CN116063578A - 一种以诺如病毒衍生的纳米颗粒作为疫苗平台的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以诺如病毒衍生的纳米颗粒作为疫苗平台的制备方法和应用,所述纳米颗粒由SpyCatcher003融合到诺如病毒S结构域的C端、自组装形成,是一种强大的、模块化、多功能的、通用的纳米颗粒。该纳米颗粒作为新型疫苗平台,可以快速地通过异肽键与Spytag003偶联的肿瘤抗原连接并呈递在纳米颗粒表面,形成纳米疫苗。所述纳米疫苗在体外显著促进骨髓来源的树突状细胞成熟和抗原呈递。在荷瘤小鼠中,皮下免疫后能有效迁移到淋巴结,并诱导肿瘤特异性T细胞免疫,重塑肿瘤微环境,抑制肿瘤生长甚至完全消除已形成的肿瘤。依照此方法,可以快速的获得针对不同肿瘤的个性化疫苗。这种基因工程改造的诺如病毒衍生的纳米颗粒是一种有前途的多功能通用疫苗平台。
Description
技术领域
本发明属于免疫治疗技术领域,特别涉及一种以诺如病毒衍生的纳米颗粒作为疫苗平台的制备方法和应用。
背景技术
免疫治疗是一种重要的临床癌症治疗方法,治疗性疫苗近年来受到越来越多的关注。肿瘤疫苗的主要策略是针对肿瘤抗原,诱导特异性T细胞反应,通过机体的免疫系统反应重建免疫监视和免疫清除癌细胞,防止肿瘤生长。不幸的是,在过去几十年中开发的肿瘤疫苗的临床表现并不令人满意。肿瘤抗原由于免疫抑制和免疫逃逸机制,一般表现为低免疫原性或免疫不耐受,往往不足以引起有效的抗肿瘤反应。然而,随着新的生物信息技术的快速发展,如高通量测序、表位预测算法和免疫蛋白组学,可以准确识别免疫反应性和特异性的肿瘤抗原/新抗原,使肿瘤疫苗,尤其是个性化疫苗,更有可能取得临床疗效。基于新抗原的个体化肿瘤疫苗已成为癌症免疫治疗的一个重要分支,大量临床试验正在进行中。鉴定肿瘤的新抗原目前已经不是肿瘤疫苗领域的难点。然而,如何诱导机体产生高数量的新抗原特异性T细胞免疫应答仍然是该领域的关键技术挑战。目前,主要的免疫策略是通过新抗原长肽结合佐剂或mRNA疫苗技术,但其效率仍然有限。肿瘤疫苗领域的另一个难点在于多种肿瘤新抗原的递送不足,由于单一新抗原的引发的抗肿瘤免疫反应不足,如何高效的同时递送多种肿瘤新抗原是目前肿瘤疫苗领域的热点。
为了开发有效的肿瘤疫苗,一个高免疫原性和针对性的抗原递送系统尤为重要。据报道,纳米级疫苗具有高免疫原性,各种蛋白质纳米颗粒已被开发为递送抗原的载体。然而,基于蛋白质纳米颗粒的递送的主要限制之一是,抗原的引入可能会破坏载体蛋白质组装成纳米颗粒的能力。更多的研究集中在多肽而非蛋白质抗原的呈现上,影响了基于蛋白质纳米粒子的疫苗策略的应用。目前,将异源抗原引入蛋白纳米颗粒载体通常使用两种主要方法,即化学连接和基因重组融合。然而,化学修饰可能无法有效控制,可能导致过量的不需要的位点和分子变化,从而引起恼人的问题,如蛋白质聚集、产品异质性和引入不相关或不可预测的抗原位点。此外,基因融合可能导致重组蛋白错误折叠,导致纳米粒子的破坏和关键抗原性的丧失。
原则上,治疗性疫苗有潜力通过训练长期的、肿瘤抗原特异性的抗肿瘤免疫来消除肿瘤,从而显著改善患者的预后和阻止复发。此外,治疗性癌症疫苗的主要目的是激发机体对肿瘤的适应性免疫,重新建立对肿瘤的监测和清除。决定肿瘤疫苗接种效果的关键事件包括肿瘤抗原向树突状细胞(DC)的传递效率、抗原的高效处理和交叉递呈、DC激活的特征、效应T细胞反应的强度和持久性以及效应T细胞在肿瘤微环境中的浸润和活性维持。树突状细胞在肿瘤特异性免疫反应的发展中起着关键作用。据报道,病毒来源的许多纳米颗粒具有拥有病原相关的分子模式,能够有效的刺激DC成熟和抗原呈递。诺如病毒(Nov)是一种单正链RNA病毒,是目前世界上大多数国家引起急性胃肠炎的主要病毒病原体。诺如病毒的基因组长度约为7500个核苷酸,由三个开放阅读框(ORFs)组成。ORF2编码主要的衣壳蛋白VP1,通过X射线晶体学对Nov VP1的结构分析显示,全长的VP1由一个N端壳(S)结构域组成,通过一个短的、灵活的铰链与一个C端突出的(P)结构域相连。目前,针对诺如病毒的研究集中在诺如病毒疫苗的研究上,纳米颗粒的组装也聚焦于使用毕赤酵母或者杆状病毒表达VP1蛋白并自组装成病毒样颗粒(VLP),尚无对于改造诺如病毒的结构蛋白并应用于肿瘤疫苗领域。如何在大肠杆菌中改造诺如病毒相关的结构蛋白呈递肿瘤抗原和引发特异性的抗肿瘤免疫,是目前仍未解决的科学问题。
发明内容
为了克服现有技术的问题,本发明通过对诺如病毒结构蛋白的S结构域的基因改造,提出了一种以诺如病毒衍生的纳米颗粒作为疫苗平台的制备方法和应用,从而快速的获得针对不同肿瘤的个性化疫苗。
本发明的第一方面,提供了一种以诺如病毒衍生的纳米颗粒,所述纳米颗粒由诺如病毒S结构域通过连接臂,与SpyCatcher003融合形成,纳米颗粒的尺寸为10nm~50nm,是一种高度规律均一且稳定的纳米颗粒(Nov-S-Catcher003)。
所述诺如病毒S结构域为下述A1~A3中任一种:
A1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质;
A2.A1所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与A1所示的氨基酸序列具有85%以上的同一性的蛋白质;
A3.在A1或A2的N端和/或C端连接标签得到的蛋白质。
特别地,所述的诺如病毒的S结构域包括不同诺如病毒不同基因组的不同基因型,比如说GII.2、GII.3、GII.6、GII.17、GI.1等。
所述SpyCatcher003为下述B1~B3中任一种:
B1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质;
B2.B1所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与B1所示的氨基酸序列具有85%以上的同一性的蛋白质;
B3.在B1或B2的N端和/或C端连接标签得到的蛋白质。
进一步的,所述纳米颗粒从N端到C端,分别是诺如病毒S结构域、连接臂和SpyCatcher003,其中,SpyCatcher003可与SpyTag003自发形成异肽键偶联,实现抗原的“即插即用”,通过异肽键的形成将SpyTag003偶联的抗原高效地结合到所述纳米颗粒上。SpyCatcher003和SpyTag003之间的异肽键是通过赖氨酸(Lys)的NH2-基团和天冬氨酸(Asp)的COOH-基团介导的。通过简单的混合,异肽键很容易在许多不同的条件下形成,如pH值范围为5~10,温度从4℃到37℃。SpyCatcher003是SpyCatcher的一个变体,被设计用来加速与SpyTag003的反应速率。
上述纳米颗粒可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。另外,标签蛋白是指利用DNA体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽,为便于目的蛋白的示踪和/或纯化。
本发明的第二方面,提供了与所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒相关的密码子,所述密码子由编码诺如病毒S结构域的密码子,编码连接臂的密码子,及编码SpyCatcher003的密码子组成。
本发明的第三方面,提供了一种重组载体,所述重组载体含有上述的密码子。
本发明的第四方面,提供了一种重组微生物,所述重组微生物含有上述的密码子,或含有上述的重组载体。
本发明的第五方面,提供了一种纳米疫苗,所述纳米疫苗由如上述纳米颗粒,与抗原结合形成;所述抗原通过连接臂直接与SpyTag003连接而成,SpyTag003与所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒中的SpyCatcher003通过异肽键偶联;
所述SpyTag003为下述C1~C3中任一种:
C1.氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多肽;
C2.C1所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与B1所示的氨基酸序列具有85%以上的同一性的多肽;
C3.在C1或C2的N端和/或C端连接标签得到的多肽。
进一步的,所述抗原包括肿瘤抗原,以及各类传染病的肽抗原或亚单位抗原。所述肿瘤抗原包括黑色素瘤,宫颈癌,乳腺癌,结肠癌在内的肿瘤新抗原。并且,所述纳米疫苗与SpyTag003偶联的抗原偶联的比例为1:1到1:6之间,并且可以同时偶联多个不同抗原。
本发明的第六方面,提供了一种所述纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:使所述诺如病毒S结构域的编码基因,连接臂的编码基因,及SpyCatcher003的编码基因融合后,在生物细胞中进行表达得到所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒。
本发明的第七方面,提供了一种所述纳米颗粒、或所述密码子、或所述重组载体、或所述重组微生物,在制备纳米疫苗中的应用。
本发明中,同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。
本发明的优点和有益效果是:
1、本发明成功地开发了一种新的疫苗载体系统,即所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒,其中利用诺如病毒来源的纳米颗粒作为支架,支持SpyCatcher的表面呈现,该纳米颗粒通过大肠杆菌表达实现,易于制备,且具有周期短(3-5天),产量高(97.8mg/ml),蛋白可溶性好,蛋白组装效率高等优点;
2、本发明所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒,利用SpyCatcher003可与SpyTag003自发形成异肽键偶联,实现抗原的“即插即用”,即通过异肽键的形成将SpyTag003偶联的抗原高效地结合到所述纳米颗粒上;并且,所述纳米颗粒与多种类型抗原适配,包括多种传染病相关的肽抗原、亚单位抗原,以及肿瘤的新抗原(包括黑色素瘤,宫颈癌,乳腺癌,结肠癌等),特别是肿瘤的新抗原,大多数为肽抗原,易于化学合成,周期短,对于疾病的治疗和预防能极大的缩短疫苗制备的时间,并且稳定性好,易于储备和运输;
3、基于所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒,制备获得的纳米疫苗,可激发强大的全身抗肿瘤细胞免疫,有效地重塑局部肿瘤微环境,获得抗肿瘤免疫反应,从而获得显著的肿瘤抑制作用;
4、本发明所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒,在呈现多种抗原或多种抗原组合方面的拥有显著的灵活性,所述纳米平台能够同时呈递多种抗原或者不同抗原的组合,能够极大的缩短疫苗的制备周期和增强疫苗的效果。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明实施例1将Nov-S基因与SpyCatcher003基因融合并在大肠杆菌表达后自组装成纳米颗粒的的过程示意图;
图2是本发明实施例1进行纳米颗粒表达和纯化的过程示意图;其中,A为Nov-S-Catcher003的表达和纯化流程图;B为用SDS-PAGE分析不同温度下重组蛋白的表达和可溶性部分,其中T为细菌总蛋白;P为超声和离心后的不可溶组分;S为超声和离心后的可溶性部分;C为抗His标签抗体Western blot分析;D为收集的Ni-NTA亲和层析组分的SDS-PAGE分析,其中Sup:上层清液;FL:流穿液;E为Ni-NTA层析后进一步纯化的凝胶过滤层析图,其中箭头表示含有Nov-S-Catcher003纳米颗粒的部分;F为凝胶过滤层析后SDS-PAGE通过条带扫描分析蛋白纯度;
图3是本发明实施例2进行纳米颗粒鉴定的结果图;
图4是本发明实施例3进行纳米颗粒稳定性考察的结果图;
图5是本发明实施例4自组装后的纳米颗粒与SpyTag003标记的抗原通过异肽键连接的示意图;
图6是本发明实施例4纳米颗粒与SpyTag003标记的抗原异肽键的偶联效率;其中,A为纳米颗粒和抗原在4℃孵育20h后不同比例结合的SDS-PAGE分析;B为纳米颗粒和抗原在不同比例下的偶联动力学;C为纳米颗粒偶联抗原后的TEM图像和DLS粒径分析;
图7是本发明实施例4纳米颗粒与抗原偶联后形成的纳米疫苗在不同温度下储存两周后的粒径分析结果图;
图8是本发明实施例5纳米疫苗在体外诱导DC成熟的流式分析结果图;其中,A为CD80+和CD86+阳性的细胞比例;B为CD11c+MHC I+细胞的比例;C为CD11c+MHC II+细胞的比例;
图9是本发明实施例6纳米疫苗引流并驻留在淋巴结的结果图;A为皮下分别注射PBS、Tag003-E7(FITC标记)和纳米疫苗(FITC标记)后12小时和36小时后淋巴结内FITC荧光强度的图像;B为腹股沟淋巴结冷冻切片中FITC的代表性荧光图像;
图10是本发明实施例7纳米疫苗皮下免疫后预防性策略对肿瘤的抑制结果图;A为皮下免疫三针纳米疫苗(每针间隔7天)后接种TC-1肿瘤细胞的肿瘤生长曲线;B为实验终点后小鼠脾脏的CTL的流式分析;
图11是本发明实施例7纳米疫苗对荷瘤小鼠的治疗后的结果图;A为治疗后的小鼠肿瘤体积的生长曲线;B为小鼠肿瘤的解剖图像;C为小鼠脾脏的CTL流式分析。
具体实施方式
以下实施例中,在没有特别说明的情况下,涉及到的实验仪器和原料均为市售品。
实验仪器,参见表1。
表1
仪器 | 型号 | 来源 |
透射电子显微镜 | SU7000 | Hitachi |
流式细胞仪 | CytoFLEX LX | Beckman Coulter |
粒径分析仪 | Zetasizer Nano ZS | 英国马尔文仪器有限公司 |
原料,参见表2。
表2
原料 | 级别/型号 | 来源 |
SpyTag003 | / | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
大肠杆菌感受态细胞 | BL21/DE3 | 天根生化科技有限公司 |
pThioHisA质粒 | / | Thermo Fisher Scientific |
<![CDATA[HPV 16特异抗原E7<sub>49-57</sub>]]> | / | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
Ni Sepharose 6 Fast Flow | / | Cytiva |
Sepharose 6 Fast Flow | / | Cytiva |
内切酶 | / | Takara |
质粒提取试剂盒 | / | 天根生化科技有限公司 |
实施例1——Nov-S-Catcher003纳米颗粒的制备
本实施例提供了一种以诺如病毒衍生的纳米颗粒(Nov-S-Catcher003)及其制备方法,如图1所示,所述纳米颗粒从N端到C端,分别是诺如病毒S结构域(1-221个氨基酸)、连接臂和SpyCatcher003。将Nov-S基因与SpyCatcher003基因融合并在大肠杆菌表达后自组装成纳米颗粒,具体的,Nov-S-Catcher003的制备过程包括以下步骤:
(1)质粒构建:合成编码诺如病毒S结构域、连接臂及SpyCatcher003的编码基因,并将其克隆到pThioHisA质粒中,酶切位点为Nde I和EcoR I。所述诺如病毒S结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;SpyCatcher003的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
具体的,诺如病毒S结构域的氨基酸序列为:
MKMASNDASPSDGSTANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPANAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKVIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIIVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDSTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVE。
SpyCatcher003的氨基酸序列为:
VTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHT。
连接臂(Linker)就是G(Gly)甘氨酸和S(Ser)丝氨酸的GS组合。可以将结构域自由确定不同结构域之间的Linker的长短和组合。本实施例选用连接臂的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示,具体为:GGGGSGS。
为了方便纯化,在SpyCatcher003的末端添加6个组氨酸标签(HHHHHH),Nov-S-Catcher003结构如图1中A所示。
(2)蛋白表达:如图2所示,将构建的质粒转化至大肠杆菌的感受态细胞中(BL21、DE3),从-80℃冰箱中取出所述大肠杆菌感受态细胞100μl放在冰上融化;待感受态细胞融化后,加入步骤(1)构建得到的质粒20ng后混匀,在冰上放置30min;将上述感受态细胞放入42℃水浴锅中热激50s后,迅速放回冰上3分钟,随后加入900μl LB培养基,并放在摇床上,转速为200rpm,40分钟。将转化后的细胞均匀涂在氨苄青霉素抗性的固体LB培养基上,置于37℃培养箱过夜培养。挑选单克隆接种于LB培养基中,在37℃下以220rpm的速度振荡培养,直到OD600达到0.6。然后,向培养物中加入1mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG),在恒温摇床上30℃诱导蛋白表达16小时,转速为200rpm。在诱导前后均取样200μl用于电泳鉴定。
(3)蛋白纯化:蛋白诱导结束后,诱导培养的细菌在4℃下6000rpm离心10min,然后收集细菌。将细胞重悬于冰冷的裂解缓冲液(0.01M PBS,500mM氯化钠,pH 7.2)中,超声裂解。在12000rpm离心20分钟后收集上清,通过0.45μm过滤器过滤,然后使用填料NiSepharose 6Fast Flow进行镍柱亲和层析纯化,并使用洗脱缓冲液(0.01M PBS,500mM氯化钠,500mM咪唑,PH 7.0)洗脱目的蛋白。洗脱后的目的蛋白最后用填料Sepharose 6FastFlow在组装缓冲液(0.01M PBS,500mM氯化钠,pH 6.0)进行凝胶过滤层析获得均一的蛋白纳米颗粒,即为所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒(Nov-S-Catcher003)。在纯化的每个过程均取样200μl。
实施例2——Nov-S-Catcher003纳米颗粒的鉴定
本实施例采用SDS-PAGE和WB技术,对实施例1制备纯化获得的Nov-S-Catcher003纳米颗粒进行鉴定。
具体的,使用12%的SDS-PAGE凝胶分离所述Nov-S-Catcher003纳米颗粒样品,并转移到PVDF膜(Millipore)上,一抗采用小鼠抗His Tag单克隆抗体(Beyotime,1:2000),二抗采用HRP标记的抗小鼠IgG(Beyotime,1:5000)。使用透射电子显微镜观察观察Nov-S-Catcher003纳米颗粒的形态。同时,利用动态光散射(DLS)仪器Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments,Malvern,UK)测量了所述Nov-S-Catcher003纳米颗粒的粒径分布。
结果如图3所示,左图为透射电子显微镜(TEM)的图像,右图为动态光散射(DLS)测量的纳米颗粒的粒径表征。所述Nov-S-Catcher003纳米颗粒的流体动力学直径为28.64±0.18nm。这些结果均显示通过在大肠杆菌中表达纯化后的Nov-S-Catcher003纳米颗粒能够高效的自助装成均一的环装纳米颗粒,这为后面抗原在纳米颗粒的表面修饰提供了一个稳固的平台。
实施例3——Nov-S-Catcher003纳米颗粒稳定性
本实施例考察了实施例1制备纯化获得的Nov-S-Catcher003纳米颗粒的稳定性。
具体的,对所述Nov-S-Catcher003纳米颗粒样品进行以下两种不同的处理程序:
(1)将所述Nov-S-Catcher003纳米颗粒样品分别在-80℃、-20℃、4℃或25℃保存两周,而后,12000rpm离心10min后,用SDS-PAGE分离上清蛋白,用ImageLab软件对靶蛋白条带进行扫描和密度分析。
(2)将所述Nov-S-Catcher003纳米颗粒样品冻融1至8个循环。而后同样的,12000rpm离心10min后,用SDS-PAGE分离上清蛋白,用ImageLab软件对靶蛋白条带进行扫描和密度分析。
稳定性考察的结果如图4所示,处理样品中目的蛋白与原样品中目的蛋白的比值反映了蛋白质的稳定性。图4中,A为不同冻融循环后可溶性蛋白的SDS-PAGE分析,B图为纳米颗粒在不同温度下保存两周后的SDS-PAGE分析。从SDS-PAGE的结果来看,Nov-S-Catcher003纳米颗粒在多次冻融循环和不同温度储存后均保持良好的稳定性,并无蛋白降解,显示了该纳米颗粒作为疫苗平台在保存条件和运输方面的优势。
实施例4——Nov-S-Catcher003纳米颗粒与抗原结合形成纳米疫苗
如图5所示,本实施例利用实施例1制备纯化获得的Nov-S-Catcher003纳米颗粒,制备获得了一种纳米疫苗。本实施例以人乳头瘤病毒16型(HPV 16)的特异抗原E749-57(RAHYNIVTF)为例,但能够与Nov-S-Catcher003纳米颗粒结合形成纳米疫苗的抗原不限于此。E749-57通过连接臂与SpyTag003连接,并命名为Tag003-E7。将不同浓度的Tag003-E7(0.3nM、1.0nM、1.5nM、3.0nM、4.5nM和6.0nM)与1nM Nov-S-Catcher003在4℃下孵育,在不同时间点(0.5h、1h、4h、16h和20h)获得纳米疫苗样品,采用SDS-PAGE和ImageLab半定量分析。
所述SpyTag003的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,其氨基酸序列为:
RGVPHIVMVDAYKRYK。
抗原与SpyTag003间的连接臂是GS的随机组合,比如最常用的是(GGGGS)n,通过改变n的大小来改变连接臂的长短。同时,如SEQ ID NO.3所示的连接臂序列在这里也同样适用。
产物形成率计算为100%×[1-(抗原孵育后Nov-S-Catcher003条带密度值)/(无抗原Nov-S-Catcher003条带密度值)]。
图6显示了纳米颗粒在与抗原孵育20h后,明显的看到蛋白条带的上移,抗原偶联率达到了约94%。图7结果显示抗原修饰后的纳米疫苗在不同温度下均保持良好的纳米颗粒形态,稳定性良好。
实施例5——纳米疫苗对抗原呈递细胞的刺激效果评价
由于树突状细胞(DC)在肿瘤特异性免疫反应的发展中起着关键作用,本实施例评价了实施例4制备得到的纳米疫苗对DC刺激效果。
本实施例从小鼠分离骨髓来源细胞,并使用GM-CSF刺激分化为树突状细胞(BMDCs)。将1nM实施例4获得的纳米疫苗加入200μL培养基培养24h,以LPS作为阳性对照。收集细胞进行流式细胞术分析,在培养上清中测定细胞因子。成熟的BMDCs表现出共刺激分子(CD80,CD86)和MHC分子(MHC I,MHC II)的表达增加(图8),以及促炎性细胞因子的表达和释放增加。说明,实施例4制备得到的纳米疫苗有效刺激DC的成熟,从而促进抗原呈递。
实施例6——纳米疫苗在淋巴结驻留效果评价
纳米颗粒的大小是影响其被DC吸收和主动迁移到淋巴结(LNs)的关键因素,据报道,促进纳米颗粒在LNs中靶向和积累的最佳尺寸范围在10nm到50nm之间。本申请的纳米疫苗(约30nm)非常适合靶向给LNs。
本实施例采用异硫氰酸荧光素(FITC)对Tag003-E7进行标记,并按照与实施例4所述方法将标记后的Tag003-E7与纳米颗粒Nov-S-Catcher003进行偶联得到纳米疫苗。用活体成像系统观察标记蛋白皮下接种后在LNs中的荧光积累和停留时间。
图9结果显示,所述纳米疫苗能够高效的富集并驻留在淋巴结。
实施例7——纳米疫苗对肿瘤的抑制作用评价
本实施例评价了实施例4制备得到的纳米疫苗的对肿瘤的抑制效果。
首先,本实施例使用预防性策略,采用实施例4所述纳米疫苗皮下免疫小鼠3次,每次间隔7天。第三次免疫后7天接种TC-1肿瘤细胞,并监测肿瘤的生长。与其他组相比,纳米疫苗组在所有实验中完全抑制肿瘤的生长。图10使用流式细胞术分析显示纳米疫苗诱导了更强的肿瘤特异性的CTL(CD8+IFN-γ+)反应,并且更有效地激发了CD8效应记忆T细胞(Tem)的反应(CD8+CD44+CD62L-),这意味着具有更强的免疫记忆和抗肿瘤免疫监视能力。
为了进一步评估所述纳米疫苗在临床环境中的有效性,采用了治疗性免疫策略。当肿瘤完全建立并达到约13.5mm3(约3mm×3mm)时,小鼠皮下接种纳米疫苗,共两次,每次间隔7天。在纳米疫苗皮下免疫后,87.5%的小鼠完全清除了肿瘤。图11使用流式细胞术对小鼠脾脏中的细胞比例分析显示E7抗原特异的CTL在纳米疫苗组中大幅度升高,NK细胞的(CD49b+NK1.1+)比例也在纳米疫苗组中大幅度升高。
因此,可以确定,实施例4获得的纳米疫苗诱导强烈的抗肿瘤免疫抑制肿瘤的生长甚至清除肿瘤。
最后应说明的是,以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种诺如病毒衍生的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒由诺如病毒S结构域通过连接臂,与SpyCatcher003融合形成;
所述诺如病毒S结构域为下述A1~A3中任一种:
A1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质;
A2.A1所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与A1所示的氨基酸序列具有85%以上的同一性的蛋白质;
A3.在A1或A2的N端和/或C端连接标签得到的蛋白质;
所述SpyCatcher003为下述B1~B3中任一种:
B1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质;
B2.B1所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与B1所示的氨基酸序列具有85%以上的同一性的蛋白质;
B3.在B1或B2的N端和/或C端连接标签得到的蛋白质。
2.根据权利要求1所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒从N端到C端,分别是诺如病毒S结构域、连接臂和SpyCatcher003,其中SpyCatcher003可与SpyTag003自发形成异肽键偶联。
3.与权利要求1或2所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒相关的密码子,其特征在于,所述密码子由编码诺如病毒S结构域的密码子,编码连接臂的密码子,及编码SpyCatcher003的密码子组成。
4.一种重组载体,其特征在于,所述重组载体含有如权利要求3所述的密码子。
5.一种重组微生物,其特征在于,所述重组微生物含有如权利要求3所述的密码子,或含有如权利要求4所述的重组载体。
6.一种纳米疫苗,其特征在于,所述纳米疫苗由如权利要求1或2所述纳米颗粒与抗原结合形成;所述抗原通过连接臂直接与SpyTag003连接而成,SpyTag003与所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒中的SpyCatcher003通过异肽键偶联;
所述SpyTag003为下述C1~C3中任一种:
C1.氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多肽;
C2.C1所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与B1所示的氨基酸序列具有85%以上的同一性的多肽;
C3.在C1或C2的N端和/或C端连接标签得到的多肽。
7.根据权利要求6所述的纳米疫苗,其特征在于,所述抗原包括肿瘤抗原,以及各类传染病的肽抗原或亚单位抗原。
8.根据权利要求6或7所述的纳米疫苗,其特征在于,在纳米疫苗中,所述纳米颗粒与SpyTag003偶联的抗原偶联的比例为1:1到1:6之间,并且可以同时偶联多个不同抗原。
9.一种如权利要求1或2所述纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:使权利要求1或2中所述诺如病毒S结构域的编码基因,连接臂的编码基因,及SpyCatcher003的编码基因融合后,在生物细胞中进行表达得到所述以诺如病毒衍生的纳米颗粒。
10.一种如权利要求1或2所述纳米颗粒、或权利要求3所述密码子、或权利要求4所述重组载体、或权利要求5所述重组微生物,在制备纳米疫苗中的应用。
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