JP2015525772A - 疾患および障害を検出、治療、および予防するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年7月16日に提出された米国仮出願第61/671,826号、2013年1月10日に提出された米国仮出願第61/750,916号、および2013年4月19日に提出された米国仮出願第61/813,778号に対する優先権を主張するものであって、その出願のすべては参照により本明細書においてそれらの全体として本明細書によって組み入れられる。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所(NIH)によって与えられた助成金第RC1DK086465号、第RC1DK086402号、第RO1DK065172号、および第R01DK081037号の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
虚血性急性腎損傷(AKI)は、腎尿細管の死および全身性炎症をもたらす破壊的な臨床的合併症である。腎機能障害を有する患者は、上昇した血漿カテコールアミンレベルを有する。高血圧を引き起こすことに加えて、カテコールアミンは、敗血症および多臓器機能障害において炎症反応を生じさせる。
本発明は、レナラーゼおよびそのフラグメントが、心臓および腎臓の疾患または障害などの疾患または障害の治療または予防に有用であるという発見に関する。ゆえに、本発明は、レナラーゼまたはそのフラグメントを含む組成物、ならびに心臓および腎臓の疾患または障害を含めた疾患および障害を治療および予防するための方法に関する。いくつかの態様において、本発明の組成物および方法を用いて治療されるまたは予防される腎損傷は、虚血/再灌流(IR)によって引き起こされたAKIである。
別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が関連する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の試験のための実践には、本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい材料および方法が本明細書において記載される。本発明の記載および主張において、以下の専門用語が用いられる。
いくつかの態様において、本発明の組成物および方法は、心臓または腎臓の疾患または障害の治療または予防における使用のためのレナラーゼまたはそのフラグメントを含む。いくつかの態様において、本発明のレナラーゼは、SEQ ID NO: 9またはSEQ ID NO: 10のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、本発明のレナラーゼは、SEQ ID NO: 9またはSEQ ID NO: 10のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むレナラーゼフラグメントである。いくつかの態様において、レナラーゼフラグメントは、その防御活性を保持するが、検出可能なNADHオキシダーゼ活性を呈しないペプチドである。いくつかの態様において、レナラーゼフラグメントは、その防御活性を保持するが、検出可能なアミンオキシダーゼ活性を呈しないペプチドである。特定の態様において、レナラーゼフラグメントは、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含むペプチドである。別の特定の態様において、レナラーゼフラグメントは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含むペプチドである。別の特定の態様において、レナラーゼフラグメントは、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を含むペプチドである。別の特定の態様において、レナラーゼフラグメントは、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるペプチドである。別の特定の態様において、レナラーゼフラグメントは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列からなるペプチドである。別の特定の態様において、レナラーゼフラグメントは、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列からなるペプチドである。
種々の態様において、本発明は、レナラーゼ活性化剤組成物、およびその必要がある対象、組織、または臓器におけるレナラーゼまたはそのフラグメントのレベルまたは活性を増加させる方法を含む。種々の態様において、本発明のレナラーゼ活性化剤組成物および治療の方法は、レナラーゼポリペプチドの量、レナラーゼmRNAの量、レナラーゼ酵素活性の量、レナラーゼ基質結合活性の量、またはそれらの組み合わせを増加させる。種々の態様において、レナラーゼの増加が治療成果を向上させ得る疾患および障害には、AKI、心筋壊死、心不全、鬱血性心不全、心虚血損傷、心再灌流損傷、心虚血再灌流損傷、中毒性心損傷、腎虚血損傷、腎再灌流損傷、腎虚血再灌流損傷、中毒性腎損傷、腎尿細管壊死、腎尿細管炎症、腎尿細管アポトーシス、虚血性脳損傷、再灌流脳損傷、虚血再灌流脳損傷、中毒性脳損傷、虚血性肝損傷、再灌流肝損傷、虚血再灌流肝損傷、中毒性肝損傷、および高血圧が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の組成物および方法は、血圧を制御するまたは維持するのに有用である。いくつかの態様において、本発明の組成物および方法は、非限定的な例として、不安症、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、および注意欠陥多動性障害(ADHD)など、交感神経系の疾患および障害を治療または予防するのに有用である。
いくつかの態様において、比較物と比較したレナラーゼのレベルの変化(すなわち、増加または減少)を、腎臓の疾患もしくは障害、または心臓の疾患もしくは障害の診断のための、ならびに腎臓または心臓の疾患または障害の治療をモニターするためのマーカーとして本発明の方法に用いる。
種々の態様において、本発明は、レナラーゼの活性またはレベルの減衰が所望される疾患または障害を治療または予防するレナラーゼ阻害剤組成物および方法を含む。本発明の組成物および方法で治療され得るまたは予防され得る、レナラーゼの活性またはレベルの減衰が所望される疾患または障害の非限定的な一例には、癌が含まれる。種々の態様において、本発明の治療または予防のレナラーゼ阻害剤組成物および方法は、レナラーゼポリペプチドの量、レナラーゼmRNAの量、レナラーゼ酵素活性の量、レナラーゼ基質結合活性の量、またはそれらの組み合わせを減衰させる。
本発明は、また、本発明の方法において有用なキットに関する。そのようなキットは、例えばレナラーゼ活性化剤、レナラーゼ阻害剤、レナラーゼポリペプチドまたはレナラーゼ核酸を定量的に解析するための物質、レナラーゼポリペプチドまたはレナラーゼ核酸の活性を査定するための物質、および教材を含めた、本明細書における他の箇所で記載される方法のいずれかにおいて有用な構成成分の種々の組み合わせを含む。例えば、一態様において、キットは、生物学的サンプルにおけるレナラーゼ核酸の定量化に有用な構成成分を含む。別の態様において、キットは、生物学的サンプルにおけるレナラーゼポリペプチドの定量化に有用な構成成分を含む。さらなる態様において、キットは、生物学的サンプルにおけるレナラーゼポリペプチドの活性(例えば、酵素活性、基質結合活性等)の査定に有用な構成成分を含む。
ここで記載されるように、レナラーゼポリペプチド、レナラーゼポリペプチドフラグメント、レナラーゼのレベルもしくは活性の活性化剤、またはレナラーゼのレベルもしくは活性の阻害剤を含む組成物を製剤化しかつ対象に投与することができる。非限定的な例として、ここで記載されるように、疾患または障害の治療および/または予防のための、レナラーゼポリペプチド、組換えレナラーゼポリペプチド、および活性レナラーゼポリペプチドフラグメントを含めた、有用なレナラーゼ活性体(active)または活性化剤として同定された組成物を製剤化しかつ対象に投与することができる。より非限定的な例として、ここで記載されるように、疾患または障害の治療および/または予防のための、化学物質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、小分子化学物質、アンチセンス核酸分子(例えば、siRNA、miRNA等)を含めた、有用なレナラーゼ阻害剤として同定された組成物を製剤化しかつ対象に投与することができる。
本発明は、以下の実験例に関してさらに詳細に記載される。これらの実施例は、単なる例証を目的とするものであり、別様に指定されない限り、限定することを意図するものではない。ゆえに、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される本教示の結果として明白となるありとあらゆる変化形を包含すると解釈されるべきである。
レナラーゼは、循環カテコールアミンを分解しかつ心筋壊死を低下させる、腎近位尿細管により分泌されるアミンオキシダーゼである。本明細書において提示されるデータは、レナラーゼが腎臓の虚血および再灌流による損傷を防御することを実証している。本明細書において示されるように、レナラーゼは、腎近位尿細管で選択的に発現するが、腎遠位尿細管では発現しない。腎虚血再灌流損傷に供されたマウスは、シャム手術マウスと比較して、有意に低下した腎臓および血漿でのレナラーゼレベルを有した。これと合致して、マウスの血漿ノルエピネフリンレベルは、腎虚血再灌流損傷の後に有意に増加した。さらに、腎臓の虚血および再灌流に供されたレナラーゼ欠損マウスは、レナラーゼ野生型マウスと比較してより高い血漿カテコールアミンレベルとともに、悪化した腎尿細管の炎症、壊死、およびアポトーシスを有した。組換えヒトレナラーゼの投与は、腎尿細管の壊死、炎症、およびアポトーシスを低下させることによって、レナラーゼ野生型マウスにおいて、血漿カテコールアミンレベルを低下させかつ虚血性急性腎損傷を改善させた。まとめると、本データは、レナラーゼが、腎尿細管の壊死、アポトーシス、および炎症を低下させることによって、虚血性急性腎損傷を防御することを示している。組換えレナラーゼ療法は、急性腎損傷の予防および治療のための新規な治療的アプローチを提供する。加えて、血漿レナラーゼは虚血性急性腎損傷の後に減少するため、血漿レナラーゼレベルは、急性腎損傷の検出のための新規なかつ高感度のバイオマーカーとしての役割を果たす。
記載されているように(Desir et al, 2012, J. of the Am. Heart Assn, 1(4): e002634)、ヒト組換えレナラーゼを合成した。
記載されているように(Kim et al., 2009, Kidney Int 75: 809-823;Kim et al., 2010, Am J Physiol Renal Physiol 299(2): F347-58)、C57BL/6バックグラウンドでの成体オスのレナラーゼ欠損(KO)マウス(Wu et al., 2011, Kidney Int 79: 853-860)を腎虚血/再灌流(IR)に供した。レナラーゼKOまたは野生型(WT)マウス(Harlan Labs, Indianapolis, INからのC57BL/6)を、シャム手術、または20分間(中程度)もしくは30分間(重度)の腎虚血および24時間の再灌流に供した。組換えヒトレナラーゼの腎防御効果を試験するために、30分間の腎虚血の10分前に、マウスを生理食塩水(ビヒクル)または組換えレナラーゼ(0.5、1.5、または4.5mg/kg、皮下(s.c.))で前処理した。腎虚血の完了後のレナラーゼ処理も腎防御を提供するかどうかも試験した。マウスの別個のコホートを、虚血腎の再灌流の30分または60分後に、生理食塩水またはレナラーゼ(1.5mg/kg、s.c.)で処理した。α受容体の遮断が、ヒト組換えレナラーゼ投与の腎防御効果を模倣するかどうかを試験するために、フェントラミン(α受容体アンタゴニスト、5mg/kg、腹腔内(i.p.))を腎虚血の15分前に一部のマウスに与えた。
血漿クレアチニンを、メーカーの指示に従って、酵素的creatinine reagentキット(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)で、記載されているように(Slot, 1965, J Clin Lab Invest 17: 381-387)測定した。
シャム手術または腎IRに供されたマウスにおける血漿ノルエピネフリンを、メーカーの指示に従って、商業的ELISAキットで測定した(Rocky Mountain Diagnostics, Colorado Springs, CO)。
Jablonskiら(1983, Transplantation 35: 198-204) によって概説されているように、および以前の研究(Lee et al., 2004, J Am Soc Nephrol 15: 102-111;Lee et al., 2004, Am J Physiol Renal Physiol 286: F298-F306)に記載されているように、近位尿細管に対する壊死性損傷についての確立された評価尺度(0〜4、腎損傷スコア)を、IRにより誘導されたダメージの病理組織学的な査定に用いた。アポトーシスを、メーカーによって提供された指示書に従って、市販のin situ cell death detection kit(Roche, Indianapolis, IN)を用いて、記載されているように(Park et al., 2011, Lab Invest 91: 63-84)、腎IR後にTUNEL染色で検出した。以前に記載されているように(Park et al., 2011, Lab Invest 91: 63-84)、腎臓の好中球およびマクロファージの浸潤を、IRの24時間後に免疫組織化学により査定した。腎臓に浸潤している好中球およびマクロファージを、皮髄境界部における5〜7枚の無作為に選出された200倍(好中球)または400倍(マクロファージ)の顕微鏡画像視野で定量化し、かつ結果を200〜400倍視野あたりで計数された好中球として表現した。
記載されているように(Kim et al., 2010, Am J Nephrol 31: 353-362)、マウスレナラーゼをコードするmRNAをRT-PCRで測定した。等しいRNA投入量を制御するために、GAPDH mRNAも測定した。加えて、以前に記載されているように(Kim et al., 2010, Am J Nephrol 31: 353-362)、レナラーゼ(Abcam, Cambridge, MA)およびβ-アクチン(内部タンパク質のローディング対照、Sigma)についての免疫ブロット解析のために、マウス腎皮質も回収した。
IL-17A、細胞間接着分子1(ICAM-1)、単球走化性タンパク質1(monocyte chemoattractive protein 1)(MCP-1)、マクロファージ炎症性タンパク質2(MIP-2)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、およびIL-6(肝臓および腎臓のみ)を含めた、炎症のマーカーをコードするmRNAを測定することによって、マウスにおける腎IR後の腎炎をさらに判定した。記載されているように(Park et al., 2011, Lab Invest 91: 63-84)、RT-PCRを実施した。
ヒトレナラーゼ配列に対して、レナラーゼ抗体を合成した。ブタ腎臓において、レナラーゼ免疫組織化学を実施した。ブタ腎臓薄片を固定し、透過処理し、かつ抗レナラーゼ28-4(レナラーゼペプチド
に対して産生させた)および抗E-カドヘリン(BD Biosciences)または抗メガリンの一次抗体とともに2時間インキュベートした。次いで、二次抗体(レナラーゼを検出するためのAlexa488-ヤギ抗ウサギ)およびAlexa555-ヤギ抗マウス(Molecular Probes、E-カドヘリンまたはメガリンを検出するための)を適用した。スライドを蛍光顕微鏡(Carl Zeiss, Inc.)で画像取得し、かつSPOTカメラソフトウェア(Diagnostic Instruments, Inc.)を用いて撮影した。
2群間の平均を比較する場合にはスチューデントt検定を用いて、または多群間を比較する場合には一元配置ANOVA+Tukey事後多重比較検定を用いて、データを解析した。異なるマウス系統または処理群に対するシャム手術または腎IR損傷の影響を試験するためには、二元配置ANOVA+Bonferroni事後検定を用いた。腎損傷スコアの通常値を、Mann-Whitneyノンパラメトリック検定によって解析した。すべての場合において、<0.05の確率統計をとって、有意性を表した。本書を通して、すべてのデータは平均±SEMとして表現されている。
図1Aは、メガリン(腎近位尿細管に対するマーカー)またはレナラーゼに対する抗体とインキュベートしたブタ腎臓組織についての免疫共局在解析を示している。レナラーゼおよびメガリン染色は完全に重なり合い、レナラーゼが腎近位尿細管で発現していることを表している。レナラーゼおよびE-カドヘリン(腎遠位尿細管に対するマーカー)に関する免疫共局在調査も実施した(図1B)。メガリンとは異なり、ブタ腎臓において、E-カドヘリンはレナラーゼと共局在しない。これらのデータは、腎近位尿細管におけるレナラーゼの選択的発現を表している。レナラーゼ抗体は、マウス近位尿細管におけるレナラーゼも検出した。
血漿ノルエピネフリン濃度は、レナラーゼWTマウスにおいて、腎IRの24時間後に増加した(シャム手術レナラーゼWTマウスと比較して>2倍、N=3〜5、図2)。血漿ノルエピネフリン濃度の増加は、腎IR後のレナラーゼ欠損マウスにおいてさらにより高かった(シャム手術レナラーゼKOマウスと比較して>5倍)。
血漿レナラーゼに対する免疫ブロットにより、腎IRの5時間および24時間後の血漿レナラーゼの有意な低下が明らかとなった(図3A、n=4〜5)。この血漿レナラーゼの減少と合致して、腎臓レナラーゼmRNAの発現は、腎IRの24時間後に有意に低減した(図3B、n=4)。
ベースラインの血漿クレアチニン値は、シャム手術(麻酔、開腹術、右腎摘出術、および回復)に供されたレナラーゼWTとレナラーゼKOとの間で同程度であった(図4A)。血漿クレアチニンは、シャム手術マウスと比較して、中程度(20分間)または重度(30分間)の腎IRに供されたレナラーゼWTおよびレナラーゼKOマウスにおいて有意に増加した(図4A、n=4〜6)。しかしながら、レナラーゼKOマウスは、中程度および重度の腎IR損傷の後の両方で、レナラーゼWTマウスと比較して、より高い血漿クレアチニンレベルによって表される腎損傷の有意な増加を有した。
外因性ヒト組換えレナラーゼでの前処理は、腎IR損傷を防御する。血漿クレアチニンは、シャム手術マウスと比較して、30分間の腎IRに供されたビヒクル(生理食塩水)処理マウスにおいて有意に増加した(図4B、n=4〜6)。ヒト組換えレナラーゼでの前処理(腎虚血の10分前に0.5、1.5、または4.5mg/kg s.c.)は、マウスにおいて血漿クレアチニンの増加を有意に低減させた。しかしながら、より高用量のヒト組換えレナラーゼ(4.5mg/kg)は、1.5mg/kgの組換えレナラーゼ用量と比較した場合、腎防御の低下を提供した。外因性レナラーゼ(1.5mg/kg)は、その腎防御効果と合致して、腎IR損傷に供されたマウスにおいて血漿ノルエピネフリンレベルを減少させた(ビヒクル注射したマウス血漿ノルエピネフリン=2.4±0.13ng/mL、n=4 対 レナラーゼ注射したマウス血漿ノルエピネフリン=1.6±0.2ng/mL、N=4、P<0.05)。
αアドレナリン作動性受容体の遮断は、ヒト組換えレナラーゼ投与の腎防御効果を模倣する。フェントラミン(非特異的ではあるが選択的なαアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト、5mg/kg、i.p.)は、30分間の腎IR損傷に供されたレナラーゼWTマウスにおいて有意な腎防御をもたらした(図4D)。さらに、フェントラミンは、30分間の腎IR損傷からレナラーゼKOマウスも防御した(図4D)。
中程度の腎IR損傷(20分間の腎虚血)に供されたレナラーゼ欠損マウスは、レナラーゼWTマウスと比較して、腎臓の組織学的損傷の悪化を高めた(尿細管壊死の増加、鬱血の増加を有するタンパク性円柱、図5A、上端のパネル、4〜6回の実験の代表的なもの)。対照的にかつ血漿クレアチニンのデータと合致して、ヒト組換えレナラーゼ(1.5mg/kg)で処理されたレナラーゼWTマウスは、ビヒクル処理レナラーゼWTマウスと比較して、劇的に低下した損傷を有した(図5A、下端のパネル)。Jablonski尺度(Jablonski et al., 1983, Transplantation 35: 198-204)の腎損傷スコア(尺度:0〜4)を用いて、腎IRの24時間後に腎尿細管壊死を採点した(図5B、N=4〜6)。中程度の腎IR損傷(20分間の腎虚血)に供されたレナラーゼKOマウスは、20分間の腎IR損傷に供されたレナラーゼWTマウスとは異なり、重度の急性尿細管壊死(>3の腎損傷スコアを有する)を示した。対照的に、ヒト組換えレナラーゼで処理されたレナラーゼWTマウスは、30分間の腎IR損傷に供されたビヒクル処理レナラーゼWTマウスと比較して、有意により低い腎損傷スコアを有した。
TUNEL染色は、優勢な近位尿細管細胞アポトーシスとともに、腎IRに供されたマウスの腎臓においてアポトーシス腎細胞を検出した(図6A、倍率100倍、4回の実験の代表的なもの)。シャム手術マウスの腎臓とは異なり、30分間の腎虚血および24時間の再灌流は、ビヒクル(生理食塩水)処理マウスの腎臓において重度のアポトーシスをもたらした(図6A)。腎虚血の10分前に与えられた組換えレナラーゼ(1.5mg/kg、s.c.)は、腎臓におけるアポトーシスTUNEL陽性細胞の数を有意に低下させた(図6B、N=4)。
腎IRの24時間後の腎臓における炎症誘発性サイトカインmRNA(TNF-α、ICAM-1、MCP-1、およびMIP-2)の発現を、RT-PCRで測定した(プライマー配列は表1に列挙されている)。レナラーゼWTマウスは、シャム手術レナラーゼWTマウスと比較して、検討したすべての炎症誘発性mRNAの発現を有意に増加させた(図8)。さらに、レナラーゼ欠損マウスは、レナラーゼWTマウスと比較して、ICAM-1発現のいかなる変化もなく、TNF-α、MCP-1、およびMIP-2のさらにより大きな増加を有した。
実験を実施して、マウスにおいて虚血性AKIがレナラーゼ欠損につながるかどうか、およびレナラーゼ欠損が虚血性AKIを直接悪化させるかどうかを査定した。ゆえに、実験を実施して、1)虚血性AKIが、腎臓および血漿でのレナラーゼレベルの低下につながるかどうか、2)虚血性AKIにより誘導されたレナラーゼ欠損が、血漿カテコールアミン(ノルエピネフリン)レベルの上昇につながるかどうか、3)レナラーゼ欠損マウスが、腎IR損傷の増加を呈するかどうか、ならびに4)組換えヒトレナラーゼの外因性投与が、マウスにおいて虚血性AKIを直接防御するかどうかを試験した。
シスプラチン誘導性AKIを治療することにおける組換えレナラーゼの有効性を検証し、かつその防護作用を仲介するメカニズムを査定した。シスプラチン(20mg/kg)を、WTまたはレナラーゼKOマウスのいずれかに腹腔内注射によって投与した。マウスを3日後に屠殺した。BUNおよびクレアチニン測定のために血液を回収し、かつ組織学的検討、免疫蛍光法(IF)、およびウェスタンブロット(WB)のために腎臓を採取した。調査動物の同定に対してマスク化された1人の腎臓病理学者が、それぞれの腎臓標本を審査した。尿細管壊死の存在について、病理学的特質を通常の評定尺度(0〜4;0=なし;1=<25%;2=26〜50%;3=51〜75%;4=76〜100%)を用いて採点した。腎皮質および腎髄質の形態計測を、ポイントカウント技術を用いて実施した。損傷した尿細管に位置するポイントを計数し、かつ計数された全ポイントについてのパーセンテージとして病変領域のパーセンテージを算出した。
シスプラチン処理したHK-2細胞への外因性レナラーゼの添加は、カスパーゼ3活性化を阻害し、かつBcl-2発現および細胞生存を増加させ、レナラーゼのインビボにおける防御効果が、循環カテコールアミンの低下によってのみ仲介され得るわけではないことを示唆した。レナラーゼの結晶構造の検討および抗ペプチドモノクローナル抗体を用いたインビトロ調査は、高度に保存されたレナラーゼペプチド(RP H220、26アミノ酸(aa))の同定につながり、それは、マウスにおいて検出可能なNADHオキシダーゼ活性またはアミンオキシダーゼ活性を有しないが、虚血(30分前に100μgを皮下に与えた)およびシスプラチン仲介性AKIを防御した(HPLCによって測定されたクレアチニン:シャム;0.05±0.002、シスプラチン;0.177±0.02、シスプラチン+RP H220;0.085±0.007、n=3、p=0.012)(図10)。より短いが関連するペプチド(RP 220、20aa)は効果がより少なく、一方で試験した最も短い関連ペプチド(RP 224、10aa)は防御的ではなかった。ゆえに、RP H220およびRP 220は、AKIの予防および治療に有用な化合物である。
培養ヒト近位尿細管上皮(HK-2)細胞において、組換えレナラーゼ(10μg/ml)は、H2O2による壊死に供されたビヒクル処理HK-2細胞(LDH=47+3%、N=3、p<0.01)と比較して、2mM H2O2で誘導される壊死を有意に低下させた(6時間の時点で放出されたLDH=28±2%、N=3)。同様の結果がRP H220に関して得られた。
RP H220は、検出可能なオキシダーゼ活性も全身血圧に対する有意な効果も有せず、それにもかかわらずマウスにおいて虚血性および中毒性AKIを防御するため、レナラーゼの防御効果が直接的な細胞効果によって部分的に仲介されるかどうかを査定した。予備的結果によれば、レナラーゼは、HK-2およびヒト静脈内皮細胞(HUVEC)においてBcl-2発現を24時間の時点で上方調節し(図12A)、かつAKTを活性化することにより(15分間の時点で約45倍)PI3K/AKT経路を介しておよびERKを活性化することにより(15分間の時点で約35倍)MAPK経路を介してシグナルを伝達し、かつJNKを下方調節する(JNK-p54/p46リン酸化の約95%減少)ことが示されている(図12B、12C、および12D)。シスプラチンで処理された細胞において、レナラーゼは、AKT(示さず)およびp38(図12E)の著しいかつ持続的な活性化を引き起こした。同様の結果がRP H220に関して得られたが、スクランブル型RP H220に関しては得られなかった。AKTは、いくつかのアポトーシス刺激に対して増殖因子により細胞生存を促進することが示されており、かつBcl-2上方調節は必須のメカニズムとして同定されている。
全身血圧に対する7種の異なるレナラーゼペプチド(図13)の効果を検討し、RP 220の静脈内投与(IV)および皮下投与の両方とも、全身血圧に対して著しいかつ持続的な効果を有することが見出された(図14A)。試験した他のペプチドのいずれも、BPに対していかなる測定可能な効果も有しなかったため、効果はRP 220に特異的であった。
急性腎虚血が、血液、血清、血漿、および尿におけるレナラーゼレベルの減少として検出され得る、レナラーゼの腎臓内分泌の減少をもたらすことを実証する実験を行った(図16)。
本明細書において記載されるデータは、レナラーゼ、およびアミンオキシダーゼ活性を欠いているレナラーゼペプチドがAKTおよびMAPK経路を介してシグナルを伝達すること、ならびに該ペプチドが組換えレナラーゼの細胞防御的および血行力学的な作用を十分に模倣することを実証している。
記載されているように(Desir et al., 2012, J Am Heart Assoc. 1: e002634)、ヒト組換えレナラーゼを合成した。レナラーゼペプチドをアミノ末端でアセチル化し、かつ98%均一性まで精製した(United Peptides, Herndon, VA)。以前に記載されているように(Desir et al., 2012, J Am Heart Assoc. 1: e002634)、レナラーゼの酵素活性を測定した。レナラーゼペプチドRP-220(hレナラーゼ1のアミノ酸220〜239)(Desir et al., 2012, J Am Heart Assoc. 1: e002634)に対して産出された抗レナラーゼモノクローナル抗体を用いて、レナラーゼ発現を検出した。
シスプラチン(15〜20mg/kg)を、WTまたはレナラーゼKOマウスのいずれかに、短時間のイソフルラン麻酔下で腹腔内注射(IP)によって投与した。動物を3日後に屠殺した。BUNおよびクレアチニン測定のために血液を回収し、かつ組織学的検討、免疫蛍光法(IF)、およびウェスタンブロット(WB)のために腎臓を採取した。調査動物の同定に対してマスク化された1人の腎臓病理学者が、それぞれの腎臓標本を審査した。尿細管壊死の存在について、病理学的特質を通常の評定尺度(0〜4;0=なし;1=<25%;2=26〜50%;3=51〜75%;4=76〜100%)を用いて採点した。腎皮質および腎髄質の形態計測を、ポイントカウント技術を用いて実施した。損傷した尿細管に位置するポイントを計数し、かつ計数された全ポイントについてのパーセンテージとして病変領域のパーセンテージを算出した。
動物実験委員会(animal care and use committee)による承認後、以前に記載されているように(Lee et al., 2004, American journal of physiology. Renal physiology 286: F298-306)、成体オスC57BL/6(Harlan Labs, Indianapolis, IN)を、シャム手術に、または30分間の腎虚血、それに続く24時間の再灌流に供した。レナラーゼペプチド(RP-220、RP-H220、およびRP-224)の腎防御効果を試験するために、腎虚血の10〜30分前に、マウスを生理食塩水(ビヒクル)またはレナラーゼペプチド(100μg皮下)で前処理した。
ATTC(Manassas, VA, USA)から得たHK2細胞(ヒト近位尿細管株)を、グルタミン、10% FBS、および抗生物質を補充したDMEM/F12中で培養し、かつ5% CO2中37℃で維持した。細胞をレナラーゼの存在下または非存在下でシスプラチン(20μM)に24時間曝露し、かつ細胞生存率をWST1法(Roche Applied Science, Germany)によって査定した。次いで、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(Roche Applied Science, Germany)を補充したRIPA緩衝液(20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1% NP-40、1%デオキシコール酸ナトリウム、2.5mMピロリン酸ナトリウム、1mM β-グリセロホスフェート、1mM Na3VO4、1μg/mlロイペプチン)中に細胞を採取した。タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、以下の抗体:抗レナラーゼモノクローナル(Desir et al., 2012, J Am Heart Assoc. 1: e002634;Lee et al., 2013, J Am Soc Nephrol 24: 445-455);抗カスパーゼ3(Cell Signaling Technology, MA, USA);および抗Bcl2(Thermo Scientific, USA)を用いてウェスタンブロットを行った。HK-2細胞(ATCC, Manassas, VA)における壊死性損傷を2mM H2O2への2〜8時間の曝露で誘導し、細胞培養培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)を、記載されているように(Lee and Emala, 2002, American journal of physiology. Renal physiology 282: F844-852)、商業的LDHアッセイキット(Promega, Madison, WI)を用いて測定した。
イソフルランで麻酔されたマウスから、心穿刺を介してヘパリン化シリンジ内に血液を回収し、その後、遠心分離して血漿を分離した。BUNおよびクレアチニンの測定のために、サンプルをYale O'Brien Kidney Centerに提出した。血漿クレアチニンを、メーカーの指示に従って酵素的creatinine reagentキット(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)によって、またはHPLCによって測定した。これらのクレアチニン測定の方法は、Jaffe法に関して生じることが知られている、マウス血漿色原体(chromagen)からの干渉を大幅に解消する。
以前に記載されているように(Desir et al., 2012, J Am Heart Assoc. 1: e002634)、麻酔されたマウスにおいて、収縮期および拡張期の圧力および心拍数を測定した。
腎臓のアポトーシスを、WTおよびKOマウスにおいて、メーカーによって提供された指示書に従って、市販のin situ apoptosis kit(EMD Millipore, MA, US)を用いて、記載されているようにTUNEL染色で検出した。腎臓のマクロファージ浸潤を、シスプラチンでの処理またはレナラーゼ処理の72時間後に、抗F4/80(AbCAM, MA, US)染色を用いて免疫組織化学により査定した。一次抗体を1:80希釈した。その後、それをHRP接合ラットIgGで検出し、DABで位置を突き止め、DABで対比染色し、かつ樹脂性封入溶剤で封入した。腎臓のTUNEL染色およびマクロファージ浸潤を、皮髄境界部における5枚の無作為に選出された顕微鏡画像視野で定量化した。
適切な場合に、Kruskal-Wallisの順位による一元配置分散分析を用いて、統計的有意性を評価した。Kruskal-Wallis検定により統計的有意性が明らかとなった場合、Mann-Whitney検定を一対比較に用いた。すべてのデータは平均±SEMであり、P<0.05の値を統計的に有意な差異として認めた。GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.)を用いて、統計解析を行った。
レナラーゼ欠損は、虚血性AKIを増悪させることが以前に示されている(Lee et al., 2013, J Am Soc Nephrol 24: 445-455)。本調査において、レナラーゼ欠損が、シスプラチンによる中毒性AKI(Safirstein, 2004, Int Suppl: S62-66)を同様に悪化させるかどうかを査定した。シスプラチン(20mg/kg、腹腔内注射による)での処理の3日後、血漿クレアチニンは、WTマウスと比較して、レナラーゼKOマウスにおいて有意により高かった(1.82±0.56 対 0.71±0.02mg/dl、n=6、P=0.021)(図17A)。レナラーゼ欠損マウスは、レナラーゼWTマウスと比較して、より悪い組織学的腎損傷を発症させた(図17B)。レナラーゼKOマウスは、WTマウスと比較して、より重度な急性尿細管壊死を示した(損傷スコア=:KO=56.62±7.38%、n=6、WT=17.07±4.03、n=5;P=0.0002)。アポトーシス腎細胞の数(赤みを帯びた染色)は、WTマウスと比較して、シスプラチン処理したKOマウスにおいて2倍増加した(図17C)。同様に、腎臓のマクロファージ浸潤は、WTマウスと比較して、KOマウスにおいて有意に増加した(茶色の染色)(図17D)。レナラーゼによる腎防御のメカニズムを解明するために、組換えレナラーゼが培養下の細胞を防御し得るかどうかを査定した。HK-2細胞において、組換えレナラーゼは、ビヒクル処理したHK-2細胞と比較して、2mM H2O2で誘導される壊死を有意に低下させた(図18A)。シスプラチンに24時間曝露されたHK-2細胞は、細胞生存率の減少(図18B、左のパネル)およびレナラーゼ発現の減少(図18B、右のパネル)を示し、それらの両方とも、外因性レナラーゼの添加によって逆転した。レナラーゼ処理は、カスパーゼ-3活性化を阻害し(図18C)、かつBcl-2発現を増加させた(図18D)。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、これらのインビトロの細胞データは、レナラーゼのインビボにおける防御効果が、循環カテコールアミンの低下によってのみ仲介され得るわけではないという説明と合致する。
ヒト組織のPCR(Hennebry, 2010, Mol Psychiatry 15: 234-236)および遺伝子シークエンシングデータ(GENBANK)によって立証されているように、選択的スプライシング(alternative splicing)を受けて少なくとも6種のアイソフォーム(レナラーゼ1〜7)を生じる単一レナラーゼ遺伝子(10個のエクソン)が存在する(図19A)。エクソン6のカルボキシ末端側半分は、これまでのところ検出されている、スプライシングを受けたすべてのアイソフォームに存在している。レナラーゼの結晶構造の検討により、レナラーゼペプチド220および224(RP-220およびRP-224、図19A)は、タンパク質の外部表面上に位置することが示されている(Milani et al., 2011, J Mol Biol 411: 463-473)。RP-220に対して産生されたモノクローナル抗体は、レナラーゼのアミンオキシダーゼ活性を変更しなかったが、一方で該抗体は、CCL-119細胞(急性リンパ芽球性白血病細胞株、ATCC)に対して細胞毒性があった(図19B)。これらの知見は、エピトープが該抗体に接近可能であり、かつ該タンパク質の外部表面上に位置することを示している。アミンオキシダーゼ活性の変更の非存在下での該抗体の細胞毒性効果により、該抗体は、レナラーゼと推定上の結合パートナー、おそらく膜受容体との相互作用を妨げることによって、細胞生存を減少させ得ることも示唆された。
検出可能なアミンオキシダーゼ活性を有しないレナラーゼペプチドが、AKIからマウスを防御することにおいて、組換えレナラーゼと同等に有効であるという知見は、カテコールアミン代謝に関係しないメカニズムの探索につながった。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)シグナル変換経路は、ホルモン、サイトカイン、および増殖因子を含めた種々のシグナルに対する細胞応答を協調させ(Kyriakis et al., 2012, Physiological Reviews 92: 689-737)、かつ実験的AKIの発症および重症度をモジュレートする(Bonventre and Yang, 2011, The Journal of Clinical Investigation 121: 4210-4221)。したがって、レナラーゼおよび関連ペプチドが、プロテインキナーゼB(AKT)およびMAPKを介してシグナルを伝達するかどうか、ならびにそのようなシグナル伝達が、AKIに対するそれらの防御作用に必須であることを査定した。培養下のHK-2細胞への組換えレナラーゼの添加は、細胞外シグナル制御キナーゼ1および2(ERK)ならびにp38 MAPKのリン酸化の急速かつ一時的な増加を引き起こした(図20A、左のパネル)。同様に、RP220は、ERK、p38(図20A、右のパネル)、およびプロテインキナーゼB(AKT)(図20B、左のパネル)の急速かつ一時的なリン酸化を誘導した。リン酸化の増加は、RP-H220を添加した1分以内に検出可能であり、60分以内にベースラインへ戻った(図20B、右のパネル)。JNKリン酸化は60分の時点で減少した。同様の結果がRP-220に関して得られた。対照調査において、RP-220のスクランブル版であるRP-Scr220は、AKTおよびMAPKシグナル伝達を活性化しなかった。ERKおよびAKTシグナル伝達の化学的阻害を採用して、これらの分子が、AKIにおけるRP-H220の防御効果の重要な仲介因子であるかどうかを試験した。本明細書における他の箇所で示されるように、RP-H220は、WTマウスにおいて腎虚血性損傷を改善させた。MEK1阻害剤の2'-アミノ3'メトキシフラボン(PD98059)は、該ペプチドの防御作用を完全に無効にした(図20C)。同様の結果が、ウォルトマニンによるPI3K/AKT阻害に関して得られた(図20C)。対照調査において、ペプチドなしで、PD98059またはウォルトマニン単独での前処理は、虚血性WTマウスにおけるAKIの重症度に対して効果を有しなかった(図20C)。これらの結果は、虚血性AKIにおけるレナラーゼの防御効果が、少なくとも部分的に、ERK1/2およびPI3K/AKTシグナル伝達を通して仲介されるという説明と合致する。
図19Eに示されるように、RP-H220は、虚血性AKIを防御することにおいて、RP-220よりも効果的であった。2種のペプチド間にMAPKシグナル伝達パターンの差異は検出されなかったため、該ペプチドが全身血行力学に差異的に影響を及ぼすかどうかを査定した。血圧および心拍数に対する2種のペプチドの効果を、麻酔したWTマウスにおいて検討した。図14Aに示されるように、RP-220の1回の静脈内注射は、30秒以内にかつ最大2時間の血圧の強い降下を引き起こした。RP-220の皮下投与も、血圧の降下の出現において30〜60分遅れて血圧を減少させた(図21)。著しく対照的に、RP-H220の静脈内注射も皮下注射も、血圧にいかなる効果も有しなかった(図14B)。心拍数は、RP-220処理マウスにおいて5%増加したが、RP-H220投与に関しては変化しなかった(図14C)。RP-241 H220と同様に、RP-224およびRP-Scr220は、血圧および心拍数に対して効果を有しなかった。フェノルドパムによるドーパミン1/5(D1様)受容体の活性化は、レナラーゼの遺伝子およびタンパク質の発現を上方調節することが報告されている(Wang et al., 2012, Hypertension 60)。RP-220の血圧低下効果がD1様受容体を通して仲介されるかどうかを試験するために、D1受容体遮断薬のSCH23390の効果を、WTマウスにおいて判定した。SCH23390での前処理は、RP-220の血圧低下効果を弱めなかった(15分の時点での平均血圧減少:RP-220およびRP-220+SCH23390について、それぞれ11.9±0.9および10.5±0.9mmHg、n=4、P=NS)。これらのデータは、RP-220の血圧低下効果がD1様受容体を通して仲介されるわけではないことを示唆している。
[本発明1001]
少なくとも1種の作用物質を含む組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象における腎臓の疾患または障害を治療する方法であって、該少なくとも1種の作用物質が、レナラーゼポリペプチド、レナラーゼポリペプチドフラグメント、およびレナラーゼ活性化剤からなる群より選択される少なくとも1種である、方法。
[本発明1002]
レナラーゼポリペプチドが組換えレナラーゼポリペプチドである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
レナラーゼポリペプチドがSEQ ID NO: 9のアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
レナラーゼポリペプチドがSEQ ID NO: 10のアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
少なくとも1種の作用物質が1回投与される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
少なくとも1種の作用物質が繰り返し投与される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
少なくとも1種の作用物質が、局部的に、領域的に、または全身的に投与される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
レナラーゼ活性化剤が、レナラーゼ発現の活性化剤、レナラーゼ活性の活性化剤、またはそれらの組み合わせである、本発明1001の方法。
[本発明1012]
レナラーゼ活性化剤が、化学物質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体(peptidomemetic)、および小分子化学物質からなる群より選択される少なくとも1種である、本発明1001の方法。
[本発明1013]
腎臓の疾患または障害が、腎虚血損傷、腎再灌流損傷、腎虚血再灌流損傷、中毒性腎損傷、腎尿細管壊死、腎尿細管炎症、腎尿細管アポトーシス、および高血圧からなる群より選択される少なくとも1種である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
対象がヒトである、本発明1001の方法。
[本発明1015]
SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含むレナラーゼポリペプチドフラグメントを含む、組成物。
[本発明1016]
SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含むレナラーゼポリペプチドフラグメントを含む、組成物。
[本発明1017]
SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を含むレナラーゼポリペプチドフラグメントを含む、組成物。
[本発明1018]
a.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルを決定する工程、
b.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルを比較対照と比較する工程、および
c.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、比較対照のレナラーゼのレベルと比較したときに低下している場合、対象を、腎臓の疾患または障害を有すると診断する工程
を含む、その必要がある対象における腎臓の疾患または障害を診断する方法。
[本発明1019]
腎臓の疾患または障害を有すると診断された対象を治療するさらなる工程を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼmRNAのレベルを測定することによって決定される、本発明1018の方法。
[本発明1021]
生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼポリペプチドのレベルを測定することによって決定される、本発明1018の方法。
[本発明1022]
生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼポリペプチドの酵素活性を測定することによって決定される、本発明1018の方法。
[本発明1023]
比較対照が、陽性対照、陰性対照、歴史的対照、歴史的規準、または前記生物学的サンプルにおける参照分子のレベルからなる群より選択される少なくとも1種である、本発明1018の方法。
[本発明1024]
腎臓の疾患または障害が、腎虚血損傷、腎再灌流損傷、腎虚血再灌流損傷、中毒性腎損傷、腎尿細管壊死、腎尿細管炎症、腎尿細管アポトーシス、および高血圧からなる群より選択される少なくとも1種である、本発明1018の方法。
[本発明1025]
対象がヒトである、本発明1018の方法。
[本発明1026]
少なくとも1種の作用物質を含む組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象における心臓の疾患または障害を治療する方法であって、該少なくとも1種の作用物質が、レナラーゼポリペプチド、レナラーゼポリペプチドフラグメント、およびレナラーゼ活性化剤からなる群より選択される少なくとも1種である、方法。
[本発明1027]
レナラーゼポリペプチドが組換えレナラーゼポリペプチドである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
レナラーゼポリペプチドがSEQ ID NO: 9のアミノ酸配列を含む、本発明1026の方法。
[本発明1029]
レナラーゼポリペプチドがSEQ ID NO: 10のアミノ酸配列を含む、本発明1026の方法。
[本発明1030]
レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含む、本発明1026の方法。
[本発明1031]
レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含む、本発明1026の方法。
[本発明1032]
レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を含む、本発明1026の方法。
[本発明1033]
少なくとも1種の作用物質が1回投与される、本発明1026の方法。
[本発明1034]
少なくとも1種の作用物質が繰り返し投与される、本発明1026の方法。
[本発明1035]
少なくとも1種の作用物質が、局部的に、領域的に、または全身的に投与される、本発明1026の方法。
[本発明1036]
レナラーゼ活性化剤が、レナラーゼ発現の活性化剤、レナラーゼ活性の活性化剤、またはそれらの組み合わせである、本発明1026の方法。
[本発明1037]
心臓の疾患または障害が、心筋壊死、鬱血性心不全、心虚血損傷、心再灌流損傷、心虚血再灌流損傷、および高血圧からなる群より選択される少なくとも1種である、本発明1026の方法。
[本発明1038]
レナラーゼ活性化剤が、化学物質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、および小分子化学物質からなる群より選択される少なくとも1種である、本発明1026の方法。
[本発明1039]
対象がヒトである、本発明1026の方法。
[本発明1040]
a.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルを決定する工程、
b.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルを比較対照と比較する工程、および
c.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、比較対照のレナラーゼのレベルと比較したときに低下している場合、対象を、心臓の疾患または障害を有すると診断する工程
を含む、その必要がある対象における心臓の疾患または障害を診断する方法。
[本発明1041]
心臓の疾患または障害を有すると診断された対象を治療するさらなる工程を含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼmRNAのレベルを測定することによって決定される、本発明1040の方法。
[本発明1043]
生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼポリペプチドのレベルを測定することによって決定される、本発明1040の方法。
[本発明1044]
生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼポリペプチドの酵素活性を測定することによって決定される、本発明1040の方法。
[本発明1045]
比較対照が、陽性対照、陰性対照、歴史的対照、歴史的規準、または前記生物学的サンプルにおける参照分子のレベルからなる群より選択される少なくとも1種である、本発明1040の方法。
[本発明1046]
心臓の疾患または障害が、心筋壊死、鬱血性心不全、心虚血損傷、心再灌流損傷、心虚血再灌流損傷、および高血圧からなる群より選択される少なくとも1種である、本発明1040の方法。
[本発明1047]
対象がヒトである、本発明1040の方法。
[本発明1048]
少なくとも1種の作用物質を含む組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象における癌を治療する方法であって、該少なくとも1種の作用物質がレナラーゼ阻害剤である、方法。
[本発明1049]
少なくとも1種の作用物質が1回投与される、本発明1048の方法。
[本発明1050]
少なくとも1種の作用物質が繰り返し投与される、本発明1048の方法。
[本発明1051]
少なくとも1種の作用物質が、局部的に、領域的に、または全身的に投与される、本発明1048の方法。
[本発明1052]
レナラーゼ阻害剤が、レナラーゼ発現の阻害剤、レナラーゼ活性の阻害剤、またはそれらの組み合わせである、本発明1048の方法。
[本発明1053]
レナラーゼ阻害剤が、抗体、化学物質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、および小分子化学物質からなる群より選択される少なくとも1種である、本発明1048の方法。
[本発明1054]
レナラーゼ阻害剤が、レナラーゼに特異的に結合する抗体である、本発明1048の方法。
[本発明1055]
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体(scFv)、重鎖抗体、合成抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、本発明1054の方法。
[本発明1056]
対象がヒトである、本発明1048の方法。
Claims (56)
- 少なくとも1種の作用物質を含む組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象における腎臓の疾患または障害を治療する方法であって、該少なくとも1種の作用物質が、レナラーゼポリペプチド、レナラーゼポリペプチドフラグメント、およびレナラーゼ活性化剤からなる群より選択される少なくとも1種である、方法。
- レナラーゼポリペプチドが組換えレナラーゼポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- レナラーゼポリペプチドがSEQ ID NO: 9のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- レナラーゼポリペプチドがSEQ ID NO: 10のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1種の作用物質が1回投与される、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1種の作用物質が繰り返し投与される、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1種の作用物質が、局部的に、領域的に、または全身的に投与される、請求項1に記載の方法。
- レナラーゼ活性化剤が、レナラーゼ発現の活性化剤、レナラーゼ活性の活性化剤、またはそれらの組み合わせである、請求項1に記載の方法。
- レナラーゼ活性化剤が、化学物質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体(peptidomemetic)、および小分子化学物質からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 腎臓の疾患または障害が、腎虚血損傷、腎再灌流損傷、腎虚血再灌流損傷、中毒性腎損傷、腎尿細管壊死、腎尿細管炎症、腎尿細管アポトーシス、および高血圧からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項1に記載の方法。
- SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含むレナラーゼポリペプチドフラグメントを含む、組成物。
- SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含むレナラーゼポリペプチドフラグメントを含む、組成物。
- SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を含むレナラーゼポリペプチドフラグメントを含む、組成物。
- a.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルを決定する工程、
b.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルを比較対照と比較する工程、および
c.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、比較対照のレナラーゼのレベルと比較したときに低下している場合、対象を、腎臓の疾患または障害を有すると診断する工程
を含む、その必要がある対象における腎臓の疾患または障害を診断する方法。 - 腎臓の疾患または障害を有すると診断された対象を治療するさらなる工程を含む、請求項18に記載の方法。
- 生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼmRNAのレベルを測定することによって決定される、請求項18に記載の方法。
- 生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼポリペプチドのレベルを測定することによって決定される、請求項18に記載の方法。
- 生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼポリペプチドの酵素活性を測定することによって決定される、請求項18に記載の方法。
- 比較対照が、陽性対照、陰性対照、歴史的対照、歴史的規準、または前記生物学的サンプルにおける参照分子のレベルからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項18に記載の方法。
- 腎臓の疾患または障害が、腎虚血損傷、腎再灌流損傷、腎虚血再灌流損傷、中毒性腎損傷、腎尿細管壊死、腎尿細管炎症、腎尿細管アポトーシス、および高血圧からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項18に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1種の作用物質を含む組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象における心臓の疾患または障害を治療する方法であって、該少なくとも1種の作用物質が、レナラーゼポリペプチド、レナラーゼポリペプチドフラグメント、およびレナラーゼ活性化剤からなる群より選択される少なくとも1種である、方法。
- レナラーゼポリペプチドが組換えレナラーゼポリペプチドである、請求項26に記載の方法。
- レナラーゼポリペプチドがSEQ ID NO: 9のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載の方法。
- レナラーゼポリペプチドがSEQ ID NO: 10のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載の方法。
- レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載の方法。
- レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載の方法。
- レナラーゼポリペプチドフラグメントがSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載の方法。
- 少なくとも1種の作用物質が1回投与される、請求項26に記載の方法。
- 少なくとも1種の作用物質が繰り返し投与される、請求項26に記載の方法。
- 少なくとも1種の作用物質が、局部的に、領域的に、または全身的に投与される、請求項26に記載の方法。
- レナラーゼ活性化剤が、レナラーゼ発現の活性化剤、レナラーゼ活性の活性化剤、またはそれらの組み合わせである、請求項26に記載の方法。
- 心臓の疾患または障害が、心筋壊死、鬱血性心不全、心虚血損傷、心再灌流損傷、心虚血再灌流損傷、および高血圧からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項26に記載の方法。
- レナラーゼ活性化剤が、化学物質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、および小分子化学物質からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項26に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項26に記載の方法。
- a.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルを決定する工程、
b.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルを比較対照と比較する工程、および
c.対象の生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、比較対照のレナラーゼのレベルと比較したときに低下している場合、対象を、心臓の疾患または障害を有すると診断する工程
を含む、その必要がある対象における心臓の疾患または障害を診断する方法。 - 心臓の疾患または障害を有すると診断された対象を治療するさらなる工程を含む、請求項40に記載の方法。
- 生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼmRNAのレベルを測定することによって決定される、請求項40に記載の方法。
- 生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼポリペプチドのレベルを測定することによって決定される、請求項40に記載の方法。
- 生物学的サンプルにおけるレナラーゼのレベルが、該生物学的サンプルにおけるレナラーゼポリペプチドの酵素活性を測定することによって決定される、請求項40に記載の方法。
- 比較対照が、陽性対照、陰性対照、歴史的対照、歴史的規準、または前記生物学的サンプルにおける参照分子のレベルからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項40に記載の方法。
- 心臓の疾患または障害が、心筋壊死、鬱血性心不全、心虚血損傷、心再灌流損傷、心虚血再灌流損傷、および高血圧からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項40に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項40に記載の方法。
- 少なくとも1種の作用物質を含む組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象における癌を治療する方法であって、該少なくとも1種の作用物質がレナラーゼ阻害剤である、方法。
- 少なくとも1種の作用物質が1回投与される、請求項48に記載の方法。
- 少なくとも1種の作用物質が繰り返し投与される、請求項48に記載の方法。
- 少なくとも1種の作用物質が、局部的に、領域的に、または全身的に投与される、請求項48に記載の方法。
- レナラーゼ阻害剤が、レナラーゼ発現の阻害剤、レナラーゼ活性の阻害剤、またはそれらの組み合わせである、請求項48に記載の方法。
- レナラーゼ阻害剤が、抗体、化学物質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、および小分子化学物質からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項48に記載の方法。
- レナラーゼ阻害剤が、レナラーゼに特異的に結合する抗体である、請求項48に記載の方法。
- 抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体(scFv)、重鎖抗体、合成抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項54に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項48に記載の方法。
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