JP2023002686A

JP2023002686A - 制約されたｃｄ３結合を有する多重特異性ポリペプチド構築物およびそれを使用する方法

Info

Publication number: JP2023002686A
Application number: JP2022168074A
Authority: JP
Inventors: ブレンダンピー．エッケルマン; P Eckelman Brendan; マイケルディー．カプラン; D Kaplan Michael; ケイトリンエム．ウィリス; M Willis Katelyn; クインデベラックス; Deveraux Quinn; ジョーンシー．ティマー; C Timmer John
Original assignee: Inhibrx Inc
Current assignee: Inhibrx Inc
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2022-10-20
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2038-04-11
Also published as: US20190010242A1; MX2024005371A; SG11201909160WA; EP3619235A1; NZ758264A; JP2024063176A; WO2018191438A1; KR20200005732A; TW201843177A; MY200973A; AU2018250641A1; JP7450684B2; PH12019502303A1; CA3058477A1; RU2019135842A3; JP2020516287A; US11866507B2; CN110770255A; US20240101704A1; IL269826A

Abstract

【課題】多様な治療的適用、診断的適用、および予防的適用において使用され、切断された時に二重エフェクター機能をもたらす切断可能リンカーを含有している、制約されたＣＤ３結合を有する多重特異性ポリペプチドを提供する。【解決手段】免疫グロブリンＦｃ領域を含む第１の成分およびＣＤ３結合領域を含む第２の成分を含む、多重特異性ポリペプチド構築物であって、第１および第２の成分がリンカーによってカップリングされており、Ｆｃ領域がＣＤ３結合領域のＮ末端側に位置付けられており；第１および第２の成分の一方又は両方が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する抗原結合ドメインを含む、多重特異性ポリペプチド構築物を提供する。【選択図】図２

Description

本願は、「二重エフェクター機能を有する多重特異性ポリペプチドおよびそれを使用する方法（MULTISPECIFIC POLYPEPTIDES HAVING DUAL EFFECTOR FUNCTION AND METHODS OF USING THE SAME）」という名称の2017年4月11日に出願された米国仮出願第62/484,217号に基づく優先権を主張するものであり、その内容は参照によってその全体が組み入れられる。

配列表の参照による組み入れ
本願は、電子フォーマットで配列表と共に提出される。配列表は、174,179バイトのサイズの2018年4月11日に作成された744952000140SeqList.TXTという名称のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットでの情報は、参照によってその全体が組み入れられる。

開示の分野
本発明は概して、制約されたCD3結合を有する多重特異性ポリペプチドに関する。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチドは、切断された時に二重エフェクター機能をもたらす切断可能リンカーを含有している。これらの多重特異性ポリペプチドを作製し、多様な治療的適用、診断的適用、および予防的適用において使用する方法も、提供される。

開示の背景
標的細胞枯渇を引き起こす治療用抗体は概して、Fcγ受容体（FcγR）および補体タンパク質との相互作用を介して媒介されるエフェクター機能に頼っている。FcγRを発現しているエフェクター細胞は、主に、自然免疫系のものである。T細胞は、抗体によって媒介される標的細胞枯渇に関与する直接エフェクター細胞ではない。

CD3（表面抗原分類3）T細胞共受容体は、ε鎖、γ鎖、δ鎖、およびζ鎖と呼ばれる4種の異なるポリペプチド鎖から構成される多量体タンパク質である。CD3複合体は、T細胞受容体（TCR）の抗原結合a/b鎖と非共有結合的に会合する、T細胞受容体のシグナリングモジュールとして役立つ。

CD3の直接の係合はT細胞活性化をもたらすため、多様な治療的適用および/または診断的適用のための望ましい標的である。従って、CD3/TCR経路を標的とする抗体および治療薬が必要とされている。

開示の概要
本開示は、制約されたCD3結合を示す多重特異性ポリペプチド構築物を提供する。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分、およびCD3結合領域を含む第2の成分から構成され、ここで、第1および第2の成分は、リンカーによってカップリングされているかまたは機能的に連結されており、Fc領域はCD3結合領域のN末端側に位置付けられ；第1および第2の成分の一方または両方は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、不活性状態において、第1の成分および第2の成分から構成され、ここで、第1および第2の成分は機能的に連結されており、第1および第2の成分の各々は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含み、第1の成分はFc領域を含み、第2の成分はCD3結合領域を含み、第1および第2の成分は、切断可能リンカーによってカップリングされている。いくつかの態様において、CD3結合領域は、CD3（CD3ε）に結合する。

いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、第1の成分は、第1の抗原結合ドメインを含み、第2の成分は、第2の抗原結合ドメインを含み、ここで、抗原結合ドメインの各々は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する。いくつかのケースにおいて、第1の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のアミノ末端に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のカルボキシ末端に位置付けられている。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。

N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；リンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメインを含む多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供される。N末端からC末端へ順に、免疫グロブリンFc領域；リンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性ポリペプチド構築物も、本明細書中に提供される。N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；リンカー；およびCD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域を含む多重特異性ポリペプチド構築物が、提供される。

本開示の態様には、CD3および腫瘍関連抗原（TAA）のような第2の抗原に少なくとも結合する多重特異性ポリペプチド構築物が含まれる。本明細書中に提供される多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンFc領域に連結された、抗原に結合する抗原結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む第1の成分、（本明細書中で交換可能に使用される、抗CD3結合ドメインまたはCD3結合領域と本明細書中で呼ばれる）CD3に結合する結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを少なくとも含む第2の成分、および第1の成分と第2の成分とを接合する切断可能リンカーのようなリンカーを少なくとも含む。

CD3結合領域のN末端側にFc領域を位置付けることは、CD3結合領域のCD3と結合する能力を低下させるかまたは防止する。いくつかの態様において、未切断/不活性状態において、多重特異性ポリペプチド構築物の第1の成分（成分＃1）および第2の成分（成分＃2）は連結されており、抗原結合ドメインが同族抗原と結合しない限り、CD3との結合は許可されない。これは、CD3結合領域のT細胞との全身性の結合を防止し、抗原発現の部位にそれを集中させるため、有利である。これは、末梢T細胞の主要な結合シンクを排除し、抗原発現の部位、例えば、腫瘍細胞または腫瘍微小環境へのより有利な分布および局在を可能にするため、有益である。いくつかのケースにおいて、CD3の結合および/または係合は、成分＃1および成分＃2を接合する切断可能リンカーを含めることによって増幅されるかまたは増加し、タンパク質分解等による切断可能リンカーの切断時に、CD3結合領域の増加した結合が可能になる。

不活性、即ち、未切断の状態において、多重特異性ポリペプチド構築物の成分＃1および成分＃2は、機能的に連結されており、抗原結合ドメインが同族抗原に結合しない限り、CD3と結合せず、他の方法でも係合しない。いくつかの態様において、未切断の多重特異性ポリペプチド構築物は、FcγRと相互作用し、自然免疫エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および抗体依存性細胞貪食（ADCP）を媒介することができる。いくつかの態様において、未切断の多重特異性ポリペプチド構築物は、補体タンパク質、即ち、C1qと相互作用し、補体依存性細胞傷害を媒介することができる。

本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は概して、複数の抗原結合ドメインを有する。多重特異性ポリペプチド構築物が切断可能リンカーを含有している、提供された局面において、プロテアーゼ等によって第1および第2の成分を接合しているリンカーが切断された後、各成分は、少なくとも1個の抗原結合ドメインを維持する。第1の成分（即ち、成分＃1）は、Fc領域および抗原結合ドメインを少なくとも含有している。第2の成分（即ち、成分＃2）は、抗CD3結合ドメインおよび抗原結合ドメインを少なくとも含有している。

切断可能リンカーにおけるタンパク質分解等による切断は、成分＃1と成分＃2とを物理的に分離し、その各々が、異なるエフェクター細胞に頼るとはいえ、治療的有用性を有する。成分＃1は、少なくとも1個の抗原結合ドメインおよびFc領域を含有している。いくつかの態様において、成分＃1は、自然免疫エフェクター機能、例えば、ADCC、サイトカイン放出、脱顆粒、および/または貪食を誘発することができる。成分＃2は、CD3結合領域および抗原結合ドメインを少なくとも含有しており、前者は、（成分＃1から分離された時に）CD3に結合することができる。成分＃2は、抗原発現細胞とT細胞との間に免疫シナプスを形成することができる。この同時係合は、抗原依存性のT細胞の活性化、細胞傷害、サイトカイン放出、脱顆粒、および増殖を媒介する。切断/活性化状態において、成分＃2は、成分＃1のFc領域に機能的に連結されておらず、従って、成分＃2は、FcRnと相互作用せず、抗原発現細胞が存在しない部位に局在した場合、増強された血清クリアランスを有する。これは、活性化された抗CD3結合ドメインの全身曝露を限定し、抗原を発現している組織、例えば、腫瘍細胞または腫瘍微小環境に直接集中させるため、有利である。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチドは、不活性状態、即ち、未切断状態にあり、CD3結合領域のCD3との結合は、多重特異性ポリペプチド構築物が未切断状態にある時、切断状態と比較して、阻害されるかまたは実質的に低下する。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチドは、活性化状態にあり、第1および第2の成分が、機能的に連結されていない。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチドは、活性化状態、即ち、切断状態にあり、第2の成分は、CD3のε鎖（CD3ε）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する。

いくつかの局面において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、抗体もしくは抗原結合断片、天然同族結合パートナー、アンチカリン（Anticalin）（改変型リポカリン）、ダーピン（Darpin）、フィノマー（Fynomer）、センチリン（Centyrin）（改変型フィブロネクチンIIIドメイン）、シスチンノットドメイン、アフィリン（Affilin）、アフィボディ（Affibody）、または改変型CH3ドメインより選択される。いくつかの態様において、天然同族結合パートナーには、TAAのネイティブ同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはTAAとの結合活性を示すそれらのバリアントが含まれる。

いくつかの局面において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、TAAのネイティブ同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはTAAとの結合活性を示すそれらのバリアントを含む。

いくつかの態様において、第1の成分は、抗原結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、第1の成分は、2個の抗原結合ドメインのような少なくとも2個の抗原結合ドメインを含有している。いくつかの態様において、第1の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAに結合する。いくつかのケースにおいて、第1の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAの異なるエピトープに結合する。いくつかの場合において、第1の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAの異なるエピトープに結合する。いくつかの態様において、第1の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、異なるTAAに結合する。

いくつかの態様において、いくつかのケースにおいて、第1の抗原結合ドメインである、第1の成分の抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインのような第1の成分の抗原結合ドメインは、Fab断片、F(ab')₂断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインは、1種または複数種のシングルドメイン抗体（sdAb）断片、例えば、V_HH、V_NAR、改変型V_Hドメイン、または改変型V_Kドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。V_HHは、ラクダ科動物の重鎖のみの抗体から生成され得る。V_NARは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成され得る。界面改変および特異的な生殖系列ファミリーの選択を含む様々な方法が、従来のヘテロ二量体のV_HドメインおよびV_Kドメインから単量体sdAbを生成するために実施されている。

いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインのような第1の成分の抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（TAA）のような抗原に結合する。いくつかの態様において、TAAは、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9、（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、ジャギド（Jagged）リガンド、ジャギド1、ジャギド2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン（Nicastrin）、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン-1-リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3からなる群より選択される。

いくつかの態様において、Fc領域は、ホモ二量体Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域は、ヘテロ二量体Fc領域である。

いくつかの態様において、第1の成分の免疫グロブリンFc領域は、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、およびIgG4サブクラスからなる群より選択されるIgGアイソタイプである。いくつかの例において、Fc領域は、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、もしくはヒトIgG4のFc領域であるか、またはそれらの免疫活性断片である。いくつかの態様において、Fc領域は、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む。いくつかのケースにおいて、Fc領域は、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む。そのような態様のいくつかにおいて、Fc領域は、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:4との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの例において、Fc領域は、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:5との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む。

いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、1つまたは複数の修飾を含む、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、グリコシル化を防止するため、Fc受容体相互作用を変更するため、Fc受容体結合を低下させるため、CD32Aとの相互作用を増強するため、補体タンパク質C1q結合を低下させるため、半減期を延長するため、FcRn結合を増強するため、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および/または補体依存性細胞傷害（CDC）を変更するため、ヘテロ二量体化を誘導するため、二量体化を防止するため、CH3:CH3界面におけるホモ二量体化を安定化するため、ならびにそれらの組み合わせのための1つまたは複数の修飾を含む、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

いくつかの態様において、Fcは、ヘテロ二量体Fcである。いくつかのケースにおいて、ヘテロ二量体Fc領域の一方または両方のFcポリペプチドは、ホモ二量体Fc領域のポリペプチドと比較して、任意で、SEQ ID NO:1に示されるFcポリペプチドまたはその免疫活性断片と比較して、ヘテロ二量体化を誘導するための少なくとも1個の修飾を含む。いくつかの態様において、ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドの各々は、少なくとも1個の修飾を含む。いくつかのケースにおいて、ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドの各々は、ノブイントゥホール修飾を含むか、またはポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異を含む。いくつかの態様において、アミノ酸修飾は、ノブイントゥホール修飾である。

いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの第1のFcポリペプチドは、Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val、およびそれらの組み合わせより選択される修飾を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のFcポリペプチドは、修飾T366Wを含む。いくつかのケースにおいて、第1および第2のFcポリペプチドは、非システイン残基のシステイン残基への修飾をさらに含み、ここで、第1のポリペプチドの修飾は、位置Ser354およびY349の一方にあり、第2のFcポリペプチドの修飾は、位置Ser354およびY349の他方にある。

いくつかの例において、アミノ酸修飾は、ポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異である。いくつかの態様において、第1および/または第2のFcポリペプチドは、他方のポリペプチドの相補的なアミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸への置換である修飾を、相補的な位置に含む。いくつかの態様において、第1または第2のポリペプチドは、他方のポリペプチドの相補的なアミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸への置換である修飾を、相補的な位置に含む。いくつかの態様において、少なくとも第1または第2のFcポリペプチドは、各々、他方のポリペプチドの相補的なアミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸への置換である修飾を、相補的な位置に含む。いくつかの態様において、第1および第2のFcポリペプチドは、各々、他方のポリペプチドの相補的なアミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸への置換である修飾を、相補的な位置に含む。

いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの第1または第2のFcポリペプチドの一方は、残基Ile253における修飾をさらに含む。いくつかの場合において、修飾は、Ile253Argである。いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの第1または第2のFcポリペプチドの一方は、残基His435における修飾をさらに含む。いくつかの場合において、修飾は、His435Argである。いくつかの態様において、Fc領域は、Lys447を欠くポリペプチドを含む。

いくつかの態様において、Fc領域内の修飾は、Fcγ受容体との結合を低下させるが、新生児型Fc受容体（FcRn）との結合には最小の影響を及ぼす。いくつかの態様において、変異型または修飾型のFcポリペプチドは、カバットナンバリングシステムを使用して、以下の変異を含む：Met252TyrおよびMet428LeuまたはMet252TyrおよびMet428Val（M252Y、M428L、またはM252Y、M428V）。

いくつかの態様において、Fc領域は、FcRn結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む。いくつかの例において、修飾は、Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある。いくつかのケースにおいて、修飾は、Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある。いくつかの具体的な態様において、修飾は、位置Met252および位置Met428にある。いくつかのケースにおいて、修飾は、Met252YおよびMet428Lである。いくつかのケースにおいて、修飾は、Met252YおよびMet428Vである。

いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドは、SEQ ID NO:82、86、94、または96のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドは、SEQ ID NO:83、87、90、92、98、または100のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む。

いくつかの態様において、Fc領域は、エフェクター機能を低下させかつ/またはFcγ受容体もしくはC1qより選択されるエフェクター分子との結合を低下させる少なくとも1個のアミノ酸修飾を含むポリペプチドを含む。いくつかの例において、1つまたは複数のアミノ酸修飾は、Glu233、Leu234、またはLeu235のうちの1つまたは複数の欠失である。いくつかの局面において、ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドは、SEQ ID NO:84、88、95、または97のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドは、SEQ ID NO:85、89、91、93、99、または101のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む。

いくつかの態様において、Fc領域は、FcγR結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む。いくつかのケースにおいて、修飾は、Ser239またはIle332における修飾である。いくつかの態様において、Fc領域のグリコシル化は、未修飾のFc領域と比較して、FcγR結合を増強するために修飾される。いくつかの例において、Fc領域は、フコースを欠くかまたは低下したフコース含量を有する。

いくつかの態様において、CD3結合領域は、抗CD3抗体または抗原結合断片である。いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む。そのような態様のいくつかにおいて、CD3結合領域は、1価である。

いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合断片は、単鎖抗体ではなく、任意で、単鎖可変断片（scFv）ではない。いくつかの態様において、Fcは、ヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLは、ヘテロ二量体Fcの反対のポリペプチドに連結されている。いくつかの態様において、CD3結合領域は、抗原結合ドメインのうちの少なくとも1個がそのTAAに結合しない限り、CD3に結合もしくは係合することができないかまたは実質的にできない。いくつかの局面において、CD3結合領域は、抗原結合ドメインのうちの少なくとも2個がそのTAAに結合しない限り、CD3に結合または係合することができないかまたは実質的にできない。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、ポリペプチドリンカーであるリンカーを含有している。いくつかの態様において、リンカーは、25アミノ酸長までのポリペプチドである。いくつかのケースにおいて、リンカーは、約2～24アミノ酸、2～20アミノ酸、2～18アミノ酸、2～14アミノ酸、2～12アミノ酸、2～10アミノ酸、2～8アミノ酸、2～6アミノ酸、6～24アミノ酸、6～20アミノ酸、6～18アミノ酸、6～14アミノ酸、6～12アミノ酸、6～10アミノ酸、6～8アミノ酸、8～24アミノ酸、8～20アミノ酸、8～18アミノ酸、8～14アミノ酸、8～12アミノ酸、8～10アミノ酸、10～24アミノ酸、10～20アミノ酸、10～18アミノ酸、10～14アミノ酸、10～12アミノ酸、12～24アミノ酸、12～20アミノ酸、12～18アミノ酸、12～14アミノ酸、14～24アミノ酸、14～20アミノ酸、14～18アミノ酸、18～24アミノ酸、18～20アミノ酸、または20～24アミノ酸のポリペプチドである。いくつかの態様において、リンカーは、3アミノ酸長、 4アミノ酸長、 5アミノ酸長、 6アミノ酸長、 7アミノ酸長、 8アミノ酸長、 9アミノ酸長、 10アミノ酸長、 11アミノ酸長、 12アミノ酸長、 13アミノ酸長、 14アミノ酸長、 15アミノ酸長、 16アミノ酸長、 17アミノ酸長、 18アミノ酸長、 19アミノ酸長、または20アミノ酸長であるポリペプチドである。いくつかのケースにおいて、リンカーは、切断可能リンカーである。

いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインおよび免疫グロブリンFcポリペプチドは、アミノ酸リンカーを介して機能的に連結されている。いくつかの態様において、これらの成分内リンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成され、本明細書中でGSリンカーと呼ばれる。本開示の融合タンパク質のGSリンカーは、様々な長さ、例えば、3アミノ酸長、 4アミノ酸長、 5アミノ酸長、 6アミノ酸長、 7アミノ酸長、 8アミノ酸長、 9アミノ酸長、 10アミノ酸長、 11アミノ酸長、 12アミノ酸長、 13アミノ酸長、 14アミノ酸長、 15アミノ酸長、 16アミノ酸長、 17アミノ酸長、 18アミノ酸長、 19アミノ酸長、または20アミノ酸長であり得る。

いくつかの態様において、GSリンカーは、

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、第2の成分も、抗CD3結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗CD3結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗CD3結合ドメインは、Fab断片、F(ab')₂断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗CD3結合ドメインは、（本明細書中で抗CD3εFv断片と呼ばれる）CD3εに結合するFv抗体断片を含む。いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～81の群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～81からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～62の群より選択されるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:63～81からなる群より選択されるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～62の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:63～81からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。

いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）である。

いくつかの態様において、第2の成分も、抗原結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。ある種の態様において、第2の成分は、2個の抗原結合ドメインのような少なくとも2個の抗原結合ドメインを含有している。いくつかの態様において、第2の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAに結合する。いくつかのケースにおいて、第2の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAの異なるエピトープに結合する。いくつかの場合において、第2の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、同一のTAAの異なるエピトープに結合する。いくつかの態様において、第2の成分の少なくとも2個の抗原結合ドメインは、異なるTAAに結合する。

いくつかの態様において、第1の成分は、第1の抗原結合ドメインを含有しており、第2の成分の抗原結合ドメインは、第2の抗原結合ドメインである。いくつかの態様において、第2の成分の第2の抗原結合ドメインは、第1の成分の第1の抗原結合ドメインと同一の抗原に結合する。いくつかの態様において、第2の成分の第2の抗原結合ドメインは、第1の成分の第1の抗原結合ドメインと同一の抗原の異なるエピトープに結合する。いくつかの態様において、第2の成分の第2の抗原結合ドメインは、第1の成分の第1の抗原結合ドメインと同一の抗原のエピトープに結合する。

いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインのような第2の成分の抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインは、Fab断片、F(ab')₂断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインは、1種または複数種のシングルドメイン抗体（sdAb）断片、例えば、V_HH、V_NAR、改変型V_Hドメイン、または改変型V_Kドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。V_HHは、ラクダ科動物の重鎖のみの抗体から生成され得る。V_NARは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成され得る。界面改変および特異的な生殖系列ファミリーの選択を含む様々な方法が、従来のヘテロ二量体のV_HドメインおよびV_Kドメインから単量体sdAbを生成するために実施されている。

いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインのような第2の成分の抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（TAA）のような抗原に結合する。いくつかの態様において、TAAは、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9、（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、ジャギドリガンド、ジャギド1、ジャギド2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン-1-リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3からなる群より選択される。

いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインのような第2の成分の抗原結合ドメイン、および抗CD3結合ドメインは、アミノ酸リンカーを介して機能的に連結されている。いくつかの態様において、これらの成分内リンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成され、本明細書中でGSリンカーと呼ばれる。本開示の融合タンパク質のGSリンカーは、様々な長さ、例えば、5アミノ酸長、 6アミノ酸長、 7アミノ酸長、 8アミノ酸長、 9アミノ酸長、 10アミノ酸長、 11アミノ酸長、 12アミノ酸長、 13アミノ酸長、 14アミノ酸長、 15アミノ酸長、 16アミノ酸長、 17アミノ酸長、 18アミノ酸長、 19アミノ酸長、20アミノ酸長であり得る。

いくつかの態様において、GSリンカーは、

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

ヘテロ二量体Fc領域を含む第1の成分、ならびに重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む抗CD3抗体または抗原結合断片を含む第2の成分を含む多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供され、ここで、抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLは、ヘテロ二量体Fcの反対のポリペプチドに連結されており；第1および第2の成分は、切断可能リンカーによってカップリングされており、ヘテロ二量体Fc領域は、抗CD3抗体のN末端側に位置付けられており；第1および第2の成分の一方または両方は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む。

いくつかの態様において、CD3結合領域のCD3との結合は、多重特異性ポリペプチド構築物が未切断状態にある時、切断状態と比較して実質的に低下する。いくつかの態様において、切断状態において、第1および第2の成分は、連結されていない。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、ポリペプチドである。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、プロテアーゼの基質であるポリペプチドである。いくつかの態様において、プロテアーゼは、免疫エフェクター細胞によって、腫瘍によって、または腫瘍微小環境に存在する細胞によって産生される。いくつかの態様において、プロテアーゼは、CD3εを発現する細胞の近傍の腫瘍によって産生され、かつ/または組織内のCD3εを発現する細胞と共局在している腫瘍によって産生され、多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼに曝された時、プロテアーゼは、多重特異性ポリペプチド構築物内の切断可能リンカーを切断する。いくつかの態様において、プロテアーゼは、1種もしくは複数種の腫瘍関連抗原（TAA）を発現する細胞の近傍の腫瘍によって産生され、かつ/または組織内の標的TAAを発現する細胞と共局在している腫瘍によって産生され、多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼに曝された時、プロテアーゼは、多重特異性ポリペプチド構築物内の切断可能リンカーを切断する。いくつかの態様において、プロテアーゼは、免疫エフェクター細胞によって産生される。いくつかの態様において、プロテアーゼは、TAAを発現する細胞の近傍の免疫エフェクター細胞によって産生される。いくつかの例において、プロテアーゼは、免疫エフェクター細胞によって産生され、免疫エフェクター細胞は、活性化T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、またはNK T細胞である。いくつかの態様において、プロテアーゼは、多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼに曝された時、多重特異性ポリペプチド構築物内の切断可能リンカーを切断する。いくつかの態様において、プロテアーゼは、TAAを発現する細胞の近傍の免疫エフェクター細胞によって産生され、多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼに曝された時、プロテアーゼは、多重特異性ポリペプチド構築物内の切断可能リンカーを切断する。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、50アミノ酸長までのポリペプチドである。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、25アミノ酸長までのポリペプチドである。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、15アミノ酸長までのポリペプチドである。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、本明細書中に記載されたプロテアーゼより選択されるプロテアーゼの基質である。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、uPA、レグマイン、（本明細書中でMT-SP1またはMTSP1とも呼ばれる）マトリプターゼ、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-9、MMP-12、MMP-13、MMP-14、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、uPA、レグマイン、およびマトリプターゼからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。いくつかの態様において、プロテアーゼは、マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせより選択される。

いくつかの態様において、プロテアーゼは、グランザイムBである。いくつかの例において、切断可能リンカーは、一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:150）［P4はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、またはAであり；P3はアミノ酸A、G、S、V、E、D、Q、N、またはYであり；P2はアミノ酸H、P、A、V、G、S、またはTであり；P1はアミノ酸DまたはEであり；P1'はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G、またはAである］のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:151）［P4はアミノ酸IまたはLであり；P3はアミノ酸Eであり；P2はアミノ酸PまたはAであり；P1はアミノ酸Dであり；P1'はアミノ酸I、V、T、S、またはGである］のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、アミノ酸配列IEPDI（SEQ ID NO:136）、LEPDG（SEQ ID NO:152）、LEADT（SEQ ID NO:137）、IEPDG（SEQ ID NO:138）、IEPDV（SEQ ID NO:139）、IEPDS（SEQ ID NO:140）、IEPDT（SEQ ID NO:141）、またはLEADG（SEQ ID NO:153）を含む。いくつかのケースにおいて、切断可能リンカーは、SEQ ID NO:22、105～112、136～141、148、150～153からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、プロテアーゼは、マトリプターゼである。いくつかのケースにおいて、切断可能リンカーは、配列P1QAR↓(A/V)（SEQ ID NO:154）［P1は任意のアミノ酸である］を含むか；または切断可能リンカーは、配列RQAR(A/V)（SEQ ID NO:155）を含む。いくつかの例において、切断可能リンカーは、配列RQARV（SEQ ID NO:156）を含む。いくつかのケースにおいて、切断可能リンカーは、SEQ ID NO:23、154～156からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、プロテアーゼは、MMPである。いくつかの例において、MMPは、MMP-2である。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:157）[P3はP、V、またはAであり；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はL、I、またはMである]を含む。いくつかのケースにおいて、切断可能リンカーは、一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:158）[P；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はLまたはIである]を含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、配列PAGL（SEQ ID NO:24）を含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の基質である。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、（i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む第1のポリペプチド；ならびに（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む第2のポリペプチドを少なくとも含み、ここで、第1および第2のポリペプチドの一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む。いくつかの場合において、第1または第2のポリペプチドの一方のみが、TAAに結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む。

提供された態様のいくつかにおいて、抗原結合ドメインは、 TAAとの1価、2価、3価、または4価の結合をもたらす。いくつかの態様において、TAAに結合する1つまたは複数の抗原結合ドメインは、sdAb、scFv、またはFabより独立に選択される。いくつかの態様において、TAAに結合する1つまたは複数の抗原結合ドメインは、VHおよびVLを含有している単鎖抗体断片、例えば、sdAbまたはscFvのような単鎖分子である。いくつかの態様において、抗原結合ドメインのうちの少なくとも1個は、VH-CH1（Fd）を含む第1の鎖およびVL-CLを含む第2の鎖を含有しているFabである。

いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物の第1または第2のポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、かつ/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかのケースにおいて、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインは、多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。

いくつかの態様において、抗原結合断片のうちの少なくとも1個は、Fabである。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、（i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む第1のポリペプチド；（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む第2のポリペプチド、ならびに（iii）腫瘍関連抗原に結合するFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLを含む第3のポリペプチドを含み、ここで、第1および/または第2のポリペプチドは、Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方をさらに含む。いくつかのケースにおいて、第1または第2のポリペプチドの一方のみが、Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方を含む。いくつかの態様において、第1もしくは第2のポリペプチドの両方が、Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方を含む。いくつかのケースにおいて、Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方は、多重特異性ポリペプチド構築物の第1または第2のポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。いくつかの態様において、Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方は、第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドのFc領域に対してアミノ末端側、および第1または第2のポリペプチドの他方のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている。

いくつかの例において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9、（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、ジャギドリガンド、ジャギド1、ジャギド2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン-1-リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3より選択される腫瘍抗原に結合する。

いくつかの態様において、多重特異性抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含み、ここで、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同一のTAAに結合する。いくつかのケースにおいて、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同一のTAAの異なるエピトープに結合する。いくつかの場合において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同一のTAAの同一のエピトープに結合する。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含み、ここで、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、異なるTAAに結合する。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合ドメインと免疫グロブリンFcポリペプチド領域（Fc領域）との間の第1の連結ペプチド（LP1）を含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、抗CD3結合ドメイン（CD3結合領域）と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合ドメインと免疫グロブリンFcポリペプチド領域（Fc領域）との間の第1の連結ペプチド（LP1）、および抗CD3結合ドメイン（CD3結合領域）と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む。

いくつかの態様において、未切断状態の多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ順に、以下の構造的配置を有する：第1の抗原結合ドメイン - LP1 - 免疫グロブリンFcポリペプチド領域（Fc領域） -（切断可能リンカーのような）リンカー - 抗CD3結合ドメイン - LP2 - 第2の抗原結合ドメイン。いくつかの態様において、未切断状態の多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ、以下の構造的配置を有する：第2の抗原結合ドメイン - LP2 - 抗CD3結合ドメイン（CD3結合領域） -（切断可能リンカーのような）リンカー - 免疫グロブリンFcポリペプチド領域 - LP1 - 第1の抗原結合ドメイン。いくつかの例において、リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの態様において、2個の連結ペプチドは、相互に同一でない。いくつかのケースにおいて、LP1またはLP2は、独立に、約1～20アミノ酸長のペプチドである。いくつかの例において、LP1またはLP2は、独立に、SEQ ID NO:10～13、119、135、147、149に示されるGly-Serリンカーであるかまたはそれを含むペプチドを含む。

いくつかの態様において、多重特異性構築物は、図1に示される構造的配置のいずれかを有する構築物である。いくつかの態様において、多重特異性構築物は、図2に示される構造的配置を有する二重特異性構築物である。いくつかの態様において、二重特異性構築物は、N末端からC末端へ、以下の構造的配置を有する。二重特異性構築物のN末端側は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメインを含む。第1の結合ドメインは、TAA標的の第1のエピトープに結合する。第1の抗原結合ドメインには、FcγR相互作用および/またはFcRn相互作用を制御する中央の免疫グロブリンFcポリペプチド領域がカップリングされている。いくつかの態様において、中央の免疫グロブリンFcポリペプチド領域は、ヘテロ二量体である。免疫グロブリンFcポリペプチド領域は、免疫グロブリンFcポリペプチド領域の末端のC末端側の位置に位置する、1つまたは複数のタンパク質切断部位を含有している切断可能リンカーにカップリングされている。いくつかの態様において、1つまたは複数のタンパク質切断部位は、マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、またはグランザイムBの基質である。切断可能リンカーは、Fc領域からC末端側に位置する抗CD3結合配列に付着しており、いくつかのケースにおいて、第2の成分の遠位末端に付着している。

いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合断片は、Fv抗体断片である。いくつかの態様において、Fv抗体断片は、ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）を含む。いくつかの態様において、抗CD3結合配列は、重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）との間にジスルフィド結合を含め、それによって、ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）を作製するため、改変されたFv抗体断片である。いくつかの態様において、抗CD3 Fvを構成するVHドメインおよびVLドメインは、ヘテロ二量体Fc領域の反対のメンバーに機能的に連結されている。これらの態様において、抗CD3 Fvは、1価でCD3に結合する。切断可能リンカーが完全である時、即ち、未切断または不活性の状態にある時、抗CD3 dsFvはCD3に係合しない。二重特異性構築物のC末端は、TAAに結合する第2の抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインは、第1の成分に位置する第1の抗原結合ドメインと同一のTAAに結合する。いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインは、TAAの第1のエピトープと競合しないTAAの第2のエピトープに結合する。いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインのものと異なるTAAに結合する。

いくつかの態様において、二重特異性構築物の第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々は、抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、二重特異性構築物の第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々は、Fab断片、F(ab')₂断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、二重特異性構築物の第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々は、1つまたは複数のシングルドメイン抗体（sdAb）断片、例えば、V_HH、V_NAR、改変型V_Hドメイン、または改変型V_Kドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。V_HHは、天然のラクダ科動物の重鎖のみの抗体、重鎖のみの抗体を産生する遺伝学的に修飾された齧歯類、またはナイーブ/合成のラクダ科動物もしくはヒト化ラクダ科動物シングルドメイン抗体ライブラリーから生成され得る。V_NARは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成され得る。界面改変および特異的な生殖系列ファミリーの選択を含む様々な方法が、従来のヘテロ二量体のV_HドメインおよびV_Kドメインから単量体sdAbを生成するために実施されている。

いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、sdAbである。いくつかのケースにおいて、sdAbは、ヒトまたはヒト化sdAbである。いくつかの局面において、sdAbは、VHH、VNAR、改変型VHドメイン、または改変型VKドメインである。いくつかの例において、抗体またはその抗原結合断片は、scFvである。いくつかのケースにおいて、抗体またはその抗原結合断片は、Fabである。

提供された態様のいずれかにおいて、抗CD3抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）を含むVH CDR1、アミノ酸配列

を含むVH CD2；アミノ酸配列

を含むVH CDR3；アミノ酸配列

を含むVL CDR1；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を含むVL CDR2；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を含むVL CDR3を含む。

いくつかの態様において、抗CD3 dsFvは、SEQ ID NO:14、44、および32～62のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:14、44、および32～62のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVH；ならびにSEQ ID NO:15、72、および63～81のいずれかのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:14、44、および32～62のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVLを含む。いくつかのケースにおいて、抗CD3 dsFvは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む。いくつかのケースにおいて、抗CD3 dsFvは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、第1の成分の免疫グロブリンFc領域は、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、およびIgG4サブクラスからなる群より選択されるIgGサブタイプである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、1つまたは複数の修飾を含む、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、グリコシル化を防止するため、Fc受容体相互作用を変更するため、Fc受容体結合を低下させるため、CD32Aとの相互作用を増強するため、補体タンパク質C1q結合を低下させるため、半減期を延長するため、FcRn結合を増強するため、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および/または補体依存性細胞傷害（CDC）を変更するため、ヘテロ二量体化を誘導するため、二量体化を防止するため、CH3:CH3界面におけるホモ二量体化を安定化するため、ならびにそれらの組み合わせのための1つまたは複数の修飾を含む、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、Fc領域内の修飾は、Fc受容体γ受容体との結合を低下させるが、新生児型Fc受容体（FcRn）との結合に対しては最小の影響を及ぼす。いくつかの態様において、変異型または修飾型のFcポリペプチドは、カバットナンバリングシステムを使用して、以下の変異を含む：Met252TyrおよびMet428LeuまたはMet252TyrおよびMet428Val（M252Y、M428LまたはM252Y、M428V）。

いくつかの態様において、第1の抗原結合ドメインおよび免疫グロブリンFcポリペプチドは、アミノ酸リンカーを介して機能的に連結されている。いくつかの態様において、これらの成分内リンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成され、本明細書中でGSリンカーと呼ばれる。本開示の融合タンパク質のGSリンカーは、様々な長さ、例えば、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、20アミノ酸長であり得る。

いくつかの態様において、GSリンカーは、

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、抗CD3εdsFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～81の群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3εdsFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～81からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～62の群より選択されるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:63～81からなる群より選択されるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～62からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列と、SEQ ID NO:63～81からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。

いくつかの態様において、第2の抗原結合ドメインおよび抗CD3結合ドメインは、アミノ酸リンカーを介して機能的に連結されている。いくつかの態様において、これらの成分内リンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成され、本明細書中でGSリンカーと呼ばれる。本開示の融合タンパク質のGSリンカーは、様々な長さ、例えば、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、20アミノ酸長であり得る。

いくつかの態様において、GSリンカーは、

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、ポリペプチドである。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、プロテアーゼの基質であるポリペプチドである。いくつかの態様において、プロテアーゼは、CD3εを発現する細胞の近傍の腫瘍によって産生され、かつ/または組織内のCD3εを発現する細胞と共局在する腫瘍によって産生され、ここで、多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼに曝された時、プロテアーゼは、多重特異性ポリペプチド構築物内の切断可能リンカーを切断する。いくつかの態様において、プロテアーゼは、1種または複数種の腫瘍関連抗原（TAA）を発現する細胞の近傍の腫瘍によって産生され、かつ/または組織内の標的TAAを発現する細胞と共局在する腫瘍によって産生され、ここで、多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼに曝された時、プロテアーゼは、多重特異性ポリペプチド構築物内の切断可能リンカーを切断する。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、50アミノ酸長までのポリペプチドである。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、25アミノ酸長までのポリペプチドである。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、15アミノ酸長までのポリペプチドである。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、本明細書中に記載されたプロテアーゼより選択されるプロテアーゼの基質である。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、uPA、レグマイン、（本明細書中でMT-SP1またはMTSP1とも呼ばれる）マトリプターゼ、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-9、MMP-12、MMP-13、MMP-14、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、uPA、レグマイン、およびマトリプターゼからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の基質である。

いくつかの態様において、多重特異性構築物は、多重特異性構築物にコンジュゲートされた薬剤も含む。いくつかの態様において、薬剤は、治療剤である。いくつかの態様において、薬剤は、検出可能モエティである。いくつかの態様において、検出可能モエティは、診断剤である。いくつかの態様において、薬剤は、リンカーを介して多重特異性構築物にコンジュゲートされている。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、非切断可能リンカーである。

いくつかの態様において、本明細書中に記載された多重特異性構築物は、1種もしくは複数種の付加的な薬剤または付加的な薬剤の組み合わせと共に使用される。適当な付加的な薬剤には、例えば、がんのような意図された適用のための現在の薬学的治療および/または外科的治療が含まれる。例えば、多重特異性構築物は、付加的な化学療法または抗腫瘍剤と共に使用され得る。

いくつかの態様において、多重特異性構築物および付加的な薬剤は、単一の治療用組成物に製剤化され、多重特異性構築物および付加的な薬剤は、同時に投与される。いくつかの態様において、多重特異性構築物および付加的な薬剤は、相互に別々であり、例えば、各々、別々の治療用組成物に製剤化され、多重特異性構築物および付加的な薬剤は、同時に投与されるか、または多重特異性構築物および付加的な薬剤は、処置計画中の異なる時点で投与される。例えば、多重特異性構築物が付加的な薬剤の投与の前に投与されるか、多重特異性構築物が付加的な薬剤の投与の後に投与されるか、または多重特異性構築物および付加的な薬剤が交互に投与される。本明細書中に記載されるように、多重特異性構築物および付加的な薬剤は、単回投与されるかまたは複数回投与される。

いくつかの態様において、多重特異性構築物は、天然に、1つまたは複数のジスルフィド結合を含有している。いくつかの態様において、多重特異性構築物は、1つまたは複数のジスルフィド結合を含むよう改変されていてもよい。

本開示は、本明細書中に記載された多重特異性構築物の少なくとも一部分をコードする単離された核酸分子もしくはポリヌクレオチド、ならびに/または、例えば、少なくとも、多重特異性構築物の第1の成分の少なくとも一部分をコードする第1の核酸および多重特異性構築物の第2の成分の少なくとも一部分をコードする第2の核酸のような、本明細書中に記載された多重特異性構築物をコードする1種もしくは複数種の核酸分子、ならびにこれらの単離された核酸配列を含むベクターも提供する。

提供された態様には、提供された多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチドが含まれる。提供された多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドも、提供される。提供された多重特異性構築物のいずれかの第1のポリペプチドをコードする第1の核酸配列、および多重特異性構築物の第2のポリペプチドをコードする第2の核酸配列を含むポリヌクレオチドが、さらに提供され、ここで、第1および第2の核酸配列は、配列内リボソーム進入部位（IRES）または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって分離されている。いくつかのケースにおいて、第1の核酸配列および第2の核酸配列は、同一のプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、第3のポリペプチド鎖を含み、ポリヌクレオチドは、多重特異性構築物の第3のポリペプチドをコードする第3の核酸をさらに含む。いくつかの態様において、第3の核酸は、配列内リボソーム進入部位（IRES）または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって、第1および/または第2のポリペプチドから分離されており、かつ/または第3の核酸配列は、第1および/または第2の核酸配列と同一のプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの例において、自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸は、（SEQ ID NO:159～164、またはSEQ ID NO:165に示される配列によってコードされる）T2A、P2A、E2A、またはF2Aより選択される。

提供されたポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターが、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの例において、ベクターは、ウイルスベクターまたは真核生物ベクターであり、任意で、真核生物ベクターは、哺乳動物ベクターである。

提供されたポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む細胞が、提供される。いくつかのケースにおいて、細胞は、組換えであるかまたは単離されている。いくつかの例において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの例において、細胞は、HEK293細胞またはCHO細胞である。

本開示は、多重特異性構築物の発現をもたらす条件の下で、そのような核酸配列を含む細胞を培養することによって、多重特異性構築物を作製する方法を提供する。いくつかの態様において、細胞は、そのようなベクターを含む。

提供されたポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを細胞へ導入する工程、および多重特異性ポリペプチド構築物を作製するため、多重特異性構築物の発現をもたらす条件の下で、細胞を培養する工程を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法が、本明細書中に提供される。多重特異性ポリペプチドが細胞によって発現または産生される条件の下で、提供された細胞のいずれかを培養する工程を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法も、提供される。いくつかのケースにおいて、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの例において、細胞は、HEK293細胞またはCHO細胞である。いくつかの態様において、方法は、細胞から多重特異性ポリペプチド構築物を単離するかまたは精製する工程をさらに含む。いくつかのケースにおいて、多重特異性ポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体である。

提供された方法のいずれかによって作製された多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供される。

標的細胞およびT細胞を、提供された多重特異性ポリペプチド構築物または薬学的組成物のいずれかと接触させる工程を含む、免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法が、本明細書中に提供され、ここで、標的細胞は、多重特異性ポリペプチド構築物によって認識される腫瘍関連抗原を発現している。いくつかの態様において、標的細胞は、腫瘍関連抗原（TAA）を発現する腫瘍細胞である。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、プロテアーゼの基質として機能する切断可能リンカーを含み、免疫応答の誘導または刺激が、プロテアーゼの存在下で増加する。いくつかのケースにおいて、プロテアーゼは、免疫エフェクター細胞によって、腫瘍によって、または腫瘍微小環境に存在する細胞によって産生される。

いくつかの態様において、プロテアーゼは、免疫エフェクター細胞によって産生され、免疫エフェクター細胞は、活性化T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、またはNK T細胞である。いくつかの場合において、免疫エフェクター細胞は、抗原を発現する細胞の近傍にある。いくつかの態様において、プロテアーゼは、組織内のTAAを発現する細胞の近傍の腫瘍によって産生され、かつ/または組織内のTAAと共局在している腫瘍によって産生され、多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼに曝された時、プロテアーゼは、多重特異性ポリペプチド構築物内の切断可能リンカーを切断する。いくつかの例において、プロテアーゼは、マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせより選択される。いくつかの場合において、プロテアーゼは、グランザイムBである。

いくつかの態様において、接触は、エクスビボまたはインビトロで実施される。いくつかの態様において、接触は、対象においてインビボで実施される。

提供された多重特異性コンジュゲートまたは薬学的組成物のいずれかを、治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法が提供される。いくつかのケースにおいて、方法は、細胞性免疫を増加させる。いくつかの態様において、方法は、T細胞活性を増加させる。いくつかの態様において、方法は、細胞溶解性T細胞（CTL）活性を増加させる。いくつかの例において、腫瘍またはがんに対する免疫応答が増加する。いくつかの態様において、方法は、対象における疾患または状態を処置する。

本開示は、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物を、そのような処置または防止が望まれる対象へ投与することによって、1種もしくは複数種の病理を処置するか、防止するか、その進行を遅延させるか、もしくは他の方法でその症状を寛解させるか、またはそのような病理に関連した症状を緩和する方法も提供する。提供された多重特異性コンジュゲートまたは薬学的組成物のいずれかを、治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における疾患または状態を処置する方法が、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、疾患または状態は、腫瘍またはがんである。

提供された方法のいずれかのいくつかの態様において、処置される対象のような対象は、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物である。提供された方法のいずれかのいくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、非ヒト霊長類、ペット（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、実験動物、または動物園の動物のような非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、齧歯類である。

これらの方法および使用の態様のいずれかにおいて使用される本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、疾患の任意の段階で投与され得る。例えば、そのような多重特異性ポリペプチド構築物は、初期から転移性までの任意の段階のがんに罹患した患者へ投与され得る。対象および患者という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。

これらの方法および使用の態様のいずれかにおいて使用される本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、ネオアジュバント治療を含む処置計画において使用され得る。

これらの方法および使用の態様のいずれかにおいて使用される本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、単独で投与されてもよいし、または低分子阻害剤、他の抗体に基づく治療、ポリペプチドもしくはペプチドに基づく治療、核酸に基づく治療、および/もしくは他の生物製剤を含む1種もしくは複数種の付加的な薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、非限定的な例として、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞傷害性抗生物質、およびその他の核酸傷害剤のような、化学療法剤のような、1種または複数種の付加的な薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、パクリタクセル（例えば、Abraxane（登録商標））のようなタキサンである。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、ゲムシタビンのような代謝拮抗薬である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、カルボプラチンまたはシスプラチンのような白金に基づく化学療法のようなアルキル化剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブまたはエルロチニブのような標的型薬剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、別の抗体、例えば、モノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ）、二重特異性抗体、または多重特異性抗体のような標的型薬剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、ボルテゾミブまたはカルフィルゾミブのようなプロテアソーム阻害剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、レナリドミドまたはIL-2のような免疫調節剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、放射線である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、当業者によって標準治療と見なされる薬剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、当業者に周知の化学療法剤である。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、単一の組成物に製剤化される。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、2種以上の別々の組成物として投与される。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、同時に投与される。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、連続的に投与される。

いくつかの態様において、付加的な薬剤は、ドセタキセル、パクリタクセル、アブラキサン（即ち、アルブミンとコンジュゲートされたパクリタクセル）、ドキソルビシン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、イリノテカン、およびゲムシタビンからなる群より選択される化学療法剤のような化学療法剤である。

いくつかの態様において、付加的な薬剤は、チェックポイント阻害剤、キナーゼ阻害剤腫瘍微小環境の阻害剤を標的とする薬剤、および/またはT細胞もしくはNKのアゴニストである。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、単独の、または化学療法剤もしく抗腫瘍剤のような別の付加的な薬剤と組み合わせられた放射線治療である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、ワクチン、オンコウイルス、ならびに/または、非限定的な例として、トール様受容体（TLR）アゴニストおよび/もしくはαCD40のようなDC活性化剤である。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、ADCCを介して、または毒素との直接コンジュゲーションを介して（例えば、抗体薬物コンジュゲート（ADC））、腫瘍を死滅させるよう設計された腫瘍標的型抗体である。

いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤は、CTLA-4、LAG-3、PD-1、PDL1、TIGIT、TIM-3、B7H3、B7H4、およびVistaからなる群より選択される標的の阻害剤である。いくつかの態様において、キナーゼ阻害剤は、B-RAFi、MEKi、およびイブルチニブのようなBtk阻害剤からなる群より選択される。いくつかの態様において、キナーゼ阻害剤は、クリゾチニブである。いくつかの態様において、腫瘍微小環境阻害剤は、IDO阻害剤、αCSF1R阻害剤、αCCR4阻害剤、TGFβ、骨髄系由来サプレッサー細胞、またはT制御性細胞からなる群より選択される。いくつかの態様において、アゴニストは、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、CD27、およびHVEMからなる群より選択される。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤は、CTLA-4、PD-1、および/またはPD-L1より選択される標的に結合する抗体である。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤は、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、および抗PD-L1抗体、ならびに/またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤は、例えば、Yervoy（商標）のような抗CTLA4抗体である。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤は、例えば、Opdivo（商標）および/またはKeytruda（商標）のような抗PD-1抗体である。

いくつかの態様において、阻害剤は、CTLA-4阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、LAG-3阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、PD-1阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、PDL1阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、TIGIT阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、TIM-3阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、B7H3阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、B7H4阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、Vista阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、B-RAFi阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、MEKi阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、Btk阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、イブルチニブである。いくつかの態様において、阻害剤は、クリゾチニブである。いくつかの態様において、阻害剤は、IDO阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、αCSF1R阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、αCCR4阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、TGFβである。いくつかの態様において、阻害剤は、骨髄系由来サプレッサー細胞である。いくつかの態様において、阻害剤は、T制御性細胞である。

いくつかの態様において、アゴニストは、OX40である。いくつかの態様において、アゴニストは、GITRである。いくつかの態様において、アゴニストは、CD137である。いくつかの態様において、アゴニストは、CD28である。いくつかの態様において、アゴニストは、ICOSである。いくつかの態様において、アゴニストは、CD27である。いくつかの態様において、アゴニストは、HVEMである。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、例えば、化学療法剤、抗炎症剤、および/または免疫抑制剤のような1種または複数種の付加的な薬剤と組み合わせて、処置の途中および/または後に投与される。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、単一の治療用組成物に製剤化され、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、同時に投与される。あるいは、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、相互に別々であり、例えば、各々が別々の治療用組成物に製剤化され、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、同時に投与されるか、または多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、処置計画中の異なる時点で投与される。例えば、多重特異性ポリペプチド構築物が付加的な薬剤の投与の前に投与されるか、多重特異性ポリペプチド構築物が付加的な薬剤の投与の後に投与されるか、または多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤が交互に投与される。本明細書中に記載されるように、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、単回投与されるかまたは複数回投与される。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、同時に投与される。例えば、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、単一の組成物に製剤化されてもよいし、または2種以上の別々の組成物として投与されてもよい。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、連続的に投与されるか、または多重特異性ポリペプチド構築物および付加的な薬剤は、処置計画中の異なる時点で投与される。

前記の要素に加えて、多重特異性ポリペプチド構築物は、例えば、多重特異性ポリペプチド構築物のN末端側またはC末端側のアミノ酸配列のような付加的な要素を含有していてもよい。例えば、多重特異性ポリペプチド構築物は、関心対象の細胞または組織への送達を容易にするターゲティングモエティを含んでいてよい。多重特異性ポリペプチド構築物は、治療剤、検出可能モエティ、または診断剤のような薬剤にコンジュゲートされていてもよい。薬剤の例は、本明細書中に開示される。

多重特異性ポリペプチド構築物は、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物と共に、コンジュゲートされた薬剤、リンカー、および本明細書中に記載されたその他の成分のいずれかも含んでいてよい。

本開示は、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物に由来する酵素活性毒素、またはそれらの断片）のような細胞傷害性薬剤、または放射性同位体（即ち、ラジオコンジュゲート）にコンジュゲートされた多重特異性ポリペプチド構築物を含むイムノコンジュゲートにも関する。T細胞由来リンパ腫等において疾患T細胞を標的とするために使用するための適当な細胞傷害性薬剤には、例えば、ドラスタチンおよびその誘導体（例えば、アウリスタチンE、AFP、MMAD、MMAF、MMAE）が含まれる。いくつかの態様において、薬剤は、ドラスタチンである。いくつかの態様において、薬剤は、アウリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの態様において、薬剤は、マイタンシノイドまたはマイタンシノイド誘導体である。いくつかの態様において、薬剤は、DM1またはDM4である。いくつかの態様において、薬剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの態様において、薬剤は、カリチアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの態様において、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物と細胞傷害性薬剤との間のリンカーは、切断可能である。いくつかの態様において、リンカーは、非切断可能である。いくつかの態様において、2個以上のリンカーが存在する。2個以上のリンカーは、全て同一であり、例えば、切断可能もしくは非切断可能であるか、または2個以上のリンカーは、異なり、例えば、少なくとも1個が切断可能であり、少なくとも1個が非切断可能である。

多重特異性ポリペプチド構築物およびそのコンジュゲートは、多様な障害および/または疾患を処置する方法において有用である。疾患の非限定的な例には、全ての型のがん（乳がん、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、黒色腫、頭頸部がん、膵臓がん等）、関節リウマチ、クローン病、SLE、心血管傷害、虚血等が含まれる。例えば、適応症には、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）を含む白血病、多発性骨髄腫を含むリンパ芽球性疾患、ならびに肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、および三種陰性乳がんを含む乳がんを含む固形腫瘍が含まれるであろう。例えば、適応症には、骨疾患もしくは原発腫瘍起源に関わらないがんの転移；非限定的な例として、ER/PR+乳がん、Her2+乳がん、三種陰性乳がんを含む乳がん；結腸直腸がん；子宮内膜がん；胃がん；膠芽腫；食道がんのような頭頸部がん；非限定的な例として、非小細胞肺がんのような肺がん；多発性骨髄腫；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；骨肉腫のような肉腫；非限定的な例として、腎細胞がんのような腎臓がん；および/または、非限定的な例として、扁平上皮がん、基底細胞がん、もしくは黒色腫のような皮膚がんが含まれる。いくつかの態様において、がんは、扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、皮膚扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、食道扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、頭頸部扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、肺扁平上皮がんである。

本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が、提供される。いくつかのケースにおいて、薬学的組成物は、無菌である。本開示による薬学的組成物は、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物および担体を含んでいてよい。これらの薬学的組成物は、例えば、診断キットのようなキットに含まれていてよい。

当業者は、本開示の抗体が多様な使用を有することを認識するであろう。例えば、本開示のタンパク質は、多様な障害のための治療剤として使用される。本開示の抗体は、診断キット内の試薬または診断ツールとしても使用され、またはこれらの抗体は、治療用試薬を生成するため、競合アッセイにおいて使用されてもよい。
[本発明1001]
免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分を含む、多重特異性ポリペプチド構築物であって、
第1および第2の成分がリンカーによってカップリングされており、Fc領域がCD3結合領域のN末端側に位置付けられており；
第1および第2の成分の一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む、
多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1002]
CD3結合領域がCD3（CD3ε）に結合する、本発明1001の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1003]
抗原結合ドメインが、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられ、かつ/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、本発明1001または本発明1002の多重特異性構築物。
[本発明1004]
第1の成分が第1の抗原結合ドメインを含み、第2の成分が第2の抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインの各々が腫瘍関連抗原（TAA）に結合する、本発明1001～1003のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1005]
第1の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、本発明1004の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1006]
N末端からC末端へ順に、
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；
免疫グロブリンFc領域；
リンカー；
CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメイン
を含む、多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1007]
Fc領域が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、もしくはヒトIgG4のFc領域であるか、またはそれらの免疫活性断片である、本発明1001～1006のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1008]
Fc領域が、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、もしくはSEQ ID NO:1との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列、もしくはSEQ ID NO:2との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列、もしくはSEQ ID NO:4との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；または
SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列、もしくはSEQ ID NO:5との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド
を含む、本発明1001～1007のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1009]
Fc領域がヘテロ二量体Fc領域である、本発明1001～1008のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1010]
ヘテロ二量体Fc領域の一方または両方のFcポリペプチドが、ホモ二量体Fc領域のポリペプチドと比較して、任意で、SEQ ID NO:1に示されるFcポリペプチドまたはその免疫活性断片と比較して、ヘテロ二量体化を促進するための少なくとも1個の修飾を含む、本発明1009の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1011]
ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドの各々が、ノブイントゥホール修飾を含むか、またはポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異を含む、本発明1010の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1012]
ヘテロ二量体Fcの第1のFcポリペプチドが、Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val、およびそれらの組み合わせより選択される修飾を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のFcポリペプチドが修飾T366Wを含み、任意で、第1および第2のFcポリペプチドが非システイン残基のシステイン残基への修飾をさらに含み、第1のポリペプチドの修飾が位置Ser354およびY349の一方にあり、第2のFcポリペプチドの修飾が位置Ser354およびY349の他方にある、本発明1010および本発明1011の多重特異性融合ポリペプチド。
[本発明1013]
アミノ酸修飾がポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異である、本発明1011の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1014]
Fc領域が、修飾Ile253ArgまたはHis435Argを含むポリペプチドを含む、本発明1001～1013のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1015]
Fc領域が、FcRn結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む、本発明1001～1014のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1016]
修飾が、Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある、本発明1015の多重特異性融合ポリペプチド。
[本発明1017]
ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドが、SEQ ID NO:82、86、94、または96のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドが、SEQ ID NO:83、87、90、92、98、または100のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、本発明1009～1016のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1018]
Fc領域が、
エフェクター機能を低下させかつ/またはFcγ受容体もしくはC1qより選択されるエフェクター分子との結合を低下させる少なくとも1個のアミノ酸修飾を含むポリペプチド
を含む、本発明1001～1017のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1019]
1つまたは複数のアミノ酸修飾が、Glu233、Leu234、またはLeu235のうちの1つまたは複数の欠失である、本発明1018の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1020]
ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドが、SEQ ID NO:84、88、95、または97のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドが、SEQ ID NO:85、89、91、93、99、または101のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、本発明1009～1016、1018、および1019のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1021]
CD3結合領域が抗CD3抗体または抗原結合断片である、本発明1001～1020のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1022]
抗CD3抗体または抗原結合断片が、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む、本発明1021の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1023]
CD3結合領域が1価である、本発明1001～1022のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1024]
抗CD3抗体または抗原結合断片が単鎖抗体ではなく、任意で、単鎖可変断片（scFv）ではない、本発明1021～1023のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1025]
Fcがヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLがヘテロ二量体Fcの反対のポリペプチドに連結されている、本発明1022～1024のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1026]
抗原結合ドメインのうちの少なくとも1個がそのTAAに結合しない限り、任意で、抗原結合ドメインのうちの少なくとも2個がそのTAAに結合しない限り、CD3結合領域が、CD3に結合または係合することができないかまたは実質的にできない、本発明1001～1025のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1027]
リンカーがポリペプチドリンカーである、本発明1001～1026のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1028]
リンカーが切断可能リンカーである、本発明1001～1027のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1029]
ヘテロ二量体Fc領域を含む第1の成分と、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む抗CD3抗体または抗原結合断片を含む第2の成分とを含む、多重特異性ポリペプチド構築物であって、
抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLがヘテロ二量体Fcの反対のポリペプチドに連結されており；
第1および第2の成分が切断可能リンカーによってカップリングされており、ヘテロ二量体Fc領域が抗CD3抗体のN末端側に位置付けられており；かつ
第1および第2の成分の一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む、
多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1030]
多重特異性ポリペプチド構築物が未切断状態にある時、切断状態と比較して、CD3結合領域のCD3との結合が実質的に低下する、本発明1028または本発明1029の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1031]
切断可能リンカーが、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、本発明1028～1030のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1032]
免疫エフェクター細胞によって、腫瘍によって、または腫瘍微小環境に存在する細胞によって、プロテアーゼが産生される、本発明1031の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1033]
プロテアーゼが、マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせより選択される、本発明1031または本発明1032の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1034]
プロテアーゼがグランザイムBである、本発明1033の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1035]
切断可能リンカーが、
一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:150）（P4はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、またはAであり；P3はアミノ酸A、G、S、V、E、D、Q、N、またはYであり；P2はアミノ酸H、P、A、V、G、S、またはTであり；P1はアミノ酸DまたはEであり；P1'はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G、またはAである）のアミノ酸配列、
任意で、一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:151）（P4はアミノ酸IまたはLであり；P3はアミノ酸Eであり；P2はアミノ酸PまたはAであり；P1はアミノ酸Dであり；P1'はアミノ酸I、V、T、S、またはGである）のアミノ酸配列
を含む、本発明1028～1034のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1036]
切断可能リンカーが、アミノ酸配列IEPDI（SEQ ID NO:136）、LEPDG（SEQ ID NO:152）、LEADT（SEQ ID NO:137）、IEPDG（SEQ ID NO:138）、IEPDV（SEQ ID NO:139）、IEPDS（SEQ ID NO:140）、IEPDT（SEQ ID NO:141）、またはLEADG（SEQ ID NO:153）を含む、本発明1028～1035のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1037]
切断可能リンカーが、SEQ ID NO:22、105～112、136～141、148、150～153からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1028～1036のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1038]
プロテアーゼがマトリプターゼである、本発明1033の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1039]
切断可能リンカーが、
配列P4QAR↓(A/V)（SEQ ID NO:154）（P4は任意のアミノ酸である）、
任意で、配列RQAR(A/V)（SEQ ID NO:155）または配列RQARV（SEQ ID NO:156）
を含む、本発明1028～1038のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1040]
切断可能リンカーが、SEQ ID NO:23、154～156からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1028～1039のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1041]
プロテアーゼが、MMP、任意でMMP-2である、本発明1033の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1042]
切断可能リンカーが、
一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:157）（P3はP、V、またはAであり；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はL、I、またはMである）、
任意で、一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:158）（P；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はLまたはIである）、
任意で、配列PAGL（SEQ ID NO:24）
を含む、本発明1028～1041のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1043]
切断可能リンカーが、SEQ ID NO:22～31、104～114、117～118、136～144、148、150～158からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1028～1042のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1044]
（i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む、第1のポリペプチド；ならびに
（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む、第2のポリペプチド
を少なくとも含み、
第1および第2のポリペプチドの一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む、
本発明1025～1043のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1045]
TAAに結合する1つまたは複数の抗原結合ドメインが、TAAとの1価、2価、3価、または4価の結合をもたらす、本発明1001～1044のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1046]
少なくとも1個の抗原結合ドメインが、多重特異性ポリペプチド構築物の第1もしくは第2ポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、かつ/もしくはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられているか；または
少なくとも1個の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、
本発明1044または本発明1045の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1047]
抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片である、本発明1001～1046のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1048]
抗体またはその抗原結合断片が、Fv、scFv、Fab、シングルドメイン抗体（sdAb）、V_NAR、またはV_HHである、本発明1047の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1049]
抗体または抗原結合断片がFabであり、多重特異性ポリペプチド構築物が、
（i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む、第1のポリペプチド；
（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む、第2のポリペプチド、ならびに
（iii）腫瘍関連抗原に結合するFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLを含む、第3のポリペプチド
を含み、
第1および/または第2のポリペプチドがFab抗体断片のVH-CH1(Fd)またはVL-CLの他方をさらに含む、
本発明1047または本発明1048の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1050]
第1もしくは第2のポリペプチドの一方のみがFab抗体断片のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLの他方を含むか；または
第1もしくは第2のポリペプチドの両方がFab抗体断片のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLの他方を含む、
本発明1049の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1051]
Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLの他方が、多重特異性ポリペプチド構築物の第1もしくは第2のポリペプチドの一方のFc領域のアミノにおよび/もしくはCD3結合領域のカルボキシに位置付けられているか；または
Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLの他方が、第1のポリペプチドもしくは第2のポリペプチドのFc領域のアミノにおよび第1もしくは第2のポリペプチドの他方のCD3結合領域のカルボキシに位置付けられている、
本発明1049または本発明1050の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1052]
抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9、（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、ジャギド（Jagged）リガンド、ジャギド1、ジャギド2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン（Nicastrin）、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン-1-リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3より選択される腫瘍抗原に結合する、本発明1001～1051のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1053]
少なくとも第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを含み、
第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが同一のTAAに結合する、
本発明1001～1052のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1054]
少なくとも第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを含み、
第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが異なるTAAに結合する、
本発明1001～1053のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1055]
第1の抗原結合ドメインとFc領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）およびCD3結合領域と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含み、
N末端からC末端へ以下の構造的配置：第1の抗原結合ドメイン - LP1 - Fc領域 - リンカー - CD3結合領域 - LP2 - 第2の抗原結合ドメインを有する、
本発明1006～1054のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1056]
抗CD3抗体または抗原結合断片がFv抗体断片である、本発明1021～1055のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1057]
Fv抗体断片がジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）を含む、本発明1056の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1058]
抗CD3抗体または抗原結合断片が、
アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）を含むVH CDR1；
アミノ酸配列

を含むVH CD2；
アミノ酸配列

を含むVH CDR3；
アミノ酸配列

を含むVL CDR1；
アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を含むVL CDR2；および
アミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を含むVL CDR3
を含む、本発明1021～1057のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1059]
抗CD3 dsFvが、
SEQ ID NO:14および32～62のいずれかのアミノ酸配列またはSEQ ID NO:14および32～62のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVH；ならびに
SEQ ID NO:15および63～81のいずれかのアミノ酸配列またはSEQ ID NO:14および32～62のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVL
を含む、本発明1057または本発明1058の多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1060]
抗CD3 dsFvが、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列；またはSEQ ID NO:44のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む、本発明1057～1059のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1061]
多重特異性ポリペプチド構築物が薬剤にコンジュゲートされており、任意で、薬剤が、治療剤、抗腫瘍剤、毒素もしくはその断片、検出可能モエティ、または診断剤である、本発明1001～1060のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1062]
本発明1001～1061のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1063]
本発明1001～1061のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかのポリペプチド鎖をコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1064]
本発明1001～1061のいずれかの多重特異性構築物の第1のポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、該多重特異性構築物の第2のポリペプチドをコードする第2の核酸配列とを含む、ポリヌクレオチドであって、
第1および第2の核酸配列が、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって、分離されている、
ポリヌクレオチド。
[本発明1065]
前記多重特異性ポリペプチド構築物が第3のポリペプチド鎖を含み、
前記ポリヌクレオチドが、該多重特異性構築物の第3のポリペプチドをコードする第3の核酸をさらに含み、
任意で、第3の核酸が、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって、第1および/または第2のポリペプチドから分離されており、かつ/あるいは
第3の核酸配列が第1および/または第2の核酸配列と同一のプロモーターに機能的に連結されている、
本発明1064のポリヌクレオチド。
[本発明1066]
本発明1062～1065のいずれかのポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1067]
本発明1062～1065のいずれかの1つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含む、細胞。
[本発明1068]
本発明1062～1065のいずれかの1つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは本発明1066のベクターを細胞へ導入する工程、および
多重特異性ポリペプチド構築物が産生される条件下で該細胞を培養する工程
を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法。
[本発明1069]
多重特異性ポリペプチドが細胞によって産生される条件の下で本発明1067の細胞を培養する工程を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法。
[本発明1070]
本発明1068または本発明1069の方法によって作製された、多重特異性ポリペプチド構築物。
[本発明1071]
本発明1001～1061および本発明1070のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1072]
標的細胞およびT細胞を、本発明1001～1061および本発明1070のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物または本発明1071の薬学的組成物と接触させる工程を含む、免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法であって、標的細胞が、多重特異性ポリペプチド構築物によって認識される腫瘍関連抗原を発現している、方法。
[本発明1073]
標的細胞が腫瘍関連抗原（TAA）を発現している腫瘍細胞である、本発明1072の方法。
[本発明1074]
多重特異性ポリペプチド構築物が、プロテアーゼの基質として機能する切断可能リンカーを含み、免疫応答の誘導または刺激がプロテアーゼの存在下で増加する、本発明1072または本発明1073の方法。
[本発明1075]
プロテアーゼが、マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせより選択される、本発明1072～1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
接触が、エクスビボで、インビトロで、または対象においてインビボで実施される、本発明1072～1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
本発明1001～1061および本発明1070のいずれかの多重特異性コンジュゲートまたは本発明1080の薬学的組成物を治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法。
[本発明1078]
腫瘍またはがんに対する免疫応答が増加する、本発明1077の方法。
[本発明1079]
対象における疾患または状態を処置する、本発明1072～1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
本発明1001～1061および1070のいずれかの多重特異性コンジュゲートまたは本発明1071の薬学的組成物を治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における疾患または状態を処置する方法。
[本発明1081]
疾患または状態が腫瘍またはがんである、本発明1079または本発明1080の方法。
[本発明1082]
対象がヒトである、本発明1076～1081のいずれかの方法。

図1は、制約されたCD3結合を有する本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の基本成分の模式図である。抗原結合ドメインは、アミノ末端および/またはカルボキシ末端に位置付けられている。ヘテロ二量体Fc領域のようなFc領域は、CD3結合領域のN末端側に位置付けられている。このCD3結合領域と非常に近接したFcの位置付けは、CD3結合を妨げる。図2は、切断可能リンカーを含有しており、二重のエフェクター機能を有する本開示の多重特異性分子の例示的な構造を示す図であり、ここで、切断可能リンカーのタンパク質切断は、生物学的活性を各々有する2種の成分を産生する、多重特異性ポリペプチド構築物の活性化をもたらす。図3は、2種のポリペプチド、鎖1および鎖2から構成された、FRαを標的とする様々な制約CD3構築物の模式図である。上のパネルは、例えば、MTSP1、MMP、および/またはグランザイムBのうちの1種または複数種のためのプロテアーゼ基質認識部位を含有している切断可能リンカーを有する切断可能多重特異性ポリペプチド構築物の例示的な図を提供する。鎖1は、第2のFRαsdAbに連結された抗CD3 VLドメインにプロテアーゼ切断可能リンカー（cx1547：グランザイムBのみ、cx309：MTSP1、MMP、およびグランザイムB）を介して連結されたヘテロ二量体Fc「ホール」に連結されたFRαsdAb（抗原結合ドメイン）を含有している。鎖2は、第2のFRαsdAbに連結された抗CD3 VHドメインに前記と同一のプロテアーゼリンカーを介して連結された相補的なヘテロ二量体Fc「ノブ」に連結されたFRαsdAbを含有している。図3の下のパネルは、リンカーが非切断可能リンカー（cx1356における3アミノ酸からcx681における18アミノ酸まで）である以外は、上のパネルと類似の配置を示す。同時発現させた時、CD3結合ドメインは、それぞれ、ホールおよびノブにおけるVL:VHの会合を介して適切に組み立てられる。図4A～4Cは、生成された構築物におけるCD3結合を制約するリンカーの効果を比較するために生成された構築物を図示する。図4Aは、CD3結合領域のドメインにヘテロ二量体Fcの各Fcポリペプチドをカップリングするため、同一の切断可能リンカーを各ポリペプチド鎖に含有している、多重特異性ポリペプチド構築物の例を図示する（例示的な構築物cx1762が示される）。図4Aに示されるフォーマットにおいては、未切断状態の構築物が図示されている。構築物の別のバージョンが図4Bに示され、ここでは、Fc領域をCD3結合ドメインに連結するために、1個の切断可能リンカーのみが利用されており、半分切断と名付けられた（例示的な構築物cx3238が示される）。図4Cは、完全に切断された時の図4Aおよび4Bの構築物のフォーマットのC末端部分を表す構造を図示する（例示的な構築物cx2190が示される）。タンパク質切断産物を表す構築物は、示された様々な鎖を同時発現させることによって組換え作製され得る。FRαを標的とするsdAbは、各構築物において、C末端の位置に位置付けられている。図5A～5Eは、代表的なEGFR標的型およびEGFR/cMET二重標的型の制約CD3エンゲージャーを示す。図5Aにおいて、cx2513は、ヘテロ二量体の各鎖のC末端に位置付けられたEGFRを標的とするsdAbを有し、それによって、EGFRとの2価の結合を示す。図5Bにおいて、cx3030は、ヘテロ二量体の各鎖のN末端およびC末端の両方に位置付けられたEGFRを標的とするsdAbを有し、それによって、EGFRとの4価の結合を示す。図5C、cx2973は、ヘテロ二量体の各鎖のN末端に位置付けられたcMETを標的とするsdAb、およびC末端に位置付けられたEGFRを標的とするsdAbを有し、それによって、cMETおよびEGFRの各々との2価の結合を示す。図5Dにおいて、cx2979は、ヘテロ二量体の一方の鎖のN末端に位置付けられたcMETを標的とするsdAb、およびヘテロ二量体の各鎖のC末端に位置付けられたEGFRを標的とするsdAbを有し、それによって、cMETとの1価の結合およびEGFRとの2価の結合を示す。図5Eにおいて、cx2977は、ヘテロ二量体の一方の鎖のN末端に位置付けられたcMETを標的とするsdAb、および他方の鎖のC末端に位置付けられたEGFRを標的とするsdAbを有し、それによって、cMETおよびEGFRの各々との1価の結合を示す。図6Aおよび6Bは、例示的なB7H3標的型制約CD3エンゲージャーを組み立てるための成分鎖の模式図である。これらの代表的な構築物において利用されたB7H3結合ドメインには、sdAb、scFv、またはFABが含まれていた。概して、sdAbおよびscFvを含有している構築物は、2本のヘテロ二量体鎖として構成され、FABを含有している構築物は、同族軽鎖のための第3の鎖（VL-CL）を含んでいた。図6Aの説明を参照のこと。図7は、5T4を標的とする制約CD3エンゲージャーを図示する。分子のコアは、ヘテロ二量体Fcに後続する切断可能リンカーおよびジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fvを含有するよう生成された。これらの分子のTAA結合部分は、いずれかのヘテロ二量体Fc鎖のN末端またはC末端に置かれた。上の列において、TAA結合単位は、ノブポリペプチドのN末端およびホールポリペプチドのC末端にあるFd（VH-CH1）から構成されたFabである。Fabが結合単位であるケースにおいては、第3の鎖（軽鎖VL-CL）を、Fdと会合させるため発現させた。中央および下の列において、TAA結合単位は、両方ともノブポリペプチドのN末端およびC末端に位置付けられたシングルドメイン抗体である。中央の列において、生成された構築物のTAA結合sdAbは、同一であり、下の列において、生成された構築物のTAA結合sdAbは、異なるエピトープを有する異なる配列である。図8は、CD20結合ドメインがCD20抗体GA101に由来するscFvである、代表的なCD20標的型制約CD3係合構築物cx3309の模式図である。図9は、DLL3結合ドメインがscFvである、代表的なDLL3標的型制約CD3係合構築物cx3308の模式図である。この例示的な構築物は、CD3結合ドメインおよびDLL3結合scFvの1個の成分に連結されたヘテロ二量体Fcの相補的な成分を各々含む2本の鎖から構成される。組み立てられた形態において、構築物は、DLL3に対して2価であり、Fcヘテロ二量体のC末端側に位置付けられたCD3結合ドメインを有する。図10Aは、還元条件（R）および非還元条件（NR）における、代表的なFRα標的型制約CD3係合構築物cx1547のSDS-PAGEの画像である。予想分子量135kDa。図10Bおよび10Cは、cx1547のサイズ排除分析からのクロマトグラムのグラフであり、それが137.9kDaという決定された分子量を有する単一の種であることを証明している。図10Bおよび10Cは、cx1547のサイズ排除分析からのクロマトグラムのグラフであり、それが137.9kDaという決定された分子量を有する単一の種であることを証明している。図10Cは、図10Bに示される主要ピーク付近の拡大表示である。図11Aおよび11Bは、未切断状態またはタンパク質切断状態における、本明細書中でcx309と呼ばれる本開示の例示的な多重特異性ポリペプチド構築物のヒトT細胞に結合する結合能力を証明する1対のグラフである。マトリプターゼおよびMMP-2が、それぞれ、図11Aおよび図11Bにおいて、cx309を切断するために使用された。図11Aの説明を参照のこと。図12A～12Dは、代表的なFRαを標的とする制約CD3係合構築物cx1356、cx681、およびcx1547による細胞結合を図示する。図12Aおよび図12Cは、Ovcar5細胞（FRα陽性卵巣がん細胞株）との結合を示す。図12Bおよび図12Dは、T細胞との結合の欠如を示す。図12Aおよび図12Bは、各構築物の100nMにおける蛍光に対するノーマライズされた細胞数のヒストグラムを示す。様々な細胞型における各構築物の完全な滴定が、図12Cおよび図12Dに示される。図12Aおよび図12Bにおいて、二次抗ヒトAPC抗体のみの対照は、黒色のトレースで示され、陽性対照抗CD3の結合は、白色のトレースで示され、cx1356、cx681、およびcx1547は、灰色の影付きトレースで示される。図12Aの説明を参照のこと。図12Aの説明を参照のこと。図12Aの説明を参照のこと。図13A～13Bは、代表的なEFGRを標的とする制約CD3係合構築物cx3030による細胞結合を図示する。図13Aは、100nMにおけるEGFR陽性細胞株Colo-205との結合を示す。図13Bは、100nMにおけるT細胞との結合の欠如を証明している。結合は、蛍光に対するノーマライズされた細胞数のヒストグラムとして示される。二次抗ヒトAPC抗体のみの対照は、黒色のトレースで示され、陽性対照抗CD3の結合は、白色のトレースで示され、cx3030は、灰色の影付きトレースで示される。図14A～14Dは、B7H3標的型制約CD3エンゲージャーによるB7H3陽性A375との結合（図14Aおよび14B）ならびにT細胞上のCD3との結合の欠如（図14Cおよび14D）を図示する。B7H3およびCD3を標的とする代替フォーマットDART-Fcは、B7H3およびT細胞上のCD3の両方との強力な結合を示した。cx3095 sdAb、cx3313 FAB、およびcx3314 scFvを含む様々なB7H3抗原結合ドメインが、本明細書中で使用された。scFvおよびFABは、DART-Fcフォーマットにおいて使用されたのと同一の抗B7H3のVH配列およびVL配列を含有している。図14Aおよび14Cは、各構築物についての100nM濃度の比較ヒストグラムを示す。二次抗ヒトAPC抗体のみの対照は、黒色のトレースで示され、様々なB7H3標的型CD3係合構築物は、白色の非共通のトレースで示される。図14Bおよび14Dは、それぞれ、様々な構築物によるBH73およびCD3との結合の滴定を示す。図14Aの説明を参照のこと。図14Aの説明を参照のこと。図14Aの説明を参照のこと。図15A～15Bは、代表的な5T4を標的とする制約CD3係合構築物cx3262およびcx3315による細胞結合を図示する。図15Aは、400nMにおける5T4陽性細胞株Ovcar-5との結合を示す。図15Bは、400nMにおけるT細胞との結合の欠如を証明している。結合は、蛍光に対するノーマライズされた細胞数のヒストグラムとして示される。二次抗ヒトAPC抗体のみの対照は、黒色のトレースで示され、陽性対照抗CD3の結合は、白色のトレースで示され、cx3262およびcx3315は、灰色の影付きのトレースで示される。図16A～16Dは、代表的なCD20を標的とする制約CD3係合構築物cx3309による細胞結合を図示する。図16Aおよび図16Cは、Ramos細胞（CD20陽性細胞株）との結合を示す。図16Bおよび図16Dは、T細胞との結合の欠如を証明する。図16A～16Bは、各構築物の100nMにおける蛍光に対するノーマライズされた細胞数のヒストグラムを示す。様々な細胞型における各構築物の完全な滴定が、図16C～16Dに示される。二次抗ヒトAPC抗体のみの対照は、黒色のトレースで示され、陽性対照抗CD3の結合は、白色のトレースで示され、cx3309は、灰色の影付きのトレースで示される。図16Aの説明を参照のこと。図16Aの説明を参照のこと。図16Aの説明を参照のこと。図17は、FRα発現細胞Ovcar5の存在下もしくは非存在下での、切断されたcx309または未切断のcx309のCD3 NFATレポーターJurkat細胞株（Promega,USA）を活性化する能力を示すグラフである。図18は、cx1547による抗原依存性T細胞活性化を図示する。FRα陽性（T47D、IGROV1、NCI-H2342、Ovcar-5、Skov-3、およびA2780）または陰性（NCI-H460）のいずれかである様々な細胞株を、Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞株とコインキュベートし、蛍光を6時間目に測定した。これは、制約CD3構築物の、T細胞を抗原依存的に活性化する能力を証明している。図19A～19Dは、FcドメインとCD3結合ドメインとの間のリンカーにおいてタンパク質分解が起こった場合の、制約CD3エンゲージャーのT細胞活性化能力の増強を図示する。FRα陽性Ovcar-5細胞（図19A）またはFRα陰性CCRF-CEM細胞（図19B）の存在下での、20nMのcx1762、cx3238、またはcx2190によって媒介されたT細胞活性化の速度論が、ここに示される。FRα陽性Ovcar-5細胞（図19C）またはFRα陰性CCRF-CEM細胞（図19D）の存在下での、cx1762、cx3238、またはcx2190によって媒介されるT細胞活性化の効力も、ここに示される。Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーターが、Incucyte ZOOMイメージャーを使用して、24時間にわたりCD3シグナリングをモニタリングするため、使用された。注目すべきことに、T細胞活性化は、標的細胞株における抗原発現に依存し、CD3結合VH:VLドメインの片側または両側のCD3結合ドメインのN末端側のFcドメインの除去によって大いに増強される。図19-1の説明を参照のこと。図20A～20Dは、様々なEGFR標的型およびEGFR/cMET標的型の制約CD3エンゲージャーの抗原依存性T細胞活性化能力を証明する一連のグラフである。注目すべきことに、T細胞活性化能力は、結合価の増加または付加的な標的抗原結合特異性によって増強される。抗原陽性A431細胞における様々な構築物によって媒介されるT細胞活性化速度論は、図20Aに図示され、抗原陰性CCRF-CEM細胞は、図20Cに示される。抗原陽性A431細胞における様々な構築物によるT細胞活性化の効力は、図20Bに示され、陰性CCRF-CEM細胞は、図20Dに示される。ここでは、Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞株が使用された。図20-1の説明を参照のこと。図21A～21Bは、代表的なB7H3標的型制約CD3係合構築物cx3095ならびにB7H3およびCD3を標的とする代替DART-Fcフォーマットによる標的抗原特異的T細胞活性化を媒介する能力を図示する。Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞が、B7H3陽性細胞株A375（図21A）およびB7H3陰性細胞株Raji（図21B）の存在下でのT細胞活性化を評価するため、使用された。図22A～22Fは、代表的なB7H3標的型制約CD3係合構築物ならびにB7H3およびCD3を標的とする代替DART-Fcフォーマットによる標的抗原特異的T細胞活性化を媒介する能力を図示する。注目すべきことに、制約CD3係合構築物は、B7H3標的型のsdAb、scFv、またはFABのいずれかを利用する。Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞が、B7H3陽性細胞株A375（図22A、22C、22E）およびB7H3陰性細胞株CCRF（図22B、22D、22F）の存在下でのT細胞活性化を評価するために使用された。各構築物の50nM（図22Aおよび22B）または2nM（図22Cまたは22D）によって媒介されたT細胞活性化の速度論が示される。抗原陽性細胞株（図22E）および陰性細胞株（図22F）において各構築物によって媒介されたT細胞活性化の効力も示される。図22-1の説明を参照のこと。図23A～23Bは、5T4標的型制約CD3係合構築物のT細胞活性化能力を示す一連のグラフである。この例は、TAA陽性細胞（OVCAR5）において、2価2エピトープのTAAターゲティングが、制約CD3エンゲージャーの活性を、2価1エピトープタンパク質と比べて増加させ得ることを示す。いずれの構築物も、TAA陰性細胞（CCRF）の存在下ではT細胞活性化を誘導しなかった。図24は、代表的な5T4標的型制約CD3係合構築物cx3315による抗原依存性T細胞活性化を誘導する能力を示すグラフである。Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞株が、5T4陽性細胞株（OVCAR5）および5T4陰性細胞株（CCRF-CEM）の存在下でのcx3315によるT細胞活性化をモニタリングするために使用された。図25は、代表的なCD20標的型制約CD3係合構築物cx3309による抗原依存性T細胞活性化を誘導する能力を図示する。Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞株が、CD20陽性細胞株：RamosおよびCD20陰性細胞株：CCRF-CEMの存在下でのcx3309によるT細胞活性化をモニタリングするために使用された。図26は、代表的なDLL3標的型制約CD3係合構築物cx3308によるT細胞活性化を誘導する能力を示すグラフである。Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞株が、DLL3陽性であるSHP-77細胞の存在下でのcx3309によるT細胞活性化をモニタリングするため、使用された。これは、scFvモエティが、制約CD3フォーマットでTAAを標的とし、同族TAA陽性細胞株と結合した時にT細胞を効果的に活性化するために使用され得ることを証明する。図27A～27Fは、FRα陽性細胞IGROV1（図27A、27C、27E）またはFRα陰性NCI-H460（図27B、27D、27F）の存在下でのT細胞を活性化する能力に対するリンカー長の影響を図示する。図27A～27Bは、それぞれ、抗原陽性細胞および抗原陰性細胞における様々な構築物の2nMによるT細胞活性化の速度論を示す。図27C～27Dは、それぞれ、抗原陽性細胞および抗原陰性細胞における様々な構築物の2nMによるT細胞活性化能力の大きさを示す。図27E～27Fは、それぞれ、抗原陽性細胞および陰性細胞における、異なるリンカー長を有する様々な構築物によるT細胞活性化能力の効力を示す。Jurkat CD3 NFAT-GFPレポーター細胞株が、T細胞活性化を評価するために使用された。制約CD3タンパク質は、標的細胞上の第2の抗原と結合した時にのみ、T細胞上のCD3に効果的に係合し、クラスタ形成させる。図27Aの説明を参照のこと。図27Aの説明を参照のこと。図27Aの説明を参照のこと。図27Aの説明を参照のこと。図27Aの説明を参照のこと。図28A～28Cは、cx1547によるFRα依存性T細胞媒介細胞傷害を図示する。図28Aは、cx1547が、抗原陰性細胞株（NCI-H460）のT細胞媒介細胞傷害を誘導しないことを証明する。図28Bは、cx1547が、抗原陽性細胞株（Ovcar5）のT細胞媒介細胞傷害を誘導することを証明する。図28Cは、3nMにおいてcx1547によって誘導されたOVCAR5細胞に対するT細胞媒介細胞傷害の速度論を示す。cx1547は、抗原陽性細胞株においてのみT細胞媒介細胞傷害を誘導した。ディファレンシャルに標識された標的細胞の細胞傷害は、Incucyte ZOOMイメージャーで、カスパーゼ3/7蛍光発生基質を使用してモニタリングされた。エフェクター細胞と標的細胞との比（E:T）は、このアッセイにおいて、20:1および10:1で評価された。図28Aの説明を参照のこと。図28Aの説明を参照のこと。図29A～29Fは、代表的なB7H3標的型制約CD3係合構築物ならびにB7H3およびCD3を標的とする代替DART-Fcフォーマットによって駆動されたT細胞媒介細胞傷害の速度論を図示する。B7H3陽性A375細胞株におけるCD3係合構築物の50nM～80pMの滴定範囲が、図29A～29Eに示される。図29Fは、B7H3発現がノックダウンされたA549細胞における各構築物の50nMにおける測定を示す。注目すべきことに、全ての構築物が、B7H3依存性のT細胞媒介細胞傷害を示す。図29-1の説明を参照のこと。図30は、抗原陽性細胞株（A375）および陰性細胞株（A549-B7H3ノックダウン）におけるB7H3標的型制約CD3係合構築物およびDART-Fc B7H3×CD3フォーマットの2.5nMによって誘導されたT細胞媒介細胞傷害の大きさを図示する。図31A～31Fは、FRα陽性Ovcar-5細胞（図31A～31E）およびFRα陰性NCI-H60細胞（図31F）に対するT細胞媒介細胞傷害を誘導するFRa標的型CD3エンゲージャーの2種のフォーマットの相対的な効力を図示する。cx2190は、cx1762のグランザイムBによるタンパク質分解プロセシングに由来する代表的なC末端側産物である。注目すべきことに、cx2190は、cx1792と比較して優れた効力を示し、このことは、FcとCD3結合ドメインとの間のリンカー領域におけるタンパク質分解によって媒介されるCD3結合の実質的な増強を証明している。20nM、32pM、および6pMにおけるFRα陽性細胞におけるT細胞媒介細胞傷害の速度論が、それぞれ、図31A、31B、および31Cに示される。図31Dおよび図31Eは、それぞれ、24時間目および40時間目のFRαCD3エンゲージャーの2種のフォーマットの効力を示す。グラフFは、標的細胞上のFRα発現の非存在下では、いずれの構築物によっても実質的な細胞傷害が媒介されないことを証明する。図31-1の説明を参照のこと。図32は、代表的な5T4標的型制約CD3係合構築物cx3315によって媒介されたT細胞媒介細胞傷害を図示する。cx3315は、5t4発現細胞株Ovcar-5に対して特異的なT細胞細胞傷害を誘導したが、5T4陰性細胞株CCRF-CEMに対しては誘導しなかった。20nM cx3315が、このアッセイにおいて使用された。図33は、切断されたcx309または未切断のcx309の存在下でのT細胞およびOvcar5細胞の20時間共培養後のT細胞の活性化を証明するグラフである。切断されたcx309のみが、CD3結合を介してFRα依存性T細胞活性化を媒介することができた。T細胞活性化は、CD4集団およびCD8集団のCD25％のフローサイトメトリー分析によってモニタリングされた。図34A～34Hは、代表的なB7H3標的型制約CD3係合構築物ならびにB7H3およびCD3を標的とする代替DART-Fcフォーマットによる、CD4 T細胞（図34Aおよび34E）ならびにCD8 T細胞（図34Cおよび34G）を標的依存的に活性化する能力を図示する。T細胞が、B7H3陽性細胞株A375（図34A、34C、34E、34G）またはB7H3ノックダウンA549細胞株（図34B、34D、34F、34H）と共にインキュベートされ、活性化マーカーCD25およびCD71が、フローサイトメトリーによって評価された。これらのデータは、使用された構築物のB7H3依存性T細胞活性化能力を証明する。図34-1の説明を参照のこと。図35は、抗原依存性INFγ産生を媒介するB7H3標的型制約CD3係合構築物cx3095の能力を図示する。サイトカイン産生が、INFγELISAを使用して定量化された。A375が、B7H3陽性細胞株として使用され、B7H3ノックダウンA549細胞株が、陰性細胞株として使用された。図36A～36Bは、代表的なFRα標的型制約CD3係合構築物cx1547の、FRα依存的にヒトPBMCからIFNγ（図36A）およびIL-2（図36B）を誘導する能力を図示する。サイトカイン産生が、FluoroSpotサイトカイン捕獲アッセイを使用して測定された。IGROV-1およびNCI-H460が、それぞれ、FRα陽性細胞株および陰性細胞株として使用された。図37は、B7H3標的型制約CD3係合構築物cx3095の抗原依存性INFγ産生を媒介する能力を図示する。サイトカイン産生が、FluoroSpotアッセイを使用してモニタリングされた。A375細胞株およびCCRF-CEM細胞株が、それぞれ、B7H3陽性細胞株および陰性細胞株として使用された。図38A～38Dは、FRαを標的とする制約CD3構築物cx1547の、解離した原発ヒト卵巣腫瘍試料中に存在するT細胞を活性化し、細胞傷害を誘発する能力を図示する。図38Aは、解離した卵巣腫瘍試料中の腫瘍細胞（EpCAM+）および浸潤リンパ球（CD45+）の相対存在量のフロープロットを図示する。図38Bは、6日間のインキュベーションの後の従来のFRα抗体またはcx1547による処理の後の接着性腫瘍細胞の生存度（CellTiterGlo）を示す。図38Cは、6日間のインキュベーションの後のFRα抗体またはcx1547による処理の後のINFγ産生を示す。図38Dは、抗体なし（左）、従来のFRα抗体（中央）、またはcx1547（右）による6日間の処理後の、残存する接着性腫瘍細胞の代表的な画像を示す。

詳細な説明
本開示は、CD3および第2の抗原に少なくとも結合する多重特異性ポリペプチド構築物の形態の制約T細胞係合融合タンパク質を提供する。本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンFc領域に機能的に連結された、抗原に結合する抗原結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む第1の成分、（本明細書中で交換可能に使用される用語である抗CD3結合ドメインまたはCD3結合領域と本明細書中で呼ばれる）少なくともCD3に結合する結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む第2の成分、および第1の成分と第2の成分とを接合するポリペプチドリンカーのようなリンカーを少なくとも含む。いくつかの態様において、抗原は、腫瘍関連抗原（TAA）である。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能リンカーである。

提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、Fc領域を含有している第1の成分がCD3結合領域を含有している第2の成分のN末端側にある配置を含む。そのような態様において、第1および第2の成分は、Fc領域の末端のC末端側にあるリンカーを介して接合されている。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のアミノ末端（N末端）領域に位置付けられている。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のカルボキシ末端（C末端）領域に位置付けられている。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、多重特異性ポリペプチド構築物のN末端領域およびC末端領域の両方に位置付けられている。本明細書中に提供される多重特異性ポリペプチド構築物の様々な配置は、図1に示される。

提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、抗原が抗原結合ドメインを介して結合した後にのみ、CD3に実質的に結合するため、そのような構築物は、制約されたT細胞係合活性を示す。このことは、制約CD3係合タンパク質が、TAA陽性細胞には効率的に結合することができるが、T細胞とはほとんど乃至全く結合しないことを証明する、本明細書中に提供される実施例および図面において例証される。この独特の特性は、制約CD3係合タンパク質が、末梢T細胞に結合することなく、TAAが存在する部位に分布することを可能にする。このフォーマットは、構成性のCD3結合が許可されないかまたは排除され、末梢T細胞結合を回避し、抗原結合ドメインによって認識される抗原が存在する部位への優先的な分布を可能にすることによって、有意な利益を提供するという点で、他のCD3係合多重特異性構築物とは異なる。例えば、実施例に示されるように、制約CD3係合フォーマットは、DART-Fcフォーマット（例えば、公開されたPCT出願番号WO2017/030926）に類似した効力を可能にするが、末梢T細胞との結合が、有意に減弱している。さらに、他のCD3係合構築物は、抗原依存性T細胞活性化を媒介するが、本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、抗原依存性のT細胞の結合および活性化の両方を媒介する。

提供された多重特異性ポリペプチド構築物の制約されたT細胞係合活性は、いくつかの局面において、CD3結合領域のN末端側にFc領域を位置付けることによる。いくつかの態様において、そのような位置付けは、CD3結合領域によるCD3結合を低下させ、減弱させ、妨害し、かつ/または防止する。抗原結合ドメインによる抗原結合の非存在下では、本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、低下したまたは排除されたCD3結合およびT細胞活性化能力を示す。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインによって媒介される抗原結合イベントの存在下で、CD3結合領域によるCD3に結合する能力が、大いに増強される。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインによって媒介される抗原結合イベントの存在下で、T細胞を活性化する能力が、大いに増強される。多重特異性ポリペプチド構築物内の抗原結合ドメインによるその同族抗原の係合は、その後のT細胞係合をもたらし、細胞傷害、サイトカイン放出、脱顆粒、および増殖のような抗原依存性のT細胞活性化を媒介する。いくつかの態様において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫応答を増加させるため、例えば、細胞溶解性（または細胞傷害性）T細胞活性を含むT細胞活性を増強するため、使用され得る。免疫応答の調節は、いくつかの局面において、対象における疾患または状態を処置することができる。

いくつかの態様において、1つまたは複数の抗原結合ドメインは、腫瘍細胞または腫瘍微小環境の細胞の抗原に結合する。いくつかの局面において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、腫瘍またはがんに対するT細胞活性、例えば、細胞傷害活性のような免疫応答を増加させるために使用され得る。いくつかの態様において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、対象における腫瘍またはがんを処置するために使用され得る。

本開示の多重特異性ポリペプチド構築物のCD3結合領域は、Fc領域の存在によって制約されているか、または他の方法で阻止されかつ/もしくは阻害されているため、これらの構築物は、末梢血中のCD3を介したT細胞の結合が起こらないことを確実にする。従って、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、多数の利点を提供する。いくつかの局面において、これらの構築物は、全てのT細胞の結合によって引き起こされるシンク効果を限定する。いくつかの局面において、これらの構築物は、全身毒性を低下させる。

いくつかの態様において、本開示の提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、例えば、腫瘍関連抗原（TAA）発現の部位のような、対象における所望の部位へのコントロールされた体内分布を可能にする。TAA発現の部位には、例えば、腫瘍および周囲の腫瘍微小環境が含まれる。

いくつかの態様において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、CD3および1種または複数種の他の抗原に対する特異性を示す。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、2個、3個、または4個の抗原結合ドメインのような、1種または複数種のTAAに結合することができる複数の抗原結合ドメインを含有していてよい。例えば、図1を参照すること。いくつかの態様において、1つまたは複数の抗原結合ドメインは、同一の抗原に結合する。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、同一の抗原の異なるエピトープに結合する複数の抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、1種または複数種の異なる抗原に結合する複数の抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、同一の抗原の異なるエピトープに結合する複数の抗原結合ドメインを含み、1種または複数種の異なる抗原に結合する付加的な抗原結合ドメインも含む。いくつかの局面において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインの結合を介して、CD3、およびTAAのような別の抗原に結合することができるような二重特異性ポリペプチド構築物である。いくつかの例において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの使用を通して、1種または複数種のTAAの4価の係合を提供する、二重特異性ポリペプチド構築物である。例えば、いくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド構築物は、図1および2に示されるような第1の抗原結合シングルドメイン抗体（sdAb）および第2の抗原結合sdAbを含む。

いくつかの態様において、本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、CD3に結合し、その後、T細胞を活性化する能力に関して、2種の状態で存在する：（1）CD3結合が制約され、T細胞相互作用が除去されるような、「不活性」状態、即ち、未切断状態は、抗原結合ドメインのいずれかまたは全ての結合が存在しない時に起こる。（2）CD3結合領域がCD3に結合することができ、T細胞相互作用が可能になるような、「活性」状態は、抗原結合ドメインのいずれかまたは全てによる抗原結合時に起こる。

いくつかの態様において、Fc領域は、リンカーを介してCD3結合ドメインに連結されている。いくつかの態様において、Fc領域は、非切断可能リンカーを介してCD3結合領域に連結されている。いくつかの態様において、Fc領域は、切断可能リンカーまたは他の方法で不安定なリンカーを介してCD3結合領域に連結されている。

いくつかの態様において、Fc領域およびCD3結合領域は、切断可能リンカーによって連結されている。いくつかの局面において、切断可能リンカーの切断の後に、増強されたCD3結合が起こる。いくつかのそのような局面において、「活性」状態は、いくつかの機序を介して、例えば、CD3結合領域およびFc領域を接合しているリンカーの切断を介して、さらに増幅され得る。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、プロテアーゼの基質認識部位を含有しているリンカーである。Fc領域およびCD3結合領域が切断可能リンカーによって連結されているいくつかの態様において、リンカー内の切断の後に、増強されたCD3結合が起こり得る。

いくつかの局面において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、タンパク質分解の非存在下で、治療的効力を可能にする。

いくつかの態様において、Fc領域は、ホモ二量体Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域は、ヘテロ二量体Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域は、単量体Fc領域である。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域は、FcγRと相互作用し、自然免疫エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および抗体依存性細胞貪食（ADCP）を媒介することができる。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域は、補体タンパク質、即ち、C1qと相互作用し、補体依存性細胞傷害を媒介することができる。従って、いくつかの局面において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、自然免疫エフェクターおよびT細胞を含む、複数の免疫エフェクター機序を可能にする。

Fc領域およびCD3結合領域が切断可能リンカーによって機能的に連結されているいくつかの態様において、Fc領域とCD3結合領域との間のリンカーの切断は、多重特異性ポリペプチド構築物を第1および第2の成分へ分離することができる。多重特異性ポリペプチド構築物の組成によって、第1および第2の成分は異なる機能性を有していてよい。いくつかの態様において、Fc領域は、ADCC機能、CDC機能、またはADCP機能のような1種または複数種のエフェクター機能を示す領域である。そのような例において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、自己増幅系を作製するために使用され得る。例えば、多重特異性構築物は、以下のように使用され得る：TAAターゲティングおよびFc領域のCD16結合の後にNK細胞によって媒介されるADCCは、細胞外タンパク質分解ならびに多重特異性ポリペプチド構築物の第1および第2の成分の間のリンカーの切断の能力を有するグランザイムBの放出をもたらす。

いくつかの態様において、リンカーは、切断可能リンカーである。多重特異性ポリペプチド構築物は、二重エフェクター機能を有するツーインワン治療モエティを提供し、ここで、多重特異性ポリペプチド構築物のタンパク質分解による活性化は、生物学的活性を各々有する2種の成分を産生する。本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、例えば、ADCC（例えば、NK細胞によるグランザイムBの放出）、ADCP、および/またはCDCのような、Fcによって媒介されるエフェクター機能を提供することができる。

制約CD3係合構築物は、任意のTAA結合ドメインと共に使用可能であり、末梢T細胞との相互作用を回避し、強力なTAA依存性T細胞傷害を媒介することによって、腫瘍または腫瘍微小環境におけるよりよい治療的曝露を可能にすることが企図される。FcとCD3結合ドメインの成分との間のプロテアーゼ切断可能リンカーの組み入れは、CD3結合ドメインの完全な曝露を可能にすることによって、T細胞活性化能力の増幅を可能にする。含まれる特定のリンカーに依って、増幅工程は、腫瘍関連プロテアーゼによって媒介されてもよいし、または抗原依存性T細胞活性化の後に放出されるグランザイムによって媒介されてもよい。腫瘍プロテアーゼによって切断可能なリンカーが含まれる場合、増幅は、腫瘍または腫瘍微小環境によって媒介される。一方、グランザイムBによって切断可能なリンカーが含まれる場合、増幅は、抗原依存性の活性化の後にT細胞によって自己媒介され得る。さらに、エフェクター可能（effector-enabled）Fcが構築物に含まれるケースにおいて、増幅は、ADCC機序を通して起こるNK細胞から放出されたグランザイムによって媒介され得る。

いくつかの態様において、プロテアーゼは、腫瘍微小環境において産生されるプロテアーゼ、および/または抗原結合ドメインのTAAとの結合を介して腫瘍微小環境においてCD3結合領域のCD3との初期結合によって誘導されるT細胞活性化時に産生されるプロテアーゼである。いくつかの態様において、プロテアーゼは、グランザイムBである。いくつかの局面において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、Fc免疫グロブリンポリペプチドより下の位置で多重特異性ポリペプチド構築物内のリンカーを切断し、それによって、いくつかのケースにおいて、異なるエフェクター細胞係合を有する、2種の治療活性タンパク質を生成する、腫瘍微小環境内のプロテアーゼおよび/またはグランザイムBの能力を活用する。いくつかの局面において、切断可能リンカーの切断時に、切断された第1の部分または成分は、Fcエフェクター機能、および第1の抗原結合ドメインを介した、例えば、TAAのような第1の抗原の2価ターゲティングを保持しており、Fc領域からのCD3結合領域の分離がCD3結合を可能にするため、第2の部分または成分は、T細胞係合の能力を保持している。切断された第2の部分または成分は、いくつかのケースにおいて、第2の抗原結合ドメインを介して、2価の結合であり得る、TAAとの結合の能力を保持している。

いくつかの態様において、第2の部分または成分は、TAAが存在しない限り、T細胞の活性化が起こらないような、CD3に対して1価であるCD3結合領域を含有している。多価ポリペプチド構築物が切断可能リンカーを含有しているいくつかの局面において、切断された第2の部分または成分は、TAA依存性のT細胞媒介細胞傷害を可能にする。いくつかのケースにおいて、切断された第2の部分または成分は、FcRn相互作用が起こらないことを確実にする。さらに、切断された第2の部分または成分は、十分に小さいサイズ、例えば、わずかおよそ50kDaであり、それは、何らかの理由のため、切断された第2の部分もしくは成分が腫瘍部位の外部に分布した場合、および/または腫瘍部位の外部で異常に切断された場合、迅速なクリアランスを確実にするであろう。

いくつかの態様において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、T細胞およびNK細胞によって媒介される細胞傷害が同時に起こることを可能にする。いくつかのケースにおいて、そのような活性は、所定のTAAの異なるかつ/または非競合的なエピトープを標的とすることができる、第1の抗原結合ドメイン、例えば、第1の抗TAA抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメイン、例えば、第2の抗TAA抗原結合ドメインが含有されている多重特異性ポリペプチド構築物において起こり得る。

いくつかの局面において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、現在の二重特異性治療薬と比べて多数の利点を提供する。本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、従来の治療用抗体より小さく、例えば、150kDaに対して125kDaであり、それは、よりよい標的、例えば、腫瘍への浸透を可能にするであろう。第1に、多重特異性ポリペプチド構築物全体のサイズは、未切断構築物の長い半減期を提供し、構築物の切断時に、切断された第2の部分または成分は、短い半減期を確実にするために十分に小さくなるであろう。いくつかの局面において、CD3結合領域によるCD3結合は、CD3係合が起こる前に、TAA係合に依るため、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、低下した全身毒性または腫瘍および/もしくは腫瘍微小環境の外部の区域における毒性を示す。いくつかのケースにおいて、腫瘍環境のプロテアーゼに特異的な切断可能リンカーの内含は、タンパク質分解による活性化およびTAA係合が起こるまで、多重特異性構築物によるCD3結合を低下させ、それによって、CD3係合を増幅するかまたは増強する。

本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、切断可能リンカーを切断するプロテアーゼが、腫瘍バイアスを有する必要はない（例えば、腫瘍部位および/または腫瘍環境においてのみ異なって発現される必要はない）ことを確実にするため、設計されている。むしろ、これらの多重特異性ポリペプチド構築物は、プロテアーゼがTAAと同一の位置に存在することのみを必要とする。これらの構築物の結合価は、腫瘍および/または腫瘍微小環境における体内分布および保持を駆動するであろう。

本明細書中に引用された刊行物および特許文書は、全て、そのような刊行物または文書が各々参照によって本明細書中に組み入れられると具体的に個々に示されたかのごとく、参照によって本明細書中に組み入れられる。刊行物および特許文書の引用は、何かが関係している先行技術であることの承認として意図されず、それの内容または日付に関する承認を構成するものでもない。本発明が説明文書によって記載されたが、当業者は、本発明が、多様な態様において実施され得ること、上記の説明および下記の例が、後述の特許請求の範囲を例示するためのものであって限定するためのものではないことを認識するであろう。

I. 定義
他に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。エンティティ（「a」entity）またはエンティティ（「an」entity）という用語は、そのエンティティの1つまたは複数をさす。例えば、化合物（a compound）とは、1種または複数種の化合物をさす。従って、「（a）」、「（an）」、「1または複数」、および「少なくとも1」という用語は、交換可能に使用され得る。さらに、前後関係によって他のことが必要とされない限り、単数形は、複数形を含み、複数形は、単数形を含むものとする。概して、本明細書中に記載された細胞および組織の培養、分子生物学、タンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり一般的に使用されているものである。標準的な技術が、組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織の培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のために使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書中に記載されたように実施される。上記の技術および手法は、一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従って、本明細書中に引用され記述される様々な一般的な参照およびより具体的な参照に記載されたように、実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照すること。本明細書中に記載された分析化学、合成有機化学、ならびに薬化学および製薬化学に関連して利用される命名法、ならびにそれらの実験手法および技術は、当技術分野において周知であり一般的に使用されているものである。標準的な技術が、化学合成、化学的分析、薬学的な調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置のために使用される。

本開示に従って利用されるように、以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。

本明細書中で使用されるように、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ig）分子の抗原結合部分、即ち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有している分子をさす。「特異的に結合する」または「免疫反応する」または「免疫特異的に結合する」とは、抗体が所望の抗原の1つまたは複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドとは反応しないか、またははるかに低い親和性（K_d>10^-6）で結合することを意味する。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、完全ヒト、ドメイン抗体、単鎖、Fab、およびF(ab')₂断片、Fv、scFv、およびFab発現ライブラリーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

基本の抗体構造単位は、四量体を含むことが公知である。各四量体は、同一の2対のポリペプチド鎖から構成され、各対が、1本の「軽鎖」（約25kDa）および1本の「重鎖」（約50～70kDa）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主として担う、約100～110アミノ酸またはそれ以上の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主として担う定常領域を定義する。一般に、ヒトから入手された抗体分子は、クラスIgG、IgM、IgA、IgE、およびIgDのいずれかに関し、それらは、分子内に存在する重鎖の性質によって相互に異なる。ある種のクラスは、IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、およびその他のようなサブクラスも有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。

「モノクローナル抗体」（mAb）または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書中で使用されるように、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の1分子種のみを含有している抗体分子の集団をさす。具体的には、モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）は、集団の全ての分子において同一である。MAbは、独特の結合親和性を特徴とする、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含有している。

「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分をさす。抗原結合部位は、重（「H」）鎖および軽（「L」）鎖のN末端可変（「V」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖および軽鎖のV領域内の高度に多様な3個のストレッチが、「フレームワーク領域」または「FR」として公知の、より保存された隣接するストレッチの間に挿入されている。従って、「FR」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間および隣に天然に見出されるアミノ酸配列をさす。抗体分子において、軽鎖の3個の超可変領域および重鎖の3個の超可変領域は、抗原結合表面を形成するよう、三次元空間において相互に配置される。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の3個の超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」と呼ばれる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md. (1987 and 1991))またはChothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)、Chothia et al. Nature 342:878-883(1989)の定義に従う。

本明細書中で使用されるように、「エピトープ」という用語には、抗体、抗体断片、またはその他の結合ドメインによって標的とされる抗原の特定の部分が含まれる。「エピトープ」という用語には、特異的な結合が差し向けられる任意のタンパク質領域が含まれる。「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンまたはT細胞受容体と特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は、一般的に、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的活性を有する表面基からなり、一般的に、特異的な三次元構造的特徴および特異的な電荷特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのN末端、中央、またはC末端のペプチドに対して産生され得る。さらに、抗体は、ポリペプチドの直鎖状または不連続のエピトープに対して産生され得る。抗体は、解離定数が、≦1μM、例えば、いくつかの態様において、≦100nM、いくつかの態様において、≦10nMである時、抗原に特異的に結合すると言われ、密接に関連するものであっても、異なるものであっても、他のタンパク質との結合は示さない。

本明細書中で使用されるように、「特異的結合」、「免疫学的結合」、および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に起こる型の非共有結合性の相互作用をさす。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（K_d）によって表され、より小さいK_dは、より大きい親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を使用して定量化され得る。一つのそのような方法は、抗原結合部位/抗原複合体の形成および解離の速度の測定を含み、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依る。従って、「結合速度定数」（K_on）および「解離速度定数」（K_off）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定され得る（Nature 361:186-87(1993)を参照すること）。K_off/K_onの比は、親和性と無関係の全てのパラメーターの相殺を可能にし、解離定数K_dと等しい（概して、Davies et al. (1990)Annual Rev Biochem 59:439-473を参照すること）。本開示の抗体は、当業者に公知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイのようなアッセイによって測定される結合定数（K_d）が、≦1μM、例えば、いくつかの態様において、≦100nM、いくつかの態様において、≦10nM、いくつかの態様において、≦100pM～約1pMである時、EGFRに特異的に結合すると言われる。

「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用されるように、ゲノム、cDNA、もしくは合成、またはそれらの組み合わせに由来するポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源のため、「単離されたポリヌクレオチド」は、（1）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全部または一部に関連していないか、（2）それが天然に連結されていないポリヌクレオチドに機能的に連結されているか、または（3）より大きい配列の一部として天然に存在しない。本開示によるポリヌクレオチドには、本明細書中に示される重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、および本明細書中に示される軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子が含まれる。

本明細書中で言及される「単離されたタンパク質」という用語は、cDNA、組換えRNA、もしくは合成、またはそれらのいくつかの組み合わせに由来するタンパク質を意味し、その起源または誘導元のため、「単離されたタンパク質」は、（1）天然に見出されるタンパク質に関連していないか、（2）同一の起源由来の他のタンパク質を含まない、例えば、マウスタンパク質を含まないか、（3）異なる種に由来する細胞によって発現されるか、または（4）天然に存在しない。

「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド配列のネイティブタンパク質、断片、または類似体をさすための一般用語として本明細書中で使用される。従って、ネイティブタンパク質の断片および類似体は、ポリペプチド類の一種である。本開示によるポリペプチドには、本明細書中に示される重鎖免疫グロブリン分子、および本明細書中に示される軽鎖免疫グロブリン分子が含まれ、κ軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子と共に重鎖免疫グロブリン分子を含む組み合わせによって形成された抗体分子、およびその逆も含まれ、それらの断片および類似体も含まれる。

物質に適用される「天然に存在する」という用語は、本明細書中で使用されるように、物質が天然に見出され得るという事実をさす。例えば、天然起源から単離され得、実験室において人為的に、またはその他の方法で意図的に修飾されていない、（ウイルスを含む）生物に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は、天然に存在している。

「機能的に連結された」という用語は、本明細書中で使用されるように、そのように記載された成分の位置が、意図された様式で機能することを許容する関係にあることをさす。コード配列に「機能的に連結された」コントロール配列は、コード配列の発現がコントロール配列と適合性の条件の下で達成されるようライゲートされている。

「コントロール配列」という用語は、本明細書中で使用されるように、ライゲートされているコード配列の発現およびプロセシングを達成するために必要なポリヌクレオチド配列をさす。そのようなコントロール配列の性質は、宿主生物に依って異なり、原核生物においては、そのようなコントロール配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物においては、一般に、そのようなコントロール配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「コントロール配列」という用語には、少なくともその存在が発現およびプロセシングのために必須である全ての成分が含まれるものとし、その存在が有利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含まれ得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で言及されるように、少なくとも10塩基長のヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれかまたはいずれかの型のヌクレオチドの修飾型を意味する。その用語には、DNAの一本鎖型および二本鎖型が含まれる。

本明細書中で言及されるオリゴヌクレオチドという用語には、天然に存在するヌクレオチド、ならびに天然に存在するオリゴヌクレオチド結合および天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合によって共に連結された修飾型ヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、一般に、200塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドサブセットである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、10～60塩基長、例えば、いくつかの態様において、12、13、14、15、16、17、18、19、または20～40塩基長である。オリゴヌクレオチドは、一般的には、例えば、プローブのため、一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築において使用するため、二本鎖であってもよい。本開示のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかである。

本明細書中で言及される「天然に存在するヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。本明細書中で言及される「修飾型ヌクレオチド」という用語には、修飾型または置換型の糖基等を有するヌクレオチドが含まれる。本明細書中で言及される「オリゴヌクレオチド結合」という用語には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレルロエート（phosphoroselerloate）、ホスホロジセレノエート（phosphorodiselenoate）、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニラデート（phoshoraniladate）、ホスホロンミデート（phosphoronmidate）等のようなオリゴヌクレオチド結合が含まれる。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081(1986)；Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984)、Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209(1988)、Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539(1991)；Zon et al. Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,pp. 87-108(F. Eckstein,Ed. ,Oxford University Press,Oxford England(1991))；Stecら、米国特許第5,151,510号；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543(1990)を参照すること。所望により、オリゴヌクレオチドは、検出のための標識を含んでいてもよい。

本明細書中で使用されるように、20種の従来のアミノ酸およびそれらの略語は、従来の用法に従う。Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E. S. Golub and D. R. Gren,Eds. ,Sinauer Associates,Sunderland7 Mass. (1991))を参照すること。20種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、D-アミノ酸）、α,α二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、およびその他の非慣習的アミノ酸のような非天然アミノ酸も、本開示のポリペプチドのための適当な成分であり得る。非慣習的アミノ酸の例には、4ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニン、ならびにその他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、4-ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書中で使用されるポリペプチド表示法において、標準的な用法および慣習に従って、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。

同様に、他に明示されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、5'末端側であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、5'方向と呼ばれる。新生RNA転写物の5'から3'への付加の方向は、転写方向と呼ばれ、RNAと同一の配列を有し、RNA転写物の5'末端の5'側にあるDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、RNAと同一の配列を有し、RNA転写物の3'末端の3'側にあるDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。

ポリペプチドに適用される「実質的同一性」という用語は、2種のペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを使用して、プログラムGAPまたはBESTFIT等によって、最適に整列化された時、少なくとも80パーセントの配列同一性、例えば、いくつかの態様において、少なくとも90パーセントの配列同一性、いくつかの態様において、少なくとも95パーセントの配列同一性、いくつかの態様において、少なくとも99パーセントの配列同一性を共有することを意味する。

いくつかの態様において、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。

本明細書中に記述されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列の軽微な変動は、アミノ酸配列の変動が少なくとも75％、例えば、いくつかの態様において、少なくとも80％、90％、95％、いくつかの態様において、99％を維持する限り、本開示に包含されることが企図される。具体的には、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換とは、側鎖が関連しているアミノ酸のファミリーの内部で起こるものである。遺伝学的にコードされたアミノ酸は、一般に、以下のファミリーに分類される：（1）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり；（2）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり；（3）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（4）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびトレオニンが含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが含まれる。アミノ酸の他のファミリーには、（i）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびトレオニン；（ii）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン；（iii）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；ならびに（iv）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。例えば、特に、置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合には、ロイシンとイソロイシンもしくはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、トレオニンとセリンの孤立性の置換、または構造的に関連するアミノ酸同士の類似した置換は、得られた分子の結合または特性に大きい効果を及ぼさないであろうと予想することが合理的である。アミノ酸変化が機能性ペプチドをもたらすか否かは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。アッセイは、本明細書中に詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者によって容易に調製され得る。いくつかの態様において、断片または類似体のアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能性ドメインの境界付近に存在する。構造ドメインおよび機能ドメインは、ヌクレオチドおよび/またはアミノ酸の配列データを公のまたは専有の配列データベースと比較することによって同定され得る。コンピューター化比較法が、既知の構造および/または機能を有する他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測タンパク質コンフォメーションドメインを同定するために使用される。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は、公知である。Bowie et al. Science 253:164(1991)。従って、上記の例は、当業者が、本開示に従って、構造ドメインおよび機能ドメインを定義するために使用され得る配列モチーフおよび構造コンフォメーションを認識し得ることを証明する。

いくつかの態様において、アミノ酸置換は、そのような類似体の（1）タンパク質分解に対する感受性を低下させるもの、（2）酸化に対する感受性を低下させるもの、（3）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更するもの、（4）結合親和性を変更するもの、および（4）その他の物理化学的特性または機能的特性を付与するかまたは修飾するものである。類似体には、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々なムテインが含まれ得る。例えば、1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）が、天然に存在する配列において、例えば、分子間接触形成ドメイン外のポリペプチドの部分において作製され得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきでない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊するかまたは親配列を特徴付ける他の型の二次構造を崩壊させる傾向を有するべきでない）。当技術分野において認識されている二次構造および三次構造の例は、Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton,Ed. ,W. H. Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze,eds. ,Garland Publishing,New York,N. Y. (1991))；およびThornton et at. Nature 354:105(1991)に記載されている。

「ポリペプチド断片」という用語は、本明細書中で使用されるように、アミノ末端および/もしくはカルボキシ末端の欠失ならびに/または1つもしくは複数の配列内欠失を有するポリペプチドをさすが、ここで、残りのアミノ酸配列は、例えば、全長cDNA配列から推定される天然に存在する配列における対応する位置と同一である。断片は、典型的には、少なくとも5、6、8、または10アミノ酸長、例えば、いくつかの態様において、少なくとも14アミノ酸長、いくつかの態様において、少なくとも20アミノ酸長、一般的には、少なくとも50アミノ酸長、いくつかの態様において、少なくとも70アミノ酸長である。「類似体」という用語は、本明細書中で使用されるように、適当な結合条件の下で、推定されたアミノ酸配列の一部分との実質的同一性を有しており、EGFRとの特異的結合を有する、少なくとも25アミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドをさす。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に対する保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも20アミノ酸長、例えば、いくつかの態様において、少なくとも50アミノ酸長以上であり、しばしば、全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。

「薬剤」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から作製された抽出物を示すために本明細書中で使用される。

本明細書中で使用されるように、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、ポリペプチドへの放射標識されたアミノ酸の組み込み、またはマーキングされたアビジン（例えば、光学的方法もしくは熱量測定法によって検出され得る蛍光マーカーもしくは酵素活性を含有しているストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニルモエティの付着による、検出可能マーカーの組み込みをさす。ある種の状況において、標識またはマーカーも、治療用であってよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が、当技術分野において公知であり、使用され得る。ポリペプチドのための標識の例には、放射性同位体または放射性核種（例えば、³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I）、蛍光標識（例えば、フルオロフォア、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、p-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、標識は、可能性のある立体障害を低下させるため、様々な長さのスペーサーアームによって付着させられる。「薬学的薬剤または薬物」という用語は、本明細書中で使用されるように、患者へ適切に投与された時に所望の治療効果を誘導することができる化学的化合物または組成物をさす。

本明細書中で使用されるように、「実質的に純粋な」とは、ある物質種が、存在する優勢な種である（即ち、モルベースで、組成物中の他の個々の種より豊富に存在する）ことを意味し、実質的に精製された画分とは、ある物質種が、全高分子種の（モルベースで）少なくとも約50パーセントを構成する組成物である。

概して、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全高分子種の約80パーセント超、例えば、いくつかの態様において、約85％、90％、95％、および99％超を構成するであろう。いくつかの態様において、物質種は、組成物が単一の高分子種から本質的になる（従来の検出法によって、混入種が組成物中に検出され得ない）本質的均質にまで精製される。

患者という用語には、ヒトおよび獣医学的対象が含まれる。

本明細書中の他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker,S. ,Ed. ,McGraw-Hill,San Francisco(1985))によって例証されるような、当技術分野における従来の用法に従って使用される。

II. 多重特異性ポリペプチド構築物
免疫グロブリンFc領域を含有している第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分を含有している多重特異性ポリペプチド構築物が、本明細書中に提供され、ここで、第1および第2の成分はリンカーによってカップリングされており、Fc領域はCD3結合領域のN末端側に位置付けられ；第1および第2の成分の一方または両方は、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ順に、免疫グロブリンFc領域；リンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；リンカー；およびCD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域を含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、TAAに結合する第1の抗原結合ドメイおよびTAAに結合する第2の抗原結合ドメインを少なくとも含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ順に、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；免疫グロブリンFc領域；リンカー；CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメインを含有している。

本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の成分の各々を、より詳細に以下に説明する。

1. 抗CD3結合ドメイン：
本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、抗CD3結合ドメインの1コピーまたは複数コピーを含む。本開示の抗CD3結合ドメインは、T細胞上のCD3εの係合を介してT細胞を活性化する。本開示の抗CD3結合ドメインは、CD3によって媒介されるT細胞活性化を誘起し、刺激し、活性化し、かつ/またはその他の方法で強化する。CD3の生物学的活性には、例えば、CD3とT細胞受容体（TCR）の抗原結合サブユニットとの間の相互作用を通したT細胞活性化およびその他のシグナリングが含まれる。例えば、本開示の抗CD3結合ドメインは、CD3によって媒介されるT細胞活性化を部分的にまたは完全に調節することによって、例えば、誘起するか、刺激するか、活性化するか、またはその他の方法で強化することによって、T細胞上のCD3εの係合を介して、T細胞を完全にまたは部分的に活性化する。

好ましい態様において、本開示の抗CD3結合ドメインは、CD3εとしても公知のCD3のε鎖に特異的に結合する。本開示の抗CD3ε結合ドメインは、T細胞上のCD3εの係合を介してT細胞を活性化する。本開示の抗CD3ε結合ドメインは、例えば、哺乳動物モノクローナル抗体、霊長類モノクローナル抗体、完全ヒトモノクローナル抗体ようなモノクローナル抗体、ならびにヒト化モノクローナル抗体およびキメラ抗体、ならびにそれらの抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。

いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、Fab断片、F(ab')₂断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗CD3結合ドメインは、（本明細書中で抗CD3εFv断片と呼ばれる）CD3εに結合するFv抗体断片を含む。いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）である。いくつかの態様において、抗CD3結合ドメインは、CD3結合について1価である。

いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む可変重鎖（Hv）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Lv）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む可変重鎖（Hv）およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Lv）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含む可変重鎖（Hv）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Lv）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含む可変重鎖（Hv）およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Lv）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:32～81の群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせを含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:32～62の群より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列およびSEQ ID NO:63～81の群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせを含む。

いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（Hv）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Lv）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（Hv）、およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Lv）を含む。

いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（Hv）を含む。いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:72のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Lv）を含む。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（Hv）、およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Lv）を含む。

いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～81の群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～81からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～62の群より選択されるアミノ酸配列およびSEQ ID NO:63～81からなる群より選択されるアミノ酸配列の組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗CD3εFv抗体断片は、SEQ ID NO:32～62からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:63～81からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列の組み合わせを含む。

いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列の組み合わせを含み、ここで、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列のうちの少なくとも一つは、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）を少なくとも含むVH CDR1配列）；アミノ酸配列

を少なくとも含むVH CD2配列；およびアミノ酸配列

を少なくとも含むVH CDR3配列より選択される。

いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、VL CDR1配列、VL CDR2配列、およびVL CDR3配列の組み合わせを含み、ここで、VL CDR1配列、VL CDR2配列、およびVL CDR3配列のうちの少なくとも一つは、アミノ酸配列

を少なくとも含むVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を少なくとも含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を少なくとも含むVL CDR3配列より選択される。

いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）を少なくとも含むVH CDR1配列；アミノ酸配列

を少なくとも含むVH CD2配列；アミノ酸配列

を少なくとも含むVH CDR3配列；アミノ酸配列

を少なくとも含むVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を少なくとも含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を少なくとも含むVL CDR3配列を含む。

いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列の組み合わせを含み、ここで、VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3配列のうちの少なくとも一つは、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVH CDR1配列；アミノ酸配列

と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVH CD2配列；およびアミノ酸配列

と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVH CDR3配列より選択される。

と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である配列を含むVL CDR3配列より選択される。

いくつかの態様において、抗CD3ε結合ドメインは、アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR1配列；アミノ酸配列

と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CD2配列；アミノ酸配列

と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVH CDR3配列、アミノ酸配列

と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR1配列；アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR2配列；およびアミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるVL CDR3配列を含む。

いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列の組み合わせを含むFv断片である。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:32～81からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列の組み合わせを含むFv断片である。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:32～81からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列の組み合わせを含むFv断片である。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:32～62の群より選択される重鎖可変アミノ酸配列およびSEQ ID NO:63～81からなる群より選択されるアミノ酸配列の組み合わせを含むFv断片である。いくつかの態様において、その抗CD3ε結合ドメインは、SEQ ID NO:32～62からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である重鎖可変アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:63～81からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列の組み合わせを含むFv断片である。

2. 免疫グロブリンFcポリペプチド：
本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の第1の成分は、免疫グロブリンFc領域を含む。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、およびIgG4サブクラスからなる群より選択されるIgGアイソタイプである。いくつかの態様において、Fc領域は、ヒトFcである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1～6からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1～6のいずれかの免疫活性断片であるFc鎖を含有している。いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:1～6のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一であるFcポリペプチド鎖、またはその免疫活性断片を含有している。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、各々Fcを含有しているポリペプチドによって形成された二量体である。いくつかの具体的な態様において、同一のまたは実質的に同一のポリペプチドが、ホモ二量体を作出するために二量体化するであろう。いくつかの態様において、二量体は、多重特異性ポリペプチド構築物の2本のポリペプチドが同一であるホモ二量体である。他のケースにおいて、Fc領域は、異なるポリペプチドが二量体化してヘテロ二量体を与えるヘテロ二量体化を促進するために変異させられたまたは修飾されたFcドメインによって形成される。従って、いくつかの態様において、二量体は、多重特異性ポリペプチド構築物の2本のポリペプチド鎖が異なるヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化を促進するための例示的な修飾は、公知であり、下記のものを含む。

概して、Fc領域は、免疫グロブリンの主要な機能である抗原結合能力に加えて、補体依存性細胞傷害（CDC）および抗体依存性細胞傷害（ADCC）のようなエフェクター機能を担う。さらに、Fc領域に存在するFcRn配列は、インビボFcRn受容体とのコンジュゲーションによって、インビボ半減期を増加させることによって、血清中のIgGレベルを制御する役割を果たす。いくつかの態様において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物と共に使用するためのFcにおいて、そのような機能は、変更されていてよく、例えば、低下していてもよいしまたは増強されていてもよい。

いくつかの態様において、提供された多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域は、1種または複数種のエフェクター機能を示す。いくつかのケースにおいて、Fc領域は、例えば、ADCC（例えば、NK細胞によるグランザイムBの放出）、ADCP、および/またはCDCのような、Fcによって媒介されるエフェクター機能を提供することができる。従って、多重特異性ポリペプチド構築物が切断可能リンカーを含有しているいくつかの態様において、リンカーの切断は、T細胞上のCD3に結合し係合することができるCD3結合領域、および標的特異的なエフェクター機能を示すことができるTAA抗原結合ドメインに連結されたFc領域という、生物学的活性を各々有する2種の成分を産生することができる。

いくつかの態様において、Fc領域は、1種または複数種のエフェクター機能を変更するために変異させられたまたは修飾されたFcポリペプチドを含む。エフェクター機能を変更するため、例えば、低下させるためのFcポリペプチドの変異の様々な例は、公知であり、下記のものを含む。いくつかの態様において、特定のSEQ ID NOに関して記載されない限り、Fc領域におけるアミノ酸置換の言及は、（カバットナンバリングとも呼ばれる）カバットによるEUナンバリングによる。EUナンバリングは、公知であり、最新のIMGT Scientific Chart(IMGT（登録商標）,the international ImMunoGeneTics information system（登録商標）,http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(created:17 May 2001,last updated:10 Jan 2013)およびKabat,E.A.et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th ed. US Department of Health and Human Services,NIH publication No. 91-3242(1991)において報告されたEUインデックスによる。

いくつかの態様において、低下したエフェクター機能を示すFc領域を含有している提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、制約されたCD3結合が望まれるが、（CDCおよびADCCのような）ある種のエフェクター機能が不必要であるかまたは有害である適用のため、望ましい候補であり得る。インビトロおよび/またはインビボの細胞傷害アッセイが、CDC活性および/またはADCC活性の低下/枯渇を確認するために実施され得る。例えば、多重特異性ポリペプチド構築物および/または切断されたその成分が、FcγR結合を欠く（従って、ADCC活性を欠く可能性が高い）が、FcRn結合能力を保持することを確実にするため、Fc受容体（FcR）結合アッセイが実施され得る。ADCCを媒介するための主な細胞、NK細胞は、FcγRIIIのみを発現し、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063(1986)を参照すること）およびHellstrom, I et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502(1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al.,J. Exp. Med. 166:1351-1361(1987)を参照すること）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が利用されてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのACTI（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（CellTechnology,I nc. Mountain View, Calif.）；およびCytoTox 96（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Promega, Madison, Wis.）を参照すること）。そのようなアッセイのために有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)に開示されたもののような動物モデルにおいて評価され得る。多重特異性ポリペプチド構築物または切断されたその成分がC1qに結合することができず、従って、CDC活性を欠くことを確認するため、C1q結合アッセイも実施され得る。例えば、WO 2006/029879およびWO 2005/100402のC1q結合ELISAおよびC3c結合ELISAを参照すること。補体活性化を評価するためには、CDCアッセイが実施され得る（例えば、Gazzano-Santoro et al.,J. Immunol. Methods 202:163(1996)；Cragg,M. S. et al.,Blood 101:1045-1052(2003)；およびCragg,M. S. and M. J. Glennie,Blood 103:2738-2743(2004)を参照すること）。FcRn結合およびインビボクリアランス/半減期の決定も、当技術分野において公知の方法を使用して実施され得る（例えば、Petkova,S. B. et al.,Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769(2006)を参照すること）。

いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域またはその免疫活性断片は、IgGアイソタイプである。例えば、融合タンパク質の免疫グロブリンFc領域は、以下のアミノ酸配列を有する、ヒトIgG1アイソタイプのものである：

いくつかの態様において、免疫グロブリンFc領域またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG1ポリペプチド配列を含む。

いくつかの態様において、ヒトIgG1 Fc領域は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および/または補体依存性細胞傷害（CDC）を変更するために修飾される。例えば、Natsume et al.,2008 Cancer Res,68(10):3863-72；Idusogie et al.,2001 J Immunol,166(4):2571-5；Moore et al.,2010 mAbs,2(2):181-189；Lazar et al.,2006 PNAS,103(11):4005-4010、Shields et al.,2001 JBC,276(9):6591-6604；Stavenhagen et al.,2007 Cancer Res,67(18):8882-8890；Stavenhagen et al.,2008 Advan. Enzyme Regul. ,48: 152-164；Alegre et al,1992 J Immunol,148:3461-3468に記載され；Kaneko and Niwa,2011 Biodrugs,25(1):1-11に概説されたアミノ酸修飾。それらの各々の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様において、ヒトIgG1 Fc領域のようなFc領域は、ADCC活性またはCDC活性を増強するために修飾される。ADCCを増強する変異の例は、Ser239およびIle332における修飾、例えば、Ser239AspおよびIle332Glu（S239D、I332E）を含む。CDCを増強する変異の例には、Lys326およびGlu333における修飾が含まれる。いくつかの態様において、Fc領域は、カバットナンバリングシステムを使用して、これらの位置の一方または両方において修飾される（例えば、Lys326Alaおよび/またはGlu333Ala（K326AおよびE333A））。

いくつかの態様において、本開示のヒトIgG1 Fc領域融合タンパク質は、N297におけるN結合型グリカン鎖に付着したフコースを欠くかまたは低下したフコースを有する。FUT8欠損細胞株における産生；哺乳動物細胞培養培地への阻害剤、例えば、カスタノスペルミンの添加；および産生細胞株の代謝工学を含むが、これらに限定されるわけではない、フコシル化を防止する多数の方式が存在する。いくつかの態様において、ヒトIgG1 Fc領域は、融合タンパク質のグリコシル化を防止するため、アミノ酸Asn297（ボックス内、カバットナンバリング）において修飾される（例えば、Asn297Ala（N297A）またはAsn297Asp（N297D））。

いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体結合を低下させるため、以下の位置のうちの1つまたは複数において変更される：Leu234（L234）、Leu235（L235）、Asp265（D265）、Asp270（D270）、Ser298（S298）、Asn297（N297）、Asn325（N325）、またはAla327（A327）。例えば、Leu234Ala（L234A）、Leu235Ala（L235A）、Asp265Asn（D265N）、Asp270Asn（D270N）、Ser298Asn（S298N）、Asn297Ala（N297A）、Asn325Glu（N325E）、またはAla327Ser（A327S）。いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体相互作用を変更するため、アミノ酸Leu235（前記SEQ ID NO:1のボックス内、カバットナンバリング）において修飾される（例えば、Leu235Glu（L235E）またはLeu235Ala（L235A））。いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体相互作用を変更するため、アミノ酸Leu234（前記SEQ ID NO:1のボックス内、カバットナンバリング）において修飾される（例えば、Leu234Ala（L234A））。いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、アミノ酸234および235の両方において変更される（例えば、Leu234AlaおよびLeu235Ala（L234A/L235A）またはLeu234ValおよびLeu235Ala（L234V/L235A））。好ましい態様において、Fc領域内の修飾は、Fc受容体γ受容体との結合を低下させるが、新生児型Fc受容体（FcRn）との結合に対しては最小の影響を及ぼす。

いくつかの態様において、ヒトIgG Fc領域は、FcRn結合を増強するために修飾される。FcRnとの結合を増強するFc変異の例は、Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu（それぞれ、M252Y、S254T、T256E）（カバットナンバリング、Dall'Acqua et al 2006,J. Biol Chem Vol. 281(33)23514-23524）、Met428LeuおよびAsn434Ser（M428L、N434S）（Zalevsky et al 2010 Nature Biotech,Vol. 28(2)157-159）（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのEUインデックス）である。いくつかの態様において、変異型または修飾型のFcポリペプチドは、カバットナンバリングシステムを使用して、以下の変異を含む：Met252TyrおよびMet428LeuまたはMet252TyrおよびMet428Val（M252Y、M428LまたはM252Y、M428V）。

いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体結合を低下させるため、以下の位置のうちの1つまたは複数におけるアミノ酸を欠いている:Glu233（E233）、Leu234（L234）、またはLeu235（L235）。これらの態様において、これらの3個のアミノ酸のFc欠失は、補体タンパク質C1q結合を低下させる。

いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体結合を低下させるため、Gly236（前記SEQ ID NO:1のボックス内）において変更される。例えば、Gly236が融合タンパク質から欠失させられる。いくつかの態様において、ヒトIgG1 Fc領域は、CD32Aとの相互作用を増強するため、アミノ酸Gly236において修飾される（例えば、Gly236Ala（G236A））。

いくつかの態様において、ヒトIgG1 Fc領域は、Lys447を欠く（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのEUインデックス）。

いくつかの態様において、融合物またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG2ポリペプチド配列を含む。

いくつかの態様において、融合タンパク質の免疫グロブリンFc領域またはその免疫活性断片は、以下のアミノ酸配列を有する、ヒトIgG2アイソタイプのものである：

いくつかの態様において、融合物またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG2ポリペプチド配列を含む。

いくつかの態様において、ヒトIgG2 Fc領域は、アミノ酸Asn297において修飾される（ボックス内、抗体のグリコシル化を防止するため、例えば、Asn297Ala（N297A）またはAsn297Asp（N297D））。いくつかの態様において、ヒトIgG2 Fc領域は、Lys447を欠く（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのEUインデックス）。

いくつかの態様において、融合タンパク質の免疫グロブリンFc領域または免疫活性断片は、以下のアミノ酸配列を有する、ヒトIgG3アイソタイプのものである：

いくつかの態様において、抗体またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG3ポリペプチド配列を含む。

いくつかの態様において、ヒトIgG3 Fc領域は、抗体のグリコシル化を防止するため、アミノ酸Asn297（ボックス内、カバットナンバリング）において修飾される（例えば、Asn297Ala（N297A）またはAsn297Asp（N297D））。いくつかの態様において、ヒトIgG3 Fc領域は、半減期を延長するため、アミノ酸435において修飾される（例えば、Arg435His（R435H））。いくつかの態様において、ヒトIgG3 Fc領域は、Lys447を欠く（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのEUインデックス）。

いくつかの態様において、融合タンパク質の免疫グロブリンFc領域または免疫活性断片は、以下のアミノ酸配列を有するヒトIgG4アイソタイプのものである：

いくつかの態様において、抗体またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG4ポリペプチド配列を含む。

いくつかの態様において、融合タンパク質の免疫グロブリンFc領域または免疫活性断片は、以下のアミノ酸配列を有する、ヒトIgG4アイソタイプのものである：

いくつかの態様において、抗体またはその免疫活性断片は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヒトIgG4ポリペプチド配列を含む。

他の態様において、ヒトIgG4 Fc領域は、Fc受容体相互作用を変更するため、アミノ酸235において修飾される（例えば、Leu235Glu（L235E））。いくつかの態様において、ヒトIgG4 Fc領域は、抗体のグリコシル化を防止するため、アミノ酸Asn297（ボックス内、カバットナンバリング）において修飾される（例えば、Asn297Ala（N297A）またはAsn297Asp（N297D））。いくつかの態様において、ヒトIgG4 Fc領域は、Lys447を欠く（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのEUインデックス）。

いくつかの態様において、ヒトIgG Fc領域は、Ser354のCysへの変化（S354C）およびTyr349のCysへの変化（Y349C）（S354C/Y349C）によって、2個のジスルフィド結合を導入することによって、CH3:CH3界面におけるホモ二量体化を安定化するために修飾される。

いくつかの態様において、ヒトIgG Fc領域は、ヘテロ二量体化を誘導するために修飾される。相補的なFcポリペプチドのヘテロ二量体化を促進するための様々な方法が、公知である。例えば、Ridgway et al,Protein Eng. 9:617-621(1996)；Merchant et al,Nat. Biotechnol. 16(7):677-81(1998)；Moore et al. (2011)MAbs,3:546-57；Von Kreudenstein et al. MAbs,(2013)5:646-54；Gunasekaran et al. (2010)J. Biol. Chem. ,285:19637-46；Leaver-Fay et al. (2016)Structure,24:641-51；Ha et al. (2016)Frontiers in Immunology,7:1；Davis et al. (2010)Protein Eng Des Sel,23:195-202；公開された国際PCT出願番号WO 1998/050431、WO2009/089004、WO2011143545、WO2014/067011、WO2012/058768、WO2018027025；公開された米国特許出願番号US20140363426、US20150307628、US20180016354、US20150239991；ならびに米国特許第5731168号、第7183076号、第9701759号、第9605084号、および第9650446号を参照すること。Fc鎖のヘテロ二量体化を促進する方法には、例えば、「ノブイントゥホール」変異のセットを含めるか、または異なるポリペプチド鎖の間の誘引相互作用にとって有利となるよう、Fcの静電的ステアリングを達成するための変異を含めることによる、Fc領域の変異誘発が含まれる。例えば、いくつかの態様において、ヘテロ二量体のFcポリペプチドは、静電的にマッチしたFc鎖の共発現が、有利な誘引相互作用を支持し、それによって、所望のFcヘテロ二量体の形成を促進し、不利な反発電荷相互作用が、望まれないFcホモ二量体の形成を抑制するよう、Fc二量体界面における電荷極性を変更するための変異を含む（Guneskaran et al., (2010)JBC,285:19637-19646）。細胞において共発現された時、鎖間の会合が可能であるが、電荷反発のため、鎖は実質的に自己会合しない。ヘテロ二量体Fcを生成するための他の戦略には、SEED Fcと呼ばれる、相補的なCH3のヘテロ二量体を作出するためのヒトIgGおよびIgAのCH3ドメインセグメントの混合が含まれる。

いくつかの態様において、ヘテロ二量体化を促進するため、Fcヘテロ二量体の両方のポリペプチドが、ペアのまたは相補的なアミノ酸修飾を含有している。Fc融合物のポリペプチドの例示的なアミノ酸修飾のペアを、表1に示す。

（表１）ヘテロ二量体Fcのアミノ酸のペア

いくつかの態様において、修飾は、第1および第2のFc含有ポリペプチドの複合体化を促進するため、隆起が空洞に位置付けられるよう、第1のFcポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、第2のFcポリペプチドに空洞（ホール）を導入することを含む。ポリペプチドに隆起または空洞を作出するための置換および/または修飾の標的とされるアミノ酸は、典型的には、第2のポリペプチドの界面にある1つまたは複数のアミノ酸と相互作用するかまたは接触する界面アミノ酸である。

いくつかの態様において、隆起（ホール）アミノ酸を含有するよう修飾される第1のFcポリペプチドは、第1のFcポリペプチドの界面から突出し、従って、第2のポリペプチドの近接した界面において代償的な空洞（ホール）に位置付けられる少なくとも1個の側鎖を有するアミノ酸への、ネイティブのまたは最初のアミノ酸の置換を含む。置換アミノ酸は、最初のアミノ酸残基より大きい側鎖体積を有するものであることが最も多い。隆起を作出するための理想的な置換アミノ酸であるものを同定するため、アミノ酸残基の特性を決定しかつ/または評価する方法は、当業者に公知である。いくつかの態様において、隆起の形成のための置換残基は、天然に存在するアミノ酸残基であり、例えば、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、またはトリプトファン（W）を含む。いくつかの例において、置換のために同定される最初の残基は、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリンのような、小さい側鎖を有するアミノ酸残基である。

いくつかの態様において、空洞（ホール）を含有するよう修飾される第2のFcポリペプチドは、第2のポリペプチドの界面から凹んでおり、従って、第1のポリペプチドの界面からの対応する隆起を受け入れることができる少なくとも1個の側鎖を有するアミノ酸への、ネイティブのまたは最初のアミノ酸の置換を含むものである。置換アミノ酸は、最初のアミノ酸残基より小さい側鎖体積を有するものであることが最も多い。空洞の形成のための理想的な置換残基であるものを同定するため、アミノ酸残基の特性を決定しかつ/または評価する方法は、当業者に公知である。一般に、空洞の形成のための置換残基は、天然に存在するアミノ酸であり、例えば、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、およびバリン（V）を含む。いくつかの例において、置換のために同定される最初のアミノ酸は、例えば、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンのような、大きい側鎖を有するアミノ酸である。

ヒトIgG1のCH3界面は、例えば、各表面から1090Å2埋め込まれている4本の逆平行β鎖に位置する各ドメインの16残基を含む（例えば、Deisenhofer et al. (1981)Biochemistry,20:2361-2370；Miller et al., (1990)J Mol. Biol. ,216,965-973；Ridgway et al.,(1996)Prot. Engin. ,9:617-621；米国特許第5,731,168号を参照すること）。隆起または空洞を作出するためのCH3ドメインの修飾は、例えば、米国特許第5,731,168号；国際特許出願WO98/50431およびWO2005/063816；ならびにRidgway et al., (1996)Prot.Engin.617-621に記載されている。いくつかの例において、隆起または空洞を作出するためのCH3ドメインの修飾は、典型的には、2本の中央の逆平行β鎖に位置する残基を標的とする。目標は、作出される隆起が、パートナーCH3ドメインの代償的な空洞に受け入れられるのではなく、周囲の溶媒に突出することによって受け入れられるリスクを最小化することである。

例えば、いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcは、よりかさの大きいアミノ酸、例えば、Tryと交換された時（T366W）、よりかさの小さいアミノ酸、例えば、それぞれ、Ser、Ala、Valへの位置Thr366、Leu368、およびTyr407におけるアミノ酸修飾（T366S/L368A/Y407V）を有する第2のCH3ドメインと優先的に対形成することができる、CH3ドメイン内のThr366にアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含む。CH3修飾を介したヘテロ二量体化は、例えば、反対のCH3ドメインにおけるSer354のCysへの変化（S354C）およびTyr349のCysへの変化（Y349C）による、ジスルフィド結合の導入によって、さらに安定化され得る（Carter,2001 Journal of Immunological Methods,248:7-15に概説されている）。

得られた多重特異性ポリペプチド構築物は、例えば、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムにおけるアフィニティクロマトグラフィのような、適当な方法によって精製され得る。異なるポリペプチドをコードする2種の核酸分子が細胞へ形質転換された場合、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成が起こるであろう。ヘテロ二量体形成がホモ二量体形成より有利となるよう、発現のための条件を調整することができる。

ヘテロ二量体のアフィニティ試薬に対するディファレンシャルな親和性に基づく、ヘテロ二量体のホモ二量体からの回収のための技術は、公知である。いくつかの局面において、そのような技術には、Fcポリペプチド鎖のうちの一方がアフィニティ試薬プロテインAに結合しないような、ヘテロ二量体の設計が含まれる。いくつかのケースにおいて、ポリペプチド鎖のうちの一方は、Fcヘテロ二量体のポリペプチドのうちの一方においてプロテインA試薬に対する親和性を消失させるかまたは低下させるため、1つまたは複数のアミノ酸置換を含有していてよい。例えば、WO2017134440、WO2010151792、Jendebergら（Jendeberg et al., (1997) J. Immunol. Methods, 201(1): 25-34）を参照すること。これらの態様のいくつかにおいて、Fc領域は、プロテインA結合を防止し、それによって、ヘテロ二量体融合タンパク質のより効率的な精製を可能にするため、ヘテロ二量体の一方のメンバーのプロテインA結合部位において修飾され得る。この結合部位における例示的な修飾は、Ile253、例えば、Ile253Arg（I253R）である。いくつかの態様において、修飾は、H435RまたはH435R/Y436Fであり得る。いくつかの態様において、Fcヘテロ二量体のFcポリペプチドは、プロテインAに結合することができ、プロテインGには結合し得ないような修飾（pA+/pG-）を含有していてよい。例示的なpA+/pG-アミノ酸修飾には、ヒトIgGlに関して、428位にセリン、434位にセリンを含有しており、任意で、436位にヒスチジンを含有しているか、またはヒトIgG 2、3、もしくは4における対応する位置にこれらの残基を含むFcが含まれる。いくつかの局面において、あるIgG Fcポリペプチドの428位、434位におけるそのようなアミノ酸修飾、および、任意で、436位におけるそのようなアミノ酸修飾は、プロテインGの結合を低下させるかまたは防止し、タンパク質の精製を増強する。

いくつかの態様において、アフィニティ試薬に対するディファレンシャルな親和性を付与するそのような修飾のいずれかを、前記の1つまたは複数の他のアミノ酸修飾と組み合わせることができる。例えば、I253R修飾を、T366S/L368A/Y407V修飾またはT366W修飾のいずれかと組み合わせることができる。T366S/L368A/Y407V修飾型Fcは、T336W修飾型Fcのケースにおいては存在する二量体化界面の立体障害が存在しないため、ホモ二量体を形成することができる。従って、いくつかの態様において、形成された可能性のあるホモ二量体Fcの精製が許可されないよう、I253R修飾がT366S/L368A/Y407V修飾Fcと組み合わせられる。類似した修飾が、T366S/L368A/Y407VとH453Rとを組み合わせることによって利用され得る。

いくつかの態様において、ヘテロ二量体分子のFc領域は、さらに、前記のいずれかのような1つまたは複数の他のFc変異を含有していてもよい。いくつかの態様において、ヘテロ二量体分子は、エフェクター機能を低下させる変異を含むFc領域を含有している。

いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの一方のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:82、86、94、または96のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの他方のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:83、87、90、92、98、または100のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有している。いくつかの態様において、ヘテロ二量体Fcの一方のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:84、88、95、または97のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの他方のFcポリペプチドは、SEQ ID NO:85、89、91、93、99、または101のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む。

いくつかの態様において、ヒトIgG Fc領域は、二量体化を防止するために修飾される。これらの態様において、本開示の融合タンパク質は、単量体である。例えば、残基Thr366における荷電残基への修飾、例えば、Thr366Lys、Thr366Arg、Thr366Asp、またはThr366Glu（それぞれ、T366K、T366R、T366D、またはT366E）は、CH3-CH3二量体化を防止する。

いくつかの態様において、融合タンパク質のFc領域は、Fc受容体結合を低下させるため、以下の位置のうちの1つまたは複数において変更される：Leu234（L234）、Leu235（L235）、Asp265（D265）、Asp270（D270）、Ser298（S298）、Asn297（N297）、Asn325（N325）、またはAla327（A327）。例えば、Leu234Ala（L234A）、Leu235Ala（L235A）、Asp265Asn（D265N）、Asp270Asn（D270N）、Ser298Asn（S298N）、Asn297Ala（N297A）、Asn325Glu（N325E）、またはAla327Ser（A327S）。好ましい態様において、Fc領域内の修飾は、Fc受容体γ受容体との結合を低下させるが、新生児型Fc受容体（FcRn）との結合に対しては最小の影響を及ぼす。

いくつかの態様において、融合タンパク質は、免疫グロブリンヒンジ領域に由来するポリペプチドを含有している。ヒンジ領域は、ヒトIgGサブクラスのいずれかより選択され得る。例えば、融合タンパク質は、EPKSSDKTHTCPPC（SEQ ID NO:7）の配列を有する修飾型IgG1ヒンジを含有していてよく、ここで、軽鎖のC末端システインとジスルフィドを形成するCys220は、セリンに変異させられる（例えば、Cys220Ser（C220S））。他の態様において、融合タンパク質は、配列DKTHTCPPC（SEQ ID NO:8）を有する短縮型ヒンジを含有している。

いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列ESKYGPPCPPC（SEQ ID NO:9）を有する、鎖交換を防止するかまたは低下させるために修飾（例えば、Ser228Pro（S228P））されたIgG4由来の修飾型ヒンジを有する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、リンカーポリペプチドを含有している。他の態様において、融合タンパク質は、リンカーおよびヒンジポリペプチドを含有している。

3. リンカー
提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンFc領域を含有している第1の成分とCD3結合領域を含有している第2の成分とを接合するかまたはカップリングするリンカーを含有している。いくつかの態様において、リンカーは、Fc領域がCD3結合領域のN末端側にあるよう、Fc領域のC末端領域の末端に位置付けられている。提供された多重特異性ポリペプチド構築物は、二量体のような多量体であるため、提供された構築物は、第1のポリペプチドの第1のFcポリペプチドおよびCD3結合領域の第1のドメイン（例えば、VH）と、第2のポリペプチドの第2のFcポリペプチドおよびCD3結合領域の第2のドメイン（例えば、VL）とを接合するリンカーを含む。典型的には、多重特異性ポリペプチド構築物の第1および第2のポリペプチドに存在するリンカーは、同一である。従って、いくつかの態様において、CD3結合ドメインの各ドメインは、同一のリンカーのようなリンカーを介して、ヘテロ二量体FcのようなFcの反対のポリペプチドと連結されている。

融合タンパク質において使用するための様々なポリペプチドリンカーは、公知である（例えば、Chen et al. (2013)Adv. Drug. Deliv. 65:1357-1369；および国際PCT公開番号WO2014/099997、WO2000/24884；米国特許第5,258,498号；米国特許第5,525,491号；米国特許第5,525,491号、米国特許第6,132,992号を参照すること）。

いくつかの態様において、リンカーは、CD3結合領域が多重特異性ポリペプチドコンジュゲートのFc領域と接合されている時には、CD3結合領域が制約されており、多重特異性ポリペプチド構築物が細胞と接触した時に、細胞、例えば、T細胞の表面上のCD3に結合するかまたは係合することができないかまたは実質的にできないよう、選択される。T細胞結合を評価するためのアッセイ、レポーター系を使用したNFAT活性化、細胞溶解性T細胞活性、サイトカイン産生、および/またはT細胞活性化マーカーの発現を含む、様々なアッセイが、多重特異性ポリペプチド構築物によるCD3の結合または係合を評価するために利用され得る。例示的なアッセイは、提供された実施例において示される。典型的には、リンカーは、ポリペプチド構築物の正確な折り畳みを確実にし、連結されたポリペプチドの活性または機能と調和しない電荷を示さず、連結されたポリペプチドの活性を衰弱させるかもしくは変更する、ドメインのうちの1つまたは複数におけるアミノ酸残基との結合もしくはその他の相互作用を形成しないものでもある。いくつかの態様において、リンカーは、ポリペプチドリンカーである。ポリペプチドリンカーは、可動性リンカーもしくは非可動性リンカー、または両方の組み合わせであり得る。いくつかの局面において、リンカーは、短いか、中程度であるか、または長いリンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、40アミノ酸までの長さである。いくつかの態様において、25アミノ酸までの長さである。いくつかの態様において、リンカーは、少なくとも約2アミノ酸の長さである。いくつかの局面において、適当な長さは、例えば、少なくとも1アミノ酸残基、典型的には、約40アミノ酸残基未満、例えば、2～25アミノ酸残基、5～20アミノ酸残基、5～15アミノ酸残基、8～12アミノ酸の長さである。いくつかの態様において、リンカーは、約2～24アミノ酸、2～20アミノ酸、2～18アミノ酸、2～14アミノ酸、2～12アミノ酸、2～10アミノ酸、2～8アミノ酸、2～6アミノ酸、6～24アミノ酸、6～20アミノ酸、6～18アミノ酸、6～14アミノ酸、6～12アミノ酸、6～10アミノ酸、6～8アミノ酸、8～24アミノ酸、8～20アミノ酸、8～18アミノ酸、8～14アミノ酸、8～12アミノ酸、8～10アミノ酸、10～24アミノ酸、10～20アミノ酸、10～18アミノ酸、10～14アミノ酸、10～12アミノ酸、12～24アミノ酸、12～20アミノ酸、12～18アミノ酸、12～14アミノ酸、14～24アミノ酸、14～20アミノ酸、14～18アミノ酸、18～24アミノ酸、18～20アミノ酸、または20～24アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸長である。

ある種の局面において、リンカー長が長いほど、多重特異性ポリペプチドコンジュゲートが、その抗原、例えば、TAAに結合した時のCD3結合が大きくなる。従って、いくつかの局面において、リンカーは、12アミノ酸を超える長さ、例えば、13、14、15、16、17、または18アミノ酸を超える長さである。いくつかの態様において、リンカーは、12～40アミノ酸長、12～30アミノ酸、12～24アミノ酸、12～18酸、12～15アミノ酸、15～40アミノ酸、15～30アミノ酸、15～24アミノ酸、15～18アミノ酸、18～40アミノ酸、18～30アミノ酸、18～24アミノ酸、24～40アミノ酸、24～30アミノ酸、または30～40アミノ酸である。

リンカーは、天然に存在するものであってもよいし、合成であってもよいし、または両方の組み合わせであってもよい。特に適当なリンカーポリペプチドは、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、アラニン（Ala）、およびトレオニン（Thr）より選択されるアミノ酸残基を主に含む。例えば、リンカーは、（ペプチドリンカーに存在する残基の総数に基づき計算された）少なくとも75％、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、または少なくとも90％の、Gly、Ser、Ala、およびThrより選択されるアミノ酸残基を含有していてよい。リンカーは、Gly、Ser、Ala および/またはThrの残基のみからなっていてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、1～25個のグリシン残基、5～20個のグリシン残基、5～15個のグリシン残基、または8～12個のグリシン残基を含有している。いくつかの局面において、適当なペプチドリンカーは、典型的には、少なくとも50％のグリシン残基、例えば、少なくとも75％のグリシン残基を含有している。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、グリシン残基のみを含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、グリシン残基およびセリン残基のみを含む。

いくつかの態様において、これらのリンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから主に構成され、本明細書中でGSリンカーと呼ばれる。いくつかの態様において、リンカーは、(GGS)n（nは1～10、例えば、1～5、例えば、1～3である）、例えば、GGS(GGS)n（SEQ ID NO:171）（nは0～10である）を含有している。具体的な態様において、リンカーは、配列(GGGGS)n（SEQ ID NO:173）（nは1～10であるかまたはnは1～5、例えば、1～3である）を含有している。さらなる態様において、リンカーは、(GGGGGS)n（SEQ ID NO:172）（nは1～4、例えば、1～3である）を含有している。リンカーは、前記のいずれかの組み合わせを含んでいてよく、例えば、2個、3個、4個、または5個のGSリンカー、GGSリンカー、GGGGSリンカー、および/またはGGGGGSリンカーのリピートが組み合わせられてよい。いくつかの態様において、そのようなリンカーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19アミノ酸長である。

いくつかの態様において、リンカーは、以下の通りである（1文字アミノ酸コード）:GGS、GGGGS（SEQ ID NO:149）、またはGGGGGS（SEQ ID NO:135）。いくつかの態様において、GSリンカーは、

のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、リンカーは、GGGG（SEQ ID NO:103）である。前記実施例のいくつかにおいて、セリンがアラニンに置換されてもよい（例えば、（Gly4Ala）または（Gly3Ala））。

いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列Gly_x-Xaa-Gly_y-Xaa-Gly_z（SEQ ID NO:174）（Xaaは各々独立にアラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）、プロリン（Pro）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、システイン（Cys）、チロシン（Tyr）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、アスパラギン酸（Asp）、およびグルタミン酸（Glu）より選択され、x、y、およびzは各々1～5の範囲の整数である）を有するペプチドリンカーを含む。いくつかの態様において、Xaaは、各々独立にSer、Ala、およびThrからなる群より選択される。具体的な変動において、x、y、およびzの各々は、3に等しく、従って、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly（SEQ ID NO:175）（各Xaaは前記のように選択される）を有するペプチドリンカーを与える。

いくつかの態様において、リンカーは、(SSSSG)y（SEQ ID NO:185）モチーフ（yは少なくとも1であるが、yは2、3、4、5、6、7、8、および9であってもよい）の反復に基づくセリンリッチリンカーである。

いくつかのケースにおいて、ペプチドリンカーにある程度の非可動性を提供することが望ましい場合がある。これは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列にプロリン残基を含めることによって達成され得る。従って、いくつかの態様において、リンカーは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列内に少なくとも1個のプロリン残基を含む。例えば、ペプチドリンカーは、アミノ酸残基の少なくとも25％（例えば、少なくとも50％または少なくとも75％）がプロリン残基であるアミノ酸配列を有し得る。一つの具体的な態様において、ペプチドリンカーは、プロリン残基のみを含む。

いくつかの局面において、ペプチドリンカーは、少なくとも1個のシステイン残基、例えば、1個のシステイン残基を含む。例えば、いくつかの態様において、リンカーは、少なくとも1個のシステイン残基ならびにGly、Ser、Ala、およびThrからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。いくつかのそのような態様において、リンカーは、グリシン残基およびシステイン残基、例えば、グリシン残基およびシステイン残基のみを含む。典型的には、1個のシステイン残基のみが各ペプチドリンカーに含まれる。システイン残基を含む具体的なリンカーの一例は、アミノ酸配列Gly_m-Cys-Gly_n（nおよびmは各々1～12、例えば、3～9、4～8、または4～7の整数である）を有するペプチドリンカーを含む。具体的な変動において、そのようなペプチドリンカーは、アミノ酸配列GGGGG-C-GGGGG（SEQ ID NO:177）を有する。

いくつかの態様において、融合タンパク質のリンカーは、構造化されたまたは制約されたリンカーである。具体的な態様において、構造化されたリンカーは、配列(AP)nまたは(EAAAK)n（SEQ ID NO:178）（nは2～20、好ましくは、4～10である）、例えば、以下に限定されるわけではないが、AS-(AP)n-GT（SEQ ID NO:179）またはAS-(EAAAK)n-GT（SEQ ID NO:180）（nは2～20、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15である）を含有している。他の態様において、リンカーは、配列

（nは2～20である）を含む。いくつかの態様において、リンカーは

である。いくつかの態様において、そのようなリンカーは、その構造のため、タンパク質切断に対してより耐性であり、従って、インビボで注射された時に利点を与え得る。

いくつかの態様において、リンカーは、切断可能リンカーではなく、非切断可能リンカーとも呼ばれる。いくつかの態様において、リンカーは、プロテアーゼによって切断可能でない。いくつかの態様において、切断可能リンカーでないかまたはプロテアーゼによって切断可能でないリンカーは、一般にインビボの送達または組換え作製のために安定しているものである。いくつかの局面において、プロテアーゼによって切断可能でないリンカーには、切断可能なペプチド配列またはプロテアーゼの認識部位の内部に好ましくは存在する少なくとも1個のペプチド結合を含有していないものが含まれる。具体的な態様において、非切断可能リンカーは、プロテアーゼの標的基質ではなく、従って、同プロテアーゼの基質認識部位を含有しているリンカーと比較して、プロテアーゼによって優先的にまたは特異的に切断されない。

いくつかの態様において、リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの局面において、切断可能リンカーは、生理学的条件下で分解され得る少なくとも1個の結合の存在のため、プロテアーゼの基質である配列を含むリンカーである。いくつかのケースにおいて、切断可能リンカーは、インビボに存在する特定の条件の下、例えば、インビボの細胞環境に存在するものを含む、細胞外プロテアーゼへの曝露の後に、切断に対して感受性または高感度である。いくつかのケースにおいて、プロテアーゼは、腫瘍微小環境のような特定の生理学的微小環境に存在し、従って、切断が起こり得る部位を制限するものであってよい。

プロテアーゼは、典型的には、他の非標的基質と比較して、特定の標的基質の切断に対する特異性または優先性を示す。そのような特異性の程度は、基質に対するプロテアーゼの優先性および酵素の効率の尺度である、配列、例えば、リンカーの切断の速度定数に基づき決定され得る。様々な濃度の基質の存在下で、切断の増加の速度を経時的に決定する方法を、特異性定数を計算するために使用することができる。例えば、基質は、プロテアーゼによって切断された時に放出される蛍光発生モエティに連結されている。異なるプロテアーゼ濃度において切断の速度を決定することによって、特定のリンカーに対する特定のプロテアーゼについての切断の特異性定数（k_cat/K_m）を決定することができる。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、およそ少なくとも1×10⁴M^-1S^-1、または少なくとも5×10⁴M^-1S、少なくとも10×10⁴M^-1S、少なくとも10×10⁵M^-1S、またはそれ以上の速度で、プロテアーゼによって特異的に切断され得るリンカーである。

切断可能リンカー
いくつかの態様において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、第1および第2の成分を接合する切断可能リンカーを含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、プロテアーゼ、一般的には、細胞外プロテアーゼの基質として役立つことができるアミノ酸配列を含む。例えば、切断可能リンカーは、プロテアーゼの切断可能なペプチド配列の内部に好ましくは存在する少なくとも1個のペプチド結合を含有している切断配列を含んでいてよい。適当なプロテアーゼには、例えば、関節リウマチまたはがんのような疾患において強化された様式で形成されるかまたは活性化され、過剰の組織分解、炎症、および転移をもたらす、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびプラスミン活性化因子が含まれる。具体的な態様において、プロテアーゼは、腫瘍、活性化免疫エフェクター細胞（例えば、T細胞もしくはNK細胞）、または腫瘍微小環境の細胞によって産生されるプロテアーゼである。いくつかの態様において、プロテアーゼは、グランザイムB、マトリプターゼ、またはMMP-2のようなMMPである。

切断可能リンカーは、標的を発現する細胞の近傍の腫瘍によって産生され、かつ/または多重特異性ポリペプチド構築物の所望の標的と組織内で共局在している腫瘍によって産生されるプロテアーゼに基づき選択され得る。既知の基質を有するプロテアーゼの、多数のがん、例えば、固形腫瘍における増加したレベルが、文献中に報告されている。例えば、La Rocca et al,(2004)British J. of Cancer 90(7):1414-1421を参照すること。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の第1および第2の成分を接合する切断可能リンカーは、成分のうちの一方によって活性化される免疫エフェクター細胞によって産生されたプロテアーゼによって切断される。例えば、エフェクター可能または増強（effector enabled or enhanced）IgG Fc領域を包含する多重特異性ポリペプチド構築物は、標的抗原に係合した時、ADCCを誘発することができる。ADCCの中心は、エフェクター細胞、即ち、NK細胞および細胞傷害性T細胞からのグランザイムBおよびパーフォリンの放出である。放出によって、グランザイムBは、パーフォリン依存的に標的細胞に入り、そこで、アポトーシスを媒介する。重要なことに、グランザイムBは、エフェクター細胞と標的細胞との間の細胞外シナプスにおいて活性である。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の第1および第2の成分を接合する切断可能リンカーは、グランザイムBによって切断される。グランザイムBは、多重特異性ポリペプチド構築物の成分のうちの一つによって媒介されるエフェクター細胞活性化の間に放出される。いくつかの態様において、グランザイムBおよびその他のプロテアーゼは、活性化T細胞またはNK細胞を含む免疫エフェクター細胞によって産生され得る。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物によるTAA結合時のCD3係合によるT細胞の活性化が、そのようなプロテアーゼを放出し、次いで、それが、特異的な切断可能リンカーを切断し、それによって、CD3結合分子のCD3に係合する活性を強化するかまたは増加させることができる。いくつかの態様において、切断は、未切断状態においてTAAに結合した時に多重特異性構築物によって達成される活性を増幅するかまたは増加させることができる。

例示的な基質には、以下の酵素またはプロテアーゼのうちの1種または複数種によって切断可能な基質が含まれるが、これらに限定されるわけではない：ADAMS、ADAMTS、例えば、ADAM8；ADAM9；ADAM10；ADAM12；ADAM15；ADAM17/TACE；ADAMDEC1；ADAMTS1；ADAMTS4；ADAMTS5；アスパラギン酸プロテアーゼ、例えば、BACEまたはレニン；アスパラギン酸（aspartic）カテプシン、例えば、カテプシンDまたはカテプシンE；カスパーゼ、例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10、またはカスパーゼ14；システインカテプシン、例えば、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンK、カテプシンL、カテプシンS、カテプシンV/L2、カテプシンX/Z/P；システインプロテイナーゼ、例えば、クルジパイン（Cruzipain）；レグマイン；オツバイン（Otubain）2；KLK、例えば、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、またはKLK14；メタロプロテイナーゼ、例えば、メプリン；ネプリライシン；PSMA；BMP-1；MMP、例えば、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26、またはMMP27、セリンプロテアーゼ、例えば、活性化プロテインC、カテプシンA、カテプシンG、キマーゼ、凝固因子プロテアーゼ（例えば、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa）、エラスターゼ、グランザイムB、グアニジノベンゾアターゼ（Guanidinobenzoatase）、HtrA1、ヒト好中球エラスターゼ、ラクトフェリン、マラプシン（Marapsin）、NS3/4A、PACE4、プラスミン、PSA、tPA、トロンビン、トリプターゼ、uPA；II型膜貫通セリンプロテアーゼ（TTSP）、例えば、DESC1、DPP-4、FAP、ヘプシン、マトリプターゼ2、マトリプターゼ、TMPRSS2、TMPRSS3、またはTMPRSS4；およびそれらのいずれかの組み合わせ。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、複数種のプロテアーゼ、例えば、2種以上のプロテアーゼ、3種以上のプロテアーゼ、4種以上のプロテアーゼ等によって切断される。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、特定のプロテアーゼ、例えば、標的を発現する細胞の近傍の腫瘍によって産生され、かつ/または多重特異性ポリペプチド構築物の標的と共局在している腫瘍によって産生されることが公知であるプロテアーゼと共に使用するために選択される。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、プロテアーゼによって切断されるプロテアーゼの活性部位によって認識される配列である、特定のプロテアーゼの基質認識部位または切断部位を含有している。典型的には、例えば、セリンプロテアーゼについて、切断配列は、基質内のP1-P4およびP1'-P4'アミノ酸から構成され、ここで、切断はP1位の後で起こる。典型的には、セリンプロテアーゼの切断配列は、多くのプロテアーゼの拡張された基質特異性にマッチするため、6残基長であるが、プロテアーゼに依って、より長いかまたはより短くてもよい。典型的には、切断可能リンカーは、プロテアーゼによって認識される開裂可能なP1-P1'結合配列を含む。いくつかの局面において、切断可能リンカーは、例えば、プロテアーゼの基質認識部位配列または切断配列を導入することによって、特定のプロテアーゼによって切断され得るペプチド結合を導入するために改変される。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、2種以上の基質配列の組み合わせを含む。いくつかの態様において、各基質配列は、同一のプロテアーゼによって切断される。いくつかの態様において、基質配列のうちの少なくとも2種は、異なるプロテアーゼによって切断される。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、グランザイムBの基質であるアミノ酸を含む。いくつかの態様において、グランザイムB切断可能リンカーは、一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:150）（P4はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、またはAであり；P3はアミノ酸A、G、S、V、E、D、Q、N、またはYであり；P2はアミノ酸H、P、A、V、G、S、またはTであり；P1はアミノ酸DまたはEであり；P1'はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G、またはAである）を有するアミノ酸配列を含有している。いくつかの態様において、グランザイムB切断可能リンカーは、一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:151）（P4はアミノ酸IまたはLであり；P3はアミノ酸Eであり；P2はアミノ酸PまたはAであり；P1はアミノ酸Dであり；P1'はアミノ酸I、V、T、S、またはGである）を有するアミノ酸配列を含有している。

いくつかの態様において、グランザイムBの基質は、アミノ酸配列LEAD（SEQ ID NO:22）、LEPG（SEQ ID NO:142）、またはLEAE（SEQ ID NO:143）を含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、アミノ酸配列IEPDI（SEQ ID NO:136）、LEPDG（SEQ ID NO:152）、LEADT（SEQ ID NO:137）、IEPDG（SEQ ID NO:138）、IEPDV（SEQ ID NO:139）、IEPDS（SEQ ID NO:140）、IEPDT（SEQ ID NO:141）、IEPDP（SEQ ID NO:144）、LEPDG（SEQ ID NO:152）、またはLEADG（SEQ ID NO:153）を含む。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、マトリプターゼの基質であるアミノ酸を含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、配列P4QAR↓(A/V)（SEQ ID NO:154）（P4は任意のアミノ酸である）を含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、配列RQAR(A/V)（SEQ ID NO:155）を含む。いくつかの態様において、マトリプターゼの基質は、アミノ酸配列RQAR（SEQ ID NO:23）を含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、アミノ酸配列RQARV（SEQ ID NO:156）を含む。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、1種または複数種のマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の基質であるアミノ酸を含む。いくつかの態様において、MMPは、MMP-2である。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:157）（P3はP、V、またはAであり；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はL、I、またはMである）を含有している。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:158）（P3はPであり；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はLまたはIである）を含有している。いくつかの態様において、MMPの基質は、アミノ酸配列PAGL（SEQ ID NO:24）を含む。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、グランザイムBの基質であるアミノ酸配列と、マトリプターゼの基質であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、アミノ酸配列LEAD（SEQ ID NO:22）とアミノ酸配列RQAR（SEQ ID NO:23）との組み合わせを含む。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、グランザイムBの基質であるアミノ酸配列と、MMPの基質であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、アミノ酸配列LEAD（SEQ ID NO:22）とアミノ酸配列PAGL（SEQ ID NO:24）との組み合わせを含む。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、マトリプターゼの基質であるアミノ酸配列と、MMPの基質であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、アミノ酸配列RQAR（SEQ ID NO:23）とアミノ酸配列PAGL（SEQ ID NO:24）との組み合わせを含む。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、グランザイムBの基質であるアミノ酸配列と、マトリプターゼの基質であるアミノ酸配列と、MMPの基質であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、グランザイムBの基質であるアミノ酸配列と、MMPの基質であるアミノ酸配列との組み合わせを含む。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、アミノ酸配列LEAD（SEQ ID NO:22）とアミノ酸配列RQAR（SEQ ID NO:23）とアミノ酸配列PAGL（SEQ ID NO:24）との組み合わせを含む。

切断可能リンカーには、公知のリンカーが含まれ得る。切断可能リンカーの例は、Be'liveau et al. (2009)FEBS Journal,276；公開された米国出願番号US20160194399；US20150079088；US20170204139；US20160289324；US20160122425；US20150087810；US20170081397；米国特許第9644016号に記載されている。

いくつかの態様において、切断可能リンカーは、

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む

4. 抗原結合ドメイン：
本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、少なくとも1個の抗原結合ドメインを含み、例えば、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含む。いくつかの局面において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、抗体もしくは抗原結合断片、天然同族結合パートナー、アンチカリン（改変型リポカリン）、ファーピン、フィノマー、センチリン（改変型フィブロネクチンIIIドメイン）、シスチンノットドメイン、アフィリン、アフィボディ、または改変型CH3ドメインより選択される。いくつかの態様において、天然同族結合パートナーには、TAAのネイティブ同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはTAAとの結合活性を示すそれらのバリアントが含まれる。

いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、Fab断片、F(ab')₂断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片の1コピーまたは複数コピーを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、1つまたは複数のシングルドメイン抗体（sdAb）断片、例えば、V_HH、V_NAR、改変型V_Hドメイン、または改変型V_Kドメインを含む。V_HHは、天然のラクダ科動物の重鎖のみの抗体、重鎖のみの抗体を産生する遺伝学的に修飾された齧歯類、またはナイーブ/合成のラクダ科動物もしくはヒト化ラクダ科動物シングルドメイン抗体ライブラリーから生成され得る。V_NARは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成され得る。界面改変および特異的な生殖系列ファミリーの選択を含む様々な方法が、従来のヘテロ二量体のV_HドメインおよびV_Kドメインから単量体sdAbを生成するために実施されている。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび/もしくは第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、FABまたはscFvとして組み立てられたVH配列およびVL配列を含有している。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物の抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび/もしくは第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、シングルドメイン抗体（sdAb）として結合ドメインを含有している。

いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、TAAのネイティブ同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、もしくはTAAとの結合活性を示すそれらのバリアントであるか、またはそれらを含む。

いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、同一の抗原に結合する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、異なる抗原に結合する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、同一の腫瘍関連抗原（TAA）に結合する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、異なるTAAに結合する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、同一のTAAの異なるエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、または第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインの各々は独立に、同一のTAAの同一のエピトープに結合する。

いくつかの態様において、TAAに結合する抗原結合ドメインは、または抗原結合ドメインの各々は独立に、TAAとの1価、2価、3価、または4価の結合をもたらす。

いくつかの態様において、TAAは、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9、（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、ジャギドリガンド、ジャギド1、ジャギド2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン-1-リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3より選択される。

いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）である葉酸受容体α（FRα）に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、FRαに結合するsdAbとして結合ドメインを含有している。例示的なFRα結合sdAbは、SEQ ID NO:120、121、および122に示される。

いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）であるcMETに結合する。例えば、抗原結合ドメインは、cMETに結合するsdAbとして結合ドメインを含有している。例示的なcMET結合sdAbは、SEQ ID NO:123に示される（米国特許第9,346,884号）。

いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）であるB7H3に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、B7H3に結合するscFvとして結合ドメインを含有している。例示的なB7H3結合scFvは、SEQ ID NO:124に示される。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、VH-CH1（Fd）およびLCを含むFab抗体断片であるか、またはそれを含有している。例示的なB7H3 Fdは、SEQ ID NO:127に示され、例示的なB7H3 LCは、SEQ ID NO:128に示される（PCT公開番号WO2017/030926）。

いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）であるCD20に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、CD20に結合するscFvとして結合ドメインを含有している。例示的なCD20結合scFvは、SEQ ID NO:125、189、および190に示される（米国公開番号US2005/0123546）。

いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、各々腫瘍関連抗原（TAA）であるDLL3に結合する。例えば、抗原結合ドメインは、DLL3に結合するscFvとして結合ドメインを含有している。例示的なDLL3結合scFvは、SEQ ID NO:126および189に示される（米国公開番号US2017/0037130）。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、DLL3に結合するFdおよびLCを含むFab抗体断片であるか、またはそれを含有している。例示的なDLL3 Fdは、SEQ ID NO:133に示され、例示的なDLL3 LCは、SEQ ID NO:134（米国公開番号US8,044,178）に示される。

いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）である5T4に結合する。例示的な5T4 Fdは、SEQ ID NO:129に示され、例示的な5T4 LCは、SEQ ID NO:130に示される。いくつかの態様において、抗体結合ドメインは、SEQ ID NO:167および168に示されるVH-CH1（Fd）またはVL-CLを含む（米国特許第8,044,178号）。

いくつかの態様において、少なくとも1個の抗原結合ドメインは、または各抗原結合ドメインは独立に、腫瘍関連抗原（TAA）であるgpNMBに結合する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、Fd鎖およびLC鎖を含むFab断片であるか、またはそれを含有している。例示的なgpNMB Fdは、SEQ ID NO:131に示され、例示的なgpNMB LCは、SEQ ID NO:132に示される。

いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、直接、またはリンカーを介して間接的に、Fc領域および/またはCD3結合領域と連結されている。いくつかの態様において、連結は、リンカーを介している。いくつかの態様において、リンカーは、セクションII.3に記載される可動性または非可動性のリンカーを含み得る連結ペプチド（LP）であるが、概して、抗原結合ドメインを連結するペプチドは、切断可能リンカーでない。

いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合ドメインとFc領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）を含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、CD3結合領域と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む。いくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、第1の抗原結合ドメインとFc領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）およびCD3結合領域と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む。いくつかの局面において、多重特異性ポリペプチド構築物は、N末端からC末端へ、以下のような構造的配置を有する：第1の抗原結合ドメイン - LP1 - Fc領域 - リンカー - CD3結合領域 - LP2 - 第2の抗原結合ドメイン。いくつかの態様において、2個の連結ペプチドは、相互に同一ではない。

いくつかの態様において、LP1またはLP2は、独立に、約1～20アミノ酸長のペプチドである。いくつかの態様において、LP1またはLP2は、独立に、SEQ ID NO:10～13、119、135、147、149、もしくはGGSに示されるGly-Serリンカーであるか、またはそれを含むペプチドである。

III. 薬学的組成物
提供された多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかの組成物が、本明細書中に提供される。本開示による治療用エンティティの投与は、改善された移入、送達、耐性等を提供するために製剤へ組み入れられる適当な担体、賦形剤、およびその他の薬剤と共に投与されることが理解されるであろう。多数の適切な製剤が、全ての薬剤師に公知の処方集：Remington's Pharmaceutical Sciences（15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA(1975)）、特に、その中のBlaug,Seymourによるチャプター87に見出され得る。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ロウ、油、脂質、（Lipofectin（商標）のような）脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有小胞、DNAコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型乳濁液、油中水型乳濁液、カーボワックス（carbowax）（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含有している半固体混合物が含まれる。製剤中の活性成分が、製剤によって不活化されず、製剤が、投与ルートと生理学的に適合性であって、容認されるものであれば、上記の混合物は、いずれも、本開示による処置および治療において適切であり得る。薬剤師に周知の製剤、賦形剤、および担体に関する付加的な情報については、Baldrick P. 「Pharmaceutical excipient development:the need for preclinical guidance.」Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8(2000)、Wang W.「Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.」Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60(2000)、Charman WN「Lipids,lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.」J Pharm Sci. 89(8):967-78(2000)、Powell et al.「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311(1998)、およびその中の引用も参照すること。

いくつかの態様において、本明細書中で治療薬と集合的に呼ばれる多重特異性ポリペプチド構築物、コンジュゲートされた多重特異性ポリペプチド構築物、およびそれらの組成物、ならびにそれらの誘導体、断片、類似体、および相同体を、投与のために適当な薬学的組成物へ組み入れることができる。そのような組成物の調製に関与する原理および考察、ならびに成分の選択における案内は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences:The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro,et al., editors)Mack Pub. Co.,Easton,Pa.:1995；Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa.,1994；およびPeptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4),1991,M. Dekker, New Yorkに提供されている。

そのような組成物は、典型的には、多重特異性ポリペプチド構築物またはそのコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む。多重特異性ポリペプチド構築物が抗体の断片を含む場合、標的タンパク質に特異的に結合する抗体の最も小さい断片を使用することができる。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、抗体の標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成され、かつ/または組換えDNAテクノロジーによって作製され得る（例えば、Marasco et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:7889-7893(1993)を参照すること）。

本明細書中で使用されるように、「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的投与と適合性の全ての任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等が含まれるものとする。適当な担体は、参照によって本明細書中に組み入れられる、当技術領域における標準的な参考書、Remington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の適当な例には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および5％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。リポソーム、および不揮発性油のような非水性媒体も、使用され得る。薬理活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と非適合性でない限り、組成物中に使用されることが企図される。

インビボ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。

本開示の薬学的組成物は、その意図された投与ルートと適合性であるよう製剤化される。投与ルートの例には、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮（即ち、局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与が含まれる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含んでいてよい：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（EDTA）のようなキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような浸透圧の調整のための薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基によって調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製された、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに封入され得る。

注射可能な使用のために適当な薬学的組成物には、無菌の水性溶液（水溶性）もしくは分散液、または無菌の注射可能な溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌の粉末が含まれる。静脈内投与のため、適当な担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF,Parsippany,N.J.）、またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）が含まれる。全てのケースにおいて、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。それは、製造および保管の条件の下で安定していなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの適当な混合物を含有している溶媒または分散媒であり得る。適度の流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液のケースにおいては必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くのケースにおいて、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが適当であろう。注射可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。

無菌の注射可能溶液は、必要に応じて、上に列挙された成分のうちの一つまたは組み合わせと共に、必要とされる量の活性化合物を、適切な溶媒に組み入れた後、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、基本の分散媒および上に列挙されたもののうち必要な他の成分を含有している無菌の媒体に、活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌の粉末のケースにおいて、調製の方法は、事前に滅菌濾過された溶液から、活性成分＋付加的な所望の成分の粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥である。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再生の前または後のいずれかに実施され得る。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で保管されてもよいしまたは溶液で保管されてもよい。さらに、非経口組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルに置かれる。

いくつかの態様において、薬学的組成物は、経口、経皮、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、創傷部位への直接適用、手術部位への適用、腹腔内、坐剤、皮下、皮内、経皮、噴霧、胸膜内、脳室内、関節内、眼内、または脊髄内を含む任意のルートを通して、対象へ投与される。

経口組成物は、一般に、不活性の希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されてもよいし、または錠剤へと圧縮されてもよい。経口治療的投与のため、活性化合物は、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態に、賦形剤と共に組み入れられ、使用され得る。経口組成物は、液体担体中の化合物が口内に適用され、含嗽され、喀出されるかまたは嚥下される、口内洗浄液として使用するため、液体担体を使用して調製されてもよい。薬学的に適合性の結合剤および/または補助材料が、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分または類似した性質の化合物のいずれかを含有していてよい：結晶セルロース、トラガントゴム、もしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、もしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（Sterotes）のような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動性改善剤；ショ糖もしくはサッカリンのような甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ風味のような風味剤。

吸入による投与のため、多重特異性ポリペプチド構築物は、適当な噴霧剤、例えば、二酸化炭素のような気体を含有している加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。

全身投与は、経粘膜または経皮の手段によることもできる。経粘膜投与または経皮投与のため、浸透すべき関門にとって適切な浸透剤が、製剤中に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬または坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野において一般に公知の軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。

化合物は、直腸送達のため、（例えば、カカオ脂およびその他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む）坐剤または停留浣腸の形態に調製されてもよい。

一つの態様において、治療薬は、インプラントおよびマイクロカプセル送達系を含む、徐放性/コントロールドリリース製剤のような、身体からの迅速な排除から化合物を保護する担体によって調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤の調製の方法は、当業者に明白であろう。

例えば、治療薬は、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに捕捉されてもよい。

いくつかの態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、増量剤、結合剤、コーティング、保存剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、着色剤、溶媒、緩衝剤、キレート剤、または安定剤を含む。薬学的に許容される増量剤の例には、セルロース、第二リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、結晶セルロース、ショ糖、乳糖、グルコース、マンニトール、ソルビトール、マルトール、アルファ化デンプン、コーンスターチ、またはジャガイモデンプンが含まれる。薬学的に許容される結合剤の例には、ポリビニルピロリドン、デンプン、乳糖、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ゼラチン、ショ糖、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、またはセルロースが含まれる。薬学的に許容されるコーティングの例には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、シェラック、トウモロコシタンパク質ゼイン、またはゼラチンが含まれる。薬学的に許容される崩壊剤の例には、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、またはデンプングリコール酸ナトリウムが含まれる。薬学的に許容される滑沢剤の例には、ポリエチレングリコール、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸が含まれる。薬学的に許容される保存剤の例には、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、またはソルビン酸が含まれる。薬学的に許容される甘味剤の例には、ショ糖、サッカリン、アスパルテーム、またはソルビトールが含まれる。薬学的に許容される緩衝剤の例には、炭酸、クエン酸、グルコン酸、酢酸、リン酸、または酒石酸が含まれる。

徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適当な例には、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である、抗体を含有している固体疎水性ポリマーの半透マトリックスが含まれる。いくつかの態様において、薬学的組成物は、注射可能マイクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームのような生成物のコントロールドリリースまたは徐放のための薬剤をさらに含む。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸およびγエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸グリコール酸コポリマーおよびリュープロリド酢酸塩から構成される注射可能マイクロスフェア）のような分解性の乳酸グリコール酸コポリマー、ならびにポリD-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸グリコール酸のようなポリマーは、100日以上にわたる分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間にわたりタンパク質を放出する。

材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Incから商業的に入手されてもよい。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む感染細胞にターゲティングされたリポソームを含む）リポソーム懸濁液も、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるように、当業者に公知の方法によって調製され得る。

投与の容易さおよび投薬量の均一性のため、投薬単位形態で経口または非経口の組成物を製剤化することは、特に有利である。投薬単位形態とは、本明細書中で使用されるように、処置される対象のための単位投薬量として適した物理的に不連続の単位をさし；各単位は、必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果を生じるよう計算された予め決定された量の活性化合物を含有している。本開示の投薬単位形態の詳細は、活性化合物の独特の特徴、および達成すべき特定の治療効果、および個体の処置のためのそのような活性化合物の合成の分野に固有の限界によって指示され、それらに直接依存する。

本明細書中に記載された薬学的組成物（または製品）を含むキットが、さらに提供される。薬学的組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。本明細書中に記載されたキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および本明細書中に記載された方法を実施するための説明書を含むパッケージインサートを含む、商業的見地および使用者見地から望ましい他の材料も含んでいてよい。

製剤は、処置されている特定の適応症のために必要な複数の多重特異性ポリペプチド構築物、例えば、相互に悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有していてもよい。いくつかの態様において、またはさらに、組成物は、例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害剤のような、その機能を増強する薬剤を含んでいてよい。そのような分子は、意図された目的のために有効な量で組み合わせられて適当に存在する。

いくつかの態様において、薬学的組成物の投薬は、単回投与または反復投与である。いくつかの態様において、投与は、1日1回、1日2回、1日3回、または1日4回以上、対象へ与えられる。いくつかの態様において、約1回以上（例えば、約2回以上、約3回以上、約4回以上、約5回以上、約6回以上、または約7回以上）の投与が、1週間に与えられる。いくつかの態様において、複数回投与は、数日、数週間、数か月、または数年にわたり与えられる。いくつかの態様において、処置の課程は、約1回または複数回（例えば、約2回以上、約3回以上、約4回以上、約5回以上、約7回以上、約10回以上、約15回以上、約25回以上、約40回以上、約50回以上、または約100回以上）の投与である。

いくつかの態様において、薬学的組成物は、対象へ投与される。一般に、薬学的組成物の投薬量および投与ルートは、標準的な薬学的実務に従って、対象のサイズおよび状態によって決定される。例えば、治療的に有効な用量は、最初に、細胞培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、もしくはサルのような動物モデルのいずれかにおいて評価され得る。動物モデルは、適切な濃度範囲および投与ルートを決定するためにも使用され得る。次いで、そのような情報を、ヒトにおける投与のための有用な用量およびルートを決定するために使用することができる。正確な投薬量は、処置を必要とする対象に関係のある因子を考慮して決定されるであろう。投薬量および投与は、十分なレベルの活性化合物を提供するため、または所望の効果を維持するため、調整される。考慮に入れられ得る因子には、疾患状態の重症度、対象の健康状態、対象の年齢、体重、および性別、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感度、ならびに治療に対する応答が含まれる。特定の患者のための最適の投薬量および処置計画は、疾患の兆候について患者をモニタリングし、それに応じて、処置を調整することによって、医療の当業者によって容易に決定され得る。

IV. 使用および治療的投与の方法
多重特異性ポリペプチド構築物を使用する方法およびその使用が提供される。そのような方法および使用には、例えば、分子またはそれを含有している組成物の、腫瘍またはがんのような疾患、状態、または障害を有する対象への投与を含む、治療的な方法および使用が含まれる。いくつかの態様において、分子および/または組成物は、疾患または障害の処置を達成するために有効な量で投与される。使用には、そのような方法および処置における多重特異性ポリペプチド構築物の使用、ならびにそのような治療方法を実施するための医薬の調製における使用が含まれる。いくつかの態様において、方法は、多重特異性ポリペプチド構築物またはそれを含む組成物を、疾患または状態を有するかまたは有すると推測される対象へ投与することによって実施される。いくつかの態様において、方法は、それによって、対象における疾患または状態または障害を処置する。

一つの態様において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、治療剤として使用され得る。そのような薬剤は、一般に、対象における疾患または病理を診断し、予後判定し、モニタリングし、処置し、緩和し、かつ/または防止するため、利用されるであろう。治療計画は、標準的な方法を使用して、障害に罹患している（または発症するリスクを有する）対象、例えば、ヒト患者またはその他の哺乳動物を同定することによって実施される。多重特異性ポリペプチド構築物は、対象へ投与される。多重特異性ポリペプチド構築物は、対象へ投与され、一般に、標的との結合によって効果を及ぼすであろう。

いくつかの態様において、提供された多重特異性コンジュゲートまたは薬学的組成物のいずれかを、治療的に有効な量で、投与することによって、対象における免疫応答を調節する方法が、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、免疫応答を調節する方法は、対象における免疫応答を増加させるかまたは増強する。例えば、増加したまたは増強された応答は、細胞性免疫の増加であり得る。いくつかの例において、方法は、細胞溶解性T細胞（CTL）活性のようなT細胞活性を増加させる。いくつかの態様において、調節された（例えば、増加した）免疫応答は、腫瘍またはがんに対するものである。

多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域を通したFcγRの係合を介して、自然免疫細胞を活性化することができる。多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、ADCC、サイトカイン放出、脱顆粒、および/またはADCPを含む自然免疫細胞エフェクター機能を誘起し、刺激し、活性化し、かつ/または強化することができる。多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、第1および第2の成分を接合するリンカーがプロテアーゼによって切断され、それによって、抗CD3結合部分がT細胞上のCD3εに結合することが可能になった後、T細胞を活性化することができる。多重特異性ポリペプチド構築物の投与は、CD3によって媒介されるT細胞活性化、細胞傷害、サイトカイン放出、および/または増殖を誘起し、刺激し、活性化し、かつ/または強化することができる。

いくつかの態様において、提供された方法は、提供された多重特異性コンジュゲートまたは薬学的組成物のいずれかを、治療的に有効な量で、投与することによって、対象における疾患または状態を処置するためのものである。いくつかの態様において、疾患または状態は、腫瘍またはがんである。一般に、疾患または障害の緩和または処置は、疾患または障害に関連した一つまたは複数の症状または医学的問題の低減を含む。例えば、がんのケースにおいて、治療的に有効な量の薬物は、以下のうちの一つまたは組み合わせを達成することができる：がん細胞の数の低下；腫瘍サイズの低下；末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害（即ち、ある程度の減少および/もしくは中止）；腫瘍転移の阻害；腫瘍成長のある程度の阻害；ならびに/またはがんに関連した症状のうちの一つもしくは複数のある程度の軽減。いくつかの態様において、本開示の組成物は、対象、例えば、ヒト、または非ヒト霊長類、ペット（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、実験動物、もしくは動物園の動物のようなその他の哺乳動物において、疾患または障害の発病または再発を防止するために使用され得る。対象および患者という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。

いくつかの態様において、薬学的組成物は、（ヒトがん細胞のような）哺乳動物がん細胞の成長を阻害するために使用され得る。がんを処置する方法は、本明細書中に記載された薬学的組成物のいずれかを、有効量、がんを有する対象へ投与する工程を含み得る。有効量の薬学的組成物は、がんの進行を阻害するか、停止させるか、または逆転させるために投与され得る。ヒトがん細胞は、インビボまたはエクスビボで処置され得る。ヒト患者のエクスビボ処置においては、がん細胞を含有している組織または液体が、体外で処置され、次いで、組織または液体が、患者へ戻し再導入される。いくつかの態様において、がんは、治療用組成物の患者への投与によって、インビボでヒト患者において処置される。

疾患の非限定的な例には、全ての型のがん（乳がん、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、黒色腫、頭頸部がん、膵臓がん等）、関節リウマチ、クローン病、SLE、心血管傷害、虚血等が含まれる。例えば、適応症には、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）を含む白血病、多発性骨髄腫を含むリンパ芽球性疾患、ならびに肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、および三種陰性乳がんを含む乳がんを含む固形腫瘍が含まれるであろう。例えば、適応症には、原発腫瘍起源に関わらない、がんにおける骨疾患もしくは転移；非限定的な例として、ER/PR+乳がん、Her2+乳がん、三種陰性乳がんを含む乳がん；結腸直腸がん；子宮内膜がん；胃がん；膠芽腫；食道がんのような頭頸部がん；非限定的な例として、非小細胞肺がんのような肺がん；多発性骨髄腫；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；骨肉腫のような肉腫；非限定的な例として、腎細胞がんのような腎臓がん；および/または、非限定的な例として、扁平上皮がん、基底細胞がん、もしくは黒色腫のような皮膚がんが含まれる。いくつかの態様において、がんは、扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、皮膚扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、食道扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、頭頸部扁平上皮がんである。いくつかの態様において、がんは、肺扁平上皮がんである。

本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の治療的に有効な量は、一般に、治療目的を達成するために必要とされる量に関する。前述のように、これは、ある種のケースにおいて、FcγRによって媒介される自然免疫細胞活性化またはCD3によって媒介されるT細胞活性化を誘起し、刺激し、活性化し、かつ/または強化する、多重特異性ポリペプチド構築物とその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与される必要がある量は、さらに、多重特異性ポリペプチド構築物の特定の抗原に対する結合親和性に依り、投与された多重特異性ポリペプチド構築物が、それが投与された対象の自由体積から枯渇する速度にも依るであろう。多重特異性ポリペプチド構築物の治療的に有効な用量の一般的な範囲は、例えば、非限定的に、約0.01μg/kg体重～約10mg/kg体重であり得る。いくつかの態様において、本開示の多重特異性ポリペプチド構築物の治療的に有効な用量は、例えば、非限定的に、約0.01mg/kg体重から約5～10mg/kg体重までであり得る。一般的な投薬頻度は、例えば、1日2回～週1回であり得る。

処置の有効性は、特定の障害を診断するかまたは処置する任意の公知の方法と共に決定される。所望の特異性を保有する多重特異性ポリペプチド構築物のスクリーニングの方法には、当技術分野において公知の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびその他の免疫学的に媒介される技術が含まれるが、これらに限定されるわけではない。提供された多重特異性ポリペプチド構築物の投与が、望まれない免疫応答を媒介するかもしくは媒介することができる免疫細胞の排除、隔離、もしくは不活化；防御免疫応答を媒介するかもしくは媒介することができる免疫細胞の誘導、生成、もしくは活性化；免疫細胞の物理的もしくは機能的な特性の変化；またはこれらの効果の組み合わせによって、免疫活性を十分に調節するか否かを決定するため、多様な手段が公知である。免疫活性の調節の測定の例には、（フローサイトメトリー、免疫組織化学、組織学、電子顕微鏡法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用した）免疫細胞集団の存在または欠如の調査；シグナルに応答して増殖するかまたは分裂する能力または抵抗性を含む免疫細胞の機能的能力の測定（例えば、T細胞増殖アッセイ、および抗CD3抗体、抗T細胞受容体抗体、抗CD28抗体、カルシウムイオノフォア、PMA（ホルボール12-ミリステート13-アセテート）、ペプチドまたはタンパク質抗原が負荷された抗原提示細胞による刺激後の3Hチミジン取り込みに基づくpepscan分析；B細胞増殖アッセイの使用）；（細胞傷害性T細胞アッセイのような）他の細胞を死滅させるかまたは溶解する能力の測定；（例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウエスタンブロット分析、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫沈降分析による）サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体、および細胞の他の生成物の測定；免疫細胞または免疫細胞内のシグナリング経路の活性化の生化学的マーカーの測定（例えば、ウエスタンブロット、およびチロシン、セリン、またはトレオニンのリン酸化の免疫沈降分析、ポリペプチド切断、およびタンパク質複合体の形成または解離；タンパク質アレイ分析；DNAアレイまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションを使用したDNA転写プロファイリング）；アポトーシス、壊死、またはその他の機序による細胞死の測定（例えば、アネキシンV染色、TUNELアッセイ、DNAラダー形成を測定するゲル電気泳動、組織学；蛍光発生カスパーゼアッセイ、カスパーゼ基質のウエスタンブロット分析）；免疫細胞によって産生された遺伝子、タンパク質、およびその他の分子の測定（例えば、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、二次元ゲル電気泳動、ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、フローサイトメトリー）；ならびに、例えば、再発率または疾患重症度を測定することによる、自己タンパク質または自己ポリペプチドを含む自己免疫疾患、神経変性疾患、およびその他の疾患の改善のような臨床的な症状または転帰の測定（臨床スコア、付加的な治療の使用の必要性、機能的状態、画像研究）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

多重特異性ポリペプチド構築物は、多様な診断用および予防用の製剤においても有用である。一つの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、前記の障害のうちの一つまたは複数を発症するリスクを有する患者へ投与される。患者または器官の、障害のうちの一つまたは複数の素因は、遺伝子型マーカー、血清学的マーカー、または生化学的マーカーを使用して決定され得る。

本開示の別の態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、前記の障害のうちの一つまたは複数に関連した臨床的適応症を有すると診断されたヒト個体へ投与される。診断時に、多重特異性ポリペプチド構築物は、臨床的適応症の効果を和らげるかまたは逆転させるために投与される。

組み合わせ治療
いくつかの態様において、本明細書中で集合的に治療薬と呼ばれる多重特異性ポリペプチド構築物、コンジュゲートされた多重特異性ポリペプチド構築物、およびそれらの組成物は、1種もしくは複数種の付加的な薬剤または付加的な薬剤の組み合わせと共に投与される。適当な付加的な薬剤には、意図された適用のための現在の医薬および/または外科的治療が含まれる。例えば、治療薬は、付加的な化学療法剤または抗腫瘍剤と共に使用され得る。例えば、治療薬および付加的な薬剤は、単一の治療用組成物へ製剤化され、治療薬および付加的な薬剤は、同時に投与される。いくつかの態様において、治療薬および付加的な薬剤は、相互に別々であり、例えば、各々、別々の治療用組成物へ製剤化され、治療薬および付加的な薬剤は、同時に投与されるか、または治療薬および付加的な薬剤は、処置計画中の異なる時点で投与される。例えば、治療薬が付加的な薬剤の投与の前に投与されるか、治療薬が付加的な薬剤の投与の後に投与されるか、または治療薬および付加的な薬剤が交互に投与される。本明細書中に記載されるように、治療薬および付加的な薬剤は、単回投与されるかまたは複数回投与される。いくつかの態様において、付加的な薬剤は、治療薬へカップリングされるかまたは他の方法で付着させられる。適当な付加的な薬剤は、意図された適用の目的（即ち、死滅、細胞増殖の防止、ホルモン治療、または遺伝子治療）によって選択される。そのような薬剤には、例えば、薬学的薬剤、毒素、毒素の断片、アルキル化剤、酵素、抗生物質、代謝拮抗薬、抗増殖剤、ホルモン、神経伝達物質、DNA、RNA、siRNA、オリゴヌクレオチド、アンチセンスRNA、アプタマー、診断薬、放射線不透過性色素、放射性同位体、蛍光発生化合物、磁気標識、ナノ粒子、マーカー化合物、レクチン、細胞膜透過性を変更する化合物、光化学的化合物、低分子、リポソーム、ミセル、遺伝子治療ベクター、ウイルスベクター等が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。最後に、薬剤の組み合わせまたは異なるクラスの薬剤の組み合わせが使用されてもよい。

一つの態様において、多重特異性ポリペプチド構築物は、組み合わせ治療において投与され、即ち、他の薬剤、例えば、自己免疫障害および炎症性疾患のような病理学的状態または障害を処置するため有用である治療剤と組み合わせられる。この情況において「組み合わせ」という用語は、薬剤が、実質的に同時期に、同時にまたは連続的に与えられることを意味する。連続的に与えられる場合、2種の化合物のうちの第1の化合物は、第2の化合物の投与の開始時に、未だ、処置の部位に有効な濃度で検出可能である。

例えば、組み合わせ治療には、以下により詳細に記載されるように、1種または複数種の付加的な治療剤、例えば、1種または複数種のサイトカインおよび増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、ならびに/または細胞傷害性薬剤もしくは細胞分裂阻害剤と共に製剤化されかつ/または同時投与される、1種または複数種の本開示の多重特異性ポリペプチド構築物が含まれ得る。さらに、本明細書中に記載された1種または複数種の多重特異性ポリペプチド構築物は、本明細書中に記載された治療剤のうちの2種以上と組み合わせて使用されてもよい。そのような組み合わせ治療は、有利に、投与される治療剤のより低い用量を利用し、従って、様々な単独治療に関連した可能性のある毒性または合併症を回避することができる。

他の態様において、1種または複数種の本開示の多重特異性ポリペプチド構築物は、1種または複数種の抗炎症薬、免疫抑制薬、代謝阻害剤、または酵素阻害剤と共に製剤化されかつ/または同時投与され得る。本明細書中に記載された抗体と組み合わせて使用され得る薬物または阻害剤の非限定的な例には、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）、例えば、イブプロフェン、テニダプ（tenidap）、ナプロキセン、メロキシカム（meloxicam）、ピロキシカム（piroxicam）、ジクロフェナク、およびインドメタシン；スルファサラジン；プレドニゾロンのような副腎皮質ステロイド；サイトカイン抑制性抗炎症薬（CSAID）；ヌクレオチド生合成の阻害剤、例えば、プリン生合成の阻害剤、葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート（N-[4-[[(2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル]メチルアミノ]ベンゾイル]-L-グルタミン酸）；ならびにピリミジン生合成の阻害剤、例えば、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（DHODH）阻害剤のうちの1種または複数種が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本開示の抗体と組み合わせて使用するために適当な治療剤には、NSAID、CSAID、（DHODH）阻害剤（例えば、レフルノミド）、および葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート）が含まれる。

付加的な阻害剤の例には、副腎皮質ステロイド（経口、吸入、および局所注射）；免疫抑制薬、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（FK-506）；ならびにmTOR阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン-RAPAMUNE（商標））またはラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、CCI-779）；TNFαまたはIL-1のような炎症誘発性サイトカインによるシグナリングに干渉する薬剤（例えば、IRAK、NIK、IKK、p38、またはMAPキナーゼ阻害剤）；COX2阻害剤、例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、およびそれらのバリアント；ホスホジエステラーゼ阻害薬、例えば、R973401（ホスホジエステラーゼIV型阻害剤）；ホスホリパーゼ阻害剤、例えば、サイトゾルホスホリパーゼ2（cPLA2）の阻害剤（例えば、トリフルオロメチルケトン類似体）；血管内皮細胞増殖因子または増殖因子受容体の阻害剤、例えば、VEGF阻害剤および/またはVEGF-R阻害剤；ならびに血管形成の阻害剤のうちの1種または複数種が含まれる。本開示の抗体と組み合わせて使用するために適当な治療剤は、免疫抑制薬、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（FK-506）；mTOR阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン）またはラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、CCI-779）；COX2阻害剤、例えば、セレコキシブおよびそのバリアント；ならびにホスホリパーゼ阻害剤、例えば、サイトゾルホスホリパーゼ2（cPLA2）の阻害剤、例えば、トリフルオロメチルケトン類似体である。多重特異性ポリペプチド構築物と組み合わせられ得る治療剤の付加的な例には、6-メルカプトプリン（6-MP）；アザチオプリンスルファサラジン；メサラジン；オルサラジン；クロロキン/ヒドロキシクロロキン（PLAQUENIL（登録商標））；ペニシラミン；金チオマレイン酸（筋肉内および経口）；アザチオプリン；コルヒチン；β2アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール）；キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）；クロモグリク酸；ネドクロミル；ケトチフェン；イプラトロピウムおよびオキシトロピウム；ミコフェノール酸モフェチル；アデノシンアゴニスト；抗血栓剤；補体阻害剤；ならびにアドレナリン作用薬のうちの1種または複数種が含まれる。

V. 例示的な態様
提供された態様には、以下のものが含まれる：
1. 免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分を含む多重特異性ポリペプチド構築物であって、
第1および第2の成分がリンカーによってカップリングされており、Fc領域がCD3結合領域のN末端側に位置付けられており；
第1および第2の成分の一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む、多重特異性ポリペプチド構築物。

2. CD3結合領域がCD3（CD3ε）に結合する、態様1の多重特異性ポリペプチド構築物。

3. 抗原結合ドメインが、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様1または態様2の多重特異性構築物。

4. 第1の成分が第1の抗原結合ドメインを含み、第2の成分が第2の抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインの各々が腫瘍関連抗原（TAA）に結合する、態様1～3のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

5. 第1の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様4の多重特異性ポリペプチド構築物。

6. N末端からC末端へ順に、以下のものを含む、多重特異性ポリペプチド構築物：
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；
免疫グロブリンFc領域；
リンカー；
CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメイン。

7. N末端からC末端へ順に、以下のものを含む、多重特異性ポリペプチド構築物：
免疫グロブリンFc領域；
リンカー；
CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン。

8. N末端からC末端へ順に、以下のものを含む、多重特異性ポリペプチド構築物：
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメイン；
免疫グロブリンFc領域；
リンカー；および
CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域。

9. Fc領域がホモ二量体Fc領域である、態様1～8のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

10. Fc領域が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、もしくはヒトIgG4のFc領域であるか、またはそれらの免疫活性断片である、態様1～9のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

11. Fc領域が、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:1との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む、態様1～10のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

12. Fc領域が、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:2との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含むか；
Fc領域が、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:4との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含むか；または
Fc領域が、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:5との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む、
態様1～10のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

13. Fc領域がヘテロ二量体Fc領域である、態様1～6、9、および12のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

14. ヘテロ二量体Fc領域の一方または両方のFcポリペプチドが、ホモ二量体Fc領域のポリペプチドと比較して、任意で、SEQ ID NO:1に示されるFcポリペプチドまたはその免疫活性断片と比較して、ヘテロ二量体化を誘導するための少なくとも1個の修飾を含む、態様13の多重特異性ポリペプチド構築物。

15. ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドの各々が独立に少なくとも1個のアミノ酸修飾を含む、態様14の多重特異性ポリペプチド構築物。

16. ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドの各々がノブイントゥホール修飾を含むかまたはポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異を含む、態様15の多重特異性ポリペプチド構築物。

17. アミノ酸修飾がノブイントゥホール修飾である、態様16の多重特異性ポリペプチド構築物。

18. ヘテロ二量体Fcの第1のFcポリペプチドがThr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val、およびそれらの組み合わせより選択される修飾を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のFcポリペプチドが修飾T366Wを含む、態様13～17のいずれかの多重特異性融合ポリペプチド。

19. 第1および第2のFcポリペプチドが非システイン残基のシステイン残基への修飾をさらに含み、第1のポリペプチドの修飾が位置Ser354およびY349の一方にあり、第2のFcポリペプチドの修飾が位置Ser354およびY349の他方にある、態様18の多重特異性融合ポリペプチド。

20. アミノ酸修飾がポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異である、態様16の多重特異性ポリペプチド構築物。

21. 第1および/もしくは第2のFcポリペプチドまたは第1および第2のFcポリペプチドの各々が相補的な位置に修飾を含み、ここで、修飾が他方のポリペプチドの相補的なアミノ酸と反対の電荷を有するアミノ酸への置換である、態様13～16および20のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

22. ヘテロ二量体Fcの第1または第2のFcポリペプチドの一方が残基Ile253における修飾をさらに含む、態様14～21のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

23. 修飾がIle253Argである、態様22の多重特異性ポリペプチド構築物。

24. ヘテロ二量体Fcの第1または第2のFcポリペプチドの一方が残基His435における修飾をさらに含む、態様14～23のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

25. 修飾がHis435Argである、態様24の多重特異性ポリペプチド構築物。

26. Fc領域が、Lys447を欠くポリペプチドを含む、態様1～25のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

27. Fc領域が、FcRn結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む、態様1～26のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

28. 修飾がMet252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある、態様27の多重特異性融合ポリペプチド。

29. 修飾がMet252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある、態様28の多重特異性融合ポリペプチド。

30. 修飾が位置Met252および位置Met428にある、態様28の多重特異性融合ポリペプチド。

31. 修飾がMet252YおよびMet428Lである、態様30の多重特異性融合ポリペプチド。

32. 修飾がMet252YおよびMet428Vである、態様30の多重特異性融合ポリペプチド。

33. ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドがSEQ ID NO:82、86、94、または96のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドがSEQ ID NO:83、87、90、92、98、または100のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、態様13～32のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

34. Fc領域が、エフェクター機能を低下させかつ/またはFcγ受容体もしくはC1qより選択されるエフェクター分子との結合を低下させる少なくとも1個のアミノ酸修飾を含むポリペプチドを含む、態様1～33のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

35. 1つまたは複数のアミノ酸修飾がGlu233、Leu234、またはLeu235のうちの1つまたは複数の欠失である、態様34の多重特異性ポリペプチド構築物。

36. ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドがSEQ ID NO:84、88、95、または97のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドがSEQ ID NO:85、89、91、93、99、または101のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、態様13～32、34、および35のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

37. Fc領域がFcγR結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む、態様1～32のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

38. 修飾がSer239またはIle332における修飾である、態様37の多重特異性ポリペプチド構築物。

39. Fc領域のグリコシル化が未修飾のFc領域と比較してFcγR結合を増強するために修飾されている、態様1～32および37のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

40. Fc領域がフコースを欠くかまたは低下したフコース含量を有する、態様39の多重特異性ポリペプチド構築物。

41. CD3結合領域が抗CD3抗体または抗原結合断片である、態様1～40のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

42. 抗CD3抗体または抗原結合断片が可変重鎖領域（VH）および可変軽鎖領域（VL）を含む、態様41の多重特異性ポリペプチド構築物。

43. CD3結合領域が1価である、態様1～42のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

44. 抗CD3抗体または抗原結合断片が単鎖抗体ではなく、任意で、単鎖可変断片（scFv）ではない、態様41～43のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

45. Fcがヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLがヘテロ二量体Fcの反対のポリペプチドに連結されている、態様42または態様44の多重特異性ポリペプチド構築物。

46. 抗原結合ドメインのうちの少なくとも1個がTAAに結合しない限り、CD3結合領域がCD3に結合するかまたは係合することができないかまたは実質的にできない、態様1～45のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

47. 抗原結合ドメインのうちの少なくとも2個がTAAに結合しない限り、CD3結合領域がCD3に結合するかまたは係合することができないかまたは実質的にできない、態様1～46のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

48. リンカーがポリペプチドリンカーである、態様1～47のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

49. リンカーが25アミノ酸長までのポリペプチドである、態様48の多重特異性ポリペプチド構築物。

50. リンカーが、約2～24アミノ酸、2～20アミノ酸、2～18アミノ酸、2～14アミノ酸、2～12アミノ酸、2～10アミノ酸、2～8アミノ酸、2～6アミノ酸、6～24アミノ酸、6～20アミノ酸、6～18アミノ酸、6～14アミノ酸、6～12アミノ酸、6～10アミノ酸、6～8アミノ酸、8～24アミノ酸、8～20アミノ酸、8～18アミノ酸、8～14アミノ酸、8～12アミノ酸、8～10アミノ酸、10～24アミノ酸、10～20アミノ酸、10～18アミノ酸、10～14アミノ酸、10～12アミノ酸、12～24アミノ酸、12～20アミノ酸、12～18アミノ酸、12～14アミノ酸、14～24アミノ酸、14～20アミノ酸、14～18アミノ酸、18～24アミノ酸、18～20アミノ酸、または20～24アミノ酸のポリペプチドである、態様48または態様49の多重特異性ポリペプチド構築物。

51. リンカーが、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸長であるポリペプチドである、態様48～50のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

52. リンカーが切断可能リンカーである、態様1～51のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

53. ヘテロ二量体Fc領域を含む第1の成分ならびに可変重鎖領域（VH）および可変軽鎖領域（VL）を含む抗CD3抗体または抗原結合断片を含む第2の成分を含む多重特異性ポリペプチド構築物であって、
抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLがヘテロ二量体Fcの反対のポリペプチドに連結されており；
第1および第2の成分が切断可能リンカーによってカップリングされており、ヘテロ二量体Fc領域が抗CD3抗体のN末端側に位置付けられており；
第1および第2の成分の一方または両方が腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む、
多重特異性ポリペプチド構築物。

54. 多重特異性ポリペプチド構築物が未切断状態にある時、切断状態と比較して、CD3結合領域のCD3との結合が実質的に低下する、態様52または態様53の多重特異性ポリペプチド構築物。

55. 切断状態において、第1および第2の成分が連結されていない、態様52～54のいずれかの多重特異性ポリペプチド。

56. 切断可能リンカーが、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、態様52～55のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

57. プロテアーゼが免疫エフェクター細胞によって、腫瘍によって、または腫瘍微小環境に存在する細胞によって産生される、態様56の多重特異性ポリペプチド構築物。

58. プロテアーゼが免疫エフェクター細胞によって産生され、免疫エフェクター細胞が活性化T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、またはNK T細胞である、態様57の多重特異性ポリペプチド構築物。

59. プロテアーゼがマトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせより選択される、態様56～58のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

60. プロテアーゼがグランザイムBである、態様59の多重特異性ポリペプチド構築物。

61. 切断可能リンカーが、一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:150）［P4はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、またはAであり；P3はアミノ酸A、G、S、V、E、D、Q、N、またはYであり；P2はアミノ酸H、P、A、V、G、S、またはTであり；P1はアミノ酸DまたはEであり；P1'はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G、またはAである］のアミノ酸配列を含む、態様52～60のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

62. 切断可能リンカーが、一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:151）［P4はアミノ酸IまたはLであり；P3はアミノ酸Eであり；P2はアミノ酸PまたはAであり；P1はアミノ酸Dであり；P1'はアミノ酸I、V、T、S、またはGである］のアミノ酸配列を含む、態様52～61のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

63. 切断可能リンカーが、アミノ酸配列IEPDI（SEQ ID NO:136）、LEPDG（SEQ ID NO:152）、LEADT（SEQ ID NO:137）、IEPDG（SEQ ID NO:138）、IEPDV（SEQ ID NO:139）、IEPDS（SEQ ID NO:140）、IEPDT（SEQ ID NO:141）、またはLEADG（SEQ ID NO:153）を含む、態様52～62のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

64. 切断可能リンカーがSEQ ID NO:22、105～112、136～141、148、150～153からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様52～63のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

65. プロテアーゼがマトリプターゼである、態様59の多重特異性ポリペプチド構築物。

66. 切断可能リンカーが配列P1QAR↓(A/V)（SEQ ID NO:154）［P1は任意のアミノ酸である］を含むか；または切断可能リンカーが配列RQAR(A/V)（SEQ ID NO:155）を含む、態様52～65のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

67. 切断可能リンカーが配列RQARV（SEQ ID NO:156）を含む、態様52～66のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

68. 切断可能リンカーが、SEQ ID NO:23、154～156からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様52～67のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

69. プロテアーゼがMMPである、態様59の多重特異性ポリペプチド構築物。

70. MMPがMMP-2である、態様69の多重特異性ポリペプチド構築物。

71. 切断可能リンカーが、一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:157）[P3はP、V、またはAであり；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はL、I、またはMである]を含む、態様52～70のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

72. 切断可能リンカーが、一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:158）[P3はPであり；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はLまたはIである]を含む、態様52～71のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

73. 切断可能リンカーが配列PAGL（SEQ ID NO:24）を含む、態様52～72のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

74. 切断可能リンカーが、SEQ ID NO:22～31、104～114、117～118、136～144、148、150～158からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様52～73のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

75. （i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む第1のポリペプチド；ならびに（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む第2のポリペプチドを少なくとも含む、態様45～74のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物であって、第1および第2のポリペプチドの一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む、多重特異性ポリペプチド構築物。

76. TAAに結合する1つまたは複数の抗原結合ドメインがTAAとの1価、2価、3価、または4価の結合をもたらす、態様1～75のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

77. 第1または第2のポリペプチドの一方のみが、TAAに結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む、態様75の多重特異性ポリペプチド構築物。

78. 少なくとも1個の抗原結合ドメインが、多重特異性ポリペプチド構築物の第1または第2ポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられておりかつ/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様75または態様77の多重特異性ポリペプチド構築物。

79. 少なくとも1個の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様75または態様77の多重特異性ポリペプチド構築物。

80. 抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、TAAのネイティブ同族結合パートナーの細胞外ドメインもしくはその結合断片、またはTAAとの結合活性を示すそれらのバリアントを含む、態様1～79のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

81. 抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片である、態様1～79のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

82. 抗体またはその抗原結合断片がFv、scFv、Fab、シングルドメイン抗体（sdAb）、VNAR、またはVHHである、態様81の多重特異性ポリペプチド構築物。

83. 抗体または抗原結合断片がsdAbである、態様81または態様82の多重特異性ポリペプチド構築物。

84. sdAbがヒトsdAbまたはヒト化sdAbである、態様83の多重特異性ポリペプチド構築物。

85. sdAbがVHH、VNAR、改変型VHドメイン、または改変型VKドメインである、態様83または態様84の多重特異性ポリペプチド構築物。

86. 抗体またはその抗原結合断片がscFvである、態様81または態様82の多重特異性ポリペプチド構築物。

87. 抗体またはその抗原結合断片がFabである、態様81または態様82の多重特異性ポリペプチド構築物。

88. （i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む第1のポリペプチド；
（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む第2のポリペプチド、ならびに
（iii）腫瘍関連抗原に結合するFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLを含む第3のポリペプチド
を含む、態様87の多重特異性ポリペプチド構築物であって、第1および/または第2のポリペプチドがFab抗体断片のVH-CH1(Fd)またはVL-CLの他方をさらに含む、多重特異性ポリペプチド構築物。

89. 第1または第2のポリペプチドの一方のみがFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方を含む、態様88の多重特異性ポリペプチド構築物。

90. 第1または第2のポリペプチドの両方がFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方を含む、態様89の多重特異性ポリペプチド構築物。

91. Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方が多重特異性ポリペプチド構築物の第1もしくは第2のポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様89または態様90の多重特異性ポリペプチド構築物。

92. Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLの他方が第1のポリペプチドもしくは第2のポリペプチドのFc領域に対してアミノ末端側および/または第1もしくは第2のポリペプチドの他方のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、態様89～91のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

93. 抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9、（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、ジャギドリガンド、ジャギド1、ジャギド2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン-1-リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3より選択される腫瘍抗原に結合する、態様1～92のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

94. 多重特異性抗原結合ドメインが第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含み、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが同一のTAAに結合する、態様1～93のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

95. 第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが同一のTAAの異なるエピトープに結合する、態様94の多重特異性ポリペプチド構築物。

96. 第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが同一のTAAの同一のエピトープに結合する、態様94の多重特異性ポリペプチド構築物。

97. 多重特異性抗原結合ドメインが第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを少なくとも含み、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが異なるTAAに結合する、態様1～96のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

98. 第1の抗原結合ドメインとFc領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）を含む、態様5～97のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

99. CD3結合領域と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む、態様5～98のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

100. 第1の抗原結合ドメインとFc領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）およびCD3結合領域と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含み、N末端からC末端へ以下のような構造的配置：第1の抗原結合ドメイン - LP1 - Fc領域 - リンカー - CD3結合領域 - LP2 - 第2の抗原結合ドメインを有する、態様5～99のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

101. リンカーが切断可能リンカーである、態様100の多重特異性ポリペプチド構築物。

102. 2個の連結ペプチドが相互に同一でない、態様100および態様101の多重特異性ポリペプチド構築物。

103. LP1またはLP2が独立に約1～20アミノ酸長のペプチドである、態様98～102のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

104. LP1またはLP2が独立にSEQ ID NO:10～13、119、135、147、149、またはGGSに示されるGly-Serリンカーであるかまたはそれを含むペプチドを含む、態様103の多重特異性ポリペプチド。

105. 抗CD3抗体または抗原結合断片がFv抗体断片である、態様41～104のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

106. Fv抗体断片がジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）を含む、態様105の多重特異性ポリペプチド構築物。

107. 抗CD3抗体または抗原結合断片が、
アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）を含むVH CDR1、
アミノ酸配列

を含むVH CD2；
アミノ酸配列

を含むVH CDR3；
アミノ酸配列

を含むVL CDR1；
アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を含むVL CDR2；および
アミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を含むVL CDR3
を含む、態様41～106のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

108. 抗CD3 dsFvが、
SEQ ID NO:14および32～62のいずれかのアミノ酸配列またはSEQ ID NO:14および32～62のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVH；ならびに
SEQ ID NO:15および63～81のいずれかのアミノ酸配列またはSEQ ID NO:14および32～62のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVL
を含む、態様106または態様107の多重特異性ポリペプチド構築物。

109. 抗CD3 dsFvがSEQ ID NO:14のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、態様106～108のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

110. 抗CD3 dsFvがSEQ ID NO:44のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む、態様102～104のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

111. 薬剤にコンジュゲートされている、態様1～109のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物。

112. 薬剤が治療剤、抗腫瘍剤、毒素もしくはその断片、検出可能モエティ、または診断剤である、態様111の多重特異性ポリペプチド構築物。

113. 薬剤がリンカーを介して多重特異性ポリペプチド構築物にコンジュゲートされている、態様112の多重特異性ポリペプチド構築物。

114. 態様1～113のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド。

115. 態様1～113のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド。

116. 態様1～115のいずれかの多重特異性構築物の第1のポリペプチドをコードする第1の核酸配列、および多重特異性構築物の第2のポリペプチドをコードする第2の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、第1および第2の核酸配列が配列内リボソーム進入部位（IRES）または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって分離されている、ポリヌクレオチド。

117. 第1の核酸配列および第2の核酸配列が同一のプロモーターに機能的に連結されている、態様116のポリヌクレオチド。

118. 多重特異性ポリペプチド構築物が第3のポリペプチド鎖を含み、ポリヌクレオチドが多重特異性構築物の第3のポリペプチドをコードする第3の核酸をさらに含む、態様116または態様117のポリヌクレオチド。

119. 第3の核酸が配列内リボソーム進入部位（IRES）または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって第1および/または第2のポリペプチドから分離されており、かつ/または第3の核酸配列が第1および/もしくは第2の核酸配列と同一のプロモーターに機能的に連結されている、態様118のポリヌクレオチド。

120. 自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸がT2A、P2A、E2A、またはF2Aより選択される、態様116～119のいずれかのポリヌクレオチド。

121. 態様114～120のいずれかのポリヌクレオチドを含むベクター。

122. 発現ベクターである、態様121のベクター。

123. ウイルスベクターまたは真核生物ベクター、任意で、哺乳動物ベクターである、態様121または122のベクター。

124. 態様114～120のいずれかのポリヌクレオチドまたは態様121～123のいずれかのベクターを含む細胞。

125. 組換えであるかまたは単離されたものである、態様124の細胞。

126. 哺乳動物細胞である、態様125の細胞。

127. HEK293細胞またはCHO細胞である、態様126の細胞。

128. 態様114～120のいずれかのポリヌクレオチドまたは態様121～123のいずれかのベクターを細胞へ導入する工程、および多重特異性ポリペプチド構築物が産生される条件の下で細胞を培養する工程を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法。

129. 多重特異性ポリペプチドが細胞によって産生される条件の下で態様124～127のいずれかの細胞を培養する工程を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法。

130. 哺乳動物細胞である、態様128または129の細胞。

131. HEK293細胞またはCHO細胞である、態様130の細胞。

132. 多重特異性ポリペプチド構築物を細胞から単離するかまたは精製する工程をさらに含む、態様128または態様129の方法。

133. 多重特異性ポリペプチド構築物がヘテロ二量体である、態様128～132のいずれかの方法。

134. 態様128～133のいずれかの方法によって作製された多重特異性ポリペプチド構築物。

135. 態様1～113または態様134のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。

136. 無菌である、態様135の薬学的組成物。

137. 態様1～113もしくは態様134のいずれかの多重特異性ポリペプチド構築物または態様109もしくは態様110の薬学的組成物と標的細胞およびT細胞を接触させる工程を含む、免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法であって、標的細胞が多重特異性ポリペプチド構築物によって認識される腫瘍関連抗原を発現している、方法。

138. 標的細胞が腫瘍関連抗原（TAA）を発現する腫瘍細胞である、態様137の方法。

139. 多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼの基質として機能する切断可能リンカーを含み、免疫応答の誘導または刺激がプロテアーゼの存在下で増加する、態様138または態様138の方法。

140. プロテアーゼが免疫エフェクター細胞によって、腫瘍によって、または腫瘍微小環境に存在する細胞によって産生される、態様139の方法。

141. プロテアーゼが免疫エフェクター細胞によって産生され、免疫エフェクター細胞が活性化T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、またはNK T細胞である、態様139または態様140の方法。

142. 免疫エフェクター細胞が抗原を発現する細胞の近傍にある、態様141の方法。

143. プロテアーゼが、組織内のTAAを発現する細胞の近傍の腫瘍によって産生されかつ/または組織内のTAAと共局在している腫瘍によって産生され、多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼに曝された時、プロテアーゼが多重特異性ポリペプチド構築物内の切断可能リンカーを切断する、態様137～142のいずれかの方法。

144. プロテアーゼがマトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせより選択される、態様137～143のいずれかの方法。

145. プロテアーゼがグランザイムBである、態様144の方法。

146. 接触がエクスビボまたはインビトロで実施される、態様137～145のいずれかの方法。

147. 接触が対象においてインビボで実施される、態様137～145のいずれかの方法。

148. 態様1～113もしくは態様134のいずれかの多重特異性コンジュゲート、または態様109もしくは態様110の薬学的組成物を、治療的に有効量、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法。

149. 細胞性免疫を増加させる、態様137～147および148の方法。

150. T細胞活性を増加させる、態様137～147、148、および149のいずれかの方法。

151. 細胞溶解性T細胞（CTL）活性を増加させる、態様137～147、148～150のいずれかの方法。

152. 腫瘍またはがんに対する免疫応答が増加する、態様137～147、148～151のいずれかの方法。

153. 対象における疾患または状態を処置する、態様137～147、148～152のいずれかの方法。

154. 態様1～113のいずれかの多重特異性コンジュゲートまたは態様135もしくは態様136の薬学的組成物を治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における疾患または状態を処置する方法。

155. 疾患または状態が腫瘍またはがんである、態様153または態様154の方法。

156. 対象がヒトである、態様147、148～155のいずれかの方法。

157. 不活性状態において、第1の成分および第2の成分を含む多重特異性ポリペプチド構築物であって、第1および第2の成分が機能的に連結されており、第1および第2の成分の各々が腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含み、第1の成分がFc領域を含み、第2の成分がCD3結合領域を含み、第1および第2の成分が切断可能リンカーによってカップリングされている、多重特異性ポリペプチド構築物。

158. 不活性状態において、CD3結合領域のCD3との結合が阻害されるかまたは実質的に低下する、態様157の多重特異性ポリペプチド。

159. 活性化状態において、第1および第2の成分が機能的に連結されていない、態様157の多重特異性ポリペプチド。

160. 活性化状態において、第2の成分がCD3のε鎖（CD3ε）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する、態様157の多重特異性ポリペプチド。

161. 活性化状態において、CD3のε鎖（CD3ε）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合し、
TAAの第1のエピトープに結合する第1の抗原結合ドメイン；
CD3εに結合する抗体またはその抗原結合断片；
免疫グロブリンFcポリペプチド領域；
TAAの第2のエピトープに結合する第2の抗原結合ドメイン；ならびに
免疫グロブリンFcポリペプチド領域および第2の抗原結合ドメインにカップリングされた切断可能リンカー
を含む多重特異性ポリペプチド構築物であって、切断可能リンカーがプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、多重特異性ポリペプチド構築物。

162. プロテアーゼが免疫エフェクター細胞によって産生される、態様161の多重特異性ポリペプチド構築物。

163. 免疫エフェクター細胞がTAAを発現する細胞の近傍にある、態様162の多重特異性ポリペプチド構築物。

164. 多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼに曝された時、プロテアーゼが多重特異性ポリペプチド構築物内の切断可能リンカーを切断する、態様161～163のいずれか1つの多重特異性ポリペプチド構築物。

165. プロテアーゼが組織内のTAAを発現する細胞の近傍の腫瘍によって産生されかつ/または組織内のTAAと共局在している腫瘍によって産生され、多重特異性ポリペプチド構築物がプロテアーゼに曝された時、プロテアーゼが多重特異性ポリペプチド構築物内の切断可能リンカーを切断する、態様161の多重特異性ポリペプチド構築物。

166. 切断可能リンカーが25アミノ酸長までのポリペプチドである、態様161の多重特異性ポリペプチド構築物。

167. 切断可能リンカーがマトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせの基質である、態様161の多重特異性ポリペプチド構築物。

168. 切断可能リンカーがSEQ ID NO:24～31からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様161の多重特異性ポリペプチド構築物。

169. 第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々がFab断片、F(ab')₂断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片である、態様161の多重特異性ポリペプチド構築物。

170. 抗体またはその抗原結合断片がFv、scFv、Fab、シングルドメイン抗体（sdAb）、V_NAR、またはVHHである、態様169の多重特異性融合ポリペプチド。

171. 抗体または抗原結合断片がsdAbである、態様169の多重特異性融合ポリペプチド。

172. sdAbがヒトsdAbまたはヒト化sdAbである、態様171の多重特異性融合ポリペプチド。

173. sdAbがVHH、V_NAR、改変型VHドメイン、または改変型VKドメインである、態様171の多重特異性融合ポリペプチド。

174. 免疫グロブリンFc領域ポリペプチドがSEQ ID NO:1～2からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様161の多重特異性融合ポリペプチド。

175. 免疫グロブリンFc領域ポリペプチドがFcγR結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含む、態様174の多重特異性融合ポリペプチド。

176. 修飾がSer239またはIle332における修飾である、態様175の多重特異性融合ポリペプチド。

177. 免疫グロブリンFcグリコシル化が未修飾のFc領域と比較してFcγR結合を増強するために修飾されている、態様174の多重特異性融合ポリペプチド。

178. 免疫グロブリンFcグリコシル化がフコースを欠くかまたは低下したフコース含量を有する、態様177の多重特異性融合ポリペプチド。

179. 免疫グロブリンFc領域ポリペプチドがヘテロ二量体化を誘導するための少なくとも1個の修飾を含む、態様174の多重特異性融合ポリペプチド。

180. 修飾がThr366、Leu368、およびTyr407、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある、態様179の多重特異性融合ポリペプチド。

181. 修飾がThr366Ser、Leu368Ala、およびTyr407Val、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、態様180の多重特異性融合ポリペプチド。

182. Ser354、Y349、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置における非システイン残基のシステイン残基への修飾をさらに含む、態様181の多重特異性融合ポリペプチド。

183. 残基Ile235における修飾をさらに含む、態様181の多重特異性融合ポリペプチド。

184. 修飾がIle235Argである、態様183の多重特異性融合ポリペプチド。

185. 免疫グロブリンFc領域ポリペプチドが残基Ile235における修飾を含む、態様174の多重特異性融合ポリペプチド。

186. 修飾がIle235Argである、態様185の多重特異性融合ポリペプチド。

187. 免疫グロブリンFc領域ポリペプチドがFcRn結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含む、態様174の多重特異性融合ポリペプチド。

188. 修飾がMet252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある、態様187の多重特異性融合ポリペプチド。

189. 修飾がMet252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある、態様188の多重特異性融合ポリペプチド。

190. 修飾が位置Met252および位置Met428にある、態様187の多重特異性融合ポリペプチド。

191. 修飾がMet252YおよびM428Lである、態様190の多重特異性融合ポリペプチド。

192. 修飾がMet252YおよびM428Vである、態様190の多重特異性融合ポリペプチド。

193. 第1の抗原結合ドメインと免疫グロブリンFcポリペプチド領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）を含む、態様161の多重特異性ポリペプチド構築物。

194. 抗CD3結合ドメインと第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含む、態様161の多重特異性ポリペプチド構築物。

195. 第1の抗原結合ドメインと免疫グロブリンFcポリペプチド領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）および抗CD3結合ドメインと第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含み、未切断状態において、N末端からC末端へ、以下の構造的配置：第1の抗原結合ドメイン - LP1 - 免疫グロブリンFcポリペプチドリンカー領域 - 切断可能リンカー - 抗CD3結合ドメイン - LP2 - 第2の抗原結合ドメインを有する、態様161の多重特異性ポリペプチド構築物。

196. 2個の連結ペプチドが相互に同一でない、態様195の多重特異性ポリペプチド構築物。

197. LP1およびLP2の各々が約1～20アミノ酸長のペプチドである、態様195の多重特異性ポリペプチド構築物。

198. CD3εに結合する抗体または抗原結合断片がFv抗体断片である、態様161の多重特異性ポリペプチド構築物。

199. Fv抗体断片が、ジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）を含む、態様198の多重特異性ポリペプチド構築物。

200. 抗CD3 dsFvが、
アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）を含むVH CDR1；
アミノ酸配列

を含むVH CD2；
アミノ酸配列

を含むVH CDR3；
アミノ酸配列

を含むVL CDR1；
アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を含むVL CDR2；および
アミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を含むVL CDR3
を含む、態様199の多重特異性ポリペプチド構築物。

201. 抗CD3結合Fvを構成するVHおよびVLがヘテロ二量体Fcの反対側に連結されている、態様198の多重特異性ポリペプチド構築物。

202. 抗CD3 dsFvがSEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む、態様200の多重特異性ポリペプチド構築物。

203. 抗CD3 dsFvがSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、態様200の多重特異性ポリペプチド構築物。

204. 抗CD3 dsFvがSEQ ID NO:14のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、態様200の多重特異性ポリペプチド構築物。

205. 抗CD3 dsFvがSEQ ID NO:32～81からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様204の多重特異性ポリペプチド構築物。

206. 抗CD3 dsFvがSEQ ID NO:32～62からなる群より選択されるアミノ酸配列およびSEQ ID NO:63～81からなる群より選択されるアミノ酸配列の組み合わせを含む、態様204の多重特異性ポリペプチド構築物。

207. 薬剤にコンジュゲートされている、態様1～206のいずれか1つの多重特異性ポリペプチド構築物。

208. 薬剤が治療剤、抗腫瘍剤、毒素もしくはその断片、検出可能モエティ、または診断剤である、態様207の多重特異性ポリペプチド構築物。

209. 薬剤がリンカーを介して多重特異性ポリペプチド構築物にコンジュゲートされている、態様207の多重特異性ポリペプチド構築物。

210. 態様1～209のいずれか1つの多重特異性ポリペプチド構築物と担体とを含む薬学的組成物。

211. 態様157～209のいずれか1つの多重特異性ポリペプチド構築物または態様210の薬学的組成物を、障害に関連した臨床的適応症の症状を緩和するのに十分な量、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における障害に関連した臨床的適応症の症状を処置するかまたは緩和する方法。

212. 対象がヒトである、態様211の方法。

213. 障害ががんである、態様211の方法。

VI. 実施例
以下の実施例は、例示的な目的のために含まれるに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。

実施例1. 制約CD3結合タンパク質を作製する方法
実施例1は、制約されたCD3結合を示すCD3結合領域を含有している多重特異性ポリペプチド構築物の生成および発現を記載する。リンカー（例えば、切断可能リンカー）によってCD3結合領域とカップリングされた免疫グロブリンのヘテロ二量体Fc領域、および多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側および/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられた腫瘍関連抗原（TAA）に結合する1つまたは複数の抗原結合ドメインを含有している、図1、図2、図3、図4A～4C、図5A～5E、図6A～6B、図7、図8、および図9に示される様々な配置の多重特異性構築物を生成した。異なるTAA抗原結合ドメインおよびリンカーを含む例示的な代表的な構築物を生成した。

ヘテロ二量体多重特異性ポリペプチド構築物の第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖を少なくともコードするポリヌクレオチドを、生成し、発現のためプラスミドにクローニングした。第1のポリペプチド鎖は、一般に、N末端からC末端へ順に、（例えば、SEQ ID NO:83に示される）Fcホールポリペプチド；プロテアーゼの1つまたは複数の基質認識部位を含有しているもののような切断可能リンカー；および（例えば、SEQ ID NO:72に示される）dsFv抗CD3抗体の可変軽鎖（VL）ドメインを含んでいた。第2のポリペプチド鎖は、一般に、N末端からC末端へ順に、（例えば、SEQ ID NO:82に示される）Fcノブポリペプチド；第1のポリペプチド鎖と同一の切断可能リンカー；および（例えば、SEQ ID NO:44に示される）dsFv抗CD3抗体の可変重鎖ドメインを含んでいた。注記されない限り、グランザイムBの基質認識部位を含有している例示的な切断可能リンカー

が、例示的な構築物において使用された。類似のリンカー

が、FRαを含有している例示的な構築物cx1547において使用された。例示的な構築物cx309については、例示的な切断可能リンカー

が使用された。類似の構築物が、他のヘテロ二量体Fc配置、例えば、記載されたもののような他のノブイントゥホール配置；他のリンカー、例えば、他の切断可能リンカー、具体的には、グランザイムB、マトリプターゼ、および/もしくはMMPのようなプロテアーゼの基質認識部位を含むポリペプチドリンカー；ならびに他のCD3結合領域、例えば、他の抗CD3抗体、例えば、dsFvもしくはその他の1価断片；またはscFvフォーマット、sdAbフォーマット、もしくはFabフォーマットのような他のTAA抗原結合断片を使用して生成されてもよい。

いくつかのケースにおいて、非切断可能リンカーを含有していることを除き、類似の構築物を生成した。非切断可能リンカーは、3～18アミノ酸の範囲のサイズのリンカーを含んでいた。例示的な生成された分子において使用された非切断可能リンカーの例は、GGS（例えば、例示的な構築物cx1356が含有）、GGSGGS（SEQ ID NO:10、例示的な構築物cx1357が含有）、

（SEQ ID NO:11、例示的な構築物cx1358が含有）、

（SEQ ID NO:12、例示的な構築物cx1359が含有）、

（SEQ ID NO:13、例示的な構築物cx1360が含有）、および

（SEQ ID NO:119）、または

（SEQ ID NO:147、例示的な構築物cx681が含有）であった。

ポリペプチド鎖の一方または両方は、さらに、様々な配置で、Fcドメインのアミノ末端側および/またはCD3結合領域のカルボキシ末端側に1つまたは複数のTAA抗原結合ドメインをコードした。TAAが単鎖断片、例えば、sdAbまたはscFvとして提供された時、TAA抗原結合ドメインは、Fcヘテロ二量体の一方もしくは両方のポリペプチド鎖（例えば、ホールおよび/もしくはノブ）のN末端側に、ペプチドリンカー、例えば、PGGGG（SEQ ID NO:102）によって連結され、かつ/またはCD3結合領域の一方もしくは両方のドメイン（例えば、VHおよび/もしくはVL）のC末端側に、ペプチドリンカー、例えば、GGGG（SEQ ID NO:103）によって連結された。他の類似のペプチドリンカーが利用されてもよい。cx3313またはcx3315と名付けられた例示的な構築物のように、TAAがFabとして提供された時には、Fabの軽鎖をコードする付加的なポリヌクレオチドが、プラスミドにクローニングされた。この例において、コードされたポリペプチドは、前記と同様に、FabのVH-CH1（Fd）がFcヘテロ二量体の一方もしくは両方のポリペプチド鎖のN末端に連結され、かつ/またはCD3結合領域の一方もしくは両方のドメインのC末端に連結された1本または複数本のポリペプチド鎖を含んでいた。第3のポリヌクレオチドは、FabのVL-CLをコードした。TAAに結合する任意の抗原結合ドメインが、提供された多重特異性ポリペプチド構築物において利用され得る。

例示的な生成されたタンパク質は、以下の腫瘍関連抗原のうちの1種に結合する抗原結合ドメインを含有していた：葉酸受容体α（FRα）、B7H3、EGFR、5T4、CD20、およびDLL3。生成されたタンパク質は、FabもしくはscFvとして組み立てられたVH配列およびVL配列から構成されるか、またはシングルドメイン抗体（sdAb）として結合ドメインを含有するよう生成された。以下の起源に由来するものを含むsdAb、scFv、およびFabを含む様々なTAA結合ドメインを、本明細書中で使用した：SEQ ID NO:123（米国特許第9,346,884号）に示されるcMet sdAb；SEQ ID NO:127および128に示されるB7H3 FabおよびscFv、ならびにSEQ ID NO:124（PCT公開番号WO2017030926）に示されるscFv；SEQ ID NO:129、130、167、および168（米国特許第8,044,178号）に示される5T4 scFv；SEQ ID NO:189（米国公開番号US2017/0037130）に示されるDLL3 scFv；SEQ ID NO:125、189、および190（米国公開番号US2005/0123546）に示されるCD20 GA101。例えば、1価、2価、3価、または4価の結合を提供するため、1個、2個、3個、または4個のTAA抗原結合ドメインを含有している多重特異性ポリペプチド構築物を生成した。いくつかのケースにおいて、TAA抗原結合ドメインは、同一であった。いくつかのケースにおいて、TAA抗原結合ドメインは、異なっており、従って、生成された多重特異性ポリペプチド構築物は、少なくとも2種の異なるTAA、同一のTAAの異なるエピトープ、または同一のTAAの同一のエピトープに対する特異性を示した。例えば、EGFRおよびcMetに対する特異性を有する抗原結合ドメインを含有している例示的な二重標的型多重特異性ポリペプチド構築物を生成した（例えば、図5C、ならびにcx2973、cx2979、およびcx2977と名付けられた例示的な構築物を参照すること）。さらに、B7H3の同一のエピトープもしくはB7H3の2種の異なるエピトープ（例えば、図6A、ならびにそれぞれcx2846およびcx3094と名付けられた例示的な構築物）、または5T4の同一のエピトープ（例えば、図7、例示的な構築物cx3252）に対して特異的な異なるTAA抗原結合ドメインを含有している例示的な多重特異性ポリペプチド構築物を生成した。

図3、4A（上パネル）～4C、5A～5E、6A～6B、7、8、および9に図示される構築物を含むcx1547、cx309、cx1356、cx1357、cx1358、cx1359、cx1360、cx681、およびcx1762（各々FRαを標的とする）；cx2513およびcx3030（各々EGFRを標的とする）；cx2973、cx2979、cx2977（各々cMETおよびEGFRを標的とする）；cx3095、cx2846、cx3094、cx3314、およびcx3313（各々B7H3を標的とする）；cx3315、cx3265、およびcx3262（各々5T4を標的とする）；cx3309（CD20を標的とする）；ならびにcx3308（DLL3を標的とする）と名付けられた例示的な多重特異性ポリペプチド構築物のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを生成した。切断可能リンカーまたは非切断可能リンカーを含有している構築物を生成した。

ヘテロ二量体制約CD3結合タンパク質の各鎖をコードする別々のプラスミドを、ポリエチレンイミンを使用して、哺乳動物細胞（HEK293またはCHOのいずれか）に等モル比で一過性トランスフェクトした。上清中に分泌された組換えタンパク質を、3～7日後に収集し、プロテインAクロマトグラフィ後の調製用サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）またはフロースルー疎水性相互作用クロマトグラフィ（HIC）のいずれかによって精製した。ヘテロ二量体タンパク質を、プロテインAに結合しないよう、ヘテロ二量体Fcの一方の鎖（一般的には、ホールFc）の位置I253RまたはH435Rに設計された変異によって、選択的に精製した。より疎水性であり、予想分子量の2倍である、2個のヘテロ二量体Fcを含有している望まれないクロスペア種を除去するため、SEC（Superdex-200樹脂を含むAKTA）またはFT-HIC（ブチル/フェニルセファロースを含むAKTA）における第2のクロマトグラフィ工程を使用した。

方法は、ヘテロ二量体Fcの適切に対合した種ならびに記載されたようなジスルフィドによって安定化された抗CD3 Fv（SEQ ID NO:44に示される変異G44Cを含む抗CD3 VHおよびSEQ ID NO:72に示される変異G100Cを含むVL）を含有しているヘテロ二量体多重特異性ポリペプチド構築物の生成に有利であった。精製されたヘテロ二量体制約CD3結合タンパク質は、安定しており、4℃でのインキュベーションの延長、またはタンパク質濃度の増加によって、クロスペア種を蓄積しなかった

図10Aは、還元条件（R）および非還元（NR）条件におけるFRα標的型制約CD3係合構築物cx1547のSDS-PAGEの画像を示す（予想分子量135kDa）。図10Bおよび10Cは、137.9kDaという決定された分子量を有する単一の種が観察されたことを証明する、cx1547のサイズ排除分析からのクロマトグラムを示す。

実施例2. フローサイトメトリーによるがん細胞および初代T細胞との結合
この実施例は、例示的な構築物のT細胞またはがん細胞との結合を評価する研究を記載する。これらの研究は、相互に隔離されたT細胞のみまたはがん細胞のみのいずれかを含有している単一培養物において実施された。

1. 切断状態および未切断状態における初代T細胞との結合
本明細書中でcx309と呼ばれる本開示の例示的な多重特異性ポリペプチド構築物の、初代T細胞の表面上のCD3との結合を、マトリプターゼ、グランザイムB、およびMMP-2の基質認識部位を含有している切断可能リンカー

のタンパク質切断の後に評価した。cx309の腫瘍抗原結合ドメインは、初代T細胞上に発現していない葉酸受容体α（FRα）に結合する。

初代T細胞を、健常ヒトドナーleukopaksから単離されたPBMCからネガティブ濃縮した。注記された場合、cx309を細胞へ添加する前に予め切断し、切断をSDS-PAGEによって確認した。具体的には、cx309を、マトリプターゼ（図11A）もしくはマトリックスメタロプロテアーゼ2（MMP-2）（図11B）に曝すか（切断）、またはプロテアーゼに曝さなかった（未切断）。切断されたcx309構築物または未切断のcx309構築物を、細胞において滴定するか、または単一の飽和濃度で添加した。結合したcx309を、ヒトFcまたはヒト化vhhのいずれかに特異的なフルオロフォアがコンジュゲートされた二次抗体によって検出し、結合をフローサイトメトリーによって測定した。二次抗体のみと共にインキュベートされた細胞は、陰性対照として役立った。

図11Aおよび11Bに示されるように、結合アッセイの開始前にFcドメインとCD3結合ドメインとの間のリンカーにおいてマトリプターゼまたはMMP-2のいずれかによって構築物を切断した後、cx309は、T細胞に結合した。未切断の構築物ではT細胞との結合が観察されず、このことから、cx309が、切断状態、即ち、活性状態においてはT細胞に結合することができるが、未切断形態においては検出可能なT細胞結合を示さないことが示された。

2. T細胞との結合と抗原発現がん細胞との結合の比較
FcとCD3結合ドメインの成分との間の様々なリンカーを含む付加的な代表的なFRαを標的とする制約CD3係合構築物を、前記のT細胞およびFRα発現細胞（Ovcar-5）との結合について評価した。研究のため、100nMの各構築物cx1356、cx681、またはcx1547を使用した。FcとCD3結合ドメインの成分との間の様々なリンカーを含む付加的な代表的なFRαを標的とする制約CD3係合構築物は、FRα発現細胞（Ovcar-5）に結合することが見出されたが（図12Aおよび12C）、T細胞に結合する能力は欠いていた（図12Bおよび12D）。

類似の研究において、実施例1に実質的に記載されたように生成された代表的なEGFRを標的とする制約CD3係合構築物cx3030は、EGFR発現細胞（Colo-205）に結合することが見出されたが（図13A）、T細胞に結合する能力は欠いていた（図13B）。400nMの各構築物を使用した。この観察は、制約CD3係合構築物が、隔離されたT細胞との減弱した結合を示すことをさらに証明する。

図14A～14Dに示されるように、類似の結果が、代表的なB7H3を標的とする制約CD3エンゲージャーcx3313、cx3314、およびcx3095について観察された。cx3313およびcx3314は、実質的に実施例1に記載されたように生成され、実施例1に記載されたように、それぞれFabまたはscFvとして組み立てられた同一のB7H3 VH配列およびVL配列から構成されていた。cx3095は、シングルドメイン抗体であるB7H3結合ドメインを含有していた。図14Aおよび14Bに示されるように、代表的なB7H3を標的とする制約CD3エンゲージャーは、B7H3を発現するA375細胞に結合することが見出された。しかしながら、図14Cおよび14Dに示されるように、同構築物は、隔離されたT細胞に結合することができなかった。これらの研究において、代表的なB7H3を標的とする制約CD3エンゲージャーcx3313、cx3314、およびcx3095の結合を、B7H3およびCD3を標的とする二重親和性リターゲティング抗体（DART）単量体Fcフォーマット（DART-Fc B7H3×CD3；例えば、WO2017030926A1を参照すること）と比較した。DART-Fc B7H3×CD3は、SEQ ID NO:169、145、または146に示されるB7H3配列を含有していた。注目すべきことに、DART-Fcフォーマットのみが、B7H3係合の非存在下でT細胞結合を可能にすることが観察され（図14Cおよび14D）、全てのフォーマットが、B7H3発現細胞との結合を示した（図14Aおよび14B）。

さらなる研究において、実質的に実施例1に記載されたように生成された代表的な5T4を標的とする制約CD3係合構築物cx3262およびcx3315について、類似の制約された結合が観察された。cx3262の5T4結合ドメインは、シングルドメイン抗体として生成され、cx3315の5T4結合ドメインは、SEQ ID NO:167および168（米国特許第8,044,178号を参照すること）に示されるように得られたscFvを用いて生成された。両方の代表的な5T4を標的とする制約CD3係合構築物は、5T4発現細胞（Ovcar-5）に結合することが見出されたが（図15A）、T細胞結合能力は欠いていた（図15B）。400nMの各構築物を使用した。この観察は、本明細書中に記載された制約CD3係合構築物が、隔離されたT細胞との減弱した結合を示すことをさらに証明する。

図16A～16Dに示されるように、代表的なCD20を標的とする制約CD3係合構築物cx3490は、CD20発現細胞（Ramos）に結合することが見出されたが、T細胞結合能力は欠いていた。100nMのcx3490構築物を使用した。cx3490のCD20結合ドメインは、実施例1に記載されたようなCD20抗体GA101のVHおよびVLに由来するscFvであった。

実施例3. レポーターアッセイを使用したCD3レポーターT細胞活性化の評価
この実施例は、様々な構築物の、標的抗原発現細胞と共培養されたCD3 NFATレポーターJurkat細胞株を活性化する能力の評価を記載する。これらのアッセイは、CD3結合ドメインを介したT細胞結合が、（実施例2において示されたように）隔離されたT細胞においては制限されているかまたは阻害されているが、本明細書中に提供された多重特異性ポリペプチドが同族抗原に結合した後は、T細胞に係合し、T細胞活性化を媒介することができることを証明するため、使用された。

1. ルシフェラーゼレポーターアッセイ
抗原を標的とする制約CD3係合構築物を、標的細胞と、NFATによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝学的に改変されたJurkat細胞（Promega,USA）との共培養物において滴定した。このアッセイにおいて、CD3の係合は、NFATシグナリングおよび細胞内ルシフェラーゼの生成をもたらす。アッセイプレートを、およそ6時間37℃でインキュベートし、次いで、室温へ平衡化した。Bio-Glo試薬を試料ウェルに添加し、上清の発光をSpectraMax Lマイクロプレートリーダを使用して測定した。

図17に示されるように、代表的なFRαを標的とする制約CD3係合構築物cx309は、FcとCD3結合ドメインとの間のリンカーにおいて切断された時、T細胞を活性化する有意に増強された能力を示した。本明細書中で、cx309は、アッセイ開始前にマトリプターゼによって予め切断された。注目すべきことに、T細胞活性化は、FRα陽性Ovcar-5細胞株の存在下でのみ観察された。いくつかのT細胞活性化は、未切断のcx309で観察された。この結果は、制約CD3係合構築物の、抗原との結合時にCD3結合を示す能力、タンパク質切断後の増加したCD3係合と一致している。

2. GFPレポーターアッセイ
抗原を標的とする制約CD3係合構築物を、標的細胞と、NFATによって駆動される緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する改変型Jurkat細胞との共培養物において滴定した。CD3の係合は、NFATシグナリングおよび緑色蛍光の生成をもたらす。接着性標的細胞を利用したレポーターアッセイのため、標的細胞を播種し、均一な分布のため室温で静置し、接着を可能にするため37℃で数時間インキュベートした後、レポーター細胞および抗原を標的とする制約CD3係合構築物を添加した。アッセイプレートを、IncuCyte ZOOM系を使用して連続的に画像化し、全緑色物体の積分強度を測定することによって、CD3レポーター細胞活性化を決定した。

図18および19A～19Dは、葉酸受容体（FRα）を標的とする構築物を示し；図20A～20Dは、EGFRまたはEGFRおよびcMETを標的とする構築物を示し；図21A～21Bおよび22A～22Fは、B7H3を標的とする構築物を示し；図23A～23Bおよび24は、5T4を標的とする構築物を示し；図25は、CD20を標的とする構築物を示し；図26は、DLL3を標的とする構築物を示す。全ての図に示されるように、試験された代表的な構築物の各々が、増加したGFPシグナルによって示されるように、標的発現細胞の存在下で、抗原依存性T細胞活性化を誘導することができた。図22A～Fは、活性化の程度が、実施例2に記載された比較分子DART-Fc:B7H3×CD3と類似しているか、いくつかのケースにおいては、より大きいことを示す。

注目すべきことに、図19A～19Dは、制約CD3係合構築物のFc部分が除去され、無制限のT細胞係合が可能になった時に達成される増強されたT細胞活性化能力を証明する。タンパク質切断可能リンカーがFcとCD3結合ドメインとの間に含まれる場合、制約CD3係合構築物のFcは、タンパク質分解を介して除去され得る。cx3238は、完全に切断されたC末端部分を表し、（1）C末端FRα結合sdAbに連結された抗CD3 VHおよび（2）C末端FRα結合sdAbに連結された抗CD3 VLをコードする2種のプラスミドの同時発現を介して作製された。この結果は、Fcドメインの位置付けが、CD3結合領域のCD3に結合する能力を制約することと一致している。

実施例4. 活性に対するリンカー長の評価
FcとCD3結合領域を含む成分ドメイン（VHおよびVL）との間のリンカーの様々な長さの、T細胞活性化能力に対する効果を、実施例3に記載されたJurkatレポーターアッセイを使用して試験した。表E1にリストされる変動する長さのGlySerに基づくリンカーを含有している、実施例1に記載されたように生成されたFRαを標的とする制約CD3係合構築物を、これらのアッセイにおいて使用した。

（表Ｅ１）試験されたリンカー長

図27A～27Fに示されるように、リンカーの長さとT細胞活性化能力とは、正に相関していた。T細胞活性化能力は、リンカー長に直接関係していることが示され、より短いリンカーは、より大きい程度にCD3結合を制限することが示された。重要なことに、前記実施例2において示されたように（図12A～12D）、これらの構築物は、隔離された（例えば、標的TAAと結合していない時の溶液形態の）T細胞との結合能力を示さなかったため、構築物のT細胞係合は、TAA結合に依存性である。総合すると、これらの構築物は、CD3との制限されたまたは阻害された結合を示すが、標的依存的にT細胞を活性化することができた。

実施例5. 機能的活性の評価
この実施例は、ヒト初代T細胞インビトロアッセイにおいて試験された制約CD3係合構築物の評価および特徴決定を記載する。

1. T細胞媒介細胞傷害
標的細胞を、CytoID redによって蛍光標識した。接着性標的細胞を利用した細胞傷害アッセイのため、標的細胞を播種し、均一な分布のため室温で静置し、接着を可能にするため37℃で数時間インキュベートした後、他のアッセイ成分を添加した。初代T細胞を、健常ヒトドナーleukopaksから単離されたPBMCからネガティブ濃縮し、10:1～40:1のT細胞標的細胞比で添加した。緑色カスパーゼ3/7試薬を添加し、それによって、アポトーシスを受けている細胞の核DNAを蛍光標識した。抗体を、共培養物において滴定し、アッセイプレートを、IncuCyte ZOOM系を使用して連続的に画像化した。標的細胞死を、全赤色/緑色重複物体の面積を測定することによって決定した。

図28A～28Cに示されるように、FRα標的型制約CD3係合構築物cx1547は、抗原陽性細胞株の強力なT細胞媒介細胞傷害を誘導したが、抗原陰性細胞株においては誘導せず、このことは、抗原依存性T細胞活性化を強力に誘導する能力と一致していた。同様に、B7H3を標的とする制約CD3係合構築物は、図29A～29Fおよび30に示されるように、抗原陽性細胞株の強力なT細胞媒介細胞傷害を誘導したが、抗原陰性細胞株においては誘導しなかった。これらの構築物は、代替フォーマットDART-Fc B7H3×CD3と類似した効力を示した。これらの観察は、本明細書中に提供される抗原標的型制約CD3フォーマットが、当技術分野において公知の他のCD3係合フォーマットと比較して、隔離されたT細胞との結合を欠くかまたは低下した結合を示すが、強力な抗原依存性T細胞細胞傷害誘導能力を維持していることを支持している。

図31A～31Fに示されるように、cx2190と名付けられた、TAA結合ドメインに機能的に連結されたCD3結合ドメインのみを含有しているC末端タンパク質分解産物の代表的な構築物（図4Cを参照すること）は、cx1762と名付けられた、未切断のFRα標的型制約CD3係合構築物（図4Aを参照すること）と比較して、増強された抗原依存性T細胞細胞傷害誘導能力を示した。

図32に示されるように、代表的な5T4標的型制約CD3係合構築物cx3315は、5t4発現細胞株Ovcar-5に対する特異的なT細胞細胞傷害を誘導したが、5T4陰性細胞株CCRF-CEMに対しては誘導しなかった。

2. T細胞活性化
T細胞活性化を評価するため、T細胞媒介細胞傷害アッセイから懸濁細胞を収集し、生死判別染料、ならびにフルオロフォアがコンジュゲートされた抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD25抗体、および/または抗CD71抗体によって染色した。細胞を、SONY SA3800スペクトル分析機を使用して分析し、CD4+T細胞またはCD8+T細胞の活性化を、CD25もしくはCD71の発現レベルまたはCD25もしくはCD71の陽性率を測定することによって決定した。

図33は、切断されたcx309構築物、および未切断、即ち、不活性のcx309構築物を、20時間、T細胞およびOvcar5細胞の共培養物においてインキュベートすることによって測定されたT細胞活性化を示す。示されるように、切断されたcx309のみが、CD3結合を介してFRα依存性T細胞活性化を媒介することができた。T細胞活性化を、CD4集団およびCD8集団のCD25％のフローサイトメトリー分析によってモニタリングした。

さらに、B7H3 TAAを含有している構築物も試験した。図34A～34Hに示されるように、B7H3を標的とする制約CD3係合構築物も、CD3結合を介してB7H3依存性T細胞活性化を媒介した。制約CD3係合構築物およびDART-FcフォーマットによるT細胞活性化の類似した効力が、これらの2種のフォーマットによるT細胞結合の有意な差にも関わらず、観察された（図14A～14D）。

従って、結果は、試験された抗原標的制約CD3係合構築物が、CD4 T細胞およびCD8 T細胞の両方の強力な抗原依存性の活性化を誘導することを証明した。

3. T細胞サイトカイン産生（ELISA）
T細胞媒介細胞傷害アッセイからの上清を、サンドイッチELISA（BioLegend,USA）によって、IFNγ含量について分析した。製造業者の説明書に従い、標準曲線を生成し、それから、上清試料のサイトカイン濃度値を内挿した。検出下限値未満の吸光度値を有する試料には、最低標準濃度のものの半分に等しいサイトカイン濃度を割り当てた。図35は、代表的なB7H3標的型制約CD3係合構築物が、T細胞によるIFNγ産生を抗原依存的に誘発することが観察されたことを示す。

4. T細胞サイトカイン産生（FluoroSpot）
FluoroSpot膜を、4℃で一晩、IFNγおよびIL-2の捕獲抗体によってコーティングした。膜を、PBSで洗浄し、抗体滴定、標的細胞、およびPBMCまたはPBMCからネガティブ濃縮されたT細胞を添加した。標的細胞:PBMC共培養については、細胞を、1:20比で播種した。標的細胞:T細胞共培養については、細胞を、1:10比で播種した。アッセイプレートを37℃でおよそ24時間インキュベートし、膜を製造業者（C.T.L.）の説明書に従って調製した。膜をCTL-ImmunoSpot S6 Universal Analyzerを使用して画像化した。サイトカインスポット数をアッセイウェル間の均一な曝露時間および強度設定を使用して測定した。図36A～36Bおよび37は、それぞれ、FRα依存的またはB7H3依存的にT細胞からのサイトカイン産生を誘発する抗原標的型制約CD3係合構築物の能力を図示する。

5. 解離腫瘍細胞の死滅
フローサイトメトリーによって腫瘍細胞（CD45-/EpCAM+）および腫瘍浸潤免疫細胞（CD45+/EpCAM-）を同定するため、卵巣がん解離腫瘍細胞試料（Conversant）を、Zombie Red、ならびにフルオロフォアがコンジュゲートされた抗CD45抗体および抗EpCAM抗体によって染色した。未染色の細胞を96穴組織培養プレートに播種し、代表的なFRα制約CD3係合構築物および組換えヒトIL-2を、20nMおよび10ng/mLの最終濃度で添加した。37℃で6日間培養した後、上清アリコートを、サンドイッチELISA（前記）によるIFNγ含量の分析のために収集し、非接着性細胞を含有している残りの上清を除去した。残存している懸濁細胞および砕片を除去するため、接着性細胞をPBSで静かに洗浄し、培地を細胞に添加し、腫瘍細胞コンフルエンシーを可視化するため、アッセイウェルをIncuCyte ZOOM系を使用して画像化した。等しい体積のCellTiter-Glo生死判別試薬を試料ウェルに添加し、発光をSpectraMax Lマイクロプレートリーダを使用して測定した。図38A～38Dは、腫瘍試料に以前に浸潤したT細胞を活性化し、細胞傷害および腫瘍細胞排除を媒介する、抗原標的型制約CD3係合構築物の能力を図示する。

他の態様
本発明を詳細な説明と共に記載したが、上記の説明は、本開示を例示するためのものであって、その範囲を限定するためのものではなく、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される。他の局面、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

配列表

配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> INHIBRX INC.
<120> MULTISPECIFIC POLYPEPTIDE CONSTRUCTS HAVING CONSTRAINED CD3
BINDING AND METHODS OF USING THE SAME
<150> US 62/484,217
<151> 2017-04-11
<160> 190
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG1 Fc
<400> 1
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
115 120 125
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215

<210> 2
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG2 Fc
<400> 2
Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35 40 45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
50 55 60
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
65 70 75 80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
85 90 95
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
100 105 110
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
115 120 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
180 185 190
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195 200 205
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215

<210> 3
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG2 Fc
<400> 3
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215

<210> 4
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG3 Fc
<400> 4
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215

<210> 5
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG4 Fc
<400> 5
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215

<210> 6
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG4 Fc
<400> 6
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215

<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 7
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10

<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5

<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 9
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
1 5 10

<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> (GGS)2
<400> 10
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5

<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> (GGS)3
<400> 11
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5

<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> (GGS)4
<400> 12
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10

<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> (GGS)5
<400> 13
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15

<210> 14
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 Hv
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125

<210> 15
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 Lv
<400> 15
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH CDR1
<400> 16
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5

<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH CDR2
<400> 17
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp

<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH CDR3
<400> 18
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10

<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL CDR1
<400> 19
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10

<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL CDR2
<400> 20
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5

<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL CDR3
<400> 21
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5

<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Granzyme B substrate
<400> 22
Leu Glu Ala Asp
1

<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Granzyme B substrate
<400> 23
Arg Gln Ala Arg
1

<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP substrate
<400> 24
Pro Ala Gly Leu
1

<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 25
Thr Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Pro Ala Gly Leu Gly Arg Gln Ala
1 5 10 15
Arg Val Gly

<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 26
Thr Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Gly Pro Ala
1 5 10 15
Gly Leu Gly

<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 27
Thr Gly Ser Pro Ala Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg
1 5 10 15
Val Gly Ser

<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 28
Thr Gly Pro Ala Gly Leu Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala
1 5 10 15
Arg Val Gly

<210> 29
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 29
Thr Gly Arg Gln Ala Arg Val Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Pro Ala
1 5 10 15
Gly Leu Gly

<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 30
Thr Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Gly Pro Ala Gly Leu Glu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 31
Thr Gly Pro Ala Gly Leu Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Gly Leu Glu
1 5 10 15
Ala Asp Gly Ser
20

<210> 32
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH1
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 33
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH2
<400> 33
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 34
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH3
<400> 34
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH4
<400> 35
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 36
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH5
<400> 36
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 37
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH6
<400> 37
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 38
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH7
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 39
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH8
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120

<210> 40
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH9
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 41
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH10
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 42
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH11
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 43
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH12
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120 125

<210> 44
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH13
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120 125

<210> 45
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH14
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Cys Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120 125

<210> 46
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH15
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 47
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH16
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 48
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH17
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 49
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH18
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 50
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH19
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 51
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH20
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 52
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH21
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 53
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH22
<400> 53
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 54
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH23
<400> 54
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 55
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH24
<400> 55
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 56
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH25
<400> 56
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 57
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH26
<400> 57
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 58
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH27
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 59
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH28
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120

<210> 60
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH29
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 61
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH30
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 62
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VH31
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 63
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL1
<400> 63
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 64
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL2
<400> 64
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

<210> 65
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL3
<400> 65
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 66
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL4
<400> 66
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 67
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL5
<400> 67
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 68
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL6
<400> 68
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 69
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL7
<400> 69
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 70
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL8
<400> 70
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 71
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL9
<400> 71
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

<210> 72
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL10
<400> 72
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

<210> 73
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL11
<400> 73
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Cys Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

<210> 74
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL12
<400> 74
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 75
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL13
<400> 75
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

<210> 76
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL14
<400> 76
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 77
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL15
<400> 77
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 78
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL16
<400> 78
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 79
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL17
<400> 79
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 80
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL18
<400> 80
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 81
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD3 VL19
<400> 81
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

<210> 82
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Knob Fc
<400> 82
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Thr
225

<210> 83
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 83
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Arg Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Thr
225

<210> 84
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Knob Fc
<400> 84
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Thr
210 215 220

<210> 85
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 85
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Arg Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Thr
210 215 220

<210> 86
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Knob Fc
<400> 86
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225

<210> 87
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 87
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Arg Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225

<210> 88
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Knob Fc
<400> 88
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220

<210> 89
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 89
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Arg Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220

<210> 90
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 90
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Thr
225

<210> 91
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 91
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Thr
210 215 220

<210> 92
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 92
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225

<210> 93
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 93
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220

<210> 94
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Knob Fc
<400> 94
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Thr
225

<210> 95
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Knob Fc
<400> 95
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Thr
210 215 220

<210> 96
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Knob Fc
<400> 96
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225

<210> 97
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Knob Fc
<400> 97
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220

<210> 98
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 98
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Thr
225

<210> 99
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 99
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Thr
210 215 220

<210> 100
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 100
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225

<210> 101
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hole Fc
<400> 101
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Val His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220

<210> 102
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide Linker
<400> 102
Pro Gly Gly Gly Gly
1 5

<210> 103
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide Linker
<400> 103
Gly Gly Gly Gly
1

<210> 104
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 104
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Leu Glu Pro Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg
1 5 10 15
Val Gly

<210> 105
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 105
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Ile Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 106
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 106
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Leu Glu Ala Asp Thr Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 107
Gly Ser Ile Glu Pro Asp Ile Gly Ser
1 5

<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 108
Gly Ser Leu Glu Ala Asp Thr Gly Ser
1 5

<210> 109
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 109
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 110
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Val Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 111
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 111
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 112
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 112
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Thr Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 113
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 113
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Pro Asp Gly Ser Gly Ser
1 5 10

<210> 114
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 114
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg
1 5 10 15
Val Gly

<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 115
Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

<210> 116
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 116
Gly Ser Ser Ala Gly Ser Glu Ala Gly Gly Ser Gly Gln Ala Gly Val
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 117
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 117
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Leu Glu Ala Glu Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 118
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 118
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Pro Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 119
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 119
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 120
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR alpha sdAb
<400> 120
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Lys Gly Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Leu Val Pro Ala Cys Thr Tyr Ser Asn Gly Arg Gly Pro
100 105 110
Leu Asp Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Lys
115 120 125
Pro

<210> 121
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR alpha sdAb
<400> 121
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asp
20 25 30
Ala Thr Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ile Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Pro Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ile Thr Arg Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115

<210> 122
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR alpha sdAb
<400> 122
Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu
1 5 10 15
Thr Phe Gly Val Val Phe Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
20 25 30
Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Val Thr Gly Thr Asp Thr Val Asp
35 40 45
Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Phe Ala
50 55 60
Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
65 70 75 80
Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
85 90 95
Val Thr Val Lys Pro
100

<210> 123
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cMET sdAb
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Leu Cys Ile Asp Ala Ser Asp Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Pro Ile Gly Leu Ser Ser Ser Cys Leu Leu Glu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro
115 120 125

<210> 124
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B7H3 scFv
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg
180 185 190
Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys
245

<210> 125
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD20 scFv
<400> 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu
130 135 140
Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
145 150 155 160
Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr
165 170 175
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser
180 185 190
Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245

<210> 126
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLL3 scFv
<400> 126
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Ala Val Thr Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Arg Val Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys

<210> 127
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B7H3 Fd
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys
225

<210> 128
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B7H3 LC
<400> 128
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

<210> 129
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5T4 Fd
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Gln Trp Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys
225

<210> 130
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5T4 LC
<400> 130
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Ile Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Leu Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

<210> 131
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpNMB Fd
<400> 131
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg His His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Thr Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Tyr Asn Trp Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220

<210> 132
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpNMB LC
<400> 132
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Asn
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

<210> 133
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLL3 Fd
<400> 133
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Ser
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ile Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Gly Asp Ser Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220

<210> 134
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLL3 LC
<400> 134
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

<210> 135
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 135
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 136
Ile Glu Pro Asp Ile
1 5

<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 137
Leu Glu Ala Asp Thr
1 5

<210> 138
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 138
Ile Glu Pro Asp Gly
1 5

<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 139
Ile Glu Pro Asp Val
1 5

<210> 140
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 140
Ile Glu Pro Asp Ser
1 5

<210> 141
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 141
Ile Glu Pro Asp Thr
1 5

<210> 142
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 142
Leu Glu Pro Asp
1

<210> 143
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 143
Leu Glu Ala Glu
1

<210> 144
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 144
Ile Glu Pro Asp Pro
1 5

<210> 145
<211> 274
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Polypeptide Chain of B7-H3 x CD3 Bispecific DART-A Diabody
<400> 145
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile
165 170 175
Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly
210 215 220
Ser Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala
245 250 255
Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
260 265 270
Lys Glu

<210> 146
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Third Polypeptide Chain of B7-H3 x CD3 Bispecific DART-A Diabody
<400> 146
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225

<210> 147
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 147
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 148
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 148
Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Glu Pro Asp Ile Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser

<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 149
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

<210> 150
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker consensus
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1= I, L, Y, M, F, V, or A
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X2 = A, G, S, V, E, D, Q, N, or Y
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X3 = H, P, A, V, G, S, or T
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X4 = D or E
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X5 = I, L, Y, M, F, V, T, S, G or A
<400> 150
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5

<210> 151
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker consensus
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1 = I or L
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X3 = P or A
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X5 = I, V, T, S, or G
<400> 151
Xaa Glu Xaa Asp Xaa
1 5

<210> 152
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 152
Leu Glu Pro Asp Gly
1 5

<210> 153
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 153
Leu Glu Ala Asp Gly
1 5

<210> 154
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker consensus
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1 = any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X5 = A or V
<400> 154
Xaa Gln Ala Arg Xaa
1 5

<210> 155
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker consensus
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> X5 = A or V
<400> 155
Arg Gln Ala Arg Xaa
1 5

<210> 156
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 156
Arg Gln Ala Arg Val
1 5

<210> 157
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker consensus
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> X1 = P, V or A
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X2 = Q or D
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X3 = A or N
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X4 = L, I or M
<400> 157
Xaa Xaa Xaa Xaa
1

<210> 158
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker consensus
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X2 = Q or D
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> X3 = A or N
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X4 = L or I
<400> 158
Pro Xaa Xaa Xaa
1

<210> 159
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 159
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20

<210> 160
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 160
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro

<210> 161
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2A
<400> 161
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20

<210> 162
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2A
<400> 162
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20

<210> 163
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 163
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro

<210> 164
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 164
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20

<210> 165
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 165
ggatctggag caacaaactt ctcactactc aaacaagcag gtgacgtgga ggagaatccc 60
ggaccc 66

<210> 166
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 166
Gly Ser Pro Ala Gly Leu Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val
1 5 10 15
Gly Ser

<210> 167
<211> 122
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> anti-5T4 VH
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(97)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Xaa Cys Val Arg Gln Trp Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 168
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> anti-5T4 VL
<400> 168
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Ile Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Leu Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

<210> 169
<211> 504
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Polypeptide Chain of B7-H3 x CD3 Bispecific DART-A Diabody
<400> 169
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala
245 250 255
Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
260 265 270
Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
275 280 285
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
290 295 300
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
305 310 315 320
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
325 330 335
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
355 360 365
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
370 375 380
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
385 390 395 400
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
420 425 430
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
435 440 445
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
450 455 460
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
465 470 475 480
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500

<210> 170
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 170
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

<210> 171
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (4)..(6)
<223> repeated 0 to 10 times
<400> 171
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5

<210> 172
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(6)
<223> repeated 1 to 4 times
<400> 172
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

<210> 173
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> Repeated 1 to 5 times
<400> 173
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

<210> 174
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(1)
<223> Repeated 1 to 5 times
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> X2= A, V, L, I, M,F, W, P, G, S, T, C, Y, N,Q, K, R, H, D, or E
<220>
<221> REPEAT
<222> (3)..(3)
<223> Repeated 1 to 5 times
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X4 = A, V, L, I, M,F, W, P, G, S, T, C, Y, N,Q, K, R, H, D, or E
<220>
<221> REPEAT
<222> (5)..(5)
<223> Repeated 1 to 5 times
<400> 174
Gly Xaa Gly Xaa Gly
1 5

<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> X4 = A, V, L, I, M,F, W, P, G, S, T, C, Y, N,Q, K, R, H, D, or E
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> X8 = A, V, L, I, M,F, W, P, G, S, T, C, Y, N,Q, K, R, H, D, or E
<400> 175
Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly
1 5 10

<210> 176
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 176
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
1 5 10

<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 177
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10

<210> 178
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> Repeated 2 to 20 times
<400> 178
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5

<210> 179
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (3)..(4)
<223> Repeated 2 to 20 times
<400> 179
Ala Ser Ala Pro Gly Thr
1 5

<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (3)..(7)
<223> Repeated 2 to 20 times
<400> 180
Ala Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly Thr
1 5

<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> Repeated 2 to 20 times
<400> 181
Gly Gly Gly Gly Ala
1 5

<210> 182
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> Repeated 2 to 20 times
<400> 182
Pro Gly Gly Gly Ser
1 5

<210> 183
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> Repeated 2 to 20 times
<400> 183
Ala Gly Gly Gly Ser
1 5

<210> 184
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (4)..(17)
<223> Repeated 2 to 20 times
<400> 184
Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Gly Gly Ser
20

<210> 185
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> Repeated 1 to 9 times
<400> 185
Ser Ser Ser Ser Gly
1 5

<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 186
Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ala
1 5

<210> 187
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 187
Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly
1 5

<210> 188
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLL3 scFv
<400> 188
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Ala Val Thr Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Arg Val Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys

<210> 189
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD20 VH
<400> 189
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115

<210> 190
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD20 VL
<400> 190
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val
115

Claims

免疫グロブリンFc領域を含む第1の成分およびCD3結合領域を含む第2の成分を含む、多重特異性ポリペプチド構築物であって、
第1および第2の成分がリンカーによってカップリングされており、Fc領域がCD3結合領域のN末端側に位置付けられており；
第1および第2の成分の一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む、
多重特異性ポリペプチド構築物。
CD3結合領域がCD3（CD3ε）に結合する、請求項1記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗原結合ドメインが、多重特異性ポリペプチド構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられ、かつ/またはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、請求項1または請求項2記載の多重特異性構築物。
第1の成分が第1の抗原結合ドメインを含み、第2の成分が第2の抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインの各々が腫瘍関連抗原（TAA）に結合する、請求項1～3のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
第1の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、請求項4記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
N末端からC末端へ順に、
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第1の抗原結合ドメイン；
免疫グロブリンFc領域；
リンカー；
CD3（CD3ε）に結合するCD3結合領域；および
腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第2の抗原結合ドメイン
を含む、多重特異性ポリペプチド構築物。
Fc領域が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、もしくはヒトIgG4のFc領域であるか、またはそれらの免疫活性断片である、請求項1～6のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
Fc領域が、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列、もしくはSEQ ID NO:1との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列、もしくはSEQ ID NO:2との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列、もしくはSEQ ID NO:4との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；または
SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列、もしくはSEQ ID NO:5との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド
を含む、請求項1～7のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
Fc領域がヘテロ二量体Fc領域である、請求項1～8のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
ヘテロ二量体Fc領域の一方または両方のFcポリペプチドが、ホモ二量体Fc領域のポリペプチドと比較して、任意で、SEQ ID NO:1に示されるFcポリペプチドまたはその免疫活性断片と比較して、ヘテロ二量体化を促進するための少なくとも1個の修飾を含む、請求項9記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
ヘテロ二量体FcのFcポリペプチドの各々が、ノブイントゥホール修飾を含むか、またはポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異を含む、請求項10記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
ヘテロ二量体Fcの第1のFcポリペプチドが、Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val、およびそれらの組み合わせより選択される修飾を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のFcポリペプチドが修飾T366Wを含み、任意で、第1および第2のFcポリペプチドが非システイン残基のシステイン残基への修飾をさらに含み、第1のポリペプチドの修飾が位置Ser354およびY349の一方にあり、第2のFcポリペプチドの修飾が位置Ser354およびY349の他方にある、請求項10および請求項11記載の多重特異性融合ポリペプチド。
アミノ酸修飾がポリペプチドの静電的相補性を増加させるための電荷変異である、請求項11記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
Fc領域が、修飾Ile253ArgまたはHis435Argを含むポリペプチドを含む、請求項1～13のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
Fc領域が、FcRn結合を増強するための少なくとも1個の修飾を含むポリペプチドを含む、請求項1～14のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
修飾が、Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にある、請求項15記載の多重特異性融合ポリペプチド。
ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドが、SEQ ID NO:82、86、94、または96のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドが、SEQ ID NO:83、87、90、92、98、または100のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項9～16のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
Fc領域が、
エフェクター機能を低下させかつ/またはFcγ受容体もしくはC1qより選択されるエフェクター分子との結合を低下させる少なくとも1個のアミノ酸修飾を含むポリペプチド
を含む、請求項1～17のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
1つまたは複数のアミノ酸修飾が、Glu233、Leu234、またはLeu235のうちの1つまたは複数の欠失である、請求項18記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
ヘテロ二量体Fcの第1のポリペプチドが、SEQ ID NO:84、88、95、または97のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ヘテロ二量体Fcの第2のポリペプチドが、SEQ ID NO:85、89、91、93、99、または101のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項9～16、18、および19のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
CD3結合領域が抗CD3抗体または抗原結合断片である、請求項1～20のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗CD3抗体または抗原結合断片が、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む、請求項21記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
CD3結合領域が1価である、請求項1～22のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗CD3抗体または抗原結合断片が単鎖抗体ではなく、任意で、単鎖可変断片（scFv）ではない、請求項21～23のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
Fcがヘテロ二量体Fcであり、抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLがヘテロ二量体Fcの反対のポリペプチドに連結されている、請求項22～24のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗原結合ドメインのうちの少なくとも1個がそのTAAに結合しない限り、任意で、抗原結合ドメインのうちの少なくとも2個がそのTAAに結合しない限り、CD3結合領域が、CD3に結合または係合することができないかまたは実質的にできない、請求項1～25のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
リンカーがポリペプチドリンカーである、請求項1～26のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
リンカーが切断可能リンカーである、請求項1～27のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
ヘテロ二量体Fc領域を含む第1の成分と、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む抗CD3抗体または抗原結合断片を含む第2の成分とを含む、多重特異性ポリペプチド構築物であって、
抗CD3抗体または抗原結合断片を構成するVHおよびVLがヘテロ二量体Fcの反対のポリペプチドに連結されており；
第1および第2の成分が切断可能リンカーによってカップリングされており、ヘテロ二量体Fc領域が抗CD3抗体のN末端側に位置付けられており；かつ
第1および第2の成分の一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する抗原結合ドメインを含む、
多重特異性ポリペプチド構築物。
多重特異性ポリペプチド構築物が未切断状態にある時、切断状態と比較して、CD3結合領域のCD3との結合が実質的に低下する、請求項28または請求項29記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
切断可能リンカーが、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、請求項28～30のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
免疫エフェクター細胞によって、腫瘍によって、または腫瘍微小環境に存在する細胞によって、プロテアーゼが産生される、請求項31記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
プロテアーゼが、マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせより選択される、請求項31または請求項32記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
プロテアーゼがグランザイムBである、請求項33記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
切断可能リンカーが、
一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:150）（P4はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、またはAであり；P3はアミノ酸A、G、S、V、E、D、Q、N、またはYであり；P2はアミノ酸H、P、A、V、G、S、またはTであり；P1はアミノ酸DまたはEであり；P1'はアミノ酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G、またはAである）のアミノ酸配列、
任意で、一般式P4 P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:151）（P4はアミノ酸IまたはLであり；P3はアミノ酸Eであり；P2はアミノ酸PまたはAであり；P1はアミノ酸Dであり；P1'はアミノ酸I、V、T、S、またはGである）のアミノ酸配列
を含む、請求項28～34のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
切断可能リンカーが、アミノ酸配列IEPDI（SEQ ID NO:136）、LEPDG（SEQ ID NO:152）、LEADT（SEQ ID NO:137）、IEPDG（SEQ ID NO:138）、IEPDV（SEQ ID NO:139）、IEPDS（SEQ ID NO:140）、IEPDT（SEQ ID NO:141）、またはLEADG（SEQ ID NO:153）を含む、請求項28～35のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
切断可能リンカーが、SEQ ID NO:22、105～112、136～141、148、150～153からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項28～36のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
プロテアーゼがマトリプターゼである、請求項33記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
切断可能リンカーが、
配列P4QAR↓(A/V)（SEQ ID NO:154）（P4は任意のアミノ酸である）、
任意で、配列RQAR(A/V)（SEQ ID NO:155）または配列RQARV（SEQ ID NO:156）
を含む、請求項28～38のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
切断可能リンカーが、SEQ ID NO:23、154～156からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項28～39のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
プロテアーゼが、MMP、任意でMMP-2である、請求項33記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
切断可能リンカーが、
一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:157）（P3はP、V、またはAであり；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はL、I、またはMである）、
任意で、一般式P3 P2 P1↓P1'（SEQ ID NO:158）（P；P2はQまたはDであり；P1はAまたはNであり；P1'はLまたはIである）、
任意で、配列PAGL（SEQ ID NO:24）
を含む、請求項28～41のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
切断可能リンカーが、SEQ ID NO:22～31、104～114、117～118、136～144、148、150～158からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項28～42のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
（i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む、第1のポリペプチド；ならびに
（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む、第2のポリペプチド
を少なくとも含み、
第1および第2のポリペプチドの一方または両方が、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する少なくとも1個の抗原結合ドメインを含む、
請求項25～43のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
TAAに結合する1つまたは複数の抗原結合ドメインが、TAAとの1価、2価、3価、または4価の結合をもたらす、請求項1～44のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
少なくとも1個の抗原結合ドメインが、多重特異性ポリペプチド構築物の第1もしくは第2ポリペプチドの一方のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、かつ/もしくはCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられているか；または
少なくとも1個の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のFc領域に対してアミノ末端側に位置付けられており、第2の抗原結合ドメインが多重特異性構築物のCD3結合領域に対してカルボキシ末端側に位置付けられている、
請求項44または請求項45記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片、scFv、scAb、dAb、シングルドメイン重鎖抗体、およびシングルドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される抗体またはその抗原結合断片である、請求項1～46のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗体またはその抗原結合断片が、Fv、scFv、Fab、シングルドメイン抗体（sdAb）、V_NAR、またはV_HHである、請求項47記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗体または抗原結合断片がFabであり、多重特異性ポリペプチド構築物が、
（i）ヘテロ二量体Fc領域の第1のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVHドメインを含む、第1のポリペプチド；
（ii）ヘテロ二量体Fc領域の第2のFcポリペプチド、リンカー、および抗CD3抗体または抗原結合断片のVLドメインを含む、第2のポリペプチド、ならびに
（iii）腫瘍関連抗原に結合するFab抗体断片のVH-CH1（Fd）またはVL-CLを含む、第3のポリペプチド
を含み、
第1および/または第2のポリペプチドがFab抗体断片のVH-CH1(Fd)またはVL-CLの他方をさらに含む、
請求項47または請求項48記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
第1もしくは第2のポリペプチドの一方のみがFab抗体断片のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLの他方を含むか；または
第1もしくは第2のポリペプチドの両方がFab抗体断片のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLの他方を含む、
請求項49記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLの他方が、多重特異性ポリペプチド構築物の第1もしくは第2のポリペプチドの一方のFc領域のアミノにおよび/もしくはCD3結合領域のカルボキシに位置付けられているか；または
Fab抗体断片のVH-CH1（Fd）もしくはVL-CLの他方が、第1のポリペプチドもしくは第2のポリペプチドのFc領域のアミノにおよび第1もしくは第2のポリペプチドの他方のCD3結合領域のカルボキシに位置付けられている、
請求項49または請求項50記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗原結合ドメインが、または抗原結合ドメインの各々が独立に、1-92-LFA-3、5T4、α4インテグリン、αVインテグリン、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、AGR2、抗ルイスY、アペリンJ受容体、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補体、C-242、CA9、CA19-9、（ルイスa）、炭酸脱水酵素9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、（IL-2RG）、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5（CEA）、CEACAM6（NCA-90）、クローディン3、クローディン4、cMet、コラーゲン、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、エンドセリンB受容体（ETBR）、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSVのFタンパク質、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受容体α（FRα）、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受容体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、ヒアルロニダーゼ、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受容体（FceRI）、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R（wsx1）、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、インスリン受容体、ジャギド（Jagged）リガンド、ジャギド1、ジャギド2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、ルイスX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、メソテリン、MRP4、MUC1、ムチン16（MUC16、CA-125）、Na/K ATPアーゼ、NGF、ニカストリン（Nicastrin）、ノッチ受容体、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、ホスファチジルセリン、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、スフィンゴシン-1-リン酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2、およびWISP-3より選択される腫瘍抗原に結合する、請求項1～51のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
少なくとも第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを含み、
第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが同一のTAAに結合する、
請求項1～52のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
少なくとも第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインを含み、
第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが異なるTAAに結合する、
請求項1～53のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
第1の抗原結合ドメインとFc領域との間の第1の連結ペプチド（LP1）およびCD3結合領域と第2の抗原結合ドメインとの間の第2の連結ペプチド（LP2）を含み、
N末端からC末端へ以下の構造的配置：第1の抗原結合ドメイン - LP1 - Fc領域 - リンカー - CD3結合領域 - LP2 - 第2の抗原結合ドメインを有する、
請求項6～54のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗CD3抗体または抗原結合断片がFv抗体断片である、請求項21～55のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
Fv抗体断片がジスルフィドによって安定化された抗CD3結合Fv断片（dsFv）を含む、請求項56記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗CD3抗体または抗原結合断片が、
アミノ酸配列TYAMN（SEQ ID NO:16）を含むVH CDR1；
アミノ酸配列

を含むVH CD2；
アミノ酸配列

を含むVH CDR3；
アミノ酸配列

を含むVL CDR1；
アミノ酸配列GTNKRAP（SEQ ID NO:20）を含むVL CDR2；および
アミノ酸配列ALWYSNLWV（SEQ ID NO:21）を含むVL CDR3
を含む、請求項21～57のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗CD3 dsFvが、
SEQ ID NO:14および32～62のいずれかのアミノ酸配列またはSEQ ID NO:14および32～62のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVH；ならびに
SEQ ID NO:15および63～81のいずれかのアミノ酸配列またはSEQ ID NO:14および32～62のいずれかとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す配列を有するVL
を含む、請求項57または請求項58記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
抗CD3 dsFvが、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列；またはSEQ ID NO:44のアミノ酸配列およびSEQ ID NO:72のアミノ酸配列を含む、請求項57～59のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
多重特異性ポリペプチド構築物が薬剤にコンジュゲートされており、任意で、薬剤が、治療剤、抗腫瘍剤、毒素もしくはその断片、検出可能モエティ、または診断剤である、請求項1～60のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物。
請求項1～61のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
請求項1～61のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物のいずれかのポリペプチド鎖をコードする、ポリヌクレオチド。
請求項1～61のいずれか一項記載の多重特異性構築物の第1のポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、該多重特異性構築物の第2のポリペプチドをコードする第2の核酸配列とを含む、ポリヌクレオチドであって、
第1および第2の核酸配列が、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって、分離されている、
ポリヌクレオチド。
前記多重特異性ポリペプチド構築物が第3のポリペプチド鎖を含み、
前記ポリヌクレオチドが、該多重特異性構築物の第3のポリペプチドをコードする第3の核酸をさらに含み、
任意で、第3の核酸が、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸によって、第1および/または第2のポリペプチドから分離されており、かつ/あるいは
第3の核酸配列が第1および/または第2の核酸配列と同一のプロモーターに機能的に連結されている、
請求項64記載のポリヌクレオチド。
請求項62～65のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
請求項62～65のいずれか一項記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは請求項記載のベクターを含む、細胞。
請求項62～65のいずれか一項記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは請求項66記載のベクターを細胞へ導入する工程、および
多重特異性ポリペプチド構築物が産生される条件下で該細胞を培養する工程
を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法。
多重特異性ポリペプチドが細胞によって産生される条件の下で請求項67記載の細胞を培養する工程を含む、多重特異性ポリペプチド構築物を作製する方法。
請求項68または請求項69記載の方法によって作製された、多重特異性ポリペプチド構築物。
請求項1～61および請求項70のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
標的細胞およびT細胞を、請求項1～61および請求項70のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチド構築物または請求項71記載の薬学的組成物と接触させる工程を含む、免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法であって、標的細胞が、多重特異性ポリペプチド構築物によって認識される腫瘍関連抗原を発現している、方法。
標的細胞が腫瘍関連抗原（TAA）を発現している腫瘍細胞である、請求項72記載の方法。
多重特異性ポリペプチド構築物が、プロテアーゼの基質として機能する切断可能リンカーを含み、免疫応答の誘導または刺激がプロテアーゼの存在下で増加する、請求項72または請求項73記載の方法。
プロテアーゼが、マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、グランザイムB、およびそれらの組み合わせより選択される、請求項72～74のいずれか一項記載の方法。
接触が、エクスビボで、インビトロで、または対象においてインビボで実施される、請求項72～75のいずれか一項記載の方法。
請求項1～61および請求項70のいずれか一項記載の多重特異性コンジュゲートまたは請求項80記載の薬学的組成物を治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における免疫応答を刺激するかまたは誘導する方法。
腫瘍またはがんに対する免疫応答が増加する、請求項77記載の方法。
対象における疾患または状態を処置する、請求項72～78のいずれか一項記載の方法。
請求項1～61および70のいずれか一項記載の多重特異性コンジュゲートまたは請求項71記載の薬学的組成物を治療的に有効な量で、それを必要とする対象へ投与する工程を含む、対象における疾患または状態を処置する方法。
疾患または状態が腫瘍またはがんである、請求項79または請求項80記載の方法。
対象がヒトである、請求項76～81のいずれか一項記載の方法。