとなる。組成物は、同定されていない不純物を有することとなり、５重量％未満を有することとなる。組成物は、タラロマイセス・アトロロセウス(Talaromyces atroroseus)タンパク質を実質的に含まず、これは、これらがＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって検出可能ではないことを意味する。
食品のリスト：
非限定的な例では、本発明のアトロロシン組成物は、肉（ソーセージなど）、代替肉（上に記載した通りのエンドウマメベースのものなど）及び菓子（典型的には、砂糖による又は高い砂糖含有量の食品）（例えば、ケーキ、ペストリー、クッキー、さらにはキャンディ、ガム、チョコレート、及び砂糖漬けナッツ(candied nuts)）、並びに乳製品、例えば、非限定的な例ではヨーグルト、アイスクリームなどの着色のために使用することができる。
実施例
実施例１：スモールスケールでのアトロロシン塩の生成
およそ１２のＡＵ４９０のアトロロシン－Ｅ顔料を含有する５Ｌの発酵ブロス（国際公開第２０１８２０６５９０号の方法に従って生成）を、ミラクロス(miracloth)を通して濾過して、バイオマス及び他の巨大サイズの構成物を除去し、およそ１０のＡＵ４９０のアトロロシン－Ｅ顔料を含有する４Ｌの透過液をもたらした。この４Ｌの透過液を、１０ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜を通してさらに濾過して、タンパク質及びペプチドの大部分を除去した。３．５Ｌの透過液は、およそ７のＡＵ４９０のアトロロシン－Ｅ顔料を含有していた。
透過液のｐＨを、６０ｍＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して１，３４のｐＨに低下させた。この透過液を、撹拌しながら５℃で２４時間保管した。この時間中に、アトロロシン－Ｅ顔料は沈殿した。２４時間後、この混合物を、０，８μｍセルロース膜を通して濾過した。残余分を収集し、２Ｌの２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）に溶解した。この得られた混合物は、およそ１３のＡＵ４９０のアトロロシン－Ｅ顔料を含有していた。この混合物を、凍結乾燥の前に凍結した。９．５ｇの得られた粉末を収集し、測定して２０のＥ１％を得た。
実施例の文脈では、Ｅ１％は以下である：
Ｅ１％は着色力の比較である
特定の吸光度での１％（１０ｇ／Ｌ）の生成物の吸収（ここでは、これは、典型的には、極大吸収波長（ｎｍ）である）。極大吸収波長は、着色剤がどの媒体に溶解されているかに依存し得る。
純粋な着色剤については、Ｅ１％吸収は、次式：
Ｅ１％ ｃｍ＝１０＊ε／Ｍ
におけるモル吸光率に関する。
実施例２：パイロットスケールでのアトロロシン塩の生成
およそ２５のＡＵ４９０のアトロロシン－Ｅ顔料を含有する５０Ｌの発酵ブロスを、ミラクロスを通して濾過して、バイオマス及び他の巨大サイズの構成物を除去し、およそ２３のＡＵ４９０のアトロロシン－Ｅ顔料を含有する３５Ｌの透過液をもたらした。この３５Ｌの透過液を、１０ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜を通して濾過して、タンパク質及びペプチドの大部分を除去した。３０Ｌの透過液は、およそ１７のＡＵ４９０のアトロロシン－Ｅ顔料を含有していた。
透過液のｐＨを、７００ｍＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して０，９５のｐＨに低下させた。次いで、この透過液を、５℃で２４時間保管した。２４時間後、この混合物を、０，８μｍセルロース膜を通して濾過した。次いで、濾過からの残余分を収集し、４Ｌの１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）に溶解した。この得られた混合物は、およそ７２のＡＵ４９０のアトロロシン－Ｅ顔料を含有していた。この混合物を、凍結乾燥の前に凍結した。２５ｇの得られた粉末を収集し、測定して８８のＥ１％を得た。
図１は、本発明の方法のステップｆにおいて生成された、実施例１に記載された通りの粉末を示す。
実施例３：アトロロシン塩の純度
純度は、着色組成物の重要な必要性である。
実施例２からの得られた粉末の純度を、ダイオードアレイ検出器を装備したAgilent Infinity 1290 UHPLCシステム(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)上で実施される、超高速液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析(UHPLC-HRMS)を使用して評価した。分離は、どちらも２０ｍＭ ＦＡで緩衝された水とアセトニトリルから構成される線形グラジエント（１０％ Ｂで開始し、１５分で１００％に増大させ、ここでこれを２分間保持し、０．１分で１０％に戻し、３分間維持する）（０．３５ｍＬ／ｍｉｎ、６０℃）．を用いる、Agilent Poroshell 120フェニル－ヘキシルカラム（２．１×２５０ｍｍ、２．７μｍ）で達成された。１μＬの注入体積を使用した。
ＭＳ検出は、Agilent Dual Jet Streamエレクトロスプレーイオン源を装備したAgilent 6545 QTOF MS上でポジティブ検出モードで、温度２５０℃の温度の乾燥ガス、８Ｌ／ｍｉｎのガス流、３００℃のシースガス温度、及び１２Ｌ／ｍｉｎの流速を用いて実施した。キャピラリー電圧は４０００Ｖに、ノズル電圧は５００Ｖに設定した。質量スペクトルは、１０スペクトル／ｓの取得率で、ＭＳモードではｍ／ｚ ８５～１７００についての、ＭＳ／ＭＳモードではｍ／ｚ ３０～１７００についての質量中心データとして、１０、２０、及び４０ｅＶで記録した。ロックマス溶液（７０：３０のメタノール：水中）を、１：１００スプリッターを使用する、１５μＬ／ｍｉｎの流速の、外部ＬＣポンプを使用する、第２の噴霧器に注入した。この溶液は、ロックマスとしての、１μＭトリブチルアミン(Sigma-Aldrich)及び１０μＭヘキサキス（２，２，３，３－テトラフルオロプロポキシ）ホスファゼン(Apollo Scientific Ltd., Cheshire, UK)を含有していた。両方の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋イオン（それぞれｍ／ｚ １８６．２２１６及び９２２．００９８）を使用した。
図２は、国際公開第２０１８／２０６５９０ Ａ１号の方法によって調製されたアトロロシンと比較した場合の、この新規発明のアトロロシンの改良された純度プロファイルを示す。特に、トランス－アトロロシンの量の大きな低下が注目される。ＢＰＣが、試料のすべての構成成分を検出する基準ピーククロマトグラムであるのに対して、ＵＶ／ＶＩＳ（５２０ｎｍ）は、５２０ｎｍでの発光を有する構成成分のみを検出する。アトロロシン－Ｅは、ここではメタノールとアセトニトリルの溶液中であるので、ピークは４９０ｎｍから５２０ｎｍにシフトしている。分取ＨＰＬＣでは、明らかに酢酸エチル抽出物からの他の構成物が結合するのに対して、濾過ステップと酸沈殿を伴う本発明では、ＨＰＬＣに結合するほとんどの不純物が除去される。トランス－異性体のレベルはまた、酸性条件としての分取ＨＰＬＣ方法では、メタノールへの溶解が異性化（これは水溶液中では起こらない）を好むので、かなり高い。
実施例４
非着色組成物の定量化
実施例２からの１０ｍｇの粉末を、セミ分取ＨＰＬＣに注入し、ＵＶ ５２０ｎｍシグナルに基づいて分画することができる。これは、アトロロシン－Ｅが主な構成物である、赤色の着色を与える成分の主要分画と、残りの構成物を含む第２の分画とを与えることとなる。次いで、これらの２つの分画を、ロータリーエバポレーターを使用して乾燥させることができ、次いで、乾燥物質の総量と比較して全赤色着色料を秤量することによって、着色構成物のパーセンテージを算出することができる。
実施例５
タンパク質の定量化
アトロロシン－Ｅが、タラロマイセス・アトロロセウス(Talaromyces atroroseus)由来のタンパク質を実質的に含まないことを決定するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を使用することができる。通常のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、下は３，０００Ｄａのサイズまでのタンパク質及びペプチドを検出することができる。
泳動用溶媒は、ＨＣｌで調整したトリス緩衝液ｐＨ８（２０ｇトリス／１０００ｍｌ脱塩水）である。
１．５ｇ／Ｌの濃度の、試験されることとなるアトロロシン－Ｅの試料。１ＭのＤＴＴを、試料及びマーカーに添加した。１０μＬの試料及びマーカーが、プレキャストNUPAGE Novex高性能ゲル４～１２％ ＢＩＳ－ＴＲＩＳに添加され、クーマシーブルー又は銀染色によって染色される。
実施例６
炭水化物の定量化
スクロース、グルコース、フルクトースなどの残存する炭水化物は、ＨＰＬＣによって検出及び定量化することができる。実施例２からの１．０ｇ／Ｌの粉末の試料を、Aminex HPX-87H陽イオン交換カラム(BioRad, Hercules, Ca, USA)を備えたＨＰＬＣシステムに流動させることができる。化合物を、５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４を含む３０℃の均一濃度の溶離液を使用して分離する。標準の定量化を、屈折率によって、グルコース及びピルビン酸（波長２１０ｎｍで検出）及びスクロース、フルクトース、コハク酸、グリセロール、酢酸、及びエタノールを用いて、６レベルの検量線を使用して実施する。
キャリブレーションに基づいて、炭水化物及び低分子の酸を、アトロロシン－Ｅ試料中で定量化することができる。
実施例７：アトロロシンとマルトデキストリンとの配合
実施例２からの１グラムの得られた粉末を、２０ｍｌの水に溶解し、５分間撹拌した。３グラムのマルトデキストリンを、混合物に、撹拌しながらゆっくりと添加した。マルトデキストリンが完全に溶解した後、この混合物を、凍結乾燥の前に凍結した。３．８グラムを回収し、これを測定して２１のＥ１％を得た。
実施例８：レーキとしてのアトロロシンとアルミニウムとの配合
実施例２からの１グラムの得られた粉末を、２００ｍｌの水に溶解し、５分間撹拌し、１００のＡＵ４９０を有していた。４７，４ｇのＡｌＫ（ＳＯ４）２ ＊１２Ｈ２Ｏを１００ｍｌの水に溶解することによって、１００ｍｌの硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２ ＊１２Ｈ２Ｏ）１Ｍを調製し、撹拌しながら８０℃に加熱した。１０，６ｇのＮａ２ＣＯ３を、１００ｍｌの水に溶解することによって、１００ｍｌの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）１Ｍを調製し、撹拌した。
２０ｍｌの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３の、２０ｍｌの１Ｍ ＡｌＫ（ＳＯ４）２ ＊１２Ｈ２Ｏ及び１，２ｍｌの５Ｍ ＮａＯＨへの添加によって、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）溶液を調製し、１０のｐＨの最終溶液を与えた。
アトロロシン１０：１を、水酸化アルミニウム溶液と混合することによって、アルミニウムレーキを調製した。５ｇ／Ｌの液体を含有する２００ｍｌのアトロロシンに、２０ｍｌの水酸化アルミニウムを添加し、ｐＨを、５Ｍ ＨＣｌ及び５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ４に調節した。このスラリーを、５０℃で１時間インキュベートし、その後、これを、室温で一晩冷却させた。これは、レーキにおける、重量で１：６のおよそのアトロロシンと水酸化アルミニウムの関係を与える。
一晩冷却した後、スラリーを、WhatmanフィルターGrade 50で濾過した。アトロロシンアルミニウムレーキを、５０℃で２時間乾燥させた。結合しなかったスラリーを収集し、これは９のＡＵ４９０を有し、９１％のアトロロシンがアルミニウムと結合したことを意味していた。乾燥後、アトロロシンレーキを、フィルターから削り取り、乳鉢と乳棒によって粉砕して微粉末にした。
実施例９：カルミン酸と比較したアトロロシンのｐＨ安定性
実施例２からの１００ｍｇの得られた粉末を、ｐＨ２．２～７．２の範囲のマッキルベイン(McIlvaine)緩衝液に２５０ｍｌに溶解した。緩衝液とアトロロシンを、５分間混合し、その後、この溶液を、分光光度計を使用する比色分析にかけた。４２５ｎｍ及び４９０ｎｍでの吸収極大を、ブランクとして緩衝液を用いて、０．４５ｃｍのセル長を有するマイクロタイタープレートで決定した。
異なるｐＨ値でのアトロロシン－Ｅの吸収スペクトルを、表１に示す。
表１のアトロロシン－ＥについてのｐＨデータとの比較において、カルミン酸の吸収スペクトルを、上述の通りに決定する。その吸収極大は、４９５ｎｍ、５２５ｎｍ、５６５ｎｍである。カルミン酸についてのｐＨ安定性データを、下の表２に示す：
表１及び２に示されたデータから、アトロロシン－Ｅが、カルミン酸と比較して、低ｐＨでの優れたｐＨ安定性を示すことが明らかである。
実施例１０：ベタニンと比較したアトロロシンの温度安定性
実施例２からの１００ｍｇの得られた粉末を、マッキルベイン(McIlvaine)緩衝液（ｐＨ５）に２５０ｍｌに溶解した。緩衝液とアトロロシンを、５分間混合し、その後、この溶液を、６０℃及び８０℃の インキュベーター中で加熱し、分光光度計を使用する比色分析にかけた。４２５ｎｍ及び４９０ｎｍでの吸収極大を、ブランクとして緩衝液を用いて、０．４５ｃｍのセル長を有するマイクロタイタープレートで決定した。
２４時間の期間にわたって６０℃で加熱した後の、アトロロシン－Ｅの吸収スペクトルを、表３に示す。
表３中のデータとの比較において、ベタニンの吸収スペクトルを、上述の通りに決定する。その吸収極大は、５３０ｎｍである。表４は、２４時間の期間にわたる６０℃での熱安定性を示す。
ベタニンが、２４時間の期間にわたって、６０℃でかなり分解するのに対して、アトロロシン－Ｅは、この温度での２４時間の期間内での熱による分解に対してかなり大きい耐性を示すことが明らかである。
３時間の期間にわたって８０℃で加熱した後の、アトロロシン－Ｅの吸収スペクトルを、表５に示す。
表５との比較において、ベタニンの吸収スペクトルを、上述の通りに決定する。その吸収極大は、５３０ｎｍである。表６は、３時間の期間にわたって８０℃で加熱した後の、ベタニンの吸収スペクトルを示す。
ベタニンが、３時間の期間にわたって、８０℃でかなり分解するのに対して、アトロロシン－Ｅは、この温度での３時間の期間内での熱による分解に対してかなり大きい耐性を示すことが明らかである。
実施例１１：アトロロシンの抗酸化効果
アトロロシン－Ｅの抗酸化活性を評価するために、一般的なＤＰＰＨ（２，２ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル）分析を使用した。ＤＰＰＨの作業溶液を、２２０μｇ／ｍｌ（エタノール中）の濃度で作製した。実施例２からの１ｇの得られた粉末を使用して、０μＭから４５μＭまでのアトロロシン－Ｅの希釈列を作製した。１００ｍｌの各試料を、１０００μＬのＤＰＰＨと、暗所で３０分間反応させ、その後、吸光度を測定した。反応物とのインキュベーションの前と後の、５１７ｎｍでのＤＰＰＨの吸光度を測定することによって、ＤＰＰＨの発光の阻害を算出することによって、抗酸化活性を決定した。アトロロシンは、５１７ｎｍでのバックグラウンド発光を有するので、インキュベーション前の試料は、アトロロシンの添加前ではなく、アトロロシンの添加の数秒後に測定した。アトロロシン－Ｅの抗酸化活性を、標準のトロロックス(Trolox)と比較した（図３）。
図３に示されたデータから、アトロロシン－Ｅが、対照の抗酸化剤トロロックス(Trolox)よりも、はるかに強力な抗酸化剤であることが明らかである。
実施例１２：アトロロシン－Ｅの遺伝毒性
実施例２からの得られた粉末を、ｍｉｎｉ－Ａｍｅｓ実験において遺伝毒性について評価するために、Ｃｙｐｒｏｔｏｘに送った。４３，２ｍｇのアトロロシンをＣｙｐｒｏｔｏｘに送った。ｍｉｎｉ－Ａｍｅｓ試験は、ＯＥＣＤのガイドラインの下で実施された。
表は、Ｃｈｒｍ－４＝アトロロシンについての及びＣｈｒｍ－６＝カルミンについてのデータを示す。
４．２ ＡＭＥＳ ＭＰＦ：個別データ
ベースライン値に対する有意な倍数の増大（≧２倍）は、下線で示す。有意なｔ検定確率（Ｐ＜０．０５）は太字で示され、（Ｐ＜０．０１）は下線で示される。
上で試験されたアトロロシンとの比較において、同様の４６，４ｍｇのカルミン酸も、遺伝毒性を評価するためにＣｙｐｒｏｔｏｘに送った。
ｍｉｎｉ－Ａｍｅｓ研究は、アトロロシン－Ｅとカルミン酸との両方がいかなる遺伝毒性作用も発揮しないことを示す。これは、食品着色剤にとって重要な要件である。
実施例１３：アトロロシンの薬物動態プロファイル
実施例２からの得られた粉末を、アトロロシンの薬物動態プロファイルを評価するために、Ｅｖｏｔｅｃに送った。アトロロシンのＩＶ注射のための３匹のラットと、ＰＯのための３匹のラットの、６匹のラットが使用された。これらのラットには、マウスゲージ(mouth gauge)を通して２ｍｇ／ｋｇが注射又は投与され、血液試料を一定間隔で採取した。
実施例１０との比較において、同様のカルミン酸も、薬物動態プロファイルを評価するためにＥｖｏｔｅｃに送った。
これらの結果は、アトロロシンが、経口摂取された場合に安全であり、０．３％のバイオアベイラビリティを有するのに対して、カルミン酸については、これを決定することができなかったことを示す。アトロロシンが、１６±２ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇという中程度の血漿クリアランスを有するのに対して、カルミン酸は、１．３±０．１ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇという低い血漿クリアランスを有していた。アトロロシンの半減期が、１．３±０．６ｈであるのに対して、カルミン酸については、３．５±０．２ｈであると推定された。
実施例１４：コラーゲンへの結合のためのアトロロシン染料の使用
コラーゲンは、ソーセージケーシングを作るために使用される典型的な材料である。製造の厳しい条件により、製造者がベタニンを使用することは可能にならず、製造者は、赤色＃３、合成着色剤、又はカルミンを使用する。しかし、カルミンの良くない消費者の評判に起因して、カルミンを、別の天然着色料溶液と置き換えることが産業的に妥当である。
アトロロシン染料を、製造プロセス中にコラーゲンケーシングが受ける厳しい条件の模倣物を生存するその能力について試験した。
１ｇのコラーゲンを、５０ｍＬの０．１Ｍ酢酸に溶解し、室温で２０分間撹拌した。
ステップ０：１０％コラーゲンミックスを、４５％グリセロール（９９％）及び４５％の脱塩水と混合することによって、ケーシング基質を調製した。このケーシング基質のｐＨを、５Ｍ ＨＣｌでｐＨ１．４に調整して、極限条件(conditions extreme)を作った。
ステップ１：１００ｍｌのケーシング基質に、実施例２からの１５ｍｇの得られた粉末を添加し、１０分間撹拌した。
ステップ２：１０分のインキュベーション時間後、基質のｐＨを、２Ｍ ＮａＯＨでｐＨ１０に調整した。
ステップ３：４５分のインキュベーション期間後、基質のｐＨは、ｐＨ１０で安定しているように見え、５Ｍ ＨＣｌでｐＨ５に下げた。
図４から分かる通り、ケーシング基質は、及び高及び低ｐＨ、並びにその後のｐＨの変化という厳しい条件での延長されたインキュベーションを通して、その色を保持していた。
実施例１５：ビーガンバーガーパティの着色のためのアトロロシン染料の使用
ビーガンバーガーパティについては、パティを満足のいく赤色色調に着色するために、ほんのわずかの選択肢しか利用可能ではない。カルミン酸／カルミンは、ビーガンではないので使用することができず、大多数は、高用量（１％）のビートルート由来のベタニン、又はアントシアニン（１％）を使用するが、これらの選択肢は、パティの油調理の前と後の両方で、満足のいく赤色色調を得るのに十分ではない。
この実施例では、ビーガンバーガーパティに添加することによって、本発明のアトロロシンの高い安定性の証拠が示され、また、着色は、油調理の前と後に測定される。結果を、下の表に示す。
明度（Ｌ＊）、赤及び緑（ａ＊）（マイナスは緑を示すのに対し、プラスは赤を示す）、黄及び青（ｂ＊）（マイナスは青を示すのに対し、プラスは黄を示す）を測定するためのＣＩＥＬ＊ａ＊ｂ＊表色系。
バーガーパティベース：
水：４３％
テクスチャード(textured)野菜タンパク質：２７％
ヤシ油：５％
ナタネ油：１３％
ジャガイモ粉：１０％
メチルセルロース：２％
アトロロシン染料は、８７，５ＰＰＭ及び１３０ＰＰＭの濃度で添加した。
ワックス。ベース成分が溶けた時、０．５グラムのアトロロシン－レーキをベースに添加した。
実施例１６：口紅に対するアトロロシンレーキの使用
口紅及び化粧品製品にとって、赤色は、最も使用される色である。化粧品産業では、赤色の多くの色調が、典型的には、たくさんの色を混合することによって作り出されており、ここではまた、新規のわくわくするような着色料を市場に出せるように、新規の天然着色剤の探索も進行中である。この実施例では、実施例８で作製されるアトロロシン－Ｅレーキを使用して、簡単な口紅を着色した。
５グラムのミツロウをゆっくりと加熱し、２グラムのヤシ油を、２．５グラムのカルナウバロウ(carnaboa wax)と共に添加した。ベース成分が溶けた時、０．５グラムのアトロロシン－レーキをベースに添加した。口紅ベースを、５分間撹拌し、室温で乾燥させるために適切な容器に注いだ。口紅を２時間乾燥させた後、使用できる状態であった。
参照基準として、アトロロシン染料を試験したが、ベースに容易には溶解せず、最終の口紅は、不均一な着色を有していた。
２種の製品を室温で４週間保管させることによる貯蔵寿命試験も、アトロロシン－レーキが、目に見える着色の減衰を伴わずにその色を維持できたのに対して、アトロロシン染料の口紅は、４週後にほぼ完全に退色したことを示した。この実験は、本発明のアトロロシンレーキの室温での安定性、及び化粧品に、すなわち口紅にこれらを使用する可能性を示す。
実施例１７：飲料の着色のためのアトロロシンレーキの使用
飲料、特にソフトドリンクは、赤色色調を有することが一般的である。ソフトドリンクの酸性環境により、多くの着色料が不適切となる。この実施例では、飲料を着色するためにアトロロシンを使用する。
明度（Ｌ＊）、赤及び緑（ａ＊）（マイナスは緑を示すのに対し、プラスは赤を示す）、黄及び青（ｂ＊）（マイナスは青を示すのに対し、プラスは黄を示す）を測定するためのＣＩＥＬ＊ａ＊ｂ＊表色系。
モデル飲料媒体濃縮物：
スクロース：４３％
ソルビン酸カリウム：０，０９％
安息香酸ナトリウム ０，０７％
クエン酸 ０，８６％
ＭｉｌｉＱ水：５５，９８％
濃縮物のｐＨは７．３である
ソフトドリンクは、６５ｍｌの飲料濃縮物を１８５ｍｌの炭酸水に添加することによって調製し、クエン酸でｐＨを３に低下させる。アトロロシン－Ｅを、赤色の異なる色を作るように添加した。
実施例１７：飲料の着色のためのアトロロシンレーキの使用
飲料、特にソフトドリンクは、赤色色調を有することが一般的である。ソフトドリンクの酸性環境により、多くの着色料が不適切となる。この実施例では、飲料を着色するためにアトロロシンを使用する。
明度（Ｌ＊）、赤及び緑（ａ＊）（マイナスは緑を示すのに対し、プラスは赤を示す）、黄及び青（ｂ＊）（マイナスは青を示すのに対し、プラスは黄を示す）を測定するためのＣＩＥＬ＊ａ＊ｂ＊表色系。
モデル飲料媒体濃縮物：
スクロース：４３％
ソルビン酸カリウム：０，０９％
安息香酸ナトリウム ０，０７％
クエン酸 ０，８６％
ＭｉｌｉＱ水：５５，９８％
濃縮物のｐＨは７．３である
ソフトドリンクは、６５ｍｌの飲料濃縮物を１８５ｍｌの炭酸水に添加することによって調製し、クエン酸でｐＨを３に低下させる。アトロロシン－Ｅを、赤色の異なる色を作るように添加した。
実施例１８：キャンディの着色のためのアトロロシンの使用。
キャンディ及び菓子は、典型的には、赤色に着色される。この実施例では、本発明者らは、ハード及びソフトキャンディの着色剤としてのアトロロシンを試験した。
明度（Ｌ＊）、赤及び緑（ａ＊）（マイナスは緑を示すのに対し、プラスは赤を示す）、黄及び青（ｂ＊）（マイナスは青を示すのに対し、プラスは黄を示す）を測定するためのＣＩＥＬ＊ａ＊ｂ＊表色系。
ハードキャンディは、基本レシピの成分を混合し、これをゆっくりと１２７℃に加熱することによって調製した。この温度で、所望される呈色効果のために、様々な濃度のアトロロシン－Ｅを添加した。この着色を与える糖混合物を、１４８℃まで加熱し続けた。次いで、このキャンディシロップを、型に注ぎ、室温で冷却した。
ソフトキャンディは、グルコースシロップ及び砂糖から糖混合物を作製し、これを１００℃に加熱することによって調製した。この温度で、所望される効果のために、様々な濃度のアトロロシン－Ｅを添加し、撹拌した。別のボウル内で、ゼラチンと冷水を組み合わせることによって、ゼラチン混合物を調製した。
糖混合物を、ゼラチン混合物と組み合わせて、ソフトキャンディを作製した。このソフトキャンディを型に注ぎ、固まるまで４℃で２４時間冷却した。
異なる色調を与えるために、アトロロシン－Ｅを、キャンディベースに、異なる濃度で添加した。
上の表中のデータから、本発明のアトロロシンが、ソフトキャンディとハードキャンディとの両方を調製するのに有用であること、すなわち、アトロロシンが、キャンディの製造中の厳しい加熱条件に耐えることができることが明らかである。
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Claims (32)

  1. 発酵ブロスからアトロロシン食品着色組成物を調製するための方法であって、次のステップ：
    ａ．膜濾過によってバイオマス及び他の巨大サイズの構成物を除去することと
    ｂ． １ｋＤａ～１００ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜を通した限外濾過によって、タンパク質、ペプチド、及び他の構成物を除去することと
    ｃ．ステップｂの透過液のアトロロシンの酸沈殿において、ｐＨが、アトロロシンのｐＫａ未満であるように低下されることと
    ｄ．（１μｍ未満の孔径を有する膜を用いる）膜濾過によって、ステップｃの沈殿を濾過することと
    ｅ．ｐＨを沈殿のアトロロシンのｐＫａ超に、例えば１０未満のｐＨ、例えばｐＨ５～８、例えば約ｐＨ７に増大させてその水溶性を高めるために、緩衝液（例えばクエン酸緩衝液）を添加することと
    ｆ．アトロロシンの塩組成物と緩衝液の塩とを含むアトロロシン粉末を製造するために水を除去するための乾燥ステップと
    を含む方法。
  2. 前記ステップａ．のフィルターが、１μｍ～４０μｍの孔径を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アトロロシンが、アトロロシン－Ｅであり、前記ステップｃ．の沈殿が、前記透過液のｐＨを、ｐＨ１，７よりも低く、例えばｐＨ０，５～１，７に低下させることによって行われる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ｐＨが、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）、過塩素酸（ＨＣｌＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）、塩素酸（ＨＣｌＯ３）、硫酸（１）（Ｈ２ＳＯ４）、硝酸（ＨＮＯ３）、ヒドロニウムイオン（Ｈ３Ｏ＋）、ヨウ素酸（ＨＩＯ３）、シュウ酸（１）（Ｈ２Ｃ２Ｏ４）、亜硫酸（１）（Ｈ２ＳＯ３）、硫酸（２）（ＨＳＯ４－）、亜塩素酸（ＨＣｌＯ２）、又はリン酸（１）（Ｈ３ＰＯ４）のリストから選択される酸のいずれかなどの強酸の添加によって、低下される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記酸が、塩酸、硝酸、リン酸、又は硫酸から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ステップｅ．の緩衝液が、クエン酸緩衝液である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記乾燥が、凍結乾燥、噴霧乾燥、蒸発によるものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 請求項１～５のステップａ～ｄに記載の方法によって入手可能なアトロロシン塩。
  9. 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法のステップｆ．から入手可能な粉末。
  10. 前記アトロロシンがアトロロシン－Ｅである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法、請求項８に記載の塩、又は請求項９に記載の粉末。
  11. 前記アトロロシンの少なくとも８０％がシスアトロロシンであり、２０％未満がトランスアトロロシンである、アトロロシンを含む組成物。
  12. 前記アトロロシンがアトロロシン－Ｅであり、２０重量％未満がトランスアトロロシン－Ｅである、請求項１１に記載の組成物。
  13. 重量で１５％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満、例えば４％、３％、２％未満、又は１％未満が、トランス－アトロロシン－Ｅなどのトランスアトロロシンである、請求項１１又は１２に記載の組成物。
  14. 重量で１０％未満、例えば５％未満、例えば４％未満又は３％未満又は２％未満又は１％未満が、タンパク質、ペプチド、又は炭水化物である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. レーキを生成するための、請求項８に記載の塩、請求項９及び１０に記載の粉末、又は請求項１１～１４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  16. 前記アトロロシンを金属に結合させることによって製造される、請求項１５に記載のレーキ。
  17. 前記アトロロシンが、アルミニウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、ナトリウム、又は銅のいずれかに結合される、請求項１６に記載のレーキ。
  18. 請求項８に記載の塩を含む染料、請求項９及び１０に記載の粉末、又は請求項１１～１４に記載の組成物。
  19. 前記アトロロシンが、糖又は他の炭水化物と共に配合される、請求項１８に記載の染料。
  20. 前記炭水化物が、マルトデキストリン、シクロデキストリン、又はペクチンのリストから選択される、請求項１９に記載の染料。
  21. 食品、非食品製品、及び化粧品のいずれか一つのための、着色因子としての及び／又は抗酸化剤としての及び／又は保存剤目的での、請求項８～２０のいずれか一項に記載のアトロロシン顔料の使用。
  22. 食品、非食品製品、及び化粧品から選択される、請求項８～２０のいずれか一項に記載のアトロロシン顔料を含む製品。
  23. 前記キットが、請求項８～２０のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアトロロシン顔料を含み、前記顔料が、容器中に供給され、前記製品が、食品、非食品、及び化粧品から選択される、製品を着色するための及び／又は保存するためのキット。
  24. アトロロシン以外の、顔料、抗酸化剤、又は保存剤をさらに含む、請求項２３に記載のキット。
  25. 前記食品が、乳製品である、請求項２１に記載の使用、請求項２２に記載の製品、及び請求項２３に記載のキット。
  26. 前記製品が、油脂と混合された食品である、請求項２１に記載の使用、請求項２２に記載の製品、及び請求項２３に記載のキット。
  27. 前記製品が、７未満のｐＨ、例えば６未満のｐＨ、例えばｐＨ５未満を有する食品である、請求項２１に記載の使用、請求項２２に記載の製品、及び請求項２３に記載のキット。
  28. 前記製品が、アトロロシン顔料の添加後に加熱されることとなる食品である、請求項２１に記載の使用、請求項２２に記載の製品、及び請求項２３に記載のキット。
  29. 前記食品が、少なくとも５０℃、例えば少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は少なくとも２００℃に加熱されることとなる、請求項２８に記載の使用。
  30. 前記食品製品が、バーガーパティなどの代替肉である、請求項２８又は２９に記載の使用。
  31. 前記製品が、飲料である、請求項２１に記載の使用、請求項２２に記載の製品、及び請求項２３に記載のキット。
  32. 前記製品が、請求項２７の通りの酸性であり、請求項２８又は２９に従って加熱されることとなる、請求項２１に記載の使用、請求項２２に記載の製品、及び請求項２３に記載のキット。
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