JP2023176975A

JP2023176975A - 免疫賦活性マクロファージ誘導剤、癌微小環境改善剤、癌アポトーシス誘導剤及び免疫賦活性マクロファージ誘導方法

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Publication number: JP2023176975A
Application number: JP2022089606A
Authority: JP
Inventors: 沙智田中; Sachi Tanaka; 泰瑛邱; Tai-Ying Chiou; 楓香高橋; Fuka Takahashi; 美奈子塚元; Minako Tsukamoto; 知也高橋; Tomoya Takahashi
Original assignee: Arsoa Keio Group Corp; Shinshu University NUC
Current assignee: Arsoa Keio Group Corp; Shinshu University NUC
Priority date: 2022-06-01
Filing date: 2022-06-01
Publication date: 2023-12-13
Anticipated expiration: 2042-06-01
Also published as: JP7284467B1; TW202348241A; TWI838991B

Abstract

【課題】アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体及び菌体処理物が有する新規な性質を明らかにし、これに基づいて新たな用途を提供する。【解決手段】アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を有効成分として含有する免疫賦活性マクロファージ誘導剤、癌微小環境改善剤及び癌アポトーシス誘導剤。【選択図】図１

Description

本発明は、乳酸菌であるアピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を含有する免疫賦活性マクロファージ誘導剤、癌微小環境改善剤及び癌アポトーシス誘導剤に関する。

従来から、乳酸菌やその発酵生産物が様々な生理機能を有することが知られている。例えば、野菜黒糖発酵液から単離されたフラクトフィリックな乳酸菌であるアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株は、優れたＩｇＡ産生促進作用（ひいては免疫賦活作用）を有することが知られている（特許文献１参照。なお、近年ラクトバチルス属の再分類が行われ、旧ラクトバチルス属に属する多くの乳酸菌の名称が変更された。特許文献１における「ラクトバチルス・コーソイ」は本明細書における「アピラクトバチルスコウソイ」と同じものを指している。）。

特開２０２０－９２７０４号公報

特許文献１に記載のアピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株は、他の乳酸菌に対して比較的小さなゲノムを有するとともに、グルコースの資化能が低く、フラクトースを好適な炭素源として資化するという特徴を有する。この菌株は、腸管粘膜においてＩｇＡの産生を促進し、優れた免疫賦活作用を有することが開示されているものの、その他の作用については明らかではない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株が有する新規な性質を明らかにし、これに基づいて新たな用途を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために本発明者らは、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の新たな有用性について鋭意検討した結果、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の菌体及び菌体処理物が免疫賦活性マクロファージ誘導作用、癌微小環境改善作用及び癌アポトーシス誘導作用を有することを見出して本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。

（１）アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を有効成分として含有する免疫賦活性マクロファージ誘導剤。
（２）飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である上記（１）に記載の免疫賦活性マクロファージ誘導剤。
（３）アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を有効成分として含有する癌微小環境改善剤。
（４）飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である上記（３）に記載の癌微小環境改善剤。
（５）アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を有効成分として含有する癌アポトーシス誘導剤。
（６）飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である上記（５）に記載の癌アポトーシス誘導剤。
（７）ヒトまたは非ヒト動物における免疫賦活性マクロファージ誘導用、癌微小環境改善用又は癌アポトーシス誘導用の医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物を製造するための、アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物の使用。

本発明によれば、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株が有する新規な用途として、この菌体又は菌体処理物を含む免疫賦活性マクロファージ誘導剤、癌微小環境改善剤及び癌アポトーシス誘導剤を提供することができる。

１０Ｈ株死菌体による免疫賦活性マクロファージの誘導作用を示す棒グラフである。１０Ｈ株死菌体による免疫抑制性マクロファージの抑制作用を示す棒グラフである。水溶性抽出物による免疫賦活性マクロファージの誘導作用を示す棒グラフである。水溶性抽出物による免疫抑制性マクロファージの抑制作用を示す棒グラフである。油溶性抽出物による免疫賦活性マクロファージの誘導作用を示す棒グラフである。油溶性抽出物による免疫抑制性マクロファージの抑制作用を示す棒グラフである。１０Ｈ株死菌体による癌アポトーシスの誘導作用を示す棒グラフである。

次に、本発明の実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。

（Ｉ）アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株
本発明の一実施形態における有効成分は、野菜黒糖発酵液から単離された特定の乳酸菌株及びその変異株の菌体又は菌体処理物である。好ましくは、商品名「ジオリナ（登録商標）酵素」に配合する野菜黒糖発酵液から得られるアピラクトバチルス属に属する菌の菌体又は菌体処理物であり、より好ましくは、アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株又はその変異株の菌体又は菌体処理物である。「変異株」とは、特定の菌株に対し、当業者に周知の方法により当業者がその主要な性質に変化を及ぼさない範囲で変異させたもの、あるいは、それと同等であると当業者が確認できるものを包含する意味である。

なお、アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株（寄託当時は「ラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株」）は、平成３０年（２０１８年）１１月７日（原寄託日）付で独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、１２２号室）に寄託されている。受託番号は、ＮＩＴＥＢＰ－０２８１１である（以下、本菌株を単に「１０Ｈ株」と称することもある。）。また、当該１０Ｈ株の分類学的性質は、本発明者らにより公表された論文（ＣｈｉｏｕＴ－Ｙｅｔａｌ．，ＡｎｔｏｎｉｅｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ（２０１８）、１１１：１１４９－１１５６）及び特許文献１に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれるものとする。

（アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の特徴）
本菌株は、最近発見されたフラクトフィリック乳酸菌（ＦＬＡＢ：Ｆｒｕｃｔｏｐｈｉｌｉｃｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ）として、従来の乳酸菌から進化した細菌であると考えられる（Ｆｉｌａｎｎｉｎｏｅｔａｌ．“Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｒｉｃｈｎｉｃｈｅｓｔｒａｃｅｄｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｔｏｗａｒｄｆｒｕｃｔｏｐｈｉｌｉｃｓｐｅｃｉｅｓ”ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．４５、Ｎｏ．１、２０１９、ｐｐ．６５－８１）。ＦＬＡＢは、花や果物、発酵食品、またフラクトースを主食とする昆虫の消化管など、フラクトースが豊富な環境に生息している。ＦＬＡＢは、グルコースではなくフラクトースを炭素源として好むヘテロ発酵性の乳酸菌であるが、酸素などの電子受容体基質を追加することで、グルコース存在下での生育が促進されるといわれている。１０Ｈ株は、他のＦＬＡＢ及び乳酸菌に比べて比較的小さなゲノムサイズと低いＧＣ含量を有する（Ｆｉｌａｎｎｉｎｏｅｔａｌ．のＦｉｇｕｒｅ３参照）。

本明細書における「菌体」には、生菌体と死菌体との両方を含む。菌体は凍結物や乾燥物であってもよい。また、本明細書における「菌体処理物」とは、菌体を破壊する処理や菌体から成分を抽出する処理を実施して得られる、菌体由来の成分を含有するもののことをいう。菌体処理物には、菌体を物理的手段により処理して得られる細胞質や細胞壁画分のように菌体の一部又は全部を含有するものだけでなく、菌体からの抽出物（後述する実施例２参照。）のように菌体自体は含有していないものも含まれる。

（ＩＩ）免疫賦活性マクロファージ誘導剤、癌微小環境改善剤及び癌アポトーシス誘導剤
本明細書において「免疫賦活性マクロファージ誘導剤」とは、免疫抑制性マクロファージ（Ｍ２型マクロファージ）を免疫賦活性マクロファージ（Ｍ１型マクロファージ）に誘導するもののことをいう。マクロファージは白血球の一種であり、動物の感染防御機構において重要な役割を担う細胞である。通常、マクロファージは癌細胞を攻撃する、アポトーシスを誘導するなどの抗腫瘍作用を有する免疫賦活性マクロファージとして機能する。一方で、癌細胞が発生し増加すると、マクロファージは癌局所に誘引され、癌細胞から分泌される免疫抑制性マクロファージ誘導因子（ＩＬ－６、ＩＬ－１０等）により免疫抑制性マクロファージに分化する。免疫抑制性マクロファージは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現による血管新生の促進等により、さらに癌細胞が増殖しやすい環境を形成する。このため、癌細胞の増殖抑制には、免疫賦活性マクロファージの誘導及び免疫抑制性マクロファージの抑制（低減）が重要であると考えられる。

本発明の免疫賦活性マクロファージ誘導剤は、有効成分としてアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を含有する。当該菌体及び当該菌体処理物は、後述する実施例３に示すように、免疫賦活性マクロファージの誘導作用及び免疫抑制性マクロファージの抑制作用を有する。

本明細書において「癌微小環境改善剤」とは、癌細胞周囲の環境である癌微小環境を、癌細胞の増殖を抑制できる方向に改善するもののことをいう。本発明の癌微小環境改善剤は、有効成分としてアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を含有する。当該菌体及び当該菌体処理物は、後述する実施例３に記載するように、免疫賦活性マクロファージの誘導及び免疫抑制性マクロファージの抑制を通じて癌微小環境改善作用を発揮すると考えられる。

本明細書において「癌アポトーシス誘導剤」とは、癌細胞のアポトーシスを誘導するもののことをいう。本発明の癌アポトーシス誘導剤は、有効成分としてアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を含有する。当該菌体及び当該菌体処理物は、後述する実施例４に示すように、免疫賦活性マクロファージの誘導作用及び免疫抑制性マクロファージの抑制作用を通じて癌アポトーシス誘導作用を発揮すると考えられる。

（ＩＩＩ）飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物
（有効成分組成物）
本実施形態の免疫賦活性マクロファージ誘導剤、癌微小環境改善剤及び癌アポトーシス誘導剤は、飲食品、医薬品又は飼料に配合する有効成分組成物の形態で用いることができる。有効成分組成物として用いる場合には、有効成分である１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物をそのまま用いることもできるし、１０Ｈ株の培養・発酵液（培養上清含む）やそれらの粗精製品あるいは精製品も用いることができる。また、有効成分が菌体処理物である場合には、菌体の処理に用いた物質（例えば、抽出溶媒）を含有しているものも有効成分組成物として用いることができる。

また、菌体は生菌体のみならず、加熱滅菌操作等によって滅菌されたもの（死菌体）であってもよい。１０Ｈ株は高糖濃度（高浸透圧）という過酷な生育条件において生育することから、強固な細胞表層構造を有すると考えられる。１０Ｈ株を加熱処理により死菌体とする場合の条件は、好ましくは６５～８５℃で１分以上、例えば、１０分、３０分又は６０分程度とすることができ、より好ましくは７０～７５℃で、１分以上、例えば、５分、１０分又は３０分程度とすることができる。後述する実施例において説明するように、加熱処理された菌体であっても、免疫賦活性マクロファージ誘導作用、癌微小環境改善作用及び癌アポトーシス誘導作用が期待できる。また、生菌の場合、製品製造以降の配送時や陳列時に形態変化を起こす可能性があるため、それ以上形態変化を起こさない加熱滅菌した死菌体は好適に使用できる。

また、本実施形態の有効成分組成物中には、必要に応じて更に、１０Ｈ株の維持、増殖等に適した栄養成分の適量を含有させることができる。該栄養成分の具体例としては、微生物の培養のための培養培地に利用される、例えばフラクトース、グルコース、ソルボース、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、ラクチュロース、スクロース等の炭素源、例えば酵母エキス、ペプトン等の窒素源、ビタミン類、ミネラル類、微量金属元素、その他の栄養成分等の各成分を挙げることができる。ビタミン類としては、例えばビタミンＢ、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等を例示できる。微量金属元素としては、例えば亜鉛、セレン等を例示できる。その他の栄養成分としては、例えば乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖等の各種オリゴ糖を例示できる。これらのオリゴ糖の配合量は、特に限定されるものではないが、通常本実施形態の組成物中に１～３０重量％程度となる量範囲から選ばれるのが好ましい。

本実施形態の有効成分組成物中への１０Ｈ株の配合量は、一般には、組成物１００ｇ中に、菌数が１０^８～１０^１３個前後（生菌数である必要はない。）となる量から適宜選択することができる。生菌数の測定は、１０％フラクトースを含むＭＲＳ液体培地を用いた限界希釈培養法により求めることが出来る。この生菌数と濁度とは相関するため、予め生菌数と濁度との相関を求めておくと、生菌数の測定に代えて濁度を測定することによって上記生菌数を計数できる。本実施形態の有効成分組成物は、適当な可食性担体（食品素材）、製薬上許容される担体等の適宜の配合を経て、後述するような飲食品、医薬品等の形態に調製されることが好ましい。

（医薬品）
本実施形態の免疫賦活性マクロファージ誘導剤、癌微小環境改善剤及び癌アポトーシス誘導剤を医薬品の形態とする場合は、有効成分である１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物と共に製剤学的に許容される適当な製剤担体を用いて医薬組成物の形態に調製されて実用される。当該製剤担体としては、通常この分野で使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を例示できる。

医薬品の投与単位形態としては、各種の形態が選択できるが、好適には経口投与用製剤が挙げられる。経口投与製剤の代表的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられる。

錠剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤等を使用できる。錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることもできるし、二重錠又は多層錠とすることもできる。

丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。

更に、医薬品中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させることもできる。

本実施形態の医薬品の投与方法には特に制限がなく、製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。また、その投与量は、用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択されるが、通常、上記有効成分組成物が１日当り体重１ｋｇ当り約０．５～１００ｍｇ程度とするのがよいと考えられる。医薬品は、１日に１～４回に分けてヒトに投与することができる。

（飲食品）
本明細書における「飲食品」とは、専ら飲食のために経口的に用いられる形態のもの全てを含み（例えば、飲料も含む）、錠剤等の形態のものであっても、専ら飲食のために用いられる限りにおいては、本明細書における飲食品に含まれる。例えば、健康食品、健康補助食品、病者用食品、栄養補助食品、あるいは、厚生労働省の定める保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）も、本明細書における飲食品に含まれる。健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等を目的とした食品のことをいう。

本実施形態の免疫賦活性マクロファージ誘導剤、癌微小環境改善剤及び癌アポトーシス誘導剤を飲食品とする場合は、例えば発酵乳、乳酸菌飲料、発酵野菜飲料、発酵果実飲料、発酵豆乳飲料等を挙げることができる。「発酵乳」とは、乳又は乳製品を乳酸菌又は酵母で発酵させた糊状又は液状にしたものをいう。従って該発酵乳には飲料形態と共にヨーグルト形態が包含される。また「乳酸菌飲料」とは、乳又は乳製品を乳酸菌又は酵母で発酵させた糊状又は液状にしたものを主原料としてこれを水に薄めた飲料をいう。

他の飲食品形態の例としては、漬物、味噌、発酵茶、パン等の発酵食品、離乳食、粉ミルク、ベビーフード等の乳児用食品、発泡製剤、ガム、グミ、プディング等の菓子類、麺類、カプセル、顆粒、粉末、錠剤等の栄養補助食品等、前記発酵乳及び乳酸菌飲料以外の乳製品等を挙げることができる。

本実施形態による飲食品における有効成分組成物の含有量は特に限定されるものではなく、適宜決定できる。免疫賦活性マクロファージ誘導、癌微小環境改善及び癌アポトーシス誘導の効果を奏する観点から、それぞれの飲食品の全質量に対して、例えば、０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がより好ましい。一方、飲食品中における有効成分組成物の含有量の上限は特に制限されず、通常は、飲食品の形態に合わせて適宜調整することができる。

（飼料）
本実施形態の免疫賦活性マクロファージ誘導剤、癌微小環境改善剤及び癌アポトーシス誘導剤を飼料の形態とする場合には、例えば、経口投与用製剤形態（水溶液、乳化液、顆粒、粉末、カプセル、錠剤等）とすることができる。

［実施例］
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。以下の実施例において、各種成分の添加量等を示す数値の単位％は、特記がない場合には質量％を意味する。

［実施例１］アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の培養及び死菌体調製
アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の株式会社アルソア慧央グループ保存菌株を、１０％（ｗ／ｖ）Ｄ（－）－フラクトース（富士フイルム和光純薬株式会社）添加ＭＲＳ培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、５００ｍＬメジュームビン（ＡＧＣテクノグラス株式会社）の密栓状態にて、３０℃、４８時間静置培養した。培養終了後、培養液を遠心分離機（久保田商事株式会社、６８００型）にて８０００ｒｐｍ、２０分間処理することでＭＲＳ培地を除去し、菌体ペーストを得た。得られた菌体ペーストに対し、ＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．）への懸濁及び遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）を３度繰り返すことで洗浄菌体ペーストを得た。洗浄菌体ペーストの一部を７０℃、３０分のオートクレーブ処理により死菌体とし、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社、ＦＤＵ－２２００）にて凍結乾燥した。後述する実施例３及び実施例４においては、死菌体懸濁液として、１０Ｈ株の死菌体を４０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳに懸濁したものを用いた。

［実施例２］アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の抽出物（菌体処理物）の調製
実施例１で得られた１０Ｈ株の洗浄菌体ペーストのうち１９ｍｇを、１００μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（富士フイルム和光純薬株式会社、ｐＨ＝４．７）に懸濁してイージービーズ（エーエムアール株式会社、７６８１３Ｍ）に移し、ボルテックスミキサー（エムエス機器株式会社）で２分３０秒処理した。その後、１００μＬのｎ－ブタノール（富士フイルム和光純薬株式会社）を添加し、３０分間ボルテックスミキサーにて破砕した。さらに１００μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝４．７）、及び１００μＬのｎ－ブタノールを加え、３０分間ボルテックスミキサーにて処理した。次に１３，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離処理で二層分離した。上層（ｎ－ブタノール相）と下層（水相）とをそれぞれ別のチューブに回収し、凍結乾燥した。以下、上層（ｎ－ブタノール相）の抽出物については「油溶性抽出物」と記載し、下層（水相）の抽出物については「水溶性抽出物」と記載する。以下に記載する実験（実施例３参照。）においては、１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、油溶性抽出物はメタノール（富士フイルム和光純薬株式会社）に、水溶性抽出物はＤＰＢＳに、それぞれ溶解させたものを用いた。

［実施例３］免疫賦活性マクロファージ（Ｍ１型マクロファージ）誘導作用の評価
「免疫賦活性マクロファージ誘導剤」の説明で記載したように、癌細胞の増殖抑制には、免疫賦活性マクロファージ（Ｍ１型マクロファージ）の誘導及び免疫抑制性マクロファージ（Ｍ２型マクロファージ）の抑制が重要であると考えられる。そこで、実施例３においては、１０Ｈ株死菌体、水溶性抽出物及び油溶性抽出物が免疫抑制性マクロファージから免疫賦活性マクロファージを誘導することができるかどうかについて評価した。

（免疫抑制性マクロファージ（Ｍ２型マクロファージ）の調製）
ヒト単球性白血病細胞株ＴＨＰ－１（ＪＣＲＢ細胞バンク）を、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬株式会社）を用いて、２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４穴プレート（Ｎｕｎｃ）に播種した。次に、ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈したホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（Ｓｉｇｍａ）を終濃度１００ｎｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下でＣＯ_２インキュベーター（ワケンビーテック、ＷＫＮ－ＭＣ３５）を用いて７２時間培養することでマクロファージを誘導した。さらに、得られたマクロファージをＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、終濃度１２．５ｎｇ／ｍＬのＨｕｍａｎＩＬ－６ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で７２時間培養することで、免疫抑制性マクロファージ（Ｍ２型マクロファージ）へ分化させた。

（免疫抑制性マクロファージから免疫賦活性マクロファージへの誘導）
２４穴プレートに接着させた免疫抑制性マクロファージに対し、１０Ｈ株死菌体、水溶性抽出物又は油溶性抽出物を終濃度が２μｇ／ｍＬ又は２０μｇ／ｍＬになるように添加後、２４時間培養した。培養後の細胞をＤＰＢＳで１回洗浄した後、０．３ｍＬの０．５μＭＥＤＴＡ（ナカライテスク株式会社）を添加して１０分間保持することにより、細胞をプレートから剥離させた。さらに、０．３ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加して、ピペッティングにより細胞を１．５ｍＬマイクロチューブ（ビオラモ）に回収し、もう一度ウェルを０．３ｍＬのＤＰＢＳで洗浄し、洗浄液を同じチューブに回収した。次に、遠心分離機（株式会社トミー精工、ＭＸ－３０１）を用いた５０００ｒｐｍ、５分、４℃の遠心分離処理にて上清を除去し、細胞ペレットを得た。

（抗体溶液の調製）
まず、ＤＰＢＳにＦｃＢｌｏｃｋｅｒ（バイオレジェンド株式会社）を１００倍希釈、７－ＡＡＤ（ベックマン・コールター株式会社）及びＦＩＴＣ標識－抗ＣＤ１１ｂ抗体（バイオレジェンド株式会社）を各々５０倍希釈になるように添加した溶液を調製した。上記溶液に対し、ＰＥ標識－抗ＣＤ１６３抗体（バイオレジェンド株式会社）及びＡＰＣ標識－抗ＣＤ２０９抗体（バイオレジェンド株式会社）、又は、ＰＥ標識－抗ＣＤ８０抗体（バイオレジェンド株式会社）及びＡＰＣ標識－抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（バイオレジェンド株式会社）の組み合わせにて、各々５０倍希釈になるよう各蛍光標識抗体を加え、抗体溶液を調製した。

（ＣＤ８０、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６３及びＣＤ２０９の発現率の測定）
上記細胞ペレットに調製した抗体溶液を添加し、ボルテックスミキサー処理により均一化した。蛍光標識抗体を添加した細胞ペレットを４℃で１５分間染色した後、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（ベックマン・コールター株式会社、Ｂ５３０１５）を用いて解析した。フローサイトメーター解析では、７－ＡＡＤ陰性細胞にゲートをかけ、ゲート内の細胞におけるＣＤ１１ｂ陽性細胞中のＣＤ８０、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６３及びＣＤ２０９の発現率を数値化した。なお、ＣＤ８０及びＨＬＡ－ＤＲの発現率の増減は免疫賦活性マクロファージに関するマーカー（以下、Ｍ１マーカーという。）として用いることができ、ＣＤ１６３及びＣＤ２０９は免疫抑制性マクロファージに関するマーカー（以下、Ｍ２マーカー）として用いることができる。

（ＴＮＦ－α産生量の測定）
分化させた免疫抑制性マクロファージに対し、２μｇ／ｍＬ又は２０μｇ／ｍＬの１０Ｈ株死菌体、水溶性抽出物又は油溶性抽出物を添加後、２４時間培養した培養上清を回収した。培養上清中のＴＮＦ－α産生量を測定するためにＤｕｏｓｅｔＥＬＩＳＡ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）キットを用いた。測定はすべてキットが推奨するプロトコールに従って実施した。なお、ＴＮＦ－αは炎症性サイトカインの一種であり、免疫賦活性マクロファージから産生される一方で免疫抑制性マクロファージからはほぼ産生されないため、その産生量をＭ１マーカーとして用いることができる。

（実験結果）
以上の実験の結果を図１～図６に示す。
図１は、１０Ｈ株死菌体による免疫賦活性マクロファージの誘導作用を示す棒グラフである。図１（ａ）はＣＤ８０（Ｍ１マーカー）の発現率を示す棒グラフであり、図１（ｂ）はＨＬＡ－ＤＲ（Ｍ１マーカー）の発現率を示す棒グラフであり、図１（ｃ）はＴＮＦ－α（Ｍ１マーカー）の産生量を示すグラフである。
図２は、１０Ｈ株死菌体による免疫抑制性マクロファージの抑制作用を示す棒グラフである。図２（ａ）はＣＤ１６３（Ｍ２マーカー）の発現率を示す棒グラフであり、図２（ｂ）はＣＤ２０９（Ｍ２マーカー）の発現率を示す棒グラフである。
図３は、水溶性抽出物による免疫賦活性マクロファージの誘導作用を示す棒グラフである。図３（ａ）はＣＤ８０（Ｍ１マーカー）の発現率を示す棒グラフであり、図３（ｂ）はＨＬＡ－ＤＲ（Ｍ１マーカー）の発現率を示す棒グラフであり、図３（ｃ）はＴＮＦ－α（Ｍ１マーカー）の産生量を示すグラフである。
図４は、水溶性抽出物による免疫抑制性マクロファージの抑制作用を示す棒グラフである。図４（ａ）はＣＤ１６３（Ｍ２マーカー）の発現率を示す棒グラフであり、図４（ｂ）はＣＤ２０９（Ｍ２マーカー）の発現率を示す棒グラフである。
図５は、油溶性抽出物による免疫賦活性マクロファージの誘導作用を示す棒グラフである。図５（ａ）はＣＤ８０（Ｍ１マーカー）の発現率を示す棒グラフであり、図５（ｂ）はＨＬＡ－ＤＲ（Ｍ１マーカー）の発現率を示す棒グラフであり、図５（ｃ）はＴＮＦ－α（Ｍ１マーカー）の産生量を示すグラフである。
図６は、油溶性抽出物による免疫抑制性マクロファージの抑制作用を示す棒グラフである。図６（ａ）はＣＤ１６３（Ｍ２マーカー）の発現率を示す棒グラフであり、図６（ｂ）はＣＤ２０９（Ｍ２マーカー）の発現率を示す棒グラフである。
なお、図１～６の棒グラフ上に示す「＊」印は、対照（１０Ｈ株死菌体、水溶性抽出物又は油溶性抽出物の添加量が０μｇ／ｍＬであるとき）と比較して有意な差があること（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓｔｅｓｔＰ＜０．０１）を示す。後述する図７においても同様である。

図１，３，５に示すように、１０Ｈ株死菌体、水溶性抽出物及び油溶性抽出物の全てについて、これらを添加しなかった場合（０μｇ／ｍＬ）と比較して、Ｍ１マーカーであるＣＤ８０及びＨＬＡ－ＤＲの発現率並びにＴＮＦ－αの産生量が増加することが確認できた。また、図２，４，６に示すように、１０Ｈ株死菌体、水溶性抽出物及び油溶性抽出物の全てについて、これらを添加しなかった場合（０μｇ／ｍＬ）と比較して、Ｍ２マーカーであるＣＤ１６３及びＣＤ２０９の発現率が減少することが確認できた。これらの結果から、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の菌体及び菌体処理物が、免疫抑制性マクロファージから免疫賦活性マクロファージを誘導することがわかる。従って、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の菌体及び菌体処理物は、免疫抑制性マクロファージが多量に存在する環境において免疫抑制性マクロファージを抑制（低減）するとともに免疫賦活性マクロファージを誘導（増加）することが可能であると考えられ、免疫賦活性マクロファージ誘導剤及び癌微小環境改善剤の有効成分として期待できる。

［実施例４］癌アポトーシス誘導作用の評価
実施例４においては、免疫抑制性マクロファージを１０Ｈ株死菌体の存在下で培養してＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍを調製し、当該ＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍの存在下で癌細胞株を培養することで癌細胞株のアポトーシスが誘導されるかどうかについて調べた。

（ＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍの調製）
まず、実施例３と同様の方法により、免疫抑制型マクロファージを誘導した。得られた免疫抑制型マクロファージに対して１０Ｈ株死菌体（２μｇ／ｍＬ）を添加し、２４時間培養した。培養上清を菌体除去のために８０００ｒｐｍ、５分、４℃の条件で遠心分離し、上清をＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍとして回収した（サンプル名：Ｍ２Ａ．ｋｏｓｏｉ－ＣＭ）。また、上記と同様に処理した１０Ｈ株死菌体無添加の免疫抑制型マクロファージ培養液を無添加コントロールとした（サンプル名：Ｍ２Ｎｏｎｅ－ＣＭ）。

（癌細胞株へのＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍ添加及び培養）
癌細胞株は、大腸癌細胞株ＨＴ－２９（株式会社ケー・エー・シー）、肺癌細胞株Ａ５４９（ＪＣＲＢ細胞バンク）及び、乳癌細胞株ＭＣＦ－７（ＪＣＲＢ細胞バンク）を使用した。培養培地は、ＨＴ－２９細胞についてはＲＰＭＩ１６４０培地、Ａ５４９細胞についてはＭＥＭ培地（日水製薬株式会社）、ＭＣＦ－７細胞についてはＤＭＥＭ培地（日水製薬株式会社）を、それぞれ用いた。各癌細胞株は１．２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種し、２４時間培養することでプレートの底に接着させた。その後、各癌細胞株の培養培地の５０％をＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍで置き換えた培地に交換し、４８時間（ＨＴ－２９細胞及びＡ５４９細胞）又は７２時間（ＭＣＦ－７細胞）培養した。培養後各細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、ＤＰＢＳで２倍に希釈したＴｒｙｐＬＥｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｅｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．）を０．３ｍＬ加え、５分間保持することでプレートから細胞を剥離した。その後、０．３ｍＬの１０％牛胎児血清（ｖ／ｖ）の入った各培地を添加し、酵素反応を止め、１．５ｍＬマイクロチューブ（ビオラモ）に細胞を回収した。さらに、０．３ｍＬのＤＰＢＳでプレートを１回洗浄し、細胞を回収した。回収した細胞を遠心分離処理し、細胞ペレットを得た。遠心分離処理は遠心分離機（株式会社トミー精工、ＭＸ－３０１）により、５０００ｒｐｍ、５分、４℃の条件で実施した。

（細胞の染色及びアポトーシス割合の算出）
ＤＰＢＳで５倍に希釈した７－ＡＡＤ溶液と、２５倍希釈したＦＩＴＣ標識ＡｎｎｅｘｉｎＶ溶液とをそれぞれ調製した。ＤＰＢＳで洗浄した細胞に１３μＬの７－ＡＡＤ抗体溶液を添加し、４℃、暗所で１５分間染色した後、１ｍＬのＤＰＢＳを添加し、上記と同様の遠心分離条件で細胞ペレットを得た。当該細胞ペレットに対して、２０μＬのＦＩＴＣ標識ＡｎｎｅｘｉｎＶ溶液を添加後、室温、暗所にて１５分間染色した。さらに、２００μＬのＡｎｎｅｘｉｎＶＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（バイオレジェンド）を加え、ＣｙｔｏＦＬＥＸにてアポトーシス細胞割合を解析した。アポトーシス割合は、取り込んだ全細胞に対する７－ＡＡＤ陽性、かつＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性細胞の割合をアポトーシス割合として算出した。

（実験結果）
以上の実験の結果を図７に示す。
図７は、１０Ｈ株死菌体による癌アポトーシスの誘導作用を示す棒グラフである。図７（ａ）はＨＴ－２９細胞についての癌アポトーシスの誘導作用を示す棒グラフであり、図７（ｂ）はＡ５４９細胞についての癌アポトーシスの誘導作用を示す棒グラフであり、図７（ｃ）はＭＣＦ－７細胞についての癌アポトーシスの誘導作用を示す棒グラフである。

図７に示すように、実験に用いた３種類の癌細胞株の全てについて、免疫抑制型マクロファージに対して１０Ｈ株死菌体を添加して培養することにより得られたＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍ（Ｍ２Ａ．ｋｏｓｏｉ－ＣＭ）を添加して培養することで、無添加コントロール（Ｍ２Ｎｏｎｅ－ＣＭ）と比較してアポトーシス割合が有意に増加することが確認できた。この結果から、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の菌体は、免疫抑制性マクロファージが多量に存在する環境において免疫抑制性マクロファージを抑制するとともに免疫賦活性マクロファージを誘導することで、癌細胞のアポトーシスを誘導することが可能であると考えられ、癌アポトーシス誘導剤の有効成分として期待できる。また、実施例３の結果と併せて考えると、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の菌体処理物（抽出物）も、免疫賦活性マクロファージの誘導及び免疫抑制性マクロファージの抑制により、菌体と同様に癌細胞のアポトーシスを誘導することが可能であると考えられる。従って、菌体処理物（抽出物）も癌アポトーシス誘導剤の有効成分として期待できる。

（処方例１錠剤）
常法に従って、以下の成分を混合し、錠剤を製造した。なお、有効成分組成物は、実施例１で得たアピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の凍結乾燥菌体を用いた。
組成
有効成分組成物（実施例１）１５０ｍｇ
セルロース８０ｍｇ
デンプン２０ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル２ｍｇ
上記成分を混合、打錠し、錠剤を得た。

（処方例２カプセル剤）
常法に従って、以下の成分を混合し、軟カプセルを得た。なお、有効成分組成物は、実施例１で得たアピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の凍結乾燥菌体を用いた。
組成
有効成分組成物（実施例１）１００ｍｇ
ミツロウ１０ｍｇ
ぶどう種子オイル１１０ｍｇ
上記成分を混合し、ゼラチンおよびグリセリンを混合したカプセル基剤中に充填し、軟カプセルを得た。

本発明は、乳酸菌であるアピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を含有する免疫賦活性マクロファージ誘導剤、癌微小環境改善剤及び癌アポトーシス誘導剤並びにアピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を用いる免疫賦活性マクロファージ誘導方法に関する。

Claims

アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を有効成分として含有する免疫賦活性マクロファージ誘導剤。
飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項１に記載の免疫賦活性マクロファージ誘導剤。
アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を有効成分として含有する癌微小環境改善剤。
飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項３に記載の癌微小環境改善剤。
アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の菌体又は菌体処理物を有効成分として含有する癌アポトーシス誘導剤。
飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項５に記載の癌アポトーシス誘導剤。