JP7015360B2 - 多成分試料における物質の構造決定方法 - Google Patents

多成分試料における物質の構造決定方法 Download PDF

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Description

本発明は、多成分試料における物質の構造決定方法に関する。
多成分試料の定性分析は、創薬、食品、化粧品、材料科学などあらゆる産業界で実施されており、研究開発、商品開発における必要不可欠なプロセスである。多成分試料の定性分析は、多成分中から化学物質を分離するステップと分離した化学物質の構造を決定、すなわち分離した化学物質を同定するステップから成り、一般的には容易ではない。化学物質を分離する手法としては、例えばガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動などがある。ＧＣは分離能に優れるが、分析対象試料が熱に安定な揮発性化合物に限定されるという制約を伴い、キャピラリー電気泳動は水溶性のイオン化合物に限定されるという制約を伴う。ＨＰＬＣは分析対象試料の制約が上述の手法に比べて少ないため、多成分試料における化学物質の分離手法として広く普及している。
近年、多成分試料における化学物質の分離手法として超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）が注目されている。ＳＦＣは、移動相に超臨界流体状態の二酸化炭素を用いるため、ＨＰＬＣと比べて移動相に使用する有機溶剤量を圧倒的に削減することが可能で、低炭素社会の実現という社会的ニーズの観点から環境負荷が少ない分離分析手法として注目されている。また、分離能が高く、高速分析が可能であるだけでなく、幅広い極性の化学物質の分離が可能で、ＧＣが得意とする揮発性化合物などの低極性化合物からＨＰＬＣで分析されている高極性化合物まで分離対象とし得る（非特許文献１～３）。さらに、キラルカラムと組み合わせた鏡像異性体の分離分析にも優れる（非特許文献４）。
一方、多成分分析の定性分析における分離した化学物質を同定するステップに関しては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）の場合は、ＥＩ－ＭＳ検出器と組み合わせることで分離した化学物質のＭＳスペクトル情報を得ることができ、検出頻度が高い既知成分についてはＭＳスペクトル情報がライブラリーとして整備されているため、分離した化学物質のＭＳスペクトルをライブラリー登録化合物と比較することで、化学物質の同定が可能なケースも多い。しかし、新規化合物などライブラリーに登録されていない化学物質を同定することはできず、また鏡像異性体の絶対立体配置を決定することもできない。ＨＰＬＣの場合は、一般的にはＡＰＣＩ－ＭＳ検出器やＥＳＩ－ＭＳ検出器を組み合わせるが、イオン化の原理上、測定機種や条件によってフラグメントイオンの生成パターンが異なることから、得られる情報は限定的であり、ＧＣ－ＥＩＭＳのように化学物質の同定を行うことは容易でない。そのため、検出器にＮＭＲを組み合わせたＨＰＬＣ－ＮＭＲ法が実用化されている。感度が低く、移動相に重水素化溶媒が必要になるため、高コストな手法ではあるものの、未知化学物質の構造が推定できる場合もある。これらに対しＳＦＣの場合は、ＥＩ－ＭＳ検出器との組合せ、ＮＭＲとの組合せ、いずれも実用化されておらず、ＧＣやＨＰＬＣに比べると分離した化学物質の同定力に劣る。
このように、様々な化学物質を含む多成分試料の定性分析は、依然として改善の余地を残すものであった。
J. Chromatogr. A, 2012, 1266, 143-148 J. Agric. Food Chem. 2015, 63(18), 4457-4463 J. Chromatogr. A, 2014, 1362, 270-277 Anal. Chim. Acta, 2014, 821, 1-33
本発明は、多成分試料における物質の構造を決定する新規な方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、多成分試料における対象物質の同定方法について鋭意検討を重ねていたところ、超臨界流体クロマトグラフィー（以下、単に「ＳＦＣ」ということがある）と結晶スポンジ（以下、単に「ＣＳ」ということがある）法を併用することで、多成分試料からの対象物質の分離と、分離した物質の同定が可能であること、さらにＭＳやＮＭＲでは不可能である絶対立体配置の決定が可能であること、すなわち鏡像異性体の同定が可能であることを見出した。本発明者らはまた、内径４．６ｍｍ以下のカラムを用いた分析スケールのＳＦＣとＣＳ法を併用して対象物質の絶対立体配置決定を含む構造決定が可能であること、さらには、これに加えて、ＳＦＣの移動相（モディファイア溶媒およびメークアップ溶媒を含む）に用いる溶媒を結晶スポンジ法の実施が可能な溶媒とすることで、ＳＦＣによる分離の工程とＣＳ法による構造決定の工程をオンライン上で連続して実施可能であることを見出した。本発明者らはさらに、ＳＦＣの移動相に用いる溶媒と、その溶媒に対して耐性がある結晶スポンジの組合せを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］２種以上の物質の混合物に含まれる対象物質の構造を決定する方法であって、（Ａ）前記混合物から対象物質を超臨界流体クロマトグラフィーにより分離する工程と、（Ｂ）分離した対象物質を結晶スポンジに浸漬させて結晶構造解析用試料を作製する工程と、（Ｃ）前記結晶構造解析用試料の結晶構造解析を行う工程とを含んでなる、方法。
［２］工程（Ａ）において、超臨界流体クロマトグラフィーの移動相として揮発性溶媒を用いる、上記［１］に記載の方法。
［３］工程（Ａ）の後、かつ、工程（Ｂ）の前に、分離した対象物質から揮発性溶媒を蒸発させる工程をさらに含む、上記［２］に記載の方法。
［４］工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を連続して実施する、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］工程（Ａ）の超臨界流体クロマトグラフィーの移動相に用いる溶媒が、工程（Ｂ）の結晶スポンジへの浸漬に使用可能な溶媒である、上記［４］に記載の方法。
［６］工程（Ａ）を実施する装置と工程（Ｂ）を実施する装置とをシームレスに接続して、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施する、上記［４］または［５］に記載の方法。
［７］前記混合物に含まれる対象物質のオクタノール／水分配係数（ｌｏｇ Ｐｏｗ）が－４．６以上である、上記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記対象物質が鏡像異性体である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
本発明の方法によれば、分析が困難な多成分試料（特に様々な極性物質の混合物）において対象物質の構造（特に絶対立体配置）を迅速かつ正確に決定することができる点で有利である。
図１は、ラセミ体サンプルであるオメプラゾールをＳＦＣで分析した結果（クロマトグラム）を示す。 図２は、図１ピーク１を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図３は、図１ピーク２を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図４は、ＣＳ法で観測された図１ピーク１のゲスト構造を示す。 図５は、ＣＳ法で観測された図１ピーク２のゲスト構造を示す。 図６は、ラセミ体サンプルであるｒａｃ－（４Ｒ，５Ｒ）－３，５－ジヒドロキシ－４－（３－メチルブタ－２－エン－１－イル）－２－（３－メチルブタノイル）シクロペンタ－２－エン－１－オンをＳＦＣで分析した結果（クロマトグラム）を示す。 図７は、図６ピーク１を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図８は、図６ピーク２を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図９は、ＣＳ法で観測された図６ピーク１のゲスト構造を示す。 図１０は、ＣＳ法で観測された図６ピーク２のゲスト構造を示す。 図１１は、ラセミ体サンプルであるｔｒａｎｓ－スチルベンオキサイドをＳＦＣで分析した結果（クロマトグラム）を示す。 図１２は、図１１ピーク１を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図１３は、図１１ピーク２を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図１４は、ＣＳ法で観測された図１１ピーク１のゲスト構造を示す。 図１５は、ＣＳ法で観測された図１１ピーク２のゲスト構造を示す。 図１６は、メタノールに数日間浸漬した後の［ＣｕＢｒ（ｂｔｔ）］タイプの結晶スポンジの結晶構造を示す（左：非対象単位、右：パッキング構造）。 図１７は、位置異性体混合物サンプルをＳＦＣで分析した結果（クロマトグラム）を示す。 図１８は、図１７ピーク１を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図１９は、図１７ピーク２を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図２０は、ＣＳ法で観測された図１７ピーク１のゲスト構造を示す。 図２１は、ＣＳ法で観測された図１７ピーク２のゲスト構造を示す。 図２２は、アセトニトリルに数日間浸漬した後の［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジの結晶構造を示す（左：非対象単位、右：パッキング構造）。 図２３は、立体異性体混合物サンプルをＳＦＣで分析した結果（クロマトグラム）を示す。 図２４は、図２３ピーク１を取り込んだ［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図２５は、図２３ピーク２を取り込んだ［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図２６は、図２３ピーク３を取り込んだ［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図２７は、［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジを用いてＣＳ法で観測された図２３ピーク１のゲスト構造を示す。 図２８は、［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジを用いてＣＳ法で観測された図２３ピーク２のゲスト構造を示す。 図２９は、［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジを用いてＣＳ法で観測された図２３ピーク３のゲスト構造を示す。 図３０は、図２３ピーク１を取り込んだ［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図３１は、図２３ピーク２を取り込んだ［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図３２は、図２３ピーク３を取り込んだ［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図３３は、［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジを用いてＣＳ法で観測された図２３ピーク１のゲスト構造を示す。 図３４は、［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジを用いてＣＳ法で観測された図２３ピーク２のゲスト構造を示す。 図３５は、［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジを用いてＣＳ法で観測された図２３ピーク３のゲスト構造を示す。 図３６は、揮発性化合物の構造異性体混合物サンプルをＳＦＣで分析した結果（クロマトグラム）を示す。 図３７は、図３６ピーク１を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図３８は、図３６ピーク２を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図３９は、ＣＳ法で観測された図３６ピーク１のゲスト構造を示す。 図４０は、ＣＳ法で観測された図３６ピーク２のゲスト構造を示す。 図４１は、揮発性化合物の構造異性体混合物サンプルをＳＦＣで分析した結果（クロマトグラム）を示す。 図４２は、図４１ピーク１を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図４３は、図４１ピーク２を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図４４は、ＣＳ法で観測された図４１ピーク１のゲスト構造を示す。 図４５は、ＣＳ法で観測された図４１ピーク２のゲスト構造を示す。 図４６は、イソプロパノールに数日間浸漬した後の［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジの結晶構造を示す（左：非対象単位、右：パッキング構造）。 図４７は、揮発性ラセミ体サンプルをＳＦＣで分析した結果（クロマトグラム）を示す。 図４８は、図４７ピーク１を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図４９は、図４７ピーク２を取り込んだ結晶スポンジの結晶構造解析結果（非対称単位、溶媒分子は省略）を示す。 図５０は、ＣＳ法で観測された図４７ピーク１のゲスト構造を示す。 図５１は、ＣＳ法で観測された図４７ピーク２のゲスト構造を示す。
発明の具体的説明
本発明は、多成分試料、すなわち、２種以上の物質の混合物に含まれる対象物質の構造を決定する方法である。構造決定の対象となる物質は、工程（Ａ）で分離可能であり、工程（Ｃ）で構造解析が可能である物質であれば特に限定されるものではないが、有機化合物が構造決定の主たる対象となり、ペプチドや核酸なども構造決定の対象となる。
本発明の方法は、（Ａ）２種以上の物質の混合物から対象物質を超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）により分離する工程と、（Ｂ）分離した対象物質を結晶スポンジ（ＣＳ）に浸漬させて結晶構造解析用試料を作製する工程と、（Ｃ）前記結晶構造解析用試料の結晶構造解析を行う工程とを含んでなるものである。
工程（Ａ）では、構造決定の対象物質を混合物からＳＦＣを使用して分離し、対象物質が含まれる溶液を分取する。ＳＦＣ法は揮発性化合物や、疎水性の高い化合物から親水性化合物まで、幅広い極性の物質を分離することができる。ＳＦＣの基本的な操作は公知であり、ＳＦＣや高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で通常行われている手順に従って対象物質の分離ないし分取を行うことができる。またＳＦＣを市販の装置を用いて実施する場合にはその操作手順に従って対象物質の分離ないし分取を行うことができる。
ＳＦＣの移動相は多くの場合、二酸化炭素とともにモディファイアと呼ばれる化合物の分離を調整するための溶媒を添加したものが用いられる。モディファイアには揮発性の有機溶媒、揮発性の酸および揮発性の塩基が用いられることが多い。ＳＦＣで分離された対象物質を分取する際、移動相中の二酸化炭素は気化されるため、モディファイア溶媒に溶解した状態となってフラクションコレクタなどに回収される。メークアップ溶媒は、対象物質がカラムで分離してからフラクションコレクタなどに回収される間に別途添加される溶媒であり、対象物質の溶解性を向上する目的などで添加される。分取された対象物質はモディファイア溶媒に溶解した状態であっても、モディファイア溶媒とメークアップ溶媒の混合溶媒に溶解した状態であってもよい。
工程（Ａ）でＳＦＣに供される混合物は２種以上の物質を含むものであり、２種以上の物質が含まれる限りその形態は特に限定されるものではない。ＳＦＣに供される混合物としては、例えば、食品組成物（飲料組成物を含む）、医薬組成物、ヘルスケア組成物、オーラルケア組成物、香料、天然物（例えば、果実、野菜、香辛料、ハーブなどの食品素材）およびその抽出物、有機合成化合物（例えば、塗料、顔料、農薬、殺虫剤）、生体試料（例えば、血液、尿、唾液、鼻水、生体組織、臓器）、環境試料（例えば、河川水、湖水、海水、土壌）、酵素反応物などが挙げられる。本発明の方法によれば、類似した物質を複数種含む多成分試料に含まれる物質の構造を決定できることから、本発明の方法は類似した物質を複数種含む可能性がある天然物や有機合成化合物に対して好ましくは適用することができる。また、混合物中の対象物質は極性が高い物質であってもよく、例えば、オクタノール／水分配係数（ｌｏｇ Ｐｏｗ）の値が－４．６以上の極性物質を対象物質とすることができる。ここで、オクタノール／水分配比率は、オクタノールと水の２相において、ある化合物がオクタノール相に溶解している濃度と、水に溶解している濃度の比（Ｋｏｗ）として定義され、本明細書ではオクタノール／水分配係数としてＫｏｗの常用対数であるｌｏｇ Ｐｏｗを使用する。
工程（Ｂ）では、工程（Ａ）で分取した対象物質が含まれる溶液を結晶スポンジに浸漬させて結晶構造解析用試料を作製する。ここで結晶スポンジとは、規則正しい細孔構造を有する単結晶であり、例えば、金属有機構造体（ＭＯＦ）、共有結合性有機構造体（ＣＯＦ）、細孔性有機分子結晶（ＰＯＭＣ）、ゼオライトのような無機化合物などから得ることができるが、細孔内に化合物をゲストとして取り込む性質を有する単結晶であれば、その由来について限定されるものではない。金属有機構造体から構成される結晶スポンジとしては、配位性部位を２つ以上有する配位子と中心金属としての金属イオンとを含む三次元ネットワーク構造を有する高分子金属錯体が挙げられる。ここで、「三次元ネットワーク構造」とは、配位子（配位性部位を２つ以上有する配位子およびその他の単座配位子）と金属イオンが結合して形成された構造単位が、三次元的に繰り返されてなる網状の構造をいう。結晶スポンジとして使用可能な金属有機構造体の単結晶は、例えば、Nature 2013, 495, 461-466、Chem. Commun. 2015, 51, 11252-11255、Science 2016, 353, 808-811、Chem. Commun. 2016, 52, 7013-7015、Chem. Asian J. 2017, 12, 208-211、J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 11341-11344、Chem 2017, 3, 281-289、特許第５９６９６１６号などに記載されている。単結晶の調製しやすさなどの汎用性を考慮するとNature 2013, 495, 461-466、Chem. Commun. 2015, 51, 11252-11255などに記載されている［（ＺｎＸ２）３（ｔｐｔ）２・（ｓｏｌｖｅｎｔ）ａ］ｎタイプの結晶スポンジが好適である（ここで、Ｘは、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素などのハロゲン原子を表し、ｔｐｔは２，４，６－トリ（４－ピリジル）－１，３，５－トリアジンを表し、ｓｏｌｖｅｎｔは細孔などに内包された溶媒を表し、ａは０以上の任意の数を表し、ｎは任意の正の整数を表す。以下同様。）。結晶構造解析用試料を調製するために対象物質を結晶スポンジに浸漬させてゲストとして細孔内に取り込ませる方法は、対象物質がゲストとして細孔内に取り込まれる限り、特に限定されるものではない。例えば、IUCrJ 2016, 3, 139-151、Chem. Eur. J. 2017, 23, 15035-15040、CrystEngComm, 2017, 19, 4528-4534、Org. Lett. 2018, 20, 3536-3540、Science 2016, 353, 808-811、Chem. Commun. 2015, 51, 11252-11255などに記載の方法によって対象物質をゲストとして細孔内に取り込ませることができる。
用いる結晶スポンジの種類によっては、水の存在により結晶スポンジ自体の構造が破壊されるため、工程（Ａ）で分離された対象物質を含む試料は、工程（Ｂ）に供するに当たって水分を含まないものとしてもよい。特に様々な化合物をゲストとして取込め、構造決定の実績に優れる［（ＺｎＸ２）３（ｔｐｔ）２・（ｓｏｌｖｅｎｔ）ａ］ｎタイプの結晶スポンジは溶媒として水が含まれる環境では結晶構造が破壊されるため、水の混入は避ける必要がある。前述のようにＳＦＣはその分離手順において揮発性移動相を用いることから、工程（Ａ）で分離された対象物質を含むフラクションは揮発性溶媒を一部または全部蒸発させた後、直ちに工程（Ｂ）の結晶構造解析用試料の作製工程に供することができる点で有利である。
すなわち、本発明の方法では工程（Ａ）において、揮発性溶媒（好ましくは水を含まない揮発性溶媒）をＳＦＣの移動相に用いることが好ましい。本発明の方法ではまた、工程（Ａ）の後、かつ、工程（Ｂ）の前に、分離した対象物質から揮発性溶媒を一部または全部蒸発させる工程を含んでいてもよい。また、工程（Ｂ）では対象物質の濃度を調整するために適宜溶媒を添加してもよい。このような工程を採用することにより、本発明の方法は工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を連続して実施することができる点で有利である。ここで、連続して実施するとは、オフライン上でこれらの操作を連続して実施するのみならず、ＳＦＣを実施する装置とＣＳ法を実施する装置を連結し、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をオンラインで実施することを含む。
前記の連続した実施では、工程（Ａ）のＳＦＣの移動相に用いる溶媒（モディファイア溶媒およびメークアップ溶媒を含む）として、工程（Ｂ）の結晶スポンジへの浸漬に使用可能な溶媒を使用して実施することができる。すなわち、工程（Ａ）の溶媒は、工程（Ｂ）で用いる溶媒と共通のものを用いることができ、あるいは、工程（Ｂ）で用いる溶媒と異なるものを用いる場合には、結晶スポンジに悪影響（結晶スポンジの破壊、溶解など）を及ぼさない溶媒を選択することができる。例えば、後記実施例（例５～２０）で記載するように、結晶スポンジが溶媒に浸った状態のバイアルなどを工程（Ｂ）の前に準備しておき、ＳＦＣ装置で分離された物質をＳＦＣの移動相に用いる溶媒とともにこのバイアルに直接分取してもよい。この場合、工程（Ａ）の後、かつ、工程（Ｂ）の前に、分離した対象物質から揮発性溶媒を一部または全部蒸発させる工程を省略することができることから、工程（Ａ）を実施する装置と工程（Ｂ）を実施する装置をシームレスに接続し、対象物質の構造解析を迅速に実施できる点で有利である。特に揮発性化合物は揮発ロスする性質を有するため、微量サンプルの構造解析が困難であるが、工程（Ａ）を実施する装置と工程（Ｂ）を実施する装置をシームレスに接続し、混合物から分離した解析対象化合物をそのまま結晶スポンジの細孔内に捕捉させることで、揮発ロスすることなく微量サンプルの構造解析が可能な点で極めて有利である。
結晶スポンジに悪影響を与えない溶媒は、例えば、［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２・（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ａ］ｎタイプの結晶スポンジについてはｎ－ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエンなどの炭化水素類、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）などのエーテル類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトン、２－ブタノンなどのケトン類、超臨界、亜臨界、気体または液体状態の二酸化炭素などであり、［ＣｕＢｒ（ｂｔｔ）］タイプの結晶スポンジについては上記炭化水素類、エーテル類、エステル類、ケトン類および二酸化炭素に加えて、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどのアルコール類などであり、［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプおよび［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジについては上記炭化水素類、エーテル類、エステル類、ケトン類、二酸化炭素およびアルコール類に加えて、アセトニトリルなどのニトリル類などである。さらに結晶スポンジに悪影響を与えない上記溶媒は任意の組合せ、割合で混合して用いてもよい。
工程（Ｃ）では、工程（Ｂ）で作製した結晶解析用試料を結晶構造解析することにより、対象物質の分子構造を決定することができる。結晶構造解析には、Ｘ線回折、中性子線回折および電子線回折のいずれの方法も使用することができる。また、測定データの解析、すなわち、対象物質の構造解析は公知の方法に従って実施することができる。例えば、工程（Ｂ）と工程（Ｃ）は国際公開第２０１４／０３８２２０号やIUCrJ 2016, 3, 139-151の記載に従って実施することができる。
本発明の方法によれば、分析が困難な多成分試料において対象物質の構造を迅速かつ正確に決定することができる点で有利である。対象物質が異性体の混合物であっても、それらを分離し、構造を同定し、決定することができる。異性体としては、構造異性体および立体異性体があり、構造異性体には位置異性体などが含まれ、立体異性体には配座異性体および配置異性体が含まれる。また、配置異性体には、鏡像異性体（エナンチオマー）およびジアステレオ異性体（ジアステレオマー）が含まれる。医薬品や機能性表示食品の有効成分あるいは有効成分の候補となる化合物、呈味・香気化合物などは鏡像異性体の一方のみが有効成分として機能する場合があることから、本発明の方法は多成分試料に含まれる化合物の絶対立体配置を迅速かつ正確に決定することができるので非常に有利である。
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
例１：ＳＦＣによるラセミ体サンプルの鏡像異性体分離（１）
例１では、内径１０ｍｍ以上のカラムの使用が適した分取型のＳＦＣ装置を使用してラセミ体サンプルの鏡像異性体分離を行った。
（１）方法
ラセミ体サンプルとして、市販医薬品の有効成分であり、一般試薬として入手可能なオメプラゾール（東京化成工業社）を用いた。オメプラゾール（ラセミ体）をメタノールで１０ｍｇ／ｍＬに調製し、以下の条件で超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）（Waters Thar Supercritical Fluid Chromatography System、Waters社）に供した。
Figure 0007015360000001
（２）結果
上記条件で分析したクロマトグラムの結果は、図１に示す通りであった。オメプラゾールの２種の鏡像異性体を５分以内に分離度：１０．５の高分離度で分離することができた。
例２：ＣＳ法による絶対立体構造決定（１）
例２では、例１で分離、分取したラセミ体化合物の２種の鏡像異性体についてＣＳ法により絶対立体構造の決定を行った。
（１）方法
例１の図１に示す２つのピーク（ピーク１および２）の各成分を分取し、一部（４０μｇ相当）をＶ底型１．２ｍＬバイアルに移し、溶出液であるメタノール（ＭｅＯＨ）を窒素気流下で蒸発させた。その後、結晶スポンジ１粒（大きさを１００μｍ×１００μｍ×１００μｍとし、密度を１．３ｇ／ｃｍ３としたときの理論量：１．３μｇ）をメチル－ｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）およびジメトキシエタン（ＤＭＥ）（体積比９：１）の混合溶媒２０μＬとともに添加した。バイアルに蓋をし、５０℃で１日インキュベートした後、バイアルから結晶スポンジを取り出し、単結晶Ｘ線回折装置（Ｃｕ Ｋα λ＝１．５４１８Å）で測定した。
結晶スポンジはChem. Eur. J.2017,23, 15035-15040に記載の方法に従って作製した、［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２・（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ａ］ｎタイプのものを用いた。結晶スポンジは使用前までｎ－ヘキサン（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）に浸して保存し、使用直前に上記ＭＴＢＥ／ＤＭＥ混合溶媒に置換してから実験に用いた。
測定データは、Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040に記載の方法に従って解析した。
（２）結果
単結晶Ｘ線回折装置による測定と測定データの解析の結果、結晶スポンジに取り込まれたゲスト化合物の構造を観測することができた。例１の図１のピーク１、ピーク２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の結晶データを表２に示す。
Figure 0007015360000002
ピーク１および２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の非対称単位の結晶構造を図２および図３にそれぞれ示す。点線で囲った分子が結晶スポンジに取り込まれたゲストである。また、観測されたゲスト構造のみをそれぞれ図４および図５に示した。これらの結果から、ピーク１の鏡像異性体がオメプラゾールのＳ体、ピーク２がオメプラゾールのＲ体と決定、同定することができた。
例３:ＳＦＣによるラセミ体サンプルの鏡像異性体分離（２）
例３では、内径４．６ｍｍ以下のカラムの使用が適した分析スケールのＳＦＣ装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ ＵＣ（島津製作所社））にフラクションコレクタ（ＦＲＣ－４０ ＳＦ（島津製作所社））を併用してラセミ体サンプルの鏡像異性体分離を行った。
（１）方法
ラセミ体天然物サンプルとして、J. Inst. Brew. 1990, 96, 137-141に記載の方法に従って、ｒａｃ－（４Ｒ，５Ｒ）－３，５－ジヒドロキシ－４－（３－メチルブタ－２－エン－１－イル）－２－（３－メチルブタノイル）シクロペンタ－２－エン－１－オン（rac-(4R,5R)-3,5-dihydroxy-4-(3-methylbut-2-en-1-yl)-2-(3-methylbutanoyl)cyclopent-2-en-1-one）（本化合物は互変異性化により、ｒａｃ－（４Ｒ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（３－メチルブタ－２－エン－１－イル）－２－（３－メチルブタノイル）シクロペンタ－２－エン－１－オン（rac-(4R,5R)-3,4-dihydroxy-5-(3-methylbut-2-en-1-yl)-2-(3-methylbutanoyl)cyclopent-2-en-1-one）の構造をとりうる）を調製した。本ラセミ体化合物をメタノールで８６ｍｇ／ｍＬに調製し、表３の条件でＳＦＣに供した。ＳＦＣ装置はＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ ＵＣ（島津製作所社）を用い、分離した化合物は、フラクションコレクタＦＲＣ－４０ ＳＦ（島津製作所社）により回収した。サンプルの回収効率を上げるために、フラクションコレクタにメークアップ溶媒を一定流量で添加した。
Figure 0007015360000003
（２）結果
上記条件で分析したクロマトグラムの結果は、図６に示す通りであった。本ラセミ体化合物の２種の鏡像異性体を１０分以内に分離度２．０で分離することができた。
例４：ＣＳ法による絶対立体構造決定（２）
例４では、例３で分離、分取したラセミ体化合物の２種の鏡像異性体についてＣＳ法により絶対立体構造の決定を行った。
（１）方法
例３の図６に示す２つのピーク（ピーク１および２）の各成分を分取し、一部（１回の分取量の約１／４０量である５μｇ相当）をＶ底型１．２ｍＬバイアルに移し、溶出液である移動相Ｂとメークアップ溶媒の混合溶液（メタノール、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸から成る）を窒素気流下で蒸発させた。その後、結晶スポンジ１粒（大きさを１００μｍ×１００μｍ×１００μｍとし、密度を１．３ｇ／ｃｍ３としたときの理論量：１．３μｇ）をｎ－ヘキサン５０μＬとともに添加した。バイアルに蓋をし、蓋に注射針を刺して５０℃でインキュベートし、溶媒を緩やかに揮発させた。１日後、バイアルから結晶スポンジを取り出し、単結晶Ｘ線回折装置（Ｃｕ Ｋα λ＝１．５４１８Å）で測定した。
結晶スポンジはChem. Eur. J.2017,23, 15035-15040に記載の方法に従って作製した、［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２・（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ａ］ｎタイプのものを用いた。結晶スポンジは使用前までｎ－ヘキサン（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）に浸して保存した。
測定データは、Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040に記載の方法に従って解析した。
（２）結果
単結晶Ｘ線回折装置による測定と測定データの解析の結果、結晶スポンジに取り込まれたゲスト化合物の構造を観測することができた。例３の図６のピーク１、ピーク２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の結晶データを表４に示す。
Figure 0007015360000004
ピーク１および２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の非対称単位の結晶構造を図７および図８にそれぞれ示す。点線で囲った分子が結晶スポンジに取り込まれたゲストである。また、観測されたゲスト構造のみをそれぞれ図９および図１０に示した。これらの結果から、ピーク１の鏡像異性体が（４Ｓ,５Ｓ）－３,５－ジヒドロキシ－４－（３－メチルブタ－２－エン－１－イル）－２－（３－メチルブタノイル）シクロペンタ－２－エン－１－オン）（(4S,5S)-3,5-dihydroxy-4-(3-methylbut-2-en-1-yl)-2-(3-methylbutanoyl)cyclopent-2-en-1-one）、ピーク２の鏡像異性体が（４Ｒ,５Ｒ）－３，５－ジヒドロキシ－４－（３－メチルブタ－２－エン－１－イル）－２－（３－メチルブタノイル）シクロペンタ－２－エン－１－オン）（(4R,5R)-3,5-dihydroxy-4-(3-methylbut-2-en-1-yl)-2-(3-methylbutanoyl)cyclopent-2-en-1-one）と決定、同定することができた。例３および例４の結果から、分析スケールのＳＦＣ装置を使用した場合であっても、すなわち対象物質の精製量が数十μｇ程度であっても、本発明による方法により対象物質の構造決定が可能であることが確認された。
例５：ＳＦＣによるラセミ体サンプルの鏡像異性体分離（３）
例５では、例３と同様のＳＦＣ装置およびフラクションコレクタを使用し、分離溶媒にはＣＳ法に用いる溶媒と同様のものを使用してラセミ体サンプルの鏡像異性体分離を行った。
（１）方法
ラセミ体サンプルとして、一般試薬として入手可能なｔｒａｎｓ－スチルベンオキサイドのラセミ体（東京化成工業）を用いた。ｔｒａｎｓ－スチルベンオキサイド（ラセミ体）をメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で１０ｍｇ／ｍＬに調製し、表５の条件でＳＦＣに供した。例３と同様に、ＳＦＣ装置はＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ ＵＣ（島津製作所社）を用い、分離した化合物は、フラクションコレクタＦＲＣ－４０ ＳＦ（島津製作所社）により回収した。サンプルの回収効率を上げるために、フラクションコレクタにメークアップ溶媒を一定流量で添加した。
Figure 0007015360000005
上記条件で分析したクロマトグラムの結果は、図１１に示す通りであった。本ラセミ体化合物の２種の鏡像異性体を３分以内に分離度２．４で分離することができた。
例６：ＣＳ法による絶対立体構造決定（３）
例６では、例５で分離、分取したラセミ体化合物の２種の鏡像異性体についてＣＳ法により絶対立体構造の決定を行った。
（１）方法
Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040に記載の方法に従って作製した、［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２・（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ａ］ｎタイプの結晶スポンジ１粒（大きさを１００μｍ×１００μｍ×１００μｍとし、密度を１．３ｇ／ｃｍ３としたときの理論量：１．３μｇ）をＶ底型１．２ｍＬバイアルにｎ－ヘキサンとともに移した。ｎ－ヘキサンを除去し、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を５０μＬ添加し、結晶スポンジ内の溶媒をＭＴＢＥに置換した。このバイアルを複数本用意し、フラクションコレクタにセットした。
例５の図１１に示す２つのピーク（ピーク１および２）の各成分を上述の結晶スポンジが入ったバイアルに直接分取した（各ピーク約１０μｇ）。５０℃で５０μＬ程度まで溶媒を揮発させた後、バイアルに蓋をして、注射針を蓋に刺して５０℃でインキュベートすることで緩やかに残溶媒を揮発させた。１日後、バイアルから結晶スポンジを取り出し、単結晶Ｘ線回折装置（Ｃｕ Ｋα λ＝１．５４１８Å）で測定した。
測定データは、Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040に記載の方法に従って解析した。
（２）結果
単結晶Ｘ線回折装置による測定と測定データの解析の結果、結晶スポンジに取り込まれたゲスト化合物の構造を観測することができた。例５の図１１のピーク１、ピーク２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の結晶データを表６に示す。
Figure 0007015360000006
ピーク１および２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の非対称単位の結晶構造を図１２および図１３にそれぞれ示す。点線で囲った分子が結晶スポンジに取り込まれたゲストである。また、観測されたゲスト構造のみをそれぞれ図１４および図１５に示した。これらの結果から、ピーク１の鏡像異性体がｔｒａｎｓ－スチルベンオキサイドのＲＲ体（（２Ｒ，３Ｒ）－２，３－ジフェニルオキシラン）、ピーク２がｔｒａｎｓ－スチルベンオキサイドのＳＳ体（（２Ｓ，３Ｓ）－２，３－ジフェニルオキシラン）と決定、同定することができた。例５および例６の結果から、結晶スポンジが入ったバイアルにＳＦＣで分離した化合物を直接回収し、結晶スポンジに取り込ませ、構造解析することが可能であることが確認された。
例７：メタノール耐性結晶スポンジの作製
ＳＦＣの分離溶媒としてメタノールを使用する場合には、［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２・（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ａ］ｎタイプの結晶スポンジはメタノール耐性がなくＳＦＣとＣＳ法をシームレスに実施することができなかった。そこで、例７では、メタノールに耐性のある結晶スポンジの作製について検討した。
（１）方法
Chem. Asian J. 2017, 12, 208-211に記載の方法に従って、ベンゼン－１，３，５－トリイルトリイソニコチン酸（ｂｔｔ）とＣｕＢｒから合成した［ＣｕＢｒ（ｂｔｔ）］タイプの結晶スポンジを作製した。この結晶スポンジを数日間メタノールに浸漬した後、その結晶構造を解析した。
（２）結果
Chem. Asian J. 2017, 12, 208-211では、［ＣｕＢｒ（ｂｔｔ）］タイプの結晶スポンジは、メタノールに浸漬するとひび割れし、分析に適した良好な回折が得られないと報告されていた。しかしながら、本発明者らが鋭意検討した結果、本例で作製した［ＣｕＢｒ（ｂｔｔ）］タイプの結晶スポンジは、驚くことにメタノールに数日間浸漬した後であっても、結晶構造を精度よく測定、観測することが可能であることを見出した（図１６）。
例８：ＳＦＣによる位置異性体混合物サンプルの分離
例８では、例３と同様のＳＦＣ装置およびフラクションコレクタを使用し、分離溶媒にはＣＳ法に用いる溶媒と同様のものを使用して位置異性体混合物サンプルの分離を行った。
（１）方法
位置異性体混合物サンプルとして、１－アセチルナフタレン（東京化成工業）および２－アセチルナフタレン（東京化成工業）を用い、メタノール（ＭｅＯＨ）で各化合物が２０ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液を調製し、表７の条件でＳＦＣに供した。例３と同様に、ＳＦＣ装置はＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ ＵＣ（島津製作所社）を用い、分離した化合物は、フラクションコレクタＦＲＣ－４０ ＳＦ（島津製作所社）により回収した。サンプルの回収効率を上げるために、フラクションコレクタにメークアップ溶媒を一定流量で添加した。
Figure 0007015360000007
（２）結果
上記条件で分析したクロマトグラムの結果は、図１７に示す通りであった。本例で用いた位置異性体混合物サンプル（２種の位置異性体化合物）を６分以内に分離することができた。
例９：ＣＳ法による位置異性体構造決定
例９では、例８で分離、分取した２種の位置異性体化合物について、例７で作製した結晶スポンジを用いてＣＳ法により構造決定を行った。
（１）方法
例７で作製した［ＣｕＢｒ（ｂｔｔ）］タイプの結晶スポンジ１粒（大きさを１００μｍ×１００μｍ×１００μｍとし、密度を１．５ｇ／ｃｍ３としたときの理論量：１．５μｇ、使用前までクロロホルム中で保存）をＶ底型１．２ｍＬバイアルにクロロホルムとともに移した。クロロホルムを除去し、メタノールを５０μＬ添加し、結晶スポンジ内の溶媒をメタノールに置換した。このバイアルを複数本用意し、フラクションコレクタにセットした。
例８の図１７に示す２つのピーク（ピーク１および２）の各成分を上述の結晶スポンジが入ったバイアルに直接分取した（各ピーク約１００μｇ）。５０℃で２０μＬ程度まで溶媒を揮発させた後、バイアルに蓋をしてさらに５０℃で４日間インキュベートした。４日後、バイアルから結晶スポンジを取り出し、単結晶Ｘ線回折装置（Ｃｕ Ｋα λ＝１．５４１８Å）で測定した。
測定データは、Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040およびChem. Asian J. 2017, 12, 208-211に記載の方法に準じて解析した。
（２）結果
単結晶Ｘ線回折装置による測定と測定データの解析の結果、結晶スポンジに取り込まれたゲスト化合物の構造を観測することができた。例８の図１７のピーク１、ピーク２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の結晶データを表８に示す。
Figure 0007015360000008
ピーク１および２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の非対称単位の結晶構造を図１８および図１９にそれぞれ示す。点線で囲った分子が結晶スポンジに取り込まれたゲストである。また、観測されたゲスト構造のみをそれぞれ図２０および図２１に示した。これらの結果から、ピーク１の位置異性体が１－アセチルナフタレン、ピーク２の位置異性体が２－アセチルナフタレンと決定、同定することができた。例８および例９の結果から、メタノール耐性のある結晶スポンジを用いることで、結晶スポンジが入ったバイアルにＳＦＣ（移動相にメタノールを含む）で分離した化合物を直接回収し、結晶スポンジに取り込ませ、構造解析することが可能であることが確認された。
例１０：アセトニトリル耐性結晶スポンジの作製
ＳＦＣの分離溶媒としてアセトニトリルを使用する場合には、［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２・（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ａ］ｎタイプの結晶スポンジはアセトニトリル耐性がなくＳＦＣとＣＳ法をシームレスに実施することができなかった。そこで、例１０では、アセトニトリルに耐性のある結晶スポンジの作製について検討した。
（１）方法
J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 12045-12049に記載の方法に従って、４，４’－ビピリジン（ｂｐｙ）、（Ｓ）－マンデル酸（Ｓ－ｍａｎ）または（Ｒ）－マンデル酸（Ｒ－ｍａｎ）と、Ｃｏ（ＮＯ３）２から合成した［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジおよび［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジを作製した。これらの結晶スポンジを数日間アセトニトリルに浸漬した後、その結晶構造を解析した。
（２）結果
［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジおよび［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジは、アセトニトリルに数日間浸漬した後であっても、結晶構造を精度よく測定、観測することが可能であることを見出した（図２２）。
例１１：ＳＦＣによる立体異性体混合物サンプルの分離
例１１では、例３と同様のＳＦＣ装置およびフラクションコレクタを使用し、分離溶媒にはＣＳ法に用いる溶媒と同様のものを使用して立体異性体混合物サンプルの分離を行った。
（１）方法
立体異性体混合物サンプルとして、ＲＲ体とＳＳ体等量混合物のｒａｃ－ヒドロベンゾイン（東京化成工業）およびｍｅｓｏ－ヒドロベンゾイン（東京化成工業）を用い、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）でそれぞれが２０ｍｇ／ｍＬ（ラセミ体として）および１０ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液を調製し、表９の条件でＳＦＣに供した。例３と同様に、ＳＦＣ装置はＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ ＵＣ（島津製作所社）を用い、分離した化合物は、フラクションコレクタＦＲＣ－４０ ＳＦ（島津製作所社）により回収した。サンプルの回収効率を上げるために、フラクションコレクタにメークアップ溶媒を一定流量で添加した。
Figure 0007015360000009
（２）結果
上記条件で分析したクロマトグラムの結果は、図２３に示す通りであった。本例で用いた立体異性体混合物サンプル（３種の立体異性体化合物）を５XX分以内に分離することができた。
例１２：ＣＳ法による立体異性体構造決定（１）
例１２では、例１１で分離、分取した３種の立体異性体化合物について、例１０で作製した［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジを用いてＣＳ法により構造決定を行った。
（１）方法
例１０で作製した［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジ１粒（大きさを１００μｍ×１００μｍ×１００μｍとし、密度を１．４ｇ／ｃｍ３としたときの理論量：１．４μｇ、使用前までクロロホルム中で保存）をＶ底型１．２ｍＬバイアルにクロロホルムとともに移した。クロロホルムを除去し、アセトニトリルを５０μＬ添加し、結晶スポンジ内の溶媒をアセトニトリルに置換した。このバイアルを複数本用意し、フラクションコレクタにセットした。
例１１の図２３に示す３つのピーク（ピーク１、２および３）の各成分を上述の結晶スポンジが入ったバイアルに直接分取した（各ピーク約１００μｇ）。５０℃で２０μＬ程度まで溶媒を揮発させた後、バイアルに蓋をしてさらに５０℃で３日間インキュベートした。３日後、バイアルから結晶スポンジを取り出し、単結晶Ｘ線回折装置（Ｃｕ Ｋα λ＝１．５４１８Å）で測定した。
測定データは、Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040およびJ. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 12045-12049に記載の方法に準じて解析した。
（２）結果
単結晶Ｘ線回折装置による測定と測定データの解析の結果、結晶スポンジに取り込まれたゲスト化合物の構造を観測することができた。例１１の図２３のピーク１、ピーク２、ピーク３として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の結晶データを表１０に示す。
Figure 0007015360000010
ピーク１、２および３として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の非対称単位の結晶構造を図２４、図２５および図２６にそれぞれ示す。点線で囲った分子が結晶スポンジに取り込まれたゲストである。また、観測されたゲスト構造のみをそれぞれ図２７、図２８および図２９に示した。これらの結果から、ピーク１の立体異性体が（Ｓ，Ｓ）－ヒドロベンゾイン、ピーク２の立体異性体がｍｅｓｏ－ヒドロベンゾイン、ピーク３の立体異性体が（Ｒ，Ｒ）－ヒドロベンゾインと決定、同定することができた。例１１および例１２の結果から、アセトニトリルに耐性がある結晶スポンジを用いることで、結晶スポンジが入ったバイアルにＳＦＣ（移動相にアセトニトリルを含む）で分離した化合物を直接回収し、結晶スポンジに取り込ませ、構造解析することが可能であることが確認された。
例１３：ＣＳ法による立体異性体構造決定（２）
例１３では、例１１で分離、分取した３種の立体異性体化合物について、例１０で作製した［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジを用いてＣＳ法により構造決定を行った。
（１）方法
例１２で用いた［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジをその鏡像異性体である［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジに変更したこと以外は例１２と同様の方法で分析、解析を行った。
（２）結果
単結晶Ｘ線回折装置による測定と測定データの解析の結果、結晶スポンジに取り込まれたゲスト化合物の構造を観測することができた。例１１の図２３のピーク１、ピーク２、ピーク３として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の結晶データを表１１に示す。
Figure 0007015360000011
ピーク１、２および３として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の非対称単位の結晶構造を図３０、図３１および図３２にそれぞれ示す。点線で囲った分子が結晶スポンジに取り込まれたゲストである。また、観測されたゲスト構造のみをそれぞれ図３３、図３４および図３５に示した。これらの結果から、ピーク１の立体位置異性体が（Ｓ，Ｓ）－ヒドロベンゾイン、ピーク２の立体異性体がｍｅｓｏ－ヒドロベンゾイン、ピーク３の立体異性体が（Ｒ，Ｒ）－ヒドロベンゾインと決定、同定することができた。例１１および例１３の結果から、アセトニトリル耐性のある結晶スポンジを用いることで、結晶スポンジが入ったバイアルにＳＦＣ（移動相にアセトニトリルを含む）で分離した化合物を直接回収し、結晶スポンジに取り込ませ、構造解析することが可能であることが確認された。
なお、［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジにピーク１を取り込ませた結晶構造と、［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジにピーク３を取り込ませた結晶構造は鏡像の関係にある。同様に、［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジにピーク３を取り込ませた結晶構造と［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジにピーク１を取り込ませた結晶構造は鏡像の関係にある。さらに、［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジにピーク２を取り込ませた結晶構造と、［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジにピーク２を取り込ませた結晶構造も鏡像の関係にある。
例１４：ＳＦＣによる揮発性の構造異性体混合物サンプルの分離（１）
例１４では、例３と同様のＳＦＣ装置およびフラクションコレクタを使用し、分離溶媒にはＣＳ法に用いる溶媒と同様のものを使用して揮発性化合物の構造異性体混合物サンプルの分離を行った。
（１）方法
構造異性体混合物サンプルとして、揮発性の高いモノテルペンである（＋）－イソメントン（東京化成工業）および（－）－イソプレゴール（シグマアルドリッチ）を用い、ＭＴＢＥで各化合物が１０ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液を調製し、表１２の条件でＳＦＣに供した。例３と同様に、ＳＦＣ装置はＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ ＵＣ（島津製作所社）を用い、分離した化合物は、フラクションコレクタＦＲＣ－４０ ＳＦ（島津製作所社）により回収した。サンプルの回収効率を上げるために、フラクションコレクタにメークアップ溶媒を一定流量で添加した。
Figure 0007015360000012
（２）結果
上記条件で分析したクロマトグラムの結果は、図３６に示す通りであった。本例で用いた構造異性体混合物サンプル（２種の揮発性モノテルペン化合物）を７分以内に分離することができた。
例１５：ＣＳ法による絶対立体構造決定
例１５では、例１４で分離、分取した揮発性モノテルペン化合物の２種の構造異性体についてＣＳ法により絶対立体構造の決定を行った。
（１）方法
Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040に記載の方法に従って作製した、［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２・（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ａ］ｎタイプの結晶スポンジ１粒（大きさを１００μｍ×１００μｍ×１００μｍとし、密度を１．３ｇ／ｃｍ３としたときの理論量：１．３μｇ）をＶ底型１．２ｍＬバイアルにｎ－ヘキサンとともに移した。ｎ－ヘキサンを除去し、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を５０μＬ添加し、結晶スポンジ内の溶媒をＭＴＢＥに置換した。このバイアルを複数本用意し、フラクションコレクタにセットした。
例１４の図３６に示す２つのピーク（ピーク１および２）の各成分を上述の結晶スポンジが入ったバイアルに直接分取した（各ピーク約２００μｇ）。５０℃で５０μＬ程度まで溶媒を揮発させた後、バイアルに蓋をして、注射針を蓋に刺して５０℃でインキュベートすることで緩やかに残溶媒を揮発させた。１日後、バイアルから結晶スポンジを取り出し、単結晶Ｘ線回折装置（Ｃｕ Ｋα λ＝１．５４１８Å）で測定した。
測定データは、Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040に記載の方法に従って解析した。
（２）結果
単結晶Ｘ線回折装置による測定と測定データの解析の結果、結晶スポンジに取り込まれたゲスト化合物の構造を観測することができた。例１４の図３６のピーク１、ピーク２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の結晶データを表１３に示す。
Figure 0007015360000013
ピーク１および２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の非対称単位の結晶構造を図３７および図３８にそれぞれ示す。点線で囲った分子が結晶スポンジに取り込まれたゲストである。また、観測されたゲスト構造のみをそれぞれ図３９および図４０に示した。これらの結果から、ピーク１が（＋）－イソメントン（（２Ｒ，５Ｒ）－５－メチル－２－（プロパン－２－イル）シクロヘキサノン）、ピーク２が（－）－イソプレゴール（（１Ｒ，２Ｓ，５Ｒ）－２－イソプロペニル－５－メチルシクロヘキサノール）と決定、同定することができた。例１４および例１５の結果から、結晶スポンジが入ったバイアルにＳＦＣで分離した揮発性化合物を直接回収し、結晶スポンジに取り込ませ、構造解析することが可能であることが確認された。
例１６：ＳＦＣによる揮発性の構造異性体混合物サンプルの分離（２）
例１６では、例３と同様のＳＦＣ装置およびフラクションコレクタを使用し、分離溶媒にはＣＳ法に用いる溶媒と同様のものを使用して揮発性化合物の構造異性体混合物サンプルの分離を行った。
（１）方法
構造異性体混合物サンプルとして、揮発性セスキテルペンである（＋）－β－ユーデスモール（富士フイルム和光純薬）および（－）－α－ビサボロール（シグマアルドリッチ）を用い、ＭＴＢＥで各化合物が１０ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液を調製し、表１４の条件でＳＦＣに供した。例３と同様に、ＳＦＣ装置はＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ ＵＣ（島津製作所社）を用い、分離した化合物は、フラクションコレクタＦＲＣ－４０ ＳＦ（島津製作所社）により回収した。サンプルの回収効率を上げるために、フラクションコレクタにメークアップ溶媒を一定流量で添加した。
Figure 0007015360000014
（２）結果
上記条件で分析したクロマトグラムの結果は、図４１に示す通りであった。本例で用いた構造異性体混合物サンプル（２種の揮発性セスキテルペン化合物）を９分以内に分離することができた。
例１７：ＣＳ法による絶対立体構造決定
例１７では、例１６で分離、分取した揮発性セスキテルペン化合物の２種の構造異性体についてＣＳ法により絶対立体構造の決定を行った。
（１）方法
Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040に記載の方法に従って作製した、［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２・（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ａ］ｎタイプの結晶スポンジ１粒（大きさを１００μｍ×１００μｍ×１００μｍとし、密度を１．３ｇ／ｃｍ３としたときの理論量：１．３μｇ）をＶ底型１．２ｍＬバイアルにｎ－ヘキサンとともに移した。ｎ－ヘキサンを除去し、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を５０μＬ添加し、結晶スポンジ内の溶媒をＭＴＢＥに置換した。このバイアルを複数本用意し、フラクションコレクタにセットした。
例１６の図４１に示す２つのピーク（ピーク１および２）の各成分を上述の結晶スポンジが入ったバイアルに直接分取した（各ピーク約２００μｇ）。５０℃で５０μＬ程度まで溶媒を揮発させた後、バイアルに蓋をして、注射針を蓋に刺して５０℃でインキュベートすることで緩やかに残溶媒を揮発させた。１日後、バイアルから結晶スポンジを取り出し、単結晶Ｘ線回折装置（Ｃｕ Ｋα λ＝１．５４１８Å）で測定した。
測定データは、Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040に記載の方法に従って解析した。
（２）結果
単結晶Ｘ線回折装置による測定と測定データの解析の結果、結晶スポンジに取り込まれたゲスト化合物の構造を観測することができた。例１６の図４１のピーク１、ピーク２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の結晶データを表１５に示す。
Figure 0007015360000015
ピーク１および２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の非対称単位の結晶構造を図４２および図４３にそれぞれ示す。点線で囲った分子が結晶スポンジに取り込まれたゲストである。また、観測されたゲスト構造のみをそれぞれ図４４および図４５に示した。これらの結果から、ピーク１が（＋）－β－ユーデスモール（（３Ｒ，４ａＳ）－デカヒドロ－５－メチレン－α，α，８ａβ－トリメチル－３β－ナフタレンメタノール）、ピーク２が（－）－α－ビサボロール（（２Ｓ）－６－メチル－２－［（１Ｓ）－４－メチルシクロヘキサ－３－エン－１－イル］ヘプタ－５－エン－２－オール）と決定、同定することができた。例１６および例１７の結果から、結晶スポンジが入ったバイアルにＳＦＣで分離した揮発性化合物を直接回収し、結晶スポンジに取り込ませ、構造解析することが可能であることが確認された。
例１８：イソプロパノール耐性結晶スポンジの作製
ＳＦＣの分離溶媒としてイソプロパノールを使用する場合には、［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２・（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ａ］ｎタイプの結晶スポンジはイソプロパノール耐性がなくＳＦＣとＣＳ法をシームレスに実施することができなかった。そこで、例１８では、イソプロパノールに耐性のある結晶スポンジの作製について検討した。
（１）方法
J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 12045-12049に記載の方法に従って、４，４’－ビピリジン（ｂｐｙ）、（Ｓ）－マンデル酸（Ｓ－ｍａｎ）または（Ｒ）－マンデル酸（Ｒ－ｍａｎ）と、Ｃｏ（ＮＯ３）２から合成した［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジおよび［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジを作製した。これらの結晶スポンジを数日間イソプロパノールに浸漬した後、結晶構造を解析した。
（２）結果
［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジおよび［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジは、イソプロパノールに数日間浸漬した後であっても、結晶構造を精度よく測定、観測することが可能であることを見出した（図４６）。
例１９：ＳＦＣによる揮発性ラセミ体の鏡像異性体分離
例１９では、例３と同様のＳＦＣ装置およびフラクションコレクタを使用し、分離溶媒にはＣＳ法に用いる溶媒と同様のものを使用して揮発性ラセミ体の鏡像異性体分離を行った。
（１）方法
揮発性ラセミ体サンプルとして、揮発性モノテルペンラセミ体であるｒａｃ－テルピネン－４－オール（富士フイルム和光純薬）を用い、イソプロパノールで２０ｍｇ／ｍＬに調製し、表１６の条件でＳＦＣに供した。例３と同様に、ＳＦＣ装置はＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ ＵＣ（島津製作所社）を用い、分離した化合物は、フラクションコレクタＦＲＣ－４０ ＳＦ（島津製作所社）により回収した。サンプルの回収効率を上げるために、フラクションコレクタにメークアップ溶媒を一定流量で添加した。
Figure 0007015360000016
（２）結果
上記条件で分析したクロマトグラムの結果は、図４７に示す通りであった。揮発性モノテルペンラセミ体化合物の２種の鏡像異性体を５分以内に分離することができた。
例２０：ＣＳ法による絶対立体構造決定
例２０では、例１９で分離、分取した鏡像異性体化合物について、例１８で作製した結晶スポンジを用いてＣＳ法により絶対立体構造決定を行った。
（１）方法
例１８で作製した［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプの結晶スポンジ１粒（大きさを１００μｍ×１００μｍ×１００μｍとし、密度を１．４ｇ／ｃｍ３としたときの理論量：１．４μｇ、使用前までクロロホルム中で保存）をＶ底型１．２ｍＬバイアルにクロロホルムとともに移した。クロロホルムを除去し、イソプロパノールを５０μＬ添加し、結晶スポンジ内の溶媒をイソプロパノールに置換した。このバイアルを複数本用意し、フラクションコレクタにセットした。
例１９の図４７に示す２つのピーク（ピーク１および２）の各成分を上述の結晶スポンジが入ったバイアルに直接分取した（各ピーク約２００μｇ）。窒素気流下で緩やかに溶媒を５０μＬ程度まで揮発させた後、バイアルに蓋をして５０℃で３日間インキュベートした。３日後、バイアルから結晶スポンジを取り出し、単結晶Ｘ線回折装置（Ｃｕ Ｋα λ＝１．５４１８Å）で測定した。
測定データは、Chem. Eur. J.2017,23, 15035-15040およびJ. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 12045-12049に記載の方法に準じて解析した。
（２）結果
単結晶Ｘ線回折装置による測定と測定データの解析の結果、結晶スポンジに取り込まれたゲスト化合物の構造を観測することができた。例１９の図４７のピーク１、ピーク２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の結晶データを表１７に示す。
Figure 0007015360000017
ピーク１および２として溶出される化合物を取り込ませた結晶スポンジを解析した際の非対称単位の結晶構造を図４８および図４９にそれぞれ示す。点線で囲った分子が結晶スポンジに取り込まれたゲストである。また、観測されたゲスト構造のみをそれぞれ図５０および図５１に示した。これらの結果から、ピーク１の鏡像異性体がＳ－テルピネン－４－オール（（４Ｓ）－４－イソプロピル－１－メチル－１－シクロヘキセン－４－オール）、ピーク２の鏡像異性体がＲ－テルピネン－４－オール（（４Ｒ）－４－イソプロピル－１－メチル－１－シクロヘキセン－４－オール）と決定、同定することができた。例１８、１９および例２０の結果から、イソプロパノール耐性の結晶スポンジを用いることで、結晶スポンジが入ったバイアルにＳＦＣ（移動相にイソプロパノールを含む）で分離した揮発性化合物を直接回収し、結晶スポンジに取り込ませ、構造解析することが可能であることが確認された。
例２１：イソプロパノールを窒素気流化で除去した場合の、従来の結晶スポンジを使用したＣＳ法による絶対立体構造決定
イソプロパノールは［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２］ｎタイプの結晶スポンジを破壊してしまう。そこで、例２１では、分取液に含まれるイソプロパノールを窒素気流化により除去する工程を含めた場合に、揮発性化合物のＣＳ法による絶対立体構造決定が可能か検討した。具体的には、次の手順で行った。
まず、フラクションコレクタに空のバイアルをセットし、例１９の図４７に示す２つのピーク（ピーク１および２）の各成分をそこに分取した（各ピーク約２００μｇ）。分取液に含まれるイソプロパノールを窒素気流化で除去した後（イソプロパノールは［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２］ｎタイプの結晶スポンジを破壊してしまう）、［（ＺｎＣｌ２）３（ｔｐｔ）２］ｎタイプの結晶スポンジをＭＴＢＥ５０μＬとともに添加した。バイアルに蓋をして、注射針を蓋に刺して５０℃でインキュベートすることで緩やかに残溶媒を揮発させた。１日後、バイアルから結晶スポンジを取り出し、単結晶Ｘ線回折装置（Ｃｕ Ｋα λ＝１．５４１８Å）で測定したが、解析対象化合物を観測することができなかった。その要因として、イソプロパノールを分取液から除去する工程で揮発性解析対象化合物も失われてしまったためではないかと考えられた。
したがって、例１８、１９および２０の結果が示すように、ＳＦＣとＣＳ法をシームレスに実施することは、微量揮発性化合物を解析する場合に特に有利であることが確認された。

Claims (8)

  1. ２種以上の物質の混合物に含まれる対象物質の構造を決定する方法であって、（Ａ）前記混合物から対象物質を超臨界流体クロマトグラフィーにより分離する工程と、（Ｂ）分離した対象物質を結晶スポンジに浸漬させて結晶構造解析用試料を作製する工程と、（Ｃ）前記結晶構造解析用試料の結晶構造解析を行う工程とを含んでなり、工程（Ｂ）において、工程（Ａ）で分離した対象物質を含む前記超臨界流体クロマトグラフィーの移動相の溶媒を結晶スポンジに浸漬させて、対象物質を結晶スポンジの細孔内に捕捉させることにより、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を連続して実施するものであり、前記対象物質が揮発性化合物であり、前記超臨界流体クロマトグラフィーの移動相の溶媒が水を含まない揮発性溶媒である、方法。
  2. 工程（Ａ）を実施する装置と工程（Ｂ）を実施する装置とを連結して工程（Ａ）および工程（Ｂ）を実施する、請求項１に記載の方法。
  3. ２種以上の物質の混合物に含まれる対象物質の構造を決定する方法であって、（Ａ）前記混合物から対象物質を超臨界流体クロマトグラフィーにより分離する工程と、（Ｂ）分離した対象物質を結晶スポンジに浸漬させて結晶構造解析用試料を作製する工程と、（Ｃ）前記結晶構造解析用試料の結晶構造解析を行う工程とを含んでなり、工程（Ｂ）において、工程（Ａ）で分離した対象物質を含む前記超臨界流体クロマトグラフィーの移動相の溶媒を結晶スポンジに浸漬させて、対象物質を結晶スポンジの細孔内に捕捉させることにより、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を連続して実施するものであり、前記超臨界流体クロマトグラフィーの移動相の溶媒が少なくともメタノール、エタノール、アセトニトリル、イソプロパノールおよびメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルからなる群から選択される１種または２種以上を含むものである（但し、前記超臨界流体クロマトグラフィーの移動相の溶媒は水を含まない）、方法。
  4. 前記結晶スポンジが、［（ＺｎＸ２）３（ｔｐｔ）２・（ｓｏｌｖｅｎｔ）ａ］ｎタイプ（ここで、Ｘは、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素などのハロゲン原子を表し、ｔｐｔは２，４，６－トリ（４－ピリジル）－１，３，５－トリアジンを表し、ｓｏｌｖｅｎｔは細孔に内包された溶媒を表し、ａは０以上の任意の数を表し、ｎは任意の正の整数を表す）、［ＣｕＢｒ（ｂｔｔ）］タイプ（ここで、ｂｔｔはベンゼン－１，３，５－トリイルトリイソニコチン酸を表す）、［Ｃｏ２（Ｒ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプ（ここで、Ｒ－ｍａｎは（Ｒ）－マンデル酸を表し、ｂｐｙは４，４’－ビピリジンを表す）および［Ｃｏ２（Ｓ－ｍａｎ）２（ｂｐｙ）３］（ＮＯ３）２タイプ（ここで、Ｓ－ｍａｎは（Ｓ）－マンデル酸を表し、ｂｐｙは４，４’－ビピリジンを表す）からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記超臨界流体クロマトグラフィーに用いるカラムの内径が４．６ｍｍ以下である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記工程（Ａ）を実施する装置と前記工程（Ｂ）を実施する装置とをシームレスに接続して、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記混合物に含まれる対象物質のオクタノール／水分配係数（ｌｏｇ Ｐｏｗ）が－４．６以上である、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記対象物質が鏡像異性体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
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