KR20220050143A

KR20220050143A - Kras-관련 암 치료 방법

Info

Publication number: KR20220050143A
Application number: KR1020227007201A
Authority: KR
Inventors: 무케쉬 케이. 니아티
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2022-04-22
Also published as: JP2022545005A; US20220273643A1; EP4017489A1; CA3150759A1; IL290454A; MX2022002108A; CN114286676A; EP4017489A4; BR112022003165A2; AU2020334069A1; WO2021034992A1

Abstract

하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 전구약물을 사용하여, 적어도 하나의 KRAS 돌연변이의 발현을 특징으로 하는 암을 치료하는 방법이 개시된다:
[화학식 I]

또한, 화학식 I의 화합물을 사용한 적어도 KRAS 돌연변이의 발현을 특징으로 하는 세포에서 KRAS 또는 cMet의 수준을 변경하는 방법이 개시된다.

Description

KRAS-관련 암 치료 방법

본 개시내용은 KRAS-관련 암을 치료하기 위한 헤테로사이클릭 화합물의 용도에 관한 것이다.

RAS 계열은 KRAS, NRAS 및 HRAS의 3가지 구성원으로 구성된다. KRAS는 인간 암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 단일 종양유전자이다. KRAS 돌연변이는 미국에서 가장 난치성인 3가지 암 유형: 췌장암의 95%, 결장직장암의 45%, 폐암의 35% 중 하나를 가진 환자의 암 세포에서 만연하다.

특히 난치성 암에서 KRAS 돌연변이의 유행으로 인해, KRAS 기능을 차단하는 치료 전략을 개발하기 위해 집중적인 약물 발견 노력이 기울여져 왔다. 이러한 노력에는 (i) 단백질-단백질(예를 들어, RAS-Raf) 상호작용 및 공유 불가역 KRAS-G12C 억제를 방해하는 것과 같은 직접적인 표적화 접근법; 및 (ii) 원형질막에서 RAS 집단을 감소시키는 것 및 다운스트림 이펙터 신호전달 단백질(예를 들어, ERK 또는 mTOR)을 표적화하는 것과 같은 간접적인 표적화 접근법이 포함된다. 광범위한 노력에도 불구하고, KRAS 기능을 효과적으로 차단하는 임상적으로 실행 가능한 암 치료법은 여전히 찾기 힘들다.

KRAS-관련 암을 치료하기 위해 KRAS 기능을 효과적으로 차단하는 새로운 방법의 개발이 필요하다.

발명의 개요

본 개시내용은 헤테로사이클릭 화합물, DGD1202, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 전구약물을 사용하여 KRAS-관련 암을 치료하는 것에 관한 것이다. 예상외로 DGD1202는 알려진 EGFR 억제제와 비교하여 돌연변이 KRAS의 발현에 의해 특이적으로 특징화된 특정 암에 대해 우수한 항종양 효능을 입증했다.

본 개시내용의 한 양태는 돌연변이 KRAS 단백질 및 선택적으로, 돌연변이된 EGFR 단백질의 발현을 특징으로 하는 암을 치료하는 방법이다. 상기 방법은 상기 KRAS 돌연변이로부터 야기되는 KRAS-관련 활성(예를 들어, KRAS 또는 cMet)을 변경하기에 충분한 양의 치료제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 치료제는 하기 도시된 화학식 I의 화합물("DGD1202"로 서로 바꿔서 지칭됨), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 전구약물이다:

[화학식 I]

.

일부 실시형태에서, 암은 KRAS-유도 암이다. KRAS-유도 암의 예에는 췌장암, 결장직장암, 두경부암 및 폐암이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

다양한 실시형태에서, 암은 적어도 하나의 유해한 KRAS 돌연변이의 존재를 특징으로 하며, 이는 KRAS 돌연변이를 지칭하며, 이는 암세포에 존재할 때 증가된 세포 증식에 기여한다. 유해한 KRAS 돌연변이는 G12D, G12V 및 G13D 돌연변이 중 하나일 수 있다. 암은 또한 다음 EGFR 돌연변이: L858R, T790M, C797S, S768I, del Exon 19, 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 존재를 특징으로 할 수 있다.

예시적인 방법에서, KRAS 돌연변이는 G12D 또는 G13D이고, EGFR 돌연변이는 L858R 또는 T790M이다.

일부 실시형태에서, 암은 EGFR 억제제(예를 들어, 세툭시맙 또는 오시머티닙)에 대해 내성이다.

일부 실시형태에서, 상기 치료제는 EGFR을 분해하거나 EGFR 이량체화를 차단할 수 있다. 전형적으로, 치료제는 KRAS의 활성을 변경하기에 충분한 양으로 투여된다. 1~500 mg/kg(예를 들어, 10~100 mg/kg, 10~60 mg/kg 또는 20~40 mg/kg)의 투여량으로 투여(예를 들어, 경구 투여)할 수 있다.

치료제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 추가로 개시된다. 약제학적 조성물의 담체는 조성물의 치료제와 양립가능하고(바람직하게는 치료제를 안정화할 수 있음), 치료될 대상체에 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 하나 이상의 가용화제는 치료제의 전달을 위한 약제학적 부형제로서 이용될 수 있다. 다른 담체의 예로는 콜로이드성 산화규소, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스, 라우릴황산나트륨 및 D&C 옐로우 #10이 있다.

전술한 치료제는 경구, 비경구, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로, 또는 이식된 저장소를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 척추강내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

상기 경구 투여용 치료제를 함유하는 조성물은 캡슐, 정제, 에멀젼 및 수성 현탁액, 분산액 및 용액을 포함하는 임의의 경구로 허용가능한 투여 형태일 수 있다. 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 담체에는 락토오스 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 추가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토오스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액 또는 에멀젼이 경구 투여될 때, 치료제(즉, DGD1202)는 유화제 또는 현탁제와 조합된 유상에 현탁되거나 용해될 수 있다. 원하는 경우, 특정 감미제, 풍미제 또는 착색제가 첨가될 수 있다. 경구 고체 투여 형태는 분무 건조 기술, 핫멜트 압출 전략, 미세화 및 나노 밀링 기술로 제조될 수 있다.

비강 에어로졸 또는 흡입 조성물은 약제학적 제형 분야에서 잘 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은 벤질 알코올 또는 기타 적합한 보존제, 흡수 촉진제, 플루오로카본, 및/또는 당업계에 공지된 기타 가용화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 중 용액으로 제조될 수 있다. 치료제로서 DGD1202를 갖는 조성물은 또한 직장 투여용 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

용어 "치료하는"은 질환, 증상 또는 소인을 치료, 완화, 경감, 변경, 치유, 개선 또는 영향을 미칠 목적으로 대상체에 치료제를 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다. "유효량" 또는 "유효한 양"은 대상체에게 원하는 효과를 부여하는 데 필요한 화학식 I의 화합물의 양을 지칭한다. 유효량은 투여 경로, 부형제 사용, 및 다른 활성제의 사용과 같은 다른 치료적 치료와의 공동 사용 가능성에 따라 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 다양하다.

본 개시내용의 또 다른 양태는 적어도 KRAS 돌연변이의 발현을 특징으로 하는 세포에서 KRAS의 수준을 변경하는 방법이다. 이 방법은 상기 세포를 상기 세포에서 EGFR의 활성을 분해하기에 효과적인 양의 화학식 I의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

일반적으로, KRAS-관련 세포는 KRAS G12D, KRAS G12V, KRAS G13D, EGFR L858R, EGFR T790M, EGFR C797S, EGFR S768I, EGFR del Exon 19, 또는 이들의 조합의 발현을 특징으로 한다.

또한, 본 개시내용의 범위 내에는 적어도 KRAS 돌연변이의 발현을 특징으로 하는 세포에서 cMet의 수준을 변경하는 방법이 있으며, 상기 방법은 상기 세포를 상기 세포에서 EGFR의 활성을 저하시키기에 효과적인 양으로 화학식 I의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

유사하게, cMet-관련 세포는 전형적으로 KRAS G12D, KRAS G12V, KRAS G13D, EGFR L858R, EGFR T790M, EGFR C797S, EGFR S768I, EGFR del Exon 19, 또는 이들의 조합의 발현을 특징으로 한다.

도 1은 돌연변이 KRAS(및 EGFR 공동-유도) 두경부(UMSCC74B) 종양 모델에서 DGD1202의 효과를 도시한 것이다. 누드 마우스를 포함하는 KRAS 유도 UMSCC74B 이종이식편을 비히클, 세툭시맙(100 mg/kg, 월요일) 또는 DGD1202(30 mg/kg, 월~금)로 2주 동안 처리하고 종양 성장에 대한 효과를 측정하고 플롯팅했다.
도 2는 DGD1202 KRAS 돌연변이 세포주 HCT116 및 LoVo의 효과를 도시한 것이다. KRAS 돌연변이 결장직장 세포주(HCT116, Lovo)에서 DGD1202(각 그래프의 왼쪽 선)의 효과는 세포집락 측정법(clonogenic assay)을 사용하여 세툭시맙(각 그래프의 오른쪽 선)과 비교하여 평가되었다.
도 3은 EGFR, KRAS 및 다운스트림 신호전달에 대한 DGD1202의 효과를 도시한 것이다. (A). HCT-116(결장직장암) 세포를 DGD1202로 5시간 또는 15시간 동안 처리하고, 전체 세포 용해물을 열거된 항체로 프로브(probing)했다. (B). KRAS G12D 유도 췌장 세포주(Panc1) 종양 모델에 대한 DGD1202 효과의 평가; EGFR 및 mtKRAS의 정상 상태 수준에 대한 치료 효과는 면역블롯팅에 의해 결정되었고; GAPDH 발현은 로딩 대조군으로 평가되었다.
도 4는 대조군과 비교하여 돌연변이 KRAS 마우스에서 췌장 상피내 종양(PanIns)에 대한 DGD1202의 효과를 나타낸다.
도 5는 오시머티닙 내성 NCI-H1975 폐암 이종이식편에 대한 DGD1202의 효과를 도시한 것이다. (A). NCI-H1975 오시머티닙 내성 이종이식편을 보유하는 SCID 마우스를 DGD1202(75 mg/kg, 매일, PO)로 처리했다. 화살표는 DGD1202로의 치료의 시작을 표시한다. 종양 부피의 변화가 플롯된다. (B). EGFR에 대한 DGD1202 처리의 효과는 DGD1202 처리 후 3일에 수확된 종양에서 평가되었다.
도 6은 대조군과 비교하여 DGD1202가 제공된 유전적으로 조작된 KRAS-LSL-G12D 마우스의 폐 병변 퍼센트 및 전체 폐 병변을 나타낸다.

먼저, 개시된 치료제를 사용하여 적어도 KRAS 돌연변이의 발현을 특징으로 하는 암을 치료하는 방법이 본원에서 상세히 개시된다.

KRAS는 EGFR-유도 신호전달 경로에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, Knickelbein 등, Genes & Diseases, 2015, 2, 4-12("Knickelbein")를 참조한다. Knickelbein에 보고된 바와 같이, 리간드 결합 시 EGFR의 활성화 및 후속적인 자가-인산화는 SOS/GRB2 복합체에 대한 도킹 부위를 생성하여, SOS 및 GTP-결합 형태의 KRAS에 의한 뉴클레오타이드 교환을 초래하며; 이어서, KRAS는 RAF/MEK/ERK 및 PI3K/AKT 캐스케이드를 통해 신호전달하여, 세포 성장을 촉진하고 세포자멸사를 억제한다. 이와 같이 세툭시맙 및 파니투무맙을 포함한 항-EGFR 항체는 EGFR에 결합하여 리간드 결합 및 후속 KRAS 활성화를 방지하여, RAF/MEK/ERK 및 PI3K/AKT 경로의 억제로 인한 성장 억제 및 세포 사멸을 초래한다. Knickelbein, 6페이지, 첫 번째 단락을 참조한다. 반면에, 돌연변이 KRAS는 세포 성장과 생존을 유도하는 항-EGFR 항체의 효과를 무시할 수 있다. 공보물을 참조한다.

위에서 지적한 바와 같이, 본 개시내용은 적어도 KRAS 돌연변이를 특징으로 하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 방법은 상기 KRAS 돌연변이로부터 야기되는 KRAS-관련 활성(예를 들어, KRAS 또는 cMet)을 변경하기에 충분한 양으로 치료제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 치료제는 하기 도시된 화학식 I의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 전구약물이다:

[화학식 I]

상기 기재된 바와 같이, 암은 적어도 하나의 유해한 KRAS 돌연변이 및 선택적으로, 하나 이상의 EGFR 돌연변이의 존재를 특징으로 한다. 본원에서 용어 "유해한 KRAS 돌연변이"는 암세포에 존재할 때 증가된 세포 증식에 기여하는 KRAS 돌연변이를 지칭한다. 유해한 KRAS 돌연변이의 예에는 G12D, G12V 및 G13D가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. EGFR 돌연변이의 예에는 L858R, T790M, C797S, S768I, 및 del Exon 19를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 실시형태에서, 유해한 KRAS 돌연변이는 G12D 또는 G13D이고, EGFR 돌연변이는 L858R 또는 T790M이다.

상기 기재된 화합물은 구조적으로 밀접한 유사체와 비교하여 약리학적 특성 및 생물학적 활성에서 상당한 개선을 나타낸다. 예를 들어, DGD1202는 하기 도시된 다른 두 가지 구조적으로 밀접한 화합물과 비교하여 훨씬 더 나은 간 마이크로솜 안정성을 보여준다:

DGD1202는 46분에 걸쳐 간 마이크로솜 반감기로 안정하고, pH 3.5에서 물에 용해가능하며, 전신 주사 및 경구 투여를 통해 생체이용가능하고, 세포집락 측정법에서 서브마이크로몰 IC₅₀으로 강력하다. 중요하게는, 이 화합물은 EGFR의 활성을 억제하는 대신 EGFR을 분해한다. 또한 EGF-유도 EGFR 이량체화를 차단하고, 정제된 EGFR에 직접 결합하며, EGFR-유도 오시머티닙 내성 세포주 및 이종이식 모델에서 선택적으로 활성이다.

화학식 I의 화합물(즉, DGD1202)의 항종양 활성을 추가로 조사하기 위해, NCI-60 세포주 스크리닝을 수행하였다. 이 실험의 데이터(하기 실시예 3의 표 참조)는 이 화합물이 EGFR에 의해 유도되는 종양 세포뿐만 아니라 돌연변이 KRAS를 발현하고 세툭시맙으로서 EGFR 표적화 항체에 내성을 나타내는 다양한 세포에 대해서도 활성임을 시사한다.

이들 세툭시맙-내성 세포주에 대한 DGD1202의 IC₅₀ 값은 0.5 μM 내지 2.2 μM 범위이다. 비-암 기원의 불멸화 세포에서 이 화합물의 IC₅₀ 값은 20μM 이상이다.

또한, DGD1202는 돌연변이 KRAS 양성 세포주 뿐만 아니라 형질전환 마우스 모델에서 활성을 나타내며, 여기서 KRAS G12D가 췌장 상피내 종양(PanIns)의 형성을 유발하는 췌장에서 발현된다. 또한, KRAS가 돌연변이된 세툭시맙-내성 두경부 종양 모델(UMSCC74B)에서 활성을 추가로 보여준다.

세툭시맙(Erbitux, 항-EGFR 항체)은 결장직장암(CRC) 환자에서 이점을 입증하였다. 그러나 WT-EGFR 환자의 일부만이 지속적인 임상 반응을 보였다. KRAS 돌연변이가 있는 환자는 전형적으로 세툭시맙 치료로의 EGFR 키나제 활성 억제에 반응하지 않는다. 전임상 모델을 사용한 다양한 그룹의 최근 연구에 따르면 종양단백질의 분해가 키나제 활성의 억제보다 더 효과적이다. 예를 들어, Raina 등, Proc Natl Acad Sci USA., 2016, 113:7124-7129; 및 Corcoran 등, Cancer Discovery, 2012, 2:227-235를 참조한다. 이것은 EGFR 단백질-스캐폴드가 그의 키나제 활성이 억제되더라도 다른 단백질과 상호작용하여 계속 기능할 수 있기 때문일 수 있다. (활성 억제 이상으로) 종양단백질 분해의 중요한 이점은 획득한 돌연변이-매개 내성의 비율이 더 낮을 것으로 예상된다는 점이다. 후천적 돌연변이 외에도, EGFR 억제제 요법에 처음 반응하는 환자라도 보상 신호전달의 상향조절로 인해 내성이 생길 것이다. CRC에서, EGFR-KRAS 축은 MEK-ERK 신호전달을 활성화하여 암 진행을 촉진하여 기존 키나제 억제제 요법에 대한 1차 및 2차 내성을 유발하는 것으로 알려져 있다. KRAS 돌연변이 CRC 종양에서, EGFR은 ERK 경로가 억제되더라도 ERK 경로를 통해 계속 신호를 보내 EGFR 억제제 요법에 대한 내성을 유발한다. 따라서, 적어도 KRAS 돌연변이를 특징으로 하는 암을 치료하기 위해 화학식 I의 화합물을 사용하는 방법은 공지된 치료보다 예상치 못한 우수성을 제공한다.

상기 치료 방법을 실행하기 위해, 화학식 I의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 상응한 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19에 약제학적으로 허용가능한 염을 자세히 기술하고 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 상기 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도된 것을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 무독성 산 부가염의 예는 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 트리플루오로아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산으로, 또는 이온 교환과 같은 당업계에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 기타 약제학적으로 허용가능한 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르브산염, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 카르복실산 또는 기타 산성 작용기를 함유하는 화합물의 염은 적합한 염기와 반응시켜 제조될 수 있다. 그러한 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 알루미늄 염, 암모늄, N⁺(C_1-4알킬)₄염, 및 유기 염기의 염, 예컨대 트리메틸아민, 트리에틸아민, 모르폴린, 피리딘, 피페리딘, 피콜린, 디사이클로헥실아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 2-하이드록시에틸아민, 비스-(2-하이드록시에틸)아민, 트리-(2-하이드록시에틸)아민, 프로카인, 디벤질피페리딘, 데하이드로아비에틸아민, N,N'-비스데하이드로아비에틸아민, 글루카민, N-메틸글루카민, 콜리딘, 퀴닌, 퀴놀린 및 염기성 아미노산, 예컨대 리신 및 아르기닌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용은 또한 본원에 제공된 화합물의 임의의 염기성 질소-함유 기의 4차화를 구상한다. 이러한 4차화에 의해 물 또는 유용성 또는 분산성 생성물이 수득될 수 있다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용가능한 염은 적당한 경우 무독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 반대 이온, 예컨대 할로겐화물, 수산화물, 카르복실산염, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트를 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다. 화학식 I의 화합물의 예시적인 약제학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬화수소산염, 설페이트, 니트레이트, 포스페이트, 메실레이트, 에실레이트, 이세티오네이트, 토실레이트, 나프실레이트, 베실레이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 말레에이트, 벤조에이트, 살리실레이트, 푸머레이트, 글루타메이트, 아스파르테이트, 시트레이트, 락테이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 글리콜레이트, 헥사노에이트, 옥타노에이트, 데카노에이트, 올레에이트, 스테아레이트, 파모에이트 및 폴리스트리렌 설포네이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시형태에서, 화학식 I의 화합물(DGD1202)의 전구약물이 또한 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "전구약물"은 투여 후 약리학적 활성 약물로 대사되는 (즉, 신체 내에서 전환되는) 약제 또는 화합물을 지칭한다. 따라서, DGD1202의 전구약물은 투여 후 체내에서 DGD1202로 전환되는 약제 또는 화합물을 의미한다. 숙련된 기술자는 상응하는 전구약물을 대신 사용하여 약물이 흡수, 분포, 대사 및 배설되는 방식을 개선함으로써 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에서 발휘되는 약리학적 효과를 개선할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 전구약물의 예는 아미드, 카르바메이트, 설폰아미드, 카르복사미드, N-옥사이드, N-아실옥시알킬 유도체, N-하이드록시알킬 유도체, 및 N-(포스포릴옥시)알킬 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

화학식 I의 화합물의 일반적인 합성이 하기에 제공된다:

[화학식 I]

전형적으로, 아세트아미드 B(1 당량)는 유기 용매(예를 들어, 무수 아세토니트릴)내 3-(4-브로모페닐)-8-메틸-1,4,8-트리아자스피로[4.5]덱-3-엔-2-티온 A의 용액에 첨가된다. 반응 혼합물이 사전결정된 온도(예를 들어, 40℃)로 가온된다. 다음으로, 염기(예를 들어, 2M 탄산칼륨 수용액, 1당량)가 반응 혼합물에 첨가된다. TLC가 출발 물질 손실 및 새로운 R_f 반점의 출현을 나타낼 때까지 반응이 동일한 온도에서 유지된다(전형적으로 2~6시간). TLC에 의해 반응이 완료되면, 이를 후처리하고 생성된 조 화합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 원하는 생성물: (2-((3-(4-브로모페닐)-8-메틸-1,4,8-트리아자스피로[4.5]데카-1,3-디엔-2-일)티오)-N-(퀴놀린-3-일)아세트아미드)를 수득한다.

화학식 I의 화합물을 제조하기 위한 중간체 A 및 B의 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, R. Larock, Comprehensive Organic Transformations (2^nd Ed., VCH Publishers 1999); P. G. M. Wuts and T. W. Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (4^th Ed., John Wiley and Sons 2007); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1994); L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (2^nd ed., John Wiley and Sons 2009); P. Roszkowski, J.K. Maurin, Z. Czarnocki "Enantioselective synthesis of (R)-(-)-praziquantel (PZQ)" Tetrahedron: Asymmetry 17 (2006) 1415-1419; 및 L. Hu, S. Magesh, L. Chen, T. Lewis, B. Munoz, L. Wang "Direct inhibitors of keap1-nrf2 interaction as antioxidant inflammation modulators,"　WO2013/067036을 참조한다.

치료제로 지칭되는, 본원에 기재된 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 치료적 유효량으로 (예를 들어, KRAS 돌연변이와 관련된 질환 또는 장애의 증상을 예방 또는 경감시키는데 충분한 양으로) 대상체에게 투여될 수 있다. 치료제는 단독으로 또는 약제학적으로 허용가능한 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 치료제는 한번에 모두, 여러 번 투여되거나, 일정 기간에 걸쳐 실질적으로 균일하게 전달될 수 있다.

당업자는 치료제의 투여량이 시간에 따라 변할 수 있음을 이해할 것이다. 특정 대상체에 대한 특정 투여 요법은 부분적으로 화합물, 투여되는 화합물의 양, 투여 경로, 및 임의의 부작용의 원인과 정도에 따라 달라질 것이다. 본 개시내용에 따라 대상체(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에게 투여되는 화합물의 양은 합리적인 시간 프레임에 걸쳐 원하는 반응을 달성하기에 충분해야 한다. 투여량은 전형적으로 투여 경로, 투여 시기 및 투여 빈도에 따라 다르다. 따라서, 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 수정하며, 통상적인 범위-측정 기술은 당업자에게 알려져 있다.

순전히 예시로서, 상기 기재된 암 치료 방법은 상기 언급된 인자에 따라, 예를 들어, 약 1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg의 화학식 I의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 투여량 범위는 5 mg/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 10 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 10 mg/kg 내지 약 60 mg/kg, 또는 20 mg/kg 내지 약 40 mg/kg일 수 있다. 일부 병태는 장기간의 치료를 필요로 하며, 이는 다중 투여에 걸쳐 더 낮은 용량의 화합물 투여를 수반할 수도 있고 수반하지 않을 수도 있다. 원하는 경우, 화합물의 투여량은 하루 종일 적당한 간격으로 개별적으로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 하위 투여량으로, 선택적으로 단위 투여 형태로 투여된다. 치료 기간은 특정 병태에 따라 다를 것이며, 1일에서 몇개월까지 지속될 수 있다.

화학식 I의 화합물을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물을 투여하는 적합한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 하나 이상의 경로가 사용되어 화합물을 투여할 수 있지만, 특정 경로는 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 효과적인 반응을 제공할 수 있다. 상황에 따라, 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 체강에 적용 또는 점적, 피부 또는 점막을 통해 흡수, 섭취, 흡입되고/되거나 순환에 도입된다. 예를 들어, 특정 상황에서, 치료제를 포함하는 약제학적 조성물을 경구로, 주사를 통해, 또는 하기 수단 중 하나에 의해 전달하는 것이 바람직할 것이다: 정맥내, 복강내, 뇌내(실질내), 뇌실내, 근육내, 안구내, 동맥내, 문맥내, 병변내, 골수내, 척수강내, 심실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장내, 국소, 설하, 요도, 질 또는 직장. 화합물은 서방성 시스템 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.

투여를 용이하게 하기 위해, 치료제는 다양한 양태에서 담체(예를 들어, 비히클, 보조제 또는 희석제)를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물로 제형화된다. 사용되는 특정 담체는 용해도 및 화합물과의 반응성 결여와 같은 화학적-물리적 고려사항, 및 투여 경로에 의해서만 제한된다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다. 주사용으로 적합한 예시적인 약제학적 형태는 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제5,466,468호 참조). 주사용 조성물은 예를 들어 Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia. Pa., Banker and Chalmers, eds., 238-250페이지(1982) 및 ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4판, 622-630페이지(1986))에 추가로 기재되어 있다. 치료제를 포함하는 약제학적 조성물은 한 양태에서 이러한 약제학적 조성물의 사용에 관한 지침을 제공하는 포장재와 함께 용기 내에 배치된다. 일반적으로, 이러한 지침에는 시약 농도를 설명하는 유형의 표현뿐만 아니라 특정 실시형태에서 약제학적 조성물을 재구성하는 데 필요할 수 있는 부형제 성분 또는 희석제(예를 들어, 물, 식염수 또는 PBS)의 상대적인 양이 포함된다.

비경구 주사에 적합한 조성물은 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 생리학적으로 허용가능한 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예에는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨대 올리브 오일) 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트가 포함된다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등을 첨가하여 미생물 오염이 방지될 수 있다. 또한 등장제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 약제학적 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.

경구 투여용 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투여 형태에서, 치료제는 적어도 하나의 통상적인 비활성 부형제(또는 담체), 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토오스, 수크로스, 만니톨 및 규산; (b) 결합제, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및 아카시아; (c) 습윤제, 예를 들어 글리세롤; (d) 붕해제, 예를 들어 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 복합 규산염 및 탄산나트륨; (e) 용해 지연제, 예를 들어 파라핀; (f) 흡수 촉진제, 예를 들어 4차 암모늄 화합물; (g) 습윤제, 예를 들어 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (h) 흡착제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트; 및 (i) 윤활제, 예를 들어 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트, 또는 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐 및 정제의 경우, 투여 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한 락토오스 또는 유당, 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐의 충전제로서 사용될 수 있다.

정제, 당의정, 캡슐, 환제 및 과립과 같은 고체 투여 형태는 코팅 및 쉘, 예컨대 장용 코팅 및 당업계에 널리 공지된 다른 것으로 제조될 수 있다. 고체 투여 형태는 또한 불투명화제를 함유할 수 있다. 또한, 고체 투여 형태는 장관의 특정 부분에서 지연된 방식으로 치료제를 방출하도록 하는 임베딩 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 임베딩 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스이다. 화학식 I의 화합물은 또한 선택적으로 하나 이상의 부형제와 함께 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용가능한 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 치료제 이외에, 액체 투여 형태는 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들어 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 특히 면실유, 땅콩유, 옥수수 배아유, 올리브유, 피마자유, 및 참기름, 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물 등을 함유할 수 있다.

이러한 불활성 희석제 외에, 조성물은 또한 보조제, 예컨대 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 풍미제 및 방향제를 포함할 수 있다. 현탁액은 치료제 외에 현탁제, 예를 들어 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트 또는 이들 물질의 혼합물 등을 함유할 수 있다.

제형화 시, 용액은 투여 제형과 양립가능한 방식으로 치료적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 조성물은 주사용 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다. 예를 들어, 수용액으로 비경구 투여하는 경우, 용액은 필요한 경우 적합하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 되어야 한다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다.

화학식 I의 화합물은 독특한 방식으로 EGFR을 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화합물은 EGFR 이량체화를 차단하거나 억제한다. 다양한 실시형태에서, 화합물은 EGFR 분해를 유도한다.

EGFR이 암에서 종양유전자 및 중요한 분자 표적으로 확인되었지만, 이 종양유전자의 활성을 조절하기 위한 개선된 접근법에 대한 큰 필요성과 기회가 여전히 존재한다. 이량체화(Disruptin) 또는 siRNA를 차단하는 세포 투과 펩타이드를 사용하여, EGFR 분해가 TKI 내성 세포에서도 세포 생존에 중대한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 예를 들어, Raina 등, Proc Natl Acad Sci USA., 2016, 113:7124-7129를 참조한다. 단순히 키나제 활성을 억제하는 것이 아니라 EGFR 단백질을 분해함으로써 전임상 모델에서 광범위한 활성 스펙트럼이 입증되었으며, 약제가 EGF-결합 EGFR에만 영향을 미친다는 사실로 인해 종양 조직을 표적화하는 능력이 향상되었으며, 이는 정상 조직에 비해 종양 세포에 풍부하여 안전성 프로파일과 치료 창을 향상시킨다.

EGFR의 키나제 활성을 단순히 억제하는 것보다 EGFR을 분해하는 접근 방식은 비소세포 폐암 환자에서 변함없이 발생하는 오시머티닙에 대한 내성을 극복한다. 예를 들어, Corcoran 등, Cancer Discovery, 2012, 2:227-235를 참조한다. EGFR 분해 적용의 초점은 폐암에 있지만 두경부암, 결장직장암 및 췌장암과 같이 EGFR 또는 KRAS에 의해 유발되는 다른 암에도 추가적이고 중요한 임상 기회가 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 및 이와 관련된 단어는 반드시 100% 또는 완전한 치료를 의미하지는 않는다. 오히려, 당업자가 잠재적인 이점 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식하는 다양한 정도의 치료가 존재한다. 이와 관련하여, 본 개시내용의 암을 치료하는 방법은 임의의 양 또는 임의의 수준의 암 치료를 제공할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 치료는 치료되는 암의 하나 이상의 병태 또는 증상의 치료를 포함할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 치료는 암의 진행을 늦추는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법은 종양 또는 암 성장의 감소, 종양 세포의 전이 감소, 종양 또는 암 세포의 세포 사멸 증가 등으로 암을 치료할 수 있다.

본원에 개시된 방법에 의해 치료가능한 암은 적어도 KRAS 돌연변이를 특징으로 하는 임의의 KRAS-관련 암 또는 KRAS-유도 암일 수 있다.

일부 양태에서 암은 췌장암, 결장직장암, 두경부암, 폐암, 예를 들어 비소세포폐암(NSCLC), 난소암, 자궁경부암, 위암, 유방암, 간세포 암종, 교모세포종, 간암, 악성 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 전립선암 및 신장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 췌장암, 결장직장암, 두경부암, 또는 폐암이다. 일부 실시형태에서, 암은 세툭시맙-내성 암 또는 오시머티닙-내성 암이다.

적어도 KRAS 돌연변이의 발현을 특징으로 하는 세포에서 KRAS 또는 cMet의 수준을 변경하는 방법이 여전히 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이 방법은 상기 세포를 상기 세포에서 EGFR의 활성을 분해하기에 효과적인 양으로 화학식 I의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

전형적으로, KRAS- 또는 cMet-관련 세포는 적어도 하나의 KRAS 돌연변이 및 선택적으로, 하나 이상의 EGFR 돌연변이의 존재를 특징으로 한다. KRAS 돌연변이의 예는 G12D, G12V 및 G13D를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. EGFR 돌연변이의 예는 L858R, T790M, C797S, S768I, 및 del Exon 19를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, KRAS 돌연변이는 G12D 또는 G13D이고, EGFR 돌연변이는 L858R 또는 T790M이다.

일부 실시형태에서, 화학식 I의 화합물을 투여하는 개시된 방법은 EGFR을 분해하거나 EGFR 이량체화를 차단하여 세포에서 KRAS 또는 cMet의 수준을 변경시킨다.

추가 설명 없이, 당업자는 상기 설명에 기초하여 본 개시내용을 최대한 활용할 수 있다고 믿어진다. 따라서 하기의 특정 예, 즉 실시예 1~5는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떠한 방식으로든 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것이 아니다.

실시예

실시예 1 - DGD1202의 합성 및 특성화

무수 아세토니트릴내 3-(4-브로모페닐)-8-메틸-1,4,8-트리아자스피로[4.5]덱-3-엔-2-티온 A의 용액에 아세트아미드 C(1당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃로 가온하였다. 다음으로, 2M 탄산칼륨 수용액(1당량)을 반응 혼합물에 첨가하였다. TLC가 출발 물질 손실 및 새로운 R_f 반점의 출현을 나타낼 때까지 반응이 40℃에서 유지되었다(전형적으로 2~6시간). TLC에 의해 반응이 완료되면, 이를 후처리하였다. 미정제 반응 혼합물을 분별 깔때기에 붓고, 에틸 아세테이트 및 물을 첨가하였다. 유기층을 분리한 다음, 염수(1 x)로 세척하였다. 이어서, 유기 층을 무수 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 감압 하에 농축하여 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제 생성물을 10% 메탄올/디클로로메탄 용액에서 발생하는 용리와 함께 플래시 크로마토그래피로 정제하여 DGD1202: (2-((3-(4-브로모페닐)-8-메틸-1,4,8-트리아자스피로[4.5]데카-1,3-디엔-2-일)티오)-N-(퀴놀린-3-일)아세트아미드)를 수득하였다. ¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ 10.89 (br s, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 7.96 (br d, J=8.33 Hz, 1H), 7.92 (br d, J=8.33 Hz, 1H), 7.78-7.87 (m, 4H), 7.52-7.72 (m, 2H), 4.29 (s, 2H), 2.43-2.52 (m, 4 H), 2.18 (br s, 3H), 1.55-1.85 (m, 4H); MS (ESI + m/z 523.05, ESI- m/z 521.00 ); TLC: (90:10:0.5, DCM:MeOH:NH₄OH) R_f =0.47.

실시예 2 - KRAS 돌연변이 두경부암에서 DGD1202의 평가

두경부암(UMSCC74B)의 KRAS G12D 유도 세툭시맙-내성 종양 모델에서 DGD1202의 효능 및 독성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다(도 1).

종양-보유 마우스를 1주 동안 격주로 30 mg/kg 용량의 경구 위관영양법을 통해 DGD1202로 치료하였다. 이 용량은 단일-용량 PK 프로필을 기반으로 선택하였다. 종양 부피에 대한 DGD1202의 결과적인 효과를 시험 화합물을 투여받지 않은 대조군 마우스 및 공지된 EGFR 억제제인 세툭시맙을 투여받은 대조군 마우스와 비교하였다.

예상외로, 이 치료의 용량 및 요법은 안전했고 DGD1202로 처리된 마우스는 상당한 종양 성장 억제를 나타내었고(P <0.001), 뚜렷한 대조와 대조적으로 세툭시맙은 의미 있는 효능을 나타내지 못했다.

실시예 3 - KRAS 돌연변이 결장직장암 및 췌장암 세포주에서 DGD1202의 평가

세포집락 측정법을 사용하여 KRAS G13D 유도 세툭시맙-내성 결장직장 세포주(HCT-116)에서(도 2), 그리고 KRAS G12D 돌연변이를 함유하는 췌장암 세포주(Panc1)에서(도 3b) DGD1202의 활성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다.

보다 구체적으로, 세포는 농도 범위(예를 들어, 0~10 마이크로 M)로 처리하기 하루 전에 3중으로 60 또는 100 mm 배양 접시에 클론 밀도로 플레이팅하였다. 8~12일 후, 세포를 아세트산/메탄올(1:7, v/v)로 고정하고, 크리스탈 바이올렛(0.5%, w/v)으로 염색한 후 입체현미경을 사용하여 계수하였다. 약물 세포독성(생존하는 약물-처리된 세포)을 측정하고, 처리되지 않은 대조군 세포의 생존으로 정규화하였다.

도 2 및 3b에 나타낸 데이터는 DGD1202가 돌연변이 KRAS 유도 결장직장암 및 췌장암 세포를 치료하는 데 효과적임을 시사한다. 항종양 효능은 ERK/AKT 신호전달의 재활성화를 차단하고 EGFR을 통해 발생할 가능성이 있는 EGFR 단백질의 손실로 인한 것으로 가정된다.

EGFR, ERK 및 AKT에 대한 DGD1202의 효과는 또한 면역블롯팅에 의해 평가되었다. 돌연변이 KRAS 유도 HCT-116(CRC) 및 Panc1(췌장) 세포주에서 DGD1202에 대한 예비 데이터는 각각 도 3a 및 도 3b에 도시되어 있다. 이 화합물은 Panc1 세포주의 경우 KRAS G12D 특이적 항체 및 HCT116의 경우 PAN-RAS 항체에 의해 검출된 바와 같이 EGFR 및 mtKRAS(Panc1) 수준 모두에 영향을 미치는 것으로 관찰되었으며, 이는 차례로 pAKT 및 pERK의 다운스트림 신호전달에 영향을 미쳤다.

면역블롯팅은 하기 프로토콜에 따라 수행하였다:

세포를 접시당 3×10⁵개 세포의 밀도로 60 mm 접시에 플레이팅하고, 하룻밤 또는 70% 컨플루언스까지 인큐베이션하였다. 세포를 비히클(DMSO) 또는 DGD1202로 처리한 다음, 다양한 시점에서 수확하였다. 펠렛을 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 용해 완충액에 30분 동안 재현탁시켰다. 초음파처리 후 4℃에서 10분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하여 미립자 물질을 제거하였다. 가용성 단백질 분획을 5분 동안 95℃로 가열한 다음, 4~12% Bis-Tris 프리캐스트 젤(Invitrogen)에 적용하고 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 Tris-완충 식염수(137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl(pH 7.6), 0.1%(v/v)) Tween 20 중 5% BSA 및 1% 정상 염소 혈청으로 구성된 차단 완충액에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 멤브레인을 이후 차단 완충액 중 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, 세척하고, 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. Tris-완충 식염수에서 3회 추가 세척한 후, 향상된 화학발광 플러스 시약에 의해, 결합된 항체가 검출되었다. 상대적 단백질 수준의 정량화를 위해, 면역블롯 필름을 스캔하고 Image J 1.32j 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 표시된 상대적 단백질 수준은 처리되지 않은 대조군과의 비교를 나타낸다.

이와 관련하여, DGD1202의 활성은 또한 표준 NCI 60 스크리닝 프로토콜을 사용하여 국립 암 연구소에서 60개의 상이한 인간 종양 세포주에 대해 테스트하였다. 최고 성능의 세포주에 대한 퍼센트 성장 억제는 하기 표에 개시되어 있다. 최고 반응 세포주(예를 들어, HCT-116)는 KRAS 유전자(예를 들어, KRAS G13D)의 돌연변이를 나타내며, 이는 CRC 및 췌장에서 빈번하게 돌연변이되고 세툭시맙에 대한 내성과 상관관계가 있다.

실시예 4 - KRAS 돌연변이 췌장암에서 DGD1202의 평가

KRAS G12D 유도 췌장 종양 모델에서 DGD1202의 효능을 평가하기 위한 연구를 수행하였다.

보다 구체적으로, 6주령 KC 마우스를 5주 동안 경구 위관영양법(30 mg/kg 체중, 매일)을 통해 DGD1202로 처리하였다. PanIn(췌장 상피내 종양) 수준에 대한 결과적인 효과는 DGD1202를 투여받지 않은 대조군 마우스와 비교하여 관찰하였다. 11주차에 모든 마우스를 희생시키고, PanIn에 대한 효과를 도 4에 도시된 바와 같이 채점하였다. DGD1202로 처리한 마우스는 일종의 췌관 병변인 PanIn이 발병하는 경향이 유의하게 감소된 것으로 나타났다.

이들 데이터는 DGD1202가 돌연변이 KRAS 유도 췌장암을 치료하는데 예기치 않게 효능을 나타내었음을 나타낸다.

실시예 5 - EGFR 돌연변이 폐암에서 DGD1202의 평가

돌연변이 EGFR 유도 폐암 모델에서 DGD1202의 효능을 평가하기 위한 연구를 수행하였다(도 5).

간략하게, 국소 진행성 NCI-H1975-AZR(오시머티닙 내성) 이종이식편을 보유하는 SCID 마우스를 2주 동안 DGD1202(75 mg/kg)의 경구 위관영양법으로 매일 치료하였다. 종양 부피는 일주일에 적어도 3회 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. EGFR 발현에 대한 DGD1202 처리의 효과는 처리 개시 3일 후 IHC 염색에 의해 결정되었다.

도 5에 개시된 데이터는 DGD1202가 오시머티닙에 내성인 돌연변이체 EGFR 유도 폐암을 치료하는데 있어서 예기치 않게 효능을 나타내었음을 나타낸다.

실시예 6 - 폐암에 대한 유전자 조작 KRAS-LSL-G12D 마우스 모델에서 DGD1202의 평가

DGD1202 치료의 효능을 KRAS-돌연변이 폐 종양 개시 및 진행에 대해 평가하였다. 유전자 조작된 KRAS-LSL-G12D 폐암 마우스 모델을 사용했다. 이 마우스는 KRAS G12D 점 돌연변이 대립유전자가 뒤따르는 Lox-Stop-Lox(LSL) 서열을 가지고 있다. LSL 카세트를 결실시키고 돌연변이 KRAS 종양형성 단백질의 발현을 허용하는 Cre 재조합효소를 발현하도록 폐 상피 세포를 형질도입한 아데노바이러스-Cre 입자(1.5x10e⁷ pfu)의 비강내 전달에 의해 종양 형성이 시작되었다. 이들 마우스는 6~8주령까지 폐의 증식을 보였고 12주령까지 선종을 나타냈다.

바이러스 전달 8주 후, 마우스를 30 mg/kg 경구 위관영양법의 용량으로 4주 동안 월요일~금요일 일정으로 비히클 또는 DGD1202로 처리하였다. 마우스가 20주령일 때 폐를 채취하고 H&E 섹션에서 형태학적 평가를 받았다. 폐 병변의 조직병리학적 스펙트럼은 과형성 폐포 또는 기관지, 과형성, 선종, 국소 이형성을 동반한 과형성, 기관지 이형성, 선종 및 비정형 선종 과형성의 패턴에 대해 이중-맹검 방식으로 노트 및 기록하였다. 두 치료 그룹의 모든 샘플에서 각 엽의 폐 병변의 백분율과 전체 폐 병변의 면적을 기록하고 도 6에 표시한다. 쌍을 이루는 t-검정은 2개 코호트 간의 차이가 유의미한 경향이 있음을 보여준다(p=0.0577).

다른 실시형태들

본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 기능은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적을 제공하는 대체 기능으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예일 뿐이다.

또한, 상술한 설명으로부터, 당업자는 본 개시내용의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 그의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 사용법 및 조건에 적응하도록 개시내용의 다양한 변경 및 수정을 할 수 있다. 따라서, 다른 실시형태들도 청구범위 내에 포함된다.

Claims

적어도 KRAS 돌연변이의 발현을 특징으로 하는 암을 치료하는 방법으로서, 상기 KRAS 돌연변이로부터 야기되는 KRAS 또는 cMet의 활성을 변경하기에 충분한 양의 치료제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
상기 치료제는 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 전구약물인, 방법:
[화학식 I]

.
청구항 1에 있어서,
상기 암이 KRAS-유도 암인, 방법.
청구항 2에 있어서,
상기 암이 췌장암, 결장직장암, 두경부암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암은 G12D, G12V, 및 G13D로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 KRAS 돌연변이; 및, 선택적으로, L858R, T790M, C797S, S768I, del Exon 19, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 EGFR 돌연변이의 발현을 특징으로 하는, 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 KRAS 돌연변이가 G12D 또는 G13D인, 방법.
청구항 4 또는 청구항 5에 있어서,
상기 EGFR 돌연변이가 L858R 또는 T790M인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료제가 KRAS의 활성을 변경하기에 충분한 양으로 투여되는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암이 EGFR 억제제에 대해 내성인, 방법.
청구항 8에 있어서,
상기 EGFR 억제제가 세툭시맙 또는 오시머티닙인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료제가 EGFR을 분해하는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료제가 EGFR 이량체화를 차단하는, 방법.
청구항 8에 있어서,
상기 암이 KRAS-유도 암인, 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 암이 췌장암, 결장직장암, 두경부암, 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
청구항 8에 있어서,
상기 암이 G12D, G12V, 및 G13D로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 KRAS 돌연변이; 및, 선택적으로, L858R, T790M, C797S, S768I, del Exon 19, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 EGFR 돌연변이의 발현을 특징으로 하는, 방법.
청구항 14에 있어서,
상기 KRAS 돌연변이가 G12D 또는 G13D인, 방법.
청구항 14에 있어서,
상기 EGFR 돌연변이가 L858R 또는 T790M인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료제가 1~500 mg/kg의 투여량으로 투여되는, 방법.
청구항 17에 있어서,
상기 치료제가 20~40 mg/kg의 투여량으로 투여되는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료제가 경구로 투여되는, 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 암이 EGFR 억제제에 내성이고, G12D, G12V, 및 G13D로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 KRAS 돌연변이; 및, 선택적으로, L858R, T790M, C797S, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 EGFR 돌연변이의 발현을 특징으로 하는, 방법.
청구항 20에 있어서,
상기 암은 KRAS-유도 암이고, 상기 치료제는 1~500 mg/kg의 투여량으로 경구 투여되는, 방법.
청구항 21에 있어서,
상기 암은 췌장암, 결장직장암, 두경부암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 치료제는 20~40 mg/kg의 투여량으로 경구 투여되는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료제가 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염인, 방법.
적어도 KRAS 돌연변이의 발현을 특징으로 하는 세포에서 KRAS의 수준을 변경하는 방법으로서, 상기 세포를 상기 세포에서 EGFR의 활성을 저하시키기에 효과적인 양의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 화합물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염인, 방법:
[화학식 I]

.
청구항 24에 있어서,
상기 세포가 G12D, G12V, 및 G13D로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 KRAS 돌연변이; 및, 선택적으로, L858R, T790M, C797S, S768I, del Exon 19, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 EGFR 돌연변이의 발현을 특징으로 하는, 방법.
청구항 25에 있어서,
상기 KRAS 돌연변이가 G12D 또는 G13D인, 방법.
청구항 25 또는 청구항 26에 있어서,
상기 EGFR 돌연변이가 L858R 또는 T790M인, 방법.
청구항 24 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 EGFR을 분해하는, 방법.
청구항 24 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 EGFR 이량체화를 차단하는, 방법.
적어도 KRAS 돌연변이의 발현을 특징으로 하는 세포에서 cMet의 수준을 변경하는 방법으로서, 상기 세포를 상기 세포에서 EGFR의 활성을 저하시키기에 효과적인 양의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 화합물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염인, 방법:
[화학식 I]

.
청구항 30에 있어서,
상기 세포가 G12D, G12V, 및 G13D로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 KRAS 돌연변이; 및, 선택적으로, L858R, T790M, C797S, S768I, del Exon 19, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 EGFR 돌연변이의 발현을 특징으로 하는, 방법.
청구항 31에 있어서,
상기 KRAS 돌연변이가 G12D 또는 G13D인, 방법.
청구항 31 또는 청구항 32에 있어서,
상기 EGFR 돌연변이가 L858R 또는 T790M인, 방법.
청구항 30 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 EGFR을 분해하는, 방법.
청구항 30 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 EGFR 이량체화를 차단하는, 방법.