JP2023183514A

JP2023183514A - ゲルマクレンおよび香料組成物

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Publication number: JP2023183514A
Application number: JP2022097071A
Authority: JP
Inventors: 誠藤田; Makoto Fujita; 宗太佐藤; Sota Sato; 直樹和田; Naoki Wada; 隆章三橋; Takaaki Mihashi
Original assignee: University of Tokyo NUC; National Institute of Natural Sciences
Current assignee: University of Tokyo NUC; National Institute of Natural Sciences
Priority date: 2022-06-16
Filing date: 2022-06-16
Publication date: 2023-12-28

Abstract

【課題】新規なゲルマクレン、および、このものを香料成分として含有する香料組成物を提供する。【解決手段】紅藻由来のテルペンシクラーゼ（ＴｅｒｐｅｎｅＣｙｃｌａｓｅ）によって産生される酵素反応生成物である、下記式（１）で表されるゲルマクレン、および、この化合物を香料成分として含有する香料組成物。TIFF2023183514000007.tif4659【選択図】なし

Description

本発明は、新規なゲルマクレン、及び、この化合物を香料成分として含有する香料組成物に関する。

ゲルマクレン（Ｇｅｒｍａｃｒｅｎｅ）は、シクロデカン骨格を有する一群の環状セスキテルペン炭化水素化合物であり、下記に示すゲルマクレンＡ～Ｅの５つの異性体が知られている。

これらの化合物のうち、ゲルマクレンＢ及びＤは香料成分として知られている（特許文献１、２等）。
また、ゲルマクレンＥは、ウミトサカ目シヌラリアエレクタ（Ｓｉｎｕｌａｒｉａｅｒｅｃｔａ）から単離された物質である（非特許文献１）。しかしながら、この化合物の立体配置は明らかになっていない。

特開２０２１－１８１５３６号公報特表２０１７－５０１１０９号公報

Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９９８，６１，８７２－８７５．

本発明は、新規なゲルマクレン、および、この化合物を香料成分として含有する香料組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、紅藻ローレンチアパシフィカ（Ｌａｕｒｅｎｃｉａｐａｃｉｆｉｃａ）由来のテルペンシクラーゼ（ＴｅｒｐｅｎｅＣｙｃｌａｓｅ）であるＬｐｈＴＰＳ－Ｂが産生する酵素反応生成物を単離し、いわゆる「結晶スポンジ法」を利用して、このものの分子構造の解明を試みた。
「結晶スポンジ法」とは、高分子錯体の単結晶の細孔内に解析対象化合物の分子を規則的に配列させ、得られたゲスト分子包接体を測定試料として用いて結晶構造解析を行う方法である（Ｎａｔｕｒｅ，２０１３，４９５，４６１－４６６）。
そして、この酵素反応生成物は、非特許文献１に記載されているゲルマクレンＥと同じ基本骨格を有するが、その立体配置が異なる新規化合物であることを見出した。さらに、このものは、抹茶様の甘い香りを有する物質であって、香料成分として有用であるという知見を得、本発明を完成するに至った。

かくして本発明によれば、〔１〕、〔２〕に記載のゲルマクレン、および、〔３〕に記載の香料組成物が提供される。
〔１〕下記式（１）で表されるゲルマクレン。

〔２〕紅藻類由来のテルペンシクラーゼ（ＴｅｒｐｅｎｅＣｙｃｌａｓｅ）によって産生される酵素反応生成物である、〔１〕に記載のゲルマクレン。
〔３〕前記〔１〕又は〔２〕に記載のゲルマクレンを、香料成分として含有することを特徴とする香料組成物。

本発明によれば、新規ゲルマクレン、および、このものを香料成分として含有する香料組成物が提供される。

本発明のｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）の^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトル図である。本発明のｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル図である。ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）内包高分子金属錯体の結晶構造を表す図である。

１）ゲルマクレン系化合物
本発明の第１は、前記式（１）で示されるゲルマクレン〔（４Ｓ，５Ｅ，７Ｓ，１０Ｅ）-４，１０－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－７－（ｐｒｏｐ－１－ｅｎ－２－ｙｌ）ｃｙｃｌｏｄｅｃａ－５，１０－ｄｉｅｎｅ〕である（以下、「ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）」ということがある）。

本発明のｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）は、紅藻ローレンチアパシフィカ（Ｌａｕｒｅｎｃｉａｐａｃｉｆｉｃａ）由来のテルペンシクラーゼ（ＴｅｒｐｅｎｅＣｙｃｌａｓｅ）であるＬｐｈＴＰＳ－Ｂが産生する酵素反応生成物である。

本発明者らは、ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）を次のステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）により単離した。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主として用いた異種発現系に合わせコドンを最適化したＬｐｈＴＰＳ－Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＳＶ６３４６５．１）を発現する遺伝子を、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の遺伝子合成サービスｇＢｌｏｃｋｓＧｅｎｅＦｒａｇｍｅｎｔｓにより合成した。
尚、コドン最適化は、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するＩＤＴＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＴｏｏｌにて行った。
次いで、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、発現ベクターｐ４２６ＴＥＦに、ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位でクローニングして、ＬｐｈＴＰＳ－Ｂ（プラスミド）を調製した。挿入された遺伝子配列は、ＤＮＡシーケンス受託解析サービス（株式会社ファスマック）にて検証された。

〔ステップ（ｉ）〕２相系培養
０.１Ｌのｎ－ドデカンと１ＬのＳＣ－ＵＲＡ培地（純水１Ｌに６．７ｇのＹｅａｓｔＮｉｔｏｒｇｅｎＢａｓｅｗｉｔｈｏｕｔＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ（ＢＤＤｉｆｃｏ）と２０ｇのＤ－グルコースと０．７７ｇ－ＵｒａのＤＯＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴａｋａｒａＢｉｏＩｎｃ．）を含む）を含む２Ｌの三角フラスコ中に、ＬｐｈＴＰＳ－Ｂ（プラスミド）を導入し、形質転換した出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＢＹ４７４１（ＮＢＲＰＩＤ：ＢＹ２３８４９）株）の終夜培養液１０ｍＬを加え、３０℃、３００ｒｐｍで、２日間、全容を振とうした。次いで、４０％Ｄ－グルコース水溶液０．０５Ｌを添加し、全容を１日間浸とうした。培養には４個の三角フラスコを用いた。

〔ステップ（ｉｉ）〕解乳化
ステップ（ｉ）で得た培養液をすべて１リットルの分液漏斗にいれ、断続的に水相を除き、乳化状態のドデカン相（約０．５リットル）を分取した。分取したドデカン相のエマルジョンを分液漏斗中で０．５リットルの飽和食塩水で洗浄したのち、０．１ｋｇの食塩を加えた。デカンテーションと超音波照射によりドデカン相を解乳化させ、ドデカン相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。

〔ステップ（ｉｉｉ）〕固相抽出
ステップ（ｉｉ）で得た乾燥させた有機層を、１０％硝酸銀含侵シリカゲルカラム（約１０ｇ、富士フイルム和光純薬株式会社製，ｃａｔ．ｎｏ．１９７－１１６１１）に載せ、ｎ－ペンタンで洗浄した。その後、溶離液として、ｎ－ペンタン＋酢酸エチル〔１０：１（ｖ／ｖ）〕及び酢酸エチルで溶離）を用い、目的物を含む有機層を分取した。分取した有機層を濃縮して、目的物を含む油状物を得た。

〔ステップ（ｉｖ）〕精製
次いで、ステップ（ｉｉｉ）で得た目的物を含む油状物を、逆相ＨＰＬＣで精製する（溶離液：水－アセトニトリル混合溶媒）ことにより、目的物〔ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）〕を含むフラクションを得た。分離したフラクションから目的物を溶媒抽出（抽出溶媒：ペンタン）した。ペンタン層を食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥させたペンタン層を濃縮し、濃縮物をシリカゲル６０Ｎ（約１．５ｇ，４０－１００メッシュ）を含むカラムクロマトグラフィーでさらに精製して（溶離液：ペンタン）、不純物を除いた。最後に、得られたペンタン層を濃縮して、純粋な目的物（ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１））を９．９ｍｇ得た。

ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）の物性データは次の通りである。
（１）性状：無色油状物（ｃｏｌｏｒｌｅｓｓｏｉｌ）
（２）分子式：Ｃ_１５Ｈ_２４（精密質量分析によるｍ／ｚ値：２０５．１９５４・プロトン付加体に対して計算した精密質量２０５．１９５６に対して１．０ｐｐｍの誤差）
（３）旋光度：［α］^２５．７ _Ｄ＝＋２４４．２°（ｃ０．２１，クロロホルム中）
（４）８００ＭＨＺのＮＭＲ分光計を用いて３００Kにて取得した重クロロホルム溶媒中におけるＮＭＲスペクトルデータ：^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図１に、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図２にそれぞれ示す。
また、ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）の^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルデータ及び^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルデータ（以下、これらをまとめて「ＮＭＲスペクトルデータ」ということがある。）を下記表１にまとめて示す。

表１中、記号は以下の意味を表す。
＊１（シグナル面積、シグナルの種類、カップリング定数（Ｈｚ））を表す。
ｍ：マルチプレット
dｄ：ダブルダブレット
brｔ：ブロードトリプレット
br s ：ブロードシングレット
ｔ：トリプレット
ｄ：ダブレット
ｓ：シングレット
また、内部標準として溶媒である重クロロホルムのシグナル（^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて７．２６ｐｐｍ、^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルにおいて７７．１６ｐｐｍ）を用いた。

これらのデータから、ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）は、非特許文献１に記載のゲルマクレンＥ〔以下、このものを「ゲルマクレンＥ（２）」ということがある。〕と同様のシクロデカン骨格を有する化合物であると考えられた。
非特許文献１には、ゲルマクレンＥ（２）のＮＭＲスペクトルデータも記載されている。上記表１に示す本願発明のｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）のＮＭＲスペクトルデータと、非特許文献１に記載のゲルマクレンＥ（２）のＮＭＲスペクトルデータとを比較すると、対応する炭素原子及び水素原子のケミカルシフトに明らかな差異が認められた。従って、本願発明のｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）と非特許文献１に記載されているゲルマクレンＥ（２）とは、同じシクロデカン骨格を有するジアステレオマーであると推測された。

そこで、「結晶スポンジ法」を利用して、このものの分子構造の解明を試みた。
ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）の分子構造の解明は、次のようにして行った。
（ステップ１）ノルマルヘキサン内包高分子金属錯体結晶の合成
ＷＯ２０１４／０３８２２０号公報に記載の、実施例１、ステップ１、２と同様にして、［（ＺｎＩ_２）_３（ＴＰＴ）_２（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）_ｘ］〔ＴＰＴ＝２，４，６－トリス（４－ピリジル）－１，３，５－トリアジン〕を製造した。

（ステップ２）ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）内包高分子金属錯体結晶の合成
５０μＬのノルマルヘキサンをセプタムキャップ付きマイクロバイアル瓶に入れ、次いで、この中に、ノルマルヘキサン内包高分子金属錯体［（ＺｎＩ_２）_３（ＴＰＴ）_２（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）_ｘ］の単結晶１粒（大きさ：３５２μｍ×１４８μｍ×６４μｍ）を浸漬させた。
そこへ、ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）を、濃度が１μｇ／１μＬとなるように１，２－ジクロロエタンに溶解し、得られた試料溶液１０μＬ（ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）を１０μｇ含有）をマイクロバイアル瓶内に加えた。
その後、マイクロバイアル瓶のキャップを閉め、セプタム部に針穴径０．８ｍｍの注射針でピンホールを開け、これを３０℃の恒温室内に２８時間静置した。
その後、単結晶を取り出し、Ｘ線構造解析装置にマウントし、結晶構造解析を行った。
結晶学的データを下記表２に、結晶構造を図３に示す。

Ｘ線構造解析の結果、このものの立体構造は下記のとおりであることが分かった。
なお、下記化学式中の番号は、上記表１の位置番号に対応している。

本発明のｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）は、抹茶様の甘い香りを呈する。本発明のｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）は、香料組成物の香料成分として有用である。

２）香料組成物
本発明の第２は、ｅｐｉ－ゲルマクレンＥ（１）を香料成分として含有する香料組成物である。
本発明の香料組成物中における本発明化合物の含有量は、香料組成物１００質量部あたり、好ましくは０．００１～５０質量部、より好ましくは０．０１～１０質量部、さらに好ましくは０．０５～１質量部である。

本発明の香料組成物としては、レモンやグレープフルーツ様の香りを有するミント系香料；ローズ、ラベンダー、ジャスミン様の香りを有するフローラル系香料；ピーチ、アップル、ストロベリー様の香りを有するフルーティー系香料：ヒノキ、ユーカリ、サイブレス様の香りを有する樹木系香料；ペパーミント、ローズマリー様の香りを有するハーブ系香料；合成香料を含有するマリン系香料；パチェリ、ベルガモット、グリーンティ様の香りを有するグリーン系香料；などが挙げられる。

また、本発明の香料組成物は、従来公知の香料成分に加えて、本発明の化合物を含有することにより、上記香料にさらに好ましいナチュラルで深みのある清涼感や嗜好性を向上させることができる。

香料成分としては、例えば、天然香料、天然精油等や各種合成香料を用いることができる。これらの香料は、飲食品、医薬品、香粧品、オーラルケア製品に使用できるものであれば特に限定されない。例えば、エステル類、アルデヒド類、（チオ）エーテル類、アルコール類、ケトン類、ラクトン類、カルボン酸、脂肪族炭化水素、含窒素複素環化合物、含硫黄複素環化合物、アミン類、チオール類、フェノール類、精油などが挙げられる。

具体的な化合物としては、アセトアルデヒド、アセト酢酸エチル、アセトフェノン、アネトール、アニスアルデヒド、アミルアルコール、α－アミルシンナムアルデヒド、アリルシクロヘキサンプロピオネート、アントラニル酸メチル、アンブレットリド、イオノン、イソアミルアルコール、イソオイゲノール、イソ吉草酸イソアミル、イソ吉草酸エチル、イソチオシアネート類、イソチオシアン酸アリル、イソバレルアルデヒド、イソブタノール、イソブチルアルデヒド、イソプロパノール、イソペンチルアミン、インドール及びその誘導体、γ－ウンデカラクトン、エチルアセテート、２－エチル－３，５－ジメチルピラジン及び２－エチル－３，６－ジメチルピラジンの混合物、エチルチオアセテート、エチルバニリン、２－エチルピラジン、エチルブチレート、２－エチル－３－メチルピラジン、２－エチル－５－メチルピラジン、５－エチル－２－メチルピラジン、エチルメチルフェニルグリシデート、エチルラクテート、オイゲノール、オクタナール、オクタン酸エチル、カプサイシン、カルビールアセテート、カルボン、ギ酸イソアミル、ギ酸ゲラニル、ギ酸シトロネリル、ケイ皮酸、ケイ皮酸エチル、ケイ皮酸メチル、ケトン類、ゲラニオール、酢酸イソアミル、酢酸エチル、酢酸ゲラニル、酢酸シクロヘキシル、酢酸シトロネリル、酢酸シンナミル、酢酸テルピニル、酢酸フェネチル、酢酸ブチル、酢酸ベンジル、酢酸ｌ－メンチル、酢酸リナリル、サリチル酸エチル、サリチル酸メチル、２，３－ジエチル－５－メチルピラジン、シクロヘキシルプロピオン酸アリル、シトラール、シトロネラール、シトロネロール、１，８－シネオール、ジメチルサルファイド、２，３－ジメチルピラジン、２，５－ジメチルピラジン、２，６－ジメチルピラジン、２，６－ジメチルピリジン、ジンゲロール、シンナミルアルコール、シンナムアルデヒド、スピラントール、チモール、デカナール、デカノール、デカン酸エチル、５，６，７，８－テトラヒドロキノキサリン、２，３，５，６－テトラメチルピラジン、テルピネオール、２，３，５－トリメチルピラジン、γ－ノナラクトン、バニリルブチルエーテル、バニリン、パラメチルアセトフェノン、バレルアルデヒド、ヒドロキシシトロネラール、ヒドロキシシトロネラールジメチルアセタール、ピネン、ピペリジン、ピペリン、ピペロナールピラジン、ピロリジン、フェニル酢酸イソアミル、フェニル酢酸イソブチル、フェニル酢酸エチル、２－（３－フェニルプロピル）ピリジン、フェネチルアミン、フェノキシエチルイソブチレート、フェンコン、ブタノール、ブチルアミン、ブチルアルデヒド、フルフラール及びその誘導体、プレゴン、プロパノール、プロピオンアルデヒド、プロピオン酸、プロピオン酸イソアミル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ベンジル、ヘキサン酸、ヘキサン酸アリル、ヘキサン酸エチル、ヘキサナール、ヘキセノール、ヘプタン酸エチル、ペリルアルデヒド、ベンジルアルコール、ベンズアルデヒド、２－ペンタノール、１－ペンテン－３－オール、ｄ－ボルネオール、マルトール、メチルアンスラニレート、Ｎ－メチルアントラニル酸メチル、メチルエピジャスモネート、５－メチルキノキサリン、６－メチルキノリン、５－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタピラジン、メチル β－ナフチルケトン、２－メチルピラジン、２－メチルブタノール、３－メチル－２－ブタノール、２－メチルブチルアルデヒド、３－メチル－２－ブテナール、３－メチル－２－ブテノール、メンチルアセテート、ｌ－メントール等のメントール各異性体、メントン、酪酸、酪酸イソアミル、酪酸エチル、酪酸シクロヘキシル、酪酸ブチル、炭素数４～１２のガンマ及びデルタラクトン、リナリルアセテート、リナロール、リモネンなどが挙げられる。

具体的な精油としては、アニス油、アニススター油、ベルガモット油、メボウキ油、月桂樹葉ウエストインデアン油、ガルバナム油、リンゴ油、アプリコット油、カッシア油、クスノキ剤油、ブチュ葉油、カルダモン種子油、カッシア樹皮油、クモミル花ローマン油、シナモン樹皮油、肉桂葉油、チョウジ蕾み油、コニャックグリーン油、コエンドロ油、クベバ油、ヒメウイキョウ油、ウイキョウ甘油、ニンニク油、ショウガ油、ペチグレイン油、レモン油、ライムオイル、オレンジ油、柑橘油、杉剤油、シトロネラ油、パッチュリ油、ユーカリ油、ベイ油、グレープフルーツ油、マンダリン油、白檀油、杜松実油、ローズ油、イラン油、タンジェリン油、ゼラニウム油、ウィンターグリーン油、クローブ油、タイム油、セージ油、カルダモン油、コリアンダー油、ライム油、柚子油、ラベンダー油、ローズマリー油、ローレル油、シソ油、カモミル油、キャラウェイ油、マジョラム油、セロリ油、ベイ油、オリガナム油、パインニードル油、ネロリ油、ジャスミン油、パチュリ油、パラクレス油、オリスコンクリート、ローズアブソリュート、オレンジフラワーアブソリュート、バニラアブソリュート、パチュリアブソリュート、あるいは、これらの加工処理物（前溜部カット、後溜部カット、分留、液液抽出、エッセンス化、粉末香料化等）などが挙げられる。

本発明の香料組成物は、各種配合剤及び／又は添加剤を含んでもよい。混合できる配合剤及び添加剤としては、特に限定されないが、例えば、抗酸化剤、公知の防腐剤や抗菌剤、ｐＨ調整剤などが挙げられる。前述の配合剤及び添加剤は、それぞれ２種以上を組み合わせて用いることができる。
本発明の香料組成物は、飲食品、医薬品、化粧品、オーラルケア製品などに用いることができる。

Claims

下記式（１）で表されるゲルマクレン。
紅藻類由来のテルペンシクラーゼ（ＴｅｒｐｅｎｅＣｙｃｌａｓｅ）によって産生される酵素反応生成物である、請求項１に記載のゲルマクレン。
請求項１又は２に記載のゲルマクレンを、香料成分として含有することを特徴とする香料組成物。