KR20230016158A - Kras 돌연변이 특이적 저해제 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Kras 돌연변이 특이적 저해제 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 KRAS 돌연변이 특이적 저해제 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 KRAS 돌연변이 특이적 저해제로서, 화학식 1로 표시되는 화합물; 화학식 1로 표시되는 화합물 유도체; 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물, 및 이들 화합물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 KRAS 돌연변이 단백질 저해제는 특정 KRAS 돌연변이의 GDP/GTP 결합 부위가 아닌 입체성 다른 자리(allosteric pocket)에 높은 수준으로 안정된 결합을 할 수 있으며, KRAS 돌연변이를 발현하는 암 세포를 사멸 시키거나, 성장을 억제하는 것을 확인하였으므로, KRAS 돌연변이 단백질 특이적 항암제로서 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

KRAS 돌연변이 특이적 저해제 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물{KRAS mutation specific inhibitor and composition for preventing or treating cancer comprising the same}
본 발명은 KRAS 돌연변이 특이적 저해제 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 KRAS 돌연변이 특이적 저해제로서, 화학식 1로 표시되는 화합물; 화학식 1로 표시되는 화합물 유도체; 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물, 및 이들 화합물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암이란 개체의 필요에 따라 규칙적이고 절제 있는 증식과 억제를 할 수 있는 정상세포와 달리 조직 내에서 필요한 상태를 무시하고 무제한의 증식을 하는 미분화 세포로 구성된 세포덩어리로서 종양이라고도 한다. 이러한 무제한의 증식을 하는 암 세포는 주위의 조직으로 침투하고 더 심각한 경우는 신체의 다른 기관으로 전이가 되어 심각한 고통을 수반하고 결국 죽음을 초래하는 난치병이다.
암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 폐암, 위암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생하며, 이들의 치료방법으로 최근 글리벡 또는 허셉틴과 같은 소수의 표적치료제가 특정암의 치료에 이용되고 있으나 현재까지는 수술이나 방사선 요법 및 세포증식을 억제하는 화학요법제를 이용한 항암제 치료가 주된 방법이다. 그러나 표적치료제가 아니기 때문에 기존 화학요법제의 가장 큰 문제는 세포독성으로 인한 부작용과 약제 내성으로써, 항암제에 의한 초기의 성공적인 반응에도 불구하고 결국에는 치료가 실패하게 되는 주요 요인이다. 따라서, 이러한 화학요법제의 한계를 극복하기 위해서는 항암작용 기전이 명확한 표적 치료제 개발이 지속적으로 필요하다.
KRAS(K-Ras 또는 Kirsten-Ras)는 Ras 계열 GTPase 단백질의 21 kD 구성원이며 세포 신호 전달에 필요한 구성 요소이다. 활성화된 KRAS는 일반적으로 성장 인자 및 여타 수용체 신호(c-Raf 또는 PI3-키나아제)의 전파에 필요한 다운 스트림(하류 신호) 키나아제를 활성화시킨다. KRAS를 코딩하는 유전자의 유전적 변형은 세포를 Ras 신호전달에 활성화된 상태로 유지시켜 세포 증식 및 종양화를 유발하며, 이러한 돌연변이는 췌장암세포 등에서 세포자멸사(apoptosis) 저항성을 높여 항암제 내성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 대다수의 Ras 돌연변이는 특정 잔기들을 중심으로 일어나며, 특히 KRAS의 돌연변이가 가장 많은 돌연변이율과 종양특이성을 보여준다.
대략적으로 모든 인간 종양의 약 20-25%는 KRAS를 인코딩하는 유전자에서 활성화 돌연변이를 가지는데, 특히 췌장암(90 %), 담도암(33 %), 결장 직장암(32 %), 폐암(20 %)과 관련이 있다.
암 관련 KRAS 돌연변이는 글리신-12(Gly12),글리신-13(Gly13) 또는 글루타민-61(Gln61)에서 발견되는데, 주로 Gly12 돌연변이가 발생한다(88 %). Gly12 돌연변이는 같은 위치의 결함이지만, 각각의 돌연변이는 서로 다른 특성을 가지고 있다. 예를 들어, G12C의 발현은 종종 시스플라틴에 대한 반응 감소 내지 탁솔 및 페메트렉시드에 대한 증가된 민감성과 관련이 있는 반면, G12D 돌연변이의 발현은 일반적으로 탁솔 치료에 저항을 나타내고, 소라페닙에 대한 민감성을 나타낸다. G12V 돌연변이는 와일드 타입 변이종과 비교했을 때 시스플라틴에 강한 민감성을 나타내며 페메트렉시드에 약한 내성이 있다. 현재 KRAS 돌연변이에 대한 연구는 주로 KRAS-G12C 돌연변이에 대해 공유결합 방식의 저해제 스크리닝을 중심으로 이루어져 임상시험 단계에 있으나, G12V나 G12D와 같은 non-Cys 돌연변이에 적용하기 어려운 한계가 있다. 이러한 치료 반응의 다양성은 KRAS에 특화된 약물로 적절한 치료법을 찾는데 어려움을 야기한다.
대한민국 공개특허 제10-2017-0132332호에는 KRAS 돌연변이와 관련된 악성 종양을 치료하기 위한 화합물에 대해 개시되어 있으며, GST-π 표적 서열에 상응하는 RNAi 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 그러나 단일 KRAS 돌연변이에 특이적으로 결합하는 화합물에 대한 개시는 없다.
본 발명자들은 KRAS 돌연변이에 특이적으로 결합하여 항암효과를 제공할 수 있는 조성물 내지 방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, KRAS 돌연변이, 특히 단일 돌연변이 형태를 우선적으로 또는 선택적으로 표적화할 수 있는 화합물을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 KRAS 돌연변이 특이적 저해제 조성물 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 KRAS 돌연변이를 가진 암 치료에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 식에서, R은 수소, 직쇄 또는 분쇄형 C1-3 알킬 및 할로젠으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이며, N은 0 내지 5임;
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및
하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 3]
Figure pat00002
;으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 1-1 표시될 수 있다.
[화학식 1-1]
Figure pat00003
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 유도체는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00004
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 KRAS 돌연변이 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 KRAS 돌연변이 단백질의 입체성 다른 자리(allosteric site)에 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 입체성 다른 자리는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 61번째 위치의 글루타민(Q61), 서열번호 1의 아미노산 서열에서 94번째 위치의 히스티딘(H94), 서열번호 1의 아미노산 서열에서 95번째 위치의 히스티딘(H95) 및 서열번호 1의 아미노산 서열에서 96번째 위치의 티로신(Y96)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, KRAS 돌연변이는
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 발린으로 치환된 KRAS G12V 돌연변이,
(2) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아스파르트산으로 치환된 KRAS G12D 돌연변이,
(3) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 시스테인으로 치환된 KRAS G12C 돌연변이, 및
(4) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아르기닌으로 치환된 KRAS G12R 돌연변이로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 암은 KRAS 돌연변이를 가진 암으로, 유방암, 폐암, 위암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 신장암, 췌장암, 간암, 대장암, 피부암, 두경부암 및 갑상선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 (a) 암 개체에서 KRAS 돌연변이 여부를 확인하는 단계; 및
(b) (1) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 발린으로 치환된 KRAS G12V 돌연변이,
(2) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아스파르트산으로 치환된 KRAS G12D 돌연변이,
(3) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 시스테인으로 치환된 KRAS G12C 돌연변이, 또는
(4) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아르기닌으로 치환된 KRAS G12R 돌연변이인 경우, 상기 KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물 투여가 적합한 것으로 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 암 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 KRAS 돌연변이 단백질 저해제는 특정 KRAS 돌연변이의 GDP/GTP 결합 부위가 아닌 입체성 다른 자리(allosteric pocket)에 높은 수준으로 안정된 결합을 할 수 있으며, KRAS 돌연변이를 발현하는 암 세포를 사멸 시키거나, 성장을 억제하는 것을 확인하였으므로, KRAS 돌연변이 단백질 특이적 항암제로서 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 KRAS의 야생형(wild type)과 G12V의 삼차원 구조를 비교 및 분석한 데이터이다.
도 2는 KRAS-G12V 재조합 단백질을 크로마토그래피법으로 정제한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 3a 및 도 3b은 6,600개 화합물에 대하여 1차 스크리닝 후 그 중 136개를 선별한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 4는 GDP 또는 GTP 결합 유무에 따른 21개의 화합물과 KRAS-G12V의 결합을 분석하여 그 중 11개를 선별한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 5는 선별된 11개 화합물 중 4개 화합물의 SPR 실험결과를 나타낸 데이터이다. 그 중 L11 화합물은 0.84 ~ 1.18 μM 수준의 KD 값을, L7 화합물은 3.5 μM 수준의 KD 값을 나타내는 것을 확인하였다.
도 6은 L11 화합물의 유도체 중에서 L11-10 화합물의 SPR 실험결과를 나타낸 데이터이다.
도 7은 KRAS-G12V-GMPPNP 구조를 나타낸 모식도이다.
도 8은 L11 화합물이 KRAS G12V-GDP과 KRAS G12V-GTP 각각의 단백질 중 GDP-결합형태에 더 잘 결합하는 것을 나타낸 데이터이다.
도 9는 화합물의 결합구조를 밝히기 위해 KRAS-G12V의 대체 돌연변이를 이용해 만든 결정으로, G12V/C118S-GDP, G12V/C118S-GppCp(GTP analog), Q61H-GDP 및 Q61H-GMPPNP(GTP anlaog) 단백질의 GDP 혹은 GTP 각각의 결합 형태로부터 만든 결정을 나타낸다.
도 10은 L11 화합물의 유도체의 구조 및 컴퓨터-기반 디자인 결과를 나타낸 모식도이다.
도 11은 KRAS 이중 돌연변이(KRAS double mutant)와 L11 화합물의 결합을 비교한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 12는 KRAS, HARS 및 NRAS 서열을 정렬한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 13은 KRAS-G12V의 GTP 결합형태와 GDP 결합형태의 열 안정성을 비교한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 14는 L11 화합물이 KRAS 돌연변이인 KRAS-G12D 또는 KRAS-G12R에도 결합할 수 있음을 나타낸 데이터이다.
도 15는 L11 화합물, L11-10 화합물 및 L7 화합물의 KRAS 돌연변이 발현 암 세포 저해 효과를 확인한 데이터이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 ‘억제’ 또는 ‘저해’ 란, KRAS 활성과 관련하여 억제성 화합물에 노출 없이 동일한 (돌연변이) KRAS의 활성과 비교하여 하류 신호전달 성분(MEK 또는 Erk 등)의 활성 감소를 의미한다.
본 발명의 ‘예방’이란, 본 발명의 KRAS 돌연변이 저해제로 인해 암이 억제되거나 그 발병이 지연되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 ‘치료’란, 본 발명의 KRAS 돌연변이 저해제로 인해 암과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도가 호전되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
Ras는 종양 형성에 관여하는 종양 유전자로 오래전부터 약물 표적 단백질로 주목을 받아왔으며, HRAS, NRAS, KRAS 세 분류로 나눌수 있다. 기존 KRAS 저해제 개발에 있어 (1) Ras의 직접적인 저해가 신호전달의 상위단계에서 전체적으로 영향을 미침으로써 나타날 수 있는 부작용에 대한 문제, (2) Ras의 여러 동형단백질 및 돌연변이의 존재, (3) GDP/GTP에 대한 강력한 결합력 및 (4) 깊지 않은 활성부위(active site) 등으로 Ras에 대한 직접적인 저해제 발굴에 대한 어려움이 있었으며, 현재 주된 KRAS 돌연변이에 대한 공유결합 방식의 저해제 스크리닝은 non-Cys 돌연변이에는 적용하기 어려운 단점 등이 존재하였다.
이에 본 발명자들은 DSF(differential scanning fluorimetry) 방법을 이용하여 화합물을 선별하고자 하였다. 구체적으로, 약 6,600 여개 화합물 중에서 KRAS-G12V 단백질의 결합에 대한 ΔTm을 측정하여 21개의 화합물을 선별하고, 선별한 21개 화합물의 GDP 또는 GTP 유무에 따른 KRAS-G12V 단백질에 대한 결합을 분석하여 다시 11개의 화합물을 선별하였다 (실시예 1 및 2). 상기 선별한 11개 화합물 중 결합세기가 가장 높은 L11 화합물 및 L7 화합물의 구조를 규명하고, KRAS-G12V 단백질과의 결합 위치 내지 KRAS 특이성을 확인하였다. 추가적으로 L11 화합물의 유도체를 합성하였다 (실시예 7).
본 발명의 KRAS 돌연변이 저해제인 L11 화합물 내지 L11 화합물의 유도체들, 및 L7 화합물은 특정 KRAS 돌연변이의 GDP/GTP 결합 부위가 아닌 입체성 다른 자리(allosteric pocket)에 높은 수준으로 안정된 결합을 할 수 있으므로, KRAS 돌연변이 특이적 항암제로서 효과적으로 제공될 수 있다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]
Figure pat00005
상기 식에서, R은 수소, 직쇄 또는 분쇄형 C1-3 알킬 및 할로젠으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이며, N은 0 내지 5임;
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및
하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 3]
Figure pat00006
;으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 1-1(L11 화합물)로 표시될 수 있다.
[화학식 1-1]
Figure pat00007
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 유도체는 L11-2, L11-3, L11-4, L11-5, L11-6, L11-7, L11-8, L11-9, L11-10, L11-11, L11-12, L11-13, L11-14 또는 L11-15일 수 있으며, 각각 표 2의 스마일즈 코드(smiles code)로 표시될 수 있다. 바람직하게는 L11-10는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00008
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 KRAS 돌연변이 단백질에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 KRAS 돌연변이는 KRAS G12V, KRAS G12D 및 KRAS G12R 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
구체적으로, KRAS 돌연변이는 (1) 서열번호 1(wild type KRAS protein)의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 발린으로 치환된 KRAS G12V 돌연변이,
(2) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아스파르트산으로 치환된 KRAS G12D 돌연변이,
(3) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 시스테인으로 치환된 KRAS G12C 돌연변이, 및
(4) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아르기닌으로 치환된 KRAS G12R 돌연변이로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 KRAS 돌연변이 단백질의 입체성 다른 자리(allosteric site)에 결합할 수 있다.
구체적으로, 상기 입체성 다른 자리는 서열번호 1(wild type KRAS protein)의 아미노산 서열에서 61번째 위치의 글루타민(Q61), 서열번호 1의 아미노산 서열에서 94번째 위치의 히스티딘(H94), 서열번호 1의 아미노산 서열에서 95번째 위치의 히스티딘(H95) 및 서열번호 1의 아미노산 서열에서 96번째 위치의 티로신(Y96)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 다른 일관점에서, 상기 KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 KRAS 돌연변이를 가진 암으로, 유방암, 폐암, 위암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 신장암, 췌장암, 간암, 대장암, 피부암, 두경부암 및 갑상선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 본 발명의 L11, L11-10 및 L7 화합물이 KRAS G12D, G12V 또는 G12C 돌연변이를 발현하는 암 세포를 사멸 시키거나, 성장을 억제하는 것을 확인하였다 (도 15).
본 발명은 또 다른 일관점에서, (a) 암 개체에서 KRAS 돌연변이 여부를 확인하는 단계; 및
(b) (1) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 발린으로 치환된 KRAS G12V 돌연변이,
(2) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아스파르트산으로 치환된 KRAS G12D 돌연변이,
(3) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 시스테인으로 치환된 KRAS G12C 돌연변이, 또는
(4) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아르기닌으로 치환된 KRAS G12R 돌연변이인 경우, 상기 KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물 투여가 적합한 것으로 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 암 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 향료, 유화제, 가용화제, 분산제, 향미제, 항산화제, 포장제, 안료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제; 의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여시 KRAS 돌연변이 저해제를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 KRAS 돌연변이 저해제를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
특정 KRAS 돌연변이 단백질 분석 및 정제
특정 KRAS 돌연변이 단백질의 3차원 구조분석을 통해 돌연변이-특이성을 분석하였다. KRAS 야생형과 KRAS G12V 돌연변이의 삼차원 구조를 비활성화 상태에서 비교하였을 때, GDP가 붙는 활성부위 옆에 형성되는 입체성 다른 자리 결합 부위(allosteric binding site)를 분석하였다 (도 1).
또한, KRAS 특정 돌연변이 및 특정 상태의 단백질을 직접적으로 저해할 수 있는 저해제 후보물질을 선별하기 위해, 특정 돌연변이 (G12V) 및 특정 상태 (GDP-binding state; inactive)의 KRAS 단백질을 제조하였다.
먼저, KRAS 야생형 재조합 단백질(서열번호 2), KRAS-G12V 재조합 단백질(서열번호 3), KRAS-G12D 재조합 단백질(서열번호 4), KRAS-G12R 재조합 단백질(서열번호 5), KRAS-Q61H 재조합 단백질(서열번호 6)을 수득하기 위해, 당업계에 공지된 방법으로 각각의 재조합 벡터를 제조한 다음, 대장균에 형질전환 시켰다. 형질전환된 대장균에서 각각의 재조합 단백질을 대량발현 시킨 후, 고압분산장비와 원심분리기를 이용하여 세포막을 깨고 가용화된 단백질을 얻은 후 친화성 크로마토그래피를 이용하여 95% 이상 순도의 단백질을 수득하였다. 이후 기존에 붙어있는 GDP/GTP의 제거와 원하는 형태의 GDP 혹은 GTP 처리 단계를 거쳐, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 GDP-결합 단백질 혹은 GTP(혹은 그의 유도체)-결합된 재조합 단백질을 분리 및 생산하였다 (도 2).
화합물 라이브러리 확보 및 스크리닝
화합물은행 라이브러리(Korea chemical bank library)로부터 약 6,600여개의 화합물을 확보하였다. 그 중, DSF(differential scanning fluorimetry) 방법을 이용하여 KRAS 돌연변이(G12V, G12R 및 G12D) 단백질에 대해 결합능 세기를 바탕으로한 실험법을 통해 저해제 후보물질, 특히 GDP가 붙은 비활성(inactive) 상태를 안정화시킬 수 있는 입체성 다른 자리 저해제/결합제(allosteric inhibitor/binder)를 선별하고자 하였다.
구체적으로, G12V 단백질에 결합력을 갖는 저해제가 나타내는 열 변화(thermal shift; ΔTm 값)를 측정하여 ΔTm 값이 3 이상인 136개의 화합물을 1차적으로 선별한 후(도 3a, 도 3b), 136개 중 화합물은행으로부터 제공된 시약의 재고량에 따라 추가 검증 가능한 98개 화합물 재선별하였다. 상기 98개 화합물의 농도별로 DSF 재측정 후 높은 ΔTm을 기준으로 21개의 화합물을 추가적으로 선별하였다.
선별한 21개의 화합물에 대하여, GDP-결합상태(KRAS G12V-GDP)와 GTP-결합상태(KRAS G12V-GTP)의 KRAS G12V 단백질과 발현 시 내제된 GDP 또는 GTP 상태의 단백질(KRAS G12V-endogenous)과의 결합력(총 세 가지)을 각각 측정하였다.
이는 GDP 또는 GTP 유무에 따라 각 화합물들이 결합 여부를 판단하여, GDP/GTP-결합 부위와 같은 자리를 경쟁하는 화합물인지 혹은 입체성 다른 자리(allosteric site) 혹은 미확인 자리(unidentified site)에 결합하는 화합물인지 여부를 판별하고자 함이다.
선별된 21개 화합물의 ΔTm 값
선별된 21개 화합물 Endogenous form
ΔTm (℃)		 50 μM GDP 처리
ΔTm (℃)		 50 μM GTP 처리
ΔTm (℃)		 재선별된 11개 화합물
No. 1차 2차 평균 1차 2차 평균 1차 2차 평균
18 5.18 6.16 5.67 9.10 6.60 7.85 4.27 4.49 4.38 L8
21 12.64 14.30 13.47 7.21 7.24 7.22 5.85 6.20 6.03 L11
7 16.41 44.87 30.64 10.18 10.52 10.35 10.23 38.05 24.14
2 5.13 4.38 4.76 -4.15 -3.48 -3.82 -5.00 -4.92 -4.96 L2
8 2.94 3.38 3.16 -4.66 -5.21 -4.93 -7.02 -5.60 -6.31
11 5.10 5.40 5.25 -2.43 -1.89 -2.16 -6.45 -4.45 -5.45 L6
15 -7.76 -7.27 -7.52 1.05 -5.52 -2.24 -4.23 -4.28 -4.25
20 5.86 5.01 5.44 5.75 5.57 5.66 6.58 6.29 6.44 L10
12 4.02 4.18 4.10 4.02 4.15 4.08 4.93 4.91 4.92 L7
1 4.62 3.25 3.93 2.69 2.83 2.76 3.84 3.56 3.70 L1
6 -0.08 4.12 2.02 -4.44 -1.12 -2.78 -6.43 -7.48 -6.96
14 -0.35 -0.56 -0.45 0.14 0.09 0.11 -0.40 -0.28 -0.34
16 1.54 4.49 3.01 -2.30 -2.01 -2.16 -4.49 -3.35 -3.92
4 -3.25 -2.12 -2.68 -0.53 -0.49 -0.51 -0.51 -0.81 -0.66
3 -0.17 -0.84 -0.50 -0.02 -0.08 -0.05 -0.24 -0.60 -0.42
17 37.55 -2.77 17.39 -0.83 -1.02 -0.93 -1.26 -1.92 -1.59
5 3.49 2.64 3.06 3.45 3.59 3.52 4.49 4.05 4.27 L3
19 3.27 6.87 5.07 -3.68 1.67 -1.01 -2.15 -3.60 -2.87 L9
13 2.55 4.17 3.36 0.12 0.57 0.34 0.36 0.63 0.49
9 3.22 3.25 3.23 3.02 2.91 2.97 4.45 4.36 4.40 L4
10 2.89 3.13 3.01 2.16 2.45 2.30 3.23 3.42 3.32 L5
다중 곡선(Multiple curve)를 그리는 화합물과 전체적으로 낮은 결합능을 보이는 화합물, 그리고 GDP/GTP 존재에 의존적으로 결합하지 않는 화합물을 제외하고, 화합물연구원으로부터 받은 화합물정보로부터 각 화합물의 스케폴드(scaffold)를 확인/분류하여 일부 아주 높은 ΔTm을 보이는 경우 포함한 총 11종의 화합물을 선별하였다 (도 4, 표 1).
선별한 화합물의 결합세기 측정
상기 <실시예 2>에서 선별한 11종 화합물에 대하여 결합세기(binding affinity, KD)를 측정하고자 KRAS G12V-endogenous 단백질에 대하여 SPR(surface plasmon resonance) 실험을 수행하였다.
11종의 화합물 중, 고농도에서 낮은 용해도로 인해 석출되는 5가지 화합물 및 반응성이 낮은 화합물을 제외한 4가지 화합물에 대해 μM 수준의 KD 값을 얻을 수 있었다 (도 5). 그 중, L11 화합물은 1.18 μM 수준의 KD 값(BEI: 13.5)을, L7 화합물은 3.5 μM 수준의 KD 값을 나타내어, 두 화합물 모두 매우 좋은 초기 화합물(initial hit)이 될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 선별한 L11 화합물은 하기 화학식 1, 바람직하게는 하기 화학식 1-1로 표시될 수 있으며, L7 화합물은 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00009
(상기 식에서, R은 수소, 직쇄 또는 분쇄형 C1-3 알킬 및 할로젠으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이며, N은 0 내지 5임)
[화학식 1-1]
Figure pat00010
[화학식 3]
Figure pat00011
L11 화합물의 유도체 디자인 및 합성, 결합력 측정
최종 선별된 L11 화합물의 최적화 방안을 수립하고자, 저해제-단백질이 결합된 삼차원 구조모델을 기반으로 구조/컴퓨터 기반 화학 유도체(structure/computer-based chemical derivative) 디자인을 진행하였다.
L11 화합물과 유사성이 있는 유도체와 다른 스케폴드 코어(scaffold core)를 갖는 유도체 화합물을 계획하여 14가지의 L11 유도체와 L11을 포함한 총 15가지의 화합물(L11, L11-2, L11-3, L11-4, L11-5, L11-6, L11-7, L11-8, L11-9, L11-10, L11-11, L11-12, L11-13, L11-14, L11-15)을 합성하였다. 상기 15종 화합물의 스마일즈(SMILES; Simplified Molecular Input Line Entry System) 코드는 하기 [표 2]에 나타내었다.
L11 유도체 화학식
Chem ID smiles code
L11 N1(CC2=CC=C(C=C2Cl)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2C=CC(=CC=2)C#N)O1
L11-2 N1(CC2=CC=CC=C2Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2=CC=C(C=C2)C#N)O1
L11-3 N1(CC2C=CC(=CC=2)C)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2C=CC(=CC=2)Cl)O1
L11-4 N1(CC2C=CC(=CC=2)C)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2C=CC(=CC=2)C#N)O1
L11-5 N1(CC2=CC=C(C=C2)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2=CC=CC(Cl)=C2)O1
L11-6 N1(CC2C=CC(=CC=2)C)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2C=CC=C(Cl)C=2)O1
L11-7 N1(CC2=CC=C(C=C2)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2C=CC(=CC=2)Br)O1
L11-8 N1(CC2=CC=C(C(Cl)=C2)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2=CC=C(C=C2)C#N)O1
L11-9 N1(CC2C=CC(=CC=2)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2=CC=CC=C2)O1
L11-10 N1(CC2C=CC(=CC=2)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2=CC=C(C=C2)C(O)=O)O1
L11-11 C1(C(=O)NC2=CC=NN2CC2=CC=CS2)C=C(ON=1)C1C=CC(=CC=1)OCC
L11-12 C12C(=O)N(C3=CC=CC=C3OC)C=CN1C(N(CC1C=CC(=CC=1Cl)F)N=2)=O
L11-13 COC1=CC2=C(C(=CO2)CC(NC2=CN(CC3=C(Cl)C=CC=C3)C(=O)C=C2)=O)C=C1
L11-14 FC1=CC=C(C2OC(CNC(C(N3N=NN=C3)CC3=CC=CC=C3)=O)=CC=2)C=C1
L11-15 O=C1C2=C(C3=C(O2)C=CC=C3)N=C(CSC2=CC=C(C#N)C=C2)N1
L11 유도체의 DSF 및 SPR 분석 결과
Chemicals DSF 1차 (2회) (℃) DSF 2차 (2회) (℃) 평균
(A+B)		 SPR
TmD dTmD 1차평균(A) TmD dTmD 2차평균(B) K D (μM)
Negative(none) 51.98 -0.37 51.82 -0.15
51.98 -0.37 51.37 -0.59
Negative(DMSO) 52.27 -0.07 51.97 0.00
52.42 0.07 51.97 0.00
L11 62.34 9.99 9.99 63.06 11.10 10.95 10.47 0.83-1.59
62.34 9.99 62.77 10.80
L11-2 48.43 -3.92 -14.06 26.81 -25.15 -24.86 -19.46
28.15 -24.20 27.41 -24.56
L11-3 52.42 0.07 -0.15 50.78 -1.18 -0.67 -0.41 570
51.98 -0.37 51.82 -0.15
L11-4 51.24 -1.11 -1.11 51.37 -0.59 -0.52 -0.81
51.24 -1.11 51.52 -0.44
L11-5 50.65 -1.70 -3.77 49.75 -2.22 -2.22 -3.00
46.50 -5.85 49.75 -2.22
L11-6 52.27 -0.07 -0.59 51.97 0.00 0.07 -0.26
51.24 -1.11 52.11 0.15
L11-7 52.13 -0.22 0.00 51.97 0.00 0.07 0.04
52.57 0.22 52.11 0.15
L11-8 45.91 -6.44 -6.66 47.38 -4.59 -15.02 -10.84 105.7
45.46 -6.88 26.52 -25.45
L11-9 52.13 -0.22 -0.07 51.23 -0.74 -0.67 -0.37
52.42 0.07 51.37 -0.59
L11-10 55.09 2.74 4.22 62.47 10.50 10.87 7.55 0.66-1.87
58.05 5.70 63.21 11.24
L11-11 48.57 -3.77 -2.74 45.60 -6.36 -6.14 -4.44
50.65 -1.70 46.05 -5.92
L11-12 28.00 -24.35 -24.20 44.86 -7.10 -9.32 -16.76
28.30 -24.05 40.43 -11.54
L11-13 52.13 -0.22 0.00 47.08 -4.88 5.33 -2.66
52.57 0.22 46.20 -5.77
L11-14 33.48 -18.87 -17.17 -17.17 -17.17
36.88 -15.47
L11-15 26.96 -25.38 -24.64 51.67 -0.30 -0.37 -12.51
28.44 -23.90 51.52 -0.44
DSF와 결합력(binding affinity) 측정 실험으로 L11 화합물 유도체들의 결합능을 L11 화합물과 비교 진행한 결과, 최종 3개의 유효화합물(hit; L11-3, L11-8, L11-10)을 추가로 찾아냈다. 총 4개 hit에 대해 SPR로 결합력을 확인한 결과 0.7 ~ 570 μM의 결합력을 갖는 것으로 나타났다 (표 3).
또한, L11-10 화합물은 하기 화학식 2로 표시될 수 있으며, 도 6에 나타난 바와 같이, ka는 77.7(7), kd는 0.001037(6), KD는 13.4(1)μM로 확인되었다.
[화학식 2]
Figure pat00012
L11 화합물과 KRAS와의 구조규명을 위한 KRAS-돌연변이 결정화
상기 <실시예 3>의 3개 화합물 중 가장 결합능이 좋은 L11 화합물과 KRAS G12V의 GDP-결합 형태의 단백질을 적절하게 인큐베이션 하여, 농도별 또는 온도별로 총 2,400여 조건에 대한 결정화 스크리닝을 진행하였다. 복합체 결정이 관찰되지 않을 경우를 대비하여, KRAS G12V만의 결정을 확보하고자 1,200여 조건에 대해 결정화 스크리닝을 진행하였다.
KRAS-G12V-GTP의 결정을 키워 X-선 회절 데이터를 수집하고 구조를 규명하였다 (도 7). 구조 분석을 통해 용제함량(solvent content)이 너무 낮아 리간드 침지(ligand soaking)에 적합하지 않은 결정형태임을 확인하였다. 규명된 구조 분석을 통해 KRAS-G12V의 GDP-결합형태가 리간드 결합에 더 적합할 것을 제안하였다.
상기 분석을 바탕으로, KRAS G12V-GDP과 KRAS G12V-GTP 각각의 단백질 형태를 정제 단계에서 만들어 SPR 실험을 통해 L11 화합물이 GDP-결합형태에 더 잘 결합하는 것을 확인하였다 (도 8). 또한, 용제함량(solvent content)이 어느 정도 확보되는 결정형태를 얻기 위해 다른 돌연변이 형태(mutant form)의 결정을 스크리닝하여 확보하였다 (도 9).
L11 화합물과 KRAS G12V(GDP)과의 in silico 도킹 및 결합에너지 계산
L11 화합물에 대한 결합모드를 예측하기 위하여, KRAS G12V의 GDP-결합 부위가 아닌 입체성 다른 자리 부위(allosteric pocket)에 대하여 정밀모드의 리간드 도킹(ligand docking, Glide-XP)를 수행하여 결합 모드를 분석하였다(도 10).
도킹된 단백질과 리간드 사이의 결합에너지(ΔG, Binding energy)를 계산하여(mmGBSA 이용) 상당히 높은 수준(-37.0 kcal/mol)의 안정된 결합을 하고 있음을 확인하였다.
L11 화합물의 결합 위치 검증
상기 <실시예 5>의 in silico 도킹을 통해 KRAS-G12V-GDP에 결합하는데 중요한 잔기들을 확인하고, 이들을 각각 돌연변이시켜 G12V를 포함하는 이중 돌연변이(double mutants)인 KRAS-G12V-Q61A(서열번호 7), KRAS-G12V-E91A(서열번호 8), KRAS-G12V-H94A(서열번호 9), KRAS-G12V-H94A(서열번호 10), KRAS-G12V-Y96A(서열번호 11)을 각각 제작하였다.
각각에 대해 biphasic melting pattern의 ligand-bound fraction 분석을 통해 주요 예상 잔기를 예측하여 결합 효과를 측정 비교한 결과, KRAS-G12V-GDP와 L11 화합물과의 모델링 구조에서 예측된 결합 잔기 중 Q61, H94, H95, Y96 잔기가 L11의 결합에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다 (도 11).
이 잔기들이 GDP/GTP 결합 부위가 아닌 입체성 다른 자리(allosteric pocket)에 있음에 따라, L11 화합물이 입체성 다른 자리에 결합될 수 있는 것을 확인하였다.
L11 화합물 결합의 KRAS 특이성
L11 화합물이 RAS 패밀리 단백질(family protein)에 전체적으로 결합할 수 있는지 ΔTm 값을 비교한 결과, 다른 RAS-폴드 단백질(fold protein)인 RAB1과 KRAS와 유사성이 높은 HRAS에는 결합하지 않음을 확인하였다 (표 4).
RAS 패밀리 단백질에 대한 L11 화합물 결합력 확인
DSF (℃)
Tm ΔTm 평균
KRAS Negative(none) 52.54
52.54
Negative(DMSO) 52.69
52.84
L11 69.70 16.93 17.23
70.29 17.52
HRAS Negative(none) 51.95
52.69
Negative(DMSO) 53.43
53.28
L11 50.18 -3.18 -3.11
50.33 -3.03
Rab1_WT Negative(none) 49.74
49.74
Negative(DMSO) 50.63
50.78
50.78
L11 47.97 -2.76 -2.91
48.12 -2.61
47.38 -3.35
이러한 결과는 L11의 결합에 중요한 잔기인 H95의 서열이 KRAS(4B)(서열번호 12)와 HRAS(서열번호 13)와 다르며 (도 12), 더 나아가 NRAS(서열번호 14)와 RAB 패밀리에도 결합에 중요한 잔기가 다른 성질의 잔기로 서열이 다른 것에 기인하는 것으로 여겨지며, 이는 L11 화합물과 KRAS의 결합이 KRAS-특이적인 방식으로 이루어져 향후 KRAS-특이적 결합물질/저해물질로의 개발이 가능할 것으로 여겨졌다.
KRAS-G12V의 경우 GTP-결합 형태보다 GDP-결합 형태가 더 안정한 형태를 취하고 있음을 확인할 수 있었으며(도 13), L11 화합물이 또 다른 G12의 non-Cys 돌연변이인 G12D 및 G12R에도 결합할 수 있음을 SPR 측정 결과 확인할 수 있었다 (도 14).
L11, L11-10 및 L7 화합물의 KRAS 돌연변이에 대한 친화력 확인
본 발명에서는 L11, L11-10 및 L7 화합물의 KRAS 돌연변이의 GTP-결합형태 또는 GDP-결합형태에 대한 친화력을 확인하고자 하였다.
먼저, G12V-GTP(G12V-on), G12V-GDP(G12V-off), G12D-GTP(G12D-on), 및 G12D-GDP(G12D-off) 각각의 단백질 형태를 상기 실시예 1의 정제단계에서 수득한 다음, SPR 실험을 통해 GTP-결합형태 또는 GDP-결합형태에 대한 친화력을 확인하였다. 상기에서 'on'은 GTP 결합형태, 'off'는 GDP 결합형태를 의미한다.
L11, L11-10 및 L7 화합물의 KRAS 돌연변이에 대한 친화력
Ligand Analyte Conc. ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
G12V-off L11 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 uM 2.97(6)e3
~ 5.6(2)e2		 0.00247(2)
~ 0.003255(8)		 830(20) nM
~ 5.9(3) uM
L11-10 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 uM 323(3) 6.04(4)e-4 1.87(2) uM
L7 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 uM 535(4) 6.38(5)e-4 1.19(1) uM
G12V-on L11 0.1563, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 uM 1.63(3)e3
~ 1.70(5)e3		 0.00260(1)
~ 0.00576(2)		 1.59(3) uM
~ 3.39(9) uM
L11-10 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 uM 535(3) 3.46(3)e -4 646(4) nM
L7 1.25, 2.5, 5, 10, 20 uM 422(9) 0.001277(5) 3.02(7) uM
G12D-off L11 0.1563, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 uM 1.77(1)e3 0.002054(7) 1.161(8) uM
L11-10 1.25, 2.5, 5, 10, 20 uM 946(8) 0.00132(1) 1.40(1) uM
L7 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 uM 428(4) 2.77(3)e-4 648(6) nM
G12D-on L11 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 uM 1.26(4)e3 0.00570(8) 4.5(1) uM
L11-10 0.3125,0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 uM 505(2) 1.22(2)e-4 241(1) nM
L7 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 uM 1.61(1)e3 4.67(5)e-4 290(2) nM
그 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이, L11 화합물은 G12V-GDP, G12D-GDP에 대해, L11-10 화합물은 G12V-GTP, G12D-GTP에 대해, L7 화합물은 G12V-GDP, G12D-GTP에 대해 친화력이 높은 것으로 확인되었다.
L11, L11-10 및 L7 화합물의 KRAS 돌연변이 발현 암 세포 저해 효과 확인
본 발명의 L11, L11-10 및 L7 화합물이 KRAS 돌연변이를 발현하는 암 세포를 저해하는지 확인하였다.
먼저, Pan1(Pancrease; KRASG12D) 세포는 1x103 개/웰이 되도록, MiaPaca2(Pancrease; KRASG12C) 세포는 1.5x103 개/웰 96-웰 플레이트에 각각 접종한 다음, L11, L11-10 및 L7 화합물이 0, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 μM 농도가 되도록 각각 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
암 세포 생존율은 Hochest 33342으로 5 μg/mL 로 30분간 세포를 염색한 다음, Cytation 3 instrument(BioTek) 기계로 전체 세포 이미지를 확보하고 Gen5 data analysis software (version 2.09.1)로 측정하였다.
NCI-H2444(non-samll cell lung cancer; KRASG12V) 세포 및 SHP77(samll cell lung cancer; KRASG12V) 세포의 경우 세포가 10,000 개/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 접종한 다음, L11, L11-10 및 L7 화합물이 0, 3.13, 12.5, 200 μM 농도가 되도록 각각 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 72 시간 동안 배양하였다. 암 세포 생존율은 MTT 방법을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 본 발명의 L11, L11-10 및 L7 화합물은 KRAS G12D, G12V 또는 G12C 돌연변이를 발현하는 암 세포를 사멸 시키거나, 성장을 억제하는 것을 확인하였다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00013

    (상기 식에서, R은 수소, 직쇄 또는 분쇄형 C1-3 알킬 및 할로젠으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이며, N은 0 내지 5임);
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및
    하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 3]
    Figure pat00014
    ;으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는, KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 1-1 표시되는 것을 특징으로 하는, KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물:
    [화학식 1-1]
    Figure pat00015
    .
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 유도체는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물:
    [화학식 2]
    Figure pat00016
    .
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 유도체는,
    N1(CC2=CC=C(C=C2Cl)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2C=CC(=CC=2)C#N)O1;
    N1(CC2=CC=CC=C2Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2=CC=C(C=C2)C#N)O1;
    N1(CC2C=CC(=CC=2)C)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2C=CC(=CC=2)Cl)O1;
    N1(CC2C=CC(=CC=2)C)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2C=CC(=CC=2)C#N)O1;
    N1(CC2=CC=C(C=C2)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2=CC=CC(Cl)=C2)O1;
    N1(CC2C=CC(=CC=2)C)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2C=CC=C(Cl)C=2)O1;
    N1(CC2=CC=C(C=C2)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2C=CC(=CC=2)Br)O1;
    N1(CC2=CC=C(C(Cl)=C2)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2=CC=C(C=C2)C#N)O1;
    N1(CC2C=CC(=CC=2)Cl)C(=O)C(NC1=O)=CC1=CC=C(C2=CC=CC=C2)O1;
    C1(C(=O)NC2=CC=NN2CC2=CC=CS2)C=C(ON=1)C1C=CC(=CC=1)OCC;
    C12C(=O)N(C3=CC=CC=C3OC)C=CN1C(N(CC1C=CC(=CC=1Cl)F)N=2)=O;
    COC1=CC2=C(C(=CO2)CC(NC2=CN(CC3=C(Cl)C=CC=C3)C(=O)C=C2)=O)C=C1;
    FC1=CC=C(C2OC(CNC(C(N3N=NN=C3)CC3=CC=CC=C3)=O)=CC=2)C=C1; 및
    O=C1C2=C(C3=C(O2)C=CC=C3)N=C(CSC2=CC=C(C#N)C=C2)N1으로 구성된 스마일즈 코드(smiles code)군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 KRAS 돌연변이 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, KRAS 돌연변이는,
    (1) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 발린으로 치환된 KRAS G12V 돌연변이;
    (2) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아스파르트산으로 치환된 KRAS G12D 돌연변이;
    (3) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 시스테인으로 치환된 KRAS G12C 돌연변이; 및
    (4) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아르기닌으로 치환된 KRAS G12R 돌연변이;로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 KRAS 돌연변이 단백질의 입체성 다른 자리(allosteric site)에 결합하는 것을 특징으로 하는, KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 입체성 다른 자리는,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 61번째 위치의 글루타민(Q61);
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 94번째 위치의 히스티딘(H94);
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 95번째 위치의 히스티딘(H95); 및
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 96번째 위치의 티로신(Y96);으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 KRAS 돌연변이를 가진 암으로,
    유방암, 폐암, 위암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 신장암, 췌장암, 간암, 대장암, 피부암, 두경부암 및 갑상선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. (a) 암 개체에서 KRAS 돌연변이 여부를 확인하는 단계; 및
    (b) 상기 KRAS 돌연변이가, (1) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 발린으로 치환된 KRAS G12V 돌연변이,
    (2) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아스파르트산으로 치환된 KRAS G12D 돌연변이,
    (3) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 시스테인으로 치환된 KRAS G12C 돌연변이, 또는
    (4) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 위치의 아미노산 잔기 글리신이 아르기닌으로 치환된 KRAS G12R 돌연변이인 경우,
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 KRAS 돌연변이 단백질 저해용 조성물이 상기 암 개체 투여에 적합한 것으로 정보를 제공하는 단계;를 포함하는, 암 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법.
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