CN116194460A - 制备病毒样颗粒的方法 - Google Patents

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CN116194460A CN202180045744.3A CN202180045744A CN116194460A CN 116194460 A CN116194460 A CN 116194460A CN 202180045744 A CN202180045744 A CN 202180045744A CN 116194460 A CN116194460 A CN 116194460A
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Abstract

公开了一种通过以下来制备纳米结构的方法：用增溶溶液溶解来自包涵体的重组组分B(compB)蛋白，从而生成包括产物compB蛋白的产物样品。

Description

制备病毒样颗粒的方法
相关申请
本申请要求于2020年6月9日提交的美国临时申请第63/036,535号的优先权，所述美国临时专利申请的全部内容特此通过引用并入。
关于序列表的陈述
与本申请相关的序列表以文本格式提供代替纸质副本，并在此通过引用并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称是ICVX_008_01WO_ST25.txt。所述文本文件为94KB，创建于2021年6月9日并且通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本公开一般涉及自组装蛋白质纳米结构，特别是制备纳米结构的方法，包含基于纳米结构的疫苗。
背景技术
基于蛋白质的病毒样颗粒(pbVLP)为对称呈现蛋白质或其它大分子提供了有用的平台。其可以与由病毒衣壳蛋白(例如，来自无包膜病毒)或脂质包埋蛋白(例如，从包膜病毒提取或使用与脂质混合的重组膜蛋白制备)制成的常规VLP区分开来。后者通常没有定义的对称性。由于在病毒衣壳上附着蛋白质的挑战，前者通常在其显示蛋白质的能力方面受到限制。
VLP的一种应用(尤其是对于pbVLP)通常是作为疫苗。研究实验表明，与常规亚单位疫苗和非对称VLP相比，pbVLP上显示的抗原引发更强的抗体应答。
Bale等人,《科学(Science)》353:389-394(2016)公开了各种双组分二十面体pbVLP，包含一组由指定为组分A(compA)和组分B(compB)的蛋白质组分制成的pbVLP。
本领域仍然需要表达、纯化和组装基于蛋白质的病毒样颗粒的方法。本公开满足了此需要。
发明内容
在广泛的实验之后，本发明人惊奇地发现，用于基于双组分自组装蛋白的病毒样颗粒(pbVLP)的组分B(compB)蛋白可以从包涵体中表达和纯化，其产率、纯度和/或生物活性与其可以来自重组表达系统的可溶性级分一样高或更高。此外，令人惊讶的是，本文公开的纯化程序不需要在从包涵体溶解compB蛋白后进行变性或重新折叠步骤
本文提供了一种制备纳米结构的方法，所述方法包括用增溶溶液溶解来自包涵体的重组组分B(compB)蛋白，从而生成包括产物compB蛋白的产物样品。
在一些实施例中，所述增溶溶液包括尿素。尿素的尿素浓度可以为0.15M至2M，如0.5M。
在一些实施例中，所述增溶溶液是pH为7至8，任选地pH为7.4的缓冲溶液
在一些实施例中，所述增溶溶液包括两性离子表面活性剂。
在一些实施例中，所述两性离子表面活性剂选自CHAPSO(3-(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基)-2-羟基-1-丙磺酸酯)、LDAO、DDMAB和任何
Figure BDA0004019667220000021
表面活性剂。
在一些实施例中，所述增溶溶液包括3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)。
在一些实施例中，所述方法包括在所述增溶步骤之前用包括尿素的洗涤溶液洗涤所述包涵体，任选地，尿素浓度小于150mM，任选地为50mM至150mM。
在一些实施例中，所述方法包括使所述compB蛋白与阴离子交换树脂，任选地弱阴离子交换树脂，任选地二乙氨基乙基(DEAE)缀合树脂接触；并且使用洗脱溶液从所述树脂中洗脱所述compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括在所述洗脱步骤之前用柱洗涤溶液洗涤所述阴离子交换树脂，所述柱洗涤溶液包括：
两性离子表面活性剂，任选地3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)或其等效物，和/或
非离子表面活性剂，任选地Triton X-100或其等效物。
在一些实施例中，所述洗脱溶液包括氯化钠(NaCl)浓度为400mM至600mM的NaCl。
在一些实施例中，所述方法包括用混合模式树脂(任选地为陶瓷羟基磷灰石(CHT)树脂)纯化compB蛋白。
在一些实施例中，所述包涵体在包括编码所述compB蛋白的多核苷酸的细菌细胞中生成，所述多核苷酸操作性地连接到启动子。
在一些实施例中，所述细菌细胞在低于约33℃下，任选地在约15℃至约33℃下或在约17℃至约30℃下，优选地在约30℃下培养。
在一些实施例中，所述细菌细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。
在一些实施例中，所述细菌细胞是B菌株大肠杆菌细胞。
在一些实施例中，所述细菌细胞是K12菌株大肠杆菌细胞。
在一些实施例中，所述启动子是PhoA启动子。
在一些实施例中，所述启动子是除T7启动子以外的启动子。
在一些实施例中，所述方法包括在裂解溶液中裂解所述细菌细胞，其中所述裂解溶液基本上不含促进包涵体溶解度的试剂；以及回收所述包涵体。
在一些实施例中，所述裂解溶液基本上不含洗涤剂。
在一些实施例中，所述产物compB蛋白具有至少50％的溶解度，任选地70％至95％的溶解度。
在一些实施例中，通过凝胶过滤色谱法，任选地使用Superose 6柱测量溶解度。
在一些实施例中，以占总蛋白质的重量比(w/w)计算，产物compB蛋白具有至少80％的纯度，任选地具有至少95％w/w的纯度。
在一些实施例中，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，任选地变性SDS-PAGE测量纯度。
在一些实施例中，产物compB蛋白为至少70％w/w组装感受态，任选地为90％至98％w/w组装感受态。
在一些实施例中，组装感受态compB蛋白的百分比被定义为当所述compB蛋白与包括过量的组分A(compA)蛋白的溶液混合时，所述产物溶液中组装成基于蛋白质的病毒样颗粒(vpVLP)的compB蛋白的以重量比(w/w)计的百分比。
在一些实施例中，所述产物溶液包括少于50个内毒素单位/毫克总蛋白(EU/mg)，任选地5个至15个单位EU/mg。
在一些实施例中，所述方法不包括使所述compB蛋白变性和/或不包括重新折叠所述compB蛋白。在一些实施例中，所述方法不包括使所述compB蛋白变性。在一些实施例中，所述方法不包括重新折叠所述compB蛋白。在一些实施例中，所述方法涉及在不从单体蛋白组装所述多聚体的情况下生成多聚体组装。在一些实施例中，所述方法涉及在不从单体蛋白组装五聚体的情况下生成五聚体组装。
在一些实施例中，compB蛋白的产率在采集时为介于约170g/L湿细胞重量(WCW)至190g/L WCW之间和/或在所述包涵体中为约1g/L WCW compB蛋白。
在一些实施例中，所述compB蛋白是I53-50B蛋白。
在一些实施例中，所述I53-50B蛋白与以下共有至少95％的同一性：I53-50B.1(SEQ ID NO:32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO:33)或I53-50B.4PosT1(SEQ ID NO:34)。
在一些实施例中，所述I53-50B是由以下表示的蛋白质中的任一种：SEQ ID NO:40(I53-50B属)。
在一些实施例中，所述I53-50B蛋白与以下共有至少99％的同一性：I53-50B.1(SEQ ID NO:32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO:33)或I53-50B.4PosT1(SEQ ID NO:34)。
在一些实施例中，所述I53-50B蛋白与以下共有100％的同一性：I53-50B.1(SEQIDNO:32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO:33)或I53-50B.4PosT1(SEQ ID NO:34)。
在一些实施例中，所述compB蛋白是I53_dn5A蛋白。
在一些实施例中，所述I53_dn5A蛋白与以下共有至少95％的同一性：SEQ IDNO:169。
在一些实施例中，所述I53_dn5A蛋白与以下共有至少99％的同一性：SEQ IDNO:169。
在一些实施例中，所述I53_dn5A蛋白与以下共有至少100％的同一性：SEQ IDNO:169。
本文进一步提供了一种组合物，所述组合物包括通过本文所描述的任何方法产生的compB蛋白。
本文进一步提供了包括compB蛋白的组合物，其中所述compB蛋白是：
a.至少50％可溶，任选地70％至95％可溶；
b.至少80％纯，其中纯度以占总蛋白质的重量比(w/w)计算，任选地至少95％w/w纯；和/或
c.至少70％w/w组装感受态，任选地90％至100％w/w组装感受态。
在一些实施例中，所述组合物包括一种或多种20mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲剂，任选地为20mM，和/或250mM NaCl，任选地为250mM。
在一些实施例中，将所述组合物缓冲为7至8的pH，任选地7.4的pH。
在一些实施例中，所述组合物对储存和/或冻融是稳定的。
在一些实施例中，所述组合物对储存和/或冻融是稳定的。
在一些实施例中，本公开提供了制备纳米结构的方法，其中所述纳米结构包括组分A(compA)蛋白和组分B(compB)蛋白，其中所述compB蛋白用增溶溶液从包涵体中溶解，从而生成分离的compB蛋白，其中compA和所述分离的compB形成纳米结构。
在一些实施例中，通过本文所描述的方法制备纳米结构。
在一些实施例中，所述纳米结构的compB由与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列编码：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、27、28、32-34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58。
在一些实施例中，compA和所述compB各自包括分别与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列：
(i)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
(ii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
(iii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:24；
(iv)SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:4；
(v)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；
(vi)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
(vii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:27；
(viii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:28；
(ix)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:6；
(x)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27；
(xi)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28；
(xii)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:6；
(xiii)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；
(xiv)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28；
(xv)SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38；
(xvi)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
(xvii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:32；
(xviii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:33；
(xix)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:34；
(xx)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:8；
(xxi)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:32；
(xxii)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:33；
(xxiii)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34；
(xxiv)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:8；
(xxv)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32；
(xxvi)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:33；
(xxvii)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34；
(xxviii)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:8；
(xxix)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；
(xxx)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33；
(xxxi)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34；
(xxxii)SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；
(xxxiii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
(xxxiv)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；
(xxxv)SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；
(xxxvi)SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；
(xxxvii)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
(xxxviii)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；
(xxxix)SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；
(xl)SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42；
(xli)SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；
(xlii)SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46；
(xliii)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；
(xliv)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50；
(xlv)SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:44；
(xlvi)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:52；
(xlvii)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:54；
(xlviii)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:56；以及
(xlix)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:58。
在一些实施例中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所描述的任何纳米结构，以及药学上可接受的稀释剂。
在一些实施例中，本公开提供了包含本文所描述任何纳米结构的疫苗。
在一些实施例中，本公开提供了一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所描述的纳米结构、本文所描述的药物组合物或本文所描述的疫苗。
在一些实施例中，所述疾病或病症是病毒感染。
在一些实施例中，本公开提供了一种在有需要的受试者中产生免疫应答的方法，所述方法包括施用有效量的本文所描述的纳米结构、本文所描述的药物组合物或本文所描述的疫苗。
在一些实施例中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所描述的纳米结构、本文所描述的药物组合物或本文所描述的疫苗。
在一些实施例中，本公开描述了本文所描述的纳米结构、本文所描述的药物组合物或本文所描述的疫苗用于本文所描述的任何方法的方法或作为药物的用途。
在一些实施例中，本公开提供了用于本文所描述的方法或作为药物的本文所描述的纳米结构、本文所描述的药物组合物或本文所描述的疫苗。
附图说明
图1A示出了根据本公开的基于蛋白质的病毒样颗粒(pbVLP)的说明性实施例。大肠杆菌中生成的纳米颗粒五聚体与抗原和三聚体的融合物结合，组装成pbVLP。
图1B示出了pbVLP和pbVLP组分(G蛋白未示出)的另外的说明性实施例。
图2示出了用于大肠杆菌菌株筛选的可溶性和不可溶性级分的SDS-PAGE。菌株ICXB01-ICBX025、ICXB-027和ICXB-028在SDS-PAGE上运行。CBM179、CBM163和CBM181表示未转化的对照大肠杆菌菌株。
图3示出了从实例1中生成的包涵体收集的上清液的代表性DEAE琼脂糖纯化运行的色谱图。
图4示出了代表性CHT介质纯化运行的色谱图。
图5示出了随着尿素浓度的增加，I53-50B提取物的非还原性SDS-PAGE。I53-50B以50mM尿素开始提取，并且以8M尿素结束。
图6示出了包涵体洗涤步骤的非还原性SDS PAGE。用一种指定的洗涤缓冲剂洗涤测试样品，所有这些均在PBS背景中。对照不包含洗涤步骤，而是直接进行提取。IPA＝异丙醇
图7示出了通过凝胶色谱法组装二十面体纳米结构(11.4分钟。保留时间)。过量compA运行17.3分钟。未组装compB(如果存在)运行22分钟
图8示出了组装的纳米结构的非还原性SDS PAGE。50A-OG＝compA储备(未与抗原融合)；20181112＝compB储备(未与抗原融合)；测试组装＝SEC纯化的级分；20181030＝compB；1030测试组装＝compB；1008池＝compB。
图9示出了本文公开的用于表达蛋白质、采集宿主细胞、裂解细胞、分离和洗涤包涵体以及纯化蛋白质的方法的实施例的流程图。
图10示出了compA和compB蛋白的最近邻邻接树。
图11示出了用于制造compB的实施例的流程图。MCB＝主细胞库(批号20-0158，部件号712801)
图12示出了大肠杆菌表达菌株IVXB30中I53-dn5A表达的SDS-PAGE分析。用含有I53-dn5A阅读框的pCYT13转化大肠杆菌菌株CBM179后，在phoA启动子的控制下评估I53-dn5A的生产。CBM179：缺乏I53-dn5A阅读框的对照大肠杆菌菌株；IVXB30：含有I53-dn5A阅读框的大肠杆菌生产菌株；Sol：采集大肠杆菌生产培养物后生成的可溶性级分；Insol：采集大肠杆菌生产培养物后生成的不可溶性级分。
具体实施方式
本发明涉及用于重组生产组分B(compB)蛋白的方法，所述蛋白旨在用于组装基于蛋白质的病毒样颗粒(pbVLP)。
与用于表达和纯化compB蛋白的已知方法不同，本公开的方法实现了从重组蛋白表达系统的不可溶性级分(包涵体)以高产率和纯度生产compB蛋白。先前的方法需要一定浓度的增溶剂，这会导致包涵体中蛋白质的部分变性和重新折叠。如本文所示，compB蛋白可在细菌细胞中表达并从包涵体中纯化。所述方法表明，纯化不需要在溶解后对compB蛋白进行变性或重新折叠步骤。
定义
本文中的所有出版物、专利和专利申请(包含任何附图和附录)出于所有目的以全文引用的方式并入，在程度上就像每个单独的出版物、专利或专利申请、附图或附录被特别地和单独地指出以出于所有目的以全文引用的方式并入相同。
术语“病毒样颗粒”或“VLP”是指类似病毒但非传染性的分子组装，其显示病毒蛋白或糖蛋白的抗原蛋白或其抗原片段。“基于蛋白质的VLP”是指由蛋白质或糖蛋白形成且基本上不含其它组分(例如，脂质)的VLP。基于蛋白质的VLP可以包含翻译后修饰和化学修饰，但要与胶束VLP和通过从活的或活的灭活的病毒制剂中提取病毒蛋白质而形成的VLP区分开来。术语“设计的VLP”是指包括一种或多种通过计算蛋白质设计生成的多肽的VLP。说明性设计的VLP是包括图1B所描绘的纳米结构的VLP。术语“对称VLP”是指具有对称核的基于蛋白质的VLP，如图1B所示。这些包含但不限于设计的VLP。例如，蛋白质铁蛋白已用于使用天然存在的铁蛋白序列生成对称、基于蛋白质的VLP。基于铁蛋白的VLP与设计的VLP的区别在于，除了将病毒蛋白融合到铁蛋白分子之外，不需要蛋白质工程化来从铁蛋白形成对称VLP。蛋白质设计方法可以用于基于模板结构(例如，沉积在蛋白质数据库中的结构)或从头(即通过计算设计具有期望的结构但与天然存在的蛋白质几乎没有同源性的新蛋白质)生成类似的单组分和双组分纳米结构。此类单组分和双组分纳米结构然后可以用作设计的VLP的核。
术语“二十面体颗粒”是指具有二十面体对称核的设计的pbVLP(例如，表1中标记为I53和I52的颗粒)。I53是指由五聚体和三聚体构建的二十面体颗粒。I52是指由五聚体和二聚体构建的二十面体颗粒。T33是指由两组三聚体构建的四面体颗粒。T32是指由三聚体和二聚体构建的四面体颗粒。
术语“多肽”是指通过肽键和任选地一种或多种翻译后修饰(例如，糖基化)和/或其它修饰(包含但不限于用作标志物(如荧光标签或佐剂)的多肽部分的缀合)连接的一系列氨基酸残基。
术语“变体”是指相对于参考多肽具有一个或多个插入、缺失或氨基酸取代，但保留了参考蛋白的一种或多种特性的多肽。
术语“功能变体”是指表现出与参考多肽相同或相似功能作用的变体。例如，多聚化结构域的功能变体能够以与参考多聚化结构域相同的程度或相似的程度促进多聚化，和/或能够与参考多聚化结构域相同的同源多聚化结构域进行多聚化。
术语“片段”是指与参考多肽相比具有一个或多个N端或C端截短的多肽。
术语“功能片段”是指片段的功能变体。
术语“氨基酸取代”是指用另一个氨基酸残基取代序列中的单个氨基酸。使用氨基酸取代的缩写的标准形式。例如，V94R是指用精氨酸(R)取代参考序列中的缬氨酸(V)。缩写Arg94是指相对于参考序列，其中第94个残基是精氨酸(Arg)的任何序列。
术语“螺旋”(“helix”或“helical”)是指已知发生或预测要发生的多肽中的α-螺旋二级结构。例如，当计算建模表明序列可能采用螺旋构象时，序列可以被描述为螺旋。
术语“组分”是指能够在适当条件下组装成病毒样颗粒的蛋白质或蛋白质复合物(例如，包括多三聚化结构域的抗原或多肽)。“组分A”或“compA”和“组分B”或“compB”是指能够组装以形成本文所描述的pbVLP的两种蛋白质。CompA和compB能够独立地形成如本文所描述的用于组装pbVLP的二聚体、三聚体或五聚体结构。在一些实施例中，compA与抗原连接以形成融合蛋白。
术语“药学上可接受的赋形剂”意指对于在动物或人类体内使用是生物学或药理学上相容的赋形剂，并且可以意指被联邦或州政府的管理机构批准的或者在《美国药典(U.S.Pharmacopeia)》或其它普遍认可的药典中列出的用于动物并且更特别地用于人类的赋形剂。
术语“制造”是指以任何规模生产重组多肽或病毒样颗粒，包含至少25-mL、50-mL、1-L、1,000-L、50,000-L或更大规模。
术语“培养”和“培养基”是指标准细胞培养和重组蛋白表达技术。
术语“宿主细胞”是指能够用于表达重组多肽的任何细胞。
术语“混合”是指将两种溶液接触以允许溶液混合。
术语“纯化”是指将分子与组合物中存在的其它物质分离。多肽可以通过亲和性(例如，抗体或标签，例如，使用His标签捕获树脂)、通过电荷(例如，离子交换色谱法)、通过大小(例如，制备超速离心、尺寸排阻色谱法)或其它方式纯化。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指多于约100个核苷酸的(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的核苷酸的聚合物形式。因此，此术语包含但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为“寡聚物(oligomer)”或“寡聚物(oligo)”，并且可以从基因中分离出来，或通过本领域已知的方法化学合成。应了解术语“多核苷酸”和“核酸”包含单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸(如果所描述的实施例适用的话)。
术语“同一性”、“同一”、“序列同一性”是指在两个多核苷酸或多肽序列之间相同且相对位置相同的碱基或氨基酸的百分比。因此，一个多核苷酸或多肽序列与另一多核苷酸或多肽序列相比具有一定百分比的序列同一性。为了进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。术语“参考序列”是指与测试序列进行比较的分子。
用于比较和确定序列同一性百分比的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如分别通过以下进行：Needleman和Wunsch的同源性比对算法,(1970)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.48:443，通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法，(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA)》85:2444的相似性搜索法；这些算法的计算机化实施例(威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学计算机组(GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,WI)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；手动比对和视觉检查(参见例如，Brent等人,(2003)《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》；通过使用本领域已知的算法，包含BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于以下中：Altschul等人,(1977)《核酸研究(Nuc.Acids Res.)》25:3389-3402；以及Altschul等人,(1990),《分子生物学杂志》215:403-410。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)公开获得。
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定值，例如，测量系统的局限性。例如，“约”可以意指在1个或大于1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指至多20％、至多10％或至多5％的正或负范围。
除非另有说明，否则本文中引用的所有重量百分比(即“重量％”和“wt.％”和w/w)均相对于药物组合物的总重量进行测量。
如本文所使用的，“基本上”或“基本”是指动作、特性、性质、状态、结构、项目或结果的完全或几乎完全的范围或程度。例如，“基本上”封闭的对象将会意味着对象被完全封闭或几乎完全封闭。在某些情况下，与绝对完全性的偏差的精确允许程度可以取决于具体的上下文。然而，一般而言，完成的接近度将是具有如获得了绝对且全部完成那样相同的总体结果。当以否定含义使用以指代动作、特性、性质、状态、结构、项目或结果的完全或几乎完全缺失时，“基本上”的使用同样适用。例如，“基本上不含”其它活性剂的组合物要么完全缺乏其它活性剂，要么几乎完全缺乏其它活性剂，其效果与完全缺乏其它活性剂的情况相同。换言之，“基本上不含”成分或元素或另一种活性剂的组合物仍然可以含有此类物质，只要其没有可测量效果。
如本文所使用的，术语“变性”是指折叠的多肽分子结构的变化，其导致所述多肽失去所有或基本上所有三级结构，或在错误折叠蛋白的情况下，从聚集形式转化为可溶性、未折叠形式。术语“变性的”还指在蛋白质的天然三维结构被破坏的条件下溶解包涵体后，作为重组生产过程的产物获得的表达的蛋白质的生物非活性形式。
术语“重新折叠”(或“复性”)是指使变性的蛋白质恢复其天然构象和生物活性的过程。
如本文所使用的，术语“回收”是指通过将物质与制剂中的其它物质分离，例如通过离心和/或一个或多个洗涤步骤，以获得物质(例如，包涵体和/或所关注的蛋白质)。
如本文所使用的，术语“包涵体”是指含有存在于转化的宿主细胞的细胞质中的重组蛋白的不可溶性聚集体。这些在显微镜下表现为亮点，并且可以通过从细胞的细胞质中分离包涵体来回收。在现有技术中，包涵体通常使用高浓度的离液剂(例如>8M的尿素和/或>3M的胍盐)；强离子洗涤剂(例如，N-月桂酰基肌氨酸)；和/或碱性pH溶解。根据本公开，较低浓度的这些试剂可以用于温和溶解。
如本文所使用的，术语“纳米结构”包含对称重复的、非天然的、非共价的蛋白质-蛋白质界面，所述界面将第一组分分子(例如compA)和第二组分分子(例如compB)定向成组装的结构。纳米结构包含但不限于递送媒剂，因为纳米结构可以封装所关注的分子和/或第一和/或第二蛋白质可以被修饰以结合所关注的分子(诊断、治疗、用于成像和其它应用的可检测分子等)。本公开的纳米结构非常适合于若干种应用，包含疫苗设计、治疗剂的靶向递送和生物能源。
如本文所使用的，术语“增溶”是指通过破坏生物样品的细胞将生物样品中包括的蛋白质转移到溶剂(如水性溶剂)中。如本文所使用的，“增溶(solubilization)”或“增溶(solubilize)”可以与“溶解”或“提取”互换使用。术语“增溶”还指蛋白质从包涵体释放，例如，通过溶解包涵体。
以下说明包含对理解本发明可能有用的信息。这并非承认本文所提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或并非承认任何具体或隐含引用的公开是现有技术。
实施例
本公开证明了来自包涵体的基于蛋白质的VLP的组分B(compB)蛋白的表达。令人惊奇的是，根据本公开的方法产生的compB蛋白至少与表达到宿主细胞的可溶性级分中并从其中纯化的compB蛋白一样可溶且组装感受态，或更高。
疫苗接种是一种治疗方式，用于预防或降低感染各种感染原(包含细菌、病毒和寄生虫)的严重程度。新疫苗的开发具有重要的商业和公共健康影响。具体地，莱姆病、百日咳、疱疹病毒、正粘病毒、副粘病毒、肺病毒、丝状病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、冠状病毒和疟疾是已经存在、正在开发或可能期望疫苗的感染原。
亚单位疫苗是由分离的抗原制成的疫苗，通常是在细菌、昆虫或哺乳动物细胞宿主中重组表达的蛋白质。典型地，亚单位疫苗的抗原组分选自观察到的在感染时引发天然免疫应答的感染原的蛋白质，尽管在某些情况下可以使用感染原的其它组分。用于亚单位疫苗的典型抗原包含在靶感染原表面上表达的蛋白质，如病毒表面表达的包膜糖蛋白。优选地，所述抗原是中和抗体的靶标。更优选地，所述抗原是广泛中和抗体的靶标，使得对所述抗原的免疫应答覆盖针对感染原的多种菌株的免疫。在一些情况下，通过对抗原表位的贡献或通过空间位阻引导对抗原上特定表位的免疫应答，与亚单位疫苗N连接或O连接的聚糖也可以在疫苗接种中发挥重要作用。响应于疫苗接种的免疫应答可以直接作用于蛋白质本身、聚糖或蛋白质和连接的聚糖两者。亚单位疫苗具有多种优点，包含其不含活病原体，这消除了有关患者被疫苗感染的担忧；其可以使用标准基因工程化技术来设计；其比其它形式的疫苗更同质；并且其可以在标准化的重组蛋白表达生产系统中使用充分表征的表达系统制造。在一些情况下，抗原可以经过基因工程化，以利于生成期望的抗体，如中和或广泛中和抗体。具体地，通过X射线晶体学、电子显微镜或核磁共振实验获得的关于所关注的抗原的结构信息可以用于指导亚单位疫苗的合理设计。
亚单位疫苗的已知限制是所引发的免疫应答有时可能弱于对其它类型疫苗(如全病毒、活疫苗或减毒活疫苗)的免疫应答。设计的和/或基于蛋白质的VLP疫苗有潜力利用亚单位疫苗的优点，同时通过以对称有序阵列显示抗原的多价来增加疫苗诱导的免疫应答的效力和广度。在本公开中，基于蛋白质的VLP与纳米颗粒疫苗不同，因为本领域中已使用术语“纳米颗粒疫苗”来指代基于蛋白质的或基于糖蛋白的疫苗(参见例如，美国专利第US 9,441,019号)、聚合脂质体(参见例如，美国专利第7,285,289号)、表面活性剂胶束(参见例如美国专利公开第US 2004/0038406 A1号)和合成可生物降解颗粒(参见例如美国专利第US8,323,696号)。
实施例的非限制性实例在图1A中示出，其描述了与pbVLP的组分A(compA)蛋白基因融合的蛋白抗原，其任选地在宿主细胞(例如，293F细胞)中重组表达；连同在宿主细胞(例如，大肠杆菌细胞)中重组表达的组分B(compB)蛋白组装，这两个组分自组装成在二十面体核周围显示20个拷贝的蛋白抗原的pbVLP。
在一些实施例中，compA是二聚体。在一些实施例中，compA是三聚体。在一些实施例中，compA是五聚体。
在一些实施例中，compB是二聚体。在一些实施例中，compB是三聚体。在一些实施例中，compA是五聚体。
在一些实施例中，compA是二聚体，所述二聚体选自SEQ ID No:13、17或41。在一些实施例中，compA是三聚体，所述三聚体选自SEQ ID No:5、7、9、19、21、25、26、29、30、31、37、39、43、45、47、49或51。在一些实施例中，compA是五聚体，所述五聚体选自SEQ ID No:3、11、15、23或35。
在一些实施例中，compB是二聚体，所述二聚体选自SEQ ID No:12、16、20或22。在一些实施例中，compB是三聚体，所述三聚体选自SEQ ID No:4、18、24、34、36、42、44、46、48或50。在一些实施例中，compB是五聚体，所述五聚体选自SEQ ID No:2、6、8、10、14、27、28、32、33、38或40。
在一些实施例中，compA包括与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少至少99％或100％同一性的多肽序列：SEQ IN NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、29-31、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59。
在一些实施例中，compB包括与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列：SEQ IN NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、27、28、32-34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58。
在一些实施例中，compA和Comp B形成“I53”架构。I53架构是12个五聚构建单元和二十个三聚构建单元的组合，其沿着五倍和三倍二十面体对称轴排列，如Bale等人,《科学》353:389-394(2016)中所描述的。在一些实施例中，compA是I53五聚体。在一些实施例中，compA是I53三聚体。在一些实施例中，compB是I53五聚体。在一些实施例中，compB是I53三聚体。
在一些实施例中，compA和compB形成“I52”架构。I52架构由十二个五聚体和三十个二聚体沿其对应的二十面体对称轴形成。在一些实施例中，compA是I52五聚体。在一些实施例中，compA是I52二聚体。在一些实施例中，compB是I52五聚体。在一些实施例中，compB是I52二聚体。
在一些实施例中，compA和compB形成“I32”架构。I32架构是二十个三聚体和三十个二聚体的组合，每个所述三聚体和二聚体沿其对应的二十面体对称轴排列。在一些实施例中，compA是I32三聚体。在一些实施例中，compA是I32二聚体。在一些实施例中，compB是I32三聚体。在一些实施例中，compB是I32二聚体。
在一些实施例中，compA和compB的混合物形成二十面体纳米结构。在一些实施例中，compA和compB的混合物形成四面体纳米结构。在一些实施例中，compA和compB的混合物形成八面体纳米结构。
在一些实施例中，小分子药物(即MW小于700)、生物药物(即从细菌、酵母、细胞或器官分离的药物，尤其包含重组多肽)或生物合成药物(例如，适体、反义核酸、siRNA、重组核酸、核苷类似物、重组多肽、多肽药物、抗原等)与compA融合。
在一些实施例中，抗原与compA融合。
在一些实施例中，compA和compB形成纳米结构。
在一些实施例中，通过将选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、29-31、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59之一的compA和选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、27、28、32-34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58之一的compB组合形成纳米结构。
在一些实施例中，所述纳米结构由分别与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的compA和compB多肽序列形成：
(i)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
(ii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
(iii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:24；
(iv)SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:4；
(v)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；
(vi)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
(vii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:27；
(viii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:28；
(ix)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:6；
(x)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27；
(xi)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28；
(xii)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:6；
(xiii)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；
(xiv)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28；
(xv)SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38；
(xvi)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
(xvii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:32；
(xviii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:33；
(xix)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:34；
(xx)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:8；
(xxi)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:32；
(xxii)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:33；
(xxiii)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34；
(xxiv)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:8；
(xxv)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32；
(xxvi)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:33；
(xxvii)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34；
(xxviii)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:8；
(xxix)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；
(xxx)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33；
(xxxi)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34；
(xxxii)SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；
(xxxiii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
(xxxiv)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；
(xxxv)SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；
(xxxvi)SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；
(xxxvii)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
(xxxviii)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；
(xxxix)SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；
(xl)SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42；
(xli)SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；
(xlii)SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46；
(xliii)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；
(xliv)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50；
(xlv)SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:44；
(xlvi)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:52；
(xlvii)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:54；
(xlviii)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:56；以及
(xlix)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:58。
在一些实施例中，compA包括螺旋延伸。在一些实施例中，螺旋延伸位于compA的N末端。在一些实施例中，螺旋延伸是EKAAKAEEAARK(SEQ ID NO:62)。
在一些实施例中，compB包括螺旋延伸。在一些实施例中，螺旋延伸位于compB的N末端。在一些实施例中，螺旋延伸是EKAAKAEEAARK(SEQ ID NO:62)。
在一些实施例中，纳米结构是pbVLP。在一些实施例中，pbVLP是疫苗。
本公开的其它compA/compB组装在图1B中示出。在一些实施例中，pbVLP适用于显示至多8个三聚体；8个三聚体和12个二聚体；6个四聚体和12个二聚体；6个四聚体和8个三聚体；20个三聚体和30个二聚体；4个三聚体和6个二聚体；4个第一三聚体和4个第二三聚体或8个三聚体；12个五聚体和20个三聚体；或12个五聚体和30个二聚体；或4个三聚体。在一些情况下，对称轴之一不用于抗原显示，因此，在一些实施例中，pbVLP适用于显示至多8个三聚体；12个二聚体；6个四聚体；20个三聚体；30个二聚体；4个三聚体；6个二聚体；8个三聚体；或12个五聚体。在一些情况下，显示单体抗原，并且因此，pbVLP适用于显示至多12个、24个、60个或70个单体抗原。在一些情况下，pbVLP包括混合的多个多肽，使得pbVLP的核的相同多肽显示不同的抗原或不显示抗原。因此，取决于多肽的比率，pbVLP在一些情况下适用于显示介于1个与130个之间的抗原(例如，在I52颗粒上)，其中显示的每个抗原可以是相同的或可以是混合群体的不同成员，与所选择的任何比率成比例。抗原可以在重组表达系统中共表达，并且在纯化之前自组装。非限制性示例性pbVLP在以下中提供：Bale等人,《科学》353:389-94(2016)；Heinze等人,《物理化学期刊(J.Phys.Chem B.)》120:5945-5952(2016)；King等人,《自然(Nature)》510:103-108(2014)；以及King等人,《科学》336:1171-71(2012)。
本公开的compA和compB蛋白可以具有各种氨基酸序列中的任一种。美国专利公开第US 2015/0356240 A1号描述了用于设计蛋白质组装的各种方法。如美国专利公开第US2016/0122392A1号和国际专利公开第WO 2014/124301A1号中所描述的，SEQ IDNO:1-51的分离的多肽被设计用于其成对自组装以形成pbVLP(如二十面体颗粒)的能力。所述设计涉及为多肽对的每个成员设计合适的界面残基，所述多肽对可以被组装以形成pbVLP。如此形成的pbVLP包含对称重复的、非天然的、非共价的多肽-多肽界面，所述界面将第一组装和第二组装定向到pbVLP中，如具有二十面体对称的一个。因此，在一些实施例中，compA和compB(即，pbVLP核的两个多肽)选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-51。在每种情况下，存在于全长蛋白中但通常被去除以进行融合的N-末端甲硫氨酸残基不包含在序列中。在各种实施例中，从N末端缺失一个或多个另外的残基和/或向N末端添加另外的残基(例如，以形成螺旋延伸)。如图10所示，下面公开的序列分为若干个相关蛋白序列家族。
表1
Figure BDA0004019667220000171
Figure BDA0004019667220000181
Figure BDA0004019667220000191
Figure BDA0004019667220000201
Figure BDA0004019667220000211
Figure BDA0004019667220000221
Figure BDA0004019667220000231
表2
Figure BDA0004019667220000232
Figure BDA0004019667220000241
Figure BDA0004019667220000251
表1和表2提供了本公开的实施例的compA和compB的氨基酸序列。在每种情况下，序列对一起形成具有二十面体对称的I53多聚体。表1中的右列鉴定了每个示例性多肽中的残基数量，所述示例性多肽被鉴定为存在于所得组装的病毒样颗粒的界面处(即：“鉴定的界面残基”)。可以看出，SEQ ID NO:1-34的示例性多肽的界面残基数量范围为4至13。在一些实施例中，compA和compB具有4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个界面残基。在各种实施例中，compA和compB包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自由以下组成的组的多肽的氨基酸序列相比，在其长度上至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，并且与至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个鉴定的界面位置相同(取决于给定多肽的界面残基数量)：SEQIDNO:1-34。SEQ ID NO:35-51表示来自本公开的实施例的compA和compB的其它氨基酸序列。在其它实施例中，compA和/或compB包括氨基酸序列，所述氨基酸与选自由以下组成的组的多肽的氨基酸序列相比，在其长度上至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且与鉴定的界面位置至少20％、25％、33％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％相同：SEQ ID NO:1-51。
如表2所示，compB蛋白具有相似的分子量(MW)、等电点(pI)和疏水性残基百分比，表明其可以使用相似的方法表达和纯化。
与一般蛋白质的情况一样，预期多肽能够容忍设计的序列中的一些变化，而不会破坏随后组装成病毒样颗粒的：特别是当此类变化包括保守氨基酸取代时。如本文所使用的，“保守氨基酸取代”意指：疏水性氨基酸(Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、Ile、Leu)只能被其它疏水性氨基酸取代；具有庞大侧链的疏水性氨基酸(Phe、Tyr、Trp)只能被具有庞大侧链的其它疏水性氨基酸取代；带正电荷侧链的氨基酸(Arg、His、Lys)只能被带正电荷侧链的其它氨基酸取代；带负电荷侧链的氨基酸(Asp、Glu)只能被带负电荷侧链的其它氨基酸取代；并且具有极性不带电侧链(Ser、Thr、Asn、Gln)的氨基酸只能被具有极性不带电侧链的其它氨基酸取代。
在本发明的pbVLP的各种实施例中，compA和compB，或反之亦然，包括具有选自以下对或其修饰的版本的氨基酸序列的多肽(即本发明的多肽所公开的允许的修饰：包括氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列在其长度上与SEQ ID NO所示的氨基酸序列至少有75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％相同，和/或至少在一个鉴定的界面位置处相同)：
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2(I53-34A和I53-34B)；
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4(I53-40A和I53-40B)；
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:24(I53-40A和I53-40B.1)；
SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:4(I53-40A.1和I53-40B)；
SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36(I53-40A属和I53-40B属)；
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6(I53-47A和I53-47B)；
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:27(I53-47A和I53-47B.1)；
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:28(I53-47A和I53-47B.1NegT2)；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:6(I53-47A.1和I53-47B)；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27(I53-47A.1和I53-47B.1)；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28(I53-47A.1和I53-47B.1NegT2)；
SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:6(I53-47A.1NegT2和I53-47B)；
SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27(I53-47A.1NegT2和I53-47B.1)；
SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28(I53-47A.1NegT2和I53-47B.1NegT2)；
SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38(I53-47A属和I53-47B属)；
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8(I53-50A和I53-50B)；
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:32(I53-50A和I53-50B.1)；
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:33(I53-50A和I53-50B.1NegT2)；
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:34(I53-50A和I53-50B.4PosT1)；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:8(I53-50A.1和I53-50B)；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:32(I53-50A.1和I53-50B.1)；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:33(I53-50A.1和I53-50B.1NegT2)；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34(I53-50A.1和I53-50B.4PosT1)；
SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:8(I53-50A.1NegT2和I53-50B)；
SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32(I53-50A.1NegT2和I53-50B.1)；
SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:33(I53-50A.1NegT2和I53-50B.1NegT2)；
SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34(I53-50A.1NegT2和I53-50B.4PosT1)；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:8(I53-50A.1PosT1和I53-50B)；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(I53-50A.1PosT1和I53-50B.1)；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33(I53-50A.1PosT1和I53-50B.1NegT2)；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34(I53-50A.1PosT1和I53-50B.4PosT1)；
SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40(I53-50A属和I53-50B属)；
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10(I53-51A和I53-51B)；
SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12(I52-03A和I52-03B)；
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14(I52-32A和I52-32B)；
SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16(I52-33A和I52-33B)
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18(I32-06A和I32-06B)；
SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20(I32-19A和I32-19B)；
SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22(I32-28A和I32-28B)；
SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24(I53-40A.1和I53-40B.1)；
SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42(T32-28A和T32-28B)；
SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44(T33-09A和T33-09B)；
SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46(T33-15A和T33-15B)；
SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48(T33-21A和T33-21B)；
SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50(T33-28A和T32-28B)；以及
SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:44(T33-31A和T33-09B(也称为T33-31B))，其中以“A”结尾的那些是compA，并且以“B”结尾的那些是compB(例如I53-34A是compA，并且I53-34B是compB)。
在本公开的基于蛋白质的VLP中有用的设计的蛋白质复合物的非限制性实例包含以下中所公开的那些：美国专利第9,630,994号；国际专利公开第WO 2018187325A1号；美国专利公开第2018/0137234A1号；美国专利公开第2019/0155988A2号，所述文献中的每个文献均以其整体并入本文。
在本公开的pbVLP的各种实施例中，compA和compB包括具有选自以下对或其修饰的版本的氨基酸序列的多肽(即本发明的多肽所公开的允许的修饰：包括氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列在其长度上与SEQ ID NO所示的氨基酸序列至少有75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％相同，和/或至少在一个鉴定的界面位置处相同)：
SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53(T33_dn2A和T33_dn2B)；
SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55(T33_dn5A和T33_dn5B)；
SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57(T33_dn10A和T33_dn10B)；或
SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59(I53_dn5A和I53_dn5B)，
其中以“dn5B”结尾的那些是compA，并且以“dn5A”结尾的那些是compB(例如I53_dn5B是compA，并且dn5A是compB)。
T33_dn2A(SEQ ID NO:52)
NLAEKMYKAGNAMYRKGQYTIAIIAYTLALLKDPNNAEAWYNLGNAAYKKGEYDEAIEAYQKALELDPNNAEAWYNLGNAYYKQGDYDEAIEYYKKALRLDPRNVDAIENLIEAEEKQG
T33_dn2B(SEQ ID NO:53)
EEAELAYLLGELAYKLGEYRIAIRAYRIALKRDPNNAEAWYNLGNAYYKQGDYREAIRYYLRALKLDPENAEAWYNLGNALYKQGKYDLAIIAYQAALEEDPNNAEAKQNLGNAKQKQG
T33_dn5A(SEQ ID NO:54)
NSAEAMYKMGNAAYKQGDYILAIIAYLLALEKDPNNAEAWYNLGNAAYKQGDYDEAIEYYQKALELDPNNAEAWYNLGNAYYKQGDYDEAIEYYEKALELDPNNAEALKNLLEAIAEQD
T33_dn5B(SEQ ID NO:55)
TDPLAVILYIAILKAEKSIARAKAAEALGKIGDERAVEPLIKALKDEDALVRAAAADALGQIGDERAVEPLIKALKDEEGLVRASAAIALGQIGDERAVQPLIKALTDERDLVRVAAAVALGRIGDEKAVRPLIIVLKDEEGEVREAAAIALGSIGGERVRAAMEKLAERGTGFARKVAVNYLETHK
T33_dn10A(SEQ ID NO:56)
EEAELAYLLGELAYKLGEYRIAIRAYRIALKRDPNNAEAWYNLGNAYYKQGDYDEAIEYYQKALELDPNNAEAWYNLGNAYYKQGDYDEAIEYYEKALELDPENLEALQNLLNAMDKQG
T33_dn10B(SEQ ID NO:57)
IEEVVAEMIDILAESSKKSIEELARAADNKTTEKAVAEAIEEIARLATAAIQLIEALAKNLASEEFMARAISAIAELAKKAIEAIYRLADNHTTDTFMARAIAAIANLAVTAILAIAALASNHTTEEFMARAISAIAELAKKAIEAIYRLADNHTTDKFMAAAIEAIALLATLAILAIALLASNHTTEKFMARAIMAIAILAAKAIEAIYRLADNHTSPTYIEKAIEAIEKIARKAIKAIEMLAKNITTEEYKEKAKKIIDIIRKLAKMAIKKLEDNRT
I53_dn5A(SEQ ID NO:58)
KYDGSKLRIGILHARWNAEIILALVLGALKRLQEFGVKRENIIIETVPGSFELPYGSKLFVEKQKRLGKPLDAIIPIGVLIKGSTMHFEYICDSTTHQLMKLNFELGIPVIFGVLTCLTDEQAEARAGLIEGKMHNHGEDWGAAAVEMATKFN
I53_dn5B(SEQ ID NO:59)
EEAELAYLLGELAYKLGEYRIAIRAYRIALKRDPNNAEAWYNLGNAYYKQGRYREAIEYYQKALELDPNNAEAWYNLGNAYYERGEYEEAIEYYRKALRLDPNNADAMQNLLNAKMREE
表达和纯化方法
异源蛋白在大肠杆菌中的过度表达经常导致聚集和沉积在致密的不可溶性颗粒中，也称为包涵体。虽然在包涵体中的表达可以提高所得重组蛋白的纯度，但众所周知，为了保持蛋白质期望的三级结构，通常优选从细胞的可溶性级分纯化蛋白质。当蛋白质在包涵体中表达时，蛋白质的变性和重新折叠被认为是至关重要的。因此，增溶通常在高浓度的离液剂(如尿素或盐酸胍)中进行，以达到完全展开。添加还原剂，如2-巯基乙醇(β-ΜΕ)、二硫苏糖醇(DTT)或1-单硫代甘油(MTG)以还原非天然分子间和分子内二硫键，并且保持半胱氨酸处于还原状态。
相反，目前公开的方法使用低浓度的离液剂从包涵体释放compB蛋白而不使其变性。因此，本文提供了一种制备纳米结构的方法，包括用增溶溶液溶解来自包涵体的重组组分B(compB)蛋白，从而生成包括产物compB蛋白的产物样品。在一些实施例中，所述方法不包括使所述compB蛋白变性和/或不包括重新折叠所述compB蛋白。
可以使用各种重组表达系统生成包涵体。可以使用大肠杆菌或其它细菌表达系统。在一些实施例中，大肠杆菌是菌株K-12。在一些实施例中，大肠杆菌是菌株B。在一些实施例中，大肠菌是菌株W3110 ompT。
本发明人已经确定基于T7和phoA的表达系统都能够生成合适的compB蛋白产率。然而，在一些情况下，基于phoA的表达系统以更高的产率生成compB蛋白。本文引用的参考文献中提供了合适的表达技术，所述参考文献通过引用并入。在一些实施例中，表达在低温下进行，因为本发明人发现在约30℃下的表达在包涵体中生成compB蛋白。在一些实施例中，所述细菌细胞在低于约33℃下，任选地在约15℃至约33℃下或在约17℃至约30℃下，优选地在约30℃下培养。在一些实施例中，所述细菌细胞在约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃或约33℃下培养。
宿主(例如，细菌细胞)包括编码compB蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸操作性地连接到启动子。启动子可以是phoA启动子或适合于重组蛋白表达的任何其它启动子。在一些实施例中，所述启动子是phoA启动子。在一些实施例中，所述启动子是T7启动子。在一些实施例中，所述启动子是除T7启动子以外的启动子。
可以使用本领域已知的任何技术采集包涵体，包含但不限于宿主细胞的化学和/或物理裂解。在一些实施例中，所述方法包括在裂解溶液中裂解所述细菌细胞，其中所述裂解溶液基本上不含促进包涵体溶解度的试剂；以及回收所述包涵体。在一些实施例中，所述裂解溶液基本上不含洗涤剂。可以通过离心和/或过滤从宿主细胞的细胞质中纯化包涵体。
采集包涵体后，使用增溶溶液溶解compB蛋白。可以通过搅拌或其它方式混合溶液(例如通过涡旋溶液或超声处理溶液)来促进溶解。可以使用各种增溶溶液，包含包括尿素或盐酸胍的溶液。在一些实施例中，增溶溶液包括尿素，任选地尿素浓度为0.05M至3M。尿素浓度可以是0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2.0M、2.1M、2.2M、2.3M、2.4M、2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M或3.0M。在一些情况下，增溶溶液包括缓冲剂和/或温和洗涤剂，其可以任选地是相同或不同的赋形剂。合适的缓冲剂包含Tris缓冲剂、组氨酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)缓冲剂或其组合，如磷酸盐-柠檬酸盐缓冲剂。CHAPS还具有充当表面活性剂的优点。
增溶溶液可以是处于预定pH(如中性pH)的缓冲溶液。增溶溶液的最佳pH可以通过在各种pH值下测试程序以确定最佳值来确定，例如5至6、6至7、7至8或8至9的pH。许多compB蛋白的合适的pH为pH 7.4。在增溶步骤之前，可以任选地洗涤包涵体。在一些实施例中，在增溶步骤之前洗涤包涵体。可以使用各种洗涤溶液。在一些情况下，洗涤溶液包括浓度低于增溶溶液的离液剂，例如尿素浓度小于150mM，任选地50mM至150mM。在一些实施例中，离液剂选自尿素、盐酸胍和正丙醇。。在一些实施例中，离液剂是尿素。在一些实施例中，尿素浓度小于150mM、小于140mM、小于130mM、大于120mM、小于110mM、小于100mM、小于90mM、小于80mM、小于70mM、小于60mM或小于50mM。在一些实施例中，离液剂是盐酸胍。在一些实施例中，盐酸胍的浓度小于3M。在一些实施例中，盐酸胍小于3M、小于2.5M、小于2M、小于1.5M、小于1M、小于0.5M或小于0.1M。在一些实施例中，离液剂是正丙醇。在一些实施例中，正丙醇的浓度不超过5％。在一些实施例中，正丙醇的浓度小于5％。在一些实施例中，正丙醇的浓度不超过5％。在一些实施例中，正丙醇的浓度小于5％。一旦增溶，可以使用多种生化技术进一步纯化compB蛋白。有利地，采用去除宿主细胞蛋白(HCP)、内毒素和/或其它杂质的纯化程序。特别适合用于纯化compB蛋白的是所谓的正交纯化策略。作为非限制性实例，离子交换色谱法可以与混合模式色谱法步骤相结合。
在一些实施例中，所述方法包括使所述compB蛋白与阴离子交换树脂，任选地弱阴离子交换树脂，任选地二乙氨基乙基(DEAE)缀合树脂接触；并且使用洗脱溶液从所述树脂中洗脱所述compB蛋白。在一些实施例中，所述方法包括使compB蛋白与阴离子交换树脂接触。在一些实施例中，阴离子交换树脂是弱阴离子交换树脂。在一些实施例中，阴离子交换树脂是二乙氨基乙基(DEAE)缀合树脂。在一些实施例中，阴离子交换树脂是季胺(Q)强阴离子交换树脂。在一些实施例中，所述方法包括使用阴离子交换色谱法纯化compB蛋白(参见例如
Figure BDA0004019667220000311
)。
在一些实施例中，所述方法包括在洗脱步骤之前用柱洗涤溶液洗涤阴离子交换树脂。可以使用各种柱洗涤溶液。本文公开了包括两性离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂的柱洗涤溶液。非离子表面活性剂可以是Triton X-100或其等效物。两性离子表面活性剂可以是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)或其等效物。在一些实施例中，所述两性离子表面活性剂选自CHAPSO(3-(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基)-2-羟基-1-丙磺酸酯)、LDAO、DDMAB和任何
Figure BDA0004019667220000312
表面活性剂。
可以使用盐梯度实现从阴离子交换树脂的洗脱。可以使用逐步或连续梯度。在一些实施例中，所述洗脱溶液包括NaCl浓度为50mM至800mM的氯化钠(NaCl)，例如100mM、200mM、250mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM或800mM。
在一些实施例中，所述方法包括用混合模式树脂纯化compB蛋白。合适的混合模式介质包含陶瓷羟基磷灰石(CHT)树脂。羟基磷灰石是磷酸钙的一种形式，长期用于蛋白质和DNA的色谱分离。(
Figure BDA0004019667220000313
等人,《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》313(2003)176–178。)蛋白质对羟基磷灰石的吸附涉及阴离子和阳离子两者的交换。蛋白质通常吸附在低浓度(10mM至25mM)的磷酸盐缓冲剂中，但是一些酸性蛋白质仅在水、盐水或非磷酸盐缓冲剂上样时才被吸附。蛋白质通常通过增加的磷酸盐梯度洗脱，但是Ca2++、Mg2++或Cl-离子的梯度也是有用的，特别是对于碱性蛋白质的选择性洗脱。当使用磷酸盐时，酸性蛋白质比碱性蛋白质更容易洗脱，但是通过提高pH可以降低洗脱任何蛋白质所需的磷酸盐浓度。结合到羟基磷灰石上的蛋白质混合物可以通过一系列提高pH的磷酸盐洗涤步骤进行分馏。
在一些实施例中，所述产物compB蛋白具有至少50％的溶解度，任选地70％至95％的溶解度。在一些实施例中，所述产物compB蛋白具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的溶解度。在一些实施例中，所述产物compB蛋白具有至少70％至95％的溶解度。在一些实施例中，通过凝胶过滤色谱法，任选地使用Superose 6柱测量溶解度。
在一些实施例中，以占总蛋白质的重量比(w/w)计算，产物compB蛋白具有至少80％的纯度，任选地具有至少95％w/w的纯度。在一些实施例中，所述产物compB蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％w/w纯度。在一些实施例中，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，任选地变性SDS-PAGE测量纯度。
在一些实施例中，产物compB蛋白为至少70％w/w组装感受态，任选地为90％至98％w/w组装感受态。在一些实施例中，所述产物compB蛋白为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％w/w组装感受态。在一些实施例中，产物compB蛋白为至少70％w/w组装感受态，任选地为90％至100％w/w组装感受态。在一些实施例中，组装感受态compB蛋白的百分比被定义为当所述compB蛋白与包括过量的组分A(compA)蛋白的溶液混合时，所述产物溶液中组装成基于蛋白质的病毒样颗粒(vpVLP)的compB蛋白的以重量比(w/w)计的百分比。在一些实施例中，组装感受态compB蛋白的百分比被定义为当所述compB蛋白与包括10％过量的组分A(compA)蛋白的溶液混合时，所述产物溶液中组装成基于蛋白质的病毒样颗粒(vpVLP)的compB蛋白的百分比，以重量比(w/w)计算。
在一些实施例中，所述产物溶液包括少于50个内毒素单位/毫克总蛋白(EU/mg)，任选地5个至15个单位EU/mg。在一些实施例中，产物溶液包括小于50个单位、小于45个单位、小于40个单位、小于35个单位、小于30个单位、小于25个单位、小于20个单位、小于15个单位、小于10个单位或5个单位的EU/mg。在一些实施例中，产物溶液包括4个单位、5个单位、6个单位、10个单位、7个单位、8个单位、10个单位、11个单位、12个单位、13个单位、14个单位、15个单位或16个单位的EU/mg。
本文进一步提供了一种组合物，所述组合物包括通过本公开的任何方法产生的compB蛋白。所述组合物可以是例如至少50％可溶的，任选地70％至95％可溶的；至少80％纯，其中纯度以总蛋白质(w/w)的重量比计算，任选地至少95％w/w纯；和/或至少70％w/w组装感受态，任选地90％至100％w/w组装感受态。
可以使用本领域已知的各种缓冲剂交换技术中的任一种将compB蛋白置于最终溶液中，包含将浓缩的compB溶液稀释成最终溶液和/或渗滤/超滤(DF/UF)，例如，以连续模式。在一些实施例中，所述组合物包括一种或多种20mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲剂，任选地为20mM，和/或250mM NaCl，任选地为250mM。在一些实施例中，将所述组合物缓冲为7至8的pH，任选地7.4的pH。在一些实施例中，将所述组合物缓冲到7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH。在一些实施例中，将所述组合物缓冲到7.4的pH。在一些实施例中，所述组合物对储存和/或冻融是稳定的。在一些实施例中，所述组合物对于储存是稳定的。在一些实施例中，所述组合物对于冻融是稳定的。
示例性方法
本文提供了制备纳米结构的方法。在一些实施例中，纳米结构包括组分B(compB)蛋白。在一些实施例中，纳米结构包括组分A(compA)蛋白。在一些实施例中，纳米结构包括compA和compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括在大肠杆菌中表达compB蛋白。在一些实施例中，大肠杆菌是B菌株。在一些实施例中，大肠杆菌是K12菌株。在一些实施例中，所述方法包括从包涵体分离组分蛋白(即compA或compB)。
在一些实施例中，所述方法包括：
(i)从大肠杆菌中分离包括compB蛋白的包涵体；
(ii)使包涵体与包括离液剂的增溶溶液接触以溶解compB蛋白，其中所述离液剂以足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶的浓度提供；
(iii)使compB蛋白与阴离子交换树脂接触，并且使用洗脱溶液从树脂中洗脱compB蛋白；
(iv)纯化compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：
(i)从大肠杆菌中分离包括compB蛋白的包涵体；
(ii)使包涵体与包括第一浓度的离液剂的洗涤溶液接触，其中所述第一浓度足以在不增溶compB的情况下纯化所述包涵体；
(iii)使包涵体与包括第二浓度的离液剂的增溶溶液接触以溶解compB蛋白，其中所述浓度足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶；
(iv)使compB蛋白与阴离子交换树脂接触，并且使用洗脱溶液从树脂中洗脱compB蛋白；
(v)纯化compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：
(i)从大肠杆菌中分离包括compB蛋白的包涵体；
(ii)使包涵体与包括离液剂的增溶溶液接触以溶解compB蛋白，其中所述离液剂以足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶的浓度提供；
(iii)使compB蛋白与阴离子交换树脂接触，并且使用洗脱溶液从树脂中洗脱compB蛋白；
(iv)用混合模式树脂纯化compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：
(i)从大肠杆菌中分离包括compB蛋白的包涵体；
(ii)使包涵体与包括第一浓度的离液剂的洗涤溶液接触，其中所述第一浓度足以在不增溶compB的情况下纯化所述包涵体；
(iii)使包涵体与包括第二浓度的离液剂的增溶溶液接触以溶解compB蛋白，其中所述浓度足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶；
(iv)使compB蛋白与阴离子交换树脂接触，并且使用洗脱溶液从树脂中洗脱compB蛋白；
(v)用混合模式树脂纯化compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：
(i)从大肠杆菌中分离包括compB蛋白的包涵体；
(ii)使包涵体与包括尿素的增溶溶液接触以溶解compB蛋白，其中尿素以足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶的浓度提供；
(iii)使compB蛋白与阴离子交换树脂接触，并且使用洗脱溶液从树脂中洗脱compB蛋白；
(iv)纯化compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：
(i)从大肠杆菌中分离包括compB蛋白的包涵体；
(ii)使包涵体与包括第一浓度的尿素的洗涤溶液接触，其中所述第一浓度足以在不增溶compB的情况下纯化所述包涵体；
(iii)使包涵体与包括第二浓度的尿素的增溶溶液接触以溶解compB蛋白，其中所述浓度足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶；
(iv)使compB蛋白与阴离子交换树脂接触，并且使用洗脱溶液从树脂中洗脱compB蛋白；
(v)纯化compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：
(i)从大肠杆菌中分离包括compB蛋白的包涵体；
(ii)使包涵体与包括尿素的增溶溶液接触以溶解compB蛋白，其中尿素以足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶的浓度提供；
(iii)使compB蛋白与阴离子交换树脂接触，并且使用洗脱溶液从树脂中洗脱compB蛋白；
(iv)用混合模式树脂纯化compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：
(i)从大肠杆菌中分离包括compB蛋白的包涵体；
(ii)使包涵体与包括第一浓度的尿素的洗涤溶液接触，其中所述第一浓度足以在不增溶compB的情况下纯化所述包涵体；
(iii)使包涵体与包括第二浓度的尿素的增溶溶液接触以溶解compB蛋白，其中所述浓度足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶；
(iv)使compB蛋白与阴离子交换树脂接触，并且使用洗脱溶液从树脂中洗脱compB蛋白；
(v)用混合模式树脂纯化compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：
(i)从大肠杆菌中分离包括compB蛋白的包涵体；
(ii)使包涵体与包括浓度小于150mM的尿素的洗涤溶液接触一段时间，其中所述浓度足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶；
(iii)使包涵体与包括浓度为0.15M至2M的尿素的增溶溶液接触一段时间以溶解compB蛋白，其中所述浓度足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶
(iv)使compB蛋白与二乙氨基乙基(DEAE)缀合树脂接触并且使用洗脱溶液从树脂中洗脱compB蛋白；
(v)用陶瓷羟基磷灰石(CHT)树脂纯化compB蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：
(i)从大肠杆菌中分离包括具有SEQ ID NO:58中所阐述的序列的compB蛋白的包涵体；
(ii)使包涵体与包括浓度小于150mM的尿素的洗涤溶液接触一段时间；
(iii)使包涵体与包括浓度为0.15M至2M的尿素的增溶溶液接触一段时间以溶解compB蛋白，其中所述浓度足以将compB蛋白作为能够组装成多聚体(例如，五聚体)的单体增溶；
(iv)使compB蛋白与二乙氨基乙基(DEAE)缀合树脂接触并且使用洗脱溶液从树脂中洗脱compB蛋白；
(v)用陶瓷羟基磷灰石(CHT)树脂纯化compB蛋白。
pbVLP的组装
在一些实施例中，单个组分自组装到pbVLP中。在一些实施例中，用于形成pbVLP的第一和第二组分的一个或多个纯化的样品在水性条件下以大致等摩尔摩尔比混合(例如，I53-50A/B二十面体pbVLP)。第一和第二组分(通过多聚化结构域和任选地通过胞外结构域)相互作用以驱动靶标pbVLP的组装。靶标pbVLP的成功组装可以通过使用常用的生物化学或生物物理方法分析体外组装反应来证实，所述方法用于评估蛋白质或蛋白质组装的物理尺寸，包含但不限于尺寸排阻色谱法、天然(非变性)凝胶电泳、动态光散射、多角度光散射、分析超速离心、负染色电子显微镜、冷冻电子显微镜或X射线晶体学。如果需要，组装的pbVLP可以使用通常用于通过其物理尺寸分离蛋白质的制备技术从体外组装反应中存在的其它物种或分子中纯化，包含但不限于尺寸排阻色谱法、制备超速离心、切向流过滤或制备凝胶电泳。pbVLP中抗原蛋白的存在可以通过通常用于确定水溶液中蛋白质分子的同一性的技术来评估，包含但不限于SDS-PAGE、质谱、蛋白质测序、ELISA、表面等离子体共振、生物层干涉或氨基酸分析。蛋白质在颗粒外部的可及性以及其构象或抗原性可以通过通常用于检测抗原的存在和构象的技术来评估，包含但不限于被单克隆抗体、构象特异性单克隆抗体、表面等离子体共振、生物层干涉法或抗原特异性抗血清结合。
在各种实施例中，本公开的pbVLP包括两种或更多种不同的compA，所述compA携带不同的抗原蛋白作为基因融合体；这些pbVLP在同一pbVLP上共显示多种不同的蛋白质。这些多抗原pbVLP是通过用两种或更多种抗原的混合物进行体外组装而产生的，每种所述抗原都包括多聚化结构域。混合物中每种抗原的级分决定了所得pbVLP中每种抗原蛋白的平均化合价。给定样品中每种抗原的存在和平均化合价可以通过使用上述用于评估全化合价pbVLP中抗原蛋白的存在的技术的定量分析来评估。
在各种实施例中，pbVLP的直径介于约20纳米(nm)至约40纳米之间，内部内腔介于约15nm至约32nm之间，蛋白质壳中的孔径在其最长维度上介于约1nm至约14nm之间。
在一些实施例中，pbVLP具有二十面体对称。在此类实施例中，pbVLP可以包括60个拷贝的第一组分和60个拷贝的第二组分。在一个此类实施例中，每个第一组装中相同compA的数量不同于每个第二组装中相同compA的数量。例如，在一些实施例中，pbVLP包括十二个第一组装和二十个第二组装；在此类实施例中，每个第一组装可以例如包括五个拷贝的相同的第一组分，并且每个第二组装可以例如包括三个拷贝的相同的第二组分。在其它实施例中，pbVLP包括十二个第一组装和三十个第二组装；在此类实施例中，每个第一组装可以例如包括五个拷贝的相同的第一组分，并且每个第二组装可以例如包括两个拷贝的相同的第二组分。在另外的实施例中，pbVLP包括二十个第一组装和三十个第二组装；在此实施例中，每个第一组装可以例如包括三个拷贝的相同的第一组分，并且每个第二组装可以例如包括两个拷贝的相同的第二组分。所有这些实施例都能够形成具有规则二十面体对称的基于蛋白质的pbVLP。
在各种另外的实施例中，第一和第二多聚化结构域的低聚状态如下：
I53-34A：三聚体+I53-34B：五聚体；
I53-40A：五聚体+I53-40B：三聚体；
I53-47A：三聚体+I53-47B：五聚体；
I53-50A：三聚体+I53-50B：五聚体；
I53-51A：三聚体+I53-51B：五聚体；
I32-06A：二聚体+I32-06B：三聚体；
I32-19A：三聚体+I32-19B：二聚体；
I32-28A：三聚体+I32-28B：二聚体；
I52-03A：五聚体+I52-03B：二聚体；
I52-32A：二聚体+I52-32B：五聚体；以及
I52-33A：五聚体+I52-33B：二聚体
核酸
另一方面，本公开提供了编码本公开的抗原、第一组分和/或第二组分的分离的核酸。分离的核酸序列可以包括RNA或DNA。如本文所使用的，“分离的核酸”是那些已经从基因组或cDNA序列中的其正常周围核酸序列中去除的核酸。此类分离的核酸序列可以包括可用于促进编码的蛋白的表达和/或纯化的另外的序列，包含但不限于polyA序列、经修饰的Kozak序列和编码表位标签、输出信号和分泌信号、核定位信号和质膜定位信号的序列。基于本文的教导，本领域技术人员将清楚哪些核酸序列将编码本公开的蛋白质。
在另外的方面，本公开提供重组表达载体，所述重组表达载体包括本公开的任何实施例或实施例的组合的分离的核酸，所述分离的核酸与合适的控制序列操作性地连接。“重组表达载体”包含将核酸编码区或基因与能够影响基因产物的表达的任何控制序列操作性地连接的载体。与本公开的核酸序列可操作地连接的“控制序列”是能够影响核酸分子表达的核酸序列。控制序列不需要与核酸序列邻接，只要其起到指导其表达的作用。因此，例如，中间的未翻译但仍被转录的序列可以存在于启动子序列与核酸序列之间，并且仍然可以认为启动子序列“可操作地连接”到编码序列。其它此类控制序列包含但不限于聚腺苷酸化信号、终止信号和核糖体结合位点。此类表达载体可以是本领域已知的任何类型，包含但不限于质粒和基于病毒的表达载体。用于驱动哺乳动物系统中公开的核酸序列的表达的控制序列可以是组成性的(由多种启动子中的任一种驱动，包含但不限于CMV、SV40、RSV、肌动蛋白、EF)或可诱导的(由多种可诱导启动子中的任一种驱动，包含但不限于四环素(tetracycline)、蜕皮激素、类固醇应答)。用于转染原核细胞的表达载体的构造也是本领域众所周知的，并且因此可以通过标准技术完成。(参见例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis于以下中的描述：《分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,ALaboratoryManual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1989；《基因转移和表达方案(Gene Transfer and Expression Protocols)》,第109-128页,编辑E.J.Murray,新泽西州克利夫顿的胡马纳出版社公司(The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)以及Ambion 1998目录(德克萨斯州奥斯汀的Ambion公司)。表达载体必须可以作为游离体或通过整合到宿主染色体DNA中在宿主生物体中复制。在优选的实施例中，表达载体包括质粒。然而，本公开旨在包含具有等效功能的其它表达载体，如病毒载体。
另一方面，本公开提供了用本文所公开的重组表达载体转染或转导的宿主细胞，其中所述宿主细胞可以是原核或真核的。细胞可以瞬时或稳定地转染或转导。表达载体向原核细胞和真核细胞的此类转染或转导可以通过本领域已知的任何技术完成，包含但不限于标准细菌转化、磷酸钙共沉淀、电穿孔或脂质体介导的、DEAE葡聚糖介导的，聚阳离子介导的或病毒介导的转染。(参见例如，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(Sambrook等人,1989,冷泉港实验室出版社；《动物细胞培养：基础技术手册(Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique)》,第2版(R.I.Freshney.1987.纽约州纽约市的Liss公司(Liss,Inc.New York,NY))。
另一方面，本公开提供了产生根据本公开的抗原、组分或pbVLP的方法。在一些实施例中，所述方法包括以下步骤：(a)在有利于多肽表达的条件下培养根据本公开的此方面的宿主，以及(b)任选地回收所表达的多肽。
在一些实施例中，本公开提供了一种制造疫苗的方法，所述方法包括在培养基中培养包括多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸包括编码本公开的抗原的序列，使得所述宿主细胞将抗原分泌到培养基中；任选地从培养基中纯化抗原；将抗原与第二组分混合，其中所述第二组分与所述抗原多聚化以形成pbVLP；以及任选地纯化pbVLP。
在一些实施例中，本公开提供了制造疫苗的方法，所述方法包括培养包括一种或多种多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸包括编码任一公开的pbVLP的两种组分的序列，使得宿主细胞将第一组分和第二组分分泌到培养基中；以及任选地从培养基中纯化pbVLP。
说明性宿主细胞包含大肠杆菌细胞、293和293F细胞、HEK293细胞、Sf9细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和用于生产重组蛋白的任何其它细胞系。
调配物
在一些实施例中，组合物中的缓冲剂是Tris缓冲剂、组氨酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂或乙酸盐缓冲剂。所述组合物还可以包含冻干保护剂，例如蔗糖、山梨醇或海藻糖。在某些实施例中，所述组合物包含防腐剂，例如苯扎氯铵、苄索铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基甲苯丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、苯汞硝酸盐、硫柳汞、苯甲酸以及其各种混合物。在其它实施例中，所述组合物包含膨胀剂，如甘氨酸。在又其它实施例中，所述组合物包含表面活性剂，例如聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酸酯-60、聚山梨醇酯-65、聚山梨醇酸酯-80、聚山梨醇酯-85、泊洛沙姆-188(poloxamer-188)、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三月桂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三油酸甘油酯或其组合。所述组合物还可包含张力调节剂，例如使所述调配物与人体血液基本上等张或等渗的化合物。示例性张力调节剂包含蔗糖、山梨醇、甘氨酸、甲硫氨酸、甘露醇、葡萄糖、肌醇、氯化钠、精氨酸和精氨酸盐酸盐。在其它实施例中，所述组合物另外包含稳定剂，例如基本上防止或减少冻干或液体形式的pbVLP的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性稳定剂包含蔗糖、山梨醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、甲硫氨酸、精氨酸和精氨酸盐酸盐。
使用方法
在一些实施例中，本公开提供了用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用根据本文所描述的方法制备的纳米结构(例如，pbVLP)。在一些实施例中，本公开提供了一种用于在需要的受试者体内诱导、促进或增加免疫应答的方法，所述方法包括施用根据所描述的方法制备的纳米结构(例如，pbVLP)。在一些实施例中，所述纳米结构包括一种或多种抗原。在一些实施例中，一种或多种抗原显示在纳米结构的表面上。在一些实施例中，纳米结构包括一种或多种免疫刺激分子，所述免疫刺激分子附着到外部和/或封装在笼内部。如本文所使用的，免疫刺激分子是一种化合物，无论是单独或与另一种试剂(例如，抗原)组合，其都能刺激受试者的免疫应答(包含增强预先存在的免疫应答)。示例性免疫刺激分子包含但不限于TLR配体。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于在需要的受试者体内诱导、促进或增加免疫应答的方法，所述方法包括将根据本文所描述的方法制备的纳米结构(例如，pbVLP)作为免疫原性组合物或疫苗施用。在引入宿主中后，免疫原性组合物或疫苗引发免疫应答。“免疫应答”是指诱导、增加或持久激活先天免疫或适应性免疫功效的应答。在一些实施例中，免疫应答包括生产抗体和/或细胞因子。在一些实施例中，免疫应答包括激活细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突细胞、B细胞和/或其它细胞应答。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于在需要的受试者体内诱导、促进或增加抗体应答的方法，所述方法包括将根据本文所描述的方法制备的纳米结构(例如，pbVLP)作为免疫原性组合物或疫苗施用，其中所述纳米结构显示一种或多种抗原，并且其中所述抗体应答针对存在于所述一种或多种抗原上的表位。用于分析受试者体内的抗体应答的方法是本领域技术人员已知的。例如，在一些实施例中，通过ELISA测量免疫应答的增加以确定抗原特异性抗体滴度。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于在需要的受试者体内诱导、促进或增加包括改善的B记忆细胞应答的免疫应答的方法，所述方法包括将根据本文所描述的方法制备的纳米结构(例如，pbVLP)作为免疫原性组合物或疫苗在免疫的受试者体内施用。改进的B记忆细胞应答旨在意指外周血B细胞的频率增加，其能够在抗原相遇时分化为分泌抗体的浆细胞，如通过体外分化刺激测量的。在一些实施例中，本公开提供了用于增加抗体分泌B细胞的数量的方法。在一些实施例中，抗体分泌B细胞是骨髓浆细胞或生发B细胞。在一些实施例中，用于测量抗体分泌B细胞的方法包含但不限于抗原特异性ELISPOT测定和在免疫后不同时间点收集的血浆细胞或生发中心B细胞的流式细胞术。
在一些实施例中，纳米结构(例如，pbVLP)作为预防性免疫原性组合物或疫苗的一部分施用，其中免疫原性组合物或疫苗赋予受试者对随后暴露于感染原的抵抗力。在一些实施例中，纳米结构(例如，pbVLP)作为治疗性免疫原性组合物或疫苗的一部分施用，其中免疫原性组合物或疫苗启动或增强受试者对预先存在的抗原的免疫应答。在一些实施例中，预先存在的抗原是感染了感染原或肿瘤的受试者体内的病毒抗原。在一些实施例中，预先存在的抗原是患有肿瘤或恶性肿瘤的受试者体内的癌症抗原。根据本领域公知的原理，预防性或治疗性免疫应答的期望结果取决于所治疗的疾病或病状。例如，在一些实施例中，针对感染原的免疫应答可以完全阻止感染原的定植和复制。在一些实施例中，如果疫苗减少了症状的数量、严重程度或持续时间，如果其减少了有症状的群体中的个体数量，或减少了感染原的传播，则认为针对感染原的疫苗是有效的。在一些实施例中，针对癌症、过敏原或感染原的免疫应答是有效的，其完全治疗疾病、减轻症状或有助于针对疾病的整体治疗干预。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者的急性或慢性传染病的方法，所述方法包括将根据本文所描述的方法制备的纳米结构(例如，pbVLP)作为免疫原性组合物或疫苗施用。在一些实施例中，纳米结构(例如，pbVLP)包括一种或多种传染病抗原。在一些实施例中，一种或多种传染病抗原是微生物抗原。微生物抗原是源自微生物物种的抗原，例如，细菌、病毒、真菌、寄生虫或分枝杆菌。在一些实施例中，本公开提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者的病毒感染的方法，所述方法包括将根据本文所描述方法制备的纳米结构(例如，pbVLP)作为免疫原性组合物或疫苗施用，其中所述纳米结构包括源自病毒的一种或多种传染病抗原。在一些实施例中，病毒感染是免疫缺陷(例如，HIV、乳头状瘤(例如，HPV)、疱疹(例如，HSV)、脑炎、流感(例如，人流感病毒A)、COVID-19(例如，SARS-CoV-2)和普通感冒(例如，人鼻病毒、呼吸道合胞病毒)。在一些实施例中，本公开提供了一种用于减少需要的受试者的病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据本文所描述的方法制备的纳米结构(例如，pbVLP)。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于治疗或预防与异常凋亡、分化过程(例如，细胞增殖性病症，例如，过度增殖性病症)或细胞分化病症(例如，癌症)相关的病症的方法。细胞增殖性和/或分化性病症的实例包含癌症(例如，癌、癌、转移性病症或造血肿瘤性病症)。在一些实施例中，向患有癌症的受试者施用包括根据本文所描述的方法制备的纳米结构(例如，pbVLP)的免疫原性组合物或疫苗。术语“癌症”是指各种器官系统的恶性肿瘤，包含影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴组织、胃肠器官和泌尿生殖道的恶性肿瘤，以及通常被认为包含恶性肿瘤的腺癌，如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一些实施例中，免疫原性组合物或疫苗用于治疗患有、怀疑患有或可能具有发展任何类型癌症的高风险的受试者。
在一些实施例中，本公开提供了用于在患有癌症的受试者体内诱导抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括施用包括根据本文所描述的方法制备的纳米结构(例如，pbVLP)的免疫原性组合物或疫苗。在一些实施例中，纳米结构包括一种或多种抗原，其中所述抗原是癌症抗原。癌症抗原是优选地在癌细胞上表达(即其在癌细胞中的表达水平高于在非癌细胞上的表达水平)，并且在一些情况下仅由癌细胞表达的抗原。癌症抗原可以在癌细胞内或癌细胞表面上表达。在一些实施例中，施用包括包含一种或多种癌症抗原的纳米结构(例如，pbVLP)的免疫原性组合物或疫苗诱导抗肿瘤免疫应答，从而预防或治疗受试者的癌症。
实例
实例1：用于生产CompB-01的大肠杆菌菌株的开发
本实例证明了compB-01从大肠杆菌的不可溶性级分中的表达。在B和K-12大肠杆菌宿主背景中评估了一组组合菌株。使用两种不同的启动子T7和phoA来评估不同的表达动力学。使用优化的DNA编码序列，将总共十个质粒转化到合适的宿主中，以产生27个独特的菌株(表3)。使用24孔培养皿以3mL总体积进行表达评估。通过SDS-PAGE分析可溶性和不可溶性级分。九个菌株产生了一些可检测的产物，主要存在于细胞的不可溶性级分中。四种菌株产生的产物迁移的分子量高于参考标准。在摇瓶中重新评估八个菌株，并且将表达与空宿主进行了比较。埃德曼降解(Edman degradation)证实了正确处理的N末端存在于ICXB01、ICXB10和IXCB11中，其在细胞质中表达compB-01作为包涵体。选择这三者进行4x5L发酵中的平台分批进料发酵过程的评估。未优化过程中ICXB10和ICXB11的生物质产率为170g/L至190g/L湿细胞重量(WCW)和约1g/L不可溶性compB-01。来自ICXB10的材料被纯化，QC测试并评估纳米颗粒组装。
compB-01的完整序列是SEQ ID NO:60；
MNQHSHKDHETVRIAVVRARWHAEIVDACVSAFEAAMRDIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVNGGIYRHEFVASAVINGMMNVQLNTGVPVLSAVLTPHNYDKSKAHTLLFLALFAVKGMEAARACVEILAAREKIAA
表3中提供了测试的构建体的完整列表。
表3
Figure BDA0004019667220000431
除非另有规定，否则所有温育均在30℃下进行。所有肉汤培养物在30℃，250rpm，1"轨道下振荡温育。温育2±0.5小时后，通过向每个孔中添加3μL的1M IPTG诱导T7培养物。尽管培养物是基于时间诱导的，但诱导时预期OD600为0.6至0.9。添加IPTG后，培养物温育另外4±0.5小时。采集时，记录每个孔的最终OD600。类似于T7菌株制备PhoA菌株，不同之处在于表达培养基是完全抑制碱性磷酸酶(Completely Repressed Alkaline Phosphatase，C.R.A.P)。PhoA菌株温育24±1小时。
随后使用表4中提供的发酵配置进行分批进料发酵筛选，以1％(v/v)接种发酵罐，并且在不进行操作的情况下让培养物生长8小时至12小时，直到分批培养基中的甘油耗尽，然后溶解氧(DO)急剧增加(“尖峰”)。观察到DO尖峰后，开始添加进料。进料时间表设计成斜坡指数。
表4.发酵配置
Figure BDA0004019667220000441
在自动诱导phoA启动子的phoA过程中，在峰值进料速率的时间附近，磷酸盐变得有限。因此，phoA过程诱导时间由分批培养基中补充的总磷酸盐控制。按照预先计划的时间表，进料速率将下降30％，并且在发酵的剩余时间保持恒定速率。
在每个取样时间，收集两个1.0mL全肉汤样品并离心10分钟。将上清液转移到另一组试管中，并且如果需要，测定代谢物浓度。称量沉淀以获得湿细胞重量(WCW)并冷冻储存以进行SDS-PAGE分析。所有WCW数据报告为至少两个1.0mL样品的平均值。通过埃德曼降解和compA-01颗粒组装，还评估了采集的材料的N末端序列。
compA-01的完整序列是SEQ ID NO:61；
MEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQARKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFAKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVAEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGATELE
将发酵罐设置为在IPTG添加(T7)后12小时或接种(phoA)后48小时采集。通过桶式离心采集每个发酵罐。
结果
所有质粒均成功转化到指定宿主中。通过SDS-PAGE观察到产物带主要存在于不可溶性级分中，但也存在于ICXB10的可溶性级分中。选择产生推定产物的菌株进行进一步处理，所述推定产物在SDS-PAGE上作为单个条带迁移，并且具有参考标准的近似大小。来自不可溶性级分的ICXB01、ICXB10、ICXB11和ICXB15的主条带从用Ponceau S染色的PVDF电转移中切下。通过埃德曼降解分析每个的N末端，发现ICXB01、1CXB10和ICXB11正确。PhoA前导肽仍然存在于ICXB15中，因此其不用于未来的工作。来自从初级筛选的所有SDS-PAGE凝胶在图2中呈现。任何菌株都没有明显的生长不良或遗传不稳定的迹象。生长和表达结果汇总在表5中。
表5
烧瓶 菌株 不可溶性表达b 可溶性表达b
1 BL21 --- ---
2 ICXB01 2 2
3 ICXB01 2 2
4 ICXB02 2* ---
5 ICXB02 2* ---
6 CBM048 --- ---
7 ICXB10 3 2
8 ICXB10 3 2
9 ICXB11 3 2
10 ICXB11 3 2
11 ICXB12 3* ---
12 ICXB12 3* ---
13 ICXB13 2(双峰) ---
14 ICXB13 2(双峰) ---
15 ICXB14 3* ---
16 ICXB14 3* 1/2
17 ICXB15 3* 1/2
18 ICXB15 3* ---
b给出的表达数字是基于产物条带的亮度和SDS-PAGE上的凝胶上样的任意值
基于生长曲线、表达和N末端序列数据(表6)，选择菌株ICXB01、ICXB10和ICXB11进行发酵筛选。
表6.N末端序列数据汇总：二次筛选培养物
Figure BDA0004019667220000451
使用四个5L发酵罐评估三个菌株(ICXB01、ICXB10和ICXB11)的表达。实验设计参见表7。在线曲线表明，pH、温度或气流没有发生显著的偏差。在每个发酵罐的DO尖峰处成功地开始进料递送，并且在整个运行过程中维持了相当稳定的DO分布。DO的周期性尖峰对应于消泡剂添加。发酵罐A和B的中代谢都有所下降，这表明诱导期有点长。采集标准和诱导动力学是在过程开发期间优化的参数。表8中给出了发酵罐结果的汇总。
表7.发酵筛选设计
发酵罐 菌株 过程 诱导 备注
A ICXB01 T7 1mM IPTG N/A
B ICX0B1 T7 1mM IPTG 诱导时转换到25℃
C ICXB10 phoA 自诱导的 N/A
D ICXB11 phoA 自诱导的 N/A
表8.发酵数据汇总
参数 发酵罐A 发酵罐B 发酵罐C 发酵罐D
接种的菌株 ICXB01 ICXB01 ICXB10 ICXB11
诱导期间的温度(℃) 30 25 30 30
接种物接种时的OD600 5.43 5.43 5.30 5.36
接种的总OD单位 190 190 143 145
DO尖峰时的EFT(小时) 9.5 9.5 9.5 11.0
DO尖峰时的OD600 19.4 20.4 18.5 17.5
DO尖峰时的WCW(g/L) 32.5 35.5 46.0 41.0
诱导时的EFT(小时) 15 15 --- ---
诱导时的OD600(小时) 46.9 46.7 71 75
使用的50％葡萄糖进料(g) 1005 973 1413 1379
使用的酸(g) 17 38 423 326
使用的30％NH4OH碱(g) 70.0 86.0 239.0 182.0
总EFT(小时) 27 27 48 48
采集WCW(g/L) 178 190 194 177
最终采集沉淀(g) 678 698 740 661
采集WCV(％) 17.78 18.91 19.4 17.7
总之，在小规模培养中，三种大肠杆菌菌株ICXB01、ICXB10和ICXB11在细胞质中产生了相当高水平的不可溶性compB-01。ICXB10和ICXB11在初始、未优化的5L分批进料发酵中产生了大量材料。ICXB10和ICXB11菌株中compB-01在细胞质中的表达受phoA启动子的控制，当培养基中无机磷酸盐水平耗尽时，所述phoA启动子会诱导表达。ICXB10和ICXB11产生了具有正确N末端的compB-01包涵体，其可以加工成组装感受态产物。
参考文献
以下参考文献通过全文引用的方式并入本文。
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实例2：包涵体提取
此实施例证明了从通过实例1中公开的方法产生的包涵体中回收compB-01。具体而言，在采集大肠杆菌生产培养物后，将细胞糊重悬于均质化溶液(8.4mM磷酸钠、1.5mM磷酸钾、2.7mM氯化钾、137mM氯化钠，pH 7.4)中。均质化后，如表9所示，在四种溶液中洗涤包涵体。
表9.包涵体洗涤溶液
Figure BDA0004019667220000481
将100g洗涤的包涵体(WIB)用polytron重悬于25mL/g WIB的Triton洗涤缓冲剂(0.1％Triton X-100于1X PBS中，pH 7.4)中，在室温下搅拌2小时。在4℃下以11,000g将样品离心30分钟，并且丢弃上清液。然后将沉淀的WIB用polytron重悬于50mL/gWIB的提取缓冲剂(20mM磷酸钠、150mM氯化钠、0.5M尿素、0.75％CHAPS，pH 7.4)中。将提取物在环境温度下混合温育2小时。将样品在4℃下以11,000g离心30分钟，并且使用0.22μm过滤器过滤上清液。
DEAE琼脂糖
将过滤的上清液上样到DEAE琼脂糖FF柱上。根据以下过程参数，使用步长梯度进行阴离子交换色谱法。代表性色谱图在图3中示出。
Figure BDA0004019667220000491
收集2个柱体积(CV)的从峰值上升25％(F1)的洗脱液，用于下一步纯化。
CHT色谱法
将收集的样品上样到CHT陶瓷羟基磷灰石I型培养基柱上。根据以下过程参数进行混合模式色谱法。代表性色谱图在图4中示出。
Figure BDA0004019667220000501
洗脱液收集从洗脱峰上升到峰下降侧最大值的30％开始。
超滤/渗滤
在CHT洗脱液(2958.4mg)上进行超滤/渗滤(UFDF)调配。使用MilliporePellicon2迷你盒，Biomax 10kDa(目录号：P2B010A01，0.1m2)。将CHT洗脱液浓缩到约4mg/mL(样品体积约700mL)，并且使用500毫升/分钟的进料泵流速用调配物缓冲剂(20mM Tris、250mM NaCl，pH 7.4)渗滤8DV(5600mL)。将UFDF产物过滤0.22μm，并且将浓度调节到2.55mg/mL，总体积为1051mL，最终蛋白质产率＝2680mg。等分试样储存在-80℃下。
内毒素测试表明产物符合期望的标准，如下表所示。
Figure BDA0004019667220000502
总之，从1L细胞肉汤中可以获得约1.35g最终Comp-B产物。基于调配结果，将最终调配物改为20mM Tris、250mM NaCl，pH 7.4。CHT柱洗脱收集截止被确定为洗脱峰下降侧峰最大值的30％。步进产率为77％。内毒素水平降低了4倍。最终UFDF降低内毒素水平。下表总结了总过程产率。
产率汇总
温度(℃) 30
磷酸盐(mM) 16.4
采集(g/L) 190(B)、202(C)
处理的糊量(g) 1250
IB的量(g) 366.5
处理用于纯化的IB的量(g) 100
DEAE(25％洗脱)(g) 3.86
CHT运行洗脱(30％峰最大值切割)(g) 2.96
UF/DF和最终过滤(g) 2.68
最终产物(g)/L发酵肉汤 1.35
残留DNA(pg/mg) 9.5
内毒素(EU/mg) 10
实例3：包涵体提取
此实例证明了实例2中描述的包涵体提取方法的进一步改进。检查了不可溶性沉淀洗涤的若干种选择，包含替代性洗涤剂。将I53-50B细胞沉淀以10mL/g湿细胞重量重悬于PBS中，并且使用IKAUltra-Turrax T25均质器以4000rpm均质化1分钟。使用MicrofluidicsM110P微流器在2℃至8℃下在18000psi下三次离散通过，裂解重悬的细胞。将裂解物收集在干净的容器中，分成50mL Falcon管，并且在4℃以24000g离心30分钟进行澄清。将可溶性级分移到新容器中。最初的实验确定了compB蛋白在何种尿素浓度下溶解，从50mM开始，并且增加到8M，使用裂解液的等分试样和等体积的PBS，增加尿素摩尔浓度，持续2小时。结果在图5中示出。compB蛋白在50mM尿素下开始提取，因此不采用低浓度的离液剂作为洗涤步骤。
随后的实验检查了替代性洗涤剂Triton X-100、高盐和30％异丙醇，SDS-PAGE纯度和内毒素清除率作为主要读数。结果在图6中示出。对照样品没有洗涤步骤，而是使用PBS2M尿素0.75％(w/v)Chaps pH 7.4直接进行提取。用一种以下洗涤缓冲剂洗涤测试样品，所有这些均在PBS背景中：
a.30％异丙醇，
b.0.1％Triton X-100，
c.0.5％Triton X-100，
d.1M NaCl，以及
e.1M NaCl 30％异丙醇。
异丙醇似乎对溶解度产生了负面影响，提取的级分中的compB较少。1M NaCl似乎可以去除宿主细胞蛋白，但不影响内毒素清除。0.1％Triton X-100显示出最佳的清除系数。接下来，将执行两个洗涤步骤，洗涤1为PBS 0.1％Triton X100，并且洗涤2为20mMNaPO4 1M NaCl。结果汇总在下表中。
洗涤 EU/mL 与对照的％差异
对照 >50,000
0.1％Triton 24,242 69.2
0.5％Triton 32,397 42.7
1M NaCl >50,000 0
随后，在30℃下将发酵规模扩大到四个5升发酵罐。将来自发酵罐B(696.1g)和发酵罐C(553.9g)的1.25kg细胞糊重悬、裂解并洗涤，以回收366.5g洗涤的IB，其对应于初始重量的29％。将包涵体重悬于25mL/g的0.1％Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，pH7.4，并且在室温下搅拌两小时。通过在11,000g下离心回收包涵体。然后用20mM磷酸钠、150mM、0.5M尿素、0.75％CHAPS，pH 7.4提取洗涤的包涵体。通过在11,000g下离心清除上清液并进行进一步纯化。
DEAE琼脂糖FF色谱法
测试了Triton X-100和CHAPS的组合。用20mM NaPO4、150mM NaCl，pH 7.4平衡10cm床高的DEAE柱，并且用不同的柱洗涤缓冲剂洗涤：
a.20mM NaPO4 150mM NaCl 0.1％Triton X-100pH 7.4，
b.20mM NaPO4 150mM NaCl 0.75％Chaps pH 7.4或
c.两者串联。
用5CV的20mM NaPO4 500mM NaCl进行洗脱，然后各自用5CV的20mM NaPO41M NaCl(pH 7.4)汽提柱，并且用0.5M NaOH消毒。
通过非还原性SDS-PAGE确定的洗脱纯度在三种选择之间相当，但两种洗涤剂的组合显然最有效地去除内毒素。
过程 回收 内毒素(EU/mL)
Tris 70％ 3999
CHAPS 60％ 1060
Tris然后CHAPS 45％ 824
组装感受态
通过以1:1摩尔比轻轻混合纯化的组分，分析纯化的I53-50B在体外混合时与I53-50A组装成设计的二十面体架构的能力。然后在Superose 6Increase 10/300GL凝胶过滤柱(通用电气生命科学公司(GE Life Sciences))上使用20mM NaPO4、150mM NaCl，pH 7.4作为流动相分析混合物。代表性色谱图在图7中示出。组装混合物的SDS-PAGE分析在图8中示出。单分散纳米颗粒的保留时间为约11.3分钟，I53-50A单独为17.2分钟。
总之，纯化的I53-50B既是组装感受态，又不聚集。图9所示的纯化过程流程产生了纯的、组装感受态I53-50B。
实例4：组分B的大规模制造和纯化
对于compB-01(I53-50B序列)的制造，为单元操作开发了可扩展的过程，包含生物反应器生产和采集、从不可溶性级分提取可溶性五聚体以及使用两步色谱过程进行下游处理，然后通过UF/DF进行最终调配。compB-01药物物质中间体制造过程的概述流程图在图11中提供。
对于小规模的初始概念验证，在2x 2.5L生物反应器规模上执行compB-01制造过程，得到2.6g最终药物物质中间体(compB演示批次A；0618-60)。放大，在200L生物反应器规模上执行当前良好制造方案(cGMP)compB-01的制造，约10％的所得生物反应器采集细胞糊用于后续下游处理，得到19.0g最终药物物质中间体(compB-01GMP批次B；20-4076)。
表10提供了compB-01演示批次A和compB-01GMP批次B的制造规模比较。生物反应器采集后回收的细胞糊水平，以及通过下游加工使用10倍的GMP过程包涵体使最终药物物质中间体增加7倍，突出了compB-01制造过程的成功放大。表11中提供的分析表征数据也证明了compB-01制造过程的成功放大，其中两批材料均被证明具有相当的产物质量属性。
表10.CompB-01药物物质中间体的可扩展制造
Figure BDA0004019667220000531
Figure BDA0004019667220000541
1有意调整过程规模以适应下游单元操作。
表11.CompB-01药物物质中间体的分析表征。
Figure BDA0004019667220000542
CE-SDS＝毛细管电泳十二烷基硫酸钠；CFU＝菌落形成单位；DNA＝脱氧核糖核酸；EU＝内毒素单位；SE-HPLC＝尺寸排阻高效液相色谱法
替代性CompB生产：
对于当前的GMP制造，bompB-01(I53-50B序列)在大肠杆菌中产生，并且作为可溶性五聚体提取用于下游加工。
对于I53-50B bompB-01的当前GMP制造，生产菌株IXCB10DCB(批次191100308)是通过将I53-50B序列克隆到pCTY13载体骨架中以转化大肠杆菌菌株CBM179而产生的。pCYT13载体使用phoA启动子，所述启动子在培养基中磷酸盐耗尽后驱动compB-01表达，并且产生可以在相对温和的条件下从不可溶性级分提取的可溶性compB-01五聚体。
为了使用样品制造平台评估替代性分子，还将I53-dn5A DNA序列克隆到pCTY13载体骨架中，用于大肠杆菌菌株CBM179的转化，得到表达菌株IVXB30。为了评估I53-dn5AcompB生产，使用评估I53-dn5A表达的标准程序生长1000mL摇瓶生产培养物。生产后，从细胞沉淀中分离出可溶性和不可溶性级分，并且通过SDS-PAGE进行评估。
如图12所示，在大肠杆菌生产培养物的不可溶性级分中观察到显著水平的I53-dn5A。这些结果与对I53-50B compB-01观察到的表达模式一致，并且支持使用不同可溶性五聚体的通用制造平台。
****
虽然已经结合本发明提出的具体实施例描述了本发明，但是应当理解，本发明能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖一般地遵循本发明的原理并且包含在本领域内的已知或惯常实践内的这种偏离的本公开的任何变型、用途或改编，并且可以应用于上文所述的基本特征和处于所附权利要求的范围内的以下内容。
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 1
Glu Gly Met Asp Pro Leu Ala Val Leu Ala Glu Ser Arg Leu Leu Pro
1 5 10 15
Leu Leu Thr Val Arg Gly Gly Glu Asp Leu Ala Gly Leu Ala Thr Val
20 25 30
Leu Glu Leu Met Gly Val Gly Ala Leu Glu Ile Thr Leu Arg Thr Glu
35 40 45
Lys Gly Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Arg Lys Ser Gly Leu Leu Leu
50 55 60
Gly Ala Gly Thr Val Arg Ser Pro Lys Glu Ala Glu Ala Ala Leu Glu
65 70 75 80
Ala Gly Ala Ala Phe Leu Val Ser Pro Gly Leu Leu Glu Glu Val Ala
85 90 95
Ala Leu Ala Gln Ala Arg Gly Val Pro Tyr Leu Pro Gly Val Leu Thr
100 105 110
Pro Thr Glu Val Glu Arg Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ser Ala Leu Lys
115 120 125
Phe Phe Pro Ala Glu Pro Phe Gln Gly Val Arg Val Leu Arg Ala Tyr
130 135 140
Ala Glu Val Phe Pro Glu Val Arg Phe Leu Pro Thr Gly Gly Ile Lys
145 150 155 160
Glu Glu His Leu Pro His Tyr Ala Ala Leu Pro Asn Leu Leu Ala Val
165 170 175
Gly Gly Ser Trp Leu Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ala Val Met Lys Lys
180 185 190
Val Lys Ala Ala Lys Ala Leu Leu Ser Pro Gln Ala Pro Gly
195 200 205
<210> 2
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp Met
1 5 10 15
Ala Glu Ala Ala Ile Arg Thr Leu Lys Ala Leu Ser Pro Asn Ile Lys
20 25 30
Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala Cys
35 40 45
Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu Gly
50 55 60
Met Pro Gly Lys Ala Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala Ser
65 70 75 80
Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile Glu
85 90 95
Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Asp Glu Leu Asp Ile
100 105 110
Leu Ala Leu Val Arg Ala Ile Glu His Ala Ala Asn Val Tyr Tyr Leu
115 120 125
Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu Arg
130 135 140
Gln Gly Arg Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu
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<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp Met
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Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile Lys
20 25 30
Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala Cys
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Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu Gly
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Met Pro Gly Lys Ala Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala Ser
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Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr Leu
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<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Ser Thr Ile Asn Asn Gln Leu Lys Ala Leu Lys Val Ile Pro Val Ile
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Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu Ala
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Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys Glu
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Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn Asn
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Pro Ser Thr Val Glu Ala Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu Lys
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Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser Leu
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Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile Thr
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Pro Ser Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala Cys
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<223> 合成肽
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Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Ser
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Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser Lys
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Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu Ser
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Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr Ile
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Phe
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<220>
<223> 合成肽
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Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Val
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Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala Phe
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Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Val
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<223> 合成肽
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Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala
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Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly
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Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr
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Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala Phe
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<223> 合成肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Val
1 5 10 15
Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Gln Cys Val Arg Ala Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Met Ala Asp Ala Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Val
35 40 45
Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr Leu
50 55 60
Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val Val
65 70 75 80
Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Asp
85 90 95
Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Ala
100 105 110
Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Ser Ser Arg Glu His His Glu Phe
115 120 125
Phe Arg Glu His Phe Met Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Cys
130 135 140
Ile Thr Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala
145 150 155
<210> 11
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Gly His Thr Lys Gly Pro Thr Pro Gln Gln His Asp Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Arg Ile Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Ile Ile Met Pro
20 25 30
Leu Leu Ile Gly Thr Ile Ala Lys Leu Leu Glu Cys Gly Val Lys Ala
35 40 45
Ser Asn Ile Val Val Gln Ser Val Pro Gly Ser Trp Glu Leu Pro Ile
50 55 60
Ala Val Gln Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Gln Leu Gln Thr Pro Ser Ser
65 70 75 80
Gly Pro Ser Leu Ser Ala Gly Asp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Thr Asp
85 90 95
Leu Thr Ala Leu Pro Thr Thr Thr Ala Ser Ser Thr Gly Pro Phe Asp
100 105 110
Ala Leu Ile Ala Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Glu Thr Met His Phe
115 120 125
Glu Tyr Ile Ala Asp Ser Val Ser His Gly Leu Met Arg Val Gln Leu
130 135 140
Asp Thr Gly Val Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Val Leu Thr Asp
145 150 155 160
Asp Gln Ala Lys Ala Arg Ala Gly Val Ile Glu Gly Ser His Asn His
165 170 175
Gly Glu Asp Trp Gly Leu Ala Ala Val Glu Met Gly Val Arg Arg Arg
180 185 190
Asp Trp Ala Ala Gly Lys Thr Glu
195 200
<210> 12
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Tyr Glu Val Asp His Ala Asp Val Tyr Asp Leu Phe Tyr Leu Gly Arg
1 5 10 15
Gly Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Ala Ser Asp Ile Ala Asp Leu Val Arg
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Ala Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly Thr
35 40 45
Gly Thr His Leu Glu His Phe Thr Lys Glu Phe Gly Asp Thr Ala Gly
50 55 60
Leu Glu Leu Ser Glu Asp Met Leu Thr His Ala Arg Lys Arg Leu Pro
65 70 75 80
Asp Ala Thr Leu His Gln Gly Asp Met Arg Asp Phe Gln Leu Gly Arg
85 90 95
Lys Phe Ser Ala Val Val Ser Met Phe Ser Ser Val Gly Tyr Leu Lys
100 105 110
Thr Val Ala Glu Leu Gly Ala Ala Val Ala Ser Phe Ala Glu His Leu
115 120 125
Glu Pro Gly Gly Val Val Val Val Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu Thr
130 135 140
Phe Ala Asp Gly Trp Val Ser Ala Asp Val Val Arg Arg Asp Gly Arg
145 150 155 160
Thr Val Ala Arg Val Ser His Ser Val Arg Glu Gly Asn Ala Thr Arg
165 170 175
Met Glu Val His Phe Thr Val Ala Asp Pro Gly Lys Gly Val Arg His
180 185 190
Phe Ser Asp Val His Leu Ile Thr Leu Phe His Gln Arg Glu Tyr Glu
195 200 205
Ala Ala Phe Met Ala Ala Gly Leu Arg Val Glu Tyr Leu Glu Gly Gly
210 215 220
Pro Ser Gly Arg Gly Leu Phe Val Gly Val Pro Ala
225 230 235
<210> 13
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Gly Met Lys Glu Lys Phe Val Leu Ile Ile Thr His Gly Asp Phe Gly
1 5 10 15
Lys Gly Leu Leu Ser Gly Ala Glu Val Ile Ile Gly Lys Gln Glu Asn
20 25 30
Val His Thr Val Gly Leu Asn Leu Gly Asp Asn Ile Glu Lys Val Ala
35 40 45
Lys Glu Val Met Arg Ile Ile Ile Ala Lys Leu Ala Glu Asp Lys Glu
50 55 60
Ile Ile Ile Val Val Asp Leu Phe Gly Gly Ser Pro Phe Asn Ile Ala
65 70 75 80
Leu Glu Met Met Lys Thr Phe Asp Val Lys Val Ile Thr Gly Ile Asn
85 90 95
Met Pro Met Leu Val Glu Leu Leu Thr Ser Ile Asn Val Tyr Asp Thr
100 105 110
Thr Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ser Lys Ile Gly Lys Asp Gly Ile Lys
115 120 125
Val Ile Glu Lys Ser Ser Leu Lys Met
130 135
<210> 14
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Lys Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg Trp
1 5 10 15
Asn Leu Glu Ile Ile Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ile Lys Arg Leu
20 25 30
Gln Glu Phe Gly Val Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val Pro
35 40 45
Gly Ser Phe Glu Leu Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys Gln
50 55 60
Lys Arg Leu Gly Lys Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Ile Lys Gly Ser Thr Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr Thr
85 90 95
His Gln Leu Met Lys Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile Phe
100 105 110
Gly Val Leu Thr Cys Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala Gly
115 120 125
Leu Ile Glu Gly Lys Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala
130 135 140
Ala Val Glu Met Ala Thr Lys Phe Asn
145 150
<210> 15
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Ala Val Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Lys Tyr Asp Gly Ser Lys
1 5 10 15
Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg Trp Asn Arg Lys Ile Ile Leu
20 25 30
Ala Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Gly Val Lys
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val Pro Gly Ser Phe Glu Leu Pro
50 55 60
Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys Gln Lys Arg Leu Gly Lys Pro
65 70 75 80
Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Ser Thr Met
85 90 95
His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr Thr His Gln Leu Met Lys Leu
100 105 110
Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Cys Leu
115 120 125
Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala Gly Leu Ile Glu Gly Lys Met
130 135 140
His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu Met Ala Thr
145 150 155 160
Lys Phe Asn
<210> 16
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Gly Ala Asn Trp Tyr Leu Asp Asn Glu Ser Ser Arg Leu Ser Phe Thr
1 5 10 15
Ser Thr Lys Asn Ala Asp Ile Ala Glu Val His Arg Phe Leu Val Leu
20 25 30
His Gly Lys Val Asp Pro Lys Gly Leu Ala Glu Val Glu Val Glu Thr
35 40 45
Glu Ser Ile Ser Thr Gly Ile Pro Leu Arg Asp Met Leu Leu Arg Val
50 55 60
Leu Val Phe Gln Val Ser Lys Phe Pro Val Ala Gln Ile Asn Ala Gln
65 70 75 80
Leu Asp Met Arg Pro Ile Asn Asn Leu Ala Pro Gly Ala Gln Leu Glu
85 90 95
Leu Arg Leu Pro Leu Thr Val Ser Leu Arg Gly Lys Ser His Ser Tyr
100 105 110
Asn Ala Glu Leu Leu Ala Thr Arg Leu Asp Glu Arg Arg Phe Gln Val
115 120 125
Val Thr Leu Glu Pro Leu Val Ile His Ala Gln Asp Phe Asp Met Val
130 135 140
Arg Ala Phe Asn Ala Leu Arg Leu Val Ala Gly Leu Ser Ala Val Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Pro Val Gly Ala Val Leu Ile Phe Thr Ala Arg
165 170
<210> 17
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Thr Asp Tyr Ile Arg Asp Gly Ser Ala Ile Lys Ala Leu Ser Phe Ala
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Glu Ala Asp Leu Arg His Ile Pro Gln Asp Leu Gln
20 25 30
Arg Leu Ala Val Arg Val Ile His Ala Cys Gly Met Val Asp Val Ala
35 40 45
Asn Asp Leu Ala Phe Ser Glu Gly Ala Gly Lys Ala Gly Arg Asn Ala
50 55 60
Leu Leu Ala Gly Ala Pro Ile Leu Cys Asp Ala Arg Met Val Ala Glu
65 70 75 80
Gly Ile Thr Arg Ser Arg Leu Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Tyr Thr
85 90 95
Leu Ser Asp Pro Ser Val Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Gly Asn Thr
100 105 110
Arg Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Trp Leu Pro His Ile Glu Gly Ser
115 120 125
Ile Val Ala Ile Gly Asn Ala Pro Thr Ala Leu Phe Arg Leu Phe Glu
130 135 140
Leu Leu Asp Ala Gly Ala Pro Lys Pro Ala Leu Ile Ile Gly Met Pro
145 150 155 160
Val Gly Phe Val Gly Ala Ala Glu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ala Asn
165 170 175
Ser Arg Gly Val Pro Tyr Val Ile Val Arg Gly Arg Arg Gly Gly Ser
180 185 190
Ala Met Thr Ala Ala Ala Val Asn Ala Leu Ala Ser Glu Arg Glu
195 200 205
<210> 18
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Ile Thr Val Phe Gly Leu Lys Ser Lys Leu Ala Pro Arg Arg Glu Lys
1 5 10 15
Leu Ala Glu Val Ile Tyr Ser Ser Leu His Leu Gly Leu Asp Ile Pro
20 25 30
Lys Gly Lys His Ala Ile Arg Phe Leu Cys Leu Glu Lys Glu Asp Phe
35 40 45
Tyr Tyr Pro Phe Asp Arg Ser Asp Asp Tyr Thr Val Ile Glu Ile Asn
50 55 60
Leu Met Ala Gly Arg Ser Glu Glu Thr Lys Met Leu Leu Ile Phe Leu
65 70 75 80
Leu Phe Ile Ala Leu Glu Arg Lys Leu Gly Ile Arg Ala His Asp Val
85 90 95
Glu Ile Thr Ile Lys Glu Gln Pro Ala His Cys Trp Gly Phe Arg Gly
100 105 110
Arg Thr Gly Asp Ser Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Asp Ile Tyr Val
115 120 125
<210> 19
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Gly Ser Asp Leu Gln Lys Leu Gln Arg Phe Ser Thr Cys Asp Ile Ser
1 5 10 15
Asp Gly Leu Leu Asn Val Tyr Asn Ile Pro Thr Gly Gly Tyr Phe Pro
20 25 30
Asn Leu Thr Ala Ile Ser Pro Pro Gln Asn Ser Ser Ile Val Gly Thr
35 40 45
Ala Tyr Thr Val Leu Phe Ala Pro Ile Asp Asp Pro Arg Pro Ala Val
50 55 60
Asn Tyr Ile Asp Ser Val Pro Pro Asn Ser Ile Leu Val Leu Ala Leu
65 70 75 80
Glu Pro His Leu Gln Ser Gln Phe His Pro Phe Ile Lys Ile Thr Gln
85 90 95
Ala Met Tyr Gly Gly Leu Met Ser Thr Arg Ala Gln Tyr Leu Lys Ser
100 105 110
Asn Gly Thr Val Val Phe Gly Arg Ile Arg Asp Val Asp Glu His Arg
115 120 125
Thr Leu Asn His Pro Val Phe Ala Tyr Gly Val Gly Ser Cys Ala Pro
130 135 140
Lys Ala Val Val Lys Ala Val Gly Thr Asn Val Gln Leu Lys Ile Leu
145 150 155 160
Thr Ser Asp Gly Val Thr Gln Thr Ile Cys Pro Gly Asp Tyr Ile Ala
165 170 175
Gly Asp Asn Asn Gly Ile Val Arg Ile Pro Val Gln Glu Thr Asp Ile
180 185 190
Ser Lys Leu Val Thr Tyr Ile Glu Lys Ser Ile Glu Val Asp Arg Leu
195 200 205
Val Ser Glu Ala Ile Lys Asn Gly Leu Pro Ala Lys Ala Ala Gln Thr
210 215 220
Ala Arg Arg Met Val Leu Lys Asp Tyr Ile
225 230
<210> 20
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Ser Gly Met Arg Val Tyr Leu Gly Ala Asp His Ala Gly Tyr Glu Leu
1 5 10 15
Lys Gln Ala Ile Ile Ala Phe Leu Lys Met Thr Gly His Glu Pro Ile
20 25 30
Asp Cys Gly Ala Leu Arg Tyr Asp Ala Asp Asp Asp Tyr Pro Ala Phe
35 40 45
Cys Ile Ala Ala Ala Thr Arg Thr Val Ala Asp Pro Gly Ser Leu Gly
50 55 60
Ile Val Leu Gly Gly Ser Gly Asn Gly Glu Gln Ile Ala Ala Asn Lys
65 70 75 80
Val Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Ala Trp Ser Val Gln Thr Ala Ala
85 90 95
Leu Ala Arg Glu His Asn Asn Ala Gln Leu Ile Gly Ile Gly Gly Arg
100 105 110
Met His Thr Leu Glu Glu Ala Leu Arg Ile Val Lys Ala Phe Val Thr
115 120 125
Thr Pro Trp Ser Lys Ala Gln Arg His Gln Arg Arg Ile Asp Ile Leu
130 135 140
Ala Glu Tyr Glu Arg Thr His Glu Ala Pro Pro Val Pro Gly Ala Pro
145 150 155 160
Ala
<210> 21
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Gly Asp Asp Ala Arg Ile Ala Ala Ile Gly Asp Val Asp Glu Leu Asn
1 5 10 15
Ser Gln Ile Gly Val Leu Leu Ala Glu Pro Leu Pro Asp Asp Val Arg
20 25 30
Ala Ala Leu Ser Ala Ile Gln His Asp Leu Phe Asp Leu Gly Gly Glu
35 40 45
Leu Cys Ile Pro Gly His Ala Ala Ile Thr Glu Asp His Leu Leu Arg
50 55 60
Leu Ala Leu Trp Leu Val His Tyr Asn Gly Gln Leu Pro Pro Leu Glu
65 70 75 80
Glu Phe Ile Leu Pro Gly Gly Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala His Val
85 90 95
Cys Arg Thr Val Cys Arg Arg Ala Glu Arg Ser Ile Lys Ala Leu Gly
100 105 110
Ala Ser Glu Pro Leu Asn Ile Ala Pro Ala Ala Tyr Val Asn Leu Leu
115 120 125
Ser Asp Leu Leu Phe Val Leu Ala Arg Val Leu Asn Arg Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Ala Asp Val Leu Trp Asp Arg Thr Arg Ala His
145 150 155
<210> 22
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Ile Leu Ser Ala Glu Gln Ser Phe Thr Leu Arg His Pro His Gly Gln
1 5 10 15
Ala Ala Ala Leu Ala Phe Val Arg Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Gly
20 25 30
Val Gln Arg Leu Arg Gly Leu Asp Ser Asp Gly Glu Gln Val Trp Gly
35 40 45
Glu Leu Leu Val Arg Val Pro Leu Leu Gly Glu Val Asp Leu Pro Phe
50 55 60
Arg Ser Glu Ile Val Arg Thr Pro Gln Gly Ala Glu Leu Arg Pro Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Gly Glu Arg Ala Trp Val Ala Val Ser Gly Gln Ala Thr
85 90 95
Ala Ala Glu Gly Gly Glu Met Ala Phe Ala Phe Gln Phe Gln Ala His
100 105 110
Leu Ala Thr Pro Glu Ala Glu Gly Glu Gly Gly Ala Ala Phe Glu Val
115 120 125
Met Val Gln Ala Ala Ala Gly Val Thr Leu Leu Leu Val Ala Met Ala
130 135 140
Leu Pro Gln Gly Leu Ala Ala Gly Leu Pro Pro Ala
145 150 155
<210> 23
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp Met
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile Lys
20 25 30
Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala Cys
35 40 45
Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu Gly
50 55 60
Met Pro Gly Lys Lys Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala Ser
65 70 75 80
Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile Glu
85 90 95
Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys Ile
100 105 110
Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr Leu
115 120 125
Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu Arg
130 135 140
Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu
145 150 155
<210> 24
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Asp Asp Ile Asn Asn Gln Leu Lys Arg Leu Lys Val Ile Pro Val Ile
1 5 10 15
Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu Ala
20 25 30
Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala Ala
35 40 45
Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu Ile
50 55 60
Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys Glu
65 70 75 80
Ala Gly Ala Asp Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr Val
85 90 95
Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn Asn
100 105 110
Pro Ser Thr Val Glu Gln Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser Leu
130 135 140
Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile Thr
145 150 155 160
Pro Asp Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala Cys
165 170 175
Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Arg Asn Gly Glu Trp
180 185 190
Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn Pro
195 200 205
<210> 25
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro Ser
1 5 10 15
Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu Ser
35 40 45
Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser Ile
50 55 60
Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu Phe
65 70 75 80
Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr Ile
85 90 95
His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr Thr
100 105 110
Phe
<210> 26
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro Ser
1 5 10 15
Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser Glu
20 25 30
Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu Ser
35 40 45
Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser Ile
50 55 60
Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Glu Asp His Ser Ala Val Leu Phe
65 70 75 80
Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr Ile
85 90 95
His Phe Val Asp Leu Asp Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr Thr
100 105 110
Phe
<210> 27
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Val
1 5 10 15
Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala Phe
20 25 30
Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Val
35 40 45
Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr Leu
50 55 60
Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val Val
65 70 75 80
Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Asp
85 90 95
Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Ala
100 105 110
Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Glu His His Arg Phe
115 120 125
Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala Cys
130 135 140
Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala
145 150 155
<210> 28
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Val
1 5 10 15
Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala Phe
20 25 30
Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Val
35 40 45
Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr Leu
50 55 60
Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val Val
65 70 75 80
Asp Gly Gly Ile Tyr Asp His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Asp
85 90 95
Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Ala
100 105 110
Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Glu Asp His Glu Phe
115 120 125
Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala Cys
130 135 140
Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala
145 150 155
<210> 29
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 29
Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn
1 5 10 15
Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly
20 25 30
Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val
35 40 45
Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala
50 55 60
Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly
65 70 75 80
Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe
85 90 95
Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr
100 105 110
Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu Lys Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro
130 135 140
Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn
145 150 155 160
Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Asp
165 170 175
Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys Ala Lys Lys
180 185 190
Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu
195 200
<210> 30
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn
1 5 10 15
Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly
20 25 30
Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val
35 40 45
Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala
50 55 60
Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly
65 70 75 80
Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe
85 90 95
Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr
100 105 110
Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu Lys Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Glu Phe Val Glu Ala Met Lys Gly Pro
130 135 140
Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asp Leu Asp Asp
145 150 155 160
Val Cys Glu Trp Phe Asp Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Asp
165 170 175
Ala Leu Val Glu Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Asp Ala Lys Glu
180 185 190
Phe Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Thr Glu
195 200
<210> 31
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn
1 5 10 15
Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly
20 25 30
Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val
35 40 45
Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala
50 55 60
Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly
65 70 75 80
Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe
85 90 95
Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr
100 105 110
Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu Lys Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro
130 135 140
Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn
145 150 155 160
Val Cys Lys Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Lys
165 170 175
Ala Leu Val Lys Gly Lys Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys Ala Lys Lys
180 185 190
Phe Val Lys Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu
195 200
<210> 32
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Val
1 5 10 15
Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala Phe
20 25 30
Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Val
35 40 45
Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr Leu
50 55 60
Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val Val
65 70 75 80
Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Asp
85 90 95
Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Ala
100 105 110
Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Ala His Thr Leu Leu
115 120 125
Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala Cys
130 135 140
Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala
145 150 155
<210> 33
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Val
1 5 10 15
Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala Phe
20 25 30
Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Val
35 40 45
Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr Leu
50 55 60
Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val Val
65 70 75 80
Asp Gly Gly Ile Tyr Asp His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Asp
85 90 95
Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Ala
100 105 110
Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Ala Asp Thr Leu Leu
115 120 125
Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala Cys
130 135 140
Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala
145 150 155
<210> 34
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Val
1 5 10 15
Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala Phe
20 25 30
Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Val
35 40 45
Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr Leu
50 55 60
Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val Val
65 70 75 80
Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Asn
85 90 95
Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Ala
100 105 110
Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu Leu
115 120 125
Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala Cys
130 135 140
Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala
145 150 155
<210> 35
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> VARIANT
<222> (69)..(69)
<223> Xaa是A或K
<400> 35
Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp Met
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile Lys
20 25 30
Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala Cys
35 40 45
Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu Gly
50 55 60
Met Pro Gly Lys Xaa Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala Ser
65 70 75 80
Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile Glu
85 90 95
Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys Ile
100 105 110
Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr Leu
115 120 125
Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu Arg
130 135 140
Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu
145 150 155
<210> 36
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是S或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是T或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是A或R
<220>
<221> VARIANT
<222> (84)..(84)
<223> Xaa是T或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (118)..(118)
<223> Xaa是A或Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (162)..(162)
<223> Xaa是S或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (188)..(188)
<223> Xaa是T或R
<400> 36
Xaa Xaa Ile Asn Asn Gln Leu Lys Xaa Leu Lys Val Ile Pro Val Ile
1 5 10 15
Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu Ala
20 25 30
Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala Ala
35 40 45
Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu Ile
50 55 60
Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys Glu
65 70 75 80
Ala Gly Ala Xaa Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr Val
85 90 95
Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn Asn
100 105 110
Pro Ser Thr Val Glu Xaa Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser Leu
130 135 140
Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile Thr
145 150 155 160
Pro Xaa Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala Cys
165 170 175
Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Xaa Asn Gly Glu Trp
180 185 190
Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn Pro
195 200 205
<210> 37
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是T或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (32)..(32)
<223> Xaa是K或E
<220>
<221> VARIANT
<222> (70)..(70)
<223> Xaa是S或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (73)..(73)
<223> Xaa是R或E
<220>
<221> VARIANT
<222> (100)..(100)
<223> Xaa是N或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (102)..(102)
<223> Xaa是N或D
<400> 37
Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Xaa Asp Val Pro Ser
1 5 10 15
Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser Xaa
20 25 30
Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu Ser
35 40 45
Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser Ile
50 55 60
Gly Gly Ile Glu Pro Xaa Lys Asn Xaa Asp His Ser Ala Val Leu Phe
65 70 75 80
Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr Ile
85 90 95
His Phe Val Xaa Leu Xaa Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr Thr
100 105 110
Phe
<210> 38
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Y或H
<220>
<221> VARIANT
<222> (81)..(81)
<223> Xaa是N或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是R或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (104)..(104)
<223> Xaa是S或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (118)..(118)
<223> Xaa是R或E
<220>
<221> VARIANT
<222> (120)..(120)
<223> Xaa是R或E
<220>
<221> VARIANT
<222> (123)..(123)
<223> Xaa是A或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (125)..(125)
<223> Xaa是H或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (127)..(127)
<223> Xaa是R或E
<220>
<221> VARIANT
<222> (149)..(149)
<223> Xaa是A或N
<400> 38
Asn Gln His Ser His Lys Asp Xaa Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Val
1 5 10 15
Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala Phe
20 25 30
Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Val
35 40 45
Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr Leu
50 55 60
Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val Val
65 70 75 80
Xaa Gly Gly Ile Tyr Xaa His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Asp
85 90 95
Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Ala
100 105 110
Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Asp Ser Xaa Glu Xaa His Xaa Phe
115 120 125
Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala Cys
130 135 140
Ile Glu Ile Leu Xaa Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala
145 150 155
<210> 39
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> VARIANT
<222> (123)..(123)
<223> Xaa是T或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (136)..(136)
<223> Xaa是Q或E
<220>
<221> VARIANT
<222> (139)..(139)
<223> Xaa是K或E
<220>
<221> VARIANT
<222> (157)..(157)
<223> Xaa是N或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (160)..(160)
<223> Xaa是N或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (163)..(163)
<223> Xaa是E或K
<220>
<221> VARIANT
<222> (166)..(166)
<223> Xaa是D或K
<220>
<221> VARIANT
<222> (176)..(176)
<223> Xaa是S、D或K
<220>
<221> VARIANT
<222> (180)..(180)
<223> Xaa是K或E
<220>
<221> VARIANT
<222> (182)..(182)
<223> Xaa是T、D或K
<220>
<221> VARIANT
<222> (189)..(189)
<223> Xaa是D或K
<220>
<221> VARIANT
<222> (192)..(192)
<223> Xaa是A、E或K
<220>
<221> VARIANT
<222> (195)..(195)
<223> Xaa是E或K
<220>
<221> VARIANT
<222> (196)..(196)
<223> Xaa是E或K
<400> 39
Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn
1 5 10 15
Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly
20 25 30
Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val
35 40 45
Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala
50 55 60
Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly
65 70 75 80
Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe
85 90 95
Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr
100 105 110
Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Xaa Ile Leu Lys Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Xaa Phe Val Xaa Ala Met Lys Gly Pro
130 135 140
Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Xaa Leu Asp Xaa
145 150 155 160
Val Cys Xaa Trp Phe Xaa Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Xaa
165 170 175
Ala Leu Val Xaa Gly Xaa Pro Asp Glu Val Arg Glu Xaa Ala Lys Xaa
180 185 190
Phe Val Xaa Xaa Ile Arg Gly Cys Thr Glu
195 200
<210> 40
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Y或H
<220>
<221> VARIANT
<222> (37)..(37)
<223> Xaa是A或R
<220>
<221> VARIANT
<222> (81)..(81)
<223> Xaa是N或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是R或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (96)..(96)
<223> Xaa是N或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (104)..(104)
<223> Xaa是S、N或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (118)..(118)
<223> Xaa是R、E或N
<220>
<221> VARIANT
<222> (120)..(120)
<223> Xaa是R、E或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (121)..(121)
<223> Xaa是K或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (123)..(123)
<223> Xaa是K或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (125)..(125)
<223> Xaa是H或D
<400> 40
Asn Gln His Ser His Lys Asp Xaa Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Val
1 5 10 15
Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala Phe
20 25 30
Glu Ala Ala Met Xaa Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Val
35 40 45
Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr Leu
50 55 60
Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val Val
65 70 75 80
Xaa Gly Gly Ile Tyr Xaa His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Xaa
85 90 95
Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Ala
100 105 110
Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Ala Xaa Thr Leu Leu
115 120 125
Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala Cys
130 135 140
Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala
145 150 155
<210> 41
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Gly Glu Val Pro Ile Gly Asp Pro Lys Glu Leu Asn Gly Met Glu Ile
1 5 10 15
Ala Ala Val Tyr Leu Gln Pro Ile Glu Met Glu Pro Arg Gly Ile Asp
20 25 30
Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asp Ile His Leu Glu Ala Asp Ile His Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Asn Pro Asn Gly Phe Pro Glu Gly Phe Trp Met Pro Tyr
50 55 60
Leu Thr Ile Ala Tyr Ala Leu Ala Asn Ala Asp Thr Gly Ala Ile Lys
65 70 75 80
Thr Gly Thr Leu Met Pro Met Val Ala Asp Asp Gly Pro His Tyr Gly
85 90 95
Ala Asn Ile Ala Met Glu Lys Asp Lys Lys Gly Gly Phe Gly Val Gly
100 105 110
Thr Tyr Ala Leu Thr Phe Leu Ile Ser Asn Pro Glu Lys Gln Gly Phe
115 120 125
Gly Arg His Val Asp Glu Glu Thr Gly Val Gly Lys Trp Phe Glu Pro
130 135 140
Phe Val Val Thr Tyr Phe Phe Lys Tyr Thr Gly Thr Pro Lys
145 150 155
<210> 42
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
Ser Gln Ala Ile Gly Ile Leu Glu Leu Thr Ser Ile Ala Lys Gly Met
1 5 10 15
Glu Leu Gly Asp Ala Met Leu Lys Ser Ala Asn Val Asp Leu Leu Val
20 25 30
Ser Lys Thr Ile Ser Pro Gly Lys Phe Leu Leu Met Leu Gly Gly Asp
35 40 45
Ile Gly Ala Ile Gln Gln Ala Ile Glu Thr Gly Thr Ser Gln Ala Gly
50 55 60
Glu Met Leu Val Asp Ser Leu Val Leu Ala Asn Ile His Pro Ser Val
65 70 75 80
Leu Pro Ala Ile Ser Gly Leu Asn Ser Val Asp Lys Arg Gln Ala Val
85 90 95
Gly Ile Val Glu Thr Trp Ser Val Ala Ala Cys Ile Ser Ala Ala Asp
100 105 110
Leu Ala Val Lys Gly Ser Asn Val Thr Leu Val Arg Val His Met Ala
115 120 125
Phe Gly Ile Gly Gly Lys Cys Tyr Met Val Val Ala Gly Asp Val Leu
130 135 140
Asp Val Ala Ala Ala Val Ala Thr Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Lys
145 150 155 160
Gly Leu Leu Val Tyr Ala Ser Ile Ile Pro Arg Pro His Glu Ala Met
165 170 175
Trp Arg Gln Met Val Glu Gly
180
<210> 43
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
Glu Glu Val Val Leu Ile Thr Val Pro Ser Ala Leu Val Ala Val Lys
1 5 10 15
Ile Ala His Ala Leu Val Glu Glu Arg Leu Ala Ala Cys Val Asn Ile
20 25 30
Val Pro Gly Leu Thr Ser Ile Tyr Arg Trp Gln Gly Ser Val Val Ser
35 40 45
Asp His Glu Leu Leu Leu Leu Val Lys Thr Thr Thr His Ala Phe Pro
50 55 60
Lys Leu Lys Glu Arg Val Lys Ala Leu His Pro Tyr Thr Val Pro Glu
65 70 75 80
Ile Val Ala Leu Pro Ile Ala Glu Gly Asn Arg Glu Tyr Leu Asp Trp
85 90 95
Leu Arg Glu Asn Thr Gly
100
<210> 44
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Val Arg Gly Ile Arg Gly Ala Ile Thr Val Glu Glu Asp Thr Pro Ala
1 5 10 15
Ala Ile Leu Ala Ala Thr Ile Glu Leu Leu Leu Lys Met Leu Glu Ala
20 25 30
Asn Gly Ile Gln Ser Tyr Glu Glu Leu Ala Ala Val Ile Phe Thr Val
35 40 45
Thr Glu Asp Leu Thr Ser Ala Phe Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ile
50 55 60
Gly Met His Arg Val Pro Leu Leu Ser Ala Arg Glu Val Pro Val Pro
65 70 75 80
Gly Ser Leu Pro Arg Val Ile Arg Val Leu Ala Leu Trp Asn Thr Asp
85 90 95
Thr Pro Gln Asp Arg Val Arg His Val Tyr Leu Asn Glu Ala Val Arg
100 105 110
Leu Arg Pro Asp Leu Glu Ser Ala Gln
115 120
<210> 45
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Ser Lys Ala Lys Ile Gly Ile Val Thr Val Ser Asp Arg Ala Ser Ala
1 5 10 15
Gly Ile Thr Ala Asp Ile Ser Gly Lys Ala Ile Ile Leu Ala Leu Asn
20 25 30
Leu Tyr Leu Thr Ser Glu Trp Glu Pro Ile Tyr Gln Val Ile Pro Asp
35 40 45
Glu Gln Asp Val Ile Glu Thr Thr Leu Ile Lys Met Ala Asp Glu Gln
50 55 60
Asp Cys Cys Leu Ile Val Thr Thr Gly Gly Thr Gly Pro Ala Lys Arg
65 70 75 80
Asp Val Thr Pro Glu Ala Thr Glu Ala Val Cys Asp Arg Met Met Pro
85 90 95
Gly Phe Gly Glu Leu Met Arg Ala Glu Ser Leu Lys Glu Val Pro Thr
100 105 110
Ala Ile Leu Ser Arg Gln Thr Ala Gly Leu Arg Gly Asp Ser Leu Ile
115 120 125
Val Asn Leu Pro Gly Asp Pro Ala Ser Ile Ser Asp Cys Leu Leu Ala
130 135 140
Val Phe Pro Ala Ile Pro Tyr Cys Ile Asp Leu Met Glu Gly Pro Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Cys Asn Glu Ala Met Ile Lys Pro Phe Arg Pro Lys Ala Lys
165 170 175
<210> 46
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 46
Val Arg Gly Ile Arg Gly Ala Ile Thr Val Asn Ser Asp Thr Pro Thr
1 5 10 15
Ser Ile Ile Ile Ala Thr Ile Leu Leu Leu Glu Lys Met Leu Glu Ala
20 25 30
Asn Gly Ile Gln Ser Tyr Glu Glu Leu Ala Ala Val Ile Phe Thr Val
35 40 45
Thr Glu Asp Leu Thr Ser Ala Phe Pro Ala Glu Ala Ala Arg Gln Ile
50 55 60
Gly Met His Arg Val Pro Leu Leu Ser Ala Arg Glu Val Pro Val Pro
65 70 75 80
Gly Ser Leu Pro Arg Val Ile Arg Val Leu Ala Leu Trp Asn Thr Asp
85 90 95
Thr Pro Gln Asp Arg Val Arg His Val Tyr Leu Ser Glu Ala Val Arg
100 105 110
Leu Arg Pro Asp Leu Glu Ser Ala Gln
115 120
<210> 47
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 47
Arg Ile Thr Thr Lys Val Gly Asp Lys Gly Ser Thr Arg Leu Phe Gly
1 5 10 15
Gly Glu Glu Val Trp Lys Asp Ser Pro Ile Ile Glu Ala Asn Gly Thr
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Thr Ser Phe Ile Gly Glu Ala Lys His Tyr Val Asp
35 40 45
Glu Glu Met Lys Gly Ile Leu Glu Glu Ile Gln Asn Asp Ile Tyr Lys
50 55 60
Ile Met Gly Glu Ile Gly Ser Lys Gly Lys Ile Glu Gly Ile Ser Glu
65 70 75 80
Glu Arg Ile Ala Trp Leu Leu Lys Leu Ile Leu Arg Tyr Met Glu Met
85 90 95
Val Asn Leu Lys Ser Phe Val Leu Pro Gly Gly Thr Leu Glu Ser Ala
100 105 110
Lys Leu Asp Val Cys Arg Thr Ile Ala Arg Arg Ala Leu Arg Lys Val
115 120 125
Leu Thr Val Thr Arg Glu Phe Gly Ile Gly Ala Glu Ala Ala Ala Tyr
130 135 140
Leu Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Phe Leu Leu Ala Arg Val Ile Glu
145 150 155 160
Ile Glu Lys Asn Lys Leu Lys Glu Val Arg Ser
165 170
<210> 48
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 48
Pro His Leu Val Ile Glu Ala Thr Ala Asn Leu Arg Leu Glu Thr Ser
1 5 10 15
Pro Gly Glu Leu Leu Glu Gln Ala Asn Lys Ala Leu Phe Ala Ser Gly
20 25 30
Gln Phe Gly Glu Ala Asp Ile Lys Ser Arg Phe Val Thr Leu Glu Ala
35 40 45
Tyr Arg Gln Gly Thr Ala Ala Val Glu Arg Ala Tyr Leu His Ala Cys
50 55 60
Leu Ser Ile Leu Asp Gly Arg Asp Ile Ala Thr Arg Thr Leu Leu Gly
65 70 75 80
Ala Ser Leu Cys Ala Val Leu Ala Glu Ala Val Ala Gly Gly Gly Glu
85 90 95
Glu Gly Val Gln Val Ser Val Glu Val Arg Glu Met Glu Arg Leu Ser
100 105 110
Tyr Ala Lys Arg Val Val Ala Arg Gln Arg
115 120
<210> 49
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
Glu Ser Val Asn Thr Ser Phe Leu Ser Pro Ser Leu Val Thr Ile Arg
1 5 10 15
Asp Phe Asp Asn Gly Gln Phe Ala Val Leu Arg Ile Gly Arg Thr Gly
20 25 30
Phe Pro Ala Asp Lys Gly Asp Ile Asp Leu Cys Leu Asp Lys Met Ile
35 40 45
Gly Val Arg Ala Ala Gln Ile Phe Leu Gly Asp Asp Thr Glu Asp Gly
50 55 60
Phe Lys Gly Pro His Ile Arg Ile Arg Cys Val Asp Ile Asp Asp Lys
65 70 75 80
His Thr Tyr Asn Ala Met Val Tyr Val Asp Leu Ile Val Gly Thr Gly
85 90 95
Ala Ser Glu Val Glu Arg Glu Thr Ala Glu Glu Glu Ala Lys Leu Ala
100 105 110
Leu Arg Val Ala Leu Gln Val Asp Ile Ala Asp Glu His Ser Cys Val
115 120 125
Thr Gln Phe Glu Met Lys Leu Arg Glu Glu Leu Leu Ser Ser Asp Ser
130 135 140
Phe His Pro Asp Lys Asp Glu Tyr Tyr Lys Asp Phe Leu
145 150 155
<210> 50
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
Pro Val Ile Gln Thr Phe Val Ser Thr Pro Leu Asp His His Lys Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ile Ile Tyr Arg Ile Val Thr Arg Val Val Leu Gly
20 25 30
Lys Pro Glu Asp Leu Val Met Met Thr Phe His Asp Ser Thr Pro Met
35 40 45
His Phe Phe Gly Ser Thr Asp Pro Val Ala Cys Val Arg Val Glu Ala
50 55 60
Leu Gly Gly Tyr Gly Pro Ser Glu Pro Glu Lys Val Thr Ser Ile Val
65 70 75 80
Thr Ala Ala Ile Thr Ala Val Cys Gly Ile Val Ala Asp Arg Ile Phe
85 90 95
Val Leu Tyr Phe Ser Pro Leu His Cys Gly Trp Asn Gly Thr Asn Phe
100 105 110
<210> 51
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
Glu Glu Val Val Leu Ile Thr Val Pro Ser Ala Leu Val Ala Val Lys
1 5 10 15
Ile Ala His Ala Leu Val Glu Glu Arg Leu Ala Ala Cys Val Asn Ile
20 25 30
Val Pro Gly Leu Thr Ser Ile Tyr Arg Glu Glu Gly Ser Val Val Ser
35 40 45
Asp His Glu Leu Leu Leu Leu Val Lys Thr Thr Thr Asp Ala Phe Pro
50 55 60
Lys Leu Lys Glu Arg Val Lys Glu Leu His Pro Tyr Glu Val Pro Glu
65 70 75 80
Ile Val Ala Leu Pro Ile Ala Glu Gly Asn Arg Glu Tyr Leu Asp Trp
85 90 95
Leu Arg Glu Asn Thr Gly
100
<210> 52
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 52
Asn Leu Ala Glu Lys Met Tyr Lys Ala Gly Asn Ala Met Tyr Arg Lys
1 5 10 15
Gly Gln Tyr Thr Ile Ala Ile Ile Ala Tyr Thr Leu Ala Leu Leu Lys
20 25 30
Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Ala Tyr
35 40 45
Lys Lys Gly Glu Tyr Asp Glu Ala Ile Glu Ala Tyr Gln Lys Ala Leu
50 55 60
Glu Leu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala
65 70 75 80
Tyr Tyr Lys Gln Gly Asp Tyr Asp Glu Ala Ile Glu Tyr Tyr Lys Lys
85 90 95
Ala Leu Arg Leu Asp Pro Arg Asn Val Asp Ala Ile Glu Asn Leu Ile
100 105 110
Glu Ala Glu Glu Lys Gln Gly
115
<210> 53
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 53
Glu Glu Ala Glu Leu Ala Tyr Leu Leu Gly Glu Leu Ala Tyr Lys Leu
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Arg Ile Ala Ile Arg Ala Tyr Arg Ile Ala Leu Lys Arg
20 25 30
Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Tyr Tyr
35 40 45
Lys Gln Gly Asp Tyr Arg Glu Ala Ile Arg Tyr Tyr Leu Arg Ala Leu
50 55 60
Lys Leu Asp Pro Glu Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala
65 70 75 80
Leu Tyr Lys Gln Gly Lys Tyr Asp Leu Ala Ile Ile Ala Tyr Gln Ala
85 90 95
Ala Leu Glu Glu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Lys Gln Asn Leu Gly
100 105 110
Asn Ala Lys Gln Lys Gln Gly
115
<210> 54
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 54
Asn Ser Ala Glu Ala Met Tyr Lys Met Gly Asn Ala Ala Tyr Lys Gln
1 5 10 15
Gly Asp Tyr Ile Leu Ala Ile Ile Ala Tyr Leu Leu Ala Leu Glu Lys
20 25 30
Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Ala Tyr
35 40 45
Lys Gln Gly Asp Tyr Asp Glu Ala Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys Ala Leu
50 55 60
Glu Leu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala
65 70 75 80
Tyr Tyr Lys Gln Gly Asp Tyr Asp Glu Ala Ile Glu Tyr Tyr Glu Lys
85 90 95
Ala Leu Glu Leu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Leu Lys Asn Leu Leu
100 105 110
Glu Ala Ile Ala Glu Gln Asp
115
<210> 55
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 55
Thr Asp Pro Leu Ala Val Ile Leu Tyr Ile Ala Ile Leu Lys Ala Glu
1 5 10 15
Lys Ser Ile Ala Arg Ala Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Lys Ile Gly
20 25 30
Asp Glu Arg Ala Val Glu Pro Leu Ile Lys Ala Leu Lys Asp Glu Asp
35 40 45
Ala Leu Val Arg Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Gly Gln Ile Gly Asp
50 55 60
Glu Arg Ala Val Glu Pro Leu Ile Lys Ala Leu Lys Asp Glu Glu Gly
65 70 75 80
Leu Val Arg Ala Ser Ala Ala Ile Ala Leu Gly Gln Ile Gly Asp Glu
85 90 95
Arg Ala Val Gln Pro Leu Ile Lys Ala Leu Thr Asp Glu Arg Asp Leu
100 105 110
Val Arg Val Ala Ala Ala Val Ala Leu Gly Arg Ile Gly Asp Glu Lys
115 120 125
Ala Val Arg Pro Leu Ile Ile Val Leu Lys Asp Glu Glu Gly Glu Val
130 135 140
Arg Glu Ala Ala Ala Ile Ala Leu Gly Ser Ile Gly Gly Glu Arg Val
145 150 155 160
Arg Ala Ala Met Glu Lys Leu Ala Glu Arg Gly Thr Gly Phe Ala Arg
165 170 175
Lys Val Ala Val Asn Tyr Leu Glu Thr His Lys
180 185
<210> 56
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 56
Glu Glu Ala Glu Leu Ala Tyr Leu Leu Gly Glu Leu Ala Tyr Lys Leu
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Arg Ile Ala Ile Arg Ala Tyr Arg Ile Ala Leu Lys Arg
20 25 30
Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Tyr Tyr
35 40 45
Lys Gln Gly Asp Tyr Asp Glu Ala Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys Ala Leu
50 55 60
Glu Leu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala
65 70 75 80
Tyr Tyr Lys Gln Gly Asp Tyr Asp Glu Ala Ile Glu Tyr Tyr Glu Lys
85 90 95
Ala Leu Glu Leu Asp Pro Glu Asn Leu Glu Ala Leu Gln Asn Leu Leu
100 105 110
Asn Ala Met Asp Lys Gln Gly
115
<210> 57
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 57
Ile Glu Glu Val Val Ala Glu Met Ile Asp Ile Leu Ala Glu Ser Ser
1 5 10 15
Lys Lys Ser Ile Glu Glu Leu Ala Arg Ala Ala Asp Asn Lys Thr Thr
20 25 30
Glu Lys Ala Val Ala Glu Ala Ile Glu Glu Ile Ala Arg Leu Ala Thr
35 40 45
Ala Ala Ile Gln Leu Ile Glu Ala Leu Ala Lys Asn Leu Ala Ser Glu
50 55 60
Glu Phe Met Ala Arg Ala Ile Ser Ala Ile Ala Glu Leu Ala Lys Lys
65 70 75 80
Ala Ile Glu Ala Ile Tyr Arg Leu Ala Asp Asn His Thr Thr Asp Thr
85 90 95
Phe Met Ala Arg Ala Ile Ala Ala Ile Ala Asn Leu Ala Val Thr Ala
100 105 110
Ile Leu Ala Ile Ala Ala Leu Ala Ser Asn His Thr Thr Glu Glu Phe
115 120 125
Met Ala Arg Ala Ile Ser Ala Ile Ala Glu Leu Ala Lys Lys Ala Ile
130 135 140
Glu Ala Ile Tyr Arg Leu Ala Asp Asn His Thr Thr Asp Lys Phe Met
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ile Glu Ala Ile Ala Leu Leu Ala Thr Leu Ala Ile Leu
165 170 175
Ala Ile Ala Leu Leu Ala Ser Asn His Thr Thr Glu Lys Phe Met Ala
180 185 190
Arg Ala Ile Met Ala Ile Ala Ile Leu Ala Ala Lys Ala Ile Glu Ala
195 200 205
Ile Tyr Arg Leu Ala Asp Asn His Thr Ser Pro Thr Tyr Ile Glu Lys
210 215 220
Ala Ile Glu Ala Ile Glu Lys Ile Ala Arg Lys Ala Ile Lys Ala Ile
225 230 235 240
Glu Met Leu Ala Lys Asn Ile Thr Thr Glu Glu Tyr Lys Glu Lys Ala
245 250 255
Lys Lys Ile Ile Asp Ile Ile Arg Lys Leu Ala Lys Met Ala Ile Lys
260 265 270
Lys Leu Glu Asp Asn Arg Thr
275
<210> 58
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 58
Lys Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg Trp
1 5 10 15
Asn Ala Glu Ile Ile Leu Ala Leu Val Leu Gly Ala Leu Lys Arg Leu
20 25 30
Gln Glu Phe Gly Val Lys Arg Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val Pro
35 40 45
Gly Ser Phe Glu Leu Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys Gln
50 55 60
Lys Arg Leu Gly Lys Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Ile Lys Gly Ser Thr Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr Thr
85 90 95
His Gln Leu Met Lys Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile Phe
100 105 110
Gly Val Leu Thr Cys Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala Gly
115 120 125
Leu Ile Glu Gly Lys Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala
130 135 140
Ala Val Glu Met Ala Thr Lys Phe Asn
145 150
<210> 59
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 59
Glu Glu Ala Glu Leu Ala Tyr Leu Leu Gly Glu Leu Ala Tyr Lys Leu
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Arg Ile Ala Ile Arg Ala Tyr Arg Ile Ala Leu Lys Arg
20 25 30
Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Tyr Tyr
35 40 45
Lys Gln Gly Arg Tyr Arg Glu Ala Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys Ala Leu
50 55 60
Glu Leu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala
65 70 75 80
Tyr Tyr Glu Arg Gly Glu Tyr Glu Glu Ala Ile Glu Tyr Tyr Arg Lys
85 90 95
Ala Leu Arg Leu Asp Pro Asn Asn Ala Asp Ala Met Gln Asn Leu Leu
100 105 110
Asn Ala Lys Met Arg Glu Glu
115
<210> 60
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 60
Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val
1 5 10 15
Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala
20 25 30
Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp
35 40 45
Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr
50 55 60
Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val
65 70 75 80
Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile
85 90 95
Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser
100 105 110
Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu
115 120 125
Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala
145 150 155
<210> 61
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 61
Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala
1 5 10 15
Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly
20 25 30
Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr
35 40 45
Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly
50 55 60
Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Ala Arg Lys Ala Val Glu Ser
65 70 75 80
Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln
85 90 95
Phe Ala Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro
100 105 110
Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu Lys Leu
115 120 125
Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly
130 135 140
Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp
145 150 155 160
Asn Val Ala Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly
165 170 175
Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys Ala Lys
180 185 190
Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Ala Thr Glu Leu Glu
195 200 205
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 62
Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys
1 5 10

Claims (54)

1.一种制备纳米结构的方法，所述方法包括用增溶溶液溶解来自包涵体的重组组分B(compB)蛋白，从而生成包括产物compB蛋白的产物样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述增溶溶液包括尿素，任选地尿素浓度为0.15M至2M，任选地为0.5M。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述增溶溶液是pH为7至8，任选地pH为7.4的缓冲溶液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述增溶溶液包括两性离子表面活性剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述增溶溶液包括3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括在所述增溶步骤之前用包括尿素的洗涤溶液洗涤所述包涵体，任选地，尿素浓度小于150mM，任选地为50mM至150mM。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括使所述compB蛋白与阴离子交换树脂，任选地弱阴离子交换树脂，任选地二乙氨基乙基(DEAE)缀合树脂接触；并且使用洗脱溶液从所述树脂中洗脱所述compB蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法包括在所述洗脱步骤之前用柱洗涤溶液洗涤所述阴离子交换树脂，所述柱洗涤溶液包括：
两性离子表面活性剂，任选地3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)或其等效物，和/或
非离子表面活性剂，任选地Triton X-100或其等效物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述洗脱溶液包括氯化钠(NaCl)浓度为400mM至600mM的NaCl。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括用混合模式树脂，任选地陶瓷羟基磷灰石(CHT)树脂纯化所述compB蛋白。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述包涵体在包括编码所述compB蛋白的多核苷酸的细菌细胞中生成，所述多核苷酸操作性地连接到启动子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述细菌细胞在低于约33℃下，任选地在约15℃至约33℃下或在约17℃至约30℃下，优选地在约30℃下培养。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细菌细胞是B菌株大肠杆菌细胞。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述细菌细胞是K12菌株大肠杆菌细胞。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述启动子是PhoA启动子。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述启动子是除T7启动子以外的启动子。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法包括在裂解溶液中裂解所述细菌细胞，其中所述裂解溶液基本上不含促进包涵体溶解度的药剂；以及回收所述包涵体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述裂解溶液基本上不含洗涤剂。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述产物compB蛋白具有至少50％的溶解度，任选地70％至95％的溶解度。
21.根据权利要求20所述的方法，其中通过凝胶过滤色谱法，任选地使用Superose 6柱测量溶解度。
22.根据权利要求1所述的方法，其中以占总蛋白质的重量比(w/w)计算，所述产物compB蛋白具有至少80％的纯度，任选地具有至少95％w/w的纯度。
23.根据权利要求22所述的方法，其中通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，任选地变性SDS-PAGE测量纯度。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述产物compB蛋白为至少70％w/w组装感受态，任选地为90％至98％w/w组装感受态。
25.根据权利要求24所述的方法，其中组装感受态compB蛋白的百分比被定义为当所述compB蛋白与包括过量的组分A(compA)蛋白的溶液混合时，所述产物溶液中组装成基于蛋白质的病毒样颗粒(vpVLP)的compB蛋白的以重量比(w/w)计的百分比。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述产物溶液包括少于50个内毒素单位/毫克总蛋白(EU/mg)，任选地5个至15个单位EU/mg。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括使所述compB蛋白变性和/或不包括重新折叠所述compB蛋白。
28.根据权利要求1所述的方法，其中compB蛋白的产率在采集时为介于约170g/L湿细胞重量(WCW)至190g/L WCW之间和/或在所述包涵体中为约1g/L WCW compB蛋白。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述compB蛋白是I53-50B蛋白。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述I53-50B蛋白与以下共有至少95％的同一性：I53-50B.1(SEQ ID NO:32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO:33)或I53-50B.4PosT1(SEQID NO:34)。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述I53-50B是由以下表示的蛋白质中的任一种：SEQ ID NO:40(I53-50B属)。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述I53-50B蛋白与以下共有至少99％的同一性：I53-50B.1(SEQ ID NO:32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO:33)或I53-50B.4PosT1(SEQID NO:34)。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述I53-50B蛋白与以下共有100％的同一性：I53-50B.1(SEQ ID NO:32)、I53-50B.1NegT2(SEQ ID NO:33)或I53-50B.4PosT1(SEQ IDNO:34)。
34.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述compB蛋白是I53_dn5A蛋白。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述I53_dn5A蛋白与以下共有至少95％的同一性：SEQ ID NO:169。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述I53_dn5A蛋白与以下共有至少99％的同一性：SEQ ID NO:169。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述I53_dn5A蛋白与以下共有至少100％的同一性：SEQ ID NO:169。
38.一种组合物，其包括通过根据权利要求1至37中任一项所述的方法产生的compB蛋白。
39.一种组合物，其包括compB蛋白，其中所述compB蛋白是：
a.至少50％可溶，任选地70％至95％可溶；
b.至少80％纯，其中纯度以占总蛋白质的重量比(w/w)计算，任选地至少95％w/w纯；和/或
c.至少70％w/w组装感受态，任选地90％至100％w/w组装感受态。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述组合物包括以下中的一种或多种：20mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲剂，任选地为20mM；和/或250mM NaCl，任选地为250mM。
41.根据权利要求39所述的组合物，其中将所述组合物缓冲为7至8的pH，任选地7.4的pH。
42.根据权利要求39所述的组合物，其中所述组合物对储存和/或冻融是稳定的。
43.一种制备纳米结构的方法，其中所述纳米结构包括组分A(compA)蛋白和组分B(compB)蛋白，其中所述compB蛋白用增溶溶液从包涵体中溶解，从而生成分离的compB蛋白，其中compA和所述分离的compB形成纳米结构。
44.一种纳米结构，其通过根据权利要求43所述的方法制备。
45.根据权利要求44所述的纳米结构，其中compB由与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列编码：SEQ IN NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、27、28、32-34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58。
46.根据权利要求44所述的纳米结构，其中所述compA和所述compB各自包括分别与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列：
(i)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
(ii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
(iii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:24；
(iv)SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:4；
(v)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；
(vi)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
(vii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:27；
(viii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:28；
(ix)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:6；
(x)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27；
(xi)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28；
(xii)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:6；
(xiii)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；
(xiv)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28；
(xv)SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38；
(xvi)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
(xvii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:32；
(xviii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:33；
(xix)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:34；
(xx)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:8；
(xxi)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:32；
(xxii)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:33；
(xxiii)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34；
(xxiv)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:8；
(xxv)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32；
(xxvi)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:33；
(xxvii)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34；
(xxviii)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:8；
(xxix)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；
(xxx)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33；
(xxxi)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34；
(xxxii)SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；
(xxxiii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
(xxxiv)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；
(xxxv)SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；
(xxxvi)SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；
(xxxvii)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
(xxxviii)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；
(xxxix)SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；
(xl)SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42；
(xli)SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；
(xlii)SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46；
(xliii)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；
(xliv)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50；
(xlv)SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:44；
(xlvi)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:52；
(xlvii)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:54；
(xlviii)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:56；以及
(xlix)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:58。
47.一种药物组合物，其包括根据权利要求44所述的纳米结构以及药学上可接受的稀释剂。
48.一种疫苗，其包含根据权利要求44至47中任一项所述的纳米结构。
49.一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求44所述的纳米结构、根据权利要求47所述的药物组合物或根据权利要求48所述的疫苗。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述疾病或病症是病毒感染。
51.一种在有需要的受试者体内产生免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求44所述的纳米结构、根据权利要求47所述的药物组合物或根据权利要求48所述的疫苗。
52.一种试剂盒，其包括根据权利要求44所述的纳米结构、根据权利要求47所述的药物组合物或根据权利要求48所述的疫苗。
53.一种根据权利要求44所述的纳米结构、根据权利要求46所述的药物组合物或根据权利要求48所述的疫苗用于根据权利要求49至51中任一项所述的方法或作为药物的用途。
54.根据权利要求44所述的纳米结构、根据权利要求46所述的药物组合物或根据权利要求48所述的疫苗，其用于根据权利要求49至51中任一项所述的方法或作为药物。
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