JP2022545005A

JP2022545005A - Ｋｒａｓ関連がんを治療する方法

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Publication number: JP2022545005A
Application number: JP2022511096A
Authority: JP
Inventors: ケー．ニャティムケシュ
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2022-10-24
Also published as: BR112022003165A2; CA3150759A1; MX2022002108A; EP4017489A1; US20220273643A1; IL290454A; WO2021034992A1; CN114286676A; EP4017489A4; KR20220050143A; AU2020334069A1

Abstract

以下の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、もしくはそのプロドラッグを使用して、少なくとも１つのＫＲＡＳ突然変異の発現を特徴とするがんを治療する方法が開示される：TIFF2022545005000011.tif51156式Ｉの化合物による少なくともＫＲＡＳ突然変異の発現を特徴とする細胞におけるＫＲＡＳまたはｃＭｅｔのレベルを改変する方法も開示される。

Description

本開示は、ＫＲＡＳ関連がんを治療するための複素環式化合物の使用に関する。

ＲＡＳファミリーは、３つのメンバー、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳで構成される。ＫＲＡＳは、ヒトがんにおける単一の最も頻繁に突然変異したがん遺伝子である。ＫＲＡＳ突然変異は、米国で最も難治性の３つのがんタイプ：膵臓がんの９５％、結腸直腸がんの４５％、および肺がんの３５％のうちのいずれか１つを有する患者のがん性細胞に多く見られる。

特に難治性がんにおけるＫＲＡＳ突然変異の有病率のため、ＫＲＡＳ機能を遮断する治療戦略の開発に集中的な創薬努力が注がれている。これらの努力は、（ｉ）タンパク質－タンパク質（例えば、ＲＡＳ－Ｒａｆ）相互作用および共有不可逆的ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ阻害の破壊などの直接的な標的化アプローチ、ならびに（ｉｉ）原形質膜でのＲＡＳ集団の減少および下流エフェクターシグナル伝達タンパク質（例えば、ＥＲＫまたはｍＴＯＲ）の標的化などの間接的な標的化アプローチを含む。多大な努力にもかかわらず、ＫＲＡＳ機能を効果的に遮断する臨床的に実行可能ながん療法は、達成困難なままである。

ＫＲＡＳ関連がんを治療するために、ＫＲＡＳ機能を効果的に遮断する新規方法を開発する必要性がある。

本開示は、複素環式化合物、ＤＧＤ１２０２、またはその薬学的に許容される塩、もしくはそのプロドラッグでＫＲＡＳ関連がんを治療することに関する。予期せぬことに、ＤＧＤ１２０２は、既知のＥＧＦＲ阻害剤と比較して、変異型ＫＲＡＳの発現を具体的に特徴とする特定のがんに対して優れた抗腫瘍有効性を示した。

本開示の態様は、変異型ＫＲＡＳタンパク質、および任意選択で、変異型ＥＧＦＲタンパク質の発現を特徴とするがんを治療する方法である。方法は、ＫＲＡＳ突然変異に起因する当該ＫＲＡＳ関連活性（例えば、ＫＲＡＳまたはｃＭｅｔ）を改変するために十分な量の治療剤を、それを必要とする対象に投与することを含み、治療剤は、以下に示される、式Ｉの化合物（交換可能に「ＤＧＤ１２０２」と呼ばれる）、またはその薬学的に許容される塩、もしくはそのプロドラッグである。

いくつかの実施形態では、がんは、ＫＲＡＳ駆動がんである。ＫＲＡＳ駆動がんの例は、膵臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、および肺がんを含むが、これらに限定されない。

様々な実施形態では、がんは、少なくとも１つの有害なＫＲＡＳ突然変異の存在を特徴とし、これは、がん細胞に存在する場合、ＫＲＡＳ突然変異を指し、増加した細胞増殖に寄与する。有害なＫＲＡＳ突然変異は、以下の突然変異：Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、およびＧ１３Ｄのうちの１つであり得る。がんはまた、以下のＥＧＦＲ突然変異：Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、デルエクソン１９、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上の存在を特徴とし得る。

例示的な方法では、ＫＲＡＳ突然変異は、Ｇ１２ＤまたはＧ１３Ｄであり、ＥＧＦＲ突然変異は、Ｌ８５８ＲまたはＴ７９０Ｍである。

いくつかの実施形態では、がんは、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、セツキシマブまたはオシメルチニブ）に耐性である。

いくつかの実施形態では、上記の治療剤は、ＥＧＦＲを分解するか、またはＥＧＦＲ二量体化を遮断することができる。典型的には、治療剤は、ＫＲＡＳの活性を改変するために十分な量で投与される。それは、１～５００ｍｇ／ｋｇ（例えば、１０～１００ｍｇ／ｋｇ、１０～６０ｍｇ／ｋｇ、または２０～４０ｍｇ／ｋｇ）の投与量で投与（例えば、経口投与）することができる。

治療剤および薬学的に許容される担体を含む組成物がさらに開示される。薬学的組成物中の担体は、それが組成物の治療剤と適合性であり（好ましくは、治療剤を安定化することができ）、治療される対象に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。１つ以上の可溶化剤を治療剤の送達のための薬学的賦形剤として利用することができる。他の担体の例は、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃイエロー＃１０を含む。

上記の治療剤は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸的に、鼻腔内に、頬側に、膣内に、または移植されたリザーバーを介して対象に投与することができる。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技法を含む。

経口投与のための上記の治療剤を含有する組成物は、カプセル、錠剤、乳濁液および水性懸濁液、分散液、ならびに溶液を含む、任意の経口的に許容される剤形であり得る。錠剤の場合、一般的に使用される担体は、ラクトースおよびトウモロコシデンプンを含む。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的には添加される。カプセル形態の経口投与について、有用な希釈剤は、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンを含む。水性懸濁液または乳濁液が経口投与される場合、治療剤（すなわち、ＤＧＤ１２０２）は、乳化または懸濁化剤と組み合わせて油相に懸濁または溶解することができる。所望の場合、特定の甘味剤、香味剤、または着色剤を添加することができる。経口固体剤形は、噴霧乾燥技法、ホットメルト押出戦略、微粒子化、およびナノ粉砕技法によって調製することができる。

鼻エアロゾルまたは吸入組成物は、薬学的製剤の分野において周知の技法に従って調製することができる。例えば、そのような組成物は、ベンジルアルコールもしくは他の好適な防腐剤、吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当該技術分野で知られている他の可溶化もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製することができる。治療剤としてＤＧＤ１２０２を有する組成物はまた、直腸投与のための坐剤の形態で投与することができる。

「治療する」という用語は、疾患、症状、または素因を治癒、軽減、緩和、改変、治療、改善、または影響することを目的とした、対象への治療剤の適用または投与を指す。「有効量」または「有効な量」は、対象に対して所望の効果を与えるために必要とされる式Ｉの化合物の量を指す。当業者によって認識されるように、有効量は、投与経路、賦形剤の使用、および他の活性剤の使用などの他の治療的処置との併用の可能性に応じて変動する。

本開示の別の態様は、少なくともＫＲＡＳ突然変異の発現を特徴とする細胞におけるＫＲＡＳのレベルを改変する方法である。この方法は、当該細胞を、当該細胞におけるＥＧＦＲの活性を下げるために有効な量の式Ｉの化合物と接触させることを含む。

一般に、ＫＲＡＳ関連細胞は、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、ＫＲＡＳＧ１３Ｄ、ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ、ＥＧＦＲＴ７９０Ｍ、ＥＧＦＲＣ７９７Ｓ、ＥＧＦＲＳ７６８Ｉ、ＥＧＦＲデルエクソン１９、またはそれらの組み合わせの発現を特徴とする。

少なくともＫＲＡＳ突然変異の発現を特徴とする細胞におけるｃＭｅｔのレベルを改変する方法であって、当該方法が、当該細胞を、当該細胞におけるＥＧＦＲの活性を下げるために有効な量の式Ｉの化合物と接触させることを含む、方法も、本開示の範囲内である。

同様に、ｃＭｅｔ関連細胞は、典型的には、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、ＫＲＡＳＧ１３Ｄ、ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ、ＥＧＦＲＴ７９０Ｍ、ＥＧＦＲＣ７９７Ｓ、ＥＧＦＲＳ７６８Ｉ、ＥＧＦＲデルエクソン１９、またはそれらの組み合わせの発現を特徴とする。

変異型ＫＲＡＳ（およびＥＧＦＲ共駆動）頭頸部（ＵＭＳＣＣ７４Ｂ）腫瘍モデルにおけるＤＧＤ１２０２の効果を示す。ＫＲＡＳ駆動ＵＭＳＣＣ７４Ｂ異種移植片を有するヌードマウスを、ビヒクル、セツキシマブ（１００ｍｇ／ｋｇ、月曜日）、またはＤＧＤ１２０２（３０ｍｇ／ｋｇ、月曜日から金曜日）で２週間処理し、腫瘍成長に対する効果を測定し、プロットした。ＤＧＤ１２０２ＫＲＡＳ変異型細胞株ＨＣＴ１１６およびＬｏＶｏの効果を示す。ＫＲＡＳ変異型結腸直腸細胞株（ＨＣＴ１１６、Ｌｏｖｏ）におけるＤＧＤ１２０２（各グラフの左線）の効果を、クローン原性アッセイを使用してセツキシマブ（各グラフの右線）と比較して評価した。ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、および下流シグナル伝達に対するＤＧＤ１２０２の効果を示す。（Ａ）．ＨＣＴ－１１６（結腸直腸がん）細胞をＤＧＤ１２０２で５時間または１５時間処理し、全細胞溶解物を列挙された抗体でプローブした。（Ｂ）．ＫＲＡＳＧ１２Ｄ駆動膵臓細胞株（Ｐａｎｃ１）腫瘍モデルに対するＤＧＤ１２０２効果の評価、ＥＧＦＲおよびｍｔＫＲＡＳの定常状態レベルに対する処理の効果は、イムノブロッティングによって決定し、ＧＡＰＤＨ発現は、ローディングコントロールとして評価した。対照と比較した変異型ＫＲＡＳマウスにおける膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩｎｓ）に対するＤＧＤ１２０２の効果を示す。オシメルチニブ耐性、ＮＣＩ－Ｈ１９７５肺がん異種移植片に対するＤＧＤ１２０２の効果を示す。（Ａ）．ＮＣＩ－Ｈ１９７５オシメルチニブ耐性異種移植片を有するＳＣＩＤマウスをＤＧＤ１２０２（７５ｍｇ／ｋｇ、毎日、ＰＯ）で処理した。矢印は、ＤＧＤ１２０２による処理の開始を示す。腫瘍体積の変化をプロットする。（Ｂ）．ＥＧＦＲに対するＤＧＤ１２０２処理の効果は、ＤＧＤ１２０２処理の３日後に採取された腫瘍において評価した。対照と比較してＤＧＤ１２０２が投与された遺伝子操作されたＫＲＡＳ－ＬＳＬ－Ｇ１２Ｄマウスの肺病変パーセントおよび総肺病変を示す。

本明細書で第１に詳細に開示されるのは、開示された治療剤を使用して少なくともＫＲＡＳ突然変異の発現を特徴とするがんを治療する方法である。

ＫＲＡＳは、ＥＧＦＲ誘導性シグナル伝達経路において重要な役割を果たす。例えば、Ｋｎｉｃｋｅｌｂｅｉｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１５，２，４－１２（「Ｋｎｉｃｋｅｌｂｅｉｎ」）を参照されたい。Ｋｎｉｃｋｅｌｂｅｉｎに報告されるように、リガンド結合後のＥＧＦＲの活性化およびその後の自己リン酸化は、ＳＯＳ／ＧＲＢ２複合体のドッキング部位を作製し、ＳＯＳおよびＧＴＰ結合形態のＫＲＡＳによるヌクレオチド交換をもたらし、その後、ＫＲＡＳは、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴカスケードを通してシグナル伝達して、細胞成長を促進し、アポトーシスを抑制する。そのようなものとして、セツキシマブおよびパニツムマブを含む、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲに結合し、リガンド結合およびその後のＫＲＡＳ活性化を防止し、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の阻害による成長抑制および細胞死をもたらす。Ｋｎｉｃｋｅｌｂｅｉｎ、６ページ、第１段落を参照されたい。他方、変異型ＫＲＡＳは、細胞成長および生存につながる抗ＥＧＦＲ抗体の効果を無効にすることができる。同文献を参照されたい。

上記で指摘されるように、本開示は、少なくともＫＲＡＳ突然変異を特徴とするがんを治療する方法を提供する。

より具体的には、その方法は、ＫＲＡＳ突然変異に起因する当該ＫＲＡＳ関連活性（例えば、ＫＲＡＳまたはｃＭｅｔ）を改変するために十分な量の治療剤を、それを必要とする対象に投与することを含み、治療剤は、以下に示される、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、もしくはそのプロドラッグである：

上記に記載されるように、がんは、少なくとも１つの有害なＫＲＡＳ突然変異、および任意選択で、１つ以上のＥＧＦＲ突然変異の存在を特徴とする。本明細書における「有害なＫＲＡＳ突然変異」という用語は、がん細胞に存在する場合、増加した細胞増殖に寄与する、ＫＲＡＳ突然変異を指す。有害なＫＲＡＳ突然変異の例は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、およびＧ１３Ｄを含むが、これらに限定されない。ＥＧＦＲ突然変異の例は、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、およびデルエクソン１９を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、有害なＫＲＡＳ突然変異は、Ｇ１２ＤまたはＧ１３Ｄであり、ＥＧＦＲ突然変異は、Ｌ８５８ＲまたはＴ７９０Ｍである。

上記の化合物は、構造的に近い類似体と比較して、薬理学的特性および生物学的活性において有意な改善を示す。例えば、ＤＧＤ１２０２は、以下に示される２つの他の構造的に近い化合物と比較して、はるかに良好な肝臓ミクロソーム安定性を示す。

ＤＧＤ１２０２は、４６分にわたる肝臓ミクロソーム半減期で安定しており、ｐＨ３．５の水に可溶性であり、全身注射および経口投与の両方を介して生物学的に利用可能であり、クローン原性細胞アッセイにおいてサブマイクロモルＩＣ_５０で強力である。重要なことに、この化合物は、ＥＧＦＲの活性を阻害する代わりにＥＧＦＲを分解する。それはまた、ＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲ二量体化を遮断し、精製されたＥＧＦＲに直接結合し、ＥＧＦＲ駆動オシメルチニブ耐性細胞株および異種移植片モデルにおいて選択的に活性である。

式Ｉの化合物（すなわち、ＤＧＤ１２０２）の抗腫瘍活性をさらに調査するために、ＮＣＩ－６０細胞株スクリーニングを実施した。この実験のデータ（以下の実施例３における表を参照されたい）は、この化合物がＥＧＦＲによって駆動される腫瘍細胞に対してだけでなく、変異型ＫＲＡＳを発現し、セツキシマブとして、ＥＧＦＲ標的化抗体に対する耐性を示す様々な細胞に対しても活性であることを示す。

これらのセツキシマブ耐性細胞株に対するＤＧＤ１２０２のＩＣ_５０値は、０．５μＭ～２．２μＭの範囲である。非がん起源の不死化細胞では、この化合物のＩＣ_５０値は、２０μＭをはるかに超える。

加えて、ＤＧＤ１２０２は、変異型ＫＲＡＳ陽性細胞株、およびＫＲＡＳＧ１２Ｄが膵臓において発現され、膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩｎｓ）の形成を引き起こすトランスジェニックマウスモデルに対して活性を示す。また、ＫＲＡＳが突然変異されるセツキシマブ耐性頭頸部腫瘍モデル（ＵＭＳＣＣ７４Ｂ）において活性をさらに示す。

セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、抗ＥＧＦＲ抗体）は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）患者における有益性を実証している。それでも、ＷＴ－ＥＧＦＲを有する患者のサブセットのみは、永続的な臨床応答を示している。ＫＲＡＳ突然変異を有する患者は、典型的には、セツキシマブ治療によるＥＧＦＲキナーゼ活性の阻害に応答しない。前臨床モデルを使用した様々な群の最近の研究は、がんタンパク質の分解がキナーゼ活性の阻害よりも効果的であることを示している。例えば、Ｒａｉｎａｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．，２０１６，１１３：７１２４－７１２９、およびＣｏｒｃｏｒａｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１２，２：２２７－２３５を参照されたい。これは、ＥＧＦＲタンパク質足場が、そのキナーゼ活性の阻害後も、他のタンパク質と相互作用することによって機能し続け得るためであり得る。がんタンパク質を分解する重要な利点（その活性の阻害に対して）は、おそらく、後天的な突然変異媒介耐性の割合がより低いと予想されることである。後天的な突然変異に加えて、最初にＥＧＦＲ阻害剤療法に応答する患者でも、補償的シグナル伝達の上方制御のために耐性となるであろう。ＣＲＣでは、ＥＧＦＲ－ＫＲＡＳ軸は、ＭＥＫ－ＥＲＫシグナル伝達を活性化することが知られており、これは、がん進行を促進し、既存のキナーゼ阻害剤療法に対する一次および二次耐性の両方を引き起こす。ＫＲＡＳ変異型ＣＲＣ腫瘍では、ＥＲＫ経路が阻害される場合でも、ＥＧＦＲは、ＥＲＫ経路を介してシグナル伝達し続け、それによってＥＧＦＲ阻害剤療法に対する耐性を引き起こす。したがって、少なくともＫＲＡＳ突然変異を特徴とするがんを治療するために式Ｉの化合物を使用する方法は、既知の治療に対して予想外の優位性を提供する。

上記の治療方法を実施するために、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩を使用することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、正しい医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等を伴うことなく、ヒトおよび下等動物の組織との接触での使用に好適であり、妥当な利益／リスク比に相応する塩を指す。薬学的に許容される塩は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、参照によって本明細書に組み込まれるＪ．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９７７，６６，１－１９において、薬学的に許容される塩を詳細に記載している。上記の化合物の薬学的に許容される塩は、好適な無機および有機酸および塩基に由来するものを含む。薬学的に許容される非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸、または酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などの有機酸で形成されるか、またはイオン交換などの当該技術分野で使用される他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩（ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ）、樟脳スルホン酸塩（ｃａｍｐｈｏｒｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。カルボン酸または他の酸性官能基を含む化合物の塩は、好適な塩基と反応させることによって調製され得る。かかる塩には、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウム塩、アンモニウム、Ｎ^＋（Ｃ_１－４ａｌｋｙｌ）_４塩、および有機塩基の塩、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、モルホリン、ピリジン、ピペリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、２－ヒドロキシエチルアミン、ビス－（２－ヒドロキシエチル）アミン、トリ－（２－ヒドロキシエチル）アミン、プロカイン、ジベンジルピペリジン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ，Ｎ’－ビスデヒドロアビエチルアミン、グルカミン、Ｎ－メチルグルカミン、コリジン、キニン、キノリン、ならびにリジンおよびアルギニンなどの塩基性アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。本開示はまた、本明細書に提供される化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化を想起する。水溶性もしくは油溶性または分散性産生物は、かかる四級化によって得られ得る。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適切な場合、非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、および対イオンを使用して形成されるアミンカチオン、例えば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、およびアリールスルホン酸塩などが含まれる。式Ｉの化合物の例示的な薬学的に許容される塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、メシル酸塩、エシル酸塩、イセチオン酸塩、トシル酸塩、ナプシル酸塩、ベシル酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、フマル酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、ヘキサン酸塩、オクタン酸塩、デカン酸塩、オレイン酸塩、ステアリン酸塩、パモ酸塩、およびスルホン酸ポリストリレンを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物のプロドラッグ（ＤＧＤ１２０２）も使用することができる。本明細書で使用される場合、「プロドラッグ」という用語は、投与後、薬理学的に活性な薬物に代謝される（すなわち、体内で変換される）医薬品または化合物を指す。よって、ＤＧＤ１２０２のプロドラッグは、投与後、体内でＤＧＤ１２０２に変換される医薬品または化合物を指す。当業者にとって、対応するプロドラッグを代わりに使用して、医薬が吸収、分配、代謝、および排泄される方法を改善し、それによって、それを必要とする対象（例えば、ヒト）において発揮される薬理学的効果を改善することができる。本発明で使用することができるプロドラッグの例は、アミド、カルバメート、スルホンアミド、カルボキサミド、Ｎ－オキシド、Ｎ－アシルオキシアルキル誘導体、Ｎ－ヒドロキシアルキル誘導体、およびＮ－（ホスホリルオキシ）アルキル誘導体を含むが、これらに限定されない。

以下に、式Ｉの化合物の一般的な合成を提供する。

典型的には、アセトアミドＢ（１当量）は、有機溶媒（例えば、無水アセトニトリル）中の３－（４－ブロモフェニル）－８－メチル－１，４，８－トリアザスピロ［４．５］デカ－３－エン－２－チオンＡの溶液に添加される。反応混合物は、所定の温度（例えば、４０℃）に加温される。次に、塩基（例えば、２Ｍ水性炭酸カリウム溶液、１当量）は、反応混合物に添加される。ＴＬＣが出発材料の喪失および新しいＲ_ｆスポットの出現を示すまで（典型的には２～６時間）、反応は同じ温度に維持される。ＴＬＣによって反応が完了すると、それをワークアップし、得られた粗組成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物：（２－（（３－（４－ブロモフェニル）－８－メチル－１，４，８－トリアザスピロ［４．５］デカ－１，３－ジエン－２－イル）チオ）－Ｎ－（キノリン－３－イル）アセトアミド）を得る。

式Ｉの化合物を調製するための中間体ＡおよびＢを合成するための方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＯｒｇａｎｉｃＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（２^ｎｄＥｄ．，ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ１９９９）、Ｐ．Ｇ．Ｍ．ＷｕｔｓａｎｄＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｇｒｅｅｎｅ’ｓＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（４^ｔｈＥｄ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ２００７）、Ｌ．ＦｉｅｓｅｒａｎｄＭ．Ｆｉｅｓｅｒ，ＦｉｅｓｅｒａｎｄＦｉｅｓｅｒ’ｓＲｅａｇｅｎｔｓｆｏｒＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ１９９４）、Ｌ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，ＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＲｅａｇｅｎｔｓｆｏｒＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（２^ｎｄｅｄ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ２００９）、Ｐ．Ｒｏｓｚｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｋ．Ｍａｕｒｉｎ，Ｚ．Ｃｚａｒｎｏｃｋｉ“Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ（Ｒ）－（－）－ｐｒａｚｉｑｕａｎｔｅｌ（ＰＺＱ）”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ１７（２００６）１４１５－１４１９、およびＬ．Ｈｕ，Ｓ．Ｍａｇｅｓｈ，Ｌ．Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．Ｍｕｎｏｚ，Ｌ．Ｗａｎｇ“Ｄｉｒｅｃｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｋｅａｐ１－ｎｒｆ２ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ”、ＷＯ２０１３／０６７０３６を参照されたい。

治療剤と呼ばれる、本明細書に記載される式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩は、治療有効量（例えば、ＫＲＡＳ突然変異に関連する疾患または障害の症状を予防または緩和するために十分な量）で対象に投与することができる。治療剤は、単独で、または薬学的に許容される組成物の一部として投与することができる。治療剤は、すべて１回、複数回で投与、またはある期間にわたって実質的に一様に送達することができる。

当業者は、治療剤の投与量が時間にわたって変動され得ることを理解するであろう。特定の対象に対する特定の投与レジメンは、化合物、投与される化合物の量、投与経路、ならびに任意の副作用の原因および程度に部分的に依存するであろう。本開示による対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与される化合物の量は、妥当な時間枠にわたって所望の応答をもたらすのに十分でなければならない。投与量は、典型的には、投与の経路、タイミング、および頻度に依存する。したがって、臨床医は、投与量の力価を定め、最適な治療効果を得るために投与経路を修正する。従来の範囲探索の技術は、当業者に既知である。

純粋に例示として、がんを治療する上記の方法は、上記の因子に応じて、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇの式Ｉの化合物を投与することを含む。他の実施形態では、投与量は、５ｍｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ～最大約６０ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇ～最大約４０ｍｇ／ｋｇの範囲である。ある状況では、長期の治療を必要とし、より低い用量の化合物を、複数回にわたって投与することを伴う場合もあるか、または伴わない場合もある。所望の場合、化合物の投与量は、１日を通して適切な間隔で別個に、任意選択で、単位剤形で投与される２、３、４、５、６以上の下位用量として投与される。治療期間は、特定の状態に応じ、１日～数ヶ月間続き得る。

式Ｉの化合物を含む薬学的に許容される組成物を投与する好適な方法は、当該技術分野において周知である。２つ以上の経路を使用して化合物を投与することができるが、特定の経路は別の経路よりも迅速かつ効果的な反応を提供し得る。状況に応じて、化合物を含む薬学的組成物は、体腔に適用または滴下注入され、皮膚もしくは粘膜を通じて吸収され、摂取され、吸入され、かつ／または循環血液中に導入される。例えば、特定の状況では、治療剤を含む薬学的組成物を、経口で、注射を通して、または以下の手段：静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、尿道、膣内、もしくは直腸のうち１つによって、送達することが望ましいであろう。化合物は、徐放システムによって、または埋め込みデバイスによって投与することができる。

投与を促進するために、治療剤は、様々な態様では、担体（例えば、ビヒクル、アジュバント、または希釈剤）を含む薬学的に許容される組成物に製剤化される。採用される特定の担体は、溶解度および化合物との反応性の欠如などの化学物理的考慮事項、ならびに投与経路のみによって制限される。薬学的に許容される担体は、当該技術分野で周知である。注射可能物の使用に好適な例示的薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液、および注射可能な滅菌溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照されたい）。注射可能な組成物は、例えば、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓａｎｄＰｈａｒｍａｃｙＰｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．Ｐａ．，ＢａｎｋｅｒａｎｄＣｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ２３８－２５０（１９８２）、およびＡＳＨＰＨａｎｄｂｏｏｋｏｎＩｎｊｅｃｔａｂｌｅＤｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈｅｄ．，ｐａｇｅｓ６２２－６３０（１９８６））にさらに記載されている。治療剤を含む薬学的組成物は、一態様では、そのような薬学的組成物の使用に関する指示を提供する包装材料とともに、容器内に配置される。一般に、かかる指示には、試薬濃度、ならびにある特定の実施形態では、薬学的組成物を再構成するのに必要であり得る賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはＰＢＳ）の相対量を説明する具体的な表現が含まれる。

非経口注射に好適な組成物は、生理学的に許容される滅菌水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液、および注射可能な滅菌溶液または分散液に再構成するための滅菌粉末を含み得る。好適な水性および非水性担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、それらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持され得る。

これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントも含み得る。微生物汚染は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを添加することによって防止され得る。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい場合もある。注射可能な薬学的組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。

経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、粉剤、および顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形では、治療剤は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの通例の不活性賦形剤（もしくは担体）、または（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシア、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、（ｉ）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合される。カプセル剤および錠剤の場合、剤形は、緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体組成物を、賦形剤、例えば、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟および硬充填ゼラチンカプセル剤中の充填剤として使用することもできる。

錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤などの固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティングおよび当該技術分野で周知の他のものを用いて調製され得る。固体剤形は、乳白剤も含み得る。さらに、固体剤形は、それらが治療剤を腸管の特定の部分に遅延様式で放出するように、包埋組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスである。式Ｉの化合物はまた、任意選択で、１つ以上の賦形剤を含む、マイクロカプセル化形態であり得る。

経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳濁液、溶剤、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。治療剤に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物などを含有し得る。

かかる不活性希釈剤に加えて、組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、ならびに芳香剤も含み得る。懸濁液は、治療剤に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、ならびにトラガカント、またはこれらの物質の混合物などを含有し得る。

製剤化に際して、溶液は、投与製剤と適合性の方法で、治療的に有効であるような用量で投与することができる。組成物は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどのような様々な剤形で容易に投与される。例えば、水溶液での非経口投与の場合、必要に応じて溶液を好適に緩衝し、液体希釈剤を十分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張にする必要がある。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に好適である。

式Ｉの化合物は、独自の方法でＥＧＦＲを調節することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、ＥＧＦＲ二量体化を遮断または阻害する。様々な実施形態では、化合物は、ＥＧＦＲ分解を誘導する。

ＥＧＦＲは、がん遺伝子およびがんにおける重要な分子標的として特定されているが、依然として、このがん遺伝子の活性を調節する改善されたアプローチの多大な必要性および機会が存在する。二量体化を遮断する細胞透過性ペプチド（ディスラプチン）またはｓｉＲＮＡを使用して、ＥＧＦＲ分解が、ＴＫＩ耐性細胞でさえ、細胞生存に対して大きな効果を有することが示されている。例えば、Ｒａｉｎａｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．，２０１６，１１３：７１２４－７１２９を参照されたい。ＥＧＦＲのキナーゼ活性を単に阻害するのではなく、ＥＧＦＲタンパク質を分解することによって、薬剤が、正常組織と比較して腫瘍細胞が豊富なＥＧＦ結合ＥＧＦＲにのみに影響を与え、それによって安全性プロファイルおよび治療ウィンドウを改善するという事実から、腫瘍組織を標的とする能力を改善しながら、前臨床モデルにおいて活性の広範なスペクトルが実証されている。

ＥＧＦＲのキナーゼ活性を単に阻害するのではなく、ＥＧＦＲを分解するアプローチは、非小細胞肺がんの患者で常に発症するオシメルチニブに対する耐性を克服する。例えば、Ｃｏｒｃｏｒａｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１２，２：２２７－２３５を参照されたい。ＥＧＦＲ分解の適用の焦点は、肺がんにあるが、追加の重要な臨床的機会は、頭頸部がん、結腸直腸がん、および膵臓がんなどの、ＥＧＦＲまたはＫＲＡＳによって駆動される他のがんにも存在する。

本明細書で使用される場合、用語「治療する」、ならびにそれに関連する言葉は、必ずしも１００％または完全な治療を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有するものとして認識する様々な程度の治療がある。この点で、本開示のがんを治療する方法は、任意の量または任意のレベルのがんの治療を提供することができる。さらに、本開示の方法によって提供される治療は、治療されるがんの１つ以上の状態または症状の治療を含み得る。また、本開示の方法によって提供される治療は、がんの進行を遅らせることを包含し得る。例えば、開示される方法は、腫瘍またはがん成長を低減すること、腫瘍細胞の転移を低減すること、腫瘍またはがん細胞の細胞死を増加させることなどによって、がんを治療することができる。

本明細書に開示される方法によって治療可能ながんは、少なくともＫＲＡＳ突然変異を特徴とする、任意のＫＲＡＳ関連がんまたはＫＲＡＳ駆動がんであり得る。

いくつかの態様におけるがんは、膵臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、頸部がん、胃がん、乳がん、肝細胞がん、神経膠芽細胞腫、肝臓がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、前立腺がん、および腎がんからなる群から選択されるものである。いくつかの実施形態では、がんは、膵臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、または肺がんである。いくつかの実施形態では、がんは、セツキシマブ耐性がんまたはオシメルチニブ耐性がんである。

少なくともＫＲＡＳ突然変異の発現を特徴とする細胞におけるＫＲＡＳまたはｃＭｅｔのレベルを改変する方法は、依然として本開示の範囲内である。この方法は、当該細胞を、当該細胞におけるＥＧＦＲの活性を下げるために有効な量の式Ｉの化合物と接触させることを含む。

典型的には、ＫＲＡＳまたはｃＭｅｔ関連細胞は、少なくとも１つのＫＲＡＳ突然変異、および任意選択で、１つ以上のＥＧＦＲ突然変異の存在を特徴とする。ＫＲＡＳ突然変異の例は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、およびＧ１３Ｄを含むが、これらに限定されない。ＥＧＦＲ突然変異の例は、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、およびデルエクソン１９を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ突然変異は、Ｇ１２ＤまたはＧ１３Ｄであり、ＥＧＦＲ突然変異は、Ｌ８５８ＲまたはＴ７９０Ｍである。

いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物を投与する開示された方法は、ＥＧＦＲの分解またはＥＧＦＲ二量体化の遮断のいずれかをもたらし、それによって、細胞におけるＫＲＡＳまたはｃＭｅｔのレベルを改変する。

さらなる詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本開示をその最大限に利用することができると考えられる。以下の特定の例、すなわち、実施例１～５は、したがって、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法でも本開示の残部を限定するものではない。

実施例１－ＤＧＤ１２０２の合成および特徴分析

無水アセトニトリル中の３－（４－ブロモフェニル）－８－メチル－１，４，８－トリアザスピロ［４．５］デカ－３－エン－２－チオンＡの溶液に、アセトアミドＣ（１当量）を添加した。反応混合物を４０℃に加温した。次に、２Ｍ炭酸カリウム水溶液（１当量）を反応混合物に添加した。ＴＬＣが出発材料の喪失および新しいＲ_ｆスポットの出現を示すまで（典型的には２～６時間）、反応を４０℃に維持した。ＴＬＣにより反応の完了が確認できたら、反応の後処理（ワークアップ）を行った。粗反応混合物を分液漏斗に注ぎ、酢酸エチルおよび水を添加した。有機層を分離し、次いでブラインで洗浄した（１×）。次いで、有機層を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物を、１０％メタノール／ジクロロメタン溶液で溶出が起こるフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、ＤＧＤ１２０２：（２－（（３－（４－ブロモフェニル）－８－メチル－１，４，８－トリアザスピロ［４．５］デカ－１，３－ジエン－２－イル）チオ）－Ｎ－（キノリン－３－イル）アセトアミド）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ １０．８９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．９５（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｂｒｄ，Ｊ＝８．３３Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｂｒｄ，Ｊ＝８．３３Ｈｚ，１Ｈ），７．７８－７．８７（ｍ，４Ｈ），７．５２－７．７２（ｍ，２Ｈ），４．２９（ｓ，２Ｈ），２．４３－２．５２（ｍ，４Ｈ），２．１８（ｂｒｓ，３Ｈ），１．５５－１．８５（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋ｍ／ｚ５２３．０５，ＥＳＩ－ｍ／ｚ５２１．００）；ＴＬＣ：（９０：１０：０．５，ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＮＨ_４ＯＨ）Ｒ_ｆ＝０．４７。

実施例２－ＫＲＡＳ変異型頭頸部がんにおけるＤＧＤ１２０２の評価
頭頸部がんのＫＲＡＳＧ１２Ｄ駆動、セツキシマブ耐性腫瘍モデル（ＵＭＳＣＣ７４Ｂ）におけるＤＧＤ１２０２の有効性と毒性を評価するために研究を実施した（図１）。

担がんマウスを、週２回で１週間、３０ｍｇ／ｋｇの用量で強制経口投与によってＤＧＤ１２０２で処理した。この用量は、その単回用量ＰＫプロファイルに基づいて選択した。腫瘍体積に対するＤＧＤ１２０２の得られた効果を、試験化合物が投与されなかった対照マウス、および既知のＥＧＦＲ阻害剤であるセツキシマブが投与された対照マウスと比較した。

予期せぬことに、この処理における用量およびレジメンは、安全であり、ＤＧＤ１２０２で処理されたマウスは、有意な腫瘍成長抑制（Ｐ＜０．００１）を示し、際立って対照的に、セツキシマブは、有意義な有効性を示すことができなかった。

実施例３－ＫＲＡＳ変異型結腸直腸および膵臓がん細胞株におけるＤＧＤ１２０２の評価
クローン原性生存アッセイを使用してＫＲＡＳＧ１３Ｄ駆動セツキシマブ耐性結腸直腸細胞株（ＨＣＴ－１１６）（図２）における、およびＫＲＡＳＧ１２Ｄ突然変異を含有する膵臓がん細胞株（Ｐａｎｃ１）（図３Ｂ）におけるＤＧＤ１２０２の活性を評価するために、研究を行った。

より具体的には、細胞を、ある範囲の濃度（例えば、０～１０マイクロＭ）での処理の１日前に、６０または１００ｍｍ培養皿にクローン密度で３通りに播種した。８～１２日後、細胞を酢酸／メタノール（１：７、ｖ／ｖ）で固定し、クリスタルバイオレット（０．５％、ｗ／ｖ）で染色し、実体顕微鏡を使用して計数した。薬物細胞毒性（生存する薬物処理細胞）を測定し、未処理の対照細胞の生存に対して正規化した。

図２および３Ｂに示されるデータは、ＤＧＤ１２０２が変異型ＫＲＡＳ駆動結腸直腸および膵臓がん細胞の処理に有効であったことを示す。抗腫瘍有効性は、ＥＲＫ／ＡＫＴシグナル伝達の再活性化を遮断するＥＧＦＲタンパク質の喪失によるものであり、ＥＧＦＲを介して発生する可能性が高いと仮定される。

ＥＧＦＲ、ＥＲＫ、およびＡＫＴに対するＤＧＤ１２０２の効果はまた、イムノブロッティングによって評価した。変異型ＫＲＡＳ駆動ＨＣＴ－１１６（ＣＲＣ）およびＰａｎｃ１（膵臓）細胞株におけるＤＧＤ１２０２の予備データを、それぞれ、図３Ａおよび図３Ｂに示す。この化合物は、Ｐａｎｃ１細胞株の場合はＫＲＡＳＧ１２Ｄ特異的抗体によって、ＨＣＴ１１６の場合はＰＡＮ－ＲＡＳ抗体によって検出されるように、ＥＧＦＲおよびｍｔＫＲＡＳ（Ｐａｎｃ１）レベルの両方に影響を与え、これはひいてはｐＡＫＴおよびｐＥＲＫにおける下流シグナル伝達に影響を与えたことが観察された。

イムノブロッティングは、以下のプロトコルに従うことによって行った
細胞を６０ｍｍ皿に皿当たり３×１０^５細胞の密度で播種し、一晩または７０％コンフルエンスまでインキュベートした。細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＤＧＤ１２０２で処理し、次いで様々な時点で採取した。ペレットを氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、溶解バッファーに３０分間再懸濁した。超音波処理後、粒子状材料を１３，０００ｒｐｍで１０分間４℃での遠心分離によって除去した。可溶性タンパク質画分を９５℃に５分間加熱し、次いで４～１２％ビス－トリスプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に適用し、ＰＶＤＦメンブレン上に移した。メンブレンを、トリス緩衝生理食塩水（１３７ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％ＢＳＡおよび１％正常ヤギ血清からなるブロッキングバッファー中で室温で１時間インキュベートした。メンブレンをその後ブロッキングバッファー中で一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と１時間インキュベートした。トリス緩衝生理食塩水でさらに３回洗浄後、結合した抗体を増強された化学発光プラス試薬によって検出した。相対的なタンパク質レベルの定量化のために、ＩｍａｇｅＪ１．３２ｊソフトウェアを使用して、イムノブロットフィルムを走査し、分析した。示される相対的なタンパク質レベルは、未処理の対照との比較を表す。

これに関連して、ＤＧＤ１２０２の活性も、国立がん研究所で、標準ＮＣＩ６０スクリーニングプロトコルを使用して、６０の異なるヒト腫瘍細胞株に対して試験した。上位性能の細胞株についての成長阻害パーセントを以下の表に示す。上位応答の細胞株（例えば、ＨＣＴ－１１６）は、ＣＲＣおよび膵臓において頻繁に突然変異され、セツキシマブに対する耐性と相関する、ＫＲＡＳ遺伝子（例えば、ＫＲＡＳＧ１３Ｄ）の突然変異を示す。

実施例４－ＫＲＡＳ変異型膵臓がんにおけるＤＧＤ１２０２の評価
ＫＲＡＳＧ１２Ｄ駆動膵臓腫瘍モデルにおけるＤＧＤ１２０２の有効性を評価するために研究を実施した。

より具体的には、６週齢ＫＣマウスを、ＤＧＤ１２０２で強制経口投与（３０ｍｇ／ｋｇ体重、毎日）によって５週間処理した。ＤＧＤ１２０２が投与されなかった対照マウスと比較して、ＰａｎＩｎ（膵上皮内腫瘍）レベルに対する得られた効果を観察した。図４に示されるように、１１週目にすべてのマウスを犠死させ、ＰａｎＩｎに対する効果をスコア付けした。ＤＧＤ１２０２で処理されたマウスは、膵管病変の一種である、ＰａｎＩｎを発症する有意に低減した傾向を示した。

これらのデータは、ＤＧＤ１２０２が変異型ＫＲＡＳ駆動膵臓がんの治療において予想外に有効性を示したことを示す。

実施例５－ＥＧＦＲ変異型肺がんにおけるＤＧＤ１２０２の評価
変異型ＥＧＦＲ駆動肺がんモデルにおけるＤＧＤ１２０２の有効性を評価するために研究を実施した（図５）。

簡潔には、局所的に進行したＮＣＩ－Ｈ１９７５－ＡＺＲ（オシメルチニブ耐性）異種移植片を有するＳＣＩＤマウスを、ＤＧＤ１２０２（７５ｍｇ／ｋｇ）の強制経口投与で２週間毎日処理した。腫瘍体積は、少なくとも週に３回キャリパーを使用して測定した。ＥＧＦＲ発現に対するＤＧＤ１２０２処理の効果は、処理の開始の３日後のＩＨＣ染色によって決定した。

図５に示されるデータは、ＤＧＤ１２０２が、オシメルチニブに耐性である、変異型ＥＧＦＲ駆動肺がんの治療において予想外に有効性を示したことを示す。

実施例６－肺がんの遺伝子操作されたＫＲＡＳ－ＬＳＬ－Ｇ１２ＤマウスモデルにおけるＤＧＤ１２０２の評価
ＤＧＤ１２０２処理の有効性は、ＫＲＡＳ変異型肺腫瘍の発症および進行について評価した。肺がんの遺伝子操作されたＫＲＡＳ－ＬＳＬ－Ｇ１２Ｄマウスモデルを使用した。このマウスは、Ｌｏｘ－Ｓｔｏｐ－Ｌｏｘ（ＬＳＬ）配列、続いてＫＲＡＳＧ１２Ｄ点突然変異対立遺伝子を有する。腫瘍形成は、ＬＳＬカセットを欠失し、変異型ＫＲＡＳ発がんタンパク質の発現を可能にするＣｒｅリコンビナーゼを発現するように肺上皮細胞を形質導入したアデノウイルス－Ｃｒｅ粒子（１．５×１０ｅ^７ｐｆｕ）の鼻腔内送達によって開始した。これらのマウスは、６～８週齢までに肺の過形成、および１２週齢までに腺腫を示した。

ウイルス送達の８週間後、マウスをビヒクルまたはＤＧＤ１２０２のいずれかで、月曜日から金曜日のスケジュールで４週間、３０ｍｇ／ｋｇ強制経口投与の用量で処理した。マウスが２０週齢になったとき、肺を採取し、Ｈ＆Ｅ切片は形態学的評価を受けた。肺病変の組織病理学的スペクトルは、過形成－肺胞または気管支、過形成、腺腫、限局性異型を伴う過形成、気管支異形成、腺腫、および異型腺腫様過形成についての二重盲検様式で記載および記録した。両方の処理群からのすべての試料における各葉からの肺病変のパーセンテージおよび肺病変の総面積をスコア付けし、図６に示す。対応のあるｔ検定は、２つのコホート間の差が有意に向かう傾向があることを示す（ｐ＝０．０５７７）。

他の実施形態
本明細書に開示される機能のすべては、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本明細書に開示される各機能は、同じ、同等の、または類似の目的を果たす代替の機能によって置き換えられ得る。よって、特に明記されない限り、開示される各機能は、包括的な一連の同等または類似の機能の例にすぎない。

さらに、上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合させるために本開示の様々な変更および修正を行うことができる。よって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。

Claims

少なくともＫＲＡＳ突然変異の発現を特徴とするがんを治療する方法であって、前記方法が、前記ＫＲＡＳ突然変異から生じるＫＲＡＳまたはｃＭｅｔの活性を改変するために十分な量の治療剤を、それを必要とする対象に投与することを含み、
前記治療剤が、以下の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、もしくはそのプロドラッグである、方法：
前記がんが、ＫＲＡＳ駆動がんである、請求項１に記載の方法。
前記がんが、膵臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、および肺がんからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
前記がんが、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、およびＧ１３Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ突然変異、ならびに任意選択で、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、デルエクソン１９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＥＧＦＲ突然変異の発現を特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＫＲＡＳ突然変異が、Ｇ１２ＤまたはＧ１３Ｄである、請求項４に記載の方法。
前記ＥＧＦＲ突然変異が、Ｌ８５８ＲまたはＴ７９０Ｍである、請求項４または５に記載の方法。
前記治療剤が、前記ＫＲＡＳの活性を改変するために十分な量で投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記がんが、ＥＧＦＲ阻害剤に耐性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブまたはオシメルチニブである、請求項８に記載の方法。
前記治療剤が、ＥＧＦＲを分解する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記治療剤が、ＥＧＦＲ二量体化を遮断する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記がんが、ＫＲＡＳ駆動がんである、請求項８に記載の方法。
前記がんが、膵臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、および肺がんからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
前記がんが、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、およびＧ１３Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ突然変異、ならびに任意選択で、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、デルエクソン１９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＥＧＦＲ突然変異の発現を特徴とする、請求項８に記載の方法。
前記ＫＲＡＳ突然変異が、Ｇ１２ＤまたはＧ１３Ｄである、請求項１４に記載の方法。
前記ＥＧＦＲ突然変異が、Ｌ８５８ＲまたはＴ７９０Ｍである、請求項１４に記載の方法。
前記治療剤が、１～５００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記治療剤が、２０～４０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項１７に記載の方法。
前記治療剤が、経口投与される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記がんが、ＥＧＦＲ阻害剤に耐性であり、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、およびＧ１３Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ突然変異、ならびに任意選択で、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＥＧＦＲ突然変異の発現を特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記がんが、ＫＲＡＳ駆動がんであり、前記治療剤が、１～５００ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与される、請求項２０に記載の方法。
前記がんが、膵臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、および肺がんからなる群から選択され、前記治療剤が、２０～４０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与される、請求項２１に記載の方法。
前記治療剤が、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
少なくともＫＲＡＳ突然変異の発現を特徴とする細胞におけるＫＲＡＳのレベルを改変する方法であって、前記方法が、前記細胞を、前記細胞におけるＥＧＦＲの活性を下げるために有効な量の化合物と接触させることを含み、
前記化合物が、以下の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩である、方法：
前記細胞が、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、およびＧ１３Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ突然変異、ならびに任意選択で、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、デルエクソン１９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＥＧＦＲ突然変異の発現を特徴とする、請求項２４に記載の方法。
前記ＫＲＡＳ突然変異が、Ｇ１２ＤまたはＧ１３Ｄである、請求項２５に記載の方法。
前記ＥＧＦＲ突然変異が、Ｌ８５８ＲまたはＴ７９０Ｍである、請求項２５または２６に記載の方法。
前記化合物が、ＥＧＦＲを分解する、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
前記化合物が、ＥＧＦＲ二量体化を遮断する、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
少なくともＫＲＡＳ突然変異の発現を特徴とする細胞におけるｃＭｅｔのレベルを改変する方法であって、前記方法が、前記細胞を、前記細胞における前記ＥＧＦＲの活性を下げるために有効な量の化合物と接触させることを含み、
前記化合物が、以下の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩である、方法：
前記細胞が、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、およびＧ１３Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ突然変異、ならびに任意選択で、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、デルエクソン１９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＥＧＦＲ突然変異の発現を特徴とする、請求項３０に記載の方法。
前記ＫＲＡＳ突然変異が、Ｇ１２ＤまたはＧ１３Ｄである、請求項３１に記載の方法。
前記ＥＧＦＲ突然変異が、Ｌ８５８ＲまたはＴ７９０Ｍである、請求項３１または３２に記載の方法。
前記化合物が、ＥＧＦＲを分解する、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法。
前記化合物が、ＥＧＦＲ二量体化を遮断する、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。