JP2023002680A - パラミクソウイルスおよび/またはニューモウイルスのfタンパク質を表示する自己アセンブリするタンパク質ナノ構造およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年4月4日提出の米国特許仮出願第62/481331号(その全体が本明細書中で参考として援用される)の優先権を主張する。
タンパク質の高秩序の対称超分子複合体への分子自己アセンブリおよび共アセンブリは、原子スケールで物質をパターン形成する的確かつ強力な手段である。近年、バイオマテリアル、特に、核酸から構成される自己組織化バイオマテリアルの開発が進んでいる。DNAは、例えば、ナノスケールの形状およびパターン、分子コンテナ、および三次元の巨視的結晶を作製するために使用されている。自己アセンブリするタンパク質の設計方法の進歩についてはやや遅れているものの、タンパク質の機能性および物理的性質は、高度な機能性材料を開発するための基本単位として魅力的である。
1つの態様では、ナノ構造であって、
(a)複数の第1のアセンブリであって、各々の第1のアセンブリが複数の同一の第1のポリペプチドを含む、複数の第1のアセンブリ;
(b)複数の第2のアセンブリであって、各々の第2のアセンブリが複数の同一の第2のポリペプチドを含み、第2のポリペプチドが第1のポリペプチドと異なる、複数の第2のアセンブリ;
を含み、
複数の第1のアセンブリが複数の第2のアセンブリと非共有結合的に相互作用してナノ構造を形成し;
ナノ構造が、1つまたは複数のパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントの複数のコピーをナノ構造の外面に表示している、ナノ構造を提供する。
(b)第2のポリペプチドが、配列番号1~51からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む。
(a)第1のポリペプチドは、T33-31A(配列番号51)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含み、第2のポリペプチドは、T33-09B/T33-31B(配列番号44)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含むか;
(b)第1のポリペプチドは、T33-15B(配列番号46)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含み、第2のポリペプチドは、T33-15A(配列番号45)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含むか;
(c)第1のポリペプチドは、I53-50A(配列番号7)、I53-50A.1(配列番号29)、I53-50A.1NegT2(配列番号30)、およびI53-50A.1PosT1(配列番号31)からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有し、第2のポリペプチドは、I53-50B(配列番号8)、I53-50B.1(配列番号32)、I53-50B.1NegT2(配列番号33)、およびI53-50B.4PosT1(配列番号34)からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するか;あるいは
(d)第1のポリペプチドは、I32-28A(配列番号21)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含み、第2のポリペプチドは、I32-28B(配列番号22)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む。
(a)各々の第1のポリペプチドが、DS-Cav1-foldon-T33-31A(配列番号69)またはDS-Cav1-T33-31A(配列番号70)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するとき、各々の第2のポリペプチドは、T33-31B(配列番号44)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するか;
(b)各々の第1のポリペプチドが、DS-Cav1-foldon-T33-15B(配列番号71)またはDS-Cav1-T33-15B(配列番号72)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するとき、各々の第2のポリペプチドは、T33-15A(配列番号45)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するか;
(c)各々の第1のポリペプチドが、DS-Cav1-foldon-I53-50A(配列番号73)またはDS-Cav1-I53-50A(配列番号74)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するとき、各々の第2のポリペプチドは、I53-50B(配列番号8)、I53-50B.1(配列番号32)、I53-50B.1NegT2(配列番号33)、またはI53-50B.4PosT1(配列番号34)からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するか;あるいは
(d)各々の第1のポリペプチドが、DS-Cav1-I32-28A(配列番号75)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するとき、各々の第2のポリペプチドは、I32-28Bのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する。
本発明の前述の態様およびそれに伴う利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによってより深く理解されるようになるにつれて、より容易に認識されるようになるであろう。
引用された全ての参考文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。本出願内で、別段に記述しない限りは、利用した技術を、以下などのいくつかの周知の参考文献のいずれかに見出すことができる:Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrookら,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Gene Expression Technology(Methods in Enzymology,Vol.185,edited by D.Goeddel,1991. Academic Press,San Diego,CA)、“Guide to Protein Purification” in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.);PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innisら.1990.Academic Press,San Diego,CA)、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique,2nd Ed.(R.I.Freshney.1987. Liss,Inc.New York,NY)、Gene Transfer and Expression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)、およびAmbion 1998 Catalog(Ambion,Austin,TX)。
(a)複数の第1のアセンブリであって、各々の第1のアセンブリが複数の同一の第1のポリペプチドを含む、複数の第1のアセンブリ;
(b)複数の第2のアセンブリであって、各々の第2のアセンブリが複数の同一の第2のポリペプチドを含み、第2のポリペプチドが第1のポリペプチドと異なる、複数の第2のアセンブリ;
を含み、
複数の第1のアセンブリが複数の第2のアセンブリと非共有結合的に相互作用してナノ構造を形成し;
ナノ構造が、1つまたは複数のパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントの複数のコピーをナノ構造の外面に表示している、ナノ構造を提供する。
(M)TKKVGIVDTTFARVDMASAAILTLKMESPNIKIIRKTVPGIKDLPVACKKLLEEEGCDIVMALGMPGK(A/K)EKDKVCAHEASLGLMLAQLMTNKHIIEVFVHEDEAKDDAELKILAARRAIEHALNVYYLLFKPEYLTRMAGKGLRQGFEDAGPARE
I53-40B属(配列番号36)
(M)(S/D)(T/D)INNQLK(A/R)LKVIPVIAIDNAEDIIPLGKVLAENGLPAAEITFRSSAAVKAIMLLRSAQPEMLIGAGTILNGVQALAAKEAGA(T/D)FVVSPGFNPNTVRACQIIGIDIVPGVNNPSTVE(A/Q)ALEMGLTTLKFFPAEASGGISMVKSLVGPYGDIRLMPTGGITP(S/D)NIDNYLAIPQVLACGGTWMVDKKLV(T/R)NGEWDEIARLTREIVEQVNP
I53-47A属(配列番号37)
(M)PIFTLNTNIKA(T/D)DVPSDFLSLTSRLVGLILS(K/E)PGSYVAVHINTDQQLSFGGSTNPAAFGTLMSIGGIEP(S/D)KN(R/E)DHSAVLFDHLNAMLGIPKNRMYIHFV(N/D)L(N/D)GDDVGWNGTTF
I53-47B属(配列番号38)
(M)NQHSHKD(Y/H)ETVRIAVVRARWHADIVDACVEAFEIAMAAIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVV(N/D)GGIY(R/D)HEFVASAVIDGMMNVQL(S/D)TGVPVLSAVLTPH(R/E)Y(R/E)DS(A/D)E(H/D)H(R/E)FFAAHFAVKGVEAARACIEIL(A/N)AREKIAA
I53-50A属(配列番号39)
(M)KMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGH(T/D)ILKLFPGEVVGP(Q/E)FV(K/E)AMKGPFPNVKFVPTGGV(N/D)LD(N/D)VC(E/K)WF(K/D)AGVLAVGVG(S/K/D)ALV(K/E)G(T/D/K)PDEVRE(K/D)AK(A/E/K)FV(E/K)(K/E)IRGCTE
I53-50B属(配列番号40)
(M)NQHSHKD(Y/H)ETVRIAVVRARWHAEIVDACVSAFEAAM(A/R)DIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVV(N/D)GGIY(R/D)HEFVASAVI(D/N)GMMNVQL(S/D/N)TGVPVLSAVLTPH(R/E/N)Y(R/D/E)(D/K)S(D/K)A(H/D)TLLFLALFAVKGMEAARACVEILAAREKIAA
T32-28A(配列番号41)
(M)GEVPIGDPKELNGMEIAAVYLQPIEMEPRGIDLAASLADIHLEADIHALKNNPNGFPEGFWMPYLTIAYALANADTGAIKTGTLMPMVADDGPHYGANIAMEKDKKGGFGVGTYALTFLISNPEKQGFGRHVDEETGVGKWFEPFVVTYFFKYTGTPK
T32-28B(配列番号42)
(M)SQAIGILELTSIAKGMELGDAMLKSANVDLLVSKTISPGKFLLMLGGDIGAIQQAIETGTSQAGEMLVDSLVLANIHPSVLPAISGLNSVDKRQAVGIVETWSVAACISAADLAVKGSNVTLVRVHMAFGIGGKCYMVVAGDVLDVAAAVATASLAAGAKGLLVYASIIPRPHEAMWRQMVEG
T33-09A(配列番号43)
(M)EEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYRWQGSVVSDHELLLLVKTTTHAFPKLKERVKALHPYTVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTG
T33-09B(配列番号44)
(M)VRGIRGAITVEEDTPAAILAATIELLLKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARLIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLNEAVRLRPDLESAQ
T33-15A(配列番号45)
(M)SKAKIGIVTVSDRASAGITADISGKAIILALNLYLTSEWEPIYQVIPDEQDVIETTLIKMADEQDCCLIVTTGGTGPAKRDVTPEATEAVCDRMMPGFGELMRAESLKEVPTAILSRQTAGLRGDSLIVNLPGDPASISDCLLAVFPAIPYCIDLMEGPYLECNEAMIKPFRPKAK
T33-15B(配列番号46)
(M)VRGIRGAITVNSDTPTSIIIATILLLEKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARQIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLSEAVRLRPDLESAQ
T33-21A(配列番号47)
(M)RITTKVGDKGSTRLFGGEEVWKDSPIIEANGTLDELTSFIGEAKHYVDEEMKGILEEIQNDIYKIMGEIGSKGKIEGISEERIAWLLKLILRYMEMVNLKSFVLPGGTLESAKLDVCRTIARRALRKVLTVTREFGIGAEAAAYLLALSDLLFLLARVIEIEKNKLKEVRS
T33-21B(配列番号48)
(M)PHLVIEATANLRLETSPGELLEQANKALFASGQFGEADIKSRFVTLEAYRQGTAAVERAYLHACLSILDGRDIATRTLLGASLCAVLAEAVAGGGEEGVQVSVEVREMERLSYAKRVVARQR
T33-28A(配列番号49)
(M)ESVNTSFLSPSLVTIRDFDNGQFAVLRIGRTGFPADKGDIDLCLDKMIGVRAAQIFLGDDTEDGFKGPHIRIRCVDIDDKHTYNAMVYVDLIVGTGASEVERETAEEEAKLALRVALQVDIADEHSCVTQFEMKLREELLSSDSFHPDKDEYYKDFL
T33-28B(配列番号50)
(M)PVIQTFVSTPLDHHKRLLLAIIYRIVTRVVLGKPEDLVMMTFHDSTPMHFFGSTDPVACVRVEALGGYGPSEPEKVTSIVTAAITAVCGIVADRIFVLYFSPLHCGWNGTNF
T33-31A(配列番号51)
(M)EEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYREEGSVVSDHELLLLVKTTTDAFPKLKERVKELHPYEVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTG
配列番号1および配列番号2(I53-34AおよびI53-34B);
配列番号3および配列番号4(I53-40AおよびI53-40B);
配列番号3および配列番号24(I53-40AおよびI53-40B.1);
配列番号23および配列番号4(I53-40A.1およびI53-40B);
配列番号35および配列番号36(I53-40A属およびI53-40B属);
配列番号5および配列番号6(I53-47AおよびI53-47B);
配列番号5および配列番号27(I53-47AおよびI53-47B.1);
配列番号5および配列番号28(I53-47AおよびI53-47B.1NegT2);
配列番号25および配列番号6(I53-47A.1およびI53-47B);
配列番号25および配列番号27(I53-47A.1およびI53-47B.1);
配列番号25および配列番号28(I53-47A.1およびI53-47B.1NegT2);
配列番号26および配列番号6(I53-47A.1NegT2およびI53-47B);
配列番号26および配列番号27(I53-47A.1NegT2およびI53-47B.1);
配列番号26および配列番号28(I53-47A.1NegT2およびI53-47B.1NegT2);
配列番号37および配列番号38(I53-47A属およびI53-47B属);
配列番号7および配列番号8(I53-50AおよびI53-50B);
配列番号7および配列番号32(I53-50AおよびI53-50B.1);
配列番号7および配列番号33(I53-50AおよびI53-50B.1NegT2);
配列番号7および配列番号34(I53-50AおよびI53-50B.4PosT1);
配列番号29および配列番号8(I53-50A.1およびI53-50B);
配列番号29および配列番号32(I53-50A.1およびI53-50B.1);
配列番号29および配列番号33(I53-50A.1およびI53-50B.1NegT2);
配列番号29および配列番号34(I53-50A.1およびI53-50B.4PosT1);
配列番号30および配列番号8(I53-50A.1NegT2およびI53-50B);
配列番号30および配列番号32(I53-50A.1NegT2およびI53-50B.1);
配列番号30および配列番号33(I53-50A.1NegT2およびI53-50B.1NegT2);
配列番号30および配列番号34(I53-50A.1NegT2およびI53-50B.4PosT1);
配列番号31および配列番号8(I53-50A.1PosT1およびI53-50B);
配列番号31および配列番号32(I53-50A.1PosT1およびI53-50B.1);
配列番号31および配列番号33(I53-50A.1PosT1およびI53-50B.1NegT2);
配列番号31および配列番号34(I53-50A.1PosT1およびI53-50B.4PosT1);
配列番号39および配列番号40(I53-50A属およびI53-50B属);
配列番号9および配列番号10(I53-51AおよびI53-51B);
配列番号11および配列番号12(I52-03AおよびI52-03B);
配列番号13および配列番号14(I52-32AおよびI52-32B);
配列番号15および配列番号16(I52-33AおよびI52-33B)
配列番号17および配列番号18(I32-06AおよびI32-06B);
配列番号19および配列番号20(I32-19AおよびI32-19B);
配列番号21および配列番号22(I32-28AおよびI32-28B);
配列番号23および配列番号24(I53-40A.1およびI53-40B.1);
配列番号41および配列番号42(T32-28AおよびT32-28B);
配列番号43および配列番号44(T33-09AおよびT33-09B);
配列番号45および配列番号46(T33-15AおよびT33-15B);
配列番号47および配列番号48(T33-21AおよびT33-21B);
配列番号49および配列番号50(T33-28AおよびT32-28B);ならびに
配列番号51および配列番号44(T33-31AおよびT33-09B(T33-31Bとも呼ばれる))から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
三量体パラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントを含む三量体アセンブリの1つの実施形態では、パラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントは、第1のポリペプチドに遺伝的に融合され、それにより三量体アセンブリに自己アセンブリする。三量体アセンブリは、第1のポリペプチドの3つのコピーを自己会合させて三量体基本単位を形成するように誘導するタンパク質-タンパク質界面を含む。第1のポリペプチドの各々のコピーは、第2のアセンブリドメイン上の相補的な表面が暴露した界面と相互作用する表面が暴露した界面をさらに含む。Kingら(Nature 510,103-108,2014)、Baleら(Science 353,389-394,2016)、および特許公開WO2014124301A1号およびUS20160122392A1号に記載のように、三量体アセンブリドメインと第2のアセンブリドメインとの間の相補的なタンパク質-タンパク質界面は、三量体アセンブリドメインの複数のコピーおよび第2のアセンブリドメインの標的ナノ構造へのアセンブリを駆動する。いくつかの実施形態では、ナノ構造の三量体アセンブリドメインの各々のコピーは、遺伝子融合物としてパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントを保有し;これらのナノ構造は、完全な結合価でFタンパク質を表示する。他の実施形態では、本発明のナノ構造は、遺伝子融合物としてパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントを保有する三量体アセンブリドメインの1つまたは複数のコピーならびに遺伝子融合物としてFタンパク質を保有しない1つまたは複数の三量体アセンブリドメインを含み;これらのナノ構造は、部分的結合価でFタンパク質を表示する。三量体アセンブリドメインは、三量体を形成し、第2のアセンブリドメインと相互作用して標的ナノ構造へのアセンブリを駆動する任意のポリペプチド配列であり得る。
T33-31A(配列番号51)
(M)EEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYREEGSVVSDHELLLLVKTTTDAFPKLKERVKELHPYEVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTG
>T33-31B(配列番号44)
(M)VRGIRGAITVEEDTPAAILAATIELLLKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARLIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLNEAVRLRPDLESAQ
DS-Cav1(配列番号53):
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)
RSV F
sc9-10 DS-Cav1 A149C Y458C(配列番号61)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSRTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)
sc9-10 DS-Cav1 A149C Y458C S46G K465Q S215P E92D(配列番号62)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSRTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)
RSV F SC-DM(N67I、S215P)(配列番号63)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)
SC-TM(N67I、S215P、およびE487Q)(配列番号64)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)
HMPV Fタンパク質、CAN97-83(A2)株(配列番号65)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTG
A113C、A339C、T160F、I177Lを有するHMPVF(配列番号66)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTG
A113C、A120C、A339C、T160F、I177L、およびQ426Cを有するHMPV F(配列番号67)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTCGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYCLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTG
HMPV F>AAK62968.2融合タンパク質[ヒトメタニューモウイルス](配列番号101)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTG
115-BV(A185P)(配列番号68)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRRRRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIPDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNT(SGRENLYFQGGGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRHHHHHH)
本発明のナノ構造では、Fタンパク質および三量体アセンブリドメインを、これらの両方が単一のポリペプチド中に存在するように遺伝子融合することができる。好ましくは、Fタンパク質と三量体アセンブリドメインとの間の連結により、Fタンパク質またはその抗原フラグメントが本発明のナノ構造の外面に表示される。そのようなものとして、三量体アセンブリドメインの接続点は、任意のFタンパク質の非存在下で三量体アセンブリドメインおよび第2のアセンブリドメインによって形成されたナノ構造の外面に存在すべきである。当業者によって理解されるように、多種多様のポリペプチド配列を使用して、パラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントならびに三量体アセンブリドメインを連結することができる。これらのポリペプチド配列を、リンカーと呼ぶ。任意の適切なリンカーを使用することができる;適切なリンカーとしての機能を果たすためのアミノ酸配列の要件は存在しない。Fタンパク質またはその抗原フラグメントが本発明のナノ構造の外面に表示されることを可能にする要件を超えるリンカーがFタンパク質またはその抗原フラグメントの三量体アセンブリドメインへの強固な相対的配向を強いる要件は存在しない。いくつかの実施形態では、リンカーは、三量体の形態のFタンパク質の安定化を補助するさらなる三量体化ドメイン(例えば、T4フィブリチンのfoldonドメイン)を含む。
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
他の実施形態では、リンカーは、任意の適切な長さのGly-Serリンカー(すなわち、グリシン残基およびセリン残基からなるリンカー)を含み得る。種々の実施形態では、Gly-Serリンカーは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれを超えるアミノ酸長であり得る。種々の実施形態では、Gly-Serリンカーは、GSGGSGSGSGGSGSG(配列番号55)、GGSGGSGS(配列番号56)、またはGSGGSGSG(配列番号57)のアミノ酸配列を含み得るか、これらのアミノ酸配列からなり得る。
DS-Cav1-foldon(配列番号60):
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
DS-Cav1-foldon-T33-31A(配列番号69)
(MELLILKANVIATILTAVTFCFASS)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGSMEEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYREEGSVVSDHELLLLVKTTTDAFPKLKERVKELHPYEVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTG
DS-Cav1-T33-31A(配列番号70)
(MELLILKANVIATILTAVTFCFASS)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGGSMEEVVLITVPSALVAVKIAHALVEERLAACVNIVPGLTSIYREEGSVVSDHELLLLVKTTTDAFPKLKERVKELHPYEVPEIVALPIAEGNREYLDWLRENTG
DS-Cav1-foldon-T33-15B(配列番号71)
(MELLILKANVIATILTAVTFCFASS)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGSMVRGIRGAITVNSDTPTSIIIATILLLEKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARQIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLSEAVRLRPDLESAQ
DS-Cav1-T33-15B(配列番号72)
(MELLILKANVIATILTAVTFCFASS)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGGSMVRGIRGAITVNSDTPTSIIIATILLLEKMLEANGIQSYEELAAVIFTVTEDLTSAFPAEAARQIGMHRVPLLSAREVPVPGSLPRVIRVLALWNTDTPQDRVRHVYLSEAVRLRPDLESAQ
DS-Cav1-foldon-I53-50A(配列番号73)
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DS-Cav1-I53-50A(配列番号74)
(MELLILKANVIATILTAVTFCFASS)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
DS-Cav1-I32-28A(配列番号75)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGGSGGSGSDDARIAAIGDVDELNSQIGVLLAEPLPDDVRAALSAIQHDLFDLGGELCIPGHAAITEDHLLRLALWLVHYNGQLPPLEEFILPGGARGAALAHVCRTVCRRAERSIKALGASEPLNIAPAAYVNLLSDLLFVLARVLNRAAGGADVLWDRTRAH
DS-Cav1-8GS-HelExt-I53-50A(F10)(配列番号76)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
DS-Cav1-foldon-15GS-HelExt-I53-50A(F14)(配列番号77)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGGSGSGSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
HMPV F wt_CAN97-83株-I53-50A(配列番号78)
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HMPV F A113C_A339C_T160F_I177L-I53-50A(配列番号79)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
HMPV F A113C_A339C_T160F_I177L_A120C、Q426C変異-I53-50A(配列番号80)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTCGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYCLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
sc-DS2-I53-50A(配列番号81)
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tc-DS2-I53-50A(配列番号82)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSCIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
DS-Cav1-12GS-HelExt-I53-50A(F11)(配列番号83)
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DS-Cav1-16GS-HelExt-I53-50A(F12)(配列番号84)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGSGGSGSGSGGSGSGGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
DS-Cav1-foldon-10GS-HelExt-I53-50A(F13(配列番号85)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGGSGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
DS-Cav1-foldon-20GS-HelExt-I53-50A(F15)(配列番号86)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGGSGSGSGGSGSGGSSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
sc9-10 DS-Cav1 A149C Y458C-foldon-I53-50A実施形態(配列番号87)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSRTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
sc9-10 DS-Cav1 A149C Y458C-I53-50A-F10実施形態(配列番号88)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSRTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
sc9-10 DS-Cav1 A149C Y458C S46G K465Q S215P E92D-foldon-I53-50A実施形態(配列番号89)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSRTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
sc9-10 DS-Cav1 A149C Y458C S46G K465Q S215P E92D-I53-50A-F10実施形態(配列番号90)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATGSGSAICSGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSRTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYCVNKQEGQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
SC-DM(N67I、S215P)-foldon-I53-50A実施形態(配列番号91)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
SC-DM(N67I、S215P)-I53-50A-F10実施形態(配列番号92)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
SC-TM(N67I、S215P、およびE487Q)-foldon-I53-50A実施形態(配列番号93)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
SC-TM(N67I、S215P、およびE487Q)-I53-50A-F10実施形態(配列番号94)
(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIR(KSDELL)GSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
A113C、A339C、T160F、I177L-foldon-I53-50A実施形態を有するHMPV-F(配列番号95)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
A113C、A339C、T160F、I177L-I53-50A F10実施形態を有するHMPV-F(配列番号96)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGGSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
A113C、A120C、A339C、T160F、I177L、およびQ426C-foldon-I53-50A実施形態を有するHMPV-F(配列番号97)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTCGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYCLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
A113C、A120C、A339C、T160F、I177L、およびQ426C-F10実施形態を有するHMPV-F(配列番号98)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTCGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYCLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGGSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
HMPV-F 115-BV(A185P)-foldon-I53-50A実施形態(配列番号99)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRRRRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIPDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGSGSHHHHHHHHGGSGGSGSEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
HMPV-F 115-BV(A185P)-I53-50A-F10実施形態(配列番号100)
(MSWKVVIIFSLLITPQHG)LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRRRRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIPDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGSGGSGSGEKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGCTE
本発明のナノ構造は、三量体の第1のアセンブリの複数のコピーおよび第2のアセンブリの複数のコピーを含み得る。第2のアセンブリは、第2のポリペプチドの複数のコピーが自己会合して第2のアセンブリを形成するのを誘導するタンパク質-タンパク質界面を含む。第2のアセンブリの複数のオリゴマー状態は、ナノ構造形成と適合し得る(二量体(2コピー)、三量体(3コピー)、四量体(4コピー)、五量体(5コピー)、六量体(6コピー)、またはそれを超えるオリゴマー状態が含まれる)。第2のアセンブリの各々のコピーは、三量体アセンブリドメイン上の相補的な表面が暴露した界面と相互作用する表面が暴露した界面をさらに含む。Kingら、Baleら、ならびに特許公開WO2014124301A1号およびUS20160122392A1号に記載のように、三量体アセンブリドメインと第2のアセンブリドメインとの間の相補的な界面は、三量体アセンブリドメインおよび第2のアセンブリドメインの複数のコピーの標的ナノ構造へのアセンブリを駆動する。種々の特定の実施形態では、
(a)各々の第1のポリペプチドがDS-Cav1-foldon-T33-31A(配列番号69)またはDS-Cav1-T33-31A(配列番号70)であるとき、各々の第2のポリペプチドはT33-31B(配列番号44)であり;
(b)各々の第1のポリペプチドがDS-Cav1-foldon-T33-15B(配列番号71)またはDS-Cav1-T33-15B(配列番号72)であるとき、各々の第2のポリペプチドはT33-15A(配列番号45)であり;
(c)各々の第1のポリペプチドがDS-Cav1-foldon-I53-50A(配列番号73)またはDS-Cav1-I53-50A(配列番号74)であるとき、各々の第2のポリペプチドはI53-50B(配列番号8)、I53-50B.1(配列番号32)、I53-50B.1NegT2(配列番号33)、またはI53-50B.4PosT1(配列番号34)であり;
(d)各々の第1のポリペプチドがDS-Cav1-I32-28A(配列番号75)であるとき、各々の第2のポリペプチドはI32-28Bである。
いくつかの実施形態では、ナノ構造の各々の三量体の第1のアセンブリは、遺伝子融合物として同一のFタンパク質を保有する;これらのナノ構造は、完全な(100%)結合価でFタンパク質を表示する。かかるナノ構造は、in vitroアセンブリと呼ばれるプロセスにおいて精製された第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドから産生される。Fタンパク質を含む精製された三量体の第1のポリペプチドを、適切な第2のポリペプチドと、水性条件下にておよそ1:1のモル比で混合する(図1を参照のこと)。第2のアセンブリは、標的ナノ構造のアセンブリを駆動するために三量体の第1のアセンブリと相互作用する。標的ナノ構造の首尾の良いアセンブリを、タンパク質またはタンパク質アセンブリの物理的サイズを査定するために使用される一般的な生物学的方法または生物物理学的方法(サイズ排除クロマトグラフィ、未変性(非変性)ゲル電気泳動、動的光散乱、多角度光散乱、分析用超遠心法、陰性染色電子顕微鏡法、低温電子顕微鏡法、またはX線結晶学が含まれるが、これらに限定されない)によるin vitroアセンブリ反応の分析によって確認することができる。必要ならば、アセンブリしたナノ構造を、その物理的サイズによってタンパク質を単離するために一般的に使用される分取技術(サイズ排除クロマトグラフィ、分取超遠心分離、接線流濾過、または分取ゲル電気泳動が含まれるが、これらに限定されない)を使用してin vitroアセンブリ反応物中に存在する他の種または分子から精製することができる。ナノ構造中のFタンパク質の存在を、水溶液中のタンパク質分子の同一性を決定するために一般に使用される技術(SDS-PAGE、質量分析、タンパク質配列決定、またはアミノ酸分析が含まれるが、これらに限定されない)によって査定することができる。粒子外面のFタンパク質の接近可能性およびその高次構造または抗原性を、抗原の存在および高次構造を検出するために一般に使用される技術(モノクローナル抗体、高次構造特異的モノクローナル抗体、または抗原に特異的な抗血清による結合が含まれるが、これらに限定されない)によって査定することができる。
他の実施形態では、本発明のナノ構造は、遺伝子融合物としてFタンパク質を保有する三量体の第1のアセンブリの1つまたは複数のコピーおよび遺伝子融合物としてFタンパク質を保有しない1つまたは複数の三量体の第1のアセンブリを含む;これらのナノ構造は、部分的結合価でFタンパク質を表示する。これらの部分的結合価のナノ構造は、遺伝子融合物としてFタンパク質を保有する三量体の第1のアセンブリの割合が、得られるナノ構造中の抗原の所望の結合価に等しい第1のポリペプチドの混合物を使用したin vitroアセンブリによって産生される。in vitroアセンブリ反応は、典型的には、全ての第1のポリペプチドおよび全ての第2のポリペプチドをおよそ1:1のモル比で含む。非限定的な例として、第1のポリペプチドの半分が遺伝子融合物としてFタンパク質を保有する三量体アセンブリの混合物を用いたin vitroアセンブリ反応を行うことにより、結合価が50%のFタンパク質を有するアセンブリしたナノ構造が得られるであろう。すなわち、ナノ構造上にFタンパク質表示が可能な部位が50%を占めるであろう。非限定的な例として、ナノ構造が正二十面体対称を有する120サブユニットアセンブリである場合、ナノ構造は、合計20の三量体基本単位を含み、結合価50%のナノ構造は、可能な20のFタンパク質三量体のうちの10を表示する。このようにして、in vitroアセンブリ反応におけるFタンパク質を保有する第1のポリペプチドのFタンパク質を欠く第1のポリペプチドに対する比を使用して、得られるナノ構造のFタンパク質の結合価を正確に調整することができる。この様式で調整することができるのは平均結合価であり;混合物中の個別のナノ構造の結合価は平均付近を中心として分布しているということが当業者に理解されるであろう。かかる部分的結合価のナノ構造の首尾の良いアセンブリを、完全な結合価のナノ構造を評価するための上記の技術を使用して査定することができ、必要ならば、部分的結合価のナノ構造を、完全な結合価のナノ構造の精製について記載の方法を使用して精製することができる。所与の試料中のFタンパク質を保有する第1のポリペプチドの平均結合価を、完全な結合価のナノ構造中のFタンパク質の存在を評価するための上記の技術を使用した定量分析によって査定することができる。
他の実施形態では、本発明のナノ構造は、遺伝子融合物として異なるFタンパク質を保有する2つ以上の別個の第1のポリペプチドを含み;これらのナノ構造は、同一のナノ構造上に複数の異なるFタンパク質を同時に表示する。これらの多抗原ナノ構造は、各々の第1のポリペプチドが遺伝子融合物として2つ以上の別個のFタンパク質のうちの1つを保有する第1のポリペプチドの混合物を用いてin vitroアセンブリを行うことによって産生される。混合物中の各々の第1のポリペプチドの割合は、得られるナノ構造中の各々のFタンパク質の平均結合価を決定づける。in vitroアセンブリ反応は、典型的には、全ての三量体の第1のポリペプチドの全ての第2のポリペプチドに対するモル比がおよそ1:1である。所与の試料中の各々のFタンパク質を保有する第1のポリペプチドの存在および平均結合価を、完全な結合価のナノ構造中のFタンパク質の存在を評価するための上記の技術を使用した定量分析によって査定することができる。
I53-34A:三量体+I53-34B:五量体;
I53-40A:五量体+I53-40B:三量体;
I53-47A:三量体+I53-47B:五量体;
I53-50A:三量体+I53-50B:五量体;
I53-51A:三量体+I53-51B:五量体;
I32-06A:二量体+I32-06B:三量体;
I32-19A:三量体+I32-19B:二量体;
I32-28A:三量体+I32-28B:二量体;
I52-03A:五量体+I52-03B:二量体;
I52-32A:二量体+I52-32B:五量体;および
I52-33A:五量体+I52-33B:二量体
(a)融合前F特異的抗体(モノクローナル抗体D25が含まれるが、これに限定されない)に結合すること;
(b)対称構造(正二十面体構造が含まれるが、これに限定されない)を形成すること;
(c)50℃で安定であること;および/または
(d)2.25M塩酸グアニジン中で安定であること。
方法:
Fタンパク質および三量体アセンブリドメインを含む三量体基本単位の発現およびスクリーニング
DS-Cav1融合物を含むか欠く三量体基本単位のためのヒトコドン最適化配列を、Genscriptから取り寄せた。単一構成成分のナノ構造(すなわち、I3-01)の基本単位を、1つのCMVプロモーターを含むpcDNA3.1ベクター(ThermoFisher Scientific)にクローン化し、一方で、2構成成分のナノ構造(例えば、I53-50)の基本単位を、CMVプロモーターおよびEF-1αプロモーターの両方を含むpBudCE4.1(商標)ベクター(ThermoFisher Scientific)にクローン化した。組換えタンパク質を、ポリエチレンイミン(PEI)を使用したExpi293F(商標)細胞(ThermoFisher Scientific)の一過性トランスフェクションによって発現させた。細胞培養物を、トランスフェクションの5日後に遠心分離によって回収した。分泌されたタンパク質を、細胞上清の直接コーティングを使用したELISAまたはサンドイッチELISAのいずれかによって分析した。簡潔に述べれば、96ウェルMaxiSorp(商標)プレート(Nunc)に、直接ELISAについては細胞上清をコーティングし、サンドイッチELISAについてはマウス抗Hisタグモノクローナル抗体(ThermoFisher Scientific)をコーティングした。分泌されたタンパク質を、ヒトパリビズマブ、MPE8、RSD5、およびD25モノクローナル抗体を使用して検出した。トランスフェクトされたExpi293F細胞を固定し、BDcytofix/cytoperm(BD Biosciences)を使用して透過処理し、ヒトパリビズマブ、MPE8、およびD25モノクローナル抗体とインキュベートし、アレクサフルオル647抱合抗ヒトIgG抗体(Jackson ImmunoResearch)で染色した。染色された細胞を、FACS Fortessa(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)で計数した。FlowJo(商標)ソフトウェアを使用して解析した。細胞株を、マイコプラズマ汚染について定常的に試験した。
レンチウイルスを、直鎖25kDaポリエチレンイミン(PEI;Polysciences)を使用した293T(ATCC)細胞の一過性トランスフェクションによって産生した。簡潔に述べれば、4×106細胞を、10cm組織培養プレート上にプレートした。24時間後、3μgのpsPAX2、1.5μgのpMD2G(それぞれ、Addgene(商標)プラスミド番号12260および番号12259)、および6μgのレンチウイルスベクタープラスミドを、500μl希釈剤(5mM HEPES、150mM NaCl、pH=7.05)および42μlのPEI(1mg/ml)で混合し、15分間インキュベートした。次いで、DNA/PEI複合体をプレートに滴下した。トランスフェクションの48時間後にレンチウイルスを回収し、8000gで18時間の低速遠心分離によって100倍に濃縮した。10×106細胞を含む10mL成長培地を含む125mL振盪フラスコ中で標的細胞株を形質導入した。100uLの100×レンチウイルスをフラスコに添加し、細胞を、37℃で振盪(225rpm)しながら、8%CO2中で4~6時間インキュベートした。4~6時間後に20mLの成長培地を振盪フラスコに添加した。
結合価100%の粒子(正二十面体ナノ構造あたり20のDS-Cav1三量体)を、それぞれ50μMのDS-Cav1-foldon-I53-50A三量体およびI53-50B.4PT1五量体を混合し、ロッキングしながら4℃で一晩インキュベートすることによって調製した。場合によっては、GE Sephacryl S-500 HR 16/60カラムを使用した25mM Tris(pH8)、250mM NaCl、5%グリセロールを含む緩衝液中でのin vitroアセンブリ反応物中に残存した過剰成分からアセンブリしたナノ構造を精製した。試料の負荷およびSEC画分を、還元剤の存在下および非存在下でのSDS-PAGEによって分析した。ピーク画分をプールし、GE Vivaspin(商標)20 30kDa MWCO遠心濾過器を使用して濃縮し、Agilent 8454分光光度計を使用して定量した。
25mM Tris(pH8)、250mM NaCl、5%グリセロールを使用して0.01mg/mLまで希釈することによってネガティブ染色EMのための試料を調製し、3.5μLをグロー放電した銅製の炭素コーティングしたグリッド上で20秒間インキュベートした後、Whatman No.1濾紙片を用いて液体を吸い取った。試料の吸い取りから数秒以内に、3.5μLの染色液の液滴(2%w/vギ酸ウラニル)を沈着させ、直ちに吸い取り、次いで、第2サイクルの染色/ブロッティングを行った。
Fタンパク質(0.5mg ml-1)由来のCDスペクトルを、Chirascan(商標)分光偏光計(Applied Photophysics)にて、バンド幅1nm、ステップサイズ0.5nm、および1秒/ステップで波長範囲195~260nmにわたって記録した。遠紫外域のスペクトルには3スキャンの平均が必要であり、このスペクトルを、緩衝液を用いて行ったブランクスペクトルから差し引いた。各温度で1分間の平衡後に1℃間隔でスキャンすることによって熱変性をモニタリングした。データを、単純一次曲線に対してフィッティングした。ΔA222の値を、20℃で記録した値の百分率としてy軸上に示した。
抗体または血清の特異的結合を試験するために、96ウェルMaxiSorp(商標)プレート(Nunc)に、Fタンパク質および三量体アセンブリドメインまたは2μg ml-1の以下の精製したタンパク質を含む三量体基本単位を発現する細胞由来の組織培養上清の系列希釈物でコーティングした:foldonを有するDs-Cav1、三量体の第1のポリペプチドに融合したDs-Cav1、またはDS-Cav1を表示するナノ構造。プレートを、1%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロッキングし、滴定した抗体(D25、MPE8、パリビズマブ、RSD5)またはマウス血清とインキュベートし、その後にAP抱合ヤギ抗ヒトIgG(Southern Biotech,2040-04)またはヤギ抗マウスIgG(Southern Biotech,1030-04)とインキュベートした。次いで、プレートを、PBS緩衝液(Gibco、Invitrogen)で洗浄し、0.05%Tween-20および基質(p-NPP、Sigma)を添加し、プレートを405nmで読み取った。
ProteON(商標)XPR-36装置(Bio-Rad Laboratories)にて25℃のPBS緩衝液(Gibco,Invitrogen)、0.05% Tween-20中で実験した。1000反応単位(RU)でのアミンカップリングによってD25mAbをGLMセンサーチップ表面上に固定し、タンパク質を含まないブランク表面を、基準として使用するために同一のカップリング条件下で作製した。モノクローナル抗体(D25、MPE8、パリビズマブ、および131-2a)を、流速100μl/分、濃度50nMで異なるセンサーチャネル中に注入した。データを、Proteonソフトウェアを使用して処理し、データの局所フィッティング前にブランク表面および緩衝液のみの注入を差し引くことによって二重に参照した。
6~9週齢の雌BALB/cマウスを、ENVIGO Laboratories(Italy)から入手した。全タンパク質を、製造者の説明書に従ってAddaVax(商標)アジュバント(Invivogen)を用いて製剤化した。0、14、および28日目に、50%AddaVax(商標)を含むPBS中の5μgのDS-Cav1抗原等価物に相当する総タンパク質用量を用いてマウスの皮下(s.c)に免疫化した。24日目および40日目にマウスから採血した。回収した血清を使用して、結合力価および中和力価を測定した。結合力価を、3μg/mlのDS-Cav1、I53-50ナノ構造、またはI53-50ナノ構造サブユニットのコーティングによって測定した。
血清によるRSV感染の中和を、マイクロ中和フローサイトメトリー系アッセイを使用して測定した。血清の系列希釈物を、RSVと37℃で1時間プレインキュベートし、96ウェル平底プレート中に10000 HEp-2(ATCC(登録商標)CCL-23(商標))細胞/ウェルまで添加した(MOIは1)。24時間後、細胞を洗浄し、剥離し、2%ホルムアルデヒドで固定した。GFP陽性細胞の百分率を、自動化プラットフォームと連結したIntellicytを使用した高処理FACSによって測定した。組織培養阻止希釈(TCID)での50%感染中和(TCID50)を、Prism 7(GraphPad Software)を使用した非線形回帰によって計算した。
アカゲザルを、0週目および4週目に、MF59様アジュバントSWEで製剤化した三量体DS-Cav1(50μg;n=4)またはDS-Cav1-foldon-I53-50ナノ構造(96μg、50μgの表示されたDS-Cav1を含む;n=5)でi.m.(右四頭筋)にて免疫化した。血清学的分析のために、6週目および16週目に血清を得た。
ProteON(商標)XPR-36装置(Bio-Rad Laboratories)にて20℃のPBS緩衝液(Gibco,Thermo Fisher Scientific)および0.05%Tween-20(Sigma)中で実験した。100nM D25抗体をアミンカップリング(EDC/NHS化学)によってGLMセンサーチップ表面上に固定し、抗体を含まないブランク表面を、基準として使用するために同一のカップリング条件下で作製した。異なる温度(20、50、70、または80℃)で1時間熱ストレスを与えた分析タンパク質(可溶性DS-Cav1、可溶性DS-Cav1-I53-50A、およびDS-Cav1-foldon-I53-50ナノ構造)を、流速100μl/分、濃度50nMで異なるセンサーチャネル中に注入した。データを、Proteonソフトウェアを使用して処理し、データの局所フィッティング前にブランク表面および緩衝液のみの注入を差し引くことによって二重に参照した。
三量体DS-Cav1、DS-Cav1-I53-50A、DS-Cav1-I53-50、I53-50、三量体I53-50A、または五量体I53-50B.4PT1を、0Mから6.5Mまでの範囲で0.25Mずつ増加する種々の濃度の塩酸グアニジンを有する25mM Tris(pH8)、250mM NaCl、5%グリセロールで最終濃度2.5μMまで希釈した。試料を三連で調製し、周囲温度で16時間インキュベートした。Cary Eclipse蛍光分光光度計にて、自家蛍光を、各々のタンパク質および各々の複製の各々の塩酸グアニジン濃度のために測定した。Peltierコントローラをセルホルダー中で使用して、全実験を通して25℃に維持した。10mmセル(Agilent Cuvette、部品番号6610021600)を使用して、290nmで励起し、310nmから510nmまでの発光をバンド幅1nmにて速度60nm/分でスキャニングした蛍光スペクトルを収集した。
試料サイズを予め決定するために統計学的方法を使用しなかった。データを、Prism 6(GraphPad(商標)ソフトウェア)にて2群比較のための両側ノンパラメトリックマン・ホイットニーU検定または3群以上を比較するときのクラスカル・ウォリス検定(およびDunnのポストテスト)を使用して解析した。
Fタンパク質および三量体アセンブリドメインを含む三量体基本単位
各々が三量体アセンブリドメインに遺伝子融合したFタンパク質を含むいくつかの三量体基本単位は、HEK293F細胞から分泌されたことが見出され、ELISAアッセイにおける融合前特異的モノクローナル抗体結合によって判断したところ、そのFタンパク質は、十分に折り畳まれた融合前高次構造であった。図2は、DS-Cav1-foldon、DS-Cav1-foldon-T33-31A、およびDS-Cav1-T33-31Aを発現するHEK293F細胞の上清を分析したELISAデータの例を示す。いくつかの他の三量体基本単位により、十分に折り畳まれた融合前Fタンパク質が検出可能に分泌された。
DS-Cav1-foldon-I53-50Aをコードするレンチウイルスベクターを使用して、大量発現のためにHEK293F細胞を形質導入した。分泌されたタンパク質を、固定金属アフィニティクロマトグラフィおよびサイズ排除クロマトグラフィによって組織培養上清から精製した。サイズ排除クロマトグラム(図3)は、精製したタンパク質が単一の単分散種を形成することを示した。
I53-50B.4PT1(正二十面体I53-50系ナノ構造のアセンブリを駆動するためにI53-50AまたはDS-Cav1-foldon-I53-50A内の三量体アセンブリドメインと相互作用する第2のアセンブリドメインを含む五量体タンパク質)を、Baleらおよび特許公開US20160122392A1号に記載のように発現および精製した。
I53-50は、Baleらが最近記載しているように、20の三量体(I53-50A)および12の五量体(I53-50B)の基本単位を含む正二十面体対称を有する120サブユニットの2構成成分のナノ構造である。I53-50AのN末端は、I53-50ナノ構造の外面に露出しており、それにより、I53-530AのN末端への遺伝子融合によるナノ構造外面への抗原の表示が可能である。精製されたDS-Cav1-foldon-I53-50AおよびI53-50B.4PT1をin vitroでアセンブリして、2つの精製されたタンパク質を種々のモル比で混合することによってナノ構造外面に種々の量のDS-Cav1を表示する120サブユニットの正二十面体ナノ構造を形成した。個別の調製物において、結合価が100%(20の三量体)、66%(約14の三量体)、および33%(約7の三量体)でDS-Cav1を表示するナノ構造を、上記のように調製した。一晩のインキュベーション後のin vitroアセンブリ反応物中に存在する種を、いくつかの技術(サイズ排除クロマトグラフィ-多角度光散乱(SEC-MALS)、動的光散乱、およびUV/可視分光法が含まれる)によって査定した。アセンブリした120サブユニットのナノ構造を、サイズ排除クロマトグラフィを使用してin vitroアセンブリ反応物から精製した(結合価100%のナノ構造を使用して得たクロマトグラムの例を、図4に示す)。精製したナノ構造が陰性染色電子顕微鏡法によって特徴づけられ、これにより、DS-Cav1がコア正二十面体I53-50アセンブリから外向きに突出したスパイクとして明確に視認可能である単分散粒子領域が明らかとなった(結合価100%の粒子を使用して得た顕微鏡写真の例を、図5に示す)。融合前高次構造に特異的なモノクローナル抗体を使用したELISAアッセイにおいて、上記のようにナノ構造外面に表示されたDS-Cav1が十分に折り畳まれており、抗原性がインタクトであることが確認された(図6)。モノクローナル抗体結合の動態を評価する表面プラズモン共鳴実験により、結合価100%のDS-Cav1-foldon-I53-50ナノ構造からの抗体の解離がDS-Cav1-foldon三量体からの解離より遅いことが明らかとなり、これは、ナノ構造外面上のDS-Cav1の多価提示に由来するアビディティー効果に起因する可能性が高い(図6)。まとめると、これらの実験から、DS-Cav1-foldon-I53-50ナノ構造が、十分に折り畳まれた、抗原性がインタクトなDS-Cav1三量体をその外面に表示している単分散正二十面体ナノ構造を形成することが確認された。これらの所見は、動物におけるDS-Cav1に対する体液性免疫応答を誘導するための免疫原としてのDS-Cav1-foldon-I53-50ナノ構造の有用性を評価する実験を行う動機づけとなった。
結合価が33%、66%、および100%でDS-Cav1を表示するDS-Cav1-foldon-I53-50ナノ構造を、上記のプライム・ブーストストラテジーを使用してマウスに注射した。さらなるマウス群に、ナノ構造によるDS-Cav1に対して誘導された体液性免疫応答のベンチマークとしての三量体DS-Cav1-foldonまたはDS-Cav1特異的応答のネガティブコントロールとしてのDS-Cav1を表示しないI53-50ナノ構造を注射した。注射後の規定の時点でのマウスから抽出した血清のELISAアッセイを使用して、注射した動物の血清中に存在するDS-Cav1特異的抗体価を測定した(図7)。予想通り、DS-Cav1を表示しないI53-50ナノ構造を注射した動物由来の血清は、DS-Cav1に特異的な抗体を含まなかった。以前の結果(McClellanら)に従って、三量体DS-Cav1-foldonは、DS-Cav1特異的抗体を誘導した。結合価が33%、66%、および100%のDS-Cav1ナノ構造は全て、三量体DS-Cav1-foldonよりも高いDS-Cav1特異的抗体価を誘導し、この抗体価は、DS-Cav1結合価が増加するにつれて増加した。DS-Cav1特異的力価は、DS-Cav1と比較して結合価が100%のDS-Cav1-foldon-I53-50ナノ構造を注射したマウスにおいて平均しておよそ2.5倍高かった。これらの結果は、パラミクソウイルスFタンパク質が自己アセンブリしたタンパク質ナノ構造上に多価で表示されている免疫原が、動物に注射されたときにより高い体液性免疫応答を誘導することができることを証明している。
融合前Fの重要な抗原特性を考慮して、本発明者らは、I53-50Aに融合したときおよび/または正二十面体ナノ構造にさらにアセンブリしたときのDS-Cav1の物理的安定性を測定するための2つの直交性アプローチを使用した。第1のアッセイは、温度ストレス後の融合前特異的mAb(D25)による結合の持続時間を測定した(融合前F安定性を特徴づけるために以前に使用されていたアプローチ)(McLellanら、2013;Joyceら、2016;Krarupら、2015)。等濃度(50nM)のDS-Cav1を含む三量体DS-Cav1、三量体DS-Cav1-I53-50A、およびDS-Cav1-I53-50ナノ構造の試料を、4つのアリコートに分割し、20、50、70、または80℃で1時間インキュベートした。室温に冷却後、D25結合を、表面プラズモン共鳴(SPR)によってアッセイした。本発明者らは、DS-Cav1について以前に報告されているように(McLellanら,2013;Joyceら,2016)、全ての試料は20℃および50℃でD25に等しく結合したが、80℃で1時間後にはD25に対する反応性のほとんどが失われることを見出した(図10)。興味深いことに、D25も70℃で1時間インキュベートした三量体DS-Cav1に結合することはできなかったが、三量体DS-Cav1-I53-50AおよびDS-Cav1-I53-50ナノ構造は、そのそれぞれの結合シグナルの50%および80%を保持していた(図10)。DS-Cav1-I53-50ナノ構造の多価性が三量体DS-Cav1との直接的な定量的比較を複雑にしているが、これらの結果は、I53-50A三量体への遺伝子融合がDS-Cav1の融合前高次構造をさらに安定化していることを示し、この安定性の増加がアセンブリしたナノ構造免疫原の状況において維持されていることを示唆している。
配列情報
Claims (43)
- ナノ構造であって、
(a)複数の第1のアセンブリであって、各々の第1のアセンブリが複数の同一の第1のポリペプチドを含む、複数の第1のアセンブリ;
(b)複数の第2のアセンブリであって、各々の第2のアセンブリが複数の同一の第2のポリペプチドを含み、前記第2のポリペプチドが前記第1のポリペプチドと異なる、複数の第2のアセンブリ;
を含み、
前記複数の第1のアセンブリが前記複数の第2のアセンブリと非共有結合的に相互作用してナノ構造を形成し;
前記ナノ構造が、1つまたは複数のパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントの複数のコピーを前記ナノ構造の外面に表示している、ナノ構造。 - (a)前記第1のポリペプチドが、配列番号1~51からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含み;
(b)前記第2のポリペプチドが、配列番号1~51からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1に記載のナノ構造。 - 前記1つまたは複数のパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントが、配列番号53、61~68、および101からなる群から選択されるポリペプチドに対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1または2に記載のナノ構造。
- 前記1つまたは複数のパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントが、配列番号53および61~64からなる群から選択されるRSV Fタンパク質またはその変異体に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、以下の残基:67I、149C、458C、46G、465Q、215P、92D、および487Qのうちの1つまたは複数を含む、請求項1または2に記載のナノ構造。
- 前記1つまたは複数のパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントが、配列番号65~68および101からなる群から選択されるMPV Fタンパク質またはその変異体に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、以下の残基:113C、120C、339C、160F、177L、185P、および426Cのうちの1つまたは複数を含む、請求項1または2に記載のナノ構造。
- 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドは、以下の対:
配列番号1および配列番号2(I53-34AおよびI53-34B);
配列番号3および配列番号4(I53-40AおよびI53-40B);
配列番号3および配列番号24(I53-40AおよびI53-40B.1);
配列番号23および配列番号4(I53-40A.1およびI53-40B);
配列番号35および配列番号36(I53-40A属およびI53-40B属);
配列番号5および配列番号6(I53-47AおよびI53-47B);
配列番号5および配列番号27(I53-47AおよびI53-47B.1);
配列番号5および配列番号28(I53-47AおよびI53-47B.1NegT2);
配列番号25および配列番号6(I53-47A.1およびI53-47B);
配列番号25および配列番号27(I53-47A.1およびI53-47B.1);
配列番号25および配列番号28(I53-47A.1およびI53-47B.1NegT2);
配列番号26および配列番号6(I53-47A.1NegT2およびI53-47B);
配列番号26および配列番号27(I53-47A.1NegT2およびI53-47B.1);
配列番号26および配列番号28(I53-47A.1NegT2およびI53-47B.1NegT2);
配列番号37および配列番号38(I53-47A属およびI53-47B属);
配列番号7および配列番号8(I53-50AおよびI53-50B);
配列番号7および配列番号32(I53-50AおよびI53-50B.1);
配列番号7および配列番号33(I53-50AおよびI53-50B.1NegT2);
配列番号7および配列番号34(I53-50AおよびI53-50B.4PosT1);
配列番号29および配列番号8(I53-50A.1およびI53-50B);
配列番号29および配列番号32(I53-50A.1およびI53-50B.1);
配列番号29および配列番号33(I53-50A.1およびI53-50B.1NegT2);
配列番号29および配列番号34(I53-50A.1およびI53-50B.4PosT1);
配列番号30および配列番号8(I53-50A.1NegT2およびI53-50B);
配列番号30および配列番号32(I53-50A.1NegT2およびI53-50B.1);
配列番号30および配列番号33(I53-50A.1NegT2およびI53-50B.1NegT2);
配列番号30および配列番号34(I53-50A.1NegT2およびI53-50B.4PosT1);
配列番号31および配列番号8(I53-50A.1PosT1およびI53-50B);
配列番号31および配列番号32(I53-50A.1PosT1およびI53-50B.1);
配列番号31および配列番号33(I53-50A.1PosT1およびI53-50B.1NegT2);
配列番号31および配列番号34(I53-50A.1PosT1およびI53-50B.4PosT1);
配列番号39および配列番号40(I53-50A属およびI53-50B属);
配列番号9および配列番号10(I53-51AおよびI53-51B);
配列番号11および配列番号12(I52-03AおよびI52-03B);
配列番号13および配列番号14(I52-32AおよびI52-32B);
配列番号15および配列番号16(I52-33AおよびI52-33B)
配列番号17および配列番号18(I32-06AおよびI32-06B);
配列番号19および配列番号20(I32-19AおよびI32-19B);
配列番号21および配列番号22(I32-28AおよびI32-28B);
配列番号23および配列番号24(I53-40A.1およびI53-40B.1);
配列番号41および配列番号42(T32-28AおよびT32-28B);
配列番号43および配列番号44(T33-09AおよびT33-09B);
配列番号45および配列番号46(T33-15AおよびT33-15B);
配列番号47および配列番号48(T33-21AおよびT33-21B);
配列番号49および配列番号50(T33-28AおよびT32-28B);および
配列番号51および配列番号44(T33-31BおよびT33-09B(T33-31Bとも呼ばれる))から選択されるアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載のナノ構造。 - 前記第1のポリペプチドが、T33-31A(配列番号51)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含み、前記第2のポリペプチドが、T33-09B/T33-31B(配列番号44)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 前記第1のポリペプチドが、T33-15B(配列番号46)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含み、前記第2のポリペプチドが、T33-15A(配列番号45)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 前記第1のポリペプチドが、I53-50A(配列番号7)、I53-50A.1(配列番号29)、I53-50A.1NegT2(配列番号30)、およびI53-50A.1PosT1(配列番号31)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含み、前記第2のポリペプチドが、I53-50B(配列番号8)、I53-50B.1(配列番号32)、I53-50B.1NegT2(配列番号33)、およびI53-50B.4PosT1(配列番号34)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 前記第1のポリペプチドが、I32-28A(配列番号21)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含み、前記第2のポリペプチドが、I32-28B(配列番号22)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 前記1つまたは複数のパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントが、前記第1のポリペプチドとの融合タンパク質として発現される、請求項1~10のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 前記複数の第1のアセンブリの各々が同一の融合タンパク質を含む、請求項11に記載のナノ構造。
- 前記複数の第1のアセンブリが、合計で2つ以上のパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントを含む、請求項11に記載のナノ構造。
- 前記第1のポリペプチドのサブセットのみが、Fタンパク質またはその抗原フラグメントとの融合タンパク質を含む、請求項11または12に記載のナノ構造。
- 各々の第1のアセンブリが、前記第1のポリペプチドのホモ三量体を含む、請求項1~14のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 前記1つまたは複数のパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントが、DS-Cav1(配列番号53)のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1~15のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 各々の融合タンパク質が、前記第1のポリペプチドと前記1つまたは複数のパラミクソウイルスおよび/もしくはニューモウイルスのFタンパク質、またはその抗原フラグメントとの間に配置されたアミノ酸リンカーを含む、請求項11~16のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 前記アミノ酸リンカー配列が、1つまたは複数の三量体化ドメインを含む、請求項17に記載のナノ構造。
- 前記アミノ酸リンカー配列が、アミノ酸配列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(配列番号54)を含む、請求項17または18に記載のナノ構造。
- 前記アミノ酸リンカー配列がGly-Serリンカーを含む、請求項17に記載のナノ構造。
- 前記融合タンパク質が、配列番号69~100からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項11~20のいずれか1項に記載のナノ構造。
- (a)各々の融合タンパク質がDS-Cav1-foldon-T33-31A(配列番号69)またはDS-Cav1-T33-31A(配列番号70)であるとき、各々の第2のポリペプチドはT33-31B(配列番号44)であり;
(b)各々の融合タンパク質がDS-Cav1-foldon-T33-15B(配列番号71)またはDS-Cav1-T33-15B(配列番号72)であるとき、各々の第2のポリペプチドはT33-15A(配列番号45)であり;
(c)各々の融合タンパク質がDS-Cav1-foldon-I53-50A(配列番号73)またはDS-Cav1-I53-50A(配列番号74)であるとき、各々の第2のポリペプチドはI53-50B(配列番号8)、I53-50B.1(配列番号32)、I53-50B.1NegT2(配列番号33)、またはI53-50B.4PosT1(配列番号34)であり;あるいは
(d)各々の融合タンパク質がDS-Cav1-I32-28A(配列番号75)であるとき、各々の第2のポリペプチドはI32-28B(配列番号22)である、請求項21に記載のナノ構造。 - 各々の第1のポリペプチドが、アミノ酸リンカーを介して配列番号7(I53-50A)に連結したDS-Cav1(配列番号53)の融合タンパク質を含む、請求項16に記載のナノ構造。
- 前記アミノ酸リンカーが、Gly-Serリンカーおよび/またはヘリックス伸張ドメインを含む、請求項23に記載のナノ構造。
- 各々の融合タンパク質が、配列番号69~77および81~90からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項11~24のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 各々の融合タンパク質が、配列番号76(F10)のアミノ酸配列を含む、請求項23~24のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 各々の第2のポリペプチドが、I53-50B(配列番号8)、I53-50B.1(配列番号32)、I53-50B.1NegT2(配列番号33)、またはI53-50B.4PosT1(配列番号34)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項23~25のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 各々の第2のポリペプチドが、I53-50B.4PosT1(配列番号34)のアミノ酸配列を含む、請求項23~27のいずれか1項に記載のナノ構造。
- 前記ナノ構造が、
(a)融合前F特異的抗体(モノクローナル抗体D25が含まれるが、これに限定されない)に結合し;
(b)対称構造(正二十面体構造が含まれるが、これに限定されない)を形成し;
(c)50℃で安定であり;かつ/または
(d)2.25M塩酸グアニジン中で安定である、請求項1~28のいずれか1項に記載のナノ構造。 - 請求項11~29のいずれか1項に引用された第1のポリペプチド融合タンパク質をコードする、組換え核酸。
- プロモーターに作動可能に連結された請求項30に記載の組換え核酸を含む、組換え発現ベクター。
- 請求項31に記載の組換え発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 請求項1~29のいずれか1項に記載の第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを発現することができる1つまたは複数の組換え発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 請求項1~29のいずれか1項に記載のナノ構造を含む免疫原性組成物、および薬学的に許容され得る担体。
- アジュバントをさらに含む、請求項34に記載の免疫原性組成物。
- 被験体においてパラミクソウイルスおよび/またはニューモウイルスのFタンパク質に対する免疫応答を生じさせる方法であって、それを必要とする前記被験体に、有効量の請求項1~29および34~35のいずれか1項に記載のナノ構造または免疫原性組成物を投与して免疫応答を生じさせる工程を含む、方法。
- 被験体においてパラミクソウイルスおよび/またはニューモウイルスの感染を治療または制限する方法であって、それを必要とする前記被験体に、有効量の請求項1~29および34~35のいずれか1項に記載のナノ構造または免疫原性組成物を投与し、それにより、前記被験体におけるパラミクソウイルスおよび/またはニューモウイルスの感染を治療または予防する工程を含む、方法。
- 前記投与により前記被験体におけるパラミクソウイルスおよび/またはニューモウイルスの中和抗体が産生される、請求項36または37に記載の方法。
- 前記中和抗体が、少なくとも1,000の力価(1/ID50)で前記被験体の血清中に存在する、請求項39に記載の方法。
- in vitroで請求項1~29のいずれか1項に記載のナノ構造をアセンブリさせるプロセスであって、2つ以上のナノ構造の構成成分を水性条件で混合して、前記所望のナノ構造の自発的アセンブリを駆動する工程を含む、プロセス。
- 前記混合する工程が、各々がFタンパク質またはその抗原フラグメント(「Fタンパク質」)を含む第1のポリペプチド(三量体の第1のポリペプチドなど)を含む第1のアセンブリを、第2のポリペプチドを含む適切な第2のアセンブリと、第1のポリペプチド:第2のポリペプチドのモル比およそ1:1にて、前記第1のアセンブリおよび前記第2のアセンブリが相互作用して前記ナノ構造を形成するのに適切な条件下および時間で混合する工程を含む、請求項40に記載のプロセス。
- 前記混合する工程が、全数未満の第1のポリペプチド(例えば、75%、50%、25%など)がFタンパク質を含んでいる第1のポリペプチド(三量体の第1のポリペプチドなど)を含む第1のアセンブリを、第2のポリペプチドを含む適切な第2のアセンブリと、第1のポリペプチド:第2のポリペプチドのモル比およそ1:1にて、前記第1のアセンブリおよび前記第2のアセンブリが相互作用して前記ナノ構造を形成するのに適切な条件下および時間で混合する工程を含む、請求項40に記載のプロセス。
- 前記混合する工程が、各々がFタンパク質を含む第1のポリペプチド(三量体の第1のポリペプチドなど)を含む第1のアセンブリであって、前記第1のポリペプチド全体で複数の異なるFタンパク質(例えば、2、3、4、またはそれを超える)を含む、第1のポリペプチドを、第2のポリペプチドを含む適切な第2のアセンブリと、第1のポリペプチド:第2のポリペプチドのモル比およそ1:1にて、前記第1のアセンブリおよび前記第2のアセンブリが相互作用して複数のFタンパク質またはその抗原フラグメントを含む前記ナノ構造を形成するのに適切な条件下および時間で混合する工程を含む、請求項40に記載のプロセス。
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