JP2023509005A - 二重特異性融合タンパク質及びその応用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、完全長ＩｇＧヒンジ領域に選択的なペプチドリンカーを介して第２の結合ドメインを挿入した、新規な構造を有する二重特異性融合タンパク質を提供する。該融合タンパク質は、ＩｇＧと同じ発現及び生産上の利点を有し、融合タンパク質のＦａｂ領域の結合活性に影響を与えないし、安定性がさらに向上するし、より高い半減期も得られた。また、第２の結合ドメインと標的結合部位との結合活性は、対応する可溶性天然結合フラグメントのモノマーと対応する標的との結合活性と比較して明らかに改善された。

Description

本発明は、新規な構造を有する二重特異性融合タンパク質及びその応用に関し、さらには、上記の融合タンパク質をコード又は作製するポリヌクレオチド、核酸構築物、宿主細胞に関する。
バイオテクノロジーの発展に伴い、抗体は、成熟した治療薬として、腫瘍及び免疫疾患の治療の分野で重要な役割を果たしている。現在、上場された抗体医薬品の大半は、単一の抗原に対するのもであり、１つの標的分子にしか作用できない。しかし、複雑な疾患は、多くの場合、本質的に多因子性であり、疾患メディエーターの過剰発現又は相互相乗作用、或いは様々な受容体のアップレギュレーション、並びにシグナル伝達ネットワークにおける分子相互作用に関与する。従って、複数のシグナル伝達経路の調節によって、治療性抗体の治療効果を向上させることが可能になる。二重標的戦略を用いた二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＢｓＡｂｓ）療法は、腫瘍及び免疫疾患の治療手段の１つとして有効である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｗｉｔｈ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｃ］／／ＭＡｂｓ．Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１２，４（２）：１８２－１９７．）。
二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又は抗原性エピトープに特異的に結合可能なものとして知られている（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２４８（１－２）：７－１５．）。早くも１９８０年代に、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらによって、グルカン及びダンシルに対する四価二重特異性抗体は、初めに、異なる特異性を持つ一本鎖抗体を柔軟なペプチドセグメントで結合した後に融合発現することにより実際的に作製された（Ｃｏｌｏｍａ Ｍ Ｊ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ Ｌ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５（２）：１５９．）。しかし、抗体作製における技術的なボトルネックとシグナル経路に関する基礎研究が不十分であったために、二重特異性抗体の発展が妨げられていた。疾患の病因への深い理解及び治療性のモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭｃＡｂ）に関連する技術の急速な発展につれて、抗体の構築、発現及び精製技術が大幅に改善され、その結果、二重特異性抗体の発展が制限要素を克服する技術と動力を具備するようになった。現在、二重特異性又は多重特異性抗体は、主に、（１）ブリッジング細胞（Ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｃｅｌｌｓ（ｉｎ ｔｒａｎｓ））；（２）受容体抑制又は受容体活性化（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎＨｉｂｉｔｉｏｎ（ｉｎ－ｃｉｓ） ｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ｉｎ－ｃｉｓ））；（３）補因子模倣（Ｃｏ－ｆａｃｔｏｒ ｍｉｍｅｔｉｃ）；（４）ピギーバックアプローチ（ＰＩｇＧｙｂａｃｋ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ）（Ａｒａｎ Ｆ．Ｌａｂｒｉｊｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｖｏｌｕｍｅ １８，ｐａｇｅｓ５８５－６０８（２０１９））といったメカニズムで働いている。
二重特異性抗体の開発では、分子構造形態の選択が非常に重要である。異なる二重特異性抗体の設計にはそれぞれ長所と短所があるが、臨床治療を目的とした二重特異性抗体の全ての設計では、第一に、２対（又はそれ以上）の異なる軽鎖と重鎖が確実にカップリング又はペアリングしたのを確保すること；第二に、各モノクローナル抗体のそれぞれの結合ドメインの独立性が維持される一方、異なるエピトープに結合する際に互いに立体障害の干渉が生じないこと；第三に、抗体分子が哺乳動物の細胞で発現されやすく、複雑なタンパク質修飾プロセスが要らないこと；第四に、高熱安定性や、高化学的安定性、高溶解性、重合しにくい、低粘性、高発現量、適切な半減期などの創薬可能性が良好であること（Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ，Ｚｈａｉ Ｑ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ Ｊ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１５，６７（２）：９５－１０６．）という課題を解決する必要がある。
二重特異性抗体は、分子構造形態（即ち、組成部分及び構築方式）の違いに基づいて多くのタイプに分けることができ、例えば、構造の左右対称性に基づいて対称構造と非対称構造に分けられ、Ｆｃ領域の有無に基づいてＦｃ領域を含む二重特異性抗体とＦｃ領域を含まない二重特異性抗体に分けることができ、また、抗原結合領域の数に基づいて二価、三価、四価又はそれ以上の価の構造に分けられる。現在、数十の二重特異性抗体が開発されており（Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ，Ｚｈａｉ Ｑ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ Ｊ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１５，６７（２）：９５－１０６．）、これらの数十の二重特異性抗体は、構造が多様で、ＩｇＧ様二重特異性抗体、追加の機能領域を含むＩｇＧ様二重特異性抗体、異なる抗原結合フラグメントを直列に結合する二重特異性抗体、融合タンパク質型二重特異性抗体、化学カップリング二重特異性抗体を包含する５つのカテゴリーに大別される。その中で、ＩｇＧ様二重特異性抗体は、主に組換えＤＮＡ技術による構造改造により構築される。構築されたＩｇＧ様二重特異性抗体は、完全な結晶化可能なフラグメント（即ち、Ｆｃフラグメント）を持ち、異なる抗原に結合するとともに、Ｆｃフラグメントが媒介するＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性効果、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）及びＣＤＣ（補体依存性細胞毒性効果、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などの機能も保持している。その一方、このタイプの抗体は、新生児Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦｃＲｎ）に結合することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の半減期を延長するという特徴も保持している（Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ Ｂ Ｂ，Ｐｒｅｓｔａ Ｌ Ｇ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．‘Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１９９６，９（７）：６１７－６２１．）。追加の機能領域を含むＩｇＧ様二重特異性抗体は、一般に、従来のＩｇＧ抗体に基づいて、タンパク質と融合することによって、他の特異的な抗原結合フラグメント（即ち、単ドメイン抗体、一本鎖抗体などの追加の機能領域）を重鎖及び／又は軽鎖に追加する（ＬａＦｌｅｕｒ Ｄ，Ａｂｒａｍｙａｎ Ｄ，Ｋａｎａｋａｒａｊ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｗｉｔｈ ｕｐ ｔｏ ｆｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ［Ｃ］／／ＭＡｂｓ．Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１３，５（２）：２０８－２１８．）ように構築される。異なる抗原結合フラグメントを直列に結合してなされる二重特異性抗体は、異なるＦａｂ、一本鎖抗体、単ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントなどをリンカーペプチドで一定の順に接続することにより得られる（Ｓｔｏｒｋ Ｒ，Ｍuｌｌｅｒ Ｄ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ Ｅ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｆｕｓｉｎｇ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｄｉａｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ａｎ ａｌｂｕｍｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２００７，２０（１１）：５６９－５７６．）。融合タンパク質型二重特異性抗体は、ポリペプチドフラグメントなどのリンカーを介して、異なる特異的な抗体／抗体断片（ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）を連結して形成される、２つ以上の抗原を同時に結合可能なタンパク質分子である。化学カップリング二重特異性抗体は、融合タンパク質型二重特異性抗体と同様であり、化学カップリング型二重特異性抗体では、２つの抗体／抗体断片を別々に作製する必要があり、その後、化学結合により両方をカップリングするかまたは両方をキャリアタンパク質と同時にカップリングすることにより得られる。
ところで、シグナル経路の基礎研究及び二重抗体の作用機構の発展に伴い、二重特異性抗体選択に利用可能な標的及び組み合わせもますます増えてきて、例としては、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＦＧＬ１、ＴＩＭ－３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５及びＴＧＦ－β受容体（ＴＧＦ－βＲ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ－ｔｒａｐ、ＦＧＬ１、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＳＩＲＰα；並びにＣｌａｕｄｉｎ １８．２、ＨＥＲ－２、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＢＣＭＡ、ＳＳＴＲ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＦＣＲＨ５、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、Ａ３３、ＣＥＡ、ＣＤ２８、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＦＧＦＲ、Ｃ－ｍｅｔ、ＲＡＮＫＬ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ＤＬＬ４、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２を含む腫瘍抗原が挙げられる。免疫チェックポイント標的又は腫瘍標的を癌細胞の発達への抵抗又はＴ細胞の活性化に関連する他の標的と組み合わせたり、複数の免疫チェックポイント標的を組み合わせたりすることによって、腫瘍などの悪性疾患の治療の可能性が大幅に向上した。初期には、臨床的に２つの単独のチェックポイント抗体を併用して治療効果を向上させたことがある。例えば、単一のイピリムマブを用いた治療と比較して、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）＋ニボルマブ（抗ＰＤ１）を用いた黒色腫患者への治療は、生存率を向上させることができる。現在、４つのＰＤ－１×ＣＴＬＡ４ｂｓＡｂの安全性及び初期の治療効果は、初期の臨床試験で評価されている。２つの免疫チェックポイント阻害剤をブロックするという概念は、ＰＤ－１×ＬＡＧ３、ＰＤ－１×ＴＩＭ３及びＰＤ－Ｌ１×ＣＴＬＡ４などの他の標的の組み合わせにも臨床的に適用されている。（Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗｉｔｈ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ａｎｄ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７７（１４）：１３４５－１３５６，（２０１７）；Ｄｏｖｅｄｉ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＭＥＤＩ５７５２：Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｓ ＣＴＬＡ－４ ｏｎ ＰＤ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７８（１３），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ．Ａｂｓｔｒａｃｔ２７７６：（２０１８）．Ｈｅｄｖａｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ－ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｏｒ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ－ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［ａｂｓｔｒａｃｔ Ｐ６６４］．Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ２０１８ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（ＳＩＴＣ）（２０１８）；Ａｒａｎ Ｆ．Ｌａｂｒｉｊｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｖｏｌｕｍｅ１８，ｐａｇｅｓ５８５－６０８（２０１９）。
現在、多くの二重特異性抗体はまだ臨床又は臨床前の研究段階になっており、市販されているのは、トリオンファーマ社のカツマキソマブ（２０１７年に商業上の理由で上市廃止）、アムジェン社のブリナツモマブ及びロシュのエミシズマブの３つの二重特異性抗体しかない。カツマキソマブは、トリオマブの構造形態をしたＩｇＧ様二重特異性抗体であり、Ｔ細胞及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）が過発現した腫瘍細胞を標的として作用し、Ｔ細胞の活性化、抗体依存性細胞依存性傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）により腫瘍細胞を傷害するものであり、２００９年に標準的な治療では効果がないか実行不可能であるＥｐＣＡＭ陽性腫瘍による悪性腹水症の治療に用いられることがＥＭＡによって承認された。なお、この薬は、販売が承認された最初の二重特異性抗体でもある。ブリナツモマブはＦｃ領域を含まない二重特異性抗体であり、ＢｉＴＥ（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）構造形態をしている。ブリナツモマブは、抗ＣＤ３部分がＴ細胞に結合し、抗ＣＤ１９部分が悪性及び正常なＢ細胞に結合することにより、Ｔ細胞依存性腫瘍細胞傷害を誘導するものであり、２０１４年に、フィラデルフィア染色体陰性の前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病の治療に用いられることがＦＤＡによって承認された。エミシズマブは、修飾されたヒト化二重特異性ＩｇＧ４モノクローナル抗体であり、因子ＩＸａ及び因子Ｘに結合する可能性がある。この抗体では、Ｆｃ設計に「Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（ＫｉＨ）」、ＬＣ設計に「Ｃｏｍｍｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ－ＩｇＧ（ＣＬＣ－ＩｇＧ）」及び可変領域最適化に「Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ（多次元最適化）」を採用しており、２０１７年に、第ＶＩＩＩ因子阻害剤が存在するＡ型血友病の日常的な予防に用いられるのがＦＤＡによって承認された。
Figure 2023509005000002
現在、数十の二重特異性抗体／プラットフォーム及び３つの市販薬の研究開発経験があるが、二重特異性抗体は構造形態が複雑で、作用特徴が多様であるため、その開発には一般的な抗体より多くの問題及び挑戦がある。例えば、ＩｇＧ様二重特異性抗体は、作製過程において重鎖－重鎖又は重鎖－軽鎖のミスマッチの問題に直面している。その中で最も典型的な例としてはカツマキソマブである。カツマキソマブは、販売が承認された最初の二重特異性抗体であるが、トリオマブ抗体の製造プロセスが複雑であり、また異種抗体が免疫原性を比較的に発生しやすいといった非常に明らかな制限も有するから、２０１７年に、商業上の理由で上市廃止された。別の例として、異なる抗原結合フラグメントが直列に結合された二重特異性抗体は、定常領域、特にＦｃフラグメントが欠乏しているため、半減期が短く、また、その発現量及び発現後の細胞内安定性が従来のＩｇＧよりも低くなることが一般である（Ｓｔｏｒｋ Ｒ，Ｍuｌｌｅｒ Ｄ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ Ｅ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｆｕｓｉｎｇ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｄｉａｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ａｎ ａｌｂｕｍｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２００７，２０（１１）：５６９－５７６．）。また、これらの抗体は、精製過程においてアフィニティー精製法を使用することが困難である場合が多いため、その精製プロセス及び最終製品における不純物の分析も、従来のＩｇＧよりも複雑である（Ｔａｎ Ｐ Ｈ，Ｓａｎｄｍａｉｅｒ Ｂ Ｍ，Ｓｔａｙｔｏｎ Ｐ Ｓ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＶＨ／ＶＬ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｓｃＦｖ ｆｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ，１９９８，７５（３）：１４７３－１４８２．）。その中で最も典型的な例としては、ブリナツモマブである。ブリナツモマブは、Ｆｃフラグメントがなく、分子量が小さいため、血液中での半減期が１．２５±０．６３ｈrしかなく、完全な抗体の半減期よりはるかに短く、有効量になるには静脈注射で４週間連続的に投与される必要があるし、試薬の使用時には連続輸液装置を追加的に装備する必要もあるし、それに、製造時には安定性が悪いこと及び凝集体が形成されやすいことも、製品の品質に悪影響を及ばして製造コストを増加させる恐れがある。現在、二重特異性抗体には、発現量が低く、安定性が悪く、製造プロセスが複雑で、研究開発コストがモノクローナル抗体より明らかに高いなどの様々問題があった。これらの問題は二重特異性抗体の開発を制限してしまった。従って、臨床使用により多くの選択を提供するためには、新規な構造を有する二重特異性抗体の開発が要望されている。
本発明は、上記の問題に鑑みて、追加の機能領域を含むＩｇＧ様二重特異性融合タンパク質に属する新規な構造を有する二重特異性融合タンパク質を提供するものである。具体的には、前記の融合タンパク質は、完全長免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のヒンジ領域に選択的なペプチドリンカーを介して第２の結合ドメインが挿入されたものであり、前記ＩｇＧのＦａｂ領域は前記融合タンパク質の第１の結合ドメインであり、また、第２の結合ドメインが挿入された前記ＩｇＧの重鎖は前記融合タンパク質の重鎖であり、前記ＩｇＧの軽鎖は前記融合タンパク質の軽鎖であり、また、前記第２の結合ドメインは、ヒト受容体、リガンド、前記受容体又はリガンドの細胞外領域フラグメント、結合ドメインフラグメント、又はフラグメントの組み合わせから選択され、ここで、前記受容体又はリガンドは、天然のシグナル経路において二量体化又は多量体化の構造を形成してシグナル経路を活性化又は阻害する受容体又はリガンドであり、前記第２の結合ドメインと前記第１の結合ドメインとは異なる標的を標的とする。
上記の構造を有する二重特異性融合タンパク質は、Ｈｉｂｏｄｙ（Ｈｉｎｇｅ－ｉｎｓｅｒｓｉｏｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）構造融合タンパク質（以下に、Ｈｉｂｏｄｙ構造融合タンパク質又はＨｉｂｏｄｙと呼ぶ）と命名した。
さらに、前記第１の結合ドメインは、免疫チェックポイント分子又は腫瘍抗原を標的として結合する。
さらに、前記免疫チェックポイント分子には、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １ ｌｉｇａｎｄ １）、ＣＴＬＡ－４（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ－４）、ＬＡＧ－３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ－３）、ＦＧＬ１（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＴＩＭ－３（Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－３）、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－９、ＴＩＧＩＴ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ＩＴＩＭ ｄｏｍａｉｎｓ）、ＣＤ１５５、ＣＤ４７が含まれる。前記腫瘍抗原には、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、Ｈｅｒ－２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２）、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＢＣＭＡ（Ｂ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＳＴＲ２（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＰＲＣ５Ｄ（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ Ｃ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＦｃＲＨ５（Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ５）、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、Ａ３３、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏ－ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＤ２８、ＤＬＬ３（Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＶＥＧＦＲ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＶＥＧＦＲ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＶＥＧＦ－Ａ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－Ａ）、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＦＧＦＲ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、Ｃ－ｍｅｔ、ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ－Ｂ ｌｉｇａｎｄ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦＲ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＰＤＧＦＲα（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）、ＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ４）、Ａｎｇ－１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１）、Ａｎｇ－２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２）が含まれる。
さらに、前記第２の結合ドメインは、ヒトＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）、ＣＴＬＡ－４、ＶＥＧＦ、ＬＡＧ３、ＣＤ２７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ４７、ＦＧＬ１（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＴＬＴ－２（Ｔｒｅｍ－ｌｉｋｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ２）、ＣＤ２８、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＣＳＦ１（Ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １）、ＣＸＣＬ１（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １）、ＣＸＣＬ２（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ２）、ＣＸＣＬ３（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ３）、ＣＸＣＬ５（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ５）、ＣＸＣＬ６（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ６）、ＣＸＣＬ７（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ７）、ＣＸＣＬ８（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ８）、ＣＸＣＬ９（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ９）、ＣＸＣＬ１０（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １０）、ＣＸＣＬ１２（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １２）、ＧＩＴＲ（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）を標的として結合する。
さらに、前記受容体又はリガンドは、ヒトＴＧＦ－β受容体（ＴＧＦ－βＲ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ－ｔｒａｐ、ＦＧＬ１、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＳＩＲＰα（Ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｃ－ｍｅｔ、ＣＳＦ１Ｒ（Ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＸＣＲ２（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＣＸＣＲ３（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３）、ＣＸＣＲ４（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）、ＧＩＴＲＬ（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）、ＥＧＦＲ、ＩＣＯＳ（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）である。
その中で、ＣＤ８０及びＣＤ８６は、ともに膜貫通型糖タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである。成熟したＣＤ８０分子は、２５４個のアミノ酸からなり、その細胞外領域（ＥＣＤ）が２０８個のアミノ酸であり、膜貫通ドメインが２５個のアミノ酸であり、細胞内ドメインが２１個のアミノ酸である。同様に、成熟したＣＤ８６分子は３０３個のアミノ酸からなり、その細胞外領域が２２２個のアミノ酸であり、膜貫通ドメインが２０個のアミノ酸であり、細胞内ドメインが６１個のアミノ酸である。ＣＤ８０及びＣＤ８６の細胞外領域は、免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）領域及び免疫グロブリンＣ（ＩｇＣ）領域を含む。ＣＤ８０及びＣＤ８６は、免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）領域によりそのリガンドであるＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に結合する。ＣＤ８０及びＣＤ８６がＣＤ２８に結合する場合、ＣＤ８０及びＣＤ８６は、抗原誘導Ｔ細胞の活性化、増殖及びエフェクター機能の産生に対して重要な調節効果を示し、正の調節因子となる。一方、ＣＤ８０及びＣＤ８６がＣＴＬＡ－４に結合する場合、ＣＤ８０及びＣＤ８６は、免疫応答を下方制御し、負の調節因子となる。従って、ＣＤ８０及びＣＤ８６は、Ｔリンパ球活性化における補助刺激因子であり、自己免疫モニタリング、体液免疫応答、及び移植反応において重要な役割を果たす。ＣＤ２８を採用するリガンドＣＤ８０を活性化因子として用いてＴ細胞を活性化することは、アゴニスト的な抗ＣＤ２８抗体を用いてＴ細胞を活性化するのとは異なり、重度のサイトカインストームを引き起こすことなく、患者の生命を脅かす恐れを大幅に低減する。
いくつかの実施形態において、ＣＤ８０ＥＣＤは、ヒトＣＤ８０（例えば、配列番号１３４のヒトＣＤ８０）、又は、ＣＤ８０アイソタイプ２若しくはアイソタイプ３に由来のヒトＣＤ８０ＥＣＤ（配列番号１３５及び１３６）から選択される。前記ＣＤ８０ＥＣＤは、ＣＤ８０免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）領域（ＣＤ８０－ＩｇＶ、配列番号１３３）を含む。一実施形態では、前記ＣＤ８０ＥＣＤは、ヒトＣＤ８０免疫グロブリンＶ領域とＣ領域（ＣＤ８０－ＩｇＶＩｇＣ、配列番号３２）を含む。一実施形態では、前記ＣＤ８０ＥＣＤは、ヒトＣＤ８０ＥＣＤである。一実施形態では、前記ＣＤ８０ＥＣＤは、ヒトＣＤ８０ＩｇＶを含む。
ＣＤ８０－ＩｇＶ（配列番号１３３）：
VIHVTKEVKE VATLSCGHNV SVEELAQTRI YWQKEKKMVL TMMSGDMNIW PEYKNRTIFD 60
ITNNLSIVIL ALRPSDEGTY ECVVLKYEKD AFKREHLAEV TLSVKADFPT PS 112
ＣＤ８０－ＩｇＶＩｇＣ（配列番号３２）：
VIHVTKEVKE VATLSCGHNV SVEELAQTRI YWQKEKKMVL TMMSGDMNIW PEYKNRTIFD 60
ITNNLSIVIL ALRPSDEGTY ECVVLKYEKD AFKREHLAEV TLSVKADFPT PSISDFEIPT 120
SNIRRIICST SGGFPEPHLS WLENGEELNA INTTVSQDPE TELYAVSSKL DFNMTTNHSF 180
MCLIKYGHLR VNQTFNWN 198
ＣＤ８０アイソタイプ１（配列番号１３４）：
MGHTRRQGTS PSKCPYLNFF QLLVLAGLSH FCSGVIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA 60
QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK 120
YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE 180
ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP 240
DNLLPSWAIT LISVNGIFVI CCLTYCFAPR CRERRRNERL RRESVRPV 288
ＣＤ８０アイソタイプ２（配列番号１３５）：
MGHTRRQGTS PSKCPYLNFF QLLVLAGLSH FCSGVIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA 60
QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK 120
YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE 180
ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTSFAPRCR 240
ERRRNERLRR ESVRPV 256
ＣＤ８０アイソタイプ３（配列番号１３６）：
MGHTRRQGTS PSKCPYLNFF QLLVLAGLSH FCSGVIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA 60
QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK 120
YEKDAFKREH LAEVTLSVKG FAPRCRERRR NERLRRESVR PV 162
さらに、前記第１の結合ドメイン及び前記第２の結合ドメインは、
（１）前記第１の結合ドメインが、ＰＤ－Ｌ１を標的として結合し、前記第２の結合ドメインが、ヒトＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＦＧＬ１、ＣＤ４７、ＣＤ１５５、ＨＧＦ、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＥＧＦ、又はＩＣＯＳＬを標的として結合するか、或いは
（２）前記第１の結合ドメインが、ＰＤ－１を標的として結合し、前記第２の結合ドメインが、ヒトＣＴＬＡ－４、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＣＤ２８、ＬＡＧ３、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、又はＯＸ４０を標的として結合するか、或いは
（３）前記第１の結合ドメインが、ＣＴＬＡ－４を標的として結合し、前記第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ２８、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＬＡＧ３、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、又はＯＸ４０を標的として結合するか、或いは
（４）前記第１の結合ドメインがＬＡＧ－３を標的として結合し、前記第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ２８、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、又はＯＸ４０を標的として結合するか、或いは
（５）前記第１の結合ドメインが、ＦＧＬ１を標的として結合し、前記第２の結合ドメインが、ヒトＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＣＤ４７、ＣＤ１５５、ＨＧＦ、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＥＧＦ、又はＩＣＯＳＬを標的として結合するか、或いは
（６）前記第１の結合ドメインが、ＴＩＭ－３標的として結合し、前記第２の結合ドメインが、ヒトＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＬＡＧ３、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、又はＯＸ４０を標的として結合するか、或いは
（７）前記第１の結合ドメインが、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－９を標的として結合し、前記第２の結合ドメインが、ヒトＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＣＤ４７、ＣＤ１５５、ＨＧＦ、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＥＧＦ、又はＩＣＯＳＬを標的として結合するか、或いは
（８）前記第１の結合ドメインが、ＴＩＧＩＴを標的として結合し、前記第２の結合ドメインが、ヒトＴＧＦ－β、ＨＧＦ、ＥＧＦ又はＶＥＧＦを標的として結合するか、或いは
（９）前記第１の結合ドメインが、ＣＤ１５５を標的として結合し、前記第２の結合ドメインが、ヒトＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＣＤ４７又はＣＤ１５５を標的として結合するか、或いは
（１０）前記第１の結合ドメインが、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ＨＥＲ－２、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＢＣＭＡ、ＳＳＴＲ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＦＣＲＨ５、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、Ａ３３、ＣＥＡ、ＣＤ２８、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＦＧＦＲ、Ｃ－ｍｅｔ、ＲＡＮＫＬ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ＤＬＬ－４、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２を標的として結合し、前記第２の結合ドメインが、ヒトＣＴＬＡ－４，ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＦＧＬ１、ＬＡＧ３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４７、ＣＤ１５５、ＨＧＦ、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＥＧＦ、又はＩＣＯＳＬを標的として結合する、という組み合わせから選択される。
さらに、前記第１の結合ドメイン及び前記受容体、リガンドは、
（１）前記第１の結合ドメインが、ＰＤ－Ｌ１を標的として結合し、前記受容体、リガンドが、ＴＧＦ－βＲＩＩ、ＶＥＧＦＲ、ＬＡＧ－３、ＳＩＲＰα、ＴＩＧＩＴ、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ又はＩＣＯＳから選択されるか、或いは
（２）前記第１の結合ドメインが、ＰＤ－１を標的として結合し、前記受容体、リガンドが、ヒトＣＤ８０、ＣＤ８６、ＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＦＧＬ１、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌから選択されるか、或いは
（３）前記第１の結合ドメインが、ＣＴＬＡ－４を標的として結合し、前記受容体、リガンドが、ヒトＣＤ８０、ＣＤ８６、ＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＦＧＬ１、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌから選択されるか、或いは
（４）前記第１の結合ドメインが、ＬＡＧ－３を標的として結合し、前記受容体、リガンドが、ヒトＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌから選択されるか、或いは
（５）前記第１の結合ドメインが、ＦＧＬ１を標的として結合し、前記受容体、リガンドが、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ、ＶＥＧＦＲ、ＳＩＲＰα、ＴＩＧＩＴ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ又はＩＣＯＳから選択されるか、或いは
（６）前記第１の結合ドメインが、ＴＩＭ－３を標的として結合し、前記受容体、リガンドが、ヒトＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＦＧＬ１、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌから選択されるか、或いは
（７）前記第１の結合ドメインが、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－９を標的として結合し、前記受容体、リガンドが、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ、ＶＥＧＦＲ、ＳＩＲＰα、ＴＩＧＩＴ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ又はＩＣＯＳから選択されるか、或いは
（８）前記第１の結合ドメインが、ＴＩＧＩＴを標的として結合し、前記受容体、リガンドが、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ又はＶＥＧＦＲから選択されるか、或いは
（９）前記第１の結合ドメインは、ＣＤ１５５を標的として結合し、前記受容体、リガンドは、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ、ＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＳＩＲＰα又はＴＩＧＩＴから選択されるか、或いは
（１０）前記第１の結合ドメインが、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ＨＥＲ－２、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＢＣＭＡ、ＳＳＴＲ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＦＣＲＨ５、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、Ａ３３、ＣＥＡ、ＣＤ２８、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＦＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＲＡＮＫＬ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ＤＬＬ４、Ａｎｇ－１又はＡｎｇ－２を標的として結合し、前記受容体、リガンドが、ヒトＣＴＬＡ－４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＧＦ－βＲＩＩ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＬ１、ＬＡＧ３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ｃ－ＭＥＴ、ＳＩＲＰα、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ又はＩＣＯＳから選択される、という組み合わせから選択される。
さらに、前記受容体のフラグメン、リガンドのフラグメントには、受容体又はリガンドの細胞外領域フラグメント、結合ドメインフラグメントが含まれる。
さらに、前記第１の結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１を標的として結合し、前記第２の結合ドメインは、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのフラグメントである。或いは、前記第１の結合ドメインは、ＰＤ－１を標的として結合し、前記第２の結合ドメインは、ヒトＣＤ８０ ＥＣＤ、ＣＤ８０ ＩｇＶ領域、ヒトＣＤ８０ＩｇＶＩｇＣ、ＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤ、ＶＥＧＦＲ２ ＥＣＤ、又はＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外領域とＶＥＧＦＲ２の第３の細胞外領域との組み合わせを含む。或いは、前記第１の結合ドメインは、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、又はＨＥＲ－２、ＥＧＦＲを標的として結合し、前記第２の結合ドメインは、ヒトＣＤ８０ ＥＣＤ、ＣＤ８０ ＩｇＶ領域、ヒトＣＤ８０ＩｇＶＩｇＣ、ＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤ、ＶＥＧＦＲ２ ＥＣＤ、又は、ＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外領域とＶＥＧＦＲ２の第３の細胞外領域との組み合わせから選択される。
さらに、前記第２の結合ドメインは、以下：
（１）配列番号３１、１３１若しくは１３２に示される配列を含むヒトＴＧＦ－βＲＩＩ、又は配列番号３１、１３１若しくは１３２に示される配列と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列、又は配列番号３１、１３１若しくは１３２に示される配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個のアミノ酸が置換又は欠失されたアミノ酸配列、或いは
（２）配列番号３２若しくは１３３に示される配列を含むＣＤ８０ ＥＣＤ又は配列番号３２若しくは１３３に示される配列と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列、又は配列番号３２若しくは１３３に示される配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個のアミノ酸が置換又は欠失されたアミノ酸配列、或いは
（３）配列番号３３に示される配列を含むＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外領域とＶＥＧＦＲ２の第３の細胞外領域のフラグメント組み合わせ、又は配列番号３３に示される配列と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列、又は配列番号３３に示される配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個のアミノ酸が置換又は欠失されたアミノ酸配列、から選択される。
さらに、前記第２の結合ドメインのＣ端又は／及びＮ端は、２～３０個のアミノ酸からなるペプチドリンカーを有する。
さらに、前記ペプチドリンカーは、
(1)（ＧＧＧＧＳ）ｎ、又は
(2)ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号８０）、又は
(3)ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号８１）、又は
(4)ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号８２）、又は
(5)ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号８３）、又は
(6)ＳＡＫＴＴＰ（配列番号８４）、又は
(7)ＲＡＤＡＡＰ（配列番号８５）、又は
(8)ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号８６）、又は
(9)ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号８７）、又は
(10)ＲＡＤＡＡＡＡ（配列番号８８）、又は
(11)ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号８９）、又は
(12)ＡＤＡＡＰ（配列番号９０）、又は
(13)ＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号９１）、又は
(14)ＴＶＡＡＰ（配列番号９２）、又は
(15)ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号９３）、又は
(16)ＱＰＫＡＡＰ（配列番号９４）、又は
(17)ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号９５）、又は
(18)ＡＫＴＴＰＰ（配列番号９６）、又は
(19)ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号９７）、又は
(20)ＡＫＴＴＡＰ（配列番号９８）、又は
(21)ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号９９）、又は
(22)ＡＳＴＫＧＰ（配列番号１００）、又は
(23)ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号１０１）、又は
(24)ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号１０２）、又は
(25)ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号１０３）、又は
(26)ＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号１０４）、又は
(27)ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号１０５）（ただし、前記ｎは、１、２、３又は４に等しい）であってもよい。
ｎ＝１の場合、前記の（ＧＧＧＧＳ）ｎは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２０）である。
ｎ＝２の場合、前記の（ＧＧＧＧＳ）ｎは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２１）又は（ＧＧＧＧＳ）2である。
ｎ＝３の場合、前記の（ＧＧＧＧＳ）ｎは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２２）又は（ＧＧＧＧＳ）3である。
ｎ＝４の場合、前記の（ＧＧＧＧＳ）ｎは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２３）又は（ＧＧＧＧＳ）4である。
さらに、挿入された前記第２の結合ドメインのサイズは、２３５、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０又は３００個のアミノ酸を超えない。
さらに、前記第２の結合ドメインの挿入部位は、免疫グロブリンのジスルフィド結合の形成に影響を及ぼさないように、ヒンジ領域の中央前部に位置する。ここで、前記ヒンジ領域の中央前部は、通常、２３１Ａより前の部分を指す。さらに、前記挿入部位の前後のヒンジ領域のアミノ酸の一部が置換又は欠失されており、例えば、前記ヒンジ領域は、Ｄ２２１Ｇ及び／又はＣ２２０Ｖ変異を含む。
さらに、前記ＩｇＧは、哺乳動物ＩｇＧ、ヒト化ＩｇＧ及びヒトＩｇＧから選択される。前記哺乳動物には、マウス、ラットが含まれる。好ましくは、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である。
さらに、前記の融合タンパク質のＦｃ領域は、非グリコシル化若しくは脱グリコシル化されたものであるか、または、減少したフコース化若しくは非フコシル化されたものである。
さらに、前記ＩｇＧは、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、イピリムマブである。好ましくは、前記ＩｇＧはアテゾリズマブであり、前記ＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は配列番号１０６に示され、前記ＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１０７に示される。あるいは、前記ＩｇＧはアベルマブであり、前記ＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は配列番号１０８に示され、前記ＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１０９に示される。或いは、前記ＩｇＧはデュルバルマブであり、前記ＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は配列番号１１０に示され、前記ＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１１１に示される。或いは、前記ＩｇＧはニボルマブであり、前記ＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は配列番号１１２に示され、前記ＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１１３に示される。或いは、前記ＩｇＧはペムブロリズマブであり、前記ＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は配列番号１１４に示され、前記ＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１１５に示される。或いは、前記ＩｇＧはイピリムマブであり、前記ＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は配列番号１１６に示され、前記ＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１１７に示される。或いは、前記ＩｇＧはセミプリマブであり、前記ＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は配列番号１１８に示され、前記ＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１１９に示される。
具体的には、本発明は、ヒトＰＤ－Ｌ１を標的とする第１の結合ドメインを有するＨｉｂｏｄｙ構造融合タンパク質を提供するものであり、前記ＩｇＧのＦａｂにおける重鎖可変領域のＣＤＲ及び／又は前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列で特定された抗体と同じのＣＤＲ配列を有するか、又は以下の配列で特定された抗体のＣＤＲの上に１～２個のアミノ酸を置換した配列を有する。前記配列で特定された抗体は、
（１）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号６６に示され、及び／又は
（２）軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号６７に示されるものである。
さらに、前記ＩｇＧのＦａｂにおける重鎖可変領域のＣＤＲ及び／又は前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、
（１）重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号１～５及び配列番号１～５に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号６～１０及び配列番号６～１０に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号１１～１５及び配列番号１１～１５に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、及び／又は
（２）軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号１６～２０及び配列番号１６～２０に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号２１～２５及び配列番号２１～２５に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号２６～３０及び配列番号２６～３０に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択されるものである。
特定の実施形態において、測定方法又はシステムの同定に従って、対応する重鎖及び軽鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１～３を表２に示す。
Figure 2023509005000003
さらに、前記融合タンパク質は、
（１）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号１、６、１１又は配列番号１、６、１１に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号１６、２１、２６又は配列番号１６、２１、２６に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
（２）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号２、７、１２又は配列番号２、７、１２に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号１７、２２、２７、又は配列番号１７、２２、２７に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号３、８、１３、又は配列番号３、８、１３に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号１８、２３、２８、又は配列番号１８、２３、２８に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号４、９、１４又は配列番号４、９、１４に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号１９、２４、２９又は配列番号１９、２４、２９に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
（５）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号５、１０、１５又は配列番号５、１０、１５に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号２０、２５、３０又は配列番号２０、２５、３０に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列である、ＣＤＲ配列を含む。
さらに、前記融合タンパク質の重鎖における重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列は、配列番号３、８、１３であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列は、配列番号１８、２３、２８である。
さらに、前記融合タンパク質の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列は、
（１）重鎖可変領域の配列が、配列番号６６に示されるか、配列番号６６と同じのＣＤＲ１～３を有し、かつ配列番号６６と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列であり、及び／又は
（２）軽鎖可変領域の配列が、配列番号６７に示されるか、配列番号６７と同じのＣＤＲ１～３を有し、かつ配列番号６７と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列である、ものである。
より具体的には、前記融合タンパク質の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、
（１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号７２に示されるか、配列番号７２と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列であり、
（２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号７３に示されるか、配列番号７３と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列である、ものである。
さらに、前記融合タンパク質の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、
（１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号７２と比較して１～１５個のアミノ酸部位変異を有するか、又は置換されたペプチドリンカーを有し、
（２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号７３と比較して１～１０個のアミノ酸部位変異を有する、ものである。
具体的には、本発明は、第１の結合ドメインがヒトＰＤ－１を標的とするＨｉｂｏｄｙ構造融合タンパク質を提供するものであり、前記Ｆａｂにおける重鎖可変領域のＣＤＲ及び／又は前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列で特定された抗体と同じのＣＤＲ配列を有するか、又は以下の配列で特定された抗体のＣＤＲの上に１～２個のアミノ酸を置換した配列を有する。前記配列で特定された抗体は、
（１）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号６４に示され、及び／又は
（２）軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号６５に示される、ものである。
さらに、融合タンパク質中のＦａｂにおける重鎖可変領域のＣＤＲ及び／又は前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、
（１）重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号３４～３８及び配列番号３４～３８に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号３９～４３及び配列番号３９～４３に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号４４～４８及び配列番号４４～４８に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、及び／又は
（２）軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号４９～５３及び配列番号４９～５３に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号５４～５８及び配列番号５４～５８に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号５９～６３及び配列番号５９～６３に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択される、ものである。
特定の実施形態において、異なる測定方法又はシステムの同定に従って、対応する重鎖及び軽鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１～３を表３に示す。
Figure 2023509005000004
さらに、前記融合タンパク質可変領域のＣＤＲ１～３は、
（１）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号３４、３９、４４又は配列番号３４、３９、４４に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号４９、５４、５９又は配列番号４９、５４、５９に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
（２）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号３５、４０、４５又は配列番号３５、４０、４５に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号５０、５５、６０又は配列番号５０、５５、６０に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号３６、４１、４６又は配列番号３６、４１、４６に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号５１、５６、６１又は配列番号５１、５６、６１に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号３７、４２、４７又は配列番号３７、４２、４７に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号５２、５７、６２又は配列番号５２、５７、６２に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
（５）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号３８、４３、４８又は配列番号３８、４３、４８に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号５３、５８、６３又は配列番号５３、５８、６３に１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるものとして、定義される。
さらに、前記融合タンパク質の可変領域のＣＤＲ１～３は、重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号３６、４１、４６であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号５１、５６、６１であるものとして、定義される。
さらに、前記融合タンパク質の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（１）重鎖可変領域の配列が、配列番号６４に示されるか、配列番号６４と同じのＣＤＲ１～３を有し、かつ配列番号６４と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列であり、及び／又は
（２）軽鎖可変領域の配列が、配列番号６５に示されるか、配列番号６５と同じのＣＤＲ１～３を有し、かつ配列番号６５と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列である、ものである。
より具体的には、前記融合タンパク質の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、
（１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号６８に示されるか、配列番号６８と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列であり、
（２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号６９に示されるか、配列番号６９と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列である、ものとして定義される。
さらに、前記融合タンパク質の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、
（１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号６８と比較して１～１５個のアミノ酸部位変異を有するか、又は置換されたペプチドリンカーを有し、
（２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号６９と比較して１～１０個のアミノ酸部位変異を有する、ものである。
より具体的には、前記融合タンパク質の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、
（１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号７０に示されるか、配列番号７０と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列であり、
（２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７１に示されるか、配列番号７１と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列である、ものとして定義される。
さらに、前記融合タンパク質の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、
（１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号７０と比較して１～１５個のアミノ酸部位変異を有するか、又は置換されたペプチドリンカーを有し、
（２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号７１と比較して１～１０個のアミノ酸部位変異を有する、ものである。
本発明は、さらに、上記のような融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供するものである。
本発明は、さらに、上記のようなポリヌクレオチドを含む核酸構築物を提供するものである。前記核酸構築物は、キャリアであることが好ましい。
本発明は、さらに、上記のようなポリヌクレオチド又は核酸構築物又はキャリアを含む宿主細胞を提供するものである。前記細胞は、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物の細胞、大腸菌細胞又はＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞であることが好ましい。
本発明は、さらに、上記のような融合タンパク質と薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を提供するものである。
本発明は、さらに、治療又は軽減を必要とする被検者に上記のような融合タンパク質又は前記医薬組成物を投与する工程を含む、腫瘍又はがんを治療するための方法を提供するものである。
本発明は、さらに、腫瘍又はがんを治療又は予防するための医薬品の製造における、上記のような融合タンパク質、ポリヌクレオチド、核酸構築物又はキャリア及び医薬組成物の使用を提供するものである。前記の腫瘍又はがんには、固形腫瘍又は非固形腫瘍が含まれる。
本発明は、さらに、上記のような融合タンパク質を含む診断キットを提供するものである。
本発明は、さらに、上記のような核酸構築物の発現を可能にする条件下で前記の宿主細胞を培養し、得られた融合タンパク質を培養物から回収することを含む、融合タンパク質の製造方法を提供するものである。
本発明で提供されるＨｉｂｏｄｙ構造融合タンパク質は、第２の結合ドメインがヒンジ領域に挿入されているため、ＩｇＧと同じの発現及び生産上の利点を有し、既存のＩｇＧ発現プラットフォーム及び精製プラットフォームにとシームレスに統合することができ、後続の開発コストが大幅に低減される。また、既存の二重特異性抗体プラットフォームで構築された二重特異性抗体に比べると、Ｈｉｂｏｄｙプラットフォームで構築された二重特異性抗体は、発現量が高く、軽鎖及び重鎖のミスマッチの問題がなく、抗体製造コストをさらに大幅に低減される。さらに、２つのヒンジ領域に一定範囲にあるサイズの第２の結合ドメインを挿入することは、融合タンパク質のＦａｂ領域の結合活性及びタンパク質の安定性に影響を及ぼさなかっただけでなく、安定性も向上しており、そして、より高い半減期が得られる。より顕著なことは、第２の結合ドメインと標的結合部位との結合活性が、対応する可溶性天然結合フラグメントのモノマーと対応する標的との結合活性と比較して明らかに改善される。その理由は、第２の結合ドメインとして選択された受容体又はリガンドは、自然のシグナル経路において二量体化又は多量体化構造を形成してシグナル経路を活性化又は阻害する一方、ヒンジ領域に挿入されると、ヒンジ領域におけるその空間的位置関係が対応する受容体又はリガンド又はそのフラグメントの二量体化の形成を促進し、従って、自然のシグナル経路を模倣することによって、より明らかに改善された結合活性が得られ、その結果、この融合タンパク質は、可溶性の受容体又はリガンド又は結合フラグメントを使用する場合に比べると、その活性化又は阻害能力が大幅に改善される、ことにあるであろうと考えられる。また、２つの結合ドメインの合理的な組み合わせによれば、受容体抑制又は受容体活性化の標的を良好に選択して効果的な相乗効果を実現することができ、２つの標的薬剤の単独投与又は従来技術の二重特異性抗体に対して、より有意な疾患治療効果を有するので、特に様々な腫瘍やがんにおいて、疾患プロセスを効果的に治療又は制御することができる。
図１は、Ｈｉｂｏｄｙ構造融合タンパク質の概略図である。 図２は、マウス結腸がんモデルに対するＨｉｂ－ＰＤＶ及びその対照群の腫瘍抑制曲線である。 図３は、マウス結腸がんに対するＨｉｂ－ＰＤＣ及びその対照群の腫瘍抑制曲線である。 図４は、Ｈｉｂ－ＰＬＴ及びその対照群が１０～１００ｎＭレベルの濃度において細胞からＩＦＮ－γ因子の分泌を促進するレベルの対照図である。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明にかかる当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。当業者なら、具体的に『細胞及び分子生物学の辞書』（Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第三版、１９９９、学術出版社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；『生物医学及び分子生物学簡明辞書』（ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ、第二版、２００２、ＣＲＣ出版社；及び『生物化学及び分子生物学オックスフォード辞書』（ｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、改訂版、２０００、オックスフォード大学出版社（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照すればよい。
本発明に係るアミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字の記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生物化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字の記号によって表すことができる。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に認められている１文字のコードによって表すことができる。
本発明においては、抗体可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の測定又は番号付け方法には、当技術分野でよく知られているＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ（カバット（Ｋａｂａｔ）らの免疫学的に注目されるタンバク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、公衆衛生サービス（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ．）（１９９１）に記載されている）、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔ法が含まれる。
本発明においては、２つの核酸又はアミノ酸配列間の「一致性」、「同一性」又は「類似性」は、最適なアラインメント（最適なアラインメント）の後に得られる、比較される２つの配列の間にある同じヌクレオチドまたは同じアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージはまったく統計的であり、２つの配列間の差異がランダムに分布し、完全な長さを包含する。２つの核酸又はアミノ酸配列間の配列比較は、一般にそれらが最適な方法で照合された後、これらの配列を比較することにより行われる。ここで、前記比較は、セグメント又は「比較ウィンドウ」により実施されることができる。手動で実施できることに加えて、配列を比較するための最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）［Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２］のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの（１９７０）［Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３］ローカルホモロジーアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４）類似性検索方法、これらのアルゴリズムを用いたコンピュータソフトウェアにより実施することもできる（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，又はＢＬＡＳＴ Ｎ ｏｒ ＢＬＡＳＴ Ｐ比較ソフトウェアにより）。
広く定義されるように、本発明に係る免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）は、抗体活性を有する動物タンパク質を指し、２つの同じの軽鎖と２つの同じの重鎖からなり、一種類の重要な免疫エフェクター分子であり、高等動物の免疫系リンパ球から産生したタンバク質は、抗原の誘導によって抗体に転化することができる。構造によっては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５種類に分けられる。好ましくは、本発明に係る免疫グロブリンはＩｇＧである。
広く定義されるように、本発明に係る受容体は、細胞膜または細胞内に存在するものであり、細胞外の特定のシグナル伝達分子に結合して細胞内の一連の生化学的反応を活性化することにより細胞が外界刺激に対して対応する反応を生じることを可能とする一種類の特殊なタンバク質である。受容体に結合する生物活性物質は、まとめてリガンド（ｌｉｇａｎｄ）と呼ばれる。受容体がリガンドに結合すると、分子の立体配座の変化が起こり、細胞間シグナル伝達や、細胞間接着、エンドサイトーシスなどの細胞応答が起こる。
本発明に係る二重特異性融合タンパク質は、免疫グロブリン構造に基づいてそのヒンジ領域に第２の結合ドメインが挿入されているものであるため、本発明に係る二重特異性融合タンパク質は、２つの結合ドメインを有する。
以下、実施例を通じて本発明をさらに説明する。以下の実施例は、本発明をさらに説明及び解釈するために用いられるものであるが、本発明に対する制限と見なすべきではないことに留意されたい。
実施例１ タンパク質の構築
本実施例は、当技術分野における従来の方法を採用して、以下のタンパク質分子：
（１）３つのＨｉｂｏｄｙ二重特異性融合タンパク質：Ｈｉｂ－ＰＬＴ、Ｈｉｂ－ＰＤＣ、Ｈｉｂ－ＰＤＶ、
（２）対照タンパク質１～３：ＷＯ２０１５／１１８１７５における二機能性分子構造に従って構築したもの、
（３）他の対照タンパク質：ＴＧＦ－β－Ｒ－Ｈｉｓ、ＶＥＧＦ－Ｒ－Ｈｉｓ、ＣＤ８０－Ｈｉｓ、ＰＤ－Ｌ１対照抗体、を構築し、また、当技術分野における従来の方法に従って、それらを一時的又は安定的に発現した。
Figure 2023509005000005
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＬＴの重鎖及び軽鎖の核酸配列及びアミノ酸配列は、以下の通りである。
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＬＴの重鎖の核酸配列（配列番号７８）：
Figure 2023509005000006
注：下線が引かれた太字の配列は、ＴＧＦ－βＲIIの核酸配列である。
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＬＴの重鎖のアミノ酸配列（配列番号７２）：
Figure 2023509005000007
注：太字の四角で囲まれたフラグメントはヒンジ領域の配列、斜体はペプチドリンカー、下線が引かれた太字の配列はＴＧＦ－βＲIIのアミノ酸配列である。
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＬＴの軽鎖の核酸配列（配列番号７９）：
GATATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCCCTGGCCGTGTCCCCAGGACAGAGGGCCACCATCACATGTCGGGCTTCCAAGAGCGTGCACACAAGCGGCTACTCTTATATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTATCTGGCTTCCAACCTGGAGAGCGGAGTGCCAGCTAGGTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGACAATCAATCCTGTGGAGGCCAACGATACAGCTAATTACTATTGCCAGCACTCCGGAGAGCTGCCATACACCTTCGGCGGAGGCACAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＬＴの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号７３）：
DIVLTQSPAS LAVSPGQRAT ITCRASKSVH TSGYSYMHWY QQKPGQPPKL LIYLASNLES 60
GVPARFSGSG SGTDFTLTIN PVEANDTANY YCQHSGELPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF 120
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 180
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 218
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＤＣの重鎖及び軽鎖の核酸配列及びアミノ酸配列は、以下の通りである。
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＤＣの重鎖の核酸配列（配列番号７４）：
Figure 2023509005000008
注：下線が引かれた太字の配列は、ＣＤ８０の核酸配列である。
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＤＣの重鎖のアミノ酸配列（配列番号６８）：
Figure 2023509005000009
注：斜体はペプチドリンカー、下線が引かれた太字の配列はＣＤ８０のアミノ酸配列である。
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＤＣの軽鎖の核酸配列（配列番号７５）：
GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCAGCCACTCTGTCACTGTCCCCAGGAGAAAGGGCTACTCTGTCTTGCCGGGCAAGCCAGTCTGTCTCCAGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCTCCTAGACTGCTGATCTACGACGCAAGTAACAGAGCCACCGGCATCCCCGCACGCTTCAGTGGCTCAGGCTCCGGAACAGACTTTACTCTGACCATCTCTAGTCTGGAGCCTGAAGATTTCGCCGTGTACTATTGTCAGCAGAGCTCTAATTGGCCTAGAACCTTCGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＤＣの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６９）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA 60
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＤＶの重鎖及び軽鎖の核酸配列及びアミノ酸配列は、以下の通りである。
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＤＶの重鎖の核酸配列（配列番号７６）：
Figure 2023509005000010
注：下線が引かれた太字の配列は、ＶＥＧＦＲの核酸配列である。
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＤＶの重鎖のアミノ酸配列（配列番号７０）：
Figure 2023509005000011
注：斜体はペプチドリンカー、下線が引かれた太字の配列はＶＥＧＦのアミノ酸配列である。
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＤＶの軽鎖の核酸配列（配列番号７７）：
GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCAGCCACTCTGTCACTGTCCCCAGGAGAAAGGGCTACTCTGTCTTGCCGGGCAAGCCAGTCTGTCTCCAGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCTCCTAGACTGCTGATCTACGACGCAAGTAACAGAGCCACCGGCATCCCCGCACGCTTCAGTGGCTCAGGCTCCGGAACAGACTTTACTCTGACCATCTCTAGTCTGGAGCCTGAAGATTTCGCCGTGTACTATTGTCAGCAGAGCTCTAATTGGCCTAGAACCTTCGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＤＶの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号７１）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA 60
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214
対照タンパク質１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
対照タンパク質１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２４）：
Figure 2023509005000012
注：斜体はペプチドリンカー、下線が引かれた太字の配列はＴＧＦ－βＲＩＩのアミノ酸配列である。
対照タンパク質１の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１２５）：
DIVLTQSPAS LAVSPGQRAT ITCRASKSVH TSGYSYMHWY QQKPGQPPKL LIYLASNLES 60
GVPARFSGSG SGTDFTLTIN PVEANDTANY YCQHSGELPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF 120
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 180
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 218
対照タンパク質２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
対照タンパク質２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２６）：
Figure 2023509005000013
注：斜体はペプチドリンカー、下線が引かれた太字の配列はＣＤ８０のアミノ酸配列である。
対照タンパク質２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１２７）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA 60
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214
対照タンパク質３の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
対照タンパク質３の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２８）：
Figure 2023509005000014
注：斜体はペプチドリンカー、下線が引かれた太字の配列はＶＥＧＦＲのアミノ酸配列である。
対照タンパク質３の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１２９）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA 60
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214
ＴＧＦ－β－Ｒ－Ｈｉｓ
ＴＧＦ－β－Ｒ－Ｈｉｓは、Ｈｉｓタグ付きＴＧＦ－βＲIIの細胞外領域フラグメントである
。前記のＴＧＦ－βＲIIの細胞外領域フラグメントのアミノ酸配列（配列番号１３７）：
TIPPHVQKSV NNDMIVTDNN GAVKFPQLCK FCDVRFSTCD NQKSCMSNCS ITSICEKPQE 60
VCVAVWRKND ENITLETVCH DPKLPYHDFI LEDAASPKCI MKEKKKPGET FFMCSCSSDE 120
CNDNIIFSEE YNTSNPD 137
ＶＥＧＦ－Ｒ－Ｈｉｓのアミノ酸配列
ＶＥＧＦ－Ｒ－Ｈｉｓは、ＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外領域とＶＥＧＦＲ２の第３の細胞外領域とのＨｉｓタグ付き組み合わせフラグメントであり、前記のＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外領域とＶＥＧＦＲ２の第３の細胞外領域との組み合わせフラグメントのアミノ酸配列（配列番号１３０）：
GRPFVEMYSE IPEIIHMTEG RELVIPCRVT SPNITVTLKK FPLDTLIPDG KRIIWDSRKG 60
FIISNATYKE IGLLTCEATV NGHLYKTNYL THRQTNTIID VVLSPSHGIE LSVGEKLVLN 120
CTARTELNVG IDFNWEYPSS KHQHKKLVNR DLKTQSGSEM KKFLSTLTID GVTRSDQGLY 180
TCAASSGLMT KKNSTFVRVH EP 202
ＣＤ８０－Ｈｉｓアミノ酸配列
ＣＤ８０－Ｈｉｓは、Ｈｉｓタグ付きＣＤ８０フラグメントであり、前記のＣＤ８０フラグメントのアミノ酸配列（配列番号３２）：
VIHVTKEVKE VATLSCGHNV SVEELAQTRI YWQKEKKMVL TMMSGDMNIW PEYKNRTIFD 60
ITNNLSIVIL ALRPSDEGTY ECVVLKYEKD AFKREHLAEV TLSVKADFPT PSISDFEIPT 120
SNIRRIICST SGGFPEPHLS WLENGEELNA INTTVSQDPE TELYAVSSKL DFNMTTNHSF 180
MCLIKYGHLR VNQTFNWN 198
実施例２ ＣＨＯの発現
Ａ．細胞の蘇生と増幅：
ＣＨＯ宿主細胞を蘇生させ、蘇生培養体積を１０ｍＬとし、培養条件を３７．０℃、２００ｒｐｍ、８％ＣＯ2、８０％湿度とした。蘇生後の細胞密度が２．８２×１０5個／ｍＬで、生存率が９５．４１％であった。
細胞を７２時間増幅と培養した後、生細胞密度が２．２２×１０6個／ｍＬで、生存率が９８．３２％であった。
細胞を５×１０5個／ｍＬで再接種して細胞再接種操作を行い、培養を４８時間継続した後、生細胞密度が２×１０6個／ｍＬで、生存率が９８．６８％であった。
細胞を５×１０5個／ウェルで６ウェルプレートに敷設し、培養体積を２ｍＬ／ウェルとし、二酸化炭素インキュベーター（培養条件３７℃、８％ＣＯ2）に入れて一晩培養し、翌日の壁付着性トランスフェクションに供給するように用意した。
Ｂ．トランスフェクション
トランスフェクション試薬は、ＬＴＸ及びＰｌｕｓ試薬を内含するＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅRＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン、カタログ番号１５３３８－１００）であった。
トランスフェクション操作：６ウェルプレート中の培地を交換し、トランスフェクションコンプレックス：ＬＴＸ ９μｌ／ウェル＋プラスミド ２．５μｇ／ウェル＋ｐｌｕｓ ２．５μｌ／ウェルを調製し、該トランスフェクションコンプレックスをウェルあたり２５０μｌで６ウェルプレートに添加した。６ウェルプレートの各ウェルの細胞について、細胞トランスフェクションの５ｈ後に培地交換した。トランスフェクション完了４８ｈ後に上清を採取し、上清の抗体含有量を二重抗原ＥＬＩＳＡ法で検出した。
Ｃ．バッチ培養と流加培養
トランスフェクション完了４８ｈ後、６ウェルプレートの細胞を消化して収集し、細胞培養チューブに入れ、細胞密度３×１０5個／ｍＬで懸濁成長させて適応させ、細胞生存率が９０％程度に回復したときにＨｉｂ－ＰＬＴの発現細胞プールと対照タンパク質１の発現細胞プールをバッチ培養し、Ｈｉｂ－ＰＤＣ、対照タンパク質２、Ｈｉｂ－ＰＤＶ、対照タンパク質３を流加培養した。
バッチ培養：細胞密度３×１０5個／ｍＬでＴＰＰ細胞培養チューブで培養を行い、体積を３０ｍＬ、培養条件を３７．０℃、２００ｒｐｍ、８％ＣＯ2、８０％湿度とした。毎日に、細胞生存率と代謝をモニタリングし、生存率＜６０％になった時に、培養を終了し、培養終了後の細胞上澄みを採取して濃度を検出した。
流加培養：細胞密度３×１０5個／ｍＬでＴＰＰ細胞培養チューブで培養を行い、体積を３０ｍＬ、培養条件を３７．０℃、２００ｒｐｍ、８％ＣＯ2、８０％湿度とした。特定の流加戦略（表５を参照）に従って細胞に濃縮培地を与え、培養期間においてＧｌｃを２～６ｇ／Ｌに制御するように保証した。生存率＜６０％になった時に、培養を終了し、培養終了後の細胞上澄みを採取して濃度を検出した。
Figure 2023509005000015
表６には、Ｈｉｂｏｄｙ二重特異性融合タンパク質Ｈｉｂ－ＰＬＴ、Ｈｉｂ－ＰＤＣ、Ｈｉｂ－ＰＤＶ及びそれらに対応する対照タンパク質の発現量の結果を示す。その結果、Ｈｉｂ－ＰＬＴは、対応する対照タンパク質と比較して発現量の増加相対値が５２．８５％増加し、Ｈｉｂ－ＰＤＣは、対応する対照タンパク質と比較して発現量の増加相対値が３３．４３％増加し、Ｈｉｂ－ＰＤＶは、対応する対照タンパク質と比較して発現量の増加相対値が２５．６％増加した。本発明で提供されるＨｉｂｏｄｙ二重特異性融合タンパク質の発現量はいずれも対応する対照タンパク質の発現量よりも明らかに優れており、また、本発明で提供される二重特異性抗体は、予想外の技術的効果を有することが示された。
Figure 2023509005000016
実施例３ 結合活性の測定
１．Ｈｉｂ－ＰＬＴ結合活性の測定：
（１）抗原のコーティング：ＴＧＦ－β１をコーティング緩衝液で２μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートにウェルあたり１００μｌを加え、２～８℃で一晩静置した。
（２）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを３回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（３）プレートのブロッキング：３％ＢＳＡ－ＰＢＳＴをブロッキング溶液とし、ウェルあたり３００μｌ、３７℃で２時間インキュベートした。
（４）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを３回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（５）サンプルの添加：下表に示される各濃度点を有するサンプルをウェルあたり１００μｌに９６ウェルプレート順次に加え、濃度点ごとに２つの重複ウェルを設置し、３７℃で２時間インキュベートした。
Figure 2023509005000017
（６）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを３回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（７）二次抗体の添加：
●Ｈｉｂ－ＰＬＴサンプルウェル：Ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ－Ｆｃ－ＨＲＰを１：５０００で希釈した後、ウェルあたり１００μｌ、３７℃で２時間インキュベートした。
●ＴＧＦ－β－Ｒ－Ｈｉｓウェル：Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰを１：５０００で希釈した後、ウェルあたり１００μｌ、３７℃で２時間インキュベートした。
（８）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを５回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（９）発色：ＴＭＢを発色溶液とし、ウェルあたり１００μｌで２分間発色させた。
（１０）発色の停止：２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を停止液とし、ウェルあたり５０μｌで発色を停止した。
（１１）読み取り：ＭＤマイクロプレートリーダーによりそれぞれ４５０ｎｍ及び６５５ｎｍで吸光値を読み取り、受試サンプルの濃度を横軸とし、吸光値を縦軸とし、４－ＰＬ曲線を作成した。ＥＣ５０値がソフトウェアにより自動的に得られた。
２．Ｈｉｂ－ＰＤＶ結合活性の測定：
（１）抗原のコーティング：ＶＥＧＦをコーティング緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートにウェルあたり１００μｌを加え、２～８℃で一晩静置した。
（２）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを３回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（３）プレートのブロッキング：３％ＢＳＡ－ＰＢＳＴをブロッキング溶液とし、ウェルあたり３００μｌ、３７℃で２時間インキュベートした。
（４）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを３回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（５）サンプルの添加：下表に示される各濃度点を有するサンプルをウェルあたり１００μｌに９６ウェルプレート順次に加え、濃度点ごとに２つの重複ウェルを設置し、３７℃で２時間インキュベートした。
Figure 2023509005000018
（６）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを３回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（７）二次抗体の添加：
●Ｈｉｂ－ＰＤＶサンプルウェル：Ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ－Ｆｃ－ＨＲＰを１：５０ ００で希釈した後、ウェルあたり１００μｌ、３７℃で２時間インキュベートした。
●ＶＥＧＦＲ－Ｈｉｓウェル：Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰを１：５０００で希釈した後、ウェル あたり１００μｌ、３７℃で２時間インキュベートした
（８）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを５回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（９）発色：ＴＭＢを発色溶液とし、ウェルあたり１００μｌで２分間発色させた。
（１０）発色の停止：２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を停止液とし、ウェルあたり５０μｌで発色を停止した。
（１１）読み取り：ＭＤマイクロプレートリーダーはそれぞれ４５０ｎｍ、６５５ｎｍで吸光値を読み取り、受試サンプルの濃度を横軸とし、吸光値を縦軸とし、４－ＰＬ曲線を作成した。ＥＣ５０値がソフトウェアにより自動的に得られた。
３．Ｈｉｂ－ＰＤＣ結合活性の測定：
（１）抗原のコーティング：ＣＴＬＡ－４ Ｐｒｏｔｅｉｎを１ｍＬの滅菌水で濃度が２００ｕｇ／ｍＬとなるように再溶解した。コーティング緩衝液で２０μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートにウェルあたり１００μｌを加え、２～８℃で一晩静置した。
（２）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを３回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（３）プレートのブロッキング：３％ＢＳＡ－ＰＢＳＴをブロッキング溶液とし、ウェルあたり３００μｌ、３７℃で２ｈ±２０ｍｉｎインキュベートした。
（４）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを３回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（５）サンプルの添加：ビオチン化サンプルをＰＢＳＴで希釈し、下表に示される各濃度点を有するサンプルをウェルあたり１００μｌに９６ウェルプレート順次に加え、濃度点ごとに２つの重複ウェルを設置し、ブランクウェルをＰＢＳＴで、３７℃で２ｈ±２０ｍｉｎインキュベートした。
Figure 2023509005000019
（６）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを３回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（７）二次抗体の添加：
●Ｈｉｂ－ＰＤＣサンプルウェル及びＣＤ８０－Ｈｉｓウェル：Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを１：２０００で希釈した後、ウェルあたり１００μｌ、３７℃で１ｈ±１０ｍｉｎインキュベートした。
（８）プレートの洗浄：ＰＢＳＴを溶離液とし、ウェルあたり３５０μｌでプレートを５回自動的に洗浄し、洗浄後にプレートをたたいて乾かした。
（９）発色：１００μｌ／ウェルのＴＭＢ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｌｏｗ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを加え、室温で暗所で６分間発色させた。
（１０）発色の停止：２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を停止液とし、ウェルあたり５０μｌで発色を停止した。
（１１）読み取り：ＭＤマイクロプレートリーダーによりそれぞれ４５０ｎｍ、６５５ｎｍで吸光値を読み取り、受試サンプルの濃度を横軸とし、吸光値を縦軸とし、４－ＰＬ曲線を作成した。ＥＣ５０値がソフトウェアにより自動的に得られた（表７を参照）。
Figure 2023509005000020
結合力の測定により、Ｈｉｂ－ＰＬＴとＴＧＦ－β受容体モノマーとの比較の結果：Ｈｉｂ－ＰＬＴのＥＣ５０値が０．１６４ｎＭであり、ＴＧＦ－β受容体モノマーのＥＣ５０値が１１．６０ｎＭであり、Ｈｉｂ－ＰＬＴの結合活性がＴＧＦ－β受容体モノマーの約７０倍より優れた。また、Ｈｉｂ－ＰＤＶとＶＥＧＦ受容体モノマーとの比較の結果：Ｈｉｂ－ＰＤＶのＥＣ５０値が０．０６１ｎＭであり、ＶＥＧＦ受容体モノマーのＥＣ５０値が２１５４ｎＭであり、Ｈｉｂ－ＰＤＶ結合活性がＶＥＧＦ受容体モノマーの約３５３１１倍より優れた。Ｈｉｂ－ＰＤＣとＣＤ８０モノマーとの比較の結果：Ｈｉｂ－ＰＤＣのＣ５０値が２４．３６ｎＭであり、ＣＤ８０モノマーのＥＣ５０値が５０．６９ｎＭであり、Ｈｉｂ－ＰＤＣ結合活性がＣＤ８０モノマーの約２倍より優れた。即ち、本発明で提供される二重抗モデルで構築されたＨｉｂ－ＰＬＴ、Ｈｉｂ－ＰＤＶ、Ｈｉｂ－ＰＤＣは、対応するモノマーの結合活性より結合力活性が大幅に向上した。
実施例４ 結腸がんＭＣ３８細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ｈＰＤ－１マウスに皮下移植した腫瘍に対するＨｉｂ－ＰＤＶの治療効果
３２匹の７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊヒト化ＰＤ－１トランスジェニックマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．から）を取った。０．１ｍＬの結腸がんＭＣ３８細胞の懸濁液（１×１０6ｃｅｌｌｓ／匹）をマウスの右脇腹に皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ3程度に成長したとき、腫瘍体積のサイズに応じてランダムにＶｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ）群、Ｈｉｂ－ＰＤＶ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）群、Ｈｉｂ－ＰＤＶ（２．５ｍｇ／ｋｇ）群及びＨｉｂ－ＰＤＶ（５ｍｇ／ｋｇ）群の４群に分け、各群における８匹の担癌マウスを週１回、合計３回に腹腔内投与した。投与期間中、腫瘍の長径、短径及び体重を週に２回測定した。投与後の２１日目に、腫瘍阻害率（ＴＧＩRTV）を算出して薬効評価を行い、表８に示した。
Figure 2023509005000021
計算式：
腫瘍体積：ＴＶ＝Ｄ1×Ｄ2 2／２、ここでは、Ｄ１、Ｄ２はそれぞれ腫瘍の長径、腫瘍の短径を表す。
相対腫瘍体積：ＲＴＶ＝ＴVT／ＴV1、ここでは、ＴV1は投与前の腫瘍体積、ＴVTは各測定時の腫瘍体積である。
相対の腫瘍阻害率：ＴＧＩRTV（％）＝（１－ＴRTV／ＣRTV）×１００％、ここでは、ＴRTVは投与群又は陽性対照群ＲＴＶ、ＣRTVは陰性対照群ＲＴＶを表す。
結果と結論：マウス結腸がんモデル腫瘍に対するＨｉｂ－ＰＤＶの阻害効果をそれぞれ表９及び図２に示す。ここでは、表９は、マウス結腸がんモデルの腫瘍体積およびそれに対するＨｉｂ－ＰＤＶの腫瘍阻害率であり、図２は、投与後の腫瘍成長の曲線図である。実験結果は、Ｈｉｂ－ＰＤＶがマウス結腸がんモデル腫瘍に対して有意な阻害効果を有することを示した。
Figure 2023509005000022
実施例５ トランスジェニックｈＰＤ－Ｌ１のＭＣ３８細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ｈＰＤ－１マウスに皮下移植した腫瘍に対するＨｉｂ－ＰＤＣの薬効の研究
３２匹の７～９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊヒト化ＰＤ－１トランスジェニック雌性マウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．から）を取り、０．１ｍＬのトランスジェニックｈＰＤ－Ｌ１ ＭＣ３８細胞懸濁液（１×１０6ｃｅｌｌｓ／匹）をマウス右前肢の脇の下の後ろに皮下移植した。腫瘍が約１００ｍｍ3程度に成長したとき、腫瘍体積のサイズに応じてランダムにＶｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ）群、Ｈｉｂ－ＰＤＣ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）群、Ｈｉｂ－ＰＤＣ（２．５ｍｇ／ｋｇ）群、Ｈｉｂ－ＰＤＣ（５ｍｇ／ｋｇ）群の４群に分け、各群８匹の担癌マウスを週１回、合計３回に腹腔内投与し、投与期間中、腫瘍の長径、短径及び体重を週２回測定した。投与後２１日目に、腫瘍阻害率（ＴＧＩRTV）を算出して薬効評価を行い、表１０に示した。
Figure 2023509005000023
計算式：
腫瘍体積：ＴＶ＝Ｄ１×Ｄ２2／２、ここでは、Ｄ１、Ｄ２はそれぞれ腫瘍の長径、腫瘍の短径を表す。
相対腫瘍体積：ＲＴＶ＝ＴVT／ＴV1、ＴV1は投与前の腫瘍体積、ＴVTは各測定時の腫瘍体積である。
相対の腫瘍阻害率：ＴＧＩRTV（％）＝（１－ＴRTV／ＣRTV）×１００％、ＴRTVは投与群又は陽性対照群ＲＴＶ、ＣRTVは陰性対照群ＲＴＶを表す。
結果と結論：マウス結腸がん腫瘍に対するＨｉｂ－ＰＤＣの阻害効果をそれぞれ表１１及び図３に示す。表１１はマウス結腸がんモデルの腫瘍体積及びそれに対するＨｉｂ－ＰＤＣの腫瘍阻害率であり、図３は投与後の腫瘍成長曲線である。試験結果は、Ｈｉｂ－ＰＤＣがマウス結腸・直腸癌の皮下移植腫瘍に対して有意な腫瘍阻害効果を有することを示した。
Figure 2023509005000024
実施例６ 同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）リンパ球の混合反応におけるサイトカイン分泌に対するＨｉｂ－ＰＬＴの影響
細胞上清中のサイトカインＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡ法で検出し、ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化におけるＨｉｂ－ＰＬＴの効果を評価した。ＤＣ細胞インビトロ急速成熟キット（ｃａｔ：ＣＴ－００４、三一造血）によりインビトロでドナー１の単核リンパ球を成熟樹状細胞に誘導し、４８ｈ後に細胞を収集し、２×１０5個／ｍＬに希釈した。ドナー２のＣＤ４+Ｔ細胞（ＥａｓｙＳｅｐTM Ｈｕｍａｎ ＣＤ４+Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ、ｃａｔ：１９０５２）を磁気ビーズで濃化して１×１０6個／ｍＬに希釈した。成熟樹状細胞とＣＤ４+Ｔ細胞を体積比１：１の割合で混合し、混合細胞懸濁液をウェルあたり１００μＬの体積で９６ウェルプレートに加えた。Ｈｉｂ－ＰＬＴ、ＰＤ－Ｌ１対照抗体＋ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ（併用投与）、ＰＤ－Ｌ１対照抗体、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ、ヒトＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、終濃度が０．０１～１００ｎＭになるように、混合細胞懸濁液を含む９６ウェルプレートに加えた。３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターに入れて１２０時間培養し、２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、細胞上清１５０～２００μＬを収集した。ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ、ｃａｔ：Ｓ２０５０；Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ、ｃａｔ：ＳＩＦ５０Ｃ）を用いて同種異系リンパ混合反応の上澄み中のＩＦＮ－γ因子を検出した。一元配置分散で群間の差異を分析した。
結果と結論：図４に示すように、Ｈｉｂ－ＰＬＴは、１０～１００ ｎＭレベルの濃度で、細胞のＩＦＮ－γ因子分泌を促進したレベルが、ＰＤ－Ｌ１対照抗体とＴＧＦ－β ｔｒａｐの併用投与群と比較して有意に上昇した（ｐ＜０．０５）。この結果から、１０～１００ｎＭの濃度レベルで混合リンパ反応においてＣＤ４+Ｔ細胞の活性化を促進する効果は、Ｈｉｂ－ＰＬＴのほうが併用投与群よりも優れていることが示された。
本発明は、特定の実施形態によって例示されてきた。しかし、本発明が特定の実施形態に限定されず、当業者であれば本発明の範囲内で様々な変更や変形を行うことが可能であり、また、本明細書の様々な箇所で言及された各技術的特徴を本発明の精神及び範囲から逸脱することなく相互に組み合わせることも可能であることを当業者なら理解するであろう。このような変更及び変形は、いずれも本発明の範囲内にあるものとする。

Claims (45)

  1. 完全長免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のヒンジ領域に選択的なペプチドリンカーを介して第２の結合ドメインが挿入されており、
    前記ＩｇＧのＦａｂ領域が第１の結合ドメインであり、
    第２の結合ドメインが挿入された前記ＩｇＧの重鎖が前記融合タンパク質の重鎖であり、前記ＩｇＧの軽鎖が前記融合タンパク質の軽鎖である、構造を有する融合タンパク質であって、
    前記第２の結合ドメインが、ヒト受容体、リガンド、又は前記受容体のフラグメン、リガンドのフラグメント、及びフラグメントの組み合わせから選択され、
    ここで、前記受容体、リガンドが、自然のシグナル経路において二量体化又は多量体化の構造を形成してシグナル経路を活性化又は阻害する受容体又はリガンドであり、
    前記第２の結合ドメインと前記第１の結合ドメインとが、異なる標的を標的とする、二重特異性融合タンパク質。
  2. 前記第１の結合ドメインが、免疫チェックポイント分子又は腫瘍抗原を標的として結合する、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記免疫チェックポイント分子には、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＦＧＬ１、ＴＩＭ－３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－９、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＣＤ４７が含まれ、
    前記腫瘍抗原には、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、ＨＥＲ－２、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＢＣＭＡ、ＳＳＴＲ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＦＣＲＨ５、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、Ａ３３、ＣＥＡ、ＣＤ２８、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＦＧＦＲ、Ｃ－ｍｅｔ、ＲＡＮＫＬ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ＤＬＬ４、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２が含まれる、ことを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記第２の結合ドメインが、ヒトＴＧＦ－β、ＣＴＬＡ－４、ＶＥＧＦ、ＬＡＧ３、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ４７、ＦＧＬ１、ＴＬＴ－２、ＣＤ２８、ＨＧＦ、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＧＩＴＲ、ＥＧＦ、ＩＣＯＳＬを標的として結合する、ことを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
  5. 前記受容体又はリガンドが、ヒトＴＧＦ－β受容体（ＴＧＦ－βＲ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ－ｔｒａｐ、ＦＧＬ１、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＳＩＲＰα、Ｂ７－Ｈ３、Ｃ－ｍｅｔ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＧＩＴＲＬ、ＥＧＦＲ、ＩＣＯＳである、ことを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質。
  6. 前記第１の結合ドメイン及び前記第２の結合ドメインが、以下：
    （１）前記第１の結合ドメインがＰＤ－Ｌ１を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＦＧＬ１、ＣＤ４７、ＣＤ１５５、ＨＧＦ、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＥＧＦ、又はＩＣＯＳＬを標的として結合するか、或いは
    （２）前記第１の結合ドメインがＰＤ－１を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＣＴＬＡ－４、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＣＤ２８、ＬＡＧ３、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、又はＯＸ４０を標的として結合するか、或いは
    （３）前記第１の結合ドメインがＣＴＬＡ－４を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＣＤ２８、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＬＡＧ３、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、又はＯＸ４０を標的として結合するか、或いは
    （４）前記第１の結合ドメインがＬＡＧ－３を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＣＤ２８、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、又はＯＸ４０を標的として結合するか、或いは
    （５）前記第１の結合ドメインがＦＧＬ１を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＣＤ４７、ＣＤ１５５、ＨＧＦ、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＥＧＦ、又はＩＣＯＳＬを標的として結合するか、或いは
    （６）前記第１の結合ドメインがＴＩＭ－３を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＬＡＧ３、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、又はＯＸ４０を標的として結合するか、或いは
    （７）前記第１の結合ドメインがＧａｌｅｃｔｉｎ－９を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＣＤ４７、ＣＤ１５５、ＨＧＦ、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＥＧＦ、又はＩＣＯＳＬを標的として結合するか、或いは
    （８）前記第１の結合ドメインがＴＩＧＩＴを標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＴＧＦ－β、ＨＧＦ、ＥＧＦ又はＶＥＧＦを標的として結合するか、或いは
    （９）前記第１の結合ドメインがＣＤ１５５を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＣＤ４７又はＣＤ１５５を標的として結合するか、或いは
    （１０）前記第１の結合ドメインがＣｌａｕｄｉｎ １８．２、ＨＥＲ－２、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＢＣＭＡ、ＳＳＴＲ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＦＣＲＨ５、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、Ａ３３、ＣＥＡ、ＣＤ２８、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＦＧＦＲ、Ｃ－ｍｅｔ、ＲＡＮＫＬ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ＤＬＬ－４、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＣＴＬＡ－４，ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＦＧＬ１、ＬＡＧ３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４７、ＣＤ１５５、ＨＧＦ、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＥＧＦ、又はＩＣＯＳＬを標的として結合する、という組み合わせから選択される、ことを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質。
  7. 前記第１の結合ドメイン、及び前記受容体、リガンドが、以下：
    （１）前記第１の結合ドメインがＰＤ－Ｌ１を標的として結合し、前記受容体、リガンドがＴＧＦ－βＲＩＩ、ＶＥＧＦＲ、ＬＡＧ－３、ＳＩＲＰα、ＴＩＧＩＴ、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ又はＩＣＯＳから選択されるか、或いは
    （２）前記第１の結合ドメインがＰＤ－１を標的として結合し、前記受容体、リガンドがヒトＣＤ８０、ＣＤ８６、ＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＦＧＬ１、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌから選択されるか、或いは
    （３）前記第１の結合ドメインがＣＴＬＡ－４を標的として結合し、前記受容体、リガンドがヒトＣＤ８０、ＣＤ８６、ＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＦＧＬ１、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌから選択されるか、或いは
    （４）前記第１の結合ドメインがＬＡＧ－３を標的として結合し、前記受容体、リガンドがヒトＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌから選択されるか、或いは
    （５）前記第１の結合ドメインがＦＧＬ１を標的として結合し、前記受容体、リガンドがヒトＴＧＦ－βＲＩＩ、ＶＥＧＦＲ、ＳＩＲＰα、ＴＩＧＩＴ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ又はＩＣＯＳから選択されるか、或いは
    （６）前記第１の結合ドメインがＴＩＭ－３を標的として結合し、前記受容体、リガンドがヒトＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＦＧＬ１、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌから選択されるか、或いは
    （７）前記第１の結合ドメインがＧａｌｅｃｔｉｎ－９を標的として結合し、前記受容体、リガンドがヒトＴＧＦ－βＲＩＩ、ＶＥＧＦＲ、ＳＩＲＰα、ＴＩＧＩＴ、ｃ－ＭＥＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ又はＩＣＯＳから選択されるか、或いは
    （８）前記第１の結合ドメインがＴＩＧＩＴを標的として結合し、前記受容体、リガンドがヒトＴＧＦ－βＲＩＩ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ又はＶＥＧＦＲから選択されるか、或いは
    （９）前記第１の結合ドメインがＣＤ１５５を標的として結合し、前記受容体、リガンドがヒトＴＧＦ－βＲＩＩ、ＶＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＳＩＲＰα又はＴＩＧＩＴから選択されるか、或いは
    （１０）前記第１の結合ドメインがＣｌａｕｄｉｎ １８．２、ＨＥＲ－２、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＢＣＭＡ、ＳＳＴＲ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＦＣＲＨ５、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、Ａ３３、ＣＥＡ、ＣＤ２８、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＦＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＲＡＮＫＬ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ＤＬＬ４、Ａｎｇ－１又はＡｎｇ－２を標的として結合し、前記受容体、リガンドがヒトＣＴＬＡ－４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＧＦ－βＲＩＩ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＬ１、ＬＡＧ３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ｃ－ＭＥＴ、ＳＩＲＰα、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ又はＩＣＯＳから選択される、という組み合わせから選択される、ことを特徴とする請求項６に記載の融合タンパク質。
  8. 前記受容体のフラグメン、リガンドのフラグメントには、受容体又はリガンドの細胞外領域フラグメント、結合ドメインフラグメントが含まれる、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記第１の結合ドメインがＰＤ－Ｌ１を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＴＧＦ－βＲＩＩのフラグメントであるか、或いは
    前記第１の結合ドメインがＰＤ－１を標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＣＤ８０ ＥＣＤ、ＣＤ８０ ＩｇＶ領域、ヒトＣＤ８０ＩｇＶＩｇＣ、ＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤ、ＶＥＧＦＲ２ ＥＣＤ、又はＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外領域とＶＥＧＦＲ２の第３の細胞外領域との組み合わせから選択されるか、或いは
    前記第１の結合ドメインがＣｌａｕｄｉｎ １８．２又はＨＥＲ－２、ＥＧＦＲを標的として結合し、前記第２の結合ドメインがヒトＣＤ８０ ＥＣＤ、ＣＤ８０ ＩｇＶ領域、ヒトＣＤ８０ＩｇＶＩｇＣ、ＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤ、ＶＥＧＦＲ２ ＥＣＤ、又はＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外領域とＶＥＧＦＲ２の第３の細胞外領域との組み合わせから選択される、ことを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
  10. 前記第２の結合ドメインが、以下：
    （１）配列番号３１、１３１若しくは１３２に示される配列を含むヒトＴＧＦ－βＲＩＩ、又は配列番号３１、１３１若しくは１３２に示される配列と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列、又は配列番号３１、１３１若しくは１３２に示される配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個のアミノ酸が置換又は欠失されたアミノ酸配列、或いは
    （２）配列番号３２若しくは１３３に示される配列を含むＣＤ８０ ＥＣＤ、又は配列番号３２若しくは１３３に示される配列と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列、又は配列番号３２若しくは１３３に示される配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個のアミノ酸が置換又は欠失されたアミノ酸配列、或いは
    （３）配列番号３３に示される配列を含むＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外領域とＶＥＧＦＲ２の第３の細胞外領域のフラグメント組み合わせ、又は配列番号３３に示される配列と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列、又は配列番号３３に示される配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個のアミノ酸が置換又は欠失されたアミノ酸配列、から選択されることを特徴とする請求項９に記載の融合タンパク質。
  11. 前記第１の結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１を標的として結合し、
    前記ＩｇＧのＦａｂにおける重鎖可変領域のＣＤＲ及び／又は前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、
    （１）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６６に示され、及び／又は
    （２）軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６７に示される配列で特定された抗体と同じのＣＤＲ配列を有するか、又は前記の特定された抗体のＣＤＲの上に１～２個のアミノ酸が置換されている、ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の融合タンパク質。
  12. 前記ＩｇＧのＦａｂにおける重鎖可変領域のＣＤＲ及び／又は前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、
    （１）重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号１～５及び配列番号１～５に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号６～１０及び配列番号６～１０に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号１１～１５及び配列番号１１～１５に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、及び／又は
    （２）軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号１６～２０及び配列番号１６～２０に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号２１～２５及び配列番号２１～２５に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号２６～３０及び配列番号２６～３０に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択されるものである、ことを特徴とする請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. （１）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号１、６、１１、又は配列番号１、６、１１に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号１６、２１、２６、又は配列番号１６、２１、２６に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
    （２）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号２、７、１２又は配列番号２、７、１２に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号１７、２２、２７、又は配列番号１７、２２、２７に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
    （３）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号３、８、１３、又は配列番号３、８、１３に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号１８、２３、２８、又は配列番号１８、２３、２８に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
    （４）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号４、９、１４、又は配列番号４、９、１４に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号１９、２４、２９、又は配列番号１９、２４、２９に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
    （５）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号５、１０、１５、又は配列番号５、１０、１５に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、配列番号２０、２５、３０、又は配列番号２０、２５、３０に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列である、ことを特徴とする請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. 重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号３、８、１３であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号１８、２３、２８である、ことを特徴とする請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. （１）重鎖可変領域の配列が、配列番号６６に示されるか、配列番号６６と同じのＣＤＲ１～３を有し、かつ配列番号６６と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えた同一性を有する配列であり、及び／又は
    （２）軽鎖可変領域の配列が、配列番号６７に示されるか、配列番号６７と同じのＣＤＲ１～３を有し、かつ配列番号６７と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列である、ことを特徴とする請求項１４に記載の融合タンパク質。
  16. （１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号７２に示されるか、配列番号７２と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列であり、
    （２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号７３に示されるか、配列番号７３と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列である、ことを特徴とする請求項１５に記載の融合タンパク質。
  17. （１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が配列番号７２と比較して１～１５個のアミノ酸部位変異を有するか、又は置換されたペプチドリンカーを有し、
    （２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が配列番号７３と比較して１～１０個のアミノ酸部位変異を有する、ことを特徴とする請求項１６に記載の融合タンパク質。
  18. 前記第１の結合ドメインは、ＰＤ－１を標的として結合し、前記ＩｇＧのＦａｂにおける重鎖可変領域のＣＤＲ及び／又は前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、
    （１）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６４に示され、及び／又は
    （２）軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６５に示される配列で特定された抗体と同じのＣＤＲ配列を有するか、又は前記の特定された抗体のＣＤＲの上に１～２個のアミノ酸が置換されている、ことを特徴とする請求項９に記載の融合タンパク質。
  19. 前記ＩｇＧのＦａｂにおける重鎖可変領域のＣＤＲ及び／又は前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、
    （１）重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号３４～３８及び配列番号３４～３８に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号３９～４３及び配列番号３９～４３に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号４４～４８及び配列番号４４～４８に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、及び／又は
    （２）軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号４９～５３及び配列番号４９～５３に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号５４～５８及び配列番号５４～５８に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号５９～６３及び配列番号５９～６３に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列から選択されるものである、ことを特徴とする請求項１８に記載の融合タンパク質。
  20. （１）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号３４、３９、４４又は配列番号３４、３９、４４に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号４９、５４、５９又は配列番号４９、５４、５９に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
    （２）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号３５、４０、４５又は配列番号３５、４０、４５に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号５０、５５、６０又は配列番号５０、５５、６０に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
    （３）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号３６、４１、４６又は配列番号３６、４１、４６に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号５１、５６、６１又は配列番号５１、５６、６１に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
    （４）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号３７、４２、４７又は配列番号３７、４２、４７に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号５２、５７、６２又は配列番号５２、５７、６２に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であるか、或いは
    （５）重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号３８、４３、４８又は配列番号３８、４３、４８に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号５３、５８、６３又は配列番号５３、５８、６３に対して１若しくは２個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列である、ことを特徴とする請求項１９に記載の融合タンパク質。
  21. 重鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号３６、４１、４６であり、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が配列番号５１、５６、６１である、ことを特徴とする請求項２０に記載の融合タンパク質。
  22. （１）重鎖可変領域の配列が、配列番号６４に示されるか、配列番号６４と同じのＣＤＲ１～３を有し、かつ配列番号６４と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列であり、及び／又は
    （２）軽鎖可変領域の配列が、配列番号６５に示されるか、配列番号６５と同じのＣＤＲ１～３を有し、かつ配列番号６５と比較して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列である、ことを特徴とする請求項２１に記載の融合タンパク質。
  23. （１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号６８に示されるか、配列番号６８と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列であり、
    （２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号６９に示されるか、配列番号６９と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列である、ことを特徴とする請求項２２に記載の融合タンパク質。
  24. （１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号６８と比較して１～１５個のアミノ酸部位変異を有するか、又は置換されたペプチドリンカーを有し、
    （２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号６９と比較して１～１０個のアミノ酸部位変異を有する、ことを特徴とする請求項２３に記載の融合タンパク質。
  25. （１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号７０に示されるか、配列番号７０と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列であり、
    （２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号７１に示されるか、配列番号７１と比較して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％を超えた同一性を有する配列である、ことを特徴とする請求項２２に記載の融合タンパク質。
  26. （１）前記融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号７０と比較して１～１５個のアミノ酸部位変異有するか、又は置換されたペプチドリンカーを有し、
    （２）前記融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号７１と比較して１～１０個のアミノ酸部位変異を有する、ことを特徴とする請求項２５に記載の融合タンパク質。
  27. 前記ＩｇＧが、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、イピリムマブである、ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  28. 前記第２の結合ドメインのＣ端又は／及びＮ端が、２～３０個のアミノ酸からなるペプチドリンカーを有する、ことを特徴とする請求項１～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  29. 前記ペプチドリンカーが、
    （１）（ＧＧＧＧＳ）ｎ、又は
    （２）ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号８０）、又は
    （３）ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号８１）、又は
    （４）ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号８２）、又は
    （５）ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号８３）、又は
    （６）ＳＡＫＴＴＰ（配列番号８４）、又は
    （７）ＲＡＤＡＡＰ（配列番号８５）、又は
    （８）ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号８６）、又は
    （９）ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号８７）、又は
    （１０）ＲＡＤＡＡＡＡ（配列番号８８）、又は
    （１１）ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号８９）、又は
    （１２）ＡＤＡＡＰ（配列番号９０）、又は
    （１３）ＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号９１）、又は
    （１４）ＴＶＡＡＰ（配列番号９２）、又は
    （１５）ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号９３）、又は
    （１６）ＱＰＫＡＡＰ（配列番号９４）、又は
    （１７）ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号９５）、又は
    （１８）ＡＫＴＴＰＰ（配列番号９６）、又は
    （１９）ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号９７）、又は
    （２０）ＡＫＴＴＡＰ（配列番号９８）、又は
    （２１）ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号９９）、又は
    （２２）ＡＳＴＫＧＰ（配列番号１００）、又は
    （２３）ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号１０１）、又は
    （２４）ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号１０２）、又は
    （２５）ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号１０３）、又は
    （２６）ＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号１０４）、又は
    （２７）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号１０５）である（ただし、前記ｎは 、１、２、３又は４に等しい。）ことを特徴とする請求項２８に記載の融合タンパク質。
  30. 挿入された前記第２の結合ドメインのサイズが、３００個のアミノ酸を超えない、ことを特徴とする請求項１～２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  31. 前記第２の結合ドメインの挿入部位が、免疫グロブリンのジスルフィド結合の形成に影響を及ぼさないように、ヒンジ領域の中央前部に位置する、ことを特徴とする請求項１～３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  32. 前記ヒンジ領域の中央前部とは、２３１Ａより前の部分を指す、ことを特徴とする請求項３１に記載の融合タンパク質。
  33. 前記挿入部位の前後のヒンジ領域のアミノ酸の一部が置換又は欠失されている、ことを特徴とする請求項１～３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  34. 前記ヒンジ領域が、Ｄ２２１Ｇ及び／又はＣ２２０Ｖ変異を含む、ことを特徴とする請求項３３に記載の融合タンパク質。
  35. 前記ＩｇＧが、哺乳動物ＩｇＧ、ヒト化ＩｇＧ及びヒトＩｇＧから選択され、
    前記哺乳動物には、マウス、ラット、兔が含まれ、
    好ましくは、前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である、ことを特徴とする請求項１～３４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  36. この融合タンパク質のＦｃ領域が、非グリコシル化若しくは脱グリコシル化されたものであるか、又は減少したフコース化若しくは非フコシル化されたものである、ことを特徴とする請求項１～３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  37. 請求項１～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  38. 好ましくは、キャリアである核酸構築物であって、
    請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
  39. 好ましくは、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物の細胞、大腸菌細胞又はＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞である細胞であって、請求項３７に記載のポリヌクレオチド又は請求項３８に記載の核酸構築物若しくは前記キャリアを含む、宿主細胞。
  40. 請求項１～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
  41. 治療又は軽減を必要とする被検者に請求項１～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項４０に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、腫瘍又はがんを治療するための方法。
  42. 腫瘍又はがんを治療又は予防するための医薬品の製造における、請求項１～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３７に記載のポリヌクレオチド、請求項３８に記載の核酸構築物若しくは前記キャリア、又は請求項４０に記載の医薬組成物の、使用。
  43. 前記腫瘍又はがんには、固形腫瘍又は非固形腫瘍が含まれる、ことを特徴とする請求項４２に記載の使用。
  44. 請求項１～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む診断キット。
  45. 請求項３８に記載の核酸構築物の発現を可能にする条件下で、請求項３９に記載の宿主細胞を培養し、得られた融合タンパク質を培養物から回収することを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質の製造方法。
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