ES2905360T3 - Composiciones y métodos para detectar, tratar y prevenir enfermedades y trastornos - Google Patents

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Abstract

Una composición para uso en tratar una enfermedad o trastorno renal en un sujeto, comprendiendo el uso administrar al sujeto la composición, en donde la composición comprende al menos un agente, en donde el al menos un agente es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un fragmento de polipéptido renalasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y un fragmento de polipéptido renalasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para detectar, tratar y prevenir enfermedades y trastornos
Antecedentes de la invención
La lesión renal aguda (AKI) isquémica es una complicación clínica devastadora que produce muerte tubular renal e inflamación sistémica. Los pacientes con disfunción renal tienen niveles elevados en plasma de catecolaminas. Además de producir hipertensión, las catecolaminas producen una respuesta inflamatoria en septicemia y disfunción multiorgánica.
La renalasa es una amina oxidasa dependiente de dinucleótido de flavina y adenina (FAD) de 38 kDa sintetizada y secretada por los túbulos proximales renales (Xu et al., 2005, J Clin Invest 115: 1275-1280). La renalasa degrada catecolaminas circulantes y regula la presión sanguínea sistémica en roedores y seres humanos (Desir, 2012, Pediatr Nephrol 27: 719-725). Las catecolaminas en plasma y la presión sanguínea sistémica están elevadas en pacientes con disfunción renal crónica o insuficiencia renal terminal (Schlaich, 2009, J Am Soc Nephrol 20: 933-939). Estudios recientes sugieren que la deficiencia en renalasa en pacientes con insuficiencia renal crónica produce niveles en plasma de catecolaminas y presión sanguínea sistémica elevados (Desir, 2012, Pediatr Nephrol 27: 719-725; Desir, 2009, Kidney Int 76: 366-370; Desir, 2011, Curr Opin Nephrol Hypertens 20: 31-36; Li et al., 2008, Circulation 117: 1277-1282).
Además de regular la presión sanguínea, la renalasa puede proteger contra lesión tisular inflamatoria metabolizando catecolaminas. Las catecolaminas a través de la activación de receptores alfa adrenérgicos de leucocitos directamente producen inflamación en septicemia y disfunción multiorgánica (Grisanti et al., 2011, J Pharmacol Exp Ther 338: 648­ 657; Miksa et al., 2009, PLoS One 4: e5504). En efecto, los pacientes con insuficiencia renal crónica muestran marcadores de inflamación aumentados que contribuyen directamente a morbilidad y mortalidad aumentada (Kaysen y Eiserich, 2003, Semin Dial 16: 438-446). En ratones, la deficiencia en renalasa produjo lesión IR cardiaca exacerbada y la administración de renalasa exógena redujo la necrosis miocárdica (Wu et al., 2011, Kidney Int 79: 853-860).
La lesión renal aguda isquémica es un problema principal para pacientes sometidos a procedimientos quirúrgicos principales que implican el riñón, el hígado, el corazón o la aorta (Chertow et al., 2005, J Am Soc Nephrol 16: 3365­ 3370). La lesión de isquemia reperfusión (IR) renal es una causa frecuente de AKI clínica superando la incidencia de AKI el 50% después de cirugía cardiaca, hepatobiliar o aortica principal (Bove et al., 2004, J Cardiothorac Vasc Anesth 18: 442-445; Elapavaluru y Kellum, 2007, Acta Clin Belg Suppl 326-331). Además, la AKI isquémica con frecuencia está complicada por disfunción multiorgánica, inflamación sistémica, septicemia y muerte (Jones y Lee, 2008, Best Pract Res Clin Anaesthesiol 22: 193-208). Desafortunadamente, no hay terapias demostradas para prevenir o tratar AKI en el marco perioperativo (Jo et al., 2007, Clin J Am Soc Nephrol 2: 356-365). El documento US 2010/136651 A1 se refiere a la identificación y aislamiento de una nueva forma secretada de una monoamina oxidasa, designada por el nombre "MAO-C" o "renalasa". El documento WO 2007/059357 divulga métodos de usar renalasa como una proteína terapéutica en sus formas activa e inactiva. Xu J, et al 2005, J Clin Invest. 2005 115(5):1275-80 describen la identificación de una novedosa amina oxidasa dependiente de dinucleótido de flavina y adenina (renalasa) que se secreta en la sangre por el riñón y metaboliza catecolaminas in vitro.
Por tanto, hay una necesidad en la técnica para composiciones y métodos para el tratamiento y prevención de lesión renal, tal como AKI. La presente invención aborda esta necesidad no cumplida en la técnica.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a una composición para uso en tratar una enfermedad o trastorno renal en un sujeto, el uso comprende administrar al sujeto la composición, en donde la composición comprende al menos un agente, en donde el al menos un agente es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un fragmento de polipéptido renalasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y un fragmento de polipéptido renalasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
La presente invención también se refiere a una composición para uso en tratar una enfermedad o trastorno renal en un sujeto según la invención, en donde la enfermedad o trastorno renal es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en lesión isquémica renal, lesión de reperfusión renal, lesión isquémica-reperfusión renal, lesión renal tóxica, necrosis tubular renal, inflamación tubular renal, apoptosis tubular renal y en caso de una renalasa que consiste en SEQ ID NO: 3 también hipertensión.
La invención se refiere a una composición que comprende un fragmento de polipéptido renalasa seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
Breve descripción de los dibujos
La siguiente descripción detallada de formas de realización preferidas de la invención se entenderá mejor cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. Para el fin de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos formas de realización que son actualmente preferidas. Se debe entender, sin embargo, que la invención no está limitada a las organizaciones e instrumentalidades precisas de las formas de realización mostradas en los dibujos.
La figura 1, que comprende las figuras 1A y 1B, es un conjunto de imágenes que muestran que la renalasa colocaliza con los túbulos proximales. Secciones de riñón de cerdo se cotiñeron con un anticuerpo contra renalasa y o bien con un anticuerpo contra megalina (un marcador de túbulo proximal - figura 1A) o con una E-cadherina (un marcador de túbulo distal - figura 1B). Se observó que la renalasa se expresa exclusivamente en túbulos proximales. Representativo de 3 experimentos. Las imágenes se amplificaron 100X para la cotinción con megalina y 40X para la cotinción con E-cadherina.
La figura 2 es un gráfico que muestra los niveles de norepinefrina en plasma en ratones. Los niveles de norepinefrina en plasma se midieron en ratones sometidos a operación de referencia o a lesión de isquemia/reperfusión (IR) renal (N = 3-5 por grupo). La concentración de norepinefrina en plasma aumento significativamente 24 h después de IR renal en ratones de tipo salvaje (WT) para renalasa y este aumento era incluso mayor en ratones deficientes en renalasa (KO). *P<0,05 frente a grupo de referencia. #P<0, 05 frente a grupo WT IR.
La figura 3, que comprende las figuras 3A y 3B, es un conjunto de imágenes y gráficos que muestran los niveles de renalasa en plasma y riñón en ratones. Figura 3A: inmunotransferencia representativa (arriba) y cuantificaciones de la intensidad de la banda (abajo) para proteína renalasa en plasma en ratones con operación de referencia y ratones sometidos a 30 min de isquemia renal y 5 hr o 24 hr de reperfusión (N = 4-5 por grupo). Nótese las reducciones significativas en la renalasa en plasma después de IR renal. Figura 3B: Imágenes representativas (arriba) y cuantificaciones de la intensidad de la banda normalizada a GAPDH (abajo) para ARNm de renalasa en riñón de ratones WT de renalasa o ratones KO de renalasa. Los ratones se sometieron a operación de referencia o a 30 min de isquemia renal y 24 hr de reperfusión (N = 4 por grupo). El ARNm de GAPDH sirvió como controles de carga internos. Consistente con los descensos significativos en renalasa en plasma, la expresión del ARNm de renalasa de riñón estaba significativamente atenuada 24 hr después de la IR renal. Los datos se presentan como media ± EEM. *P<0,05 frente a grupo de referencia.
La figura 4, que comprende las figuras 4A a 4D, es un conjunto de gráficos que demuestran que la renalasa modula AKI isquémica en ratones. Niveles de creatinina en plasma de ratones sometidos a cirugía de referencia o a isquemia y reperfusión (IR) renal. Figura 4A: Se sometieron ratones de tipo salvaje para renalasa (WT) o deficientes en renalasa (KO) a 20 min (isquemia moderada) o 30 min (isquemia grave) de isquemia renal y 24 hr de reperfusión (N = 4-6 por grupo). La deficiencia en renalasa exacerbó la lesión IR renal en ratones. Figura 4B: Ratones WT de renalasa se sometieron a cirugía de referencia o a 30 min de IR renal. Para ratones sometidos a IR renal, se inyectó renalasa recombinante humana o vehículo (solución salina) 10 min antes de la isquemia renal. La renalasa recombinante humana produjo protección renal significativa en ratones WT de renalasa (N = 4-6 por grupo). Figura 4C: La renalasa recombinante humana pre o pos-isquémica rescata la función renal después de IR en ratones (N = 4-6 por grupo). Recombinante humana dada 30 min después de completar la isquemia renal protegía contra lesión IR. Figura 4D: Fentolamina (5 mg/kg, un antagonista selectivo del receptor alfa-adrenérgico) protegía tanto ratones de tipo salvaje (WT) para renalasa como deficientes en renalasa (KO) sometidos a 30 min de isquemia renal y 24 hr de reperfusión (N = 4). *P<0,05 frente a ratones tratados con vehículo sometidos a cirugía de referencia. #P<0,05 frente a ratones WT tratados con vehículo sometidos a IR renal. Las barras de error representan 1 EEM.
La figura 5, que comprende las figuras 5A y 5B, es un conjunto de imágenes y un gráfico que demuestran que la renalasa modula la necrosis tubular renal después de IR. Figura 5A: Fotomicrografías representativas para tinción de hematoxilina y eosina (aumento 200X) de secciones de riñón de ratones de tipo salvaje (WT) para renalasa o deficientes (KO) en renalasa sometidos a 20 min o 30 min de isquemia renal y 24 hr de reperfusión. Algunos ratones WT de renalasa se pretrataron con renalasa recombinante humana 1,5 mg/kg 10 min antes de la isquemia renal. Las fotografías son representativas de 3-5 experimentos independientes. Figura 5B: Resumen de puntuaciones de lesión renal de la escala de Jablonski (N = 4, graduado de tinción de hematoxilina y eosina, escala 0-4) para ratones sometidos a IR renal. Se ha mostrado que ratones KO de renalasa tenían peor necrosis tubular renal después de IR y la renalasa recombinante proporcionó protección tubular renal significativa contra la necrosis en ratones WT de renalasa. *P<0,05 frente a ratones WT sometidos a 20 min de IR renal. #P<0,05 frente a ratones WT tratados con vehículo sometidos a 30 min de IR renal. Las barras de error representan 1 EEM.
La figura 6, que comprende las figuras 6A y 6B, es una imagen y un gráfico que muestran que la renalasa humana recombinante exógena reduce la apoptosis tubular renal en ratones después de IR. Figura 6A: Fotomicrografías representativas para tinción TUNEL (representa núcleos apoptóticos, aumento 100X) de secciones de riñón de ratones sometidos a operación de referencia o a 30 min de isquemia renal y 24 hr de reperfusión. Los ratones se pretrataron con vehículo salino o con renalasa recombinante humana 1,5 mg/kg 10 min antes de la isquemia renal. Las fotografías son representativas de 4 experimentos independientes. Figura 6B: Cuantificaciones de células apoptóticas por campo 100X en los riñones de ratones después de IR renal. *P<0,05 frente a ratones tratados con vehículo sometidos a IR renal. Las barras de error representan 1 EEM. El tratamiento con renalasa recombinante disminuyó significativamente la apoptosis tubular renal en ratones después de lesión IR renal.
La figura 7, que comprende las figuras 7A a 7D, es un conjunto de imágenes y gráficos que demuestran que la renalasa humana recombinante exógena reduce la infiltración renal de neutrófilos en ratones después de IR. Figuras 7A y 7C: Fotomicrografías representativas para inmunohistoquímica para infiltración de neutrófilos (aumento 200X) o macrófagos (tinción F4/80, aumento 400X) de secciones de riñón de ratones sometidos a operación de referencia o a 30 min de isquemia renal y 24 hr de reperfusión. Los ratones se pretrataron con vehículo salino o con renalasa recombinante humana 1,5 mg/kg 10 min antes de la isquemia renal. Las fotografías son representativas de 3-5 experimentos independientes. Figuras 7B y 7D: Cuantificaciones de los neutrófilos (por campo de 200X) y macrófagos (por campo de 400X) infiltrados en los riñones de ratones después de IR renal. *P<0,05 frente a grupo de operación de referencia. #P<0,05 frente a ratones tratados con vehículo sometidos a IR renal. Las barras de error representan 1 EEM. El tratamiento con renalasa recombinante disminuyó significativamente la infiltración renal de neutrófilos, así como de macrófagos en ratones después de lesión IR renal.
La figura 8, que comprende las figuras 8A y 8B, es un conjunto de imágenes y gráficos que demuestran que la deficiencia en renalasa aumenta la expresión de genes proinflamatorios en el riñón después de IR. Figura 8A: Imágenes de gel representativas de RT-PCR de GAPDH, TNF-a, ICAM-1, MCP-1 y MIP-2. Figura 8B: Cuantificación densitométrica de intensidades de banda relativas normalizadas a GAPDH de marcadores proinflamatorios TNF-a, ICAM-1, MCP-1 y MIP-2 de riñones de ratones sometidos a IR renal (N = 4-5 por grupo). Los ratones deficientes en renalasa tenían expresión significativamente aumentada de los ARNm de TNF-a, MCP-1 y MIP-2 examinados comparados con los ratones WT de renalasa sometidos a IR renal. *P<0,05 frente a ratones con operación de referencia. #P<0,05 frente a ratones WT de renalasa sometidos a IR renal. Las barras de error representan 1 EEM.
La figura 9, es un conjunto de gráficos e imágenes que muestran que tres días después del tratamiento con cisplatino, la creatinina en plasma era significativamente mayor en ratones KO de renalasa comparados con WT (1,820,56 frente a 0,71 0,02 mg/dl, n = 6, P = 0,021), como lo era la puntuación de lesión renal (KO = 56,627,38%, n = 6 frente a WT = 17,074,03, n = 5; p<0,0002). El grado de apoptosis (aumento de 2 veces en tinción TUNEL, p<0,005), y la infiltración de macrófagos (aumento del 35% en tinción F4/80, p<0,005). Estos datos muestran que la renalasa protege contra AKI por cisplatino al disminuir señales proapoptóticas y aumentar las de prosupervivencia. La renalasa podría proporcionar una opción terapéutica útil para AKI por cisplatino.
La figura 10 es un gráfico que muestra que el péptido de renalasa protege contra AKI isquémica. Cambio en creatinina en plasma a las 24 hr en ratones WT sometidos a 30 min de isquemia renal con y sin pretratamiento con los péptidos de renalasa indicados.
La figura 11, que comprende las figuras 11A a 11D, es un conjunto de imágenes y gráficos que muestran que la renalasa protege células HK-2 contra toxicidad de cisplatino, inhibe apoptosis y aumenta la expresión de Bcl-2. Figura 11A: Células HK-2 tratadas con cisplatino con y sin renalasa durante 24 hr, expresión de renalasa medida por inmunotransferencia; Figura 11B: la renalasa mejora la supervivencia celular medida por WST-1; Figura 11C: Células HK-2 tratadas con cisplatino con y sin renalasa durante 24 h, caspasa medida por inmunotransferencia, y cuantificada por densitometría (panel derecho); Figura 11D: como en la figura 11C, Bcl-2 medida por inmunotransferencia.
La figura 12, que comprende las figuras 12A a 12E, es un conjunto de imágenes y gráficos que muestran que la renalasa aumenta Bcl-2, activa PI3K/AKT, ERK, p38 e inhibe JNK. Análisis por inmunotransferencia; P- indica proteínas fosforiladas, activadas; señales normalizadas a control de carga de GAPDH, después se calculan los cambios en la fosforilación de proteínas (aumento = activación, disminución = inhibición) desde el tiempo 0. Figura 12A: Células HK-2 y HUVEC incubadas con renalasa durante 24 hr; Figura 12B: Inmunotransferencia de la evolución temporal de la señalización de AKT y MAPK por renalasa, células HK-2 incubadas con renalasa durante el tiempo indicado; los cambios sobre el nivel basal en 4c-d son significativos (p<0,05); Figura 12C: Activación de AKT (T308), AKT (5473) y ERK; Figura 12D: Inhibición de JNK; Figura 12E: Aumento marcado y sostenido (60 min ) de p38 por renalasa en presencia de cisplatino, inmunotransferencia para evolución temporal, REN = renalasa, CP = cisplatino.
La figura 13 es una lista de las secuencias de aminoácidos de péptidos de renalasa.
La figura 14, que comprende las figuras 14A-14C, representa los resultados de experimentos que demuestran el efecto hemodinámico de péptidos de renalasa. Una única inyección intravenosa de RP-220 en ratones de tipo salvaje anestesiados; la presión PS se registra de forma continua; RP-220 se da en el tiempo 0; cada punto de datos representa la media de valores de PS sistólica o diastólica recogidos en los puntos de tiempo indicados en 6 animales; la prueba de Kruskal-Wallis reveló significación estadística, y la prueba de Mann-Whitney se usó para comparaciones por pares; *: indica P<0,05 (Figura 14A). Como en la figura 14A, excepto que se inyecta RP-H220; sin cambios significativos en la presión sanguínea (Figura 14B). Efecto de una única inyección intravenosa de RP-220 (cuadrados) y RP-H220 (rombos) en la frecuencia cardiaca en ratones de tipo salvaje (Figura 14C). RP H220, RP A220, RP 224, RP 220 mezclado, RP 128 y RP 19 no tuvieron efecto en la PS.
La figura 15 es un diagrama que representa un modelo de funcionamiento de renalasa. La renalasa se une a un receptor de membrana para activar rutas de señalización celular que afectan la supervivencia celular. El efecto hemodinámico de renalasa recombinante o RP 220 puede estar mediado por el mismo receptor que activa la señalización celular o por un receptor diferente.
La figura 16 representa los resultados de experimentos que demuestran que la isquemia renal aguda produce una disminución en la secreción de renalasa en riñón, que se puede detectar como una disminución en el nivel de renalasa en sangre, suero, plasma y orina.
La figura 17, que comprende las figuras 17A-17D, representa los resultados de experimentos que demuestran que la deficiencia en renalasa agrava la AKI de cisplatino. Niveles de creatinina en plasma en ratones WT y KO de renalasa 3 días tras la administración de cisplatino; n = 6; *: P<0,05 (Figura 17A). Fotomicrografías representativas para tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de secciones de riñón de ratones WT tratados con cisplatino (Figura 17B, panel izquierdo). Fotomicrografías representativas de tinción H&E de riñón de ratones KO de renalasa tratados con cisplatino (Figura 17B, panel medio). Puntuación de lesión renal, n = 6, *: P<0,05 (Figura 17B, panel derecho). Fotomicrografías representativas de tinción TUNEL de secciones de riñón de ratones WT tratados con cisplatino; n = 6 (Figura 17C, panel izquierdo). Fotomicrografías representativas de tinción TUNEL de secciones de riñón de ratones KO de renalasa tratados con cisplatino (Figura 17C, panel medio). Número de núcleos apoptóticos por campo de 40X, n = 6, *: P<0,05 (Figura 17C, panel derecho). Fotomicrografías representativas de tinción de macrófagos (F4/80) de secciones de riñón de ratones WT tratados con cisplatino; n = 5 (Figura 17D, panel izquierdo). Fotomicrografías representativas de tinción de macrófagos (F4/80) de secciones de riñón de ratones KO de renalasa tratados con cisplatino; n = 5 (Figura 17D, panel medio). Número de macrófagos por campo de 100X; n = 5, *: P<0,05 (Figura 17D, panel derecho).
La figura 18, que comprende las figuras 18A-18D, representa los resultados de experimentos que demuestran que la renalasa recombinante protege células HK-2 frente a lesión oxidante y mediada por cisplatino. Células HK-2 tratadas con H2O22 mM con y sin renalasa durante el tiempo indicado; LDH: lactato deshidrogenasa; n = 8, *: P<0,05 para control frente a renalasa; #: P<0,05 para control frente a H2O2 (Figura 18A). Células HK-2 tratadas con cisplatino 20 |jM con o sin renalasa durante 24 hr (Figura 18B). Supervivencia celular medida por el método WST-1; n = 6, *: P<0,05 (Figura 18B, panel izquierdo). Expresión de renalasa medida por inmunotransferencia; se muestra una membrana representativa (Figura 18B, panel derecho). Células HK-2 tratadas con como en 18B (Figura 18C); Activación de caspasa medida por inmunotransferencia (Figura 18C). Cuantificación por densitometría, n = 3, *: P<0,05 (Figura 18C, panel derecho). Células HK-2 tratadas como en 18B (Figura 18D). Expresión de Bcl-2 medida por inmunotransferencia (Figura 18D, panel izquierdo). Cuantificación por densitometría, n = 3, *: P<0,05 (Figura 18D, panel derecho).
La figura 19, que comprende las figuras 19A-19F, representa los resultados de experimentos que demuestran que el efecto protector de renalasa es independiente de su actividad enzimática. Isoformas de renalasa Ren1-7; exones numerados de 1 a 10; RP-224: péptido de renalasa aminoácidos 224-233 de Ren1 o Ren2; RP-220; aminoácidos 220­ 239; RP-H220: RP-220 etiquetado con histidina; RP-Scr220: RP-220 mezclado (Figura 19A). Células CCL-119 en cultivo tratadas con anticuerpo monoclonal anti-renalasa durante 24 hr; supervivencia celular medida por el método WST-1; n = 3, *: P<0,05 (Figura 19B). Células HK-2 tratadas con H2O22 mM con y sin péptidos de renalasa durante el tiempo indicado; LDH: lactato deshidrogenasa; n = 6, *: P<0,05 para control frente a péptido de renalasa (Figura 19C). Células HK-2 tratadas con cisplatino 20 jM con o sin renalasa recombinante y péptidos de renalasa durante 24 hr, *: P<0,05 para control frente a péptido de renalasa (Figura 19D). Niveles de creatinina en plasma de ratones sometidos a cirugía de referencia o a isquemia renal y reperfusión (IR); Ratones WT de renalasa se sometieron a cirugía de referencia o a 30 min de IR renal. Para ratones sometidos a IR renal, se inyectó RP-H220 o vehículo (solución salina) 10 min antes de la isquemia renal. RP-H220 produjo protección renal significativa en ratones WT de renalasa (N = 4-6 por grupo). *: P<0,05 frente a ratones tratados con vehículo sometidos a cirugía de referencia; #: P<0,05 frente a ratones W t tratados con vehículo sometidos a IR renal (Figura 19E). Los péptidos de renalasa no oxidan NADH; renalasa recombinante o péptidos en Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 5 mM, y nA d H 150 jM , a 37°C; *: P<0,05 (Figura 19F).
La figura 20, que comprende las figuras 20A-20C, representa los resultados de experimentos que demuestran que la activación de MAPK es crítica para el efecto protector de péptidos de renalasa. Señalización de MAPK por renalasa y péptidos de renalasa. Análisis por inmunotransferencia; ERK: quinasa regulada por señal extracelular 1 y 2; JNK: c-Jun N-terminal quinasas; AKT: proteína quinasa B; p- indica proteínas fosforiladas, activadas; transferencia representativa, n = 3 (Figura 20A). Renalasa activa AKT (Figura 20B). Análisis por inmunotransferencia; P- indica proteínas fosforiladas, activadas; transferencia representativa, n = 3 (Figura 20B, panel izquierdo). Señales normalizadas a control de carga de GAPDH; n = 3; cambio sobre nivel basal estadísticamente significativo (P<0,05) de 1-60 min para ERK, p38 y AKT (T308) y a 30 min solo para AKT (S473) (Figura 20B, panel derecho). La inhibición de ERK o AKT anula el efecto protector de RP-H220 (Figura 20C). Niveles de creatinina en plasma de ratones sometidos a cirugía de referencia o a isquemia renal y reperfusión (IR); Ratones WT de renalasa se sometieron a cirugía de referencia o a 30 min de IR renal. Para ratones sometidos a IR renal, se inyectó RP-H220 o vehículo (solución salina) 10 min antes de la isquemia renal. Algunos animales se pretrataron con el inhibidor de ERK PD98059 o el inhibidor de PI3K/ATK wortmanina. (N = 6-8 por grupo). *: P<0,05 frente a ratones tratados con vehículo sometidos a cirugía de referencia; #: P<0,05 frente a ratones WT tratados con vehículo sometidos a IR renal (Figura 20C).
La figura 21 representa el resultado de experimentos que examinan el efecto de la inyección de RP-220 sobre la presión sanguínea. Una única inyección subcutánea de RP-220 (n = 3) o tampón (n = 2) en ratones de tipo salvaje anestesiados; la presión PS se registra de forma continua; RP-220 se da en el tiempo 0; cada punto de datos representa la presión media; se muestran los errores estándar de la media.
Descripción detallada
La presente invención se define mediante las reivindicaciones.
La presente divulgación se refiere al descubrimiento de que renalasa, y fragmentos de la misma, son útiles para el tratamiento o la prevención de enfermedades y trastornos, tal como enfermedades y trastornos cardiacos y renales. Por tanto, la divulgación se refiere a composiciones que comprenden renalasa, o fragmentos de la misma, y métodos para tratar y prevenir enfermedades y trastornos incluyendo enfermedades y trastornos cardiacos y renales. En algunas formas de realización, la lesión renal tratada o prevenida usando las composiciones y métodos de la invención es AKI causada por isquemia/reperfusión (IR).
En un ejemplo, la renalasa de la divulgación es una renalasa. En algunas formas de realización, el fragmento de renalasa es un péptido que retiene su actividad protectora de AKI, pero no muestra actividad amina oxidasa detectable. En otra forma de realización particular, el fragmento de renalasa es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otra forma de realización particular, el fragmento de renalasa es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
Las composiciones y métodos de la divulgación comprenden renalasa recombinante, o fragmentos de la misma. Las composiciones y métodos de la invención incluyen composiciones y métodos para tratar lesión isquémica renal, lesión de reperfusión renal, lesión isquémica-reperfusión renal, lesión renal tóxica, necrosis tubular renal, inflamación tubularrenal, apoptosis tubular renal, lesión cerebral isquémica, lesión cerebral de reperfusión, lesión cerebral isquémica-reperfusión, lesión cerebral tóxica, lesión hepática isquémica, lesión hepática de reperfusión, lesión hepática isquémica-reperfusión, lesión hepática tóxica, e hipertensión. En algunas formas de realización, las composiciones y métodos de la divulgación son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos del sistema nervioso simpático, tal como, a modo de ejemplos no limitantes, ansiedad, trastorno de estrés postraumático (TEPT) y trastorno de hiperactividad con déficit de atención (THDA).
En otro ejemplo, la divulgación es un método de diagnosticar una enfermedad o trastorno renal de un sujeto evaluando el nivel de renalasa en una muestra biológica del sujeto. En una forma de realización, un cambio (es decir, aumento o disminución) en el nivel de renalasa comparado con un comparador es un marcador para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno renal, o una enfermedad o trastorno cardiaco, así como para seguir el tratamiento de una enfermedad o trastorno renal o cardiaco.
Definiciones
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica para ensayar la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en el presente documento. Al describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología.
También se debe entender que la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir formas de realización particulares solo, y no se pretende que sea limitante.
Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.
“Aproximadamente” como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similar, se pretende que abarque variaciones no limitantes de ±40% o ±20% o ±10%, ±5%, ±1%, o ±0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas.
El término “anómalo” cuando se usa en el contexto de organismos, tejidos, células o componentes de los mismos, se refiere a esos organismos, tejidos, células o componentes de los mismos que se diferencian en al menos una característica observable o detectable (por ejemplo, edad, tratamiento, tiempo del día, etc.) de esos organismos, tejidos, células o componentes de los mismos que muestran la característica “normal” (esperada) respectiva. Las características que son normales o esperadas para un tipo de célula o tejido, podrían ser anómalas para un tipo de célula o tejido diferente.
Como se usa en el presente documento, “aliviar” o “tratar” una enfermedad significa reducir la frecuencia o gravedad de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno.
Como se usa en el presente documento, los términos “alteración”, “defecto”, “variación” o “mutación” se refiere a una mutación en un gen en una célula que afecta la función, actividad, expresión (transcripción o traducción) o conformación del polipéptido que codifica. Las mutaciones abarcadas por la presente divulgación pueden ser cualquier mutación de un gen en una célula que produce el aumento o la alteración de la función, actividad, expresión o conformación del polipéptido codificado, incluyendo la ausencia total de expresión de la proteína codificada y puede incluir mutaciones de cambio de sentido y sinsentido, inserciones, deleciones, cambios de marco de lectura y terminaciones prematuras. Sin estar limitado así, las mutaciones abarcadas por la presente divulgación pueden alterar el ayuste del ARNm (mutación de sitio de ayuste) o producir un cambio en el marco de lectura.
El término “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que es capaz de unirse específicamente a un epítopo específico en un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos en la presente divulgación pueden existir en una variedad de formas incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos intracelulares (“ intracuerpos”), Fv, Fab y F(ab)2, así como anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos de cadena pesada, tal como anticuerpos de camélidos, anticuerpos sintéticos, anticuerpo quiméricos, y anticuerpos humanizados (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
Una “cadena pesada de anticuerpo” como se usa en el presente documento, se refiere a la mayor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en todas las moléculas de anticuerpos en sus conformaciones naturales.
Una “cadena ligera de anticuerpo” como se usa en el presente documento, se refiere a la menor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en todas las moléculas de anticuerpos en sus conformaciones naturales. Cadenas ligeras k y A se refiere a los dos isotipos de cadenas ligeras de anticuerpo principales.
Mediante el término “anticuerpo sintético” como se usa en el presente documento, se quiere decir un anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago como se describe en el presente documento. El término también se debe interpretar que significa un anticuerpo que se ha generado por la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en donde la secuencia de ADN o aminoácidos se ha obtenido usando ADN sintético o tecnología de secuencia de aminoácidos, que está disponible y se conoce bien en la técnica.
Como se usa en el presente documento, un “inmunoensayo” se refiere a cualquier ensayo de unión que usa un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una molécula diana para detectar y cuantificar la molécula diana.
Mediante el término “se une específicamente”, como se usa en el presente documento con respecto a un anticuerpo, se quiere decir un anticuerpo que reconoce un antígeno específico, pero sustancialmente no reconoce o se une a otras moléculas en una muestra. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de una especie también se puede unir a ese antígeno de una o más especies. Pero, tal reactividad entre especies no altera en sí misma la clasificación de un anticuerpo como específico. En otro ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno también se puede unir a formas alélicas diferentes del antígeno. Sin embargo, tal reactividad cruzada no altera ella misma la clasificación de un anticuerpo como específico. En algunos casos, los términos “unión específica” y “que se une específicamente” se pueden usar en referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína, o un péptido con una segunda especie química, para significar que la interacción es dependiente de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica específica más que a proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para el epítopo “A”, la presencia de una molécula que contiene el epítopo A (o A libre, sin marcar), en una reacción que contienen “A” marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.
Mediante el término “aplicador”, como el término se usa en el presente documento, se quiere decir cualquier dispositivo incluyendo, pero no limitado a, una jeringa hipodérmica, una pipeta, un dispositivo de iontoforesis, un parche, y similares, para administrar las composiciones de la invención a un sujeto.
Como se usa en el presente documento, el término “marcador” o “biomarcador” se pretende que incluya un parámetro que sea útil según esta divulgación para determinar, por ejemplo, la presencia y/o gravedad de una enfermedad o trastorno cardiaco o renal. A modo de un ejemplo no limitante, un “marcador” o “biomarcador” es el nivel y/o la actividad de renalasa.
El nivel de un marcador o biomarcador “significativamente” se diferencia del nivel del marcador o biomarcador en una muestra de referencia si el nivel del marcador en una muestra del paciente se diferencia del nivel en una muestra del sujeto de referencia en una cantidad mayor del error estándar del ensayo empleado para evaluar el marcador, y preferiblemente al menos el 10%, y más preferiblemente el 25%, 50%, 75% o 100%.
“Cáncer” como se usa en el presente documento, se refiere al crecimiento anómalo o división de células. En general, el crecimiento y/o vida de una célula cancerosa supera, y no está coordinado con, la de células y tejidos normales a su alrededor. Los cánceres pueden ser benignos, premalignos o malignos. El cáncer se produce en una variedad de células y tejidos, incluyendo la cavidad bucal (por ejemplo, boca, lengua, faringe, etc.), aparato digestivo (por ejemplo, esófago, estómago, intestino delgado, colon, recto, hígado, conducto biliar, vesícula biliar, páncreas, etc.), aparato respiratorio (por ejemplo, laringe, pulmón, bronquio, etc.), huesos, articulaciones, piel (por ejemplo, célula basal, célula escamosa, meningioma, etc.). mama, aparato genital (por ejemplo, útero, ovario, próstata, testículo, etc.), aparato urinario (por ejemplo, vejiga, riñón, uréter, etc.), ojo, sistema nervioso (por ejemplo, cerebro, etc.), sistema endocrino (por ejemplo, tiroides, etc.), y sistema hematopoyético (por ejemplo, linfoma, mieloma, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, etc.).
El término “secuencia codificante”, como se usa en el presente documento, significa una secuencia de un ácido nucleico o su complemento, o una parte de la misma, que se puede transcribir y/o traducir para producir el ARNm y/o el polipéptido o un fragmento del mismo. Las secuencias codificantes incluyen exones en un ADN genómico o transcritos de ARN primarios inmaduros, que se unen por la maquinaria bioquímica de la célula para proporcionar un ARNm maduro. La hebra antisentido es el complemento de tal ácido nucleico, y la secuencia codificante se puede deducir de la misma. En contraste, el término “secuencia no codificante”, como se usa en el presente documento, significa una secuencia de un ácido nucleico o su complemento, o una parte de la misma, que no se traduce a aminoácidos in vivo, o donde ARNt no interacciona para colocar o intentar colocar un aminoácido. Las secuencias no codificantes incluyen tanto secuencias intrónicas en ADN genómico o transcritos de ARN primarios inmaduros, como secuencias asociadas a genes tal como promotores, potenciadores, silenciadores, y similares.
Como se usa en el presente documento, los términos “complementario” o “complementariedad” se usan en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia “A-G-T” es complementaria a la secuencia “T-C-A”. La complementariedad puede ser “parcial”, en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos son coincidentes según las reglas del emparejamiento de bases. O, puede ser complementariedad “completa” o “total” entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre hebras de ácidos nucleicos tiene efectos significativos en la eficacia y potencia de la hibridación entre hebras de ácidos nucleicos. Esto es de importancia particular en reacciones de amplificación, así como en métodos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.
Una “enfermedad” es un estado de salud de un animal en donde el animal no puede mantener la homeostasis, y en donde si la enfermedad no se alivia entonces la salud del animal sigue deteriorándose. En contraste, un “trastorno” en un animal es un estado de salud en el que el animal es capaz de mantener la homeostasis, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Dejado sin tratar, un trastorno no produce necesariamente una disminución adicional en el estado de salud del animal.
Una “cantidad eficaz” como se usa en el presente documento, significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico.
“Codificar” se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc, o un ARNm, para servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen o bien una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Por tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del ARNm y habitualmente se proporciona en listas de secuencias, como la hebra no codificante, usada como molde para la transcripción de un gen o ADNc, se pueden denominar que codifican la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.
Como se usa en el presente documento, el término “fragmento”, aplicado a un ácido nucleico, se refiere a una subsecuencia de un ácido nucleico mayor. Un “fragmento” de un ácido nucleico puede tener al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud; por ejemplo, de al menos aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100 nucleótidos; de al menos aproximadamente 100 hasta aproximadamente 500 nucleótidos, de al menos aproximadamente 500 hasta aproximadamente 1000 nucleótidos; de al menos aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 1500 nucleótidos, de al menos aproximadamente 1500 hasta aproximadamente 2500 nucleótidos; o aproximadamente 2500 nucleótidos (y cualquier valor entero entre medias). Como se usa en el presente documento, el término “fragmento”, aplicado a una proteína, polipéptido o péptido, se refiere a una subsecuencia de una proteína o péptido mayor. Un “fragmento” de una proteína, polipéptido o péptido puede tener al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud; por ejemplo, al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud; al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud; al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud; al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud; al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud; o al menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud (y cualquier valor entero entre medias).
El término “gen” se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que incluye secuencias codificantes necesarias para la producción de un polipéptido, precursor, o ARN (por ejemplo, ARNm). El polipéptido puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante siempre que la actividad o propiedad funcional deseada (por ejemplo, actividad enzimática, unión a ligando, transducción de señales, inmunogenicidad, etc.) de la longitud completa o fragmento se retenga. El término también abarca la región codificante de un gen estructural y la secuencia localizada adyacente a la región codificante en los extremos tanto 5' como 3' en una distancia de aproximadamente 2 kb o más en cualquier extremo de modo que el gen corresponde a la longitud del ARNm de longitud completa y secuencias reguladoras 5' que influyen las propiedades transcripcionales del gen. Las secuencias localizadas 5' de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias 5' no traducidas habitualmente contienen las secuencias reguladoras. Las secuencias localizadas 3' o después de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas. El término “gen” abarca las formas tanto genómica como de ADNc de un gen. Un forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante interrumpida con secuencias no codificantes llamadas “intrones” o “regiones intermedias” o “secuencias intermedias”. Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben a ARN nuclear (ARNhn); los intrones pueden contener elementos reguladores tal como potenciadores. Los intrones se eliminan o “someten a ayuste” a partir del transcrito nuclear o primario; por tanto, los intrones están ausentes en el transcrito de ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia u orden de aminoácidos en un polipéptido naciente.
“Homólogo” se refiere a la similitud de secuencia o identidad de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en ambas de las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma subunidad monómero de base o aminoácido, por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas X 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias son coincidentes u homólogas entonces las dos secuencias son el 60% homólogas. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN ATTGCC y TATGGC comparten el 50% de homología. En general, se hace una comparación cuando dos secuencias se alinean para dar homología máxima.
“Material instructivo”, como ese término se usa en el presente documento, incluye una publicación, un registro, un diagrama, o cualquier otro medio de expresión que se puede usar para comunicar la utilidad del ácido nucleico, péptido, polipéptido y/o compuesto de la divulgación en el kit para identificar o aliviar o tratar las varias enfermedades o trastornos enumerados en el presente documento. Opcionalmente, o alternativamente, el material instructivo puede describir uno o más métodos de identificar o aliviar las enfermedades o trastornos en una célula o un tejido de un sujeto. El material instructivo del kit puede, por ejemplo, estar fijado a un envase que contiene el ácido nucleico, polipéptido y/o compuesto de la divulgación o ser enviado junto con un envase que contiene el ácido nucleico, polipéptido y/o compuesto. Alternativamente, el material instructivo se puede enviar por separado del envase con la intención de que el receptor use el material instructivo y el compuesto cooperativamente.
“Aislado” significa alterado o retirado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido naturalmente presente en un animal vivo no está “aislado”, pero el mismo ácido nucleico o polipéptido parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”. Un ácido nucleico o proteína aislado puede existir en forma sustancialmente purificada, o puede existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, una célula huésped.
Un “ácido nucleico aislado” se refiere a un segmento o fragmento de ácido nucleico que ha sido separado de secuencias que lo flanquean en un estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha retirado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento, por ejemplo, las secuencias adyacentes en un genoma en el que se produce de forma natural. El término también aplica a ácidos nucleicos que se han purificado sustancialmente de otros componentes que acompañan de forma natural al ácido nucleico, por ejemplo, a Rn o ADN o proteínas, que lo acompañan de forma natural en la célula. El término, por tanto, incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora a un vector, en un plásmido de replicación autónoma o un virus, o en el a Dn genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, como un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido por PCR o digestión con enzimas de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia polipeptídica adicional.
El término “marcador” cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado directa o indirectamente a una sonda para generar una sonda “marcada”. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable (por ejemplo, avidina-biotina). En algunos casos, se pueden marcar cebadores para detectar un producto de PCR.
Mediante el término “modular”, como se usa en el presente documento, se quiere decir mediar un aumento o disminución detectable en la actividad y/o nivel de un ARNm, polipéptido, o una respuesta en un sujeto comparado con la actividad y/o nivel de un ARNm, polipéptido o una respuesta en el sujeto en ausencia de un tratamiento o compuesto y/o comparado con la actividad y/o nivel de un ARNm, polipéptido, o una respuesta en otro sujeto de otra manera idéntico, pero sin tratar. El término abarca activar, inhibir y/o afectar de otra manera una señal nativa o respuesta mediando de esta manera una respuesta terapéutica beneficiosa en un sujeto, preferiblemente, un ser humano.
Una “mutación”, como se usa en el presente documento, se refiere a un cambio en la secuencia de ácido nucleico o polipéptido relativa a una secuencia de referencia (que es preferiblemente una secuencia normal natural o “de tipo salvaje”), e incluye translocaciones, deleciones, inserciones, y sustituciones/mutaciones puntuales. Un “mutante” como se usa en el presente documento, se refiere o bien a un ácido nucleico o una proteína que comprende una mutación.
Un “ácido nucleico” se refiere a un polinucleótido e incluye polirribonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos. Los ácidos nucleicos según la presente divulgación pueden incluir cualquier polímero u oligómero de bases pirimidínicas y púricas, preferiblemente citosina, timina, y uracilo, y adenina y guanina, respectivamente. (Véase Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, en 793-800 (Worth Pub. 1982)). En efecto, la presente divulgación contempla cualquier componente desoxirribonucleótido, ribonucleótido o ácido péptido nucleico, y cualquier variante de los mismos, tal como formas metiladas, hidroximetiladas o glucosiladas de estas bases, y similares. Los polímeros u oligómeros pueden ser heterogéneos u homogéneos en composición, y pueden estar aislados de fuentes naturales o pueden estar producidos de forma artificial o sintética. Además, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, o una mezcla de los mismos, y pueden existir permanente o transitoriamente en forma monocatenaria o bicatenaria, incluyendo homoduplex, heterodúplex y estados híbridos.
Un “oligonucleótido” o “polinucleótido” es un ácido nucleico que varía de al menos 2, preferiblemente al menos 8, 15 o 25 nucleótidos de longitud, pero puede tener hasta 50, 100, 1000, o 5000 nucleótidos de longitud o un compuesto que específicamente hibrida con un polinucleótido. Los polinucleótidos incluyen secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) o miméticos de los mismos que se pueden aislar de fuentes naturales, producir de forma recombinante o sintetizar artificialmente. Un ejemplo adicional de un polinucleótido de la presente divulgación puede ser un ácido peptidonucleico (APN). (Véase la patente en EE UU No. 6.156.501). La divulgación también abarca situaciones en las que hay un emparejamiento de bases no tradicional, tal como emparejamiento de bases de Hoogsteen que se ha identificado en ciertas moléculas de ARNt y postulado que existe como triple hélice. “Polinucleótido” y “oligonucleótido” se usan de forma intercambiable en esta divulgación. Se entenderá que cuando una secuencia de nucleótidos está representada en el presente documento por una secuencia de ADN (por ejemplo, A, T, G, y C), esto también incluye la correspondiente secuencia de ARN (por ejemplo, A, U, G, y C) en la que “U” sustituye a “T”.
Los términos “paciente”, “sujeto”, “ individuo”, y similares se usan de forma intercambiable en el presente documento, y se refieren a cualquier animal, o células del mismo, sea in vitro o in situ, susceptibles a los métodos descritos en el presente documento. En ciertas formas de realización no limitantes, el paciente, sujeto o individuo es un ser humano.
Como se usa en el presente documento, el término “reacción en cadena de la polimerasa” (“PCR”) se refiere al método de K. B. Mullis (patentes en EE UU No. 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188) para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este proceso para amplificar la secuencia diana consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores oligonucleotídicos a la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido por una secuencia precisa de ciclado térmico en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus hebras respectivas de la secuencia diana bicatenaria. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores hibridan entonces con sus secuencias complementarias en la molécula diana. Después de la hibridación, los cebadores se extienden con una polimerasa de modo que se forme un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión por polimerasa se pueden repetir muchas veces (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión constituyen un “ciclo”; puede haber numerosos “ciclos”) para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina por las posiciones relativas de los cebadores con respecto uno a otro, y, por tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del proceso, el método se denomina “reacción en cadena de la polimerasa” (de aquí en adelante “PCR”). Puesto que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se vuelven las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están “amplificados por PCR”. Como se usa en el presente documento, los términos “producto de PCR”, “fragmento de PCR”, “producto de amplificación” o “amplicón” se refieren a la mezcla resultante de compuestos después de completar dos o más ciclos de las etapas de PCR de desnaturalización, hibridación y extensión. Estos términos abarcan el caso donde ha habido amplificación de uno o más segmentos de una o más secuencias diana.
Como se usa en el presente documento, el término “sonda” se refiere a un oligonucleótido (es decir, una secuencia de nucleótidos), ya sea natural en un digerido de restricción purificado o producido de forma sintética, recombinante o por amplificación por PCR, que es capaz de hibridar con otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares.
Como se usa en el presente documento, los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan de forma intercambiable, y se refieren a un compuesto formado de residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se coloca limitación en el número máximo de aminoácidos que puede comprender una secuencia de proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Como se usa en el presente, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que en general se denominan en la técnica proteínas, de las que hay muchos tipos. Los “polipéptidos” incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos, o una combinación de los mismos.
Como se usa en el presente documento, “polinucleótido” incluye ADNc, ARN, híbrido ADN/ARN, ARN antisentido, ribozima, ADN genómico, formas sintéticas, y polímeros mixtos, hebras tanto sentido como antisentido, y pueden estar química o biológicamente modificadas para contener bases de nucleótidos no naturales o derivadas, sintéticas o semisintéticas. Además, se contemplan alteraciones de un gen de tipo salvaje o sintético, incluyendo, pero no limitado a deleción, inserción, sustitución de uno o más nucleótidos, o fusión a otras secuencias de polinucleótidos.
“Prevenir” una enfermedad o trastorno como el término se usa en el presente documento, significa reducir la gravedad o frecuencia de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno que experimenta un sujeto.
“Muestra” o “muestra biológica” como se usa en el presente documento significa un material biológico aislado de un sujeto. La muestra biológica puede contener cualquier material biológico adecuado para detectar ARNm, polipéptido u otro marcador de un proceso fisiológico o patológico en un sujeto, y puede comprender fluido, tejido, material celular y/o no celular obtenido del individuo.
Como se usa en el presente documento, “sustancialmente purificado” se refiere a estar esencialmente libre de otros componentes. Por ejemplo, un polipéptido sustancialmente purificado es un polipéptido que se ha separado de otros componentes con los que normalmente se asocia en su estado natural.
Como se usa en el presente documento, los términos “terapia” o “pauta terapéutica” se refieren a esas actividades tomadas para prevenir, aliviar, o alterar un estado de trastorno o enfermedad, por ejemplo, un curso de tratamiento pretendido para reducir o eliminar al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno usando técnicas farmacológicas, quirúrgicas, dietéticas y/u otras. Una pauta terapéutica puede incluir una dosis prescrita de uno o más compuestos o cirugía. Las terapias con la mayor frecuencia serán beneficiosas y reducirán o eliminarán al menos un signo o síntoma del estado de trastorno o enfermedad, pero en algunos casos el efecto de una terapia tendrá efectos no deseables o secundarios. El efecto de la terapia también estará impactado por el estado fisiológico del sujeto, por ejemplo, edad, sexo, genética, peso, otras enfermedades, etc.
El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad del compuesto objeto que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, o sujeto que busca el investigador, veterinario, médico u otro personal clínico. El término “cantidad terapéuticamente eficaz” incluye esa cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar a algún nivel, uno o más de los signos o síntomas del trastorno o enfermedad que se trata. La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc., del sujeto que se va a tratar.
“Tratar” una enfermedad o trastorno como el término se usa en el presente documento, significa reducir la frecuencia 0 gravedad de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno experimentado por un sujeto.
Como se usa en el presente documento, el término “tipo salvaje” se refiere a un gen o producto génico aislado de una fuente natural. Un gen de tipo salvaje es ese que se observa con más frecuencia en una población y por tanto se designa arbitrariamente la forma “normal” o de “tipo salvaje” del gen. En contraste, el término “modificado” o “mutante” se refiere a un gen o producto génico que muestra modificaciones en secuencia y/o propiedades funcionales (es decir, características alteradas) cuando se compara con el gen o producto génico de tipo salvaje. Se advierte que se pueden aislar mutantes naturales; estos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas (incluyendo secuencias de ácido nucleico alteradas) cuando se comparan con el gen o producto génico de tipo salvaje.
Intervalos: a lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la divulgación se pueden presentar en formato de intervalo. Según esto, la descripción de un intervalo se debe considerar que tiene específicamente divulgados todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 se debe considerar que tienen específicamente divulgados subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales en ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3, y 6. Esto aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Descripción
En algunos ejemplos, las composiciones y métodos de la divulgación comprenden renalasa, o un fragmento de la misma, para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno cardiaco o renal. En algunos ejemplos, la renalasa de la divulgación es un fragmento de renalasa que es un péptido que retiene su actividad protectora, pero no muestra actividad NADH oxidasa detectable. En algunas formas de realización, el fragmento de renalasa es un péptido que retiene su actividad protectora, pero no muestra actividad amina oxidasa detectable. En otra forma de realización particular, el fragmento de renalasa es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otra forma de realización particular, el fragmento de renalasa es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
Las composiciones y métodos de la divulgación comprenden renalasa recombinante, o fragmentos de la misma. Las composiciones y métodos de la divulgación incluyen composiciones y métodos para tratar o prevenir trastornos y enfermedades donde es deseable una actividad o nivel de renalasa aumentado. En varias formas de realización, los trastornos y enfermedades donde es deseable una actividad o nivel de renalasa aumentado que se pueden tratar o prevenir con las composiciones o métodos de la divulgación incluyen AKI, necrosis miocárdica, insuficiencia cardiaca, insuficiencia cardiaca congestiva, lesión isquémica cardiaca, lesión de reperfusión cardiaca, lesión isquémicareperfusión cardiaca, lesión cardiaca tóxica, lesión isquémica renal, lesión de reperfusión renal, lesión isquémicareperfusión renal, lesión renal tóxica, necrosis tubular renal, inflamación tubular renal, apoptosis tubular renal, lesión cerebral isquémica, lesión cerebral de reperfusión, lesión cerebral isquémica-reperfusión, lesión cerebral tóxica, lesión hepática isquémica, lesión hepática de reperfusión, lesión hepática isquémica-reperfusión, lesión hepática tóxica, e hipertensión. En algunos ejemplos, las composiciones y métodos de la divulgación son útiles para controlar o mantener la presión sanguínea. En algunos ejemplos, las composiciones y métodos de la divulgación son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos del sistema nervioso simpático, tal como, a modo de ejemplos no limitantes, ansiedad, trastorno de estrés postraumático (TEPT) y trastorno de hiperactividad con déficit de atención (THDA).
En otro ejemplo, la divulgación es un método de diagnosticar una enfermedad o trastorno renal de un sujeto evaluando el nivel de renalasa en una muestra biológica del sujeto. En una forma de realización, un cambio (es decir, aumento o disminución) en el nivel de renalasa comparado con un comparador es un marcador para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno renal, o una enfermedad o trastorno cardiaco, así como para seguir el tratamiento de una enfermedad o trastorno renal o cardiaco.
Composiciones y métodos de tratamiento y prevención
En varios ejemplos, la presente divulgación incluye composiciones activadoras de renalasa y métodos de aumentar el nivel o actividad de renalasa, o un fragmento de la misma, en un sujeto, un tejido, o un órgano en necesidad de ello. En varios ejemplos, las composiciones activadoras de renalasa y métodos de tratamiento de la divulgación aumentan la cantidad de polipéptido renalasa, la cantidad de ARNm de renalasa, la cantidad de actividad enzimática de renalasa, la cantidad de actividad de unión a sustrato de renalasa, o una combinación de los mismos. En varios ejemplos, las enfermedades y trastornos donde un aumento en renalasa puede mejorar el desenlace terapéutico incluyen, pero no están limitados a, AKI, necrosis miocárdica, insuficiencia cardiaca, insuficiencia cardiaca congestiva, lesión isquémica cardiaca, lesión de reperfusión cardiaca, lesión isquémica-reperfusión cardiaca, lesión cardiaca tóxica, lesión isquémica renal, lesión de reperfusión renal, lesión isquémica-reperfusión renal, lesión renal tóxica, necrosis tubular renal, inflamación tubular renal, apoptosis tubular renal, lesión cerebral isquémica, lesión cerebral de reperfusión, lesión cerebral isquémica-reperfusión, lesión cerebral tóxica, lesión hepática isquémica, lesión hepática de reperfusión, lesión hepática isquémica-reperfusión, lesión hepática tóxica, e hipertensión. En algunos ejemplos, las composiciones y métodos de la divulgación son útiles para controlar o mantener la presión sanguínea. En algunos ejemplos, las composiciones y métodos de la divulgación son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos del sistema nervioso simpático, tal como, a modo de ejemplos no limitantes, ansiedad, trastorno de estrés postraumático (TEPT) y trastorno de hiperactividad con déficit de atención (THDA).
Un experto en la materia entenderá, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, que un aumento en el nivel de renalasa abarca el aumento en expresión de renalasa, incluyendo transcripción, traducción, o ambas. El experto en la materia también apreciará, una vez armado con las enseñanzas de la presente invención, que un aumento en el nivel de renalasa incluye un aumento en la actividad renalasa (por ejemplo, actividad enzimática, actividad de unión a sustrato, etc.). Por tanto, aumentar el nivel o actividad de renalasa incluye, pero no está limitado a, aumentar la cantidad de polipéptido renalasa, y aumentar la transcripción, traducción, o ambas, de un ácido nucleico que codifica renalasa; y también incluye aumentar cualquier actividad de un polipéptido renalasa, asimismo. Las composiciones activadoras de renalasa y métodos de la divulgación pueden activar selectivamente renalasa, o pueden activar tanto renalasa como otra molécula.
Por tanto, la presente divulgación se refiere a la prevención y tratamiento de una enfermedad o trastorno por administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido renalasa, un polipéptido renalasa recombinante, un fragmento de polipéptido renalasa activo (es decir, péptido de renalasa), o un activador de la expresión o actividad de renalasa, a un sujeto en necesidad de ello, para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno, o sus signos, síntomas o patologías asociados. En algunas formas de realización, el fragmento de polipéptido renalasa es un péptido que retiene su actividad protectora, pero no muestra actividad NADH oxidasa detectable. En algunas formas de realización, el fragmento de polipéptido renalasa es un péptido que retiene su actividad protectora, pero no muestra actividad amina oxidasa detectable. En otra forma de realización particular, el fragmento de polipéptido renalasa es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En otra forma de realización particular, el fragmento de polipéptido renalasa es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
Un experto en la materia entiende que un aumento en el nivel de renalasa abarca un aumento en la cantidad de renalasa, o fragmento de la misma (por ejemplo, por administración de renalasa o un fragmento de la misma, aumentando la expresión de la proteína renalasa, etc.). Además, el experto en la materia apreciaría, que un aumento en el nivel de renalasa incluye un aumento en la actividad renalasa. Por tanto, aumentar el nivel o actividad de renalasa incluye, pero no está limitado a, la administración de renalasa o un fragmento de la misma, así como aumentar la transcripción, traducción, o ambas, de un ácido nucleico que codifica renalasa; y también incluye aumentar cualquier actividad de renalasa, asimismo.
El nivel o actividad aumentado de renalasa se puede evaluar usando una amplia variedad de métodos, incluyendo los divulgados en el presente documento, así como métodos bien conocidos en la técnica o que se van a desarrollar en el futuro. Es decir, la persona de rutina apreciará, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, que aumentar el nivel o actividad de renalasa se puede evaluar fácilmente usando métodos que evalúan el nivel de un ácido nucleico que codifica renalasa (por ejemplo, ARNm), el nivel de polipéptido renalasa, y/o el nivel de actividad renalasa en una muestra biológica obtenida de un sujeto.
Un experto en la materia, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, entendería que la invención es útil en sujetos que, en todo (por ejemplo, sistémicamente) o en parte (por ejemplo, localmente, tejido, órgano), se tratan o tratarán para una enfermedad o trastorno asociado con un nivel o actividad disminuido de renalasa. El experto en la materia apreciará, basado en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que las enfermedades y trastornos tratables por las composiciones y métodos descritos en el presente documento abarcan cualquier enfermedad o trastorno donde un aumento en renalasa fomentará un desenlace terapéutico positivo.
Un experto en la materia se dará cuenta que además de activar renalasa directamente, disminuir la cantidad o actividad de una molécula que ella misma disminuye la cantidad o actividad de renalasa puede servir para aumentar la cantidad o actividad de renalasa. Por tanto, un activador de renalasa puede incluir, pero no se debe interpretar que está limitado a, un compuesto químico, una proteína, un peptidomimético, un anticuerpo, una ribozima, y una molécula de ácido nucleico antisentido. Un experto en la materia apreciaría fácilmente, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, que un activador de renalasa abarca un compuesto químico que aumenta el nivel, actividad enzimática, o actividad de unión a sustrato de renalasa. Además, un activador de renalasa abarca un compuesto químicamente modificado, y derivados, como sabe bien un experto en las técnicas químicas.
Un experto en la materia entenderá, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, que un aumento en el nivel de renalasa abarca el aumento en expresión de renalasa, incluyendo transcripción, traducción, o ambas. El experto en la materia también apreciará, una vez armado con las enseñanzas de la presente invención, que un aumento en el nivel de renalasa incluye un aumento en la actividad renalasa (por ejemplo, actividad enzimática, actividad de unión al sustrato, etc.). Por tanto, aumentar el nivel o actividad de renalasa incluye, pero no está limitado a, aumentar la cantidad de polipéptido renalasa, aumentar la transcripción, traducción, o ambas, de un ácido nucleico que codifica renalasa; y asimismo incluye aumentar cualquier actividad de un polipéptido renalasa también. Las composiciones activadoras de renalasa y métodos de la divulgación pueden activar selectivamente renalasa, o pueden activar tanto renalasa como otra molécula. Por tanto, la presente divulgación se refiere a la administración de un polipéptido renalasa, un polipéptido renalasa recombinante, un fragmento de polipéptido renalasa activo, o un activador de la expresión o actividad de renalasa.
Además, un experto en la materia apreciaría, cuando esté equipado con esta divulgación y los métodos ejemplificados en el presente documento, que un activador de renalasa incluye tales activadores que se descubran en el futuro, como se pueden identificar por criterios bien conocidos en la técnica de la farmacología, tal como los resultados fisiológicos de activación de renalasa como se describe en detalle en el presente documento y/o como se sabe en la técnica. Por tanto, la presente divulgación no está limitada en modo alguno a ningún activador particular de renalasa ejemplificado o divulgado en el presente documento; más bien, la divulgación abarca esos activadores que la persona de rutina entendería que son útiles como se sabe en la técnica y los descubiertos en el futuro.
Los expertos en la materia conocen bien métodos adicionales de identificar y producir un activador de renalasa incluyendo, pero no limitados a, obtener un activador de una fuente natural (por ejemplo, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Stylotella aurantium, etc.). Alternativamente, un activador de renalasa se puede sintetizar químicamente. Además, una persona de rutina apreciaría, basado en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que se puede obtener un activador de renalasa de un organismo recombinante. Las composiciones y métodos para sintetizar químicamente activadores de renalasa y para obtenerlos de fuentes naturales se conocen bien en la técnica y están descritos en la técnica.
Un experto en la materia apreciará que se puede administrar un activador como una sustancia química de molécula pequeña, una proteína, una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína, o combinaciones de las mismas. Se conocen bien numerosos vectores y otras composiciones y métodos para administrar una proteína o una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína a células o tejidos. Por tanto, la divulgación incluye un método de administrar una proteína o una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína que es un activador de renalasa. (Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York; Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).
Un experto en la materia se dará cuenta de que disminuir la cantidad o actividad de una molécula que ella misma disminuye la cantidad o actividad de renalasa puede servir para aumentar la cantidad o actividad de renalasa. Los oligonucleótidos antisentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias a alguna porción de una molécula de ARNm. Cuando están presentes en una célula, los oligonucleótidos antisentido hibridan con una molécula de ARNm existente e inhiben la traducción a un producto génico. Inhibir la expresión de un gen usando un oligonucleótido antisentido se conoce bien en la técnica (Marcus-Sekura, 1988, Anal. Biochem. 172:289), como son los métodos de expresar un oligonucleótido antisentido en una célula (Inoue, patente en EE UU No. 5.190.931). Los métodos de la divulgación incluyen el uso de oligonucleótidos antisentido para disminuir la cantidad de una molécula que produce una disminución en la cantidad o actividad renalasa, aumentando de esta manera la cantidad o actividad de renalasa. En la presente divulgación se contemplan oligonucleótidos antisentido que se sintetizan y proporcionan a la célula por métodos que conocen bien los expertos en la materia. Como un ejemplo, un oligonucleótido antisentido se puede sintetizar para que tenga entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100, más preferiblemente entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. La síntesis de moléculas de ácido nucleico se conoce bien en la técnica, como lo es la síntesis de oligonucleótidos antisentido modificados para mejorar la actividad biológica en comparación con oligonucleótidos antisentido sin modificar (Tullis, 1991, Patente en EE UU No.
5.023.243).
De forma similar, la expresión de un gen se puede inhibir por la hibridación de una molécula antisentido a un promotor u otro elemento regulador de un gen, afectando de esta manera la transcripción del gen. Los métodos para la identificación de un promotor u otro elemento regulador que interacciona con un gen de interés se conocen bien en la técnica, e incluyen tales métodos como el sistema del doble híbrido de levaduras (Bartel y Fields, eds., En: The Yeast Two Hybrid System, Oxford University Press, Cary, N.C.).
Alternativamente, la inhibición de un gen que expresa una proteína que disminuye el nivel o actividad de renalasa se puede lograr mediante el uso de una ribozima. Usar ribozimas para inhibir la expresión génica lo conocen bien los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Cech et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:17479; Hampel et al., 1989, Biochemistry 28: 4929; Altman et al., patente en EE UU No. 5.168.053). Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con la capacidad de cortar otras moléculas de ARN monocatenario. Se sabe que las ribozimas son específicas de secuencia, y pueden por tanto modificarse para reconocer una secuencia de nucleótidos específica (Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn. 260:3030), lo que permite el corte selectivo de moléculas específicas de ARNm. Dada la secuencia de nucleótidos de la molécula, un experto en la materia podría sintetizar un oligonucleótido antisentido o ribozima sin experimentación excesiva, proporcionada con la divulgación.
Un experto en la materia apreciará que un activador de renalasa, polipéptido renalasa, un polipéptido renalasa recombinante, o un fragmento de polipéptido renalasa activo se puede administrar individualmente o en cualquier combinación de los mismos. Un experto en la materia también apreciará que la administración puede ser aguda (por ejemplo, durante un periodo de tiempo corto, tal como un día, una semana o un mes) o crónica (por ejemplo, durante un periodo de tiempo largo, tal como varios meses o un año o más). Además, un polipéptido renalasa, un polipéptido renalasa recombinante, o un fragmento de polipéptido renalasa activo se puede administrar individualmente o en cualquier combinación de los mismos en un sentido temporal, en que se pueden administrar simultáneamente, antes y/o después de cada uno. Un experto en la materia apreciará, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, que un polipéptido renalasa, un polipéptido renalasa recombinante, o un fragmento de polipéptido renalasa activo se pueden usar, y que un activador se puede usar solo o en cualquier combinación con otro polipéptido renalasa, polipéptido renalasa recombinante, o fragmento de polipéptido renalasa activo, o activador de renalasa para producir un resultado terapéutico.
Un experto en la materia apreciará, armado con la presente divulgación incluyendo los métodos detallados en el presente documento, que la divulgación no está limitada al tratamiento de una enfermedad o trastorno una vez establecida. En particular, los síntomas de la enfermedad o trastorno no necesitan haberse manifestado al punto de daño al sujeto; en efecto, la enfermedad o trastorno no necesita detectarse en un sujeto antes de que se administre el tratamiento. Es decir, no se tiene que producir patología significativa de la enfermedad o trastorno antes de que la presente invención pueda proporcionar beneficio. Por tanto, la presente divulgación, como se describe más completamente en el presente documento, incluye un método para prevenir enfermedades y trastornos en un sujeto, en que una molécula de renalasa (por ejemplo, polipéptido, péptido, etc.), o un activador de renalasa, como se discute en otro sitio en el presente documento, se puede administrar a un sujeto antes del inicio de la enfermedad o trastorno, previniendo de esta manera que se desarrolle la enfermedad o trastorno.
Un experto en la materia, armado con la divulgación en el presente documento, apreciaría que la prevención de una enfermedad o trastorno en un sujeto abarca administrar a un sujeto un polipéptido renalasa, un polipéptido renalasa recombinante, un fragmento de polipéptido renalasa activo, o un activador de renalasa como una medida preventiva contra una enfermedad o trastorno.
Como se discute más completamente en otro sitio en el presente documento, los métodos de aumentar el nivel o actividad de una renalasa abarcan una amplia plétora de técnicas para aumentar no solo la actividad renalasa, sino también para aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica renalasa. Además, como se divulga en otro lugar en el presente documento, un experto en la materia entendería, una vez armado con las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que la presente divulgación abarca un método de prevenir una amplia variedad de enfermedades o trastornos donde la expresión y/o actividad aumentada de renalasa media, trata o previene una enfermedad o trastorno. Además, la divulgación abarca el tratamiento o prevención de tales enfermedades o trastornos descubiertos en el futuro.
La divulgación abarca la administración de un polipéptido renalasa, un polipéptido renalasa recombinante, un fragmento de polipéptido renalasa activo, o un activador de renalasa para practicar los métodos de la divulgación; el experto en la materia entendería, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, cómo formular y administrar el polipéptido renalasa, polipéptido renalasa recombinante, fragmento de polipéptido renalasa activo activador de renalasa apropiado a un sujeto. Sin embargo, la presente invención no está limitada a ningún método particular de administración o pauta de tratamiento. Esto es especialmente cierto donde un experto en la materia lo apreciaría, equipado con la divulgación proporcionada en el presente documento, incluyendo la reducción a práctica usando un modelo reconocido en la técnica de lesión por isquemia-reperfusión, métodos de administrar un polipéptido renalasa, un polipéptido renalasa recombinante, un fragmento de polipéptido renalasa activo, o un activador de renalasa que puede determinar un experto en la materia.
Como se usa en el presente documento, el término “soporte farmacéuticamente aceptable” significa una composición química con la que se puede combinar un modulador de renalasa apropiado y que, después de la combinación, se puede usar para administrar el modular de renalasa apropiado del mismo, a un sujeto.
Métodos de diagnóstico
En algunos ejemplos, se usa un cambio (es decir, aumento o disminución) en el nivel de renalasa comparado con un comparador en los métodos de la divulgación como marcador para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno renal, o una enfermedad o trastorno cardiaco, así como para seguir el tratamiento de enfermedad o trastorno renal o cardiaco.
En un ejemplo, la divulgación es un método de diagnosticar una enfermedad o trastorno renal, o una enfermedad o trastorno cardiaco, de un sujeto evaluando el nivel de renalasa en una muestra biológica del sujeto. En un ejemplo la muestra biológica del sujeto es un fluido corporal. Los ejemplos no limitantes de fluidos corporales en los que se puede evaluar el nivel de renalasa incluyen, pero no están limitados a, sangre, suero, plasma y orina. En varios ejemplos, el nivel de renalasa en la muestra biológica del sujeto se compara con el nivel de renalasa en un comparador. Los ejemplos no limitantes de comparadores incluyen, pero no están limitados a, un control negativo, un control positivo, un valor de fondo normal esperado del sujeto, un valor de fondo normal histórico del sujeto, un valor de fondo normal esperado de una población de la que el sujeto es un miembro, o un valor de fondo normal histórico de una población de la que el sujeto es un miembro.
En otro ejemplo, la divulgación es un método de seguir la evolución de una enfermedad o trastorno renal, o una enfermedad o trastorno cardiaco, de un sujeto evaluando el nivel de renalasa en una muestra biológica del sujeto. En un ejemplo la muestra biológica del sujeto es un fluido corporal. Los ejemplos no limitantes de fluidos corporales en los que se puede evaluar el nivel de renalasa incluyen, pero no están limitados a, sangre, suero, plasma y orina. En varios ejemplos, el nivel de renalasa en la muestra biológica del sujeto se compara con el nivel de renalasa en un comparador. Los ejemplos no limitantes de comparadores incluyen, pero no están limitados a, un control negativo, un control positivo, un valor de fondo normal esperado del sujeto, un valor de fondo normal histórico del sujeto, un valor de fondo normal esperado de una población de la que el sujeto es un miembro, o un valor de fondo normal histórico de una población de la que el sujeto es un miembro.
En un ejemplo adicional, la divulgación es un método de evaluar la gravedad de una enfermedad o trastorno renal, o una enfermedad o trastorno cardiaco, de un sujeto evaluando el nivel de renalasa en una muestra biológica del sujeto. En un ejemplo la muestra biológica del sujeto es un fluido corporal. Los ejemplos no limitantes de fluidos corporales en los que se puede evaluar el nivel de renalasa incluyen, pero no están limitados a, sangre, suero, plasma y orina. En varios ejemplos, el nivel de renalasa en la muestra biológica del sujeto se compara con el nivel de renalasa en un comparador. Los ejemplos no limitantes de comparadores incluyen, pero no están limitados a, un control negativo, un control positivo, un valor de fondo normal esperado del sujeto, un valor de fondo normal histórico del sujeto, un valor de fondo normal esperado de una población de la que el sujeto es un miembro, o un valor de fondo normal histórico de una población de la que el sujeto es un miembro.
En otro ejemplo, la divulgación es un método de seleccionar una pauta de tratamiento para tratar una enfermedad o trastorno renal, o una enfermedad o trastorno cardiaco, de un sujeto evaluando el nivel de renalasa en una muestra biológica del sujeto. En un ejemplo la muestra biológica del sujeto es un fluido corporal. Los ejemplos no limitantes de fluidos corporales en los que se puede evaluar el nivel de renalasa incluyen, pero no están limitados a, sangre, suero, plasma y orina. En varios ejemplos, el nivel de renalasa en la muestra biológica del sujeto se compara con el nivel de renalasa en un comparador. Los ejemplos no limitantes de comparadores incluyen, pero no están limitados a, un control negativo, un control positivo, un valor de fondo normal esperado del sujeto, un valor de fondo normal histórico del sujeto, un valor de fondo normal esperado de una población de la que el sujeto es un miembro, o un valor de fondo normal histórico de una población de la que el sujeto es un miembro.
En otro ejemplo, la divulgación es un método de seguir el efecto de un tratamiento de una enfermedad o trastorno renal, o una enfermedad o trastorno cardiaco, de un sujeto evaluando el nivel de renalasa en una muestra biológica del sujeto. En un ejemplo la muestra biológica del sujeto es un fluido corporal. Los ejemplos no limitantes de fluidos corporales en los que se puede evaluar el nivel de renalasa incluyen, pero no están limitados a, sangre, suero, plasma y orina. En varios ejemplos, el nivel de renalasa en la muestra biológica del sujeto se compara con el nivel de renalasa en un comparador. Los ejemplos no limitantes de comparadores incluyen, pero no están limitados a, un control negativo, un control positivo, un valor de fondo normal esperado del sujeto, un valor de fondo normal histórico del sujeto, un valor de fondo normal esperado de una población de la que el sujeto es un miembro, o un valor de fondo normal histórico de una población de la que el sujeto es un miembro.
En varios ejemplos, el sujeto es un sujeto humano, y puede ser de cualquier raza, sexo y edad. Los sujetos representativos incluyen los que se sospecha que han experimentado una lesión renal o cardiaca, tal como lesión IR, los han sido diagnosticados como que han experimentado una lesión renal o cardiaca, tal como lesión IR, los que han sido diagnosticados como que tienen una enfermedad o trastorno asociado con una lesión renal o cardiaca, tal como lesión IR, y los que están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con una lesión renal o cardiaca, tal como lesión IR.
La información obtenida de los métodos de la divulgación descritos en el presente documento se puede usar sola, o en combinación con otra información (por ejemplo, estado de enfermedad, antecedentes de enfermedad, constantes vitales, análisis de sangre, etc.) del sujeto o de la muestra biológica obtenida del sujeto.
En los métodos diagnósticos de la divulgación, una muestra biológica obtenida de un sujeto se evalúa para el nivel de renalasa contenido en la misma. En un ejemplo, la muestra biológica es una muestra que contiene al menos un fragmento de un polipéptido renalasa útil en los métodos descritos en el presente documento.
En otros varios ejemplos de los métodos de la divulgación, se determina que el nivel de renalasa está reducido cuando el nivel de renalasa está reducido en al menos el 10%, en al menos el 20%, en al menos el 30%, en al menos el 40%, en al menos el 50%, en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, en al menos el 90%, o en al menos el 100%, cuando se compara con un control comparador. En varios ejemplos, un nivel reducido de renalasa es indicativo de una enfermedad o trastorno.
En otros varios ejemplos de los métodos de la divulgación, se determina que el nivel de renalasa está aumentado cuando el nivel de renalasa está aumentado en al menos el 10%, en al menos el 20%, en al menos el 30%, en al menos el 40%, en al menos el 50%, en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, en al menos el 90%, o en al menos el 100%, cuando se compara con un control comparador. En varios ejemplos, un nivel aumentado de renalasa es indicativo de una enfermedad o trastorno.
En los métodos de la divulgación, una muestra biológica de un sujeto se evalúa para el nivel de renalasa en la muestra biológica obtenida del paciente. El nivel de renalasa en la muestra biológica se puede determinar evaluando la cantidad de polipéptido renalasa en la muestra biológica, la cantidad de ARNm de renalasa en la muestra biológica, la cantidad de actividad enzimática renalasa en la muestra biológica, o una combinación de las mismas.
En varios ejemplos de los métodos de la divulgación, los métodos de medir los niveles de renalasa en una muestra biológica obtenida de un paciente incluyen, pero no están limitados a, un ensayo de inmunocromatografía, un ensayo de inmunomancha, un ensayo Luminex, un ensayo ELISA, un ensayo ELISPOT, un ensayo de micromatriz de proteínas, un ensayo de inmunotransferencia, un ensayo de espectrometría de masas, un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo de radioinmunodifusión, un ensayo de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem, un ensayo de inmunodifusión de Ouchterlony, micromatriz de proteína de fase inversa, un ensayo de inmunoelectroforesis cohete, un ensayo de inmunohistotinción, un ensayo de inmunoprecipitación, un ensayo de fijación del complemento, FACS, un ensayo de unión enzima-sustrato, un ensayo enzimático, un ensayo enzimático empleando una molécula detectable, tal como un cromóforo, fluoróforo, o sustrato radioactivo, un ensayo de unión a sustrato empleando tal sustrato, un ensayo de desplazamiento de sustrato empleando tal sustrato, y un ensayo de chip de proteínas (véase también, 2007, Van Emon, Immunoassay and Other Bioanalytical Techniques, CRC Press; 2005, Wild, Immunoassay Handbook, Gulf Professional Publishing; 1996, Diamandis y Christopoulos, Immunoassay, Academic Press; 2005, Joos, Microarrays in Clinical Diagnosis, Humana Press; 2005, Hamdan y Righetti, Proteomics Today, John Wiley and Sons; 2007).
Composiciones y métodos de inhibidor terapéutico
En varios ejemplos, la presente divulgación incluye composiciones de inhibidor de renalasa y métodos de tratar o prevenir una enfermedad o trastorno donde se desea una actividad o nivel disminuido de renalasa. Un ejemplo no limitante de una enfermedad o trastorno donde se desea una actividad o nivel disminuido de renalasa que se puede tratar o prevenir con las composiciones y métodos de la divulgación incluye cáncer. En varios ejemplos, las composiciones de inhibidor de renalasa y métodos de tratamiento o prevención de la divulgación disminuyen la cantidad de polipéptido renalasa, la cantidad de ARNm de renalasa, la cantidad de actividad enzimática renalasa, la cantidad de actividad de unión a sustrato de renalasa, o una combinación de las mismas.
Un experto en la materia entenderá, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, que una disminución en los niveles de renalasa abarca la disminución en la expresión de renalasa, incluyendo transcripción, traducción, o ambas. El experto en la materia también apreciará, una vez armado con las enseñanzas de la presente invención, que una disminución en el nivel de renalasa incluye una disminución en la actividad renalasa (por ejemplo, actividad enzimática, actividad de unión a sustrato, etc.). Por tanto, disminuir el nivel o actividad de renalasa incluye, pero no está limitado a, disminuir la transcripción, traducción, o ambas, de un ácido nucleico que codifica renalasa; y también incluye disminuir cualquier actividad de un péptido de renalasa igualmente. Las composiciones de inhibidor de renalasa y métodos de la divulgación pueden selectivamente inhibir renalasa, o pueden inhibir tanto renalasa como otra molécula.
La inhibición de renalasa se puede evaluar usando una amplia variedad de métodos, incluyendo los divulgados en el presente documento, así como métodos conocidos en la técnica o que se van a desarrollar en el futuro. Es decir, la persona de rutina apreciaría, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, que disminuir el nivel o actividad de renalasa se puede evaluar fácilmente usando métodos que evalúan el nivel de un ácido nucleico que codifica renalasa (por ejemplo, ARNm), el nivel de un polipéptido renalasa presente en una muestra biológica, el nivel de actividad renalasa (por ejemplo, actividad enzimática, actividad de unión a sustrato, etc.), o una combinación de los mismos.
Un experto en la materia, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, entendería que la divulgación es útil en tratar o prevenir en un sujeto en necesidad de ello, esté o no el sujeto siendo tratado con otra medicación o terapia. Además, el experto en la materia apreciaría también, basado en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que las enfermedades o trastornos tratables por las composiciones y métodos descritos en el presente documento abarcan cualquier enfermedad o trastorno donde la renalasa desempeña un papel y donde un nivel o actividad de renalasa disminuido fomentará un desenlace terapéutico positivo.
Las composiciones de inhibidor de renalasa y métodos de la divulgación que disminuyen el nivel o actividad (por ejemplo, actividad enzimática, actividad de unión a sustrato, etc.) de renalasa incluyen, pero se debe interpretar que están limitadas a, un compuesto químico, una proteína, un péptido, un peptidomimético, un anticuerpo, una ribozima, un compuesto químico de molécula pequeña, una molécula de ácido nucleico antisentido (por ejemplo, ARNip, miARN, etc.), o combinaciones de los mismos. Un experto en la materia apreciaría fácilmente, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, que una composición de inhibidor de renalasa abarca un compuesto químico que disminuye el nivel o actividad de renalasa. Además, una composición de inhibidor de renalasa abarca un compuesto químicamente modificado, y derivados, como sabe bien un experto en las técnicas químicas.
Las composiciones de inhibidor de renalasa y métodos de la divulgación que disminuyen el nivel o actividad (por ejemplo, actividad enzimática, actividad de unión a sustrato, etc.) de renalasa incluyen anticuerpos. Los anticuerpos de la divulgación incluyen una variedad de formas de anticuerpos incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos intracelulares (“intracuerpos”), Fv, Fab y F(ab)2, anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos de cadena pesada (tal como anticuerpos de camélidos), anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos humanizados. En un ejemplo, el anticuerpo de la divulgación es un anticuerpo que se une específicamente a renalasa.
Además, un experto en la materia, equipado con esta divulgación y los métodos ejemplificados en el presente documento, apreciaría que una composición de inhibidor de renalasa incluye tales inhibidores que se descubran en el futuro, que se pueden identificar por criterios bien conocidos en el arte de la farmacología, tal como los resultados fisiológicos de inhibición de renalasa descritos en detalle en el presente documento y/o conocidos en la técnica. Por tanto, la presente divulgación no está limitada en modo alguno a ninguna composición de inhibidor de renalasa particular ejemplificada o divulgada en el presente documento; más bien, la divulgación abarca esas composiciones inhibidoras que una persona de rutina entendería que son útiles como se sabe en la técnica y según se descubran en el futuro.
Los expertos en la materia conocen bien métodos adicionales de identificar y producir composiciones inhibidoras de renalasa incluyendo, pero no limitados a, obtener un inhibidor de una fuente natural (por ejemplo, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Stylotella aurantium, etc.). Alternativamente, un inhibidor de renalasa se puede sintetizar químicamente. Además, una persona de rutina apreciaría, basado en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que se puede obtener una composición inhibidora de renalasa de un organismo recombinante. Las composiciones y métodos para sintetizar químicamente inhibidores de renalasa y para obtenerlos de fuentes naturales se conocen bien en la técnica y están descritos en la técnica.
Un experto en la materia apreciará que se puede administrar un inhibidor como una sustancia química de molécula pequeña, una proteína, un anticuerpo, una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína, un ácido nucleico antisentido, una construcción de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico antisentido, o combinaciones de las mismas. Se conocen bien numerosos vectores y otras composiciones y métodos para administrar una proteína o una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína a células o tejidos. Por tanto, la divulgación incluye un método de administrar una proteína o una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína que es un inhibidor de renalasa. (Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York; Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).
Un experto en la materia se dará cuenta de que disminuir la cantidad o actividad de una molécula que ella misma aumenta la cantidad o actividad de renalasa puede servir en las composiciones y métodos de la presente divulgación para disminuir la cantidad o actividad de renalasa.
Los oligonucleótidos antisentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias a alguna porción de una molécula de ARN. Cuando están presentes en una célula, los oligonucleótidos antisentido hibridan con una molécula de ARN existente e inhiben la traducción a un producto génico. Inhibir la expresión de un gen usando un oligonucleótido antisentido se conoce bien en la técnica (Marcus-Sekura, 1988, Anal. Biochem. 172:289), como son los métodos de expresar un oligonucleótido antisentido en una célula (Inoue, patente en EE UU No. 5.190.931). Los métodos de la divulgación incluyen el uso de un oligonucleótido antisentido para disminuir la cantidad de renalasa o para disminuir la cantidad de una molécula que produce un aumento en la cantidad o actividad renalasa, disminuyendo de esta manera la cantidad o actividad de renalasa.
En la presente divulgación se contemplan oligonucleótidos antisentido que se sintetizan y proporcionan a la célula por métodos que conocen bien los expertos en la materia. Como un ejemplo, un oligonucleótido antisentido se puede sintetizar para que tenga entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100, más preferiblemente entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. La síntesis de moléculas de ácido nucleico se conoce bien en la técnica, como lo es la síntesis de oligonucleótidos antisentido modificados para mejorar la actividad biológica en comparación con oligonucleótidos antisentido sin modificar (Tullis, 1991, Patente en EE UU No.
5.023.243).
De forma similar, la expresión de un gen se puede inhibir por la hibridación de una molécula antisentido a un promotor u otro elemento regulador de un gen, afectando de esta manera la transcripción del gen. Los métodos para la identificación de un promotor u otro elemento regulador que interacciona con un gen de interés se conocen bien en la técnica, e incluyen tales métodos como el sistema del doble híbrido de levaduras (Bartel y Fields, eds., En: The Yeast Two Hybrid System, Oxford University Press, Cary, N.C.).
Alternativamente, la inhibición de un gen que expresa renalasa, o de un gen que expresa una proteína que aumenta el nivel o actividad de renalasa, se puede lograr mediante el uso de una ribozima. Usar ribozimas para inhibir la expresión génica lo conocen bien los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Cech et al., 1992, J. Biol. Chem.
267:17479; Hampel et al., 1989, Biochemistry 28: 4929; Altman et al., patente en EE UU No. 5.168.053). Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con la capacidad de cortar otras moléculas de ARN monocatenario. Se sabe que las ribozimas son específicas de secuencia, y pueden por tanto modificarse para reconocer una secuencia de nucleótidos específica (Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn. 260:3030), lo que permite el corte selectivo de moléculas específicas de ARNm. Dada la secuencia de nucleótidos de la molécula, un experto en la materia podría sintetizar un oligonucleótido antisentido o ribozima sin experimentación excesiva, proporcionada con la divulgación.
Un experto en la materia apreciará que los inhibidores de renalasa se pueden administrar de forma aguda (por ejemplo, durante un periodo de tiempo corto, tal como un día, una semana o un mes) o crónica (por ejemplo, durante un periodo de tiempo largo, tal como varios meses o un año o más). Un experto en la materia apreciará que los inhibidores de renalasa se pueden administrar individualmente o en cualquier combinación con otros agentes. Además, los inhibidores de renalasa se pueden administrar individualmente o en cualquier combinación en un sentido temporal, en que se pueden administrar al mismo tiempo, o antes y/o después de cada uno. Un experto en la materia apreciará, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, que las composiciones inhibidoras de renalasa se pueden usar para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto en necesidad de ello, y que una composición inhibidora se puede usar sola o en cualquier combinación con otro inhibidor para efectuar un resultado terapéutico.
En varios ejemplos, cualquiera de los inhibidores de renalasa de la divulgación descritos en el presente documento se puede administrar solo o en combinación con otros inhibidores u otras moléculas asociadas con cáncer.
Un experto en la materia apreciará, armado con la presente divulgación incluyendo los métodos detallados en el presente documento, que la divulgación no está limitada al tratamiento de una enfermedad o trastorno una vez establecida. En particular, la enfermedad o trastorno no necesitan haberse manifestado al punto de daño al sujeto; en efecto, la enfermedad o trastorno no necesita detectarse en un sujeto antes de que se administre el tratamiento. Es decir, no se tiene que producir patología significativa de la enfermedad o trastorno antes de que la presente invención pueda proporcionar beneficio. Por tanto, la presente divulgación incluye un método para prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto, en que una composición inhibidora de renalasa, como se discute previamente en otro sitio en el presente documento, se puede administrar a un sujeto antes del inicio de la enfermedad o trastorno, previniendo de esta manera que se desarrolle la enfermedad o trastorno. Los métodos preventivos descritos en el presente documento también incluyen el tratamiento de un sujeto que está en remisión para la prevención de una recaída de una enfermedad o trastorno.
Un experto en la materia, armado con la divulgación en el presente documento, apreciaría que la prevención de una enfermedad o trastorno abarca administrar a un sujeto una composición inhibidora de renalasa como una medida preventiva contra una enfermedad o trastorno. Como se discute más completamente en otro sitio en el presente documento, los métodos de disminuir el nivel o actividad de una renalasa abarcan una amplia plétora de técnicas para disminuir no solo la actividad renalasa, sino también para disminuir la expresión de un ácido nucleico que codifica renalasa, incluyendo o bien una disminución en la transcripción, una disminución en la traducción, o ambas.
Además, como se divulga en otro lugar en el presente documento, un experto en la materia entendería, una vez armado con las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que la presente divulgación abarca un método de prevenir una amplia variedad de enfermedades, trastornos y patologías donde una disminución en la expresión y/o actividad de renalasa media, trata o previene una enfermedad, trastorno o patología. Los métodos para evaluar si una enfermedad está relacionada con los niveles o actividad de renalasa se conocen en la técnica. Además, la invención abarca el tratamiento o prevención de tales enfermedades descubiertas en el futuro.
La divulgación abarca la administración de un inhibidor de renalasa para practicar los métodos de la divulgación; el experto en la materia entendería, basado en la divulgación proporcionada en el presente documento, cómo formular y administrar el inhibidor de renalasa apropiado a un sujeto. Sin embargo, la presente invención no está limitada a ningún método particular de administración o pauta de tratamiento.
Kits
La presente divulgación también se refiere a kits útiles en los métodos de la divulgación. Tales kits comprenden varias combinaciones de componentes útiles en cualquiera de los métodos descritos en otro sitio en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, un activador de renalasa, un inhibidor de renalasa, materiales para analizar cuantitativamente polipéptido renalasa o ácido nucleico de renalasa, materiales para evaluar la actividad de un polipéptido renalasa o un ácido nucleico de renalasa, y material instructivo. Por ejemplo, en un ejemplo, el kit comprende componentes útiles para la cuantificación de ácido nucleico de renalasa en una muestra biológica. En otro ejemplo, el kit comprende componentes útiles para la cuantificación de polipéptido renalasa en una muestra biológica. En un ejemplo adicional, el kit comprende componentes útiles para la evaluación de la actividad (por ejemplo, actividad enzimática, actividad de unión a sustrato, etc.) de un polipéptido renalasa en una muestra biológica.
En un ejemplo adicional, el kit comprende los componentes de un ensayo para seguir la eficacia de un tratamiento administrado a un sujeto en necesidad de ello, que contiene material instructivo y los componentes para determinar si el nivel de renalasa en una muestra biológica obtenida del sujeto se modula durante o después de la administración del tratamiento. En varios ejemplos, para determinar si el nivel de renalasa está modulado en una muestra biológica obtenida del sujeto, el nivel de renalasa se compara con el nivel de al menos un control comparador contenido en el kit, tal como un control positivo, un control negativo, un control histórico, una norma histórica, o el nivel de otra molécula de referencia en la muestra biológica. En ciertos ejemplos, la proporción de renalasa y una molécula de referencia se determina para ayudar en el seguimiento del tratamiento.
Composición farmacéutica y administración
Las composiciones que comprenden un polipéptido renalasa, un fragmento de polipéptido renalasa, un activador del nivel o actividad de renalasa, o un inhibidor del nivel o actividad de renalasa se pueden formular y administrar a un sujeto, como se describe ahora. A modo de ejemplos no limitantes, una composición identificada como una renalasa activa o activador útil, incluyendo polipéptidos renalasa, polipéptidos renalasa recombinantes, y fragmentos de polipéptidos renalasa activos, para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o trastorno se puede formular y administrar a un sujeto, como se describe ahora. A modo de más ejemplos no limitantes, una composición identificada como un inhibidor de renalasa útil, incluyendo un compuesto químico, una proteína, un péptido, un peptidomimético, un anticuerpo, una ribozima, un compuesto químico de molécula pequeña, y una molécula de ácido nucleico antisentido (por ejemplo, ARNip, miARN, etc.), para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o trastorno se puede formular y administrar a un sujeto, como se describe ahora.
La divulgación abarca la preparación y uso de composiciones farmacéuticas que comprenden una composición útil para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno, divulgada en el presente documento como un principio activo. Tal composición farmacéutica puede consistir en el principio activo solo, en una forma adecuada para la administración a un sujeto, o la composición farmacéutica puede comprender el principio activo y uno o más soportes farmacéuticamente aceptables, uno o más ingredientes adicionales, o alguna combinación de estos. El principio activo puede estar presente en la composición farmacéutica en forma de un éster o sal fisiológicamente aceptable, tal como en combinación con un catión o anión fisiológicamente aceptable, como se sabe bien en la técnica. En varios ejemplos, el principio activo es un polipéptido renalasa, un fragmento de polipéptido renalasa, un activador del nivel o actividad de renalasa, un inhibidor del nivel o actividad de renalasa, o una combinación de los mismos, como se describe en otro lugar en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “soporte farmacéuticamente aceptable” significa una composición química con la que un modulador de renalasa apropiado del mismo, se puede combinar y que, después de la combinación, se puede usar para administrar el modulador de renalasa apropiado (por ejemplo, activador, inhibidor, etc.) del mismo, a un sujeto.
Las composiciones farmacéuticas útiles para practicar la invención se pueden administrar para distribuir una dosis de entre aproximadamente 0,1 ng/kg/día y 100 mg/kg/día, o más.
En varios ejemplos, las composiciones farmacéuticas útiles en los métodos de la divulgación se pueden administrar, a modo de ejemplo, por vía sistémica, parenteral, o tópica, tal como en formulaciones orales, formulaciones inhaladas, incluyendo sólidas o aerosol, y por formulaciones tópicas u otras similares. Además de la composición terapéutica apropiada, tales composiciones farmacéuticas pueden contener soportes farmacéuticamente aceptables y otros ingredientes que se sabe que aumentan y facilitan la administración de fármacos. Otras formulaciones posibles, tal como nanopartículas, liposomas, eritrocitos resellados, y sistemas inmunológicos, también se pueden usar para administrar un modulador apropiado del mismo, según los métodos de la divulgación.
Como se usa en el presente documento, el término éster o sal “fisiológicamente aceptable” significa un éster o sal del principio activo que es compatible con cualquier otro ingrediente de la composición farmacéutica, que no es dañino para el sujeto al que se va a administrar la composición.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar por cualquier método conocido o desarrollado después de esto en la técnica de la farmacología. En general, tales métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el principio activo con un soporte o uno o más otros ingredientes accesorios, y después, si es necesario o deseable, dar forma o embalar el producto en una unidad mono o multidosis deseada.
Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se dirigen principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para administración ética a seres humanos, el experto en la materia entenderá que tales composiciones son en general adecuadas para administración a animales de todos los tipos. La modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a seres humanos con el fin de hacer las composiciones adecuadas para la administración a varios animales se comprende bien, y el farmacólogo veterinario experto puede diseñar y realizar tal modificación con solamente experimentación normal, si alguna.
Las composiciones farmacéuticas que son útiles en los métodos de la divulgación se pueden preparar, embalar o vender en formulaciones adecuadas para las rutas de administración oral, rectal, vaginal, parenteral, tópica, pulmonar, intranasal, yugal, intravenosa, transdérmica, subcutánea, intramuscular, oftálmica, intratecal y otras conocidas. Otras formulaciones contempladas incluyen nanopartículas proyectadas, preparaciones liposómicas, eritrocitos resellados que contienen el principio activo, y formulaciones con base inmunológica.
Una composición farmacéutica de la invención se puede preparar, embalar, o vender a granel, como una dosis unitaria individual o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se usa en el presente documento, una “dosis unitaria” es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad del principio activo en general es igual a la dosis del principio activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de tal dosis tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosis.
Las cantidades relativas del principio activo, el soporte farmacéuticamente aceptable, y cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de la invención variará, dependiendo de la identidad, tamaño y estado del sujeto tratado y además dependiendo de la vía por la que se va a administrar la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1% y el 100% (p/p) de principio activo.
Además del principio activo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender además uno o más agentes farmacéuticamente activos adicionales.
Se pueden hacer formulaciones de liberación controlada o sostenida de una composición farmacéutica de la invención usando tecnología convencional.
Una formulación de una composición farmacéutica de la invención adecuada para la administración oral se puede preparar, embalar, o vender en forma de una dosis unitaria sólida discreta incluyendo, pero no limitada a, un comprimido, una cápsula dura o blanda, un sello, una pastilla o una tableta, que cada una contiene una cantidad predeterminada del principio activo. Otras formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen, pero no están limitadas a, una formulación en polvo o granular, una suspensión acuosa u oleaginosa, una solución acuosa u oleaginosa, o una emulsión.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no están limitados a, diluyentes inertes, agentes de granulación y disgregantes, agentes aglutinantes, y agentes lubricantes. Los agentes de dispersión conocidos incluyen, pero no están limitados a, fécula de patata y glicolato sódico de almidón. Los agentes tensioactivos conocidos incluyen, pero no están limitados a, lauril sulfato de sodio. Los diluyentes conocidos incluyen, pero no están limitados a, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, celulosa microcristalina, fosfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, y fosfato de sodio. Los agentes de granulación y disgregantes conocidos incluyen, pero no están limitados a, almidón de maíz y ácido algínico. Los agentes aglutinantes conocidos incluyen, pero no están limitados a, gelatina, goma arábiga, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona e hidroxipropilmetilcelulosa. Los agentes lubricantes conocidos incluyen, pero no están limitados a, estearato de magnesio, ácido esteárico, sílice y talco.
Las formulaciones líquidas de una composición farmacéutica de la invención se pueden preparar, embalar y vender o bien en forma líquida o en forma de un producto seco pretendido para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso.
Se pueden preparar suspensiones líquidas usando métodos convencionales para lograr la suspensión del principio activo en un vehículo acuoso u oleaginoso. Los vehículos acuosos incluyen, por ejemplo, agua y solución salina isotónica. Los vehículos oleaginosos incluyen, por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleaginosos, alcohol etílico, aceites vegetales tal como cacahuete, oliva, sésamo, o coco, aceites vegetales fraccionados, y aceites de vaselina tal como parafina líquida. Las suspensiones líquidas pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero no limitado a, agentes de suspensión, agentes dispersantes o humectantes, agentes emulsionantes, demulcentes, conservantes, tampones, sales, saborizantes, agentes colorantes, y agentes edulcorantes. Las suspensiones oleaginosas pueden además comprender un agente espesante.
Los agentes de suspensión conocidos incluyen, pero no están limitados a, jarabe de sorbitol, grasas comestibles hidrogenadas, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto, goma arábiga, y derivados de celulosa tal como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, e hidroxipropilmetilcelulosa. Los agentes dispersantes o humectantes conocidos incluyen, pero no están limitados a, fosfátidos naturales tal como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso, con un alcohol alifático de cadena larga, con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol, o con un éster parcial derivado de un ácido graso y una anhídrido de hexitol (por ejemplo, estearato de polioxietileno, heptadecaetilenoxicetanol, monooleato de sorbitol polioxietileno, y monooleato sorbitano polioxietileno). Los agentes emulsionantes conocidos incluyen, pero no están limitados a, lecitina y goma arábiga. Los conservantes conocidos incluyen, pero no están limitados a, para-hidroxibenzoatos de metilo, etilo o n-propilo, ácido ascórbico, y ácido sórbico. Los agentes edulcorantes conocidos incluyen, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol, sacarosa, y sacarina. Los agentes espesantes conocidos para suspensiones oleaginosas incluyen, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura, y alcohol cetílico.
Se pueden preparar soluciones líquidas del principio activo en solventes acuosos u oleaginosos sustancialmente de la misma manera que las suspensiones líquidas, siendo la diferencia primaria que el principio activo se disuelve, más que suspenderse en el solvente. Las soluciones líquidas de la composición farmacéutica de la invención pueden comprender cada uno de los componentes descritos con respecto a las suspensiones líquidas, entendiéndose que los agentes de suspensión no ayudarán necesariamente en la disolución del principio activo en el solvente. Los solventes acuosos incluyen, por ejemplo, agua y solución salina isotónica. Los solventes oleaginosos incluyen, por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleaginosos, alcohol etílico, aceites vegetales tal como cacahuete, oliva, sésamo, o coco, aceites vegetales fraccionados, y aceites de vaselina tal como parafina líquida.
Se pueden preparar formulaciones en polvo y granulares de una preparación farmacéutica de la invención usando métodos conocidos. Tales formulaciones se pueden administrar directamente a un sujeto, usadas, por ejemplo, para formar comprimidos, para rellenar cápsulas, o para preparar una suspensión o solución acuosa u oleaginosa por adición de un vehículo acuoso u oleaginoso a la misma. Cada una de estas formulaciones puede además comprender uno o más de agente dispersante o humectante, un agente de suspensión, y un conservante. También pueden estar incluidos en estas formulaciones excipientes adicionales, tal como rellenos y agentes edulcorantes, saborizantes, o colorantes.
Una composición farmacéutica de la invención también se puede preparar, embalar, o vender en la forma de una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite. La fase oleaginosa puede ser un aceite vegetal tal como aceite de oliva o cacahuete, un aceite de vaselina tal como parafina líquida, o una combinación de estos. Tales composiciones pueden además comprender uno o más agentes emulsionantes tal como gomas naturales tal como goma arábiga o goma tragacanto, fosfátidos naturales tal como fosfátido de soja o lecitina, ésteres o ésteres parciales derivados de combinaciones de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tal como monooleato sorbitano, y productos de condensación de tales ésteres parciales con óxido de etileno tal como monooleato sorbitano polioxietileno. Estas emulsiones también pueden contener ingredientes adicionales incluyendo, por ejemplo, agentes edulcorantes o saborizantes.
Los métodos para impregnar o recubrir un material con una composición química se conocen en la técnica, e incluyen, pero no están limitados a, métodos de depositar o unir una composición química en una superficie, métodos de incorporar una composición química en la estructura de un material durante la síntesis del material (es decir, tal como con un material fisiológicamente degradable), y métodos de absorber una solución o suspensión acuosa u oleaginosa en un material absorbente, con o sin posterior secado.
Como se usa en el presente documento, “administración parenteral” de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la ruptura física de un tejido de un sujeto y administración de la composición farmacéutica a través de la ruptura en el tejido. La administración parenteral incluye así, pero no está limitada a, administración de una composición farmacéutica por inyección de la composición, por aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, por aplicación de la composición a través de una herida no quirúrgica que penetra el tejido, y similar. En particular, se contempla que la administración parenteral incluya, pero no está limitada a, inyección cutánea, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intracisternal, y técnicas de infusión dialíticas de riñón.
Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para la administración parenteral comprenden el principio activo combinado con un soporte farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Tales formulaciones se pueden preparar, embalar o vender en una forma adecuada para administración en embolada o para la administración continua. Las formulaciones inyectables se pueden preparar, embalar, o vender en forma farmacéutica unitaria, tal como en ampollas o en envases multidosis que contienen un conservante. Las formulaciones para la administración parenteral incluyen, pero no están limitadas a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos, pastas, y formulaciones de liberación sostenida o biodegradables implantables. Tales formulaciones pueden además comprender uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero no limitados a, agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. En una forma de realización de una formulación para administración parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (es decir, polvo o granular) para reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril sin pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida.
Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, embalar, o vender en forma de una suspensión o solución acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución se puede formular según la técnica conocida, y puede comprender, además del principio activo, ingredientes adicionales tal como agentes dispersantes, agentes humectantes, o agentes de suspensión descritos en el presente documento. Tales formulaciones inyectables estériles se pueden preparar usando un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, tal como agua o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y solventes aceptables incluyen, pero no están limitados a, solución de Ringer, solución de cloruro de sodio isotónica, y aceites no volátiles tal como mono- y diglicéridos sintéticos. Otras formulaciones parenteralmente administrables que son útiles incluyen las que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparación liposómica, o como un componente de sistemas de polímeros biodegradables. Las composiciones para la liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrofóbicos farmacéuticamente aceptables tal como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero apenas soluble, o una sal apenas soluble.
Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen, pero no están limitadas a, preparaciones líquidas o semilíquidas tal como linimentos, lociones, emulsiones de aceite en agua o agua en aceite tal como cremas, pomadas o pastas, y soluciones o suspensiones. Las formulaciones administrables por vía tópica pueden, por ejemplo, comprender desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 10% (p/p) de principio activo, aunque la concentración del principio activo puede ser tan alta como el límite de solubilidad del principio activo en el solvente. Las formulaciones para la administración tópica pueden además comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento.
Una composición farmacéutica de la invención se puede preparar, embalar, o vender en una formulación adecuada para la administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Tal formulación puede comprender partículas secas que comprenden el principio activo y que tienen un diámetro en el intervalo desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 7 nanómetros, y preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 nanómetros. Tales composiciones están convenientemente en forma de polvos secos para administración usando un dispositivo que comprende un depósito de polvo seco al que se puede dirigir una corriente de propelente para dispersar el polvo usando un solvente autopropelente/envase dispensador de polvo tal como un dispositivo que comprende el principio activo disuelto o suspendido en un propelente de bajo punto de ebullición en un envase sellado. Preferiblemente, tales polvos comprenden partículas en donde al menos el 98% de las partículas en peso tienen un diámetro mayor de 0,5 nanómetros y al menos el 95% de las partículas en número tienen un diámetro menor de 7 nanómetros. Más preferiblemente, al menos el 95% de las partículas en peso tienen un diámetro mayor de 1 nanómetro y al menos el 90% de las partículas en número tienen un diámetro menor de 6 nanómetros. Las composiciones de polvo seco preferiblemente incluyen un diluyente de polvo fino sólido tal como azúcar y se proporcionan convenientemente en una forma farmacéutica unitaria.
Los propelentes de bajo punto de ebullición en general incluyen propelentes líquidos que tiene un punto de ebullición de menos de 65°F a presión atmosférica. En general, el propelente puede constituir del 50 al 99,9% (p/p) de la composición, y el principio activo puede constituir del 0,1 al 20% (p/p) de la composición. El propelente puede además comprender ingredientes adicionales tal como un tensioactivo no iónico líquido o aniónico sólido o un diluyente sólido (preferiblemente que tiene un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que comprenden el principio activo).
Las composiciones farmacéuticas de la invención formuladas para administración pulmonar también pueden proporcionar el principio activo en forma de gotitas de una solución o suspensión. Tales formulaciones se pueden preparar, embalar, o vender como soluciones o suspensiones acuosas o alcohólicas diluidas, opcionalmente estériles, que comprenden el principio activo, y se pueden administrar convenientemente usando cualquier dispositivo de nebulización o atomización. Tales formulaciones pueden además comprender uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero no limitados a, un agente saborizante tal como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tamponante, un agente tensioactivo, o un conservante tal como hidroxibenzoato de metilo. Las gotitas proporcionadas por esta vía de administración preferiblemente tienen un diámetro medio en el intervalo desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 200 nanómetros. Las formulaciones descritas en el presente documento como que son útiles para administración pulmonar también son útiles para la administración intranasal de una composición farmacéutica de la invención. Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo grueso que comprende el principio activo y que tiene una partícula media desde aproximadamente 0,2 a 500 nanómetros.
Tal formulación se administra de la manera en que toma rapé, es decir, por inhalación rápida a través del paso nasal desde un envase del polvo mantenido cerrado a las narinas. Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, comprender desde aproximadamente tan poco como el 0,1% (p/p) y tanto como el 100% (p/p) del principio activo, y pueden además comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento.
Una composición farmacéutica de la invención se puede preparar, embalar, o vender en una formulación adecuada para la administración yugal. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de comprimidos o tabletas hechos usando métodos convencionales, y pueden, por ejemplo, contener del 0,1 al 20% (p/p) de principio activo, el resto comprende una composición oralmente soluble o degradable y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento. Alternativamente, las formulaciones adecuadas para administración yugal pueden comprender un polvo o una solución o suspensión aerosolizada o atomizada que comprende el principio activo. Tales formulaciones en polvo, aerosolizadas, o aerosolizadas, cuando se dispersan, preferiblemente tienen un tamaño medio de partícula o gotita en el intervalo desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 200 nanómetros, y pueden además comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento.
Una composición farmacéutica de la invención se puede preparar, embalar, o vender en una formulación adecuada para la administración oftálmica. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de gotas oculares incluyendo, por ejemplo, una solución o suspensión al 0,1-1,0% (p/p) del principio activo en un soporte líquido acuoso u oleaginoso. Tales gotas pueden además comprender agentes tamponantes, sales, o uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento. Otras formulaciones administrables por vía oftálmica que son útiles incluyen las que comprenden el principio activo en forma microcristalina o en una preparación liposómica.
Como se usa en el presente documento, “ingredientes adicionales” incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes; excipientes; agentes tensioactivos; agentes dispersantes; diluyentes inertes; agentes de granulación y disgregantes; agentes aglutinantes; agentes lubricantes; agentes edulcorantes; agentes saborizantes; agentes colorantes; conservantes; composiciones fisiológicamente degradables tal como gelatina; vehículos y solventes acuosos; vehículos y solventes oleaginosos; agentes de suspensión; agentes dispersantes o humectantes; agentes emulsionantes; demulcentes; tampones; sales; agentes espesantes; rellenos; agentes emulsionantes; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos; agentes estabilizantes; y materiales poliméricos o hidrofóbicos farmacéuticamente aceptables. Otros “ingredientes adicionales” que se pueden incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa..
Típicamente las dosis del compuesto de la invención que se pueden administrar a un animal, preferiblemente un ser humano, varían en cantidad desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 1000 mg por kilogramo de peso corporal del animal. La dosis precisa administrada variará dependiendo de cualquier número de factores incluyendo, pero no limitados a, el tipo de animal y el tipo de enfermedad o trastorno que se trata, la edad del animal y la vía de administración. Preferiblemente, la dosis del compuesto variará desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal del animal. El compuesto se puede administrar a un animal tan frecuentemente como varias veces al día, o se puede administrar con menos frecuencia, tal como una vez al día, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, o incluso con menos frecuencia, tal como una vez cada varios meses o incluso una vez al año o menos. La frecuencia de la dosis será aparente fácilmente para el experto en la materia y dependerá de cualquier número de factores tal como, pero no limitado a, el tipo y gravedad de la enfermedad o trastorno que se trata, el tipo y edad del animal, etc.
Ejemplos experimentales
La invención se describe adicionalmente en detalle mediante referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan para fines de ilustración solo, y no se pretende que sean limitantes a menos que se especifique de otra manera. Por tanto, la invención no se debe interpretar en modo alguno como que está limitada a los siguientes ejemplos, sino más bien, se debe interpretar que abarca cualquiera y todas las variaciones que están dentro del ámbito de la invención.
Sin descripción adicional, se cree que un experto en la materia puede, usando la descripción precedente y los siguientes ejemplos ilustrativos, hacer y utilizar la presente invención. Los siguientes ejemplos de trabajo, por tanto, señalan específicamente las formas de realización preferidas de la presente invención, y no se deben interpretar como que limitan en modo alguno el resto de la divulgación.
Ejemplo 1: La renalasa protege contra lesión renal aguda isquémica en ratones
La renalasa es una amina oxidasa secretada por el túbulo proximal renal que degrada catecolaminas circulantes y reduce necrosis miocárdica. Los datos presentados en el presente documento demuestran que la renalasa protege contra lesión de isquemia y reperfusión renal. Como se muestra en el presente documento, la renalasa se expresa selectivamente en los túbulos renales proximales, pero no distales. Ratones sometidos a lesión de isquemia reperfusión renal tuvieron niveles de renalasa en riñón y plasma significativamente reducidos comparados con los ratones operados de referencia. Consistente con esto, los niveles de norepinefrina en plasma de ratón aumentaron significativamente después de la lesión de isquemia y reperfusión renal. Además, ratones deficientes en renalasa sometidos a isquemia y reperfusión renal tuvieron inflamación, necrosis y apoptosis tubular renal exacerbadas con niveles de catecolaminas en plasma mayores comparados con los ratones de tipo salvaje de renalasa. La administración de renalasa humana recombinante redujo los niveles de catecolaminas en plasma y alivió la lesión renal aguda isquémica en ratones de tipo salvaje de renalasa al reducir la necrosis, inflamación y apoptosis tubular renal. En conjunto, los datos muestran que la renalasa protege contra lesión renal aguda isquémica al reducir la necrosis, apoptosis e inflamación tubular renal. La terapia de renalasa recombinante proporciona un novedoso enfoque terapéutico para la prevención y el tratamiento de lesión renal aguda. Además, como la renalasa en plasma disminuye después de lesión renal aguda isquémica, los niveles de renalasa en plasma sirven como un novedoso y sensible biomarcador para la detección de lesión renal aguda.
Como se describe en el presente documento, se realizaron experimentos para evaluar si la AKI isquémica en ratones produce deficiencia en renalasa y si la deficiencia en renalasa directamente exacerba la AKI isquémica. Por tanto, se realizaron experimentos para comprobar si 1) la AKI isquémica produce niveles de renalasa en riñón y plasma reducidos, 2) la deficiencia en renalasa inducida por AKI isquémica produce niveles de catecolaminas (norepinefrina) en plasma elevados, 3) los ratones deficientes en renalasa muestran lesión IR renal aumentada y 4) la administración exógena de renalasa humana recombinante directamente protege contra AKI isquémica en ratones.
La AKI isquémica se complica por reclutamiento intrarrenal de leucocitos proinflamatorios e inflamación sistémica (Okusa, 2010, Contrib Nephrol 165: 153-158). Estudios recientes han demostrado que la IR renal no es una enfermedad de un único órgano, sino que implica múltiples órganos extrarrenales incluyendo el hígado, intestino y pulmón (Paladino et al., 2009, Microvasc Res 77: 8-12; Park et al., 2011, Lab Invest 91: 63-84). Aunque se han hecho muchos avances detallando los mecanismos de muerte celular tubular renal después de AKI isquémica, el desencadenante que orquesta la inflamación renal y sistémica después de AKI isquémica permanece desconocido. Mientras que no se quiere estar vinculado a ninguna teoría particular, los efectos extrarrenales de AKI isquémica pueden explicar la mortalidad desproporcionadamente alta en pacientes con AKI. Por tanto, maneras de prevenir estas complicaciones sistémicas, extrarrenales de AKI contribuirían mucho al cuidado mejorado de pacientes y supervivencia.
Como se describe en el presente documento, la muerte celular tubular renal y reducción aguda en función renal después de AKI isquémica produjo reducciones drásticas en niveles de renalasa renales y en plasma con un aumento resultante en norepinefrina en plasma. Estos hallazgos son consistentes con la explicación de que el túbulo proximal renal es una fuente principal de renalasa circulante. Además, los datos sugieren que la renalasa secretada se degrada rápidamente en plasma y se debe producir síntesis y liberación de renalasa nueva constante por el riñón para mantener los niveles normales de renalasa en plasma. Además, puesto que los niveles de renalasa en riñón y plasma disminuyen rápidamente después de AKI isquémica en ratones, la renalasa en orina y plasma también puede servir como un novedosos y sensible biomarcador para la detección temprana de AKI isquémica.
La terapia de renalasa recombinante proporciona una novedosa herramienta terapéutica para la prevención y el tratamiento de AKI ya que el poderoso efecto protector de renalasa recombinante contra lesión IR renal se ha descrito en el presente documento. Específicamente, la renalasa recombinante exógena atenuó la necrosis tubular renal (puntuación de lesión renal de Jablonski). Además, se demostró el flujo reducido de neutrófilos y macrófagos proinflamatorios al riñón y apoptosis tubular renal después de IR renal en riñones de ratones tratados con renalasa recombinante. Estos datos son consistentes con la explicación de que la administración exógena de renalasa recombinante humana proporciona poderosa protección renal contra AKI isquémica al dirigirse a las 3 rutas (necrosis, apoptosis e inflamación) de lesión celular renal.
La renalasa recombinante (1,5 mg/kg) proporcionó protección renal significativa, pero parcial (la creatinina disminuyó desde ~2,4 mg/dl a 1,4 mg/dl) lo más probable debido a la gravedad del modelo de AKI isquémica descrito en el presente documento (30 min de isquemia tibia). Treinta min de isquemia renal habrían causado necrosis tubular renal significativa durante la isquemia que no se podía rescatar con tratamiento con renalasa. También se observó que la renalasa no proporciona protección dependiente de la dosis y a dosis de 4,5 mg/kg hubo alguna inversión de la protección. Es probable que altas dosis (4,5 mg/kg) no pudieran proporcionar protección renal ya que la renalasa produce reducción dependiente de la dosis en presión sanguínea sistémica (Xu et al., 2005, J Clin Invest 115: 1275­ 1280). Un estudio previo mostró que la renalasa a una dosis de 4 mg/kg redujo la presión arterial media en ~40% (Xu et al., 2005, J Clin Invest 115: 1275-1280). Esta observación es consistente con la explicación de que la reducción en la presión sanguínea sistémica puede haber anulado los efectos protectores renales de renalasa recombinante a alta dosis.
La terapia de renalasa recombinante también era parcialmente protectora cuando se administró 30 min después de isquemia renal. Según esto, la terapia de renalasa recombinante puede ser eficaz para un grupo diverso de pacientes en riesgo para AKI isquémica. Mientras que la isquemia renal se puede anticipar en muchos procedimientos quirúrgicos, un número significativo de pacientes se presenta al hospital después de que la lesión isquémica renal ya se haya producido. La terapia post-isquémica para AKI aumentará la significancia traslacional, así como la clínica, porque no todas las AKI isquémicas se pueden anticipar de antemano. Sin embargo, se notaron diferencias significativas en la eficacia de renalasa administrada 10 min antes de la isquemia renal y 30 min después de la reperfusión. Aunque sin querer estar vinculados por ninguna teoría particular, esto puede ser debido a la gravedad de la lesión de reperfusión temprana que se produce después de 30 min de isquemia renal tibia. Parece que la renalasa recombinante debe estar presente en circulación para contrarrestar la lesión renal significativa que se produce durante 30 min después de la reperfusión.
Como se describe en el presente documento, los aumentos en los niveles de norepinefrina en plasma fueron mayores en ratones KO de renalasa comparados con los ratones WT de renalasa después de lesión IR renal. Wu y col. han demostrado también que los niveles en plasma de catecolaminas, incluyendo epinefrina, dopamina y norepinefrina, están aumentados en ratones KO de renalasa (Wu et al., 2011, Kidney Int 79: 853-860). También se mostró en estudios descritos en el presente documento que ratones KO de renalasa padecieron lesión tubular renal aumentada después de IR renal. Además, se demostraron niveles aumentados deTNF-a, MCP-1, y MIP-2 después de IR renal en ratones deficientes en renalasa. En particular, MIP-2 es una quimioquina implicada en inflamación e inmunorregulación y es un potente regulador de quimiotaxis en neutrófilos (Lemay et al., 2000, Transplantation 69: 959-963). Consistente con los hallazgos descritos en el presente documento, los ratones KO de renalsa tienen necrosis miocárdica exacerbada debido a IR (Wu et al., 2011, Kidney Int 79: 853-860). En conjunto, la deficiencia en renalasa parece exacerbar la lesión de órgano isquémica y produce mayores niveles de catecolaminas en plasma.
Aunque sin querer estar vinculados por ninguna teoría particular, los hallazgos descritos en el presente documento son consistentes con la explicación de que los efectos protectores renales de renalasa recombinante son, al menos en parte, debidos a metabolismo aumentado de catecolaminas en plasma y tejidos. Se muestra en el presente documento que la protección renal mediada por renalasa recombinante también produjo niveles de catecolaminas en plasma significativamente reducidos. Los niveles de catecolaminas aumentados después de AKI isquémica pueden exacerbar la lesión renal al disminuir el flujo de sangre renal, así como por efectos directos en túbulos renales y células inmunitarias. Las catecolaminas se han implicado en fomentar la lesión en tejido y órgano en septicemia y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (Miksa et al., 2009, PLoS One 4: e5504; Wang et al., 2000, Biochim Biophys Acta 1535: 36-44). Por ejemplo, se ha implicado la norepinefrina derivada de intestino en causar lesión hepática e inflamación sistémica en septicemia (Koo et al., 2000, Int J Mol Med 5: 457-465; Yang et al., 2000, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 279: G1274-G1281; Zhou et al., 2004, Biochim Biophys Acta 1689: 212-218). Estudios previos han mostrado que la norepinefrina derivada de intestino activa los alfa2-adrenoceptores en células de Kupffer hepáticas para aumentar la generación y liberación de TNF-a (Miksa et al., 2009, PLoS One 4: e5504; Yang et al., 2000, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 279: G1274-G1281; Yang et al., 2001, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 281: G1014-G1021; Zhou et al., 2001, Biochim Biophys Acta 1537: 49-57). En ratas sépticas, los receptores alfa2 adrenérgicos aumentan en células de Kupffer para potenciar la respuesta inflamatoria y lesión a órgano (Miksa et al., 2009, PLoS One 4: e5504). Además, los receptores alfa1 adrenérgicos aumentan la inducción de citoquinas proinflamatorias mediada por LPS en monocitos y macrófagos humanos (Grisanti et al., 2011, J Pharmacol Exp Ther 338: 648-657). Por tanto, los receptores adrenérgicos tanto alfa1 como alfa2 están implicados en efectos proinflamatorios de catecolaminas circulantes aumentadas. Apoyando un papel patogénico de receptores alfa adrenérgicos contra AKI isquémica, se encontró que el bloqueo de los receptores alfa adrenérgicos proporcionó una protección renal significativa en ratones WT de renalasa, así como KO de renalasa.
Los métodos y materiales de este ejemplo se describen ahora.
Síntesis de renalasa humana recombinante
La renalasa humana recombinante se sintetizó como se describe (Desir et al, 2012, J. of the Am. Heart Assn, 1(4):e002634).
Modelo murino de lesión de isquemia/reperfusión (IR) renal
Se sometieron ratones deficientes (KO) en renalasa machos adultos (Wu et al., 2011, Kidney Int 79: 853-860) en un fondo C57BL/6 a isquemia/reperfusión (IR) renal como se ha descrito (Kim et al., 2009, Kidney Int 75: 809-823; Kim et al., 2010, Am J Physiol Renal Physiol 299(2):F347-58). Ratones KO o de tipo salvaje (WT) de renalasa (C57BL/6 de Harlan Labs, Indianápolis, IN) se sometieron a operación de referencia o 20 min (moderada) o 30 min (grave) de isquemia renal y 24 hr de reperfusión. Para ensayar los efectos protectores renales de renalasa humana recombinante, los ratones se pretrataron con solución salina (vehículo) o renalasa recombinante (0,5, 1,5 o 4,5 mg/kg, s.c.) 10 min antes de los 30 min de isquemia renal. También se ensayó si el tratamiento con renalasa después de completar la isquemia renal también proporciona protección renal. Se trataron cohortes separadas de ratones con solución salina o con renalasa (1,5 mg/kg, s.c.) 30 min o 60 min después de la reperfusión del riñón isquémico. Para ensayar si bloquear los alfa receptores mimetizaría los efectos protectores renales de la administración de renalasa recombinante humana, se dio fentolamina (un agonista de alfa receptor, 5 mg/kg, i.p.) en algunos ratones 15 min antes de la isquemia renal.
Medida de la función renal
Se midió la creatinina en plasma como se ha descrito con un kit de reactivo de creatinina enzimático según las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) (Slot, 1965, J Clin Lab Invest 17: 381-387).
Medida de norepinefrina en plasma
La norepinefrina en plasma en ratones sometidos a operación de referencia o IR renal se medió con un kit de ELISA comercial según instrucciones del fabricante (Rocky Mountain Diagnostic, Colorado Springs, CO).
Detección histológica de necrosis, apoptosis e infiltración de neutrófilos
Se usó una escala de graduación establecida de lesión necrótica (0-4, puntuación de lesión renal) a los túbulos proximales para la evaluación histopatológica de daño inducido por IR como se esboza por Jablonski et al. (1983, Transplantation 35: 198-204) y como se describe en estudios previos (Lee et al., 2004, J Am Soc Nephrol 15: 102­ 111; Lee et al., 2004, Am J Physiol Renal Physiol 286: F298-F306). La apoptosis se detectó después de IR renal con tinción TUNEL como se describe (Park et al., 2011, Lab Invest 91: 63-84) usando un kit de detección de muerte celular in situ comercialmente disponible (Roche, Indianapolis, IN) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Las infiltraciones de neutrófilos y macrófagos al riñón se evaluaron con inmunohistoquímica 24 hr después de IR como se ha descrito previamente (Park et al., 2011, Lab Invest 91: 63-84). Los neutrófilos y macrófagos que se infiltran en el riñón se cuantificaron en 5-7 campos de imágenes de microscopio de 200X (neutrófilos) o 400X (macrófagos) elegidos al azar en la unión corticomedular y los resultados se expresaron como neutrófilos contados por campo de 200-400X.
Transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa y análisis de inmunotransferencia para renalasa de ratón
El ARNm que codifica la renalasa de ratón se midió con RT-PCR como se ha descrito (Kim et al., 2010, Am J Nephrol 31: 353-362). También se midió el ARNm de GAPDH para controlar para igual aporte de ARN. Además, también se recogieron cortezas de riñón de ratón para análisis de inmunotransferencia de renalasa (Abcam, Cambridge, MA) y pactina (control de carga de proteína interna, Sigma) como se ha descrito previamente (Kim et al., 2010, Am J Nephrol 31: 353-362).
Medida de expresión de ARNm proinflamatorio después de IR intestinal
La inflamación de los riñones después de IR renal en ratones se determinó además midiendo ARNm que codifica marcadores de inflamación incluyendo IL-17A, molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1), proteína inflamatoria de macrófagos 2 (MIP-1), factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) e IL-6 (solo en hígado y riñón). La RT-PCR se realizó como se ha descrito (Park et al., 2011, Lab Invest 91: 63-84).
Coinmunolocalización de renalasa endógena con E-cadherina o megalina en riñón de cerdo
El anticuerpo contra renalasa se sintetizó contra la secuencia de renalasa humana. Se realizó inmunohistoquímica de renalasa en riñones de cerdo. Se fijaron secciones de riñón de cerdo, se permeabilizaron e incubaron con anticuerpo primario anti-renalasa 28-4 (generado contra el péptido de renalasa EAGTKIDVPWAGQYITSNPC (SEQ ID NO: 1) y con anti-E-cadherina (BD Biosciences) o anti-megalina durante 2 hr. Los anticuerpos secundarios (Alexa488-anticonejo de cabra para detectar renalasa) y Alexa555-anti-ratón de cabra (Molecular Probes, para detectar E-cadherina o megalina) se aplicaron después. Se vieron las secciones con un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Inc.) y se fotografiaron usando un software de cámara SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.).
Análisis estadístico
Los datos se analizaron con la prueba de la t de Student cuando se comparan medias entre dos grupos o ANOVA unidireccional más prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey cuando se comparan múltiples grupos. Se usó ANOVA bidireccional más prueba posterior de Bonferroni para probar los efectos de operación de referencia o lesión IR renal en diferentes cepas de ratón o grupos de tratamiento. Los valores ordinales de las puntuaciones de lesión renal se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. En todos los casos, se tomó una probabilidad estadística < 0,05 para indicar significación. Todos los datos expresados a lo largo del texto son medias ± EEM.
Los resultados de este ejemplo se describen ahora.
La renalasa se expresa selectivamente en túbulos proximales renales
La figura 1A muestra los análisis de coinmunolocalización de tejido de riñón de cerdo incubado con anticuerpos contra megalina (un marcador para túbulos renales proximales) o renalasa. La tinción de renalasa y megalina solapan perfectamente lo que indica que la renalasa se expresa en túbulos proximales renales. También se realizaron estudios de coinmunolocalización con renalasa y E-cadherina (un marcador para túbulos renales distales) (Figura 1B). A diferencia de megalina, E-cadherina no colocaliza con renalasa en riñones de cerdo. Estos datos indican expresión selectiva de renalasa en túbulos proximales renales. El anticuerpo contra renalasa también detectó renalasa en túbulos proximales de ratón.
Niveles de norepinefrina en plasma después de operación de referencia o IR renal en ratones
La concentración de norepinefrina en plasma aumentó 24 hr después de IR renal en ratones WT de renalasa (> 2 veces comparado con ratones WT de renalasa con operación de referencia, N = 3-5, Figura 2). El aumento en la concentración de norepinefrina en plasma fue incluso mayor en ratones deficientes en renalasa después de IR renal (> 5 veces comparado con ratones KO de renalasa con operación de referencia).
Expresión de renalasa en plasma y riñón después de IR renal
La inmunotransferencia para renalasa en plasma reveló reducciones significativas en la renalasa en plasma 5 hr y 24 hr después de IR renal (Figura 3A, n = 4-5). Consistente con esta disminución en la renalasa en plasma, la expresión del ARNm de renalasa en riñón estaba significativamente atenuada 24 hr después de IR renal (Figura 3B, n = 4).
Los ratones deficientes en renalasa tienen AKI isquémica aumentada después de IR renal
Los valores de creatinina en plasma basales eran similares entre WT de renalasa y KO de renalasa sometidos a operación de referencia (anestesia, laparotomía, nefrectomía derecha y recuperación, Figura 4A). La creatinina en plasma aumentó significativamente en ratones WT de renalasa y KO de renalasa sometidos a IR renal moderada (20 min) o grave (30 min) comparados con ratones con operación de referencia (Figura 4A, n = 4-6). Sin embargo, los ratones KO de renalasa tuvieron lesión renal significativamente aumentada indicado por mayores niveles de creatinina en plasma comparados con los ratones WT de renalasa después de lesión IR renal tanto moderada como grave.
Efectos protectores renales de la administración de renalasa recombinante humana exógena
El pretratamiento con renalasa recombinante humana exógena protege contra la lesión IR renal. La creatinina en plasma aumentó significativamente en ratones tratados con vehículo (solución salina) sometidos a 30 min de IR renal comparados con ratones con operación de referencia (Figura 4B, n = 4-6). El pretratamiento con renalasa recombinante humana (0,5, 1,5 o 4,5 mg/kg s.c., 10 min antes de la isquemia renal) atenuó significativamente los aumentos en creatinina en plasma en ratones. Sin embargo, mayores dosis de renalasa recombinante humana (4,5 mg/kg) proporcionaron protección renal reducida cuando se compararon con la dosis de renalasa recombinante de 1,5 mg/kg. La renalasa exógena (1,5 mg/kg) disminuyó los niveles de norepinefrina en plasma en ratones sometidos a lesión IR renal (norepinefrina en plasma de ratones inyectados con vehículo = 2,4 ± 0,13 ng/ml, n = 4 frente a norepinefrina en plasma de ratones inyectados con renalasa = 1,6 ± 0,2 ng/ml, N = 4, P<0,05) consistente con sus efectos protectores renales.
El tratamiento con renalasa recombinante después de reperfusión renal (después de completar la isquemia renal) protegía contra lesión IR renal. La figura 4C muestra que la renalasa recombinante (1,5 mg/kg) dada 30 min después de la reperfusión era protectora contra lesión IR renal (n = 4-6). La administración de renalasa recombinante 60 min después no proporcionó protección renal contra lesión IR.
Efectos protectores renales del bloqueo de receptores alfa adrenérgicos
Bloquear los receptores alfa adrenérgicos mimetiza los efectos protectores renales de la administración de renalasa recombinante humana. La fentolamina (un antagonista no específico pero selectivo de receptores alfa adrenérgicos, 5 mg/kg, i.p.) produjo protección renal significativa en ratones WT de renalasa sometidos a lesión IR renal de 30 min (Figura 4D). Además, la fentolamina también protegió ratones KO de renalasa contra lesión IR renal de 30 min (Figura 4D).
La renalasa modula la necrosis tubular renal después de IR
Los ratones deficientes en renalasa sometidos a lesión IR renal moderada (20 min de isquemia renal) desarrollaron lesión histológica renal exacerbada comparados con ratones WT de renalasa (necrosis tubular aumentada, cilindros proteinaceos con congestión aumentada, (Figura 5A, paneles superiores, representativo de 4-6 experimentos). En contraste y consistente con los datos de creatinina en plasma, los ratones WT de renalasa tratados con renalasa recombinante humana (1,5 mg/kg) tuvieron lesión drásticamente reducida comparados con ratones WT de renalasa tratados con vehículo (Figura 5A, paneles inferiores). Se usó la puntuación de lesión renal de la escala de Jablonski (Jablonski et al., 1983, Transplantation 35: 198-204) (escala: 0-4) para graduar la necrosis tubular renal 24 hr después de IR renal (Figura 5B, N = 4-6). Los ratones KO de renalasa sometidos a lesión IR renal moderada (20 min de isquemia renal) mostraron necrosis tubular aguda grave (con puntuaciones de lesión renal >3) a diferencia de ratones WT de renalasa sometidos a lesión IR renal de 20 min. En contraste, los ratones WT de renalasa tratados con renalasa recombinante humana tuvieron puntuaciones de lesión renal significativamente menores comparados con ratones WT de renalasa tratados con vehículo sometidos a lesión IR renal de 30 min.
La renalasa exógena disminuye la apoptosis renal, infiltración de neutrófilos e infiltración de macrófagos después de IR
La tinción TUNEL detectó células renales apoptóticas en riñón de ratones sometidos a IR renal con apoptosis de células de túbulo proximal predominante (Figura 6A, aumento 100X, representativo de 4 experimentos). A diferencia de los riñones de ratones con operación de referencia, 30 min de isquemia renal y 24 hr de reperfusión produjo apoptosis grave en los riñones de ratones tratados con vehículo 8solución salina) (Figura 6a ). La renalasa recombinante (1,5 mg/kg, s.c.) dada 10 min antes de la isquemia renal redujo significativamente el número de células apoptóticas positivas en TUNEL en el riñón (Figura 6B, N = 4).
La figura 7A muestra imágenes representativas de inmunohistoquímica de neutrófilos de riñones (aumento 200X, representativo de 4 experimentos) de ratones sometidos a 30 min de isquemia renal y 24 hr de reperfusión o a operación de referencia. Hubo infiltración de neutrófilos significativa en los riñones de ratones tratados con solución salina y sometidos a 24 hr de IR renal. En ratones con operación de referencia, no se pudieron detectar neutrófilos en los riñones. Los ratones tratados con renalasa antes de la isquemia renal tuvieron número significativamente reducido de neutrófilos infiltrando el riñón después de IR (Figura 7B, N = 4). La figura 7C muestra imágenes representativas de inmunohistoquímica de macrófagos (F4/80) de riñones (aumento 400X, representativo de 4 experimentos) de ratones sometidos a 30 min de isquemia renal y 24 hr de reperfusión o a operación de referencia. Hubo infiltración de macrófagos significativamente aumentada (tinción marrón) en los riñones de ratones tratados con solución salina y sometidos a 24 hr de IR renal. Los ratones tratados con renalasa antes de la isquemia renal tuvieron número significativamente reducido de macrófagos infiltrando el riñón después de IR (Figura 7D).
La deficiencia en renalasa aumenta la expresión de genes proinflamatorios en el riñón después de IR
Se midió la expresión de los ARNm de citoquinas proinflamatorias en el riñón (TNF-a, ICAM-1, MCP-1 y MIP-2) 24 hr después de IR renal con RT-PCR (secuencias de cebadores enumeradas en la tabla 1). Los ratones Wt de renalasa aumentaron significativamente la expresión de todos los ARNm proinflamatorios examinados comparados con los ratones WT de renalasa con operación de referencia (Figura 8). Además, los ratones deficientes en renalasa tuvieron incluso mayores aumentos en la expresión de TNF-a, MCP-1 y MIP-2 sin ningún cambio en la expresión de ICAM-1 comparado con ratones WT de renalasa.
Tabla 1. Cebadores usados para amplificar ADNc basados en secuencias de GenBank para ratón
Número de Tamaño del húmero Temperatura de
producto
Cebadores acceso Secuencia Sentido/Antisentido SEQ ID NO b de ciclos hibridación (DC)
Figure imgf000029_0001
Ejemplo 2: Efecto protector de renalasa y péptidos de renalasa en AKI y lesión celular aguda
Secuencias de polipéptido y péptidos de renalasa
RP 224 - CVSIDNKKRNI (SEQ ID NO: 2)
RP 220 - CIRFVSIDNKKRNIESSEIG (SEQ ID NO: 3)
RP H220 - HHHHHHCIRFVSIDNKKRNIESSEIG (SEQ ID NO: 4)
RP A220 - IRFVSIDNAAANIESSEIG (SEQ ID NO: 5)
RP 220 MEZCLADO - CSKRIFKVISSIEDNNERG (SEQ ID NO: 6)
RP 128 - FRHRVTQINLRDDKWEVSKQ (SEQ ID NO: 7)
RP 19 - LLRRQTSGPLYLAVWDKAED (SEQ ID NO: 8)
Renalasa (NP_001026879.2) -MAQVLIVGAGMTGSLCAALLRRQTSGPLYLAVWDKAEDSGGRMTTACSPHNPQCT ADLGAQY1TCTPHYAKKHQRFYDELLAYGVLRPLSSPIEGMVMKEGDCNFVAPQG1S
SIIKHYLKESGAEVYFRHRVTQINLRDDKWEVSKQTGSPEQFDLIVLTMPVPE1LQLQ
GDITTLISECQRQQLEAVSYSSRYALGLFYEAGTKIDVPWAGQYITSNPCIRFVSIDNK KRNIESSEIGPSLVIHTTVPFGVTYLEHSIEDVQELVFQQLENILPGLPQPIATKCQKWR HSQVTNAAANCPGQMTLHHKPFLACGGDGFTQSNFDGCITSALCVLEALKNYI (SEQ
ID NO: 9)
Renalasa (NP_060833.1)-MAQVLIVGAGMTGSLCAALLRRQTSGPLYLAVWDKAEDSGGRMTTACSPHNPQCT ADLGAQYITCTPHYAKKHQRFYDELLAYGVLRPLSSPIEGMVMKEGDCNFVAPQG1S
SIIKHYLKESGAEVYFRHRVTQINLRDDKWEVSKQTGSPEQFDLIVLTMPVPEILQLQ GDITTLISECQRQQLEAVSYSSRYALGLFYEAGTKIDVPWAGQYITSNPCIRFVSIDNK KRNIESSEIGPSLVIHTTVPFGVTYLEHSIEDVQELVFQQLENILPGLPQPIATKCQKWR HSQVPSAGVILGCAKSPWMMAIGFPI (SEQ ID NO: 10)
Efecto protector de renalasa recombinante en AKI isquémica y tóxica
Se realizaron experimentos para evaluar si la AKI isquémica en ratones produce deficiencia en renalasa y si la deficiencia en renalasa exacerba directamente AKI isquémica. Por tanto, se realizaron experimentos para ensayar si 1) la AKI isquémica produce niveles de renalasa en riñón y plasma reducidos, 2) la deficiencia en renalasa inducida por AKI isquémica produce niveles de catecolaminas (norepinefrina) en plasma elevados, 3) los ratones deficientes en renalasa muestran lesión IR renal aumentada y 4) la administración exógena de renalasa humana recombinante directamente protege contra AKI isquémica en ratones.
En los estudios descritos en el presente documento, se encontró que la administración de renalasa humana recombinante redujo los niveles de catecolaminas en plasma y alivió la lesión renal aguda isquémica en ratones de tipo salvaje para renalasa al reducir la necrosis, inflamación y apoptosis tubular renal. En conjunto, estos datos muestran que la renalasa sirve para proteger contra la lesión renal aguda isquémica al reducir la necrosis, apoptosis e inflamación tubular renal.
La renalasa protege contra AKI mediada por cisplatino en ratones
Se investigó la eficacia de renalasa recombinante en tratar AKI inducida por cisplatino, y se evaluaron los mecanismos que median su acción protectora. Se administró cisplatino (20 mg/kg) por inyección intraperitoneal a ratones WT o KO de renalasa. Los ratones se sacrificaron 3 días después. Se recogió sangre para medidas de BUN y creatinina, y se recogieron los riñones para examen histológico, inmunofluorescencia (IF) e inmunotransferencia (WB). Un patólogo renal, sin conocer la identidad del animal de estudio, revisó cada muestra de riñón. Las características patológicas se puntuaron usando una escala de valoración ordinal (0-4; 0 = nada; 1 = <25%; 2 = 26-50%; 3 = 51-75%; 4 = 76-100%) para la presencia de necrosis tubular. Se realizó morfometría de la corteza y médula renal usando una técnica de contar puntos. Se contaron los puntos que están en túbulos lesionados, y se calculó el porcentaje de área de lesión como el porcentaje de los puntos totales contados.
Como se muestra en la figura 9, tres días después del tratamiento con cisplatino, la creatinina en plasma era significativamente mayor en ratones KO de renalasa comparados con WT (1,82±0,56 frente a 0,71±0,02 mg/dl, n = 6, P=0,021), como lo era la puntuación de lesión renal (k O = 56,62±7,38% n = 6 frente a WT = 17,07±4,03, n = 5; p<0,0002), el grado de apoptosis (aumento de 2 veces en tinción TUNEL, p<0,005), e infiltración de macrófagos (aumento del 35% en tinción de F4/80, p<0,05). Estos datos muestran que la renalasa protege contra AKI de cisplatino al disminuir señales proapoptóticas, y aumentar señales prosupervivencia. Por tanto, la renalasa es un compuesto útil para el tratamiento de AKI de cisplatino.
La renalasa tiene efecto celular directo en protección contra AKI
La adición de renalasa exógena a células HK-2 tratadas con cisplatino inhibió la activación de caspasa-3, y aumentó la expresión de Bcl-2, y la supervivencia celular, lo que sugiere que el efecto protector in vivo de renalasa puede no estar mediado solo por una reducción en catecolaminas circulantes. El examen de la estructura cristalina de renalasa y estudios in vitro usando anticuerpos monoclonales antipéptido llevaron a la identificación de un péptido de renalasa muy conservado (RP H220, 26 aa), que no tenía actividad NADH o amina oxidasa detectable, pero protegía contra isquemia (100 |jg dados por vía subcutánea 30 min antes), y AKI mediada por cisplatino en ratones (creatinina medida porHPLC: Referencia: 0,05±0,002, cisplatino: 0,177±0,02, cisplatino RP H220: 0,085±0,007, n = 3, p=0,012) (Figura 10). Un péptido más corto, pero relacionado (RP 220, 20 aa) era menos eficaz, mientras que el péptido más corto relacionado ensayado (RP 224, 10 aa) no era protector. Por tanto, RP H220 y RP 220 son compuestos útiles para la prevención y el tratamiento de AKI.
Renalasa y RP H220 protegen células tubulares proximales humanas (HK-2) contra lesión mediada por cisplatino y oxidante
En células epiteliales de túbulo proximal humano (HK-2) cultivadas, la renalasa recombinante (10 jg/m l) redujo significativamente la necrosis inducida con H2O2 2 mM (LDH liberada a las 6 hr = 28±2%, N = 3) comparado con células HK-2 tratadas con vehículo sometidas a necrosis con H2O2 (LDH = 47+3%, N = 3, p<0,01). Se obtuvieron resultados similares con RP H220.
Las células HK-2 se incubaron con cisplatino 20 jM durante 24 horas con y sin renalasa recombinante. Se examinó la expresión de renalasa se examinó por inmunotransferencia y se determinó la viabilidad celular (integridad mitocondrial) espectrofotométricamente usando WST-1, una sal de tetrazolio que se corta, por deshidrogenasas mitocondriales de células metabólicamente activas y viables, a formazán (420-480 nm) (Boehringer Mannheim, Alemania). Como se muestra en la figura 11A, las células HK2 expuestas a cisplatino durante 24 horas mostraron una reducción marcada en la expresión de renalasa. La adición de renalasa recombinante no solo restableció la expresión de renalasa celular, sino que también proporcionó protección significativa contra toxicidad de cisplatino, aumentó la viabilidad en ~50% (Figura 11B), disminuyó la activación de caspasa-3 (Figura 11C) y aumentó la expresión de Bcl-2 (Figura 11D). Se obtuvieron resultados similares con RP H220.
Renalasa y RP 220 señalizan a través de las rutas PI3K/AKT y MAPK
Puesto que RP H220 no tiene ni actividad oxidasa detectable, ni efecto significativo en la presión sanguínea sistémica, y aun protege contra la AKI isquémica y tóxica en ratones, se evaluó si el efecto protector de renalasa estaba en parte mediado por un efecto celular directo. Resultados preliminares indican que la renalasa aumenta la expresión de Bcl-2 en células HK-2 y endoteliales de vena humana (HUVEC) a las 24 hr (Figura 12A), y señaliza a través la ruta PI3K/AKT por activación de AKT (~45 veces a los 15 min), y la ruta de MAPK al activar ERK (~35 veces a los 15 min) y disminuye JNK (disminución de ~95% en la fosforilación de JNK-p54/p46) (Figuras 12B, 12C y 12D). En células tratadas con cisplatino, la renalasa produjo activación marcada y sustancial de AKT (no mostrado) y p38 (Figura 12E). Se obtuvieron resultados similares con RP H220, pero no con RP H220 mezclado. Se ha mostrado que AKT fomenta la supervivencia celular por factores de crecimiento contra varios estímulos apoptóticos, y se ha identificado el aumento de Bcl-2 como un mecanismo crítico.
Efectos hemodinámicos de RenPep1
Se examinó el efecto de 7 péptidos de renalasa diferentes (Figura 13) sobre la presión sanguínea sistémica y se encontró que la administración tanto IV como subcutánea de RP 220 tuvo un efecto marcado y sostenido en la presión sanguínea sistémica (Figura 14A). El efecto era específico para RP 220 ya que ninguno de los otros péptidos ensayados tuvo ningún efecto medible en la PS.
La renalasa media sus efectos fisiológicos a través de un mecanismo mediado por receptor (véase la figura 15). Los péptidos de renalasa RP 220 y RP H220 son compuestos útiles para tratar y prevenir AKI isquémica y tóxica. RP 220 es un agente hipotensor potente y es útil para tratar y prevenir la hipertensión y otras afecciones cardiovasculares, tal como insuficiencia cardiaca congestiva.
Ejemplo 3: La isquemia renal aguda dism inuye la secreción de renalasa urinaria
Se realizaron experimentos que demuestran que la isquemia renal aguda produce una disminución en la secreción renal de renalasa, que se puede detectar como una disminución en el nivel de renalasa en sangre, suero, plasma y orina (Figura 16).
Ejemplo 4: La renalasa disminuye la presión sanguínea y protege contra lesión renal agua a través de un mecanismo mediado por receptor que es independiente del metabolismo de catecolaminas
Los datos descritos en el presente documento demuestran que la renalasa y péptidos de renalasa carentes de actividad amina oxidasa, señalizan a través de las rutas de AKT y MAPK, y que los péptidos mimetizan por completo las acciones citoprotectoras y hemodinámicas de renalasa recombinante.
Se ha mostrado que la proteína renalasa recombinante, sintetizada como una proteína de fusión con GST en E coli posee actividad amina oxidasa, y metaboliza epinefrina, norepinefrina y dopamina in vitro. La proteína renalasa recombinante produjo una disminución marcada en presión sanguínea cuando se inyecta en roedores (Xu et al., 2005, J Clin Invest 115:1275-1280). Se mostró posteriormente que la renalasa recombinante requería NAD(P)H para actividad completa, y la velocidad de metabolismo de epinefrina (el sustrato preferido de renalasa) aumentó 18 veces en presencia de NADH.
Las isoformas de renalasa 3-7 carecen de grandes porciones del dominio putativo amina oxidasa, son significativamente más cortas que las isoformas 1 y 2, y es improbable que posean actividad oxidasa. RP-220 está conservado en todas las isoformas de renalasa, incluyendo la isoforma más corta 7 que carece de los 4 primeros exones. La isoforma 1 y RP-220 señalizan rápidamente a través de las rutas de PI3K y MAPK para activar AKT, ERK y p38, que es consistente con la explicación de que ambos actúan uniéndose a un receptor de superficie celular específico. La activación de AKT y e Rk es en general protectora en AKI isquémica (Arany y Safirstein, 2003, Semin Nephrol 23:460-464). La inhibición farmacológica tanto de AKT como ERK anuló el efecto protector de RP-220 contra AKI isquémica confirmando su papel protector en lesión isquémica.
Como es el caso en la lesión cardiaca isquémica y AKI isquémica, la deficiencia en renalasa agrava la AKI por cisplatino. Renalasa y RP-H220 protegen contra AKI por cisplatino. En este sentido, la renalasa, y los péptidos derivados de ella, actúan como factores de supervivencia generales interceptando rutas que llevan a la muerte celular en estrés. Las principales entre esas rutas son las MAPK y AKT (Safirstein, 2004, Int Supl:S62-66; Arany y Safirstein, 2003, Semin Nephrol 23:460-464). Al cambiar el equilibrio entre la activación de ERK y JNK hacia mayor activación de ERK y AKT, las células pueden resistir exposición a oxidante, o tóxico (Arany et al., 2004, Kidney Int. 65:1231-1239; Arany et al., 2004, American Journal of Physiology: Renal Physiology 287:F543-549; Pabla y Dong, 2008, Kidney Int 73:994-1007). La muerte celular inducida por cisplatino es dependiente de la señalización de EGFR/Src/ERK en células de túbulo proximal en ratón. Parecería que la renalasa y sus péptidos activos derivados involucran estas rutas de una manera bastante similar a otros péptidos más clásicamente asociados con crecimiento y supervivencia en estrés.
RP-H220 era más eficaz que RP-220 contra AKI isquémica. Aunque no se detectó diferencia en los patrones de señalización de los dos péptidos en células HK-2, es posible que existan diferencias sutiles en el patrón global de señalización de AKT y MAPK, que explican la mayor eficacia de RP-H220 en AKI isquémica. Una explicación alternativa y tal vez más probable para la diferencia en los efectos protectores de RP-220 y RP-H220 es la marcada diferencia en sus efectos hemodinámicos. RP-220 reduce la presión sanguínea mientras que RP-H220 no. La hipotensión inducida por RP-220 comprometería el flujo sanguíneo renal y contrarrestaría parcialmente su efecto citoprotector.
Como se describe en el presente documento, tanto RP-220 como RP-H220 son citoprotectores, pero solo RP-220 disminuye la presión sanguínea. Estas observaciones son consistentes con la explicación de que los dos péptidos se podrían unir a un único receptor de renalasa con diferentes patrones de señalización. Alternativamente, se podrían unir a dos receptores diferentes, pero relacionados. La rápida caída en la presión sanguínea sugiere que RP-220 produce vasodilatación periférica. La inhibición farmacológica del receptor de tipo D1 no tuvo efecto en la respuesta hipotensora a RP-220, consistente con la explicación de que el receptor de dopamina no desempeña un papel en mediar el efecto hemodinámico de RP-220.
Mientras que no se desea estar vinculado por ninguna teoría particular, los resultados descritos en el presente documento son consistentes con la explicación de que RP-220 disminuye la presión sanguínea al interaccionar con una proteína receptor acoplada de proteínas G (GPCR) previamente caracterizada, un receptor guanilil ciclasa (RGC) o uno de los GPCR y RGC huérfanos.
Lo descrito en el presente documento demuestra una región crítica de la molécula de renalasa que media sus efectos citoprotectores y hemodinámicos. Además, se muestra que estos dos efectos se pueden disociar. Por último, se muestra que renalasa protege contra lesión tóxica e isquémica y que disminuye la presión sanguínea no por su propiedad amina oxidasa, sino más bien por su interacción con un receptor aún no identificado que activa la señalización intracelular de una manera que fomenta la supervivencia celular.
Los métodos y materiales usados en este ejemplo se describen ahora.
Síntesis y análisis de renalasa humana recombinante y péptidos de renalasa
La renalasa recombinante humana se sintetizó como se ha descrito (Desir et al., 2012, J Am Heart Assoc. 1:e002634). Los péptidos de renalasa se acetilaron en el extremo amino y se purificaron al 98% de homogeneidad (United Peptides, Herndon, VA). La actividad enzimática de renalasa se midió como se ha descrito previamente (Desir et al., 2012, J Am Heart Assoc. 1:e002634). La expresión de renalasa se detectó usando un anticuerpo monoclonal anti-renalasa generado contra el péptido de renalasa RP-220 (aminoácidos 220-239 de hRenalasa1) (Desir et al., 2012, J Am Heart Assoc. 1:e002634).
Modelo murino de AKI por cisplatino
Se administró cisplatino (15-20 mg/kg) por inyección intraperitoneal (IP) a ratones WT o KO de renalasa con anestesia de isoflurano breve. Los animales se sacrificaron 3 días después. Se recogió sangre para medidas de BUN y creatinina, y se recogieron los riñones para examen histológico, inmunofluorescencia (IF) e inmunotransferencia (WB). Un patólogo renal, sin conocer la identidad del animal de estudio, revisó cada muestra de riñón. Las características patológicas se puntuaron usando una escala de valoración ordinal (0-4; 0 = nada; 1 = <25%; 2 = 26-50%; 3 = 51-75%; 4 = 76-100%) para la presencia de necrosis tubular. Se realizó morfometría de la corteza y médula renal usando una técnica de contar puntos. Se contaron los puntos que están en túbulos lesionados, y se calculó el porcentaje de área de lesión como el porcentaje de los puntos totales contados.
Modelo murino de lesión de isquemia reperfusión (IR) renal
Después de la aprobación del comité de cuidado y uso de animales, C57BL/6 adultos machos (Harlan Labs, Indianápolis, IN) se sometieron a operación de referencia o a 30 minutos de isquemia renal seguida por 24 hr de reperfusión como se ha descrito previamente (Lee et al., 2004, American journal of physiology. Renal physiology 286:F298-306). Para probar los efectos protectores renales de los péptidos de renalasa (r P-220, Rp -H220 y RP-224), los ratones se pretrataron con solución salina (vehículo) o con péptidos de renalasa (100 |jg subcutánea) 10 o 30 minutos antes de la isquemia renal.
Modelo in vitro de toxicidad de cisplatino y peróxido de hidrógeno
Se cultivaron células HK2 (línea tubular proximal humana) obtenidas de la ATCC (Manassas, VA, EE UU) en DMEM/F12 suplementado con glutamina, SBF al 10% y antibióticos, y se mantuvieron a 37°C en CO2 al 5%. Las células se expusieron a cisplatino (20 jM ) en presencia o ausencia de renalasa durante 24 hr, y la viabilidad celular se evaluó por el método WST1 (Roche Applied Science, Alemania). Las células se recogieron después en tampón RIPA (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Na2EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 1%, pirofosfato de sodio 2,5 mM, p-glicerofosfato 1 mM, Na3VO4 1 mM, leupeptina 1 jg/m l) suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas y fosfatasas (Roche Applied Science, Alemania). Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y se llevó a cabo inmunotransferencia usando los siguientes anticuerpos: anti-renalasa monoclonal (Desir et al., 2012, J Am Heart Assoc. 1:e002634; (Lee et al., 2013, J Am Soc Nephrol 24:445-455); anti caspasa 3 (Cell Signaling Technology, MA, EE UU) y anti Bcl2 (Thermo Scientific, USA). La lesión necrótica en células HK-2 (ATCC, Manassas, VA) se indujo con exposición a H2O2 2 mM durante 2-8 hr y se midió la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada al medio de cultivo celular como se ha descrito usando un kit de ensayo de LDH comercial (Promega, Madison, WI) (Lee y Emala, 2002, American journal of physiology. Renal physiology 282:F844-852).
Medida de la función renal
Se recogió sangre de ratones anestesiados con isoflurano mediante punción cardiaca en una jeringa heparinizada y posteriormente se centrifugó para separar el plasma. Las muestras se enviaron al Yale O'Brien Kidney Center para medida de BUN y creatinina. La creatinina en plasma se midió mediante un kit de reactivo de creatinina enzimático según las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) o por HPLC. Estos métodos de medida de creatinina en gran medida eliminan las interferencias de cromágenos de plasma de ratón, que se sabe se producen con el método de Jaffe.
Medidas de la presión sanguínea
La presión sistólica y diastólica y la frecuencia cardiaca se midieron en ratones anestesiados como se ha descrito previamente (Desir et al., 2012, J Am Heart Assoc. 1:e002634).
Detección histológica de apoptosis e infiltración de macrófagos
La apoptosis en riñones se detectó en ratones WT y KO con tinción TUNEL como se ha descrito usando un kit de apoptosis in situ comercialmente disponible (EMD Millipore, MA, EE UU) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Las infiltraciones de macrófagos en riñón se evaluaron con inmunohistoquímica 72 horas después del tratamiento con cisplatino o tratamiento con renalasa usando tinción con anti-F4/80 (AbCAM, MA, EE UU). El anticuerpo primario se diluyó 1:80. Posteriormente se detectó con IgG de rata conjugada a HRP, localizado con DAB, contrateñido con DAB, y montado con medio de montaje resinoso. La tinción TUNEL de riñón y la infiltración de macrófagos se cuantificaron en 5 campos de imágenes microscópicas elegidos al azar en la unión cortico-medular.
Análisis estadístico
Cuando fue apropiado, se usó el análisis unidireccional de Kruskal-Wallis de varianza por órdenes para evaluar la significación estadística. Cuando la prueba de Kruskal-Wallis reveló significación estadística, se usó la prueba de Mann-Whitney para comparaciones por pares. Todos los datos son medias ± EEM, y se aceptaron valores de P<0,05 como diferencia estadísticamente significativa. El análisis estadístico se llevó a cabo usando GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).
Los resultados de este ejemplo se describen ahora.
La renalasa recombinante protege a las células HK-2 contra lesión oxidante y de cisplatino
Se ha mostrado previamente que la deficiencia en renalasa agrava AKI isquémica (Lee et al., 2013, J Am Soc Nephrol 24:445-455). En este estudio, se evaluó si la deficiencia en renalasa exacerbaría similarmente AKI tóxica de cisplatino (Safirstein, 2004, Int Supl:S62-66). Tres días después del tratamiento con cisplatino (20 mg/kg, por inyección intraperitoneal), la creatinina en plasma era significativamente mayor en ratones KO de renalasa comparados con ratones WT (1,82±0,56 frente a 0,71±0,02 mg/dl, n = 6, P=0,021) (Figura 17A). Los ratones deficientes en renalasa desarrollaron peor lesión histológica renal comparados con ratones WT de renalasa (Figura 17B). Los ratones KO de renalasa mostraron más necrosis tubular aguda grave comparados con ratones WT (puntuación de lesión: KO = 56,62±7,38% n = 6, WT = 17,07±4,03, n = 5; P=0,0002). El número de células renales apoptóticas (tinción rojiza) aumentó 2 veces en ratones KO tratados con cisplatino comparados con ratones WT (Figura 17C). Asimismo, la infiltración de macrófagos renal estaba significativamente aumentada (tinción marrón) en ratones KO comparados con ratones WT (Figura 17D). Con el fin de aclarar el mecanismo de protección renal por renalasa, se evaluó si la renalasa recombinante podría proteger células en cultivo. En células HK-2, la renalasa recombinante redujo significativamente la necrosis inducida con H2O22 mM comparado con células HK-2 tratadas con vehículo (Figura 18A). Las células HK-2 expuestas a cisplatino durante 24 horas mostraron viabilidad celular (Figura 18B, panel izquierdo) y expresión de renalasa (Figura 18B, panel derecho) disminuidas, ambas de las cuales se revertían por la adición de renalasa exógena. El tratamiento con renalasa inhibió la activación de caspasa-3 (Figura 18C) y aumentó la expresión de Bcl-2 (Figura 18D). Aunque sin querer estar vinculado a ninguna teoría particular, estos datos celulares in vitro son consistentes con la explicación de que el efecto protector in vivo de renalasa puede no estar mediado solamente por una reducción en catecolaminas circulantes.
La protección de la renalasa contra lesión celular y de órgano es independiente de su función enzimática
Hay un único gen de renalasa (10 exones), que experimenta ayuste alternativo para dar lugar a al menos 6 isoformas (renalasa 1-7) como se documenta por PCR de tejido humano (Hennebry, 2010, Mol Psychiatry 15:234-236) y datos de secuenciación génica (GENBANK) (Figura 19A). La mitad carboxi terminal del exón 6 está presente en todas las isoformas de ayuste detectadas hasta ahora. El examen de la estructura cristalina de la renalasa indica que los péptidos 220 y 224 (RP-220 y RP-224, Figura 19A) están localizados en la superficie externa de la proteína (Milani et al., 2011, J Mol Biol 411:463-473). Mientras que el anticuerpo monoclonal generado contra RP-220 no alteró la actividad amina oxidasa de renalasa, el anticuerpo era citotóxico para células CCL-119 (línea de células leucémicas linfoblásticas agudas, ATCC) (Figura 19B). Estos hallazgos indicaban que el epítopo es accesible al anticuerpo y está probablemente localizado en la superficie externa de la proteína. El efecto citotóxico del anticuerpo en ausencia de actividad amina oxidasa alterada también sugería que el anticuerpo podría disminuir la supervivencia celular al interferir con la interacción de renalasa con un putativo compañero de unión, tal vez un receptor de membrana.
Estos hallazgos son consistentes con la explicación de que RP-220 podría representar el punto de contacto entre renalasa y su receptor afín. Por tanto, se ensayó si RP-220, RP-H220 y RP-224 imitarían la acción citoprotectora de renalasa in vitro. En células HK-2 incubadas con H2O2 2 mM, tanto RP-220 como RP-H220 significativamente redujeron la necrosis comparado con células tratadas con vehículo (Figura 19C) a las 2 y 4 hr. RP-224 también era protector a las 2 hr, pero no a las 4 hr. Se obtuvieron resultados similares con células HK-2 expuestas a cisplatino durante 24 hr, y como se muestra en la figura 19D, renalasa, RP-224, RP-220 y RP-H220 mejoraron la supervivencia de células HK-2.
Se mostró previamente que la renalasa recombinante protege ratones contra AKI isquémica al reducir apoptosis, necrosis e inflamación (Lee et al., 2013, J Am Soc Nephrol 24:445-455). La eficacia de los péptidos de renalasa se ensayó en ratones WT sometidos a 30 min de isquemia renal seguida por 24 hr de reperfusión. RP-220 y RP-H220, administrados 30 min antes de la isquemia, redujeron la lesión renal (Figura 19E). RP-H220 era más eficaz que RP-220, mientras que RP-224 fue ineficaz. Ninguno de estos péptidos tenía ninguna actividad amina o NADH oxidasa detectable (Figura 19F), lo que sugiere que la acción citoprotectora in vitro de renalasa es independiente de su capacidad para metabolizar catecolaminas.
La activación de AKT y MAPK crítica para el efecto protector de los péptidos de renalasa
El hallazgo de que péptidos de renalasa sin actividad oxidasa detectable eran igualmente eficaces como renalasa recombinante en proteger ratones contra AKI llevó a una búsqueda para mecanismos no relacionados con el metabolismo de catecolaminas. Las rutas de transducción de señales de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) coordinan respuestas celulares a varias señales, incluyendo hormonas, citoquinas y factores de crecimiento (Kyriakis et al., 2012, Physiological Reviews 92:689-737), y modulan el desarrollo y gravedad de AKI experimental (Bonventre y Yang, 2011, The Journal of Clinical Investigation 121:4210-4221). Por tanto, se evaluó si la renalasa y péptidos relacionados señalizan a través de la proteína quinasa B (AKT) y MAPK, y que tal señalización era crítica para su acción protectora contra AKI. La adición de renalasa recombinante a células HK-2 en cultivo produjo un aumento rápido y transitorio en proteína quinasa regulada por señal extracelular 1 y 2 (ERK) y p38 MPAK fosforiladas (Figura 20A, panel izquierdo). Asimismo, RP220 indujo fosforilación rápida y transitoria de ERK, p38 (Figura 20A, panel derecho), y proteína quinasa B (AKT) (Figura 20B, panel izquierdo). La fosforilación aumentada era detectable a 1 min de añadir RP-H220, con un retorno al nivel basal a los 60 min (Figura 20B, panel derecho). La fosforilación de JNK disminuía a los 60 min. Se obtuvieron resultados similares con RP-220. En estudios control, RP-Scr220, una versión mezclada de RP-220, no activó la señalización de AKT y MAPK. Se empleó la inhibición química de la señalización de ERK y AKT para ensayar si estas moléculas eran mediadores importantes del efecto protector de RP-H220 en AKI. Como se muestra en otra parte en el presente documento, RP-H220 mejoró la lesión isquémica renal en ratones WT. El inhibidor de MEK1 2'-amino-3'-metoxiflavona (PD98059) anuló por completo la acción protectora del péptido (Figura 20C). Se obtuvo un resultado similar con la inhibición de PI3K/AKT por wortmanina (Figura 20C). En estudios control, el pretratamiento con PD98059 o wortmanina solos sin los péptidos no tuvo efecto en la gravedad de AKI es ratones WT isquémicos (Figura 20C). Estos resultados son consistentes con la explicación de que el efecto protector de renalasa en AKI isquémica está mediado, al menos en parte, a través de la señalización de ERK1/2 y PI3K/AKT.
Efecto hemodinámico de péptidos de renalasa
Como se muestra en la figura 19E, RP-H220 era más eficaz que RP-220 en proteger contra AKI isquémica. Puesto que no se detectó ninguna diferencia en los patrones de señalización de MAPk entre los dos péptidos, se evaluó si los péptidos afectaban la hemodinámica sistémica de forma diferente. Se examinaron los efectos de los dos péptidos en la presión sanguínea y frecuencia cardiaca en ratones WT anestesiados. Como se muestra en la figura 14A, una única inyección intravenosa de RP-220 produjo una caída profunda en la presión sanguínea a los 30 segundos, y hasta dos horas. La administración subcutánea de RP-220 también disminuyó la presión sanguínea, con un retraso de 30-60 min en el inicio de la caída en la presión sanguínea (Figura 21). En marcado contraste, ni la inyección intravenosa ni la subcutánea de RP-H220 tuvo ningún efecto en la presión sanguínea (Figura 14B). La frecuencia cardiaca aumentó en el 5% en ratones tratados con RP-220, pero no cambió con la administración de RP-H220 (Figura 14C). Similar a RP-241 H220, RP-224 y RP-Scr220 no tuvieron efecto en la presión sanguínea ni la frecuencia cardiaca. Se describe que la activación de receptor de dopamina 1/5 (tipo D1) por fenoldopam aumenta la expresión del gen y la proteína renalasa (Wang et al., 2012, Hypertension 60). Para ensayar si el efecto hipotensor de RP-220 estaba mediado a través de receptores de tipo D1, se determinó el efecto del bloqueante del receptor D1, SCH23390, en ratones WT. El pretratamiento con SCH23390 no contrarrestó el efecto hipotensor de RP-220 (disminución de la presión sanguínea media a los 15 min: 11,9±0,9 y 10,5±0,9 mmHg para RP-220 y RP-220 SCH23390,

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para uso en tratar una enfermedad o trastorno renal en un sujeto, comprendiendo el uso administrar al sujeto la composición, en donde la composición comprende al menos un agente, en donde el al menos un agente es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un fragmento de polipéptido renalasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y un fragmento de polipéptido renalasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
2. La composición para uso de la reivindicación 1, en donde la enfermedad o trastorno renal es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en lesión isquémica renal, lesión de reperfusión renal, lesión isquémicareperfusión renal, lesión renal tóxica, necrosis tubular renal, inflamación tubular renal, apoptosis tubular renal.
3. Una composición que comprende un fragmento de polipéptido renalasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
4. Una composición que comprende un fragmento de polipéptido renalasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 para uso en tratar hipertensión.
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