JP2022121548A - ｍＲＮＡのＣＮＳ送達及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を中枢神経系（ＣＮＳ）へ効率的に送達するための方法及び組成物を提供すること。【解決手段】特に、本発明は、組成物の投与が、脳内及び／または脊髄中のニューロンにおいて、ｍＲＮＡの細胞内送達をもたらすように、リポソーム内に封入されたタンパク質をコードしたｍＲＮＡを含む組成物を送達する必要のある検体への髄腔内投与の方法及び組成物を提供する。本発明は、脊髄性筋萎縮症などのＣＮＳ系疾患、障害、または異常の治療に特に有用である。【選択図】なし

Description

（関連出願）
本願は、ＵＳ６２／０２０，１６１（２０１４年７月２日出願）及びＵＳ６１／８９４，
２４６（２０１３年１０月２２日出願）に対する優先権を主張し、これらの開示は、参照
することにより組み込まれる。
配列表

本明細書は、配列表（２０１４年１０月２２日に「２００６６８５－０６９０＿ＳＬ．ｔ
ｘｔ」という名前の．ｔｘｔファイルで、電子的に提出。）を参照する。この．ｔｘｔフ
ァイルは、２０１４年１０月２２日に生成され、１９，５９０バイトの大きさを有する。
この配列表の全ての内容は、参照することにより組み込まれる。

有効な治療が、神経細胞内のタンパク質における欠損、異常な発現または調節異常の結果
として、直接的にまたは間接的に生じた疾患などのＣＮＳ疾患に対する治療のためにさら
に必要とされている。ＣＮＳ疾患のための有効な治療法を実行する上で、主に、不透過性
である血液脳関門（ＢＢＢ）により、ＣＮＳの生物組織の分離及び隔離が原因である、多
くの障害が存在する。

例えば、脊髄性筋萎縮症は、タンパク質欠乏に起因したＣＮＳ疾患である。概して、健常
者は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子、（ＳＭＮ－１及びＳＭＮ－２）のそれぞれ
の機能のコピーを有し、この遺伝子は、ほぼ同一の配列である。脊髄性筋萎縮症と診断さ
れた患者は、概して、ＳＭＮ－１タンパク質の全長を発現させることができず、ＳＭＮ－
２の全長の低い発現量に頼っているのみであり、この発現量は、脳内での運動ニューロン
の死滅を防ぐためには、十分ではない。
近年、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）療法が、種々の疾患の治療、特に一種または複
数種のタンパク質欠乏に関する疾患の治療において、ますます重要な選択肢になりつつあ
る。非神経系性疾患に有望である一方、当業者は、リポソームがＢＢＢを通過することが
できないこと、及び神経細胞の中へｍＲＮＡを送達するための特有の課題を課された、神
経細胞の特有かつ複雑な膜の組成のために、ＣＮＳ疾患を治療する方法などの実行を思い
とどまった（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９２，１１２８：１－７、及びＫａｒｔｈｉｇａｓａ
ｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，
６２：１２０３－１２１３）。

Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９２，１１２８：１－７ Ｋａｒｔｈｉｇａｓａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，６２：１２０３－１２１３

本発明は、特に、治療用タンパク質をコードしたｍＲＮＡをＣＮＳのニューロン及び他の
細胞型へ効率的に送達するために改善された方法及び組成物を提供する。本発明は、一部
分において、ｍＲＮＡがロードされた脂質またはポリマー系ナノ粒子が、直接ＣＮＳの空
隙へ投与され（例えば、脊髄内投与によって）、そして神経細胞膜を有効に通過し、脳内
及び／または脊髄中のニューロンにおいて、ｍＲＮＡの細胞内送達をもたらすことが可能
であるという驚くべき発見に基づいている。本発明以前に、神経細胞膜が非神経細胞のも
のとは異なる、特有かつ複雑な脂質組成物によって特徴づけられると報告された。（Ｓｖ
ｅｎｎｅｒｈｏｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ，１９９２，１１２８：１－７、及びＫａｒｔｈｉｇａｓａｎ ｅｔ．ａｌ．
，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，６２：１２０３－
１２１３）それゆえ、神経細胞膜は、通過するのが難しいと考えられた。核酸を非神経細
胞に送達するのに有効なリポソームでさえ、神経細胞膜を通過するために効果的であると
は期待されなかった。脳と脊柱の中央部の深部に位置していて運動ニューロンに作用し難
くても、本明細書に記載されている、脂質または高分子系のナノ粒子が効果的にｍＲＮＡ
をニューロンへ送達することが可能であることは、本当に驚きであった。従って、本発明
は、改善されかつ有効なｍＲＮＡのＣＮＳ送達のための方法を提供し、そして種々のＣＮ
Ｓ疾患を治療する有効なｍＲＮＡ療法が期待できる。

よって、１つの態様において、本発明はｍＲＮＡを中枢神経（ＣＮＳ）へ送達する方法を
提供する。いくつかの実施形態において、本発明による本方法は、組成物の投与が、脳内
及び／または脊髄中のニューロンにおいて、ｍＲＮＡの細胞内送達をもたらすような、リ
ポソーム内に封入されたタンパク質をコードしたｍＲＮＡを含む組成物を送達する必要の
ある検体への髄腔内投与を含み、そこにおいて、当該リポソームは陽イオン性または非陽
イオン性脂質、コレステロール系脂質、及びＰＥＧ－修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは脳内に位置しているニューロンへ送達される。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは脊髄内に位置しているニューロンへ送達される
。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、運動ニューロンへ送達される。いくつかの
実施形態において、ｍＲＮＡは、上位運動ニューロン及び／または下位運動ニューロンへ
送達される。いくつかの実施形態において、運動ニューロンは、脊髄の前角及び／または
背根神経節の中に位置している。

いくつかの実施形態において、好適なリポソームは、一種または複数種の陽イオン性脂質
、一種または複数種の中性脂質、一種または複数種のコレステロール系脂質、及び一種ま
たは複数種のＰＥＧ－修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態において、好適な陽イオン性脂質は、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、Ｄ
ＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、Ｈ
ＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯ
ＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲ
ＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎ
ＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ
－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３から成る群から選択される。いくつかの特定の
実施形態において、一種または複数種の陽イオン性脂質はＣ１２－２００を含む。いくつ
かの特定の実施形態において、陽イオン性脂質は、ＤＬｉｎＫ２２ＤＭＡを含む。

特定の実施形態において、本発明に好適な陽イオン性脂質は、式Ｉ－ｃ１－ａの構造を有
し、

または、薬学的に受容可能なそれらの塩であり、式中、
各Ｒ^２は、独立に水素またはＣ_１－３のアルキル基であり、
各ｑは、独立に２～６であり、
各Ｒ’は、独立に水素またはＣ_１－３のアルキル基であり、
かつ各Ｒ^Ｌは独立にＣ_８－１２のアルキル基である。

特定の実施形態において、好適な陽イオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２：

である。

いくつかの実施形態において、好適な非陽イオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジ
ルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイ
ルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯ
ＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスフ
ァチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン
（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）
、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シク
ロヘキサン－ｌ－カルボキシラート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジ
ルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメ
チルポリエチレン、１６－Ｏ－ジメチルポリエチレン、１８－１－トランスポリエチレン
、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、
ホスファチジル脂質、またはそれらの混合物から選択される。

いくつかの実施形態において、好適な非陽イオン性脂質は、ホスファチジル脂質である。
いくつかの実施形態において、好適なホスファチジル脂質は、スフィンゴ脂質である。い
くつかの特定の実施形態において、好適なスフィンゴ脂質は、スフィンゴミエリンである
。

いくつかの実施形態において、本発明に好適な、一種または複数種のコレステロール系脂
質は、コレステロール、ペグ化されたコレステロール、及び／またはＤＣ－Ｃｈｏｌ（Ｎ
，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール），１，４－ビス（３－Ｎ－
オレイルアミノ－プロピル）ピペラジンから選択される。

いくつかの実施形態において、本発明に好適な一種または複数種のＰＥＧ－修飾脂質は、
Ｃ_６～Ｃ_２０の長さのアルキル鎖を有する脂質に共有結合をした、５ｋＤａ以上の長さの
ポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。いくつかの実施形態において、好適なＰＥＧ－修
飾脂質は、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－[サクシニル（メトキシポリエチレ
ングリコール）－２０００]などの誘導体化セラミドである。いくつかの実施形態におい
て、好適なＰＥＧ－修飾脂質またはペグ化された脂質は、ペグ化されたコレステロールま
たはジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）－ＰＥＧ－２Ｋである。いくつかの実施形態
において、一種または複数種のＰＥＧ－修飾脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、Ｃ８－ＰＥＧ、Ｄ
ＯＧ ＰＥＧ、セラミドＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、及びそれらの混合物からなる群から
選択される。いくつかの実施形態において、一種または複数種のＰＥＧ－修飾脂質は、全
脂質組成物のモル比で約１～１０％（例えば、約１～８％、約１～６％、または約１～５
％）を構成する。いくつかの実施形態において、一種または複数種のＰＥＧ－修飾脂質は
全脂質組成物のモル比で約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％を構成する
。いくつかの特定の実施形態において、ＰＥＧ－修飾脂質は全脂質組成物のモル比で少な
くとも５％を構成する。

いくつかの実施形態において、好適なリポソームは、Ｃ１２－２００、スフィンゴミエリ
ン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ ＰＥＧ；Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレ
ステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及
びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ｃＫＫ－Ｅ１２、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロー
ル、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ
－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＩＣＥ、Ｄ
ＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、もしくはＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレ
ステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＤＯＤＭＡ、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレ
ステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、及び／またはそれらの混合物から選択された混合
物を含む。

いくつかの実施形態において、好適なリポソームは市販のエンハンサーを含む。いくつ
かの実施形態において、リポソームは生分解性脂質を含む。いくつかの実施形態において
、リポソームはイオン性脂質を含む。いくつかの実施形態において、リポソームは開裂が
可能な脂質を含む。

いくつかの実施形態において、好適なリポソームは約２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０
ｎｍ、１２５ｎｍ、１１０ｎｍ、１００ｎｍ、９５ｎｍ、９０ｎｍ、８５ｎｍ、８０ｎｍ
、７５ｎｍ、７０ｎｍ、６５ｎｍ、６０ｎｍ、５５ｎｍ、または５０ｎｍ以下の大きさを
有する。いくつかの実施形態において、好適なリポソームは、約４０～１００ｎｍ（例え
ば約４０～９０ｎｍ、約４０～８０ｎｍ、約４０～７０ｎｍ、または約４０～６０ｎｍ）
の範囲の大きさを有する。本明細書で用いる場合、リポソームの大きさは、リポソーム粒
子の最も大きい直径の長さで決める。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ
、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、または５ｋｂより長い長さを
有する。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡによってコードされた治療用タンパク質は、サ
イトゾルタンパク質である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡにコードされた治療
用タンパク質は、分泌タンパク質である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡにコー
ドされた治療用タンパク質は、酵素である。いくつかの実施形態において、酵素はリソソ
ーム酵素である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡにコードされた治療用タンパク
質は、ＣＮＳ疾患に関連したタンパク質である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ
にコードされた治療用タンパク質は、通常脳内及び／または脊髄中のニューロンで機能す
る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡにコードされた治療用タンパク質は、通常脊
髄中の運動ニューロンで機能する。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡにコードされた治療用タンパク質は、生存運動
ニューロンタンパク質である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡにコードされた治
療用タンパク質は、生存運動ニューロン－１タンパク質である。いくつかの実施形態にお
いて、ｍＲＮＡにコードされた治療用タンパク質は、生存運動ニューロンタンパク質－１
の、スプライスアイソフォーム、断片、または欠損した異形である。いくつかの実施形態
において、ＳＭＮ－１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施
形態において、ＳＭＮ－１タンパク質をコードしたｍＲＮＡは、配列番号１の核酸配列を
含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＮ－１タンパク質をコードしたｍＲＮＡは、コ
ドン最適化がされており、かつ配列番号３、配列番号４、配列番号１０、または配列番号
１１を含む。

いくつかの実施形態において、本発明において好適なｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ配列を含
む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ配列は配列番号７を含む。いくつかの実施
形態において、ｍＲＮＡは３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ
は配列番号８または配列番号９を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡはキャッ
プ構造を含む。いくつかの実施形態において、好適なキャップ構造は、キャップ０、キャ
ップ１、またはキャップ２の構造から選択される。いくつかの実施形態において、好適な
キャップ構造は、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）または、修飾されたＡＲ
ＣＡである。

いくつかの実施形態において、治療用タンパク質をコードしたｍＲＮＡは、一種または
複数種の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、一種または複数
種のヌクレオチドは、プソイドウリジン、２－アミノアデノシン、２－チオウリジン、イ
ノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロ
ピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモ
ウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジ
ン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－
デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシ
ン、Ｏ（６）－メチルグアニン、Ｎ－１－メチルプソイドウリジン、２－チオシチジン及
びそれらの混合物からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、治療用タンパク質をコードしたｍＲＮＡは、修飾されて
いない。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの細胞内送達は、ｍＲＮＡでコードされたタン
パク質の発現を起こす。いくつかの実施形態において、コードされたタンパク質は、ニュ
ーロンのサイトゾルの中で発現する。いくつかの実施形態において、コードされたタンパ
ク質は発現して、そして発現後ニューロンから細胞外に分泌される。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、体重１ｋｇ当たり約０．０１～１０．０ｍ
ｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約０．０１～９．０ｍｇ、０．０１～８．０ｍｇ、０．０
１～７．０ｍｇ、０．０１～６．０ｍｇ、０．０１～５．０ｍｇ、０．０１～４．０ｍｇ
、０．０１～３．０ｍｇ、０．０１～２．５ｍｇ、０．０１～２．０ｍｇ、０．０１～１
．５ｍｇ、０．０１～１．０ｍｇ、０．０１－０．５ｍｇ、０．０１－０．２５ｍｇ、０
．０１～０．１ｍｇ、０．１～１０．０ｍｇ、０．１～５．０ｍｇ、０．１～４．０ｍｇ
、０．１～３．０ｍｇ、０．１～２．０ｍｇ、０．１～１．０ｍｇ、０．１～０．５ｍｇ
の範囲の服用量を投与される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは体重１ｋｇ当た
り約１０．０ｍｇ、９．０ｍｇ、８．０ｍｇ、７．０ｍｇ、６．０ｍｇ、５．０ｍｇ、４
．５ｍｇ、４．０ｍｇ、３．５ｍｇ、３．０ｍｇ、２．５ｍｇ、２．０ｍｇ、１．５ｍｇ
、１．０ｍｇ、０．８ｍｇ、０．６ｍｇ、０．５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．３ｍｇ、０．２
ｍｇ、０．１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０２ｍｇ、または
０．０１ｍｇ未満の服用量を投与される。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは実質的毒性または免疫応答を誘発することな
く送達される。

もう１つの態様において、本明細書に記載されている方法を用いて、ＣＮＳへ欠損して
いるタンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達することで、中枢
神経系（ＣＮＳ）内のタンパク質の欠乏に関する、疾患、障害、または異常を治療する方
法を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ系疾患、障害、または異常は、タン
パク質の欠損の結果である。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ系疾患、障害、または
異常は、運動ニューロンにおけるタンパク質の欠損の結果である。

特に、本発明は、脊髄性筋萎縮症を治療する方法及び組成物を提供する。

１つの態様において、本発明は、本明細書に記載されている方法を用いて、ＣＮＳへ生
存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
を送達することで、脊髄性筋萎縮症を治療する方法を提供する。

もう１つの態様において、本発明は、脊髄性筋萎縮症を治療するための組成物を提供し
、リポソーム内に封入された、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードしたｍ
ＲＮＡを含み、そこにおいて、ｍＲＮＡは配列番号３、配列番号４、配列番号１０、また
は配列番号１１（コドン最適化されたヒトＳＭＮ ｍＲＮＡに相当する。）を含み、そし
てさらにそこにおいて、リポソームは陽イオン性または非陽イオン性脂質、コレステロー
ル系脂質、及びＰＥＧ－修飾脂質を含む。

関連の１つの形態において、本発明は、脊髄性筋萎縮症を治療するための組成物を提供
し、リポソーム内に封入された、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードした
ｍＲＮＡを含み、そこにおいて、リポソームは、式Ｉ－ｃ１－ａの陽イオン性脂質を含み
、

または、薬学的に受容可能なそれらの塩であり、式中、
各Ｒ^２は、独立に水素またはＣ_１－３のアルキル基であり、
各ｑは、独立に２～６であり、
各Ｒ’は、独立に水素またはＣ_１－３のアルキル基であり、
かつ各Ｒ^Ｌは独立にＣ_８－１２のアルキル基である。

いくつかの実施形態において、好適な陽イオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２：

である。

いくつかの実施形態において、本発明は、脊髄性筋萎縮症を治療するための組成物を提
供し、リポソーム内に封入された、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードし
たｍＲＮＡを含み、そこにおいて、リポソームは、
Ｃ１２－２００、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧＰＥＧ
；
Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ｃＫＫ－Ｅ１２、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥ
Ｇ２Ｋ；
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；または、
ＤＯＤＭＡ，スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２
Ｋから選択された混合物を含む。

本発明のその他の特徴、目的、及び利点は、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の
範囲により明らかとなる。しかし、詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲は、本発明の
実施形態を示す一方で、実例としてのみ与えられ、限定されないということを理解するべ
きである。本発明の範囲において種々の変更及び修正は、当業者には明白となるだろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
中枢神経系（ＣＮＳ）にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達する方法であって、
組成物の投与が、脳内及び／または脊髄中のニューロンにおいて、ｍＲＮＡの細胞内送達をもたらすように、リポソーム内に封入されたタンパク質をコードしたｍＲＮＡを含む組成物を送達する必要のある検体に髄腔内投与することと、
そこにおいて、前記リポソームは、陽イオン性または非陽イオン性脂質、コレステロール系脂質及びＰＥＧ－修飾脂質を含む、方法。
（項目２）
前記脳及び／または脊髄中の前記ニューロンが、前記脊髄中の運動ニューロンを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記脳及び／または脊髄中の前記ニューロンが、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドログリア細胞、星状膠細胞、神経膠細胞、及びそれらの組合せから成る群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記脳及び／または脊髄中の前記ニューロンが、脊髄前角細胞及び背根神経節を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記リポソームが、一種または複数種の陽イオン性脂質、一種または複数種の中性脂質、一種または複数種のコレステロール系脂質、及び一種または複数種のＰＥＧ－修飾脂質を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目６）
一種または複数種の前記陽イオン性脂質が、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、及びそれらの組合せ、から成る群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目７）
一種または複数種の前記陽イオン性脂質がＣ１２－２００を含む、項目６に記載の方法。（項目８）
一種または複数種の前記陽イオン性脂質がＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡを含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記陽イオン性脂質が、ｃＫＫ－Ｅ１２:

である、項目６に記載の方法。
（項目１０）
一種または複数種の前記非陽イオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン酸エタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン酸エタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エタノールアミンリン酸）、ＤＯＰＧ（，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン酸－（１’－ｒａｃ－グリセロール））、スフィンゴミリン、セラミド、セファリン、セレブロシド、ジアシルグリセロール、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＤＳＰＥ、ＳＯＰＥ、スフィンゴミエリンから選択される、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１１）
一種または複数種の前記非陽イオン性脂質が、スフィンゴミエリンを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
一種または複数種の前記ＰＥＧ－修飾脂質が、ＤＭＧ－ＰＥＧ、Ｃ８－ＰＥＧ、ＤＯＧ ＰＥＧ、セラミドＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、及びそれらの組合せからなる群から選択される、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１３）
一種または複数種の前記ＰＥＧ－修飾脂質が、全脂質組成において、モル比で約１～１０％を構成する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
一種または複数種の前記ＰＥＧ－修飾脂質が、全脂質組成において、モル比で約５％を構成する、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
一種または複数種の前記コレステロール系脂質が、コレステロール、またはＰＥＧ化されたコレステロールから選択される、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１６）
前記リポソームが、
Ｃ１２－２００、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧＰＥＧ；
Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ｃＫＫ－Ｅ１２、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；または、
ＤＯＤＭＡ、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、
から選択された組合せを含む、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１７）
前記リポソームが、約４０～１００ｎｍの範囲の大きさを有する、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１８）
前記ｍＲＮＡが、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、または５ｋｂ位以上の長さを有する、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１９）
前記ｍＲＮＡによってコードされた前記タンパク質が、通常、前記脳内及び／または脊髄中の前記ニューロンの中で機能する、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目２０）
前記ｍＲＮＡでコードされた前記タンパク質が、通常、前記脊髄中の運動ニューロンの中で機能する、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目２１）
前記ｍＲＮＡでコードされた前記タンパク質が、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質である、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目２２）
前記ｍＲＮＡが、コドン最適化をされている、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目２３）
前記コドン最適化ｍＲＮＡが、配列番号３、配列番号４、配列番号１０、または配列番号１１を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記コドン最適化ｍＲＮＡが、配列番号３または配列番号４を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記ｍＲＮＡが、配列番号７の５’ＵＴＲ配列を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ｍＲＮＡが、配列番号８または配列番号９の３’ＵＴＲ配列を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記ｍＲＮＡが、キャップ構造を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目２８）
前記キャップ構造が、キャップ０、キャップ１、またはキャップ２構造から選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記キャップ構造が、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）、または、修飾されたＡＲＣＡである、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記ｍＲＮＡにコードされた前記タンパク質が、酵素である、項目１～２０のいずれか１つに記載の方法。
（項目３１）
前記酵素が、リソソーム酵素である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ｍＲＮＡの細胞内送達が、前記ニューロンのサイトゾルの中で、前記ｍＲＮＡでコードされた前記タンパク質の細胞内発現をもたらす、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目３３）
前記ｍＲＮＡの細胞内送達が、前記ｍＲＮＡでコードされた前記タンパク質の細胞内発現、及び発現後前記ニューロンから細胞外への分泌をもたらす、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目３４）
前記ｍＲＮＡが、一種または複数種の修飾されたヌクレオチドを含む、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目３５）
一種または複数種の修飾された前記ヌクレオチドが、プソイドウリジン、２－アミノアデノシン、２－チオウリジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、Ｎ－１－メチルプソイドウリジン、及び／または、２－チオシチジンを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ｍＲＮＡが、無修飾である、項目１～３３のいずれか１つに記載の方法。
（項目３７）
前記ｍＲＮＡが、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約１０ｍｇの範囲の量で送達される、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目３８）
前記ｍＲＮＡが、実質的毒性、または免疫応答を引き起こすことがなく送達される、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目３９）
前記検体が、前記ＣＮＳ中の前記ｍＲＮＡでコードされた前記タンパク質が欠乏している、先行する項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目４０）
前記中枢神経系（ＣＮＳ）で、タンパク質の欠乏に関連する、疾患、障害、または異常を治療する方法であって、先行する項目のいずれか１つによる方法を用いて、前記ＣＮＳへ欠乏した前記タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達することを含む、方法。
（項目４１）
脊髄性筋萎縮症を治療する方法であって、
前記組成物の投与が、前記脳内及び／または脊髄中のニューロンにおいて、ｍＲＮＡの細胞内送達をもたらすように、リポソーム内に封入された生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードしたｍＲＮＡを含む組成物を治療する必要のある検体に髄腔内投与することと、
そこにおいて、前記リポソームは、陽イオン性または非陽イオン性脂質、コレステロール系脂質及びＰＥＧ－修飾脂質を含む、方法。
（項目４２）
前記脳及び／または脊髄中の前記ニューロンが、前記脊髄中の運動ニューロンを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記脳及び／または脊髄中の前記ニューロンが、脊髄前角細胞及び背根神経節を含む、項目４１または４２に記載の方法。
（項目４４）
前記コドン最適化ｍＲＮＡが、配列番号３、配列番号４、配列番号１０、または配列番号１１を含む、項目４１～４３のいずれか１つに記載の方法。
（項目４５）
前記コドン最適化ｍＲＮＡが、配列番号３、または配列番号４を含む、項目４１～４３のいずれか１つに記載の方法。
（項目４６）
前記ｍＲＮＡが、配列番号７の５’ＵＴＲ配列を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ｍＲＮＡが、配列番号８、または配列番号９の３’ＵＴＲ配列を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
一種または複数種の前記非陽イオン性脂質が、スフィンゴミエリンを含む、項目４１～４７のいずれか１つに記載の方法。
（項目４９）
前記リポソームが、
Ｃ１２－２００、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ ＰＥＧ；
Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ｃＫＫ－Ｅ１２、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；または、
ＤＯＤＭＡ、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、
から選択された組合せを含む、項目４１～４８のいずれか１つに記載の方法。
（項目５０）
脊髄性筋萎縮症の治療のための組成物であって、
リポソームリポソーム内に封入された、前記生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするｍＲＮＡと、そこにおいて、前記コドン最適化ｍＲＮＡが、配列番号３、配列番号４、配列番号１０、または配列番号１１を含み、
さらに、そこにおいて、前記リポソームが、陽イオン性または非陽イオン性脂質、コレステロール系脂質、及びＰＥＧ－修飾脂質を含む、組成物。
（項目５１）
脊髄性筋萎縮症の治療のための組成物であって、
リポソーム内に封入された、前記生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを含み、そこにおいて、前記リポソームが、式Ｉ－ｃ１－ａの陽イオン性脂質を含む、組成物であって、

または、薬学的に受容可能なそれらの塩であり、式中、
各Ｒ^２は、独立に水素またはＣ_１－３のアルキル基であり、
各ｑは、独立に２～６であり、
各Ｒ’は、独立に水素またはＣ_１－３のアルキル基であり、
及び各Ｒ^Ｌは独立にＣ_８－１２のアルキル基である。
（項目５２）
前記陽イオン性脂質が、ｃＫＫ－Ｅ１２：

である、項目４４に記載の方法。
（項目５３）
脊髄性筋萎縮症を治療のための組成物であって、
リポソーム内に封入された、前記生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを含み、そこにおいて、前記リポソームが、
Ｃ１２－２００、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ ＰＥＧ；
Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ｃＫＫ－Ｅ１２、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；
ＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；または、
ＤＯＤＭＡ、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、
から選択された組合せを含む、組成物。

図面は例証に過ぎず、本発明を限定するものではない。

図１は、ＢＨＫ－２１細胞へ遺伝子導入された外来のｈＳＭＮ－１ ｍＲＮＡからなるヒトＳＭＮ－１タンパク質のウェスタンブロットによる検出を示す。ヒトＳＭＮに特異的な種々な抗体、（Ａ）抗ＳＭＮ ４Ｆ１１抗体１：１，０００希釈、（Ｂ）Ｐｉｅｒｃｅ社製ＰＡ５－２７３０９ ａ－ＳＭＮ抗体１：１０，０００希釈、及び（Ｃ）ＬＳＢｉｏ社製Ｃ１３８１４９ ａ－ＳＭＮ抗体１：１０，０００希釈を用いた。 図２Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図２Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図２Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図３Ａ～Ｃは、リポソーム製剤２を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図３Ａ～Ｃは、リポソーム製剤２を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図３Ａ～Ｃは、リポソーム製剤２を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図４Ａ～Ｃは、リポソーム製剤３を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図４Ａ～Ｃは、リポソーム製剤３を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図４Ａ～Ｃは、リポソーム製剤３を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図５Ａ～Ｃは、リポソーム製剤４を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図５Ａ～Ｃは、リポソーム製剤４を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図５Ａ～Ｃは、リポソーム製剤４を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図６Ａ～Ｃは、リポソーム製剤５を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図６Ａ～Ｃは、リポソーム製剤５を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図６Ａ～Ｃは、リポソーム製剤５を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図７Ａ～Ｃは、リポソーム製剤６を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図７Ａ～Ｃは、リポソーム製剤６を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図７Ａ～Ｃは、リポソーム製剤６を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図８Ａ～Ｃは、リポソーム製剤７を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図８Ａ～Ｃは、リポソーム製剤７を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図８Ａ～Ｃは、リポソーム製剤７を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図９Ａ～Ｃは、リポソーム製剤８を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図９Ａ～Ｃは、リポソーム製剤８を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図９Ａ～Ｃは、リポソーム製剤８を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１０Ａ～Ｃは、リポソーム製剤９を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１０Ａ～Ｃは、リポソーム製剤９を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１０Ａ～Ｃは、リポソーム製剤９を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１１Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１０を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１１Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１０を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１１Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１０を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１２Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１１を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１２Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１１を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１２Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１１を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１３Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１２を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１３Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１２を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１３Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１２を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１４Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１３を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１４Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１３を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１４Ａ～Ｃは、リポソーム製剤１３を用いた髄腔内送達２４時間後の、（Ａ）頸部、（Ｂ）胸部、（Ｃ）腰椎脊髄組織について、ヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのマルチプレックス核酸ｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１５は、担体制御の髄腔内送達２４時間後の、脊髄組織中のヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。画像は倍率５倍で示されている。 図１６は、担体制御の髄腔内送達２４時間後の、脊髄組織中のヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。画像は倍率１０倍で示されている。 図１７は、担体制御の髄腔内送達２４時間後の、脊髄組織中のＵｂＣ ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。 図１８は、担体制御の髄腔内送達２４時間後の、脊髄組織中のヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。画像は倍率５倍で示されている。 図１９は、髄腔内送達２４時間後の、脊髄組織中のヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。画像は倍率５倍で示されている。 図２０は、髄腔内送達２４時間後の、脊髄組織中のヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。画像は倍率１０倍で示されている。 図２１は、髄腔内送達２４時間後の、脊髄組織中のヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。画像は倍率１０倍及び２０倍で示されている。 図２２は、ヒトＳＭＮ－１ ｍＲＮＡがロードされた脂質ナノ粒子の脊髄内投与後２４時間における、ラットの脊髄中で生成したヒトＳＭＮ－１タンパク質の陽性検出を示す。抗ヒトＳＭＮ ４Ｆ１１抗体を１：２５００希釈して使用した。パネルＡは、処置したラットの脊髄組織を表し、パネルＢは、未処理のラットの脊髄組織を表す。 図２３Ａ～Ｃは、髄腔内送達３０分後の、脳組織中のヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。脳（Ａ）のｉｎ ｓｉｔｕ検出では、脳の灰白質及び白質内の両方で観測された強いシグナルを示している。脳（Ｂ）のセクション１及び脳（Ｃ）のセクション２の２つの領域は、より詳細な分析のために、拡大している。 図２３Ａ～Ｃは、髄腔内送達３０分後の、脳組織中のヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。脳（Ａ）のｉｎ ｓｉｔｕ検出では、脳の灰白質及び白質内の両方で観測された強いシグナルを示している。脳（Ｂ）のセクション１及び脳（Ｃ）のセクション２の２つの領域は、より詳細な分析のために、拡大している。 図２３Ａ～Ｃは、髄腔内送達３０分後の、脳組織中のヒト生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ検出を示す。脳（Ａ）のｉｎ ｓｉｔｕ検出では、脳の灰白質及び白質内の両方で観測された強いシグナルを示している。脳（Ｂ）のセクション１及び脳（Ｃ）のセクション２の２つの領域は、より詳細な分析のために、拡大している。

定義
本発明をより容易に理解するために、まず一定の用語を以下で定義する。以下の用語及
び他の用語に関する付加的な定義は、本明細書全体を通して記述されている。

「アルキル」 本明細書で用いる場合、「アルキル」という用語は、１～１５の炭素原
子を有する直鎖の遊離基、または分岐状飽和炭化水素基（「Ｃ_１－１５アルキル」）を指
す。いくつかの実施形態において、アルキル基は１～３の炭素原子（「Ｃ_１－３アルキル
」）を有する。Ｃ_１－３のアルキル基の例には、メチル（Ｃ_１）、エチル（Ｃ_２）、ｎ－
プロピル（Ｃ_３）、及びイソプロピル（Ｃ_３）を含む。いくつかの実施形態において、ア
ルキル基は、８～１２の炭素原子（「Ｃ_８－１２アルキル」）を有する。Ｃ_８－１２のア
ルキル基の例には、ｎ－オクチル（Ｃ_８）、ｎ－ノニル（Ｃ_９）、ｎ－デシル（Ｃ_１０）
、ｎ－ウンデシル（Ｃ_１１）、ｎ－ドデシル（Ｃ_１２）などを含むが、特に制限されない
。接頭辞「ｎ－」（ｎｏｒｍａｌ）は、分岐していないアルキル基を指す。例えば、ｎ－
Ｃ_８アルキルは、（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３を指し、ｎ－Ｃ_１０アルキルは、（ＣＨ_２）_９ＣＨ
_３などを示す。

「およそ」または「約」 本明細書で用いる場合、「およそ」または「約」という用語
は、１つ以上の当該値に適用される場合、記述参照値と類似する値を指す。ある実施形態
では、「およそ」または「約」という用語は、別記しない限り、あるいは本文から明らか
な場合を除き（このような数が、可能な値の１００％を超える場合を除く）、記述参照値
の（より大きいかまたはより小さい）いずれかの方向で、２５％、２０％、１９％、１８
％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、
７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下に収まる値の範囲を指す。

「改善」 本明細書で用いる場合、「改善」という用語は、ある状態の防止、低減また
は緩和、あるいは検体の状態の改善を意味する。改善は、疾患状態の完全回復または完全
防止を含むが、必要とするわけではない。いくつかの実施形態において、改善は、関連疾
患組織中に欠けている関連タンパク質またはその活性のレベルを増大することを含む。

「アミノ酸」 本明細書で用いる場合、「アミノ酸」という用語は、最も広義には、ポ
リペプチド鎖に取り込まれることが可能な任意の化合物及び／または物質を指す。いくつ
かの実施形態において、アミノ酸は一般構造Ｈ_２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する
。いくつかの実施形態において、アミノ酸は自然に存在するアミノ酸である。いくつかの
実施形態において、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態において、アミ
ノ酸はｄ－アミノ酸であり、いくつかの実施形態において、アミノ酸はｌ－アミノ酸であ
る。「標準アミノ酸」は、自然に存在するペプチドによく見られる、任意の２０の標準ｌ
－アミノ酸を指す。「非標準アミノ酸」は、それが合成されたか、天然物から得られたか
どうかに関わらず、標準アミノ酸以外の、任意のアミノ酸を指す。本明細書で用いる場合
、「合成アミノ酸」は、化学的に修飾されたアミノ酸を包含し、塩、アミノ酸誘導体（ア
ミドなど）、及び／または置換体を含むが、限定されない。ペプチドのカルボキシ－及び
／またはアミノ－末端アミノ酸を含むアミノ酸は、それらの活性に不利に影響することな
く、ペプチドの半減期を変えることが可能な、他の化学基とのメチル化、アミド化、アセ
チル化、保護基、及び／または、置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド
結合に関与してもよい。アミノ酸は、一種または複数種の化学物質（例えば、メチル基、
酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレ
ングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分、など）との会合などを１つ
または翻訳後修飾を含んでもよい。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換
的に用いられ、そして遊離アミノ酸及び／または、ペプチドのアミノ酸残基を指してもよ
い。遊離アミノ酸か、ペプチドの残基を示すのかどうかは、当該用語が用いられる文脈か
ら明らかになるだろう。

「動物」 本明細書で用いる場合、「動物」という用語は、動物界の任意の一員を示す
。いくつかの実施形態において、「動物」は、発達の任意の段階にある、ヒトを指す。い
くつかの実施形態において、「動物」は、発達の任意の段階にある、ヒトではない動物を
指す。特定の実施形態においては、ヒトではない動物は、哺乳動物（齧歯動物、マウス、
ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタなど）で
ある。いくつかの実施形態において、動物は、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、
虫類、及び／または蠕虫類を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態におい
て、動物は、遺伝子導入された動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンでもよい
。

「生物学的に活性な」 本明細書で用いる場合、「生物学的に活性な」という語句は、
生物学的系において、特に生物体において活性を有する任意の作用物質の特徴を指す。例
えば、生物体に投与された場合、その生物体に及ぼす生物学的作用を有する作用物質は、
生物学的に活性であるとみなされる。タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性で
ある特定の実施形態では、当該タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学
的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部分は、概して「生物学的活性
」部分として言及される。

「送達」 「送達」という用語は、ＣＮＳ送達と関連して用いられる場合は、ｍＲＮＡ
がニューロン中で細胞内送達され、コードされたタンパク質がニューロンの中で発現して
保持する状態と、ｍＲＮＡがニューロン中で細胞内送達され、コードされたタンパク質が
、ＣＳＦなどに発現し分泌され、他のニューロンによって提供される状態を包含する。

「発現」 本明細書で用いる場合、核酸配列の「発現」は、以下の１つ以上の事象を指
す。（１）ＤＮＡ配列からＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写
物の処理（スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、及び／または、３’キ
ャップ形成など）、（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡ翻訳、及び／または
（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後の修飾。本願では、「発現」及び「生成」
という用語ならびに文法的に等価であるものは、区別なく用いられる。

「断片」 本明細書で用いる場合、「断片」という用語は、ポリペプチドを指し、その
ポリペプチドに特有であるか特徴的である、特定のポリペプチドにおいて任意の分離した
部分として定義される。本明細書で用いる場合、当該用語は、全長ポリペプチドの少なく
とも一部の活性を保持する、特定のポリペプチドの任意である分離した部分も示す。好ま
しくは、保持される活性部分は、少なくとも全長ポリペプチドの活性の１０％である。よ
り好ましくは、保持される活性部分は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３
０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。さらにより好まし
くは、保持される活性部分は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、保持される活性部分は、全長ポリペ
プチドの活性の１００％である。本明細書で用いる場合、当該用語は、少なくとも、全長
ポリペプチドで見つかる確立した配列要素を含む、特定のポリペプチドのいかなる部分も
意味する。好ましくは、配列要素は、少なくとも４～５、より好ましくは、全長ポリペプ
チドの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上のアミ
ノ酸に及ぶ。

「機能的な」 本明細書で用いる場合、「機能的な」生体分子は、それが特徴づけられ
る特性及び／または活性を示す形の生体分子である。

「半減期」本明細書で用いる場合、「半減期」という用語は、核酸またはタンパク質の
、濃度または活性などの量が、ある期間の最初に測定した値の半分に下がるために必要と
する時間のことである。

「改善する」、「増加する」、または「減少する」 本明細書で用いる場合、「改善す
る」、「増加する」、または「減少する」という用語、あるいは文法的等価物は、基線測
定値、例えば本明細書中に記載される処置の開始前の同一個体における測定値、または本
明細書中に記載される処置の非存在下で、対照検体（または複数の対照検体）における測
定値と比較した場合の値を示す。「対照検体」は、治療を受けている検体と同じ形の疾患
に苦しめられていて、治療を受けている検体とほぼ同年齢の検体である。

「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ」 本明細書で用いる場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、
人工の環境において起こる現象を指し、多細胞生物体中というよりは、例えば試験管の中
、または反応器中、細胞培養液中などである。

「Ｉｎ Ｖｉｖｏ」 本明細書で用いる場合、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、ヒト
及びヒト以外の動物などの多細胞生物体中で起こる現象を指す。細胞ベースのシステムと
いう文脈において、当該用語は、生細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムと対照的に
）の中で起こる現象を指すために用いてもよい。

「髄腔内投与」 本明細書で用いる場合、「髄腔内投与」または「髄腔内注射」という
用語は、脊柱管（脊髄周囲の髄腔内空隙）への注射を指す。穿頭孔、大槽、または腰椎穿
刺などを通した、外側脳室注射を含む種々の技法が用いられてもよいが、これらに限定さ
れない。いくつかの実施形態において、本発明による「髄腔内投与」または「髄腔内送達
」は、腰椎部または領域を介した、ＩＴ投与または送達、すなわち、腰椎ＩＴ投与または
送達を指す。本明細書で用いる場合、「腰部領域」または「腰椎域」という用語は、第三
及び第四腰椎（背中下部）の間の区域、さらに包括的には、脊椎のＬ２～Ｓ１領域を指す
。

「下位運動ニューロン」 本明細書で用いる場合、「下位運動ニューロン」という用語
は、脳幹及び脊髄を筋繊維へ接続する運動ニューロンを指す。言い換えれば、下位運動ニ
ューロンは上位運動ニューロンから筋肉へ神経衝動をもたらす。概して、下位運動ニュー
ロンの軸索は、エフェクター（筋肉）で終止する。下位運動ニューロンは、「脊髄ニュー
ロン」及び「脊髄前角細胞」を含む。

「リソソーム酵素」 本明細書で用いる場合、「リソソーム酵素」という用語は、哺乳
類のリソソーム中の蓄積物質を減少し得るか、あるいは一種または複数種のリソソーム蓄
積症の症状から救出するか、または改善し得る、任意の酵素を指す。本発明に好適なリソ
ソーム酵素は、野生型または修飾されたリソソーム酵素両方を含み、遺伝子組換え方法及
び合成方法を用いて生成すること、または天然物から精製することが可能である。リソソ
ーム酵素の例は、表２に列挙されている。

「リソソーム酵素欠乏症」 本明細書で用いる場合、「リソソーム酵素欠乏症」は、リ
ソソーム中で高分子（例えば酵素基質）をペプチド、アミノ酸、単糖、核酸、及び脂肪酸
に分解するために必要な酵素のうちの少なくとも１つにおける欠乏に起因する遺伝性障害
の一群を指す。その結果、リソソーム酵素欠乏症に罹患している個体は、種々の生物組織
（例えば、ＣＮＳ、肝臓、脾臓、腸、血管壁及びその他の器官）中に物質を蓄積している
。

「リソソーム蓄積症」 本明細書で用いる場合、「リソソーム蓄積症」という用語は、
天然高分子を代謝するために必要な一種または複数種のリソソーム酵素の欠乏に起因する
任意の疾患を指す。概して、これらの疾患では、リソソーム中に未分解分子の蓄積を生じ
て、貯蔵顆粒（貯蔵小胞とも呼ばれる）の数を増大する。これらの疾患及び種々の例は、
以下で詳細に記載される。

「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」 本明細書で用いる場合、「メッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、少なくとも一種のポリペプチドでコードされたポリヌクレオチド
を指す。本明細書で用いられるｍＲＮＡは、修飾されたＲＮＡ及び無修飾のＲＮＡの両方
を包含する。ｍＲＮＡは、一種または複数種のコード領域及びノンコーディング領域を含
み得る。ｍＲＮＡは、天然物から精製されたり、組み換え発現システムを用いて生成され
て任意で精製されたり、化学的に合成されたりされ得る。必要に応じて、例えば、化学的
に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは化学的に修正された、塩基または糖、骨格修飾など
を有する類似体のようなヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別に指示がな
い限り、５’から３’の方向で存在している。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは
天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）、ヌクレオ
シド類似体（２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン
、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プ
ロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウ
リジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチ
ジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デア
ザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニ
ン、及び２－チオシチジン）、化学修飾塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチ
ル化された塩基）、介在塩基、改質糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２
’－デオキシリボース、アラビノース及びヘキソース）、及び／または改質リン酸基（例
えば、ホスホロチオネート及び５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合）も含む。

「核酸」 本明細書で用いる場合、「核酸」という用語は、最も広義には、ポリヌクレ
オチド鎖へ組み込まれ得る、任意の化合物、及び／または物質を指す。いくつかの実施形
態において、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖へ組み込まれ得
る化合物、及び／または物質である。いくつかの実施形態において、「核酸」は、個体の
核酸残基（例えば、ヌクレオチド、及び／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施
形態において、「核酸」は、個体の核酸残基を含む、ポリヌクレオチド鎖を指す。いくつ
かの実施形態において、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに１本鎖及び／または２本鎖ＤＮＡ
、及び／またはｃＤＮＡ、を包含する。

「患者」 本明細書で用いる場合、「患者」または「検体」という用語は、例えば実験
上の、診断上の、予防の、装飾上の、及び／または治療上の目的で、提供される組成物を
投与し得る、任意の生物体を指す。典型な患者は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサ
ギ、ヒト以外の霊長類、及び／またはヒトなどの哺乳類）を含む。いくつかの実施形態に
おいて、患者はヒトである。ヒトは、出生前、及び出生後の形態を含む。

「薬学的に受容可能な」 本明細書で用いる場合、「薬学的に受容可能な」という用語
は、健全な医療判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題、
または合併症がない、ヒト及び動物の生物組織に接する利用に好適で、妥当な利益／危険
の比に相当する、物質を指す。

「薬学的に受容可能な塩」 薬学的に受容可能な塩は、当技術分野で既知である。例え
ば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、薬学的に受容可能な塩について詳細にＪ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９７７）６６：１－１９で述べている。本発明
において化合物の薬学的に受容可能な塩は、好適な無機、及び有機酸、ならびに有機塩に
由来するものを含む。薬学的に受容可能で、毒性のない酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素
酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸などの無機酸、または、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、
酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸、または、イオン交換などの
従来技術において使用する他の方法を用いて形成された、アミノ群の塩である。その他の
薬学的に受容可能な塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギ
ン酸塩、ベンゼンスルホナート、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酢酸塩、ショウノ
ウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグル
コン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン
酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨ
ウ化水素塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリ
ン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩
、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パ
ルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、ペルオキソ硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸
塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸
塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカノアート
、吉草酸塩、などを含む。適切な塩基から得た塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、
アンモニウム、及びＮ^＋（Ｃ_１－４アルキル）_４塩を含む。代表的なアルカリまたはアル
カリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを
含む。さらに薬学的に受容可能な塩は、適切な場合に、非毒性アンモニウム塩、四級アン
モニウム、及び、例えば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、
硝酸塩、スルホン酸塩、及びアリールスルホナート、などの対イオンを用いて形成される
アミンカチオン、を含む。さらに薬学的に受容可能な塩は、例えば、四級アルキルアミノ
基を含む塩を形成するハロゲン化アルキルなどの適切な求電子剤を使用したアミンの四級
化で形成された塩を含む。

「検体」 本明細書で用いる場合、「検体」という用語は、ヒト、またはヒト以外の任
意の動物を（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ
、または霊長類）を指す。ヒトは、出生前、及び出生後の形態を含む。多くの実施形態に
おいて、検体はヒトである。「検体」は、患者であってもよく、疾病の診断または治療の
ために、医療提供者に見せるヒトを指す。本明細書では、「検体」という用語は、「個体
」または「患者」と区別なく用いられる。検体は、疾患や障害に苦しめられたり、または
影響を受けたりし得るが、疾患や障害の症候を見せる場合も見せない場合もある。

「治療的有効量」 本明細書中で用いる場合、治療薬の「治療的有効量」という用語は
、疾患、障害、及び／または異常の兆候の開始を治療、診断、予防、及び／または遅らせ
るために、疾患、障害、及び／または異常に罹っている、または感染しやすい検体へ投与
するときに、十分な量を指す。治療的有効量は概して、少なくとも１単位用量を含む投薬
計画によって投与される量であることは、当業者によって、理解されるだろう。

「治療」 本明細書で用いる場合、「治療」（「治療する」または「治療すること」も
同様）という用語は、特定の疾患、障害、及び／または異常（例えば、インフルエンザ）
の１つ以上の症候、特徴、及び／または原因の罹患率を、部分的または完全に緩和する、
改善する、生き返る、抑制する、発生を遅らせる、深刻さを低減する、及び／または、減
らす物質（例えば、提供された組成物）の任意の投与を指す。当該治療は、関連の疾患、
障害、及び／または異常の兆候を示さない検体、及び／または疾患、障害、及び／または
異常の、早期の兆候のみを示す検体に関してもよい。これに代え又はこれに加えて、当該
治療は、関連の疾患、障害、及び／または異常の１つ以上の確証された兆候を示す検体に
関してもよい。いくつかの実施形態において、治療は、関連の疾患、障害、及び／または
異常に罹っていると診断されている検体に関してもよい。いくつかの実施形態において、
治療は、関連の疾患、障害、及び／または異常について発生の恐れが増大していることと
統計的に相関がある、１つ以上の感受性因子を有していると考えられる検体に関しても良
い。

「上位運動ニューロン」 本明細書で用いる場合、「上位運動ニューロン」及び「皮質
脊髄ニューロン」という用語は、大脳皮質の運動野、もしくは脳幹で生じて、最終共通路
に至るまで運動情報を伝える運動ニューロンを指す同義語として用いられる。概して、上
位運動ニューロンは、目的とする筋肉を刺激する直接の原因ではない任意の運動ニューロ
ンを指す。
詳細な説明

本発明は、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を中枢神経系（ＣＮＳ）へ効率的
に送達する、方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、組成物の投与が、脳内及び／
または脊髄中のニューロンにおいて、ｍＲＮＡの細胞内送達をもたらすような、リポソー
ム内に封入されたタンパク質をコードしたｍＲＮＡを含む組成物を送達する必要のある対
象への髄腔内投与の方法及び組成物を提供する。本発明は、脊髄性筋萎縮症などのＣＮＳ
系疾患、障害、または異常の治療に特に有用である。本明細書で用いる場合、「リポソー
ム」という用語は、任意の、層状、多層状、または固形状の、脂質ナノ粒子小胞を指す。
概して、本明細書で用いられるリポソームは、一種または複数種の脂質を混合することで
、または一種または複数種の脂質とポリマーを混合することで、形成され得る。従って、
本明細書で用いられる「リポソーム」という用語は、脂質とポリマー系両方のナノ粒子を
含む。いくつかの実施形態において、本発明に好適なリポソームは、陽イオン性または非
陽イオン性脂質、コレステロール系脂質、及びＰＥＧ－修飾脂質を含む。

本発明の種々な態様は、以下の節で詳細に記載される。節の記載内容は、本発明を限定
するものではない。各節は、本発明の任意の態様に適用し得る。この出願において、「ま
たは」は、別記しない限り「及び／または」を意味する。
ＣＮＳ疾患、障害、または異常に関連するｍＲＮＡ

本発明は、中枢神経系へ任意のｍＲＮＡを送達するために用いられ得る。特に、本発明
は、ＣＮＳ疾患、障害、または異常に関連する、または関連づけられる、タンパク質をコ
ードするｍＲＮＡを送達するのに有用である。本明細書で用いる場合、「ＣＮＳ疾患、障
害、または異常」は、中枢神経系（すなわち、脳及び／または脊髄）の１つ以上の神経機
能に影響する、疾患、障害、または異常を指す。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾
患、障害、または異常は、ＣＮＳ（すなわち、脳及び／または脊髄）のニューロン中で、
タンパク質の欠乏または機能障害によって引き起こされ得る。

典型的なＣＮＳ疾患、障害、または異常は、酸性リパーゼ欠損症、酸性マルターゼ欠損症
、後天性てんかん性失語、急性散在性脳脊髄炎、多動症候群、アディー瞳孔、アディー症
候群、副腎白質ジストロフィー、失認、アイカルディ症候群、エカルディ‐グティエール
症候群障害、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎
縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、無脳症、動脈瘤、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素
症、抗リン脂質抗体症候群、失語症、失行、クモ膜炎、アーノルド・キアリ奇形、アスペ
ルガー症候群、運動失調、毛細血管拡張性運動失調症、運動失調及び小脳または脊髄小脳
変性症、注意欠陥・多動性障害、自閉症、自律神経機能障害、バース症候群、バッテン病
、ベッカーミオトニー、ベーチェット病、ベル麻痺、ベルナール・ロス症候群、ビンスワ
ンガー病、色素失調症、ブラッドベリ・エグルストン症候群、脊髄性片麻痺、球脊髄性筋
萎縮症、カダシル、カナバン病、灼熱痛、海綿腫、海綿状血管腫、中心性頸髄症候群、脊
髄中心症候群、橋中心髄鞘崩壊症、セラミダーゼ欠損症、小脳変性症、小脳低形成、脳脚
気、脳性巨人症、脳性麻痺、脳眼顔骨症候群（ＣＯＦＳ）、コレステロールエステル蓄積
症、舞踏病、舞踏病‐有棘赤血球症、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）
、慢性起立性調節障害、コケイン症候群ＩＩ型、コッフィン・ラウリー症候群、コルポセ
ファリー、先天性筋無力症、大脳皮質基底核変性症、頭蓋動脈炎、クリー脳炎、クロイツ
フェルト・ヤコブ症候群、クッシング症候群、巨大細胞封入体病、ダンシングアイズ－ダ
ンス足症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、ドーソン病、中隔視神経形成異常症、デ
ジェリン－クルンプケ麻痺、歯状核小脳萎縮、歯状核赤核萎縮症、皮膚筋炎、発達統合運
動障害、視神経脊髄炎、びまん性硬化症、乳児重症ミオクロニーてんかん、自律神経障害
、書字障害、読字障害、嚥下障害、行為障害、ミオクロニー性小脳性協働収縮異常症、進
行性小脳性共同運動障害、ファブリー病、ファール病、家族性自律神経異常症、家族性血
管腫、特発性家族性大脳基底核石灰化症、家族性周期性四肢麻痺、家族痙性麻痺、ファー
バー病、線維筋異形成症、フィッシャー症候群、筋緊張低下児候群、フリードライヒ運動
失調症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシド症、ゲルストマン症候群、ゲルストマン・シ
ュトロイスラー・シャインカー症候群、巨大軸索ニューロパチー、巨細胞動脈炎、巨大細
胞封入病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、舌咽神経痛、糖原病、ギラン・バレー症
候群、ハレルフォルデン・スパッツ病、持続性片側頭痛、交叉性片麻痺、遺伝性痙性対麻
痺、多発神経炎型遺伝性運動失調症、ホームズ・アディー症候群、全前脳症、ヒューズ症
候群、ハンチントン病、水無脳症、水脊髄症、コルチゾン過剰症、免疫介在、脳脊髄炎、
封入体筋炎、色素失調症、小児筋緊張低下、乳児神経軸索ジストロフィー、酸蓄積症、後
頭孔脳脱出、アイザック症候群、ジュベール症候群、カーンズ・セイヤー症候群、ケネデ
ィ病、Ｋｉｎｓｂｏｕｒｎｅ症候群、クライン・レビン症候群、クリッペル・フェール症
候群、クリッペル・トレノノーニ症候群（ＫＴＳ）、クリューバー・ビューシー症候群、
コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲル・ウェランダー病、ランバート・イートン
筋無力症候群、ランドウ・クレフナー症候群、外側大腿皮神経エントラップメント、延髄
外側症候群、リー病、レノックス・ガストー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、レヴァ
イン－クリッチュリー症候群、レヴィ小体型認知症、リポイドタンパク症、滑脳症、閉じ
込め症候群、ルー・ゲーリッグ病、ループス神経後遺症、ライム病、マシャド・ジョセフ
病、大頭脳症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、メンケス病、知覚異常性大腿痛、
異染性白質ジストロフィー、小頭症、ミラー・フィッシャー症候群、メビウス症候群、多
発性硬化症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、ミエリノクラスチックびまん性硬化症、
ナルコレプシー、神経有棘赤血球症、神経線維腫症、神経遮断薬による悪性症候群、神経
サルコイドーシス、ニーマン・ピック病、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソ
クロヌス・ミオクローヌス、オサリバン・マクラウド症候群、パントテン酸キナーゼ関連
神経変性症、傍腫瘍性症候群、感覚異常、パーキンソン病、発作性舞踏アテトーシス、発
作性片側頭痛、パリー・ロンバーグ、ペリツェウス・メルツバッハー病、ペナショッカー
ＩＩ症候群、脳室周囲白質軟化症、フィタン酸蓄積症、ピック病、梨状筋症候群、多発性
筋炎、ポンペ病、ポストポリオ症候群、原発歯状萎縮症、原発性側索硬化症、原発性進行
性失語症、プリオン病、進行性顔面片側萎縮症、進行性歩行運動失調、進行性多巣性白質
脳症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、相貌失認、ラムゼイ・ハ
ント症候群Ｉ、ラムゼイ・ハント症候群ＩＩ、ラスムッセン脳炎、レフサム病、レット症
候群、ライ症候群、ライリー・デイ症候群、サンドホフ病、シルダー病、ザイテルベルゲ
ル病、乳児重症ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）、シャイ・ドレーガー症候群、シェー
グレン症候群、痙性、二分脊椎、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症、脊髄小脳変性症、ス
ティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、線条体黒質変性症、スタージ・ウェ
ーバー症候群、遅発性ジスキネジア、テイ・サックス病、胸郭出口症候群、甲状腺中毒ミ
オパチー、疼痛性チック、トッド麻痺、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺症、トロイヤ
ー症候群、フォン・エコーノモ病、フォンヒッペル・リンダウ病（ＶＨＬ）、フォンレッ
クリングハウゼン病、ワーレンベルグ症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病、ウェルニッ
ケ－コルサコフ症候群、ウェスト症候群、ウィップル病、ウィリアムス症候群、ウィルソ
ン病、ウォルマン病、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症及びツェルヴェーガー症候群を含むが、
限定されない。
運動ニューロン疾患

いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患、障害、または異常は、運動ニューロンの１つ
以上の機能に影響する、疾患、障害、または異常であり、運動ニューロン疾患ともいう。
いくつかの実施形態において、運動ニューロン疾患は、ＣＮＳ（すなわち、脳及び／また
は脊髄）の運動ニューロン中で、タンパク質の欠乏または機能障害によって引き起こされ
得る。本明細書で用いる場合、「運動ニューロン」という用語は、随意筋の活性を制御す
るそれらのニューロンを指す。概して、運動ニューロンは、上位運動ニューロン及び下位
運動ニューロンを含む。本明細書で用いる場合、「上位運動ニューロン」は、大脳皮質の
運動野、または脳幹で生じて、そして最終共通路に至るまで、運動情報を伝える、運動ニ
ューロンを指す。上位運動ニューロンは、「皮質脊髄ニューロン」ともいう。概して、上
位運動ニューロンは、目的とする筋肉を刺激する直接の原因ではない、任意の運動ニュー
ロンを指す。本明細書で用いる場合、「下位運動ニューロン」という用語は、脳幹及び脊
髄を筋繊維へ接続する運動ニューロンを指す。言い換えれば、下位運動ニューロンは上位
運動ニューロンから筋肉へ神経衝動をもたらす。概して、下位運動ニューロンの軸索は、
エフェクター（筋肉）で終止する。下位運動ニューロンは、「脊髄ニューロン」及び「脊
髄前角細胞」を含む。

典型的な運動ニューロン疾患、障害、または異常は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原
発性側索硬化症（ＰＬＳ）、偽性球麻痺、遺伝性痙性対麻痺、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）
、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、遠位遺伝性運動ニューロパチー、及び脊髄性筋萎縮症を含む
が、特に限定されない。

いくつかの実施形態において、運動ニューロン疾患、障害、または異常は、脊髄性筋萎縮
症の一形態である。脊髄性筋萎縮症の一群は、下位運動ニューロンの退化で特徴付けられ
る、珍しい消耗性疾患の遺伝子的に及び臨床的に不均一な群である。脊髄の脊髄前角とし
ても知られる、下位運動ニューロン内の細胞の退化は、体内にある種々の筋肉群の萎縮及
び過度の消耗をもたらす、運動機能の低下を引き起こす。当該一群を含む疾病は、基部、
末端、常染色体劣性基部及び局部的脊髄性筋萎縮症へ分けることができる。しかし、タン
パク質欠乏は種々の形態の脊髄性筋萎縮症において主要な原因であることを考慮し、各疾
病の要素は、通常、異常に関連する遺伝子により分類される。下の表１に、脊髄性筋萎縮
症の主要な６つの群を記載する。

ＣＮＳ構成成分に関する疾患

いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患、障害、または異常は、ＣＮＳ構成成分に関す
る疾患である。概して、ＣＮＳ構成成分に関する疾患は、体内の、ＣＮＳと末梢組織の両
方を含み、一種または複数種の生物組織、１つまたは複数のＣＮＳの病因及び／または症
状が生じる、タンパク質欠乏によって起こる。例えば、いくつかの実施形態において、タ
ンパク質欠乏は、細胞内及び／または細胞外構成成分、例えば、グルコサミノグリカン（
ＧＡＧ）、脂質、斑（すなわち、β－アミロイド）、またはタンパク質などの、過度の蓄
積という結果になり得る。従って、いくつかの実施形態において、ＣＮＳ構成成分に関す
る疾患は、リソソーム酵素の欠乏によって起こるリソソーム蓄積症であり、これによりＣ
ＮＳと末梢組織の両方の中でグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）の過度の蓄積が生じるもの
である。

いくつかの実施形態において、ＣＮＳの病因及び／または症状を有するリソソーム蓄積症
は、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シ
スチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコース
蓄積症、ガラクトシアリドーシスＩ型／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ型／ＩＩ型／ＩＩＩ型、グ
ロボイド細胞白質ジストロフィー、クラッベ病、糖原病ＩＩ、ポンペ病、ＧＭ１ガングリ
オシドーシスタイプＩ型／ＩＩ型／ＩＩＩ型、ＧＭ２ガングリオシドーシスＩ型、テイ・
サックス病、ＧＭ２ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホフ病、ＧＭ２ガングリオシド
ーシス、α－マンノース蓄積症Ｉ型／ＩＩ型、β－マンノース蓄積症、異染性白質ジスト
ロフィー、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシスＩ型／ＩＩ型、ムコリピドーシスＩＩ
型／ＩＩＩ型、Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽ハーラー多発性ジストロフィー
、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型、サンフィリッポ症候群、
ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症タイプＩＩＩＣ、ムコ多糖症はＩＩＩＤ、ムコ多糖症
ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症タイプＩＶＢ、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症Ｖ
ＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖症のＩＸ型、マルチプルサルファターゼ欠損症、神経セ
ロイドリポフスチン症、ＣＬＮ１バッテン病、ＣＬＮ２バッテン病、ニーマン・ピック病
Ａ型／Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、濃化異骨症、シン
ドラー病Ｉ型／ＩＩ型、ゴーシェ病、及びシアル酸蓄積症を含むが、これらに限定されな
い。

リソソーム蓄積症の遺伝的病因、臨床症状、及び分子生物学の詳細な検討は、Ｓｃｒｉｖ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，７．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅ
ｄ．，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，（１９９５）に詳述されている。従って
、上の疾患における酵素欠損は当業者に知られており、そのいくつかを下の表２に例示す
る。

種々の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている、任意のＣＮＳ系疾患、
障害、または異常において、欠損しているタンパク質をコードしたｍＲＮＡを送達するた
めに用いられてもよい。いくつかの実施形態において、本発明は、運動ニューロン疾患、
例えば表１に示す運動ニューロン疾患において、欠損しているタンパク質をコードしたｍ
ＲＮＡを送達するために用いられてもよい。特定の実施形態において、本発明は、脊髄性
筋萎縮症（ＳＭＡ）、例えば、以下に詳細に記載されているＳＭＮ１において欠損してい
るタンパク質をコードしたｍＲＮＡを送達するために用いられてもよい。いくつかの実施
形態において、本発明は、ＣＮＳ構成成分でリソソーム蓄積症において、欠損しているリ
ソソーム酵素をコードしたｍＲＮＡを送達するために用いられてもよい。いくつかの実施
形態において、本発明は、表２から選択されたリソソーム酵素をコードしたｍＲＮＡを送
達するために用いられてもよい。いくつかの実施形態において、本発明において好適なｍ
ＲＮＡは、野生型または自然に存在する、アミノ酸配列をコードしてもよい。いくつかの
実施形態において、本発明において好適なｍＲＮＡは、野生型または自然に存在する、ア
ミノ酸配列であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明において好適なｍＲＮ
Ａは、コドン最適化された配列であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明に
おいて好適なｍＲＮＡは、実質的ホモロジーを有するアミノ酸配列をコードし、または野
生型または自然に存在する、アミノ酸タンパク質配列（例えば、野生型または自然に存在
するアミノ酸配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９５％、９８％、一致する配列を有する）を同定し得る。
生存運動ニューロン

いくつかの実施形態において、本発明によって提供される本方法及び組成物は、脊髄性筋
萎縮症（ＳＭＡ）の治療のために、ＣＮＳへ生存運動ニューロンタンパク質をコードした
ｍＲＮＡを送達するために用いられる。

好適なＳＭＮ ｍＲＮＡは、自然に存在するＳＭＮタンパク質の活性の代わりになること
もでき、または、脊髄性筋萎縮症に関連する、１つ以上の表現型もしくは症状を救出する
こともできる、任意のＳＭＮタンパク質の全長、断片、または一部をコードする。ヒト生
存運動ニューロン－１（ｈＳＭＮ－１）のｍＲＮＡ配列、及び典型的な野生型または自然
に存在するｈＳＭＮ－１タンパク質の対応するアミノ酸配列を、表３に示す。

従って、いくつかの実施形態において、本発明において好適なｍＲＮＡは、野生型ｈＳＭ
Ｎ－１ ｍＲＮＡ配列（配列番号１）である。いくつかの実施形態において、好適なｍＲ
ＮＡは、（配列番号３）で表される、コドン最適化されたｈＳＭＮ－１ ｍＲＮＡ配列で
あってもよい。
ＡＵＧＧＣＣＡＵＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＵＧＣＣＣ
ＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＵＧＣＵＧＵＵＣＡＧＧＡＧＡＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣ
ＡＧＡＧＣＧＡＵＧＡＣＡＧＣＧＡＵＡＵＣＵＧＧＧＡＣＧＡＵＡＣＣＧＣＵＣＵＧＡＵ
ＣＡＡＧＧＣＣＵＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＵＧＧＣＣＡＧＣＵＵＣＡＡＧＣＡＣＧＣＣ
ＣＵＧＡＡＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＡＵＣＵＧＣＧＡＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡ
ＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＵＡＡＧＡＧ
ＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＵＧＣＡＧＣＡＧＵＧＧＡＡＧ
ＧＵＧＧＧＣＧＡＣＡＡＧＵＧＣＡＧＣＧＣＣＡＵＣＵＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＵ
ＧＣＡＵＣＵＡＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＣＧＣＣＡＧＣＡＵＣＧＡＣＵＵＣＡＡＧＡＧ
ＡＧＡＧＡＣＣＵＧＣＧＵＧＧＵＣＧＵＧＵＡＣＡＣＣＧＧＣＵＡＣＧＧＣＡＡＣＡＧＡ
ＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＵＧＡＧＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＣＣＣＡＵＵＵＧＵＧ
ＡＧＧＵＧＧＣＣＡＡＵＡＡＣＡＵＣＧＡＡＣＡＧＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡ
ＧＡＡＵＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＵＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＧＣ
ＡＧＡＵＣＵＣＣＵＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＣＣＵＡＡＧＵ
ＣＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＡＡＣＡＧＣＵＵＣＣＵＧＣＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＡＣＣＣＡＵ
ＧＣＣＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＵＧＧＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＣＵＧＧＣＣＵＧＡＡＧ
ＵＵＣＡＡＣＧＧＡＣＣＡＣＣＵＣＣＣＣＣＵＣＣＡＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＣＡＣＣＵＣ
ＡＵＣＵＣＣＵＧＡＧＣＵＧＣＵＧＧＣＵＧＣＣＡＣＣＣＵＵＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣ
ＣＣＣＵＡＵＣＡＵＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＵＣＣＣＡＵＣＵＧＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣ
ＣＵＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＡＵＧＣＣＣＵＧＧＧＣＡＧＣＡＵＧＣＵＧＡＵＣＡＧＣＵ
ＧＧＵＡＣＡＵＧＡＧＣＧＧＣＵＡＣＣＡＣＡＣＡＧＧＡＵＡＣＵＡＣＡＵＧＧＧＣＵＵ
ＣＡＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＡＵＧＣＵＣＣＣＡＣＵＣＣＣＵＧ
ＡＡＣＵＧＡ

あるいは、いくつかの実施形態において、好適なｍＲＮＡは（配列番号４）で表される
、コドン最適化されたｈＳＭＮ－１ ｍＲＮＡ配列であり得る。
ＡＵＧＧＣＣＡＵＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＵＧＣＣＡ
ＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＵＡＧＣＧＵＧＣＵＧＵＵＵＣＧＣＣＧＧＧＧＣＡＣＣＧＧＡＣ
ＡＡＵＣＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＧＡＵＡＵＵＵＧＧＧＡＣＧＡＣＡＣＵＧＣＧＣＵＣＡＵ
ＣＡＡＧＧＣＣＵＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＵＧＧＣＵＵＣＧＵＵＣＡＡＧＣＡＣＧＣＵ
ＣＵＧＡＡＧＡＡＣＧＧＧＧＡＵＡＵＣＵＧＵＧＡＡＡＣＣＡＧＣＧＧＵＡＡＡＣＣＡＡ
ＡＡＡＣＵＡＣＧＣＣＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＧＵＣ
ＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＵＡＣＣＧＣＵＧＣＧＡＧＣＵＵＧＣＡＧＣＡＧＵＧＧＡＡＧ
ＧＵＧＧＧＣＧＡＣＡＡＧＵＧＣＵＣＣＧＣＧＡＵＵＵＧＧＵＣＧＧＡＡＧＡＵＧＧＵＵ
ＧＣＡＵＣＵＡＣＣＣＧＧＣＡＡＣＣＡＵＣＧＣＣＵＣＣＡＵＣＧＡＣＵＵＵＡＡＧＣＧ
ＧＧＡＧＡＣＵＵＧＣＧＵＣＧＵＧＧＵＣＵＡＣＡＣＣＧＧＡＵＡＣＧＧＣＡＡＵＡＧＡ
ＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＡＵＣＵＧＵＣＡＧＡＣＣＵＵＣＵＧＵＣＧＣＣＡＡＵＣＵＧＣＧ
ＡＧＧＵＣＧＣＣＡＡＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＧＣＣＣＡＡＧＡＧＡＡＣＧＡ
ＧＡＡＵＧＡＧＵＣＣＣＡＡＧＵＧＵＣＣＡＣＧＧＡＣＧＡＡＵＣＧＧＡＡＡＡＣＵＣＡ
ＣＧＧＵＣＣＣＣＵＧＧＧＡＡＣＡＡＧＵＣＡＧＡＵＡＡＣＡＵＣＡＡＧＣＣＵＡＡＡＵ
ＣＧＧＣＡＣＣＡＵＧＧＡＡＣＵＣＣＵＵＣＣＵＧＣＣＧＣＣＵＣＣＧＣＣＵＣＣＧＡＵ
ＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＵＧＧＧＡＣＣＧＧＧＵＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＵＣＡＡＧ
ＵＵＣＡＡＵＧＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣ
ＡＣＣＵＣＣＵＣＵＣＧＵＧＣＵＧＧＣＵＧＣＣＧＣＣＧＵＵＣＣＣＵＵＣＣＧＧＡＣＣ
ＧＣＣＵＡＵＣＡＵＵＣＣＧＣＣＡＣＣＵＣＣＡＣＣＵＡＵＣＵＧＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣ
ＣＵＧＧＡＵＧＡＵＧＣＣＧＡＣＧＣＡＵＵＧＧＧＣＵＣＣＡＵＧＣＵＣＡＵＣＵＣＡＵ
ＧＧＵＡＣＡＵＧＵＣＧＧＧＡＵＡＣＣＡＵＡＣＵＧＧＧＵＡＵＵＡＣＡＵＧＧＧＣＵＵ
ＣＡＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＣＧＣＵＧＵＵＣＣＣＡＵＡＧＣＣＵＧ
ＡＡＣＵＡＧ

いくつかの実施形態において、好適なｍＲＮＡは、ヒト生存運動ニューロン‐２（ｈＳＭ
Ｎ－２）タンパク質の、全長、断片、または一部をコードする。ｈＳＭＮ－２及び、典型
的な野生型または自然に存在するｈＳＭＮ－２タンパク質のアミノ酸配列に対応する、ｍ
ＲＮＡ配列を表４に示す。

従って、いくつかの実施形態において、本発明において好適なｍＲＮＡは、野生型ｈＳＭ
Ｎ－２ ｍＲＮＡ配列（配列番号５）である。いくつかの実施形態において、好適なｍＲ
ＮＡは、コドン最適化されたｈＳＭＮ－１ ｍＲＮＡ配列であり得る。

いくつかの実施形態において、好適なｍＲＮＡ配列は、ヒトＳＭＮ－１（配列番号２）ま
たはヒトＳＭＮ－２（配列番号６）の相同物または類似体をコードしたｍＲＮＡ配列であ
り得る。例えば、ヒトＳＭＮ－１もしくはＳＭＮ－２、タンパク質の相同物または類似体
は、重要なＳＭＮ－１またはＳＭＮ－２タンパク質の活性を保持して、野生型または自然
に存在するヒトＳＭＮ－１タンパク質（例えば配列番号２）、またはヒトＳＭＮ－２タン
パク質（例えば配列番号６）と比較すると、１種又は複数種のアミノ酸の置換、欠損及び
／または挿入を含む、修飾されたヒトＳＭＮ－１もしくはＳＭＮ－２、タンパク質であっ
てもよい。いくつかの実施形態において、本発明において好適なｍＲＮＡは、配列番号２
もしくは配列番号６と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、またはそれ以上に相同な、アミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形
態において、本発明において好適なｍＲＮＡは、ヒトＳＭＮ－１タンパク質（配列番号２
）または、ヒトＳＭＮ－２タンパク質（配列番号６）と、実質的に同一のタンパク質をコ
ードする。いくつかの実施形態において、本発明において好適なｍＲＮＡは、配列番号２
または配列番号６と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％、またはそれ以上一致したアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態に
おいて、本発明において好適なｍＲＮＡは、ヒトＳＭＮ－１タンパク質またはヒトＳＭＮ
－２タンパク質の断片または一部をコードし、そこにおいて、当該タンパク質の断片また
は一部は、当該それぞれの野生型タンパク質の活性と同様である、ＳＭＮ－１またはＳＭ
Ｎ－２の活性を保持したままである。いくつかの実施形態において、本発明において好適
なｍＲＮＡは、配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号５に、少なくとも、
５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同
一のヌクレオチド配列を含む。

ヒトＳＭＮ－１遺伝子は、選択的プロセシング及び転写修飾を経て、選択的スプライスア
イソフォームを生成する。例えば、５つの既知であるｈＳＭＮ－１スプライスアイソフォ
ームである、ｈＳＭＮ－１アイソフォームｂ、ｃ、ｅ、ｆ、及びｇがある。ヒトＳＭＮ－
２遺伝子も、選択的プロセシング及び転写修飾を経て、選択的スプライスアイソフォーム
を生成する。４つの既知であるｈＳＭＮ－２スプライスアイソフォームである、ｈＳＭＮ
－２アイソフォームａ、ｂ、ｃ、及びｄが存在する。いくつかの実施形態において、本発
明はｈＳＭＮ－１アイソフォーム（例えばアイソフォームｂ、ｃ、ｅ、ｆ、またはｇ）を
コードするｍＲＮＡを送達するために用いられる。いくつかの実施形態において、本発明
はｈＳＭＮ－２アイソフォーム（例えばアイソフォームａ、ｂ、ｃ、またはｄ）をコード
するｍＲＮＡを送達するために用いられる。ｈＳＭＮ－１及びｈＳＭＮ－２のアイソフォ
ームのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、当技術分野で既知である。従って、いくつかの
実施形態において、本発明は、ｈＳＭＮ－１アイソフォーム、またはｈＳＭＮ－２タンパ
ク質、またはそれらのアイソフォームをコードしたｍＲＮＡを送達するために用いられ得
る。いくつかの実施形態において、本発明において好適なｍＲＮＡは、野生型または自然
に存在する、ｈＳＭＮ－１またはｈＳＭＮ－２アイソフォーム配列であってもよい。いく
つかの実施形態において、本発明において好適なｍＲＮＡは、コドン最適化された、ｈＳ
ＭＮ－１またはｈＳＭＮ－２アイソフォーム配列であってもよい。いくつかの実施形態に
おいて、本発明において好適なｍＲＮＡは、実質的ホモロジーを有するアミノ酸配列をコ
ードし、または野生型または自然に存在する、ｈＳＭＮ－１またはｈＳＭＮ－２アイソフ
ォーム配列（例えば、野生型または自然に存在するｈＳＭＮ－１またはｈＳＭＮ－２アイ
ソフォーム配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％、９５％、９８％の配列相同性を有する）を同定し得る。
ｍＲＮＡの合成

本発明によるｍＲＮＡは、任意である種々の既知の方法により、合成され得る。例えば、
本発明によるｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応（ＩＶＴ）によって、合成され得る
。簡潔に言えば、ＩＶＴは、概して、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール
、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含みうるバッファーシステム、ならびに適切なＲＮＡ
ポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）、デオキシリボ
ヌクレアーゼＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはリボヌクレアーゼインヒビターを含
む、線状または環状ＤＮＡテンプレートを用いて行われる。正確な条件は、具体的な用途
により変わるであろう。

いくつかの実施形態において、本発明によるｍＲＮＡの調製のために、ＤＮＡテンプレー
トは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写される。好適なＤＮＡテンプレートは、概して、所望のｍ
ＲＮＡ及び終結シグナルに適した所望のヌクレオチド配列に続く、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
のための、例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６プロモーターのようなプロモーターを有す
る。

本発明による所望のｍＲＮＡ配列は、標準的な手法を用いたＤＮＡテンプレートへ、測定
され、組み込まれる。例えば、所望のアミノ酸配列（例えば酵素配列）から開始し、実質
上の逆転写が、変質した遺伝情報に基づき実行される。最適化されたアルゴリズムが、好
適なコドンの選択のために用いられ得る。概して、Ｇ／Ｃ含量は、一方では、最良のＧ／
Ｃ含量を達成するために最適化され得るが、その他方で、コドン使用頻度に応じたｔＲＮ
Ａの頻度を最大限考慮に入れている。最適化されたＲＮＡ配列は、例えば、適切な表示装
置の助けによって、そして本来の（野生型）配列と比較されながら、確証され、かつ発現
され得る。二次構造についてもまた、ＲＮＡの、安定化する及び不安定化する特性、また
はそれぞれの領域を確かめながら分析され得る。
修飾されたｍＲＮＡ

いくつかの実施形態において、本発明によるｍＲＮＡは、無修飾または修飾されたｍＲＮ
Ａとして合成され得る。概して、ｍＲＮＡは安定性を強化するために、修飾される。ｍＲ
ＮＡの修飾は、例えばＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。従って、本発明により修
飾されたｍＲＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。いくつか
の実施形態において、ｍＲＮＡは、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））、もしく
はピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、を含むが限定されな
い天然に存在するヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体（修飾されたヌクレオチ
ド）から、１－メチル－アデニン、２－メチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イ
ソペンテニルアデニン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６イソペンテニルアデニン、２－チオ
－シトシン、３－メチルシトシン、４－アセチルシトシン、５－メチルシトシン、２，６
－ジアミノプリン、１－メチルグアニン、２－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニ
ン、７－メチルグアニン、イノシン、１－メチルイノシン、シュードウラシル（５－ウラ
シル）、ジヒドロウラシル、２チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメ
チルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシ
ル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル
－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチルウラシル、Ｎ－ウラシル－５
－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノ
メチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシ
－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（Ｖ
）、１－メチルシュードウラシル、キューオシン、β－Ｄ－マンノシル－キューオシン、
ワイブトキソシン、及びホスホロアミド酸、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド
、メチルホスホン酸、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン及びイノシンなどの、
プリン及びピリミジンの修飾されたヌクレオチド類似体または誘導体として合成され得る
が、これらに限定されない。当該類似体の調製は、例えば、ＵＳ４，３７３，０７１、Ｕ
Ｓ４，４０１，７９６、ＵＳ４，４１５，７３２、ＵＳ４，４５８，０６６、ＵＳ４，５
００，７０７、ＵＳ４，６６８，７７７、ＵＳ４，９７３，６７９、ＵＳ５，０４７，５
２４、ＵＳ５，１３２，４１８、ＵＳ５，１５３，３１９、ＵＳ５，２６２，５３０、及
びＵＳ５，７００，６４２などが当業者には知られており、これらの開示は、その全体が
参照として組み込まれる。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡはＲＮＡ骨格修飾を含んでもよい。概して、骨格
修飾とは、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドのリン酸塩骨格が化学的に修飾される、修飾で
ある。典型的な骨格修飾は、概して、メチルホスホン酸、メチルホスホロアミド酸、ホス
ホロアミド酸、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’－Ｏ－（１－チオホスフェー
ト））、ボラノリン酸、正に荷電したグアニジウム基からなる群からの修飾を含むが、限
定されず、これは他のアニオン性、カチオン性、または中性の基によって、ホスホジエス
テル結合を入れ替えることを意味する。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは糖修飾を含んでもよい。典型的な糖修飾は、２
’－デオキシ－２’－フルオロオリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキ
シシチジン５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）
、２’－デオキシ－２’－デアミン－オリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デ
オキシシチジン５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸
）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキル
オリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン－５’－三リン酸、２’－メチルウ
リジン５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びそれら（２
’－アラシチジン５’－三リン酸、２’－アラウリジン５’－トリホスフェート）、また
はアジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アジ
ド－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）の異性体、からなる群から選択される糖修
飾を含む、ヌクレオチドの糖の化学修飾であるが、限定されない。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡはヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含み
得る。塩基修飾を含む修飾されたヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも言われる。
当該塩基修飾ヌクレオチドは、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド５’－三リン酸、
２－アミノアデノシン５’－三リン酸、２－チオシチジン５’－三リン酸、２チオウリジ
ン－５’－三リン酸、４－チオウリジン－５’－三リン酸、５－アミノアリルシチジン５
’－三リン酸、５－アミノアリルウリジン５’－三リン酸、５ブロモシチジン５’－三リ
ン酸、５ブロモウリジン５’－三リン酸、５－ヨードシチジン５’－三リン酸、５ヨード
ウリジン５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、５－メチルウリジン５
’－三リン酸、６－アザシチジン－５’－三リン酸、６－アザウリジン５’－三リン酸、
６－クロロプリンリボシド５’－三リン酸、７－デアザアデノシン５’－三リン酸、７－
デアザグアノシン５’－三リン酸、８－アザアデノシン５’－三リン酸、８－アジドアデ
ノシン５’－三リン酸、ベンズイミダゾールリボシド５’－三リン酸、Ｎ１－メチルアデ
ノシン５’－三リン酸、Ｎ１メチルグアノシン５’－三リン酸、Ｎ６メチルアデノシン５
’－三リン酸、Ｏ６メチルグアノシン５’－三リン酸、プソイドウリジン５’－三リン酸
、ピューロマイシン５’－三リン酸またはキサントシン５’－三リン酸、を含むが、限定
されない。

概して、ｍＲＮＡ合成は、Ｎ末端（５’）に「キャップ」を、そしてＣ末端（３’）に「
テール」を付加することを含む。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞で見られるヌク
レアーゼに耐性を付与するために重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌ
クレアーゼ分解から保護するために役立つ。
キャップ構造

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。概して、５’キャ
ップは以下のように付加される。始めに、ＲＮＡ末端のリン酸塩が、５’ヌクレオチドか
ら、１つの末端リン酸塩基を取り除き、２つの末端リン酸塩を脱離する。そして、グアニ
リルトランスフェラーゼによって、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を末端リン酸塩へ加え
、５’５’５三リン酸結合を生成する。そして、次いでグアニンの７－窒素は、メチルト
ランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（
５’）Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含むが、こ
れに限定されない。

自然に存在するキャップ構造は、三リン酸の架橋によって、第一に転写されたヌクレオチ
ドの５’末端へ結合し、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎのジヌクレオチドキャップを得
る、７－メチルグアノシンを含み、このＮは任意のヌクレオチドである。Ｉｎ ｖｉｖｏ
では、キャップは酵素として付加される。キャップは、核の中に付加され、そして酵素で
あるグアニリルトランスフェラーゼによって、触媒される。ＲＮＡの５’末端へのキャッ
プの付加が、転写の開始直後に起こる。末端ヌクレオシドは、概してグアノシンであり、
他の全てのヌクレオチド、すなわち、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐとは逆向き
である。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成されたｍＲＮＡの通常のキャップは、ｍ^７Ｇ（５’）
ｐｐｐ（５’）Ｇであり、これは５’末端にキャップ構造を有するＲＮＡを得るための、
Ｔ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写においてジヌクレオチ
ドキャップとして利用される。キャッピングされたｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成の一
般的な方法は、転写のイニシエーターとして、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ^７Ｇ
ｐｐｐＧ）の形態をもつ、前もって形成したジヌクレオチドを用いる。

現在のところ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳実験で用いる合成ジヌクレオチドキャップの通常の
形態は、アンチリバースキャップアナログ（「ＡＲＣＡ」）または、修飾されたＡＲＣＡ
で、これは一般に２’または３’のＯＨ基が、ＯＣＨ_３に替わった、修飾されるキャップ
類似体である。

付加的なキャップ類似体は、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＣ；非メチ
ル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ^２
，７ＧｐｐｐＧ）；トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ^{２，２，７}ＧｐｐｐＧ）、
ジメチル化シンメトリカルキャップ類似体（例えば、ｍ^７Ｇｐｐｐｍ^７Ｇ）、またはアン
チリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ^{７，２’Ｏｍｅ}ＧｐｐｐＧ、ｍ^{７２’
ｄ}ＧｐｐｐＧ、ｍ^{７，３’Ｏｍｅ}ＧｐｐｐＧ、ｍ^{７，３’ｄ}ＧｐｐｐＧ、及びそれらの四
リン酸誘導体）から成る群から選択される化学構造を含むが、限定されない。（例えば、
Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ, Ｊ. ｅｔ ａｌ．， “Ｎｏｖｅｌ ‘ａｎｔｉ-ｒｅｖｅｒｓ
ｅ’ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”,ＲＮＡ、９：１１０８－１１２２（２００３）を参照の
こと）。

いくつかの実施形態において、好適なキャップは、三リン酸の架橋によって、第一に転写
されたヌクレオチドの５’末端へ結合し、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎを得る、７－
メチルグアニル酸（「ｍ^７Ｇ」）であり、このとき、Ｎは任意のヌクレオチドである。本
発明の実施例において利用した、ｍ^７Ｇキャップの好ましい実施形態はｍ^７Ｇ（５’）ｐ
ｐｐ（５’）Ｇである。

いくつかの実施形態において、キャップは、キャップ０構造である。キャップ０構造は、
塩基１及び２へ付属するリボースの２’－Ｏ－メチル残渣が欠損している。いくつかの実
施形態において、キャップは、キャップ１構造である。キャップ１構造は、塩基２に、２
’－Ｏ－メチル残渣を有している。いくつかの実施形態において、キャップはキャップ２
構造である。キャップ２構造は、塩基２と塩基３の両方に付属する、２’－Ｏ－メチル残
渣を有している。

種々のｍ^７Ｇキャップ類似体は、当技術分野で知られており、その多くは、市販されてい
る。それらは、上に記載したｍ^７ＧｐｐｐＧを含み、ＡＲＣＡ３’－ＯＣＨ_３及び２’－
ＯＣＨ_３キャップ類似体も同様である（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ
，９：１１０８－１１２２（２００３））。本発明の実施形態において用いる付加的なキ
ャップ類似体は、Ｎ７－ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，
Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９－１４８７（２００４）に記載）、ホスホロ
チオネートキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ－Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．
，ＲＮＡ，１３：１７４５－１７５５（２００７）に記載）、ＵＳ８，０９３，３６７及
びＵＳ８，３０４，５２９に記載されるテールキャップ類似体（ビオチン化キャップ類似
体を含む）を含み、ここに参照として組み込まれる。
テール構造

概して、「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するために役
立つ。ポリＡテールは、天然メッセンジャー及び合成の、センスＲＮＡを安定化すると考
えられる。それゆえ、一定の実施形態においては、長いポリＡテールはｍＲＮＡ分子へ加
えられて、そうしてＲＮＡをより安定させることが可能である。ポリＡテールは、種々の
当該技術分野において承認されている技術を用いて加えられ得る。例えば、長いポリＡテ
ールは、ポリＡポリメラーゼを用いて、合成した、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された
、ＲＮＡへ加えられ得る（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２－１２５６）。転写ベクターも、長いポリＡテール
をコードすることができる。さらに、ポリＡテールは、ＰＣＲ生成物から直接転写するこ
とで、加えることもできる。ポリＡもまた、ＲＮＡリガーゼでセンスＲＮＡの３’端へ結
合され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ：１９９１ ｅｄｉｔｉｏｎ）などを参照のこと）。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。概して、
ポリＡテールの長さは、少なくとも約１０、５０、１００、２００、３００、４００、ま
たは５００のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、概して、ｍＲＮＡ
の３’端のポリＡテールは、約１０～３００のアデノシンヌクレオチド（例えば約１０～
２００のアデノシンヌクレオチド、約１０～１５０のアデノシンヌクレオチド、約１０～
１００のアデノシンヌクレオチド、約２０～７０のアデノシンヌクレオチド、または約２
０～６０のアデノシンヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは
３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。概して、ｍＲＮＡの３’端のポリＣテールは、約１０
～２００のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～１５０のシトシンヌクレオチド、約
１０～１００のシトシンヌクレオチド、約２０～７０のシトシンヌクレオチド、約２０～
６０のシトシンヌクレオチド、または約１０～４０のシトシンヌクレオチド）を含む。ポ
リＣテールは、ポリＡテールへ加えられてもよく、またはポリＡテールを置換してもよい
。

いくつかの実施形態において、ポリＡまたはポリＣテールの長さは、本発明の修飾センス
ｍＲＮＡ分子の安定性、及び、つまりタンパク質の転写を制御するように調節される。例
えば、ポリＡテールの長さは、センスｍＲＮＡ分子の半減期に影響し得るので、ポリＡテ
ールの長さは、ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの耐性水準を変更するために調節すること
も可能であり、標的細胞内で、ポリヌクレオチドの発現、及び／またはポリペプチドの生
成の経過時間を制御することも可能である。
５’及び３’の非翻訳領域

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、５’及び／または３’の非翻訳領域を含む。
いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳、例えば
鉄反応エレメントなどに影響する、１つ以上のエレメントを含む。いくつかの実施形態に
おいて、５’非翻訳領域は、長さが約５０～５００の間のヌクレオチドであってもよい。

いくつかの実施形態において、３’非翻訳領域は、１つ以上のポリアデニル化シグナル、
細胞内におけるｍＲＮＡの位置安定性に影響するタンパク質の結合部位、または１つ以上
のマイクロＲＮＡ用の結合部位を含む。いくつかの実施形態において、３’非翻訳領域は
、長さが約５０～５００の間、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。

典型的な３’及び／または５’ＵＴＲ配列は、安定である（例えば、グロビン、アクチン
、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）ｍＲＮＡ分子から得
ることが可能であり、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加する。例えば、５’ＵＴＲ配列
は、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列、またはそれらの断片を含んでもよく、
ヌクレアーゼ耐性の改善、及び／または、ポリヌクレオチドの半減期の改善をする。また
、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはそれらの断片を、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮ
Ａ）の、３’端または非翻訳領域へコードする配列の包含も意図され、さらにポリヌクレ
オチドを安定化させる。一般に、これらの修飾は、これらの無修飾である同等物と比較し
て、ポリヌクレオチドの安定性及び／または薬物動態的特性（例えば、半減期）を改善し
、そして例えば、ｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼ分解に対する当該ポリヌクレオチドの耐性
を改善するために行われる修飾も含む。
送達担体

本発明によると、ｍＲＮＡは、むき出しのＲＮＡ（パッケージされていない）として、ま
たは送達担体によって、ＣＮＳへ送達され得る。本明細書で用いる場合、「送達担体」、
「転写担体」、「ナノ粒子」、または文法的に等価である、用語は、区別なく用いられる
。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、単一の送達担体を介して送達され得る。いく
つかの実施形態において、ｍＲＮＡは、それぞれ異なる組成物である、一種または複数種
の送達担体を介して、送達され得る。種々の実施形態によると、好適な送達担体は、ポリ
エチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子及びリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含
有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然及び合成的に誘導されたエキソソーム、天
然、合成、及び半合成の層状体、ナノ微粒子、カルシウムケイ酸塩蛍光体ナノ粒子、リン
酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ粒子、ポ
リ（Ｄ－アルギニン）、ゾル－ゲル、ナノデンドリマー、デンプン系送達システム、ミセ
ル、エマルジョン、ニオソーム、マルチドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポ
リプロピルアクリル酸ポリマー、動的ポリ抱合体）、乾燥粉末製剤、プラスミド、ウイル
ス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド及び、そのほかのベクトルタ
グなどのポリマー系キャリアを含むが、限定されない。
リポソーム送達担体

いくつかの実施形態において、好適な送達担体は、例えば、脂質ナノ粒子などのリポソー
ム送達担体である。本明細書で用いる場合、脂質ナノ粒子などのリポソーム送達担体は、
通常、一種または複数種の２分子膜によって外側の培地から隔離された内側の水のある部
分を有する、極微の小胞として特徴づけられる。リポソームの２分子膜は、概して、空間
的に分離された、親水性及び疎水性の部位を含む、合成のまたは天然由来の脂質などの両
親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，
１６：３０７－３２１，１９９８）。概して、本発明において好適なリポソーム送達担体
（例えば、脂質ナノ粒子またはリポソーム）は、一種または複数種の異なる脂質及び／ま
たはポリマーを組み合わせることで、形成される。いくつかの実施形態において、リポソ
ーム送達担体（例えば脂質ナノ粒子または、リポソーム）は、一種または複数種の陽イオ
ン性脂質、一種または複数種の非陽イオン性／ヘルパー脂質、一種または複数種のコレス
テロール系脂質、及び／または一種または複数種のＰＥＧ化された脂質を含む。
陽イオン性脂質

いくつかの実施形態において、好適な送達担体は、陽イオン性脂質を含む。本明細書で用
いる場合、「陽イオン性脂質」という表現は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨに正味
の正電荷を有する、任意である多数の脂質種を指す。特に、滴定できる、またはｐＨ滴定
ができる陽イオン性脂質として知られる、一部の陽イオン性脂質は、ｍＲＮＡの送達に特
に有効である。種々の陽イオン性（例えば、滴定ができる）脂質が、文献に記載されてお
り、その多くは、市販されている。本発明の組成物及び方法で用いる、特に好適な陽イオ
ン性脂質は、ＷＯ２０１０／０５３５７２（そして特にＣＩ２－２００は、段落[００２
２５]に記載されている）、及びＷＯ２０１２／１７０９３０に記載されており、その両
方が、参照することにより、組み込まれる。いくつかの実施形態において、陽イオン性脂
質である、Ｎ－[ｌ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル]－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチ
ルアンモニウム塩化物、または「ＤＯＴＭＡ」が用いられる（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）、ＵＳ４，
８９７，３５５）。ＤＯＴＭＡは、単独で組み立てられるか、または中性脂質、ジオレオ
イルフォスファチジル－エタノールアミン、もしくは「ＤＯＰＥ」、または他の陽イオン
性もしくは非陽イオン性脂質をリポソーム転写担体もしくは脂質ナノ粒子へ結合され得る
、そして当該リポソームは、標的細胞への核酸の送達を向上させるために用いられ得る。
他の好適な陽イオン性脂質には、例えば、５－カルボキシスペリミルグリシンジオクタデ
シルアミド、または、「ＤＯＧＳ」、２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－[２（スペルミ
ン－カルボキシアミド）エチル]－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミニウム、または、
「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８６，６９８２（１９８９）及び、ＵＳ５，１７１，６７８、ＵＳ５，３３４，７６１）
、ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン、または「ＤＯＤＡＰ」
、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン、または「ＤＯＴＡＰ
」を含む。意図する陽イオン性脂質は、ｌ，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル
－３－アミノプロパン、もしくは「ＤＳＤＭＡ」、１，２－ジオレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ
－ジメチル－３－アミノプロパン、もしくは「ＤＯＤＭＡ」、１，２－ジリノレイルオキ
シ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン、もしくは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２－ジ
リノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン、もしくは「ＤＬｅｎＤＭＡ
」、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロライド、もしくは「ＤＯＤＡＣ
」、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド、もしくは「ＤＤＡ
Ｂ」、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－
ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、もしくは「ＤＭＲＩＥ」、３－ジメチルアミノ
－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，
シス，－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン、もしくは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２
－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ]－
３－ジメチルｌ－ｌ－（シス、シス－９’、ｌ－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン
、もしくは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレオイルオキシベン
ジルアミン、もしくは「ＤＭＯＢＡ」、１、２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－
ジメチルアミノプロパン、もしくは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３－ジリノレイルオキ
シ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン、もしくは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２－Ｎ、Ｎ’
－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン、もしくは「ＤＬｉｎｃａｒｂ
ＤＡＰ」、１，２－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン、もしくは「
ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３]－
ジオキソラン、もしくは「ＤＬｉｎ－－ＤＭＡ」、２，２－ジリノレイル－４－ジメチル
アミノエチル［１，３]－ジオキソラン、もしくは「ＤＬＩＮ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」
、及び２－（２，２－ジ（（９Ｚ、１２Ｚ）－オクタデカ－９、Ｌ２、ジエン－１－イル
）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ、Ｎ－ジメチルエタンアミン（ＤＬＩＮ－Ｋ
Ｃ２－ＤＭＡ））（ＷＯ２０１０／０４２８７７、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０）を参照のこと）、またはそ
れらの混合物も含む（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒ
ｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００
５）、ＰＣＴ Ｐｕｎｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１）。

いくつかの実施形態において、このような組成物中に存在する、一種または複数種の陽イ
オン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイ１－４－ジメチルアミノエチル１－[１，３]
－ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－
６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）、
ＡＬＮＹ－１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ
，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ[
ｄ][１，３]ジオキソール－５－アミン））、ＮＣ９８－５（４，７，１３－トリス（３
－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウデシル－４，７，
１０，１３－テトラアザヘキサデカン－１，１６－ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２－ジ
オレイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（ＷＯ２０１２／１７
０８８９、この教示は、その全体が明細書に参照として組み込まれる）、ＩＣＥ（ＷＯ２
０１１／０６８８１０、この教示は、その全体が明細書に参照として組み込まれる）から
選択される。

特定の実施形態においては、本発明の組成物及び方法は、２０１２年３月２９日に出願さ
れた、ＵＳ６１／６１７，４６８（本明細書に参照として組み込まれる）に記載されてい
る、イオン性陽イオン性脂質、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（
９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－ｙｌ）テトラコサ－１５，１８－
ジエン－１－アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－
（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５
，１８－トリエン－ｌ－アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－
ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－ｙｌ）テトラ
コサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００２）などを含む、脂質ナノ
粒子を用いる。

いくつかの実施形態において、提供されるリポソームは、ＷＯ２０１３０６３４６８及び
、本出願と同日同時に、アメリカで仮出願された「Ｌｉｐｉｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ
ｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ」で記載された陽イ
オン性脂質を含み、その両方が参照することにより組み込まれる。いくつかの実施形態に
おいて、陽イオン性脂質は、式Ｉ－ｃ１－ａの化合物を含み、

または、薬学的に受容可能なそれらの塩であり、式中、
各Ｒ^２は、独立に水素またはＣ_１－３のアルキル基であり、
各ｑは、独立に２～６であり、
各Ｒ’は、独立に水素またはＣ_１－３のアルキル基であり、
かつ各Ｒ^Ｌは独立にＣ_８－１２のアルキル基である。

いくつかの実施形態において、各Ｒ^２は、独立に、水素、メチル、またはエチルである。
いくつかの実施形態において、各Ｒ^２は、独立に水素またはメチルである。いくつかの実
施形態において、各Ｒ^２は水素である。

いくつかの実施形態において、各ｑは、独立に３～６である。いくつかの実施形態におい
て、各ｑは、独立に３～５である。いくつかの実施形態において、各ｑは４である。

いくつかの実施形態において、各Ｒ’は、独立に水素、メチル、またはエチルである。い
くつかの実施形態において、各Ｒ’は、独立に水素、またはメチルである。いくつかの実
施形態において、各Ｒ’は、独立に水素である。

いくつかの実施形態において、各Ｒ^Ｌは、独立にＣ_８－１２アルキルである。いくつかの
実施形態において、各Ｒ^Ｌは、独立にｎ－Ｃ_８－１２アルキルである。いくつかの実施形
態において、各Ｒ^Ｌは、独立にＣ_９－１１アルキルである。いくつかの実施形態において
、各Ｒ^Ｌは、独立にｎ－Ｃ_９－１１アルキルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ
^Ｌは、独立にＣ_１０アルキルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ^Ｌは、独立にｎ
－Ｃ_１０アルキルである。

いくつかの実施形態において、各Ｒ^２は、独立に水素、またはメチルであり、各ｑは独立
に３～５であり、各Ｒ’は、独立に水素またはメチルであり、かつ各Ｒ^Ｌは、独立にＣ_{８
－１２}アルキルである。

いくつかの実施形態において、各Ｒ^２は、水素であり、各ｑは独立に３～５であり、各Ｒ
’は、水素であり、かつ各Ｒ^Ｌは、独立にＣ_８－１２アルキルである。

いくつかの実施形態において、各Ｒ^２は、水素であり、各ｑは４であり、各Ｒ’は、水素
であり、かつ各Ｒ^Ｌは、独立にＣ_８－１２アルキルである。

いくつかの実施形態において、陽イオン性脂質は、式Ｉ－ｇの化合物を含み、

または、それらの薬学的に受容可能な塩であり、式中各Ｒ^Ｌは独立にＣ_８－１２アルキ
ルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ^Ｌは、独立にｎ－Ｃ_８－１２アルキルであ
る。いくつかの実施形態において、各Ｒ^Ｌは、独立にＣ_９－１１アルキルである。いくつ
かの実施形態において、各Ｒ^Ｌは、独立にｎ－Ｃ_９－１１アルキルである。いくつかの実
施形態において、各Ｒ^Ｌは、独立にＣ_１０アルキルである。いくつかの実施形態において
、各Ｒ^Ｌは、独立にｎ－Ｃ_１０アルキルである。

特定の実施形態において、提供されるリポソームは、陽イオン性脂質ｃＫＫ－Ｅ１２、ま
たは（３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジ
ン－２，５－ジオン）を含む。ｃＫＫ－Ｅ１２の構造を以下に示す。

いくつかの実施形態において、本発明における好適な脂質ナノ粒子は、次に述べる陽イオ
ン性脂質のうち、少なくとも１つを含む： Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ
、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｒｅ－１、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ＸＴ
Ｃ、ＤＳＰＣ、ＭＣ３、ＨＧＴ５０００、またはＨＧＴ５００１。

いくつかの実施形態において、リポソーム内の陽イオン性脂質の割合は、モル比で、約１
０％より大きくても、約２０％より大きくても、約３０％より大きくても、約４０％より
大きくても、約５０％より大きくても、約６０％より大きくても、または約７０％より大
きくても、よい。いくつかの実施形態において、陽イオン性脂質は、モル比で、リポソー
ムの、約３０～５０％（例えば、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約
３５～４５％または、約３５～４０％）を構成する。いくつかの実施形態において、陽イ
オン性脂質は、モル比で、リポソームの、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、ま
たは約５０％を構成する。
非陽イオン性／ヘルパー脂質

いくつかの実施形態において、提供されるリポソームは、一種または複数種の非陽イオン
性（ヘルパー）脂質を含む。本明細書で用いる場合、「非陽イオン性脂質」という表現は
、任意の中性、双性イオン、または陰イオン性脂質を指す。本明細書で用いる場合、「陰
イオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたＨに正味の負電荷を輸送する、任意で
ある多数の脂質種を指す。いくつかの実施形態において、非陽イオン性脂質は、中性脂質
であり、すなわち、当該組成物が組み立てられたり、及び／または投与されたりする条件
下で、正味の電荷を運ばない脂質である。非陽イオン性脂質は、ジステアロイルホスファ
チジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミ
トイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（
ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコ
リン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰ
Ｅ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－
シクロヘキサン－ｌ－カルボキシラート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰ
Ｅ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モ
ノメチルポリエチレン、１６－Ｏ－ジメチルポリエチレン、１８－１－トランスポリエチ
レン、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ
）、またはそれらの混合物を含むが、限定されない。

いくつかの実施形態において、好適な非陽イオン性（ヘルパー）脂質は、一種または複数
種のホスファチジル脂質、例えばホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセ
ロール，ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルエタノール
アミン）を含む。

いくつかの実施形態において、好適な非陽イオン性（ヘルパー）脂質は、一種または複数
種のスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブ
ロシド、及びガングリオシドを含む。

いくつかの実施形態において、非陽イオン性（ヘルパー）脂質は、モル比で、リポソーム
中に存在する全脂質の約５％～約９０％（例えば、約１０～８０％、１０～７０％、１０
～６０％、１０～５０％、１０～４０％、１０～３０％、または１０～２０％）を構成し
うる。いくつかの実施形態において、リポソーム中の非陽イオン性（ヘルパー）脂質の割
合は、モル比で、約５％より大きくても、約１０％より大きくても、約１５％より大きく
ても、約２０％より大きくても、約２５％より大きくても、約３０％より大きくても、約
３５％より大きくても、または約４０％より大きくてもよい。
コレステロール系脂質

いくつかの実施形態において、提供されるリポソームは、一種または複数種のコレステロ
ール系脂質を含む。例えば、好適なコレステロール系陽イオン性脂質は、例えば、コレス
テロール、ＰＥＧ化されたコレステロール、ＤＣ－ＣＨＯｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エ
チルカルボキサミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピ
ル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆｅｔａｌ．Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
２３，１３９（１９９７）、ＵＳ５，７４４，３３５）、またはＩＣＥを含む。いくつか
の実施形態において、コレステロール系脂質は、モル比で、リポソーム中に存在する全脂
質に対して、約２％～約３０％、または約５％～２０％を構成し得る。いくつかの実施形
態において、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質の割合は、モル比で５％より多くて
も、１０％より多くても、２０％より多くても、３０％より多くても、または４０％より
多くてもよい。
ＰＥＧ化された脂質

いくつかの実施形態において、提供される脂質ナノ粒子は、一種または複数種のＰＥＧ化
された脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質及び、Ｎ－
オクタノイル－スフィンゴシン－ｌ－[サクシニル（メトキシポリエチレングリコール）
－２０００]（Ｃ８ＰＥＧ－２０００セラミド）を含む、誘導体化されたセラミド（ＰＥ
Ｇ－ＣＥＲ）などの誘導体化された脂質の使用は、一種または複数種の陽イオン性脂質、
及びいくつかの実施形態においては、他の脂質と混合物により本発明によって意図される
。いくつかの実施形態において、好適なＰＥＧ化された脂質は、短いアシル鎖（例えば、
Ｃ_１４またはＣ_１８）を有する、ＰＥＧ－セラミドを含む。いくつかの実施形態において
、ＰＥＧ化された脂質ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－マレイミド－レクチンが、用いられ得る。他の
意図される、ＰＥＧ－修飾脂質は、Ｃ_６～Ｃ_２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合を
した、５ｋＤａ以上の長さのポリエチレングリコール鎖を含むが、限定されない。特定の
理論に縛られることを望むものではないが、これは、ＰＥＧ化された脂質の付加が、複雑
な凝集を防ぎ、そして標的細胞へｍＲＮＡを封入したリポソームの送達を促進して、循環
寿命を増加しえることが意図される。

いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－修飾リン脂質及び／または、誘導体化された脂質
は、モル比で、リポソーム中に存在する全脂質に対して、約０％～約２０％、約０％～約
１５％、約０％～約１０％、約１％～約１０％、約１％～約８％、約１％～約６％、約１
％～約５％、約２％～約１０％、約４％～約１０％より構成し得る。いくつかの実施形態
において、ＰＥＧ－修飾リン脂質及び／または、誘導体化された脂質の割合は、モル比で
、リポソーム中に存在する全脂質に対して、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約
８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％以下であり得る
。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－修飾リン脂質及び／または、誘導体化された脂
質の割合は、モル比で、リポソーム中に存在する全脂質に対して、約１％、約２％、約３
％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、または、
約２０％以上であり得る。
ポリマー

いくつかの実施形態において、好適な送達担体は、担体としてポリマーを用いて、単独で
、または本明細書に記載されている種々の脂質を含む、他の担体と組み合わせることで、
組み立てられる。従って、いくつかの実施形態において、リポソーム送達担体は、本明細
書で用いられる場合、ナノ粒子を含むポリマーも包含する。好適なポリマーは、例えば、
ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポ
リグリコリド共重合体、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、ア
ルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタ
ミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化されたＰＬＬ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み得る。Ｐ
ＥＩが存在する場合、それは、１０～４０ｋＤａの範囲の分子量である、直鎖または分枝
ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａ分枝ＰＥＩ（シグマ社４０８７２７番）であってもよい。

種々の実施形態において、好適な送達担体（例えば、脂質ナノ粒子）は、本明細書に記載
されている、一種または複数種の脂質及び／またはポリマー構成要素を組み合わせる事で
、調製される。例えば、脂質ナノ粒子は、Ｃ１２－２００、スフィンゴミエリン、ＤＯＰ
Ｅ、コレステロール、及びＤＭＧＰＥＧ；またはＣ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロ
ール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及
びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはｃＫＫ－Ｅ１２、スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレス
テロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール
、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤ
ＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ
－ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；また
はＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＤＯＤＭＡ、
スフィンゴミエリン、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＲｅ
－１、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはｃＫＫ－ＥＥ１２、ＤＯ
ＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ及び／またはＤＳＰＥ－ＰＥＧ－マイレミド
－レクチンの混合物で調製され得る。

種々の実施形態において、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、コレステロール、及び／
またはＰＥＧ－修飾脂質は、種々な相対的なモル比で、組み合わされ得る。例えば、陽イ
オン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００など）の、非陽イオン性脂質（例
えば、ＤＯＰＥ、スフィンゴミエリンなど）と、コレステロール系脂質（例えば、コレス
テロール）と、ＰＥＧ化された脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）とに対する割合は、
それぞれ約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５の間であってもよい。いくつ
かの実施形態において、陽イオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００など
）の、非陽イオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ、スフィンゴミエリンなど）と、コレステロ
ール系脂質（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ化された脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥ
Ｇ２Ｋ）とに対する割合は、それぞれおよそ４０：３０：２０：１０である。いくつかの
実施形態において、陽イオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００など）の
、非陽イオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ、スフィンゴミエリンなど）と、コレステロール
系脂質（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ化された脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２
Ｋ）とに対する割合は、それぞれおよそ４０：３０：２５：５である。いくつかの実施形
態において、陽イオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００など）の、非陽
イオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ、スフィンゴミエリンなど）と、コレステロール系脂質
（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ化された脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）と
に対する割合は、それぞれおよそ４０：３２：２５：３である。いくつかの実施形態にお
いて、陽イオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００など）の、非陽イオン
性脂質（例えば、ＤＯＰＥ、スフィンゴミエリンなど）と、コレステロール系脂質（例え
ば、コレステロール）と、ＰＥＧ化された脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）とに対す
る割合は、それぞれおよそ５０：２５：２０：５である。
脂質ナノ粒子の調製

本発明で用いる、脂質ナノ粒子などの送達担体は、現在当技術分野で周知の種々の技術を
用いて調製され得る。多重層リポソーム（ＭＬＶ）は、従来技術によって調製され得る。
例えば、適切な溶媒で脂質を溶解させて、好適なコンテナまたは容器の内壁に選択した脂
質を沈着させた後、当該溶媒を蒸発させるか、または、噴霧乾燥させることで、容器の内
側に薄膜を残存させる。それから、水相をボルテックスしたまま当該容器に加えて、ＭＬ
Ｖを形成する。次いで、単層リポソーム（ＵＬＶ）は、多重層リポソームの、均質化、超
音波処理、または押し出し成形によって形成され得る。さらに、単層リポソームは、洗剤
除去技術によって形成され得る。

この発明の特定の実施形態において、本発明の組成物は、転写担体を含み、そこにおいて
ｍＲＮＡは、転写担体の両表面に関連し、同じ転写担体の中で封入される。例えば、本発
明の組成物の調製をする間に、陽イオン性脂質は、静電相互作用を介してｍＲＮＡと関連
され得る。

リポソームの２分子膜は、両親媒性ポリマー及び表面活性物質（例えば、ポリマーソーム
、ニオソーム、など）によっても形成され得る。リポソームへの、所望のｍＲＮＡの結合
工程は、しばしば「ローディング」という。典型的な方法は、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ ａｌ．
，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５－２５８，１９９２で記載されており、ここに
参照することにより組み込まれる。リポソームが組み込まれた核酸は、リポソームの２分
子膜内のリポソーム内部空間に、完全にまたは部分的に位置してもよく、またはリポソー
ム膜の外部表面と結合してもよい。リポソームへの核酸の取り込みは、ここでは、「封入
」ともいい、そこにおいて、核酸はリポソームの内部空間内に完全に含まれている。リポ
ソームなどの転写担体へｍＲＮＡを取り込む目的は、核酸及び／もしくは系、または、核
酸の速い分泌を引き起こすレセプターを劣化させるような酵素もしくは化学物質を含む環
境から、しばしば核酸を守るためである。従って、いくつかの実施形態において、好適な
送達担体は、そこに含まれるｍＲＮＡの安定性を向上することができ、及び／または、標
的ＣＮＳ細胞もしくは生物組織へのｍＲＮＡ送達を促進する。

本発明による好適なリポソーム送達担体は、種々の大きさで作成されてもよい。いくつか
の実施形態において、リポソームの大きさは、リポソーム粒子の最も大きい直径の長さで
決める。いくつかの実施形態において、好適なリポソーム送達担体は、約２５０ｎｍ以下
（例えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎ
ｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、または４０ｎｍ以下）の大き
さを有する。いくつかの実施形態において、好適なリポソーム送達担体は、約４０～１０
０ｎｍ（例えば、約４０～９０ｎｍ、約４０～８０ｎｍ、約４０～７０ｎｍ、約４０～６
０ｎｍ、約４０～５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約５０～９０ｎｍ、約５０～８０ｎｍ
、約５０～７０ｎｍ、約５０～６０ｎｍ、約６０～１００ｎｍ、約６０～９０ｎｍ、約６
０～８０ｎｍ、約６０～７０ｎｍ、約７０～１００ｎｍ、約７０～９０ｎｍ、約７０～８
０ｎｍ、約８０～１００ｎｍ、約８０～９０ｎｍ、または約９０～１００ｎｍの範囲）の
範囲の大きさを有する。

当技術分野において既知である種々の方法が、リポソーム転写担体の集合のサイジングに
利用できる。そのようなサイジング方法の１つが、ＵＳ４，７３７，３２３に記載されて
おり、ここに参照することにより組み込まれる。槽またはプローブのどちらかの超音波処
理によって、リポソーム懸濁液を超音波処理することで、所望の小さいＵＬＶに至るまで
、大きさの減少を進行して、生成することができる。均質化は、大きいリポソームを小さ
い物へ断片化するためのせん断エネルギーに頼る、別の方法である。典型的な均質化の手
順では、ＭＬＶが選択したリポソームの大きさになるまで、標準的なエマルションホモジ
ナイザーで、再循環される。リポソーム担体の大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１－１５０（１９８１）に記載
されているように、準弾性光散乱法（ＱＥＬＳ）で決定することができ、ここに参照する
ことにより組み込まれる。標準的なリポソームの直径は、形成したリポソームを超音波処
理することで、減らすことができる。効率的なリポソーム合成へ導くために、断続的な超
音波処理サイクルを、ＱＥＬＳ評価と交互に行っても良い。
ＣＮＳ送達

本明細書に記載されているように、ｍＲＮＡまたは、送達担体を含むｍＲＮＡ（例えばｍ
ＲＮＡがロードされた脂質ナノ粒子）は、ＣＮＳ送達に好適である。いくつかの実施形態
において、ｍＲＮＡがロードされた脂質ナノ粒子は、実質内、脳内、脳室内大脳（ＩＣＶ
）、髄腔内（例えば、ＩＴ－腰椎、ＩＴ－大槽）投与、及びＣＮＳ及び／またはＣＳＦへ
直接もしくは間接注射する任意の他の技術及び経路を含む、種々の技術及び経路によって
、ＣＮＳへ送達され得るが、これらに限定されない。
髄腔内送達

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡがロードされた脂質ナノ粒子は、治療の必要な検
体の脳脊髄液（ＣＳＦ）へ注射されることでＣＮＳへ送達される。いくつかの実施形態に
おいて、脊髄内投与は、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡがロードされたナノ粒子をＣＳＦへ注
射するために用いられる。本明細書で用いる場合、脊髄内投与（脊髄内注射ともいう）は
、脊柱管（脊髄を取り囲む髄腔内空隙）への注射を指す。穿頭孔、大槽、または腰椎穿刺
などを通した、外側脳室注射を含む種々の技法が用いられてもよいが、これらに限定され
ない。典型的な方法が、Ｌａｚｏｒｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄ
ｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１４３－１９２、及びＯｍａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１：１６９－１７９に記載されており、これらの
内容が、参照することにより組み込まれる。

本発明によると、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡがロードされたナノ粒子は、脊柱管を取り囲む
任意の領域へ注入され得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡが
ロードされたナノ粒子は、腰部領域、もしくは大槽へ注射されるか、または脳室空間に脳
室内注射される。本明細書で用いる場合、「腰部領域」または「腰椎域」という用語は、
第三及び第四腰椎（背中下部）の間の区域、さらに包括的には、脊椎のＬ２～Ｓ１領域を
指す。概して、腰部領域または腰椎域を介した髄腔内注射は、「腰椎ＩＴ送達」または「
腰椎ＩＴ投与」ともいう。「大槽」という用語は、頭蓋骨と脊椎上部との間の開口部を通
した、小脳の周囲及び下の空隙を指す。概して、大槽を介した髄腔内注射は、「大槽送達
」ともいう。「脳室」という用語は、脊髄の中心管と連続した脳内の腔を指す。概して、
脳室腔を介した注射を、脳室内（ＩＣＶ）送達という。

いくつかの実施形態では、本発明による「髄腔内投与」または「髄腔内送達」は、例えば
、第三及び第四腰椎（背中下部）間、さらに包括的には、脊椎のＬ２～Ｓ１領域に送達さ
れる腰椎ＩＴ投与または送達を指す。

いくつかの実施形態において、脊髄内投与は、腰椎穿刺（すなわち緩徐ボーラス）かポー
ト・カテーテル送達系（すなわち、注入または、ボーラス）のどちらかで行われ得る。い
くつかの実施形態において、カテーテルは腰椎の薄板間に挿入され、先端は、包膜空隙に
所望のレベル（一般的にＬ３～Ｌ４）に突き通される。
投与

本発明は、本明細書中に記載されるｍＲＮＡまたはｍＲＮＡがロードされたナノ粒子の治
療的有効量の単回ならびに多数回投与を意図する。ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡがロードされ
たナノ粒子は、検体のＣＮＳ疾患または状態の、性質、重症度及び程度によって、一定間
隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡがロードされたナ
ノ粒子の治療的有効量は、一定間隔で（例えば、年１回、６カ月に１回、５カ月に１回、
３カ月に１回、隔月（２カ月に１回）、毎月（１カ月に１回）、隔週（２週間に１回）、
毎週、毎日または連続的に）、定期的に髄腔内投与され得る。

いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患は、周辺症状に関連する。従って、いくつかの
実施形態において、脊髄内投与は、他の投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腸管
外、経皮的、または経粘膜的（例えば、経口的または経鼻的に）に）と共同で用いられ得
る。

本明細書で用いる場合、「治療的有効量」という用語は、主として、本発明の薬学的組成
物中に含有されるｍＲＮＡの総量に基づいて確定される。一般に、治療的有効量は、検体
に対して意義のある利益（例えば、根元的疾患または症状を治療し、調整し、治癒し、予
防し、及び／または寛解させること）を達成するのに十分である。例えば、治療的有効量
は、所望の治療的及び／または予防的作用を達成するのに十分な量であり得る。一般に、
それらを必要とする検体に投与されるｍＲＮＡの量は、検体の特徴に依存するであろう。
このような特徴には、検体の症状、疾患の重症度、全身の健康状態、年齢、性別及び体重
が含まれる。当業者は、これらとその他の関連因子によって、適切な投与量を容易に決定
し得る。さらに、最適な投与量範囲を決めるために、客観的及び主観的試験が任意に用い
られ得る。

いくつかの実施形態において、治療的有効量は体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～１０
ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．００５ｍｇ～約１０ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０
．０１ｍｇ～約１０ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～９ｍｇまで、体重１ｋ
ｇ当たり約０．０１ｍｇ～約８ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約７ｍｇま
で、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約６ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ
～約５ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約４ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約
０．０１ｍｇ～約３ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約２ｍｇまで、体重１
ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約１ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約０．５
ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ～約１０ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．１
ｍｇ～約５ｍｇまで、体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ～約１０ｍｇまで、または体重１ｋ
ｇ当たり約０．５ｍｇ～約５ｍｇの範囲である。

いくつかの実施形態において、治療的有効量は、脳重量１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～
１００ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～９０ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当
たり約０．００１ｍｇ～８０ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～７０ｍｇ
まで、脳重量１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～６０ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当たり約０．
００１ｍｇ～５０ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～４０ｍｇまで、脳重
量１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～３０ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ
～２０ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～１０ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当
たり約０．００１ｍｇ～５ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～１ｍｇまで
、脳重量１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～１００ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当たり約０．０５
ｍｇ～１００ｍｇまで、脳重量１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ～１００ｍｇまで、または脳重
量１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ～１００ｍｇまで、の範囲である。

脳重量及び体重は相関し得ることは、当業者は理解し得るだろう（Ｄｅｋａｂａｎ Ａ
Ｓ．“Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓ
ｐａｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｆｅ： ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｗｅｉ
ｇｈｔｓ ｔｏ ｂｏｄｙ ｈｅｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔｓ，”Ａ
ｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ １９７８； ４：３４５－５６）。従って、いくつかの実施形態に
おいて、投与量は、表５に示されるように換算され得る。

脳内及び／または脊髄中のニューロン及び他の細胞型への送達

本発明による本方法が、脳内及び／または脊髄中の種々のニューロン及び他の細胞型内で
、ｍＲＮＡの送達をもたらす。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質をコード
するｍＲＮＡは、ニューロン、神経膠細胞、血管周囲の細胞、及び／または髄膜の細胞を
含むが、これに限定されない脳内の種々の細胞へ送達される。特に、本発明による本方法
は、ＣＮＳ疾患及び／または欠陥に影響を受ける種々のニューロン及びその他の細胞型内
、または、ＣＮＳ疾患に関連する欠損したタンパク質が、通常発現される種々のニューロ
ン及び他の細胞型内でｍＲＮＡの送達をもたらす。いくつかの実施形態において、本発明
による本方法は、例えばリソソーム蓄積症を患っているか、または影響を受けやすい患者
が生物組織の細胞のリソソーム中に蓄えている、検知可能もしくは異常に多い量の酵素基
質が存在するＣＮＳ内の種々のニューロン及び他の細胞型においてｍＲＮＡ送達をもたら
すものである。いくつかの実施形態において、本発明による本方法は疾患に関連する病理
、症状または特徴を示すような種々のニューロン及びその他の細胞型で、ｍＲＮＡの送達
をもたらす。例えばｍＲＮＡは、精神変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソ
ン病、及びハンチントン病）に関連するそれらのニューロンもしくは非神経細胞、または
運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬ
Ｓ）、偽性球麻痺、遺伝性痙性対麻痺、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢ
Ｐ）、遠位遺伝性運動ニューロパチー、及び脊髄性筋萎縮症）と関連のある運動ニューロ
ン、などのアポトーシスを悪化させたり、退化させたり、経たりするニューロンまたはそ
の他の細胞型へ送達され得る。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは脳内に位置しているニューロン及び／または非
ニューロン細胞へ送達される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは脊髄内に位置し
ているニューロン及び／または非ニューロン細胞へ送達される。いくつかの実施形態にお
いて、ｍＲＮＡは、運動ニューロンへ送達される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮ
Ａは、上位運動ニューロン及び／または下位運動ニューロンへ送達される。いくつかの実
施形態において、運動ニューロンは、脊髄の脊髄前角及び／または背根神経節の中に位置
している。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは脳内及び／または脊髄中の、種々のニューロン
及び他の細胞型内で、細胞内に送達される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡはニ
ューロンの軸索に送達される。いくつかの実施形態において、本発明によるｍＲＮＡ送達
は、ニューロンのサイトゾルの中で、ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の細胞内
発現をもたらす。いくつかの実施形態において、本発明によるｍＲＮＡ送達は、ニューロ
ンの細胞内コンパートメント、例えばリソソーム、ミトコンドリア、膜内外、などの中の
ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の、細胞内発現をもたらす。いくつかの実施形
態において、本発明によるｍＲＮＡ送達は、ｍＲＮＡ及びニューロンにコードされたタン
パク質の細胞内発現及びニューロンから細胞外への分泌をもたらす。

脳内及び／または脊髄中の、さらに例示的なニューロン及びその他の細胞型は、以下に例
示される。
脳

概して、本発明による本方法は、脳の種々の領域におけるニューロン及びその他の細胞型
へ、ｍＲＮＡ及びコードされたタンパク質を送達するために用いられ得る。概して、脳は
、別々の領域、層、及び生物細胞に分けられ得る。例えば、髄膜の生物組織は、脳を含む
中枢神経系を包囲する膜系である。髄膜は、硬膜、クモ膜、及び軟膜を含む３つの層を含
有する。概して、髄膜及び脳脊髄液の第１機能は、中枢神経系を保護することである。い
くつかの実施形態において、ｍＲＮＡ及びコードされたタンパク質は、髄膜の一種または
複数種の層内のニューロンまたは非神経細胞へ送達される。

脳は、大脳、小脳、及び脳幹を含む、３つの区分を有する。大部分の他の脳構造の上に位
置している、大脳半球は、皮質で覆われている。大脳の下には脳幹が横たわり、この脳幹
は茎に似ており、その上に大脳が取り付けられている。脳の後部、大脳の下及び脳幹の背
後には、小脳がある。

脳の正中線近く及び中脳の上に位置している間脳は、視床、視床後部、視床下部、視床上
部、腹側視床及び視蓋腹部を含有する。中脳（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）は、中脳（
ｍｉｄｂｒａｉｎ）とも呼ばれ、視蓋、被蓋、中脳水道、及び、大脳脚、赤核及び第３脳
神経核を含有する。中脳は、視覚、聴覚、運動制御、睡眠／覚醒、警戒及び温度調節に関
連する。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ及びコードされたタンパク質は、小脳の一種また
は複数種の生物組織内のニューロン及び／または非神経細胞へ送達される。特定の実施形
態においては、標的である小脳の一種または複数種の生物組織が、分子層の生物組織、プ
ルキニエ細胞層の生物組織、顆粒細胞層の生物組織、小脳脚、及びそれらの組合せから成
る群から選択される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ及びコードされたタンパク
質は、プルキニエ細胞層の生物組織、顆粒細胞層の生物組織、深部小脳白質の生物組織（
例えば、顆粒細胞層に対して深部）、及び深部小脳核の生物組織を含むが、それらに限定
されない小脳の一種または複数種の深部組織へ送達される。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ及びコードされたタンパク質は、脳幹の一種また
は複数種の生物組織に送達される。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ及びコードされたタンパク質は、灰白質、白質、
脳室周囲域、軟膜－くも膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状核
／被殻領域、中脳、脳橋または延髄の深部領域、及びそれらの組合せを含むが、これらに
限定されない、種々の脳組織へ送達される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ及び
コードされたタンパク質は、深部白質のオリゴデンドロサイトへ送達される。
脊髄

いくつかの実施形態において、本発明による本方法は、脊髄の種々の領域におけるニュー
ロン及びその他の細胞型へ、ｍＲＮＡ、及びコードされたタンパク質を送達するために用
いられ得る。概して、脊髄の領域または生物組織は、その生物組織の深さに基づいて、特
徴づけることができる。例えば、脊髄組織は、表面または浅在組織、中深部組織、及び／
または深部組織として特徴づけることができる。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ及びコードされたタンパク質は、脊髄の一種また
は複数種の表面または浅在組織に送達される。いくつかの実施形態において、脊髄の標的
表面または浅在組織は、軟膜及び／または白質路を含有する。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ及びコードされたタンパク質は、脊髄の一種また
は複数種の深部組織に送達される。いくつかの実施形態において、脊髄の標的深部組織は
、脊髄灰白質及び／または上衣細胞を含有する。

本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。しか
しながら、それらは本発明の範囲を限定するよう意図されるべきでない。全ての文献引用
が、参照によって組み込まれる。

実施例１
製剤及びメッセンジャーＲＮＡ物質
本実施例は、ＣＮＳにおけるｍＲＮＡの効果的な送達及び発現のための典型的なリソソー
ム製剤を提供する。概して、本明細書に記載されている製剤は、種々の核酸系物質を被包
するように設計された、一種または複数種の陽イオン性脂質、中性脂質、コレステロール
及び／またはＰＥＧ化された脂質の使用比率を変えた、多成分性脂質混合物を含有する。
メッセンジャーＲＮＡ物質

コドン最適化ヒト生存運動ニューロン－１（ｈＳＭＮ－１）メッセンジャーＲＮＡは、遺
伝子をコードしたプラスミドＤＮＡテンプレートからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成
され、続いて、５’キャップ構造（キャップ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ， Ｐ．； Ｂｒｏｗ
ｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５，８６，１２３９－１２４９）、及び、ゲル電気泳動で
決定した長さが約２５０ヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールを付加した。各ｍＲＮＡ生
成物に存在する５’及び３’非翻訳領域は、Ｘ及びＹでそれぞれ表され、述べる通りに定
義される。
生存運動ニューロン（ｈＳＭＮ－１）ｍＲＮＡ
Ｘ－配列番号３－Ｙ
５’及び３’ＵＴＲ配列
Ｘ（５’ＵＴＲ配列）＝
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣ
ＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣ
ＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧ
ＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ（配列番号７）
Ｙ（３’ＵＴＲ配列）＝
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵ
ＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣ
ＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ（配列番号８）
または
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧ
ＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣ
ＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ（配列番号９）

例えば、コドン最適化ヒト生存運動ニューロン－１（ｈＳＭＮ－１）メッセンジャーＲＮ
Ａは、以下を含み、
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣ
ＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣ
ＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧ
ＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧＡＵＧＧＣＣＡＵＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧ
ＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＵＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＵＧＣＵ
ＧＵＵＣＡＧＧＡＧＡＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＧＡＵＧＡＣＡＧＣＧＡＵＡＵＣ
ＵＧＧＧＡＣＧＡＵＡＣＣＧＣＵＣＵＧＡＵＣＡＡＧＧＣＣＵＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧ
ＵＧＧＣＣＡＧＣＵＵＣＡＡＧＣＡＣＧＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＡＵＣＵＧ
ＣＧＡＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧ
ＣＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＧ
ＣＣＡＧＣＣＵＧＣＡＧＣＡＧＵＧＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＧＡＣＡＡＧＵＧＣＡＧＣＧＣ
ＣＡＵＣＵＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＵＧＣＡＵＣＵＡＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＣ
ＧＣＣＡＧＣＡＵＣＧＡＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＵＧＣＧＵＧＧＵＣＧＵＧＵ
ＡＣＡＣＣＧＧＣＵＡＣＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＵＧＡＧＣＧＡ
ＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＣＣＣＡＵＵＵＧＵＧＡＧＧＵＧＧＣＣＡＡＵＡＡＣＡＵＣＧＡＡ
ＣＡＧＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＵＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＵＧＡＧＣＡ
ＣＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＵＣＵＣＣＵＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧ
ＣＧＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＣＣＵＡＡＧＵＣＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＡＡＣＡＧＣＵＵＣ
ＣＵＧＣＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＡＣＣＣＡＵＧＣＣＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＵＧＧＧＡＣ
ＣＣＧＧＡＡＡＡＣＣＵＧＧＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＡＣＧＧＡＣＣＡＣＣＵＣＣＣＣＣ
ＵＣＣＡＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＣＡＣＣＵＣＡＵＣＵＣＣＵＧＡＧＣＵＧＣＵＧＧＣＵＧ
ＣＣＡＣＣＣＵＵＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＣＣＣＵＡＵＣＡＵＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣ
ＣＵＣＣＣＡＵＣＵＧＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＣＵＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＡＵＧＣＣＣＵ
ＧＧＧＣＡＧＣＡＵＧＣＵＧＡＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＵＧＡＧＣＧＧＣＵＡＣＣＡＣ
ＡＣＡＧＧＡＵＡＣＵＡＣＡＵＧＧＧＣＵＵＣＡＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧ
ＧＣＡＧＡＵＧＣＵＣＣＣＡＣＵＣＣＣＵＧＡＡＣＵＧＡＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵ
ＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣ
ＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵ
ＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ（配列番号１０）
または、コドン最適化ヒト生存運動ニューロン－１（ｈＳＭＮ－１）メッセンジャーＲ
ＮＡは、
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣ
ＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣ
ＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧ
ＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧＡＵＧＧＣＣＡＵＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧ
ＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＵＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＵＧＣＵ
ＧＵＵＣＡＧＧＡＧＡＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＧＡＵＧＡＣＡＧＣＧＡＵＡＵＣ
ＵＧＧＧＡＣＧＡＵＡＣＣＧＣＵＣＵＧＡＵＣＡＡＧＧＣＣＵＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧ
ＵＧＧＣＣＡＧＣＵＵＣＡＡＧＣＡＣＧＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＡＵＣＵＧ
ＣＧＡＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧ
ＣＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＧ
ＣＣＡＧＣＣＵＧＣＡＧＣＡＧＵＧＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＧＡＣＡＡＧＵＧＣＡＧＣＧＣ
ＣＡＵＣＵＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＵＧＣＡＵＣＵＡＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＣ
ＧＣＣＡＧＣＡＵＣＧＡＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＵＧＣＧＵＧＧＵＣＧＵＧＵ
ＡＣＡＣＣＧＧＣＵＡＣＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＵＧＡＧＣＧＡ
ＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＣＣＣＡＵＵＵＧＵＧＡＧＧＵＧＧＣＣＡＡＵＡＡＣＡＵＣＧＡＡ
ＣＡＧＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＵＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＵＧＡＧＣＡ
ＣＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＵＣＵＣＣＵＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧ
ＣＧＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＣＣＵＡＡＧＵＣＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＡＡＣＡＧＣＵＵＣ
ＣＵＧＣＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＡＣＣＣＡＵＧＣＣＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＵＧＧＧＡＣ
ＣＣＧＧＡＡＡＡＣＣＵＧＧＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＡＣＧＧＡＣＣＡＣＣＵＣＣＣＣＣ
ＵＣＣＡＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＣＡＣＣＵＣＡＵＣＵＣＣＵＧＡＧＣＵＧＣＵＧＧＣＵＧ
ＣＣＡＣＣＣＵＵＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＣＣＣＵＡＵＣＡＵＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣ
ＣＵＣＣＣＡＵＣＵＧＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＣＵＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＡＵＧＣＣＣＵ
ＧＧＧＣＡＧＣＡＵＧＣＵＧＡＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＵＧＡＧＣＧＧＣＵＡＣＣＡＣ
ＡＣＡＧＧＡＵＡＣＵＡＣＡＵＧＧＧＣＵＵＣＡＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧ
ＧＣＡＧＡＵＧＣＵＣＣＣＡＣＵＣＣＣＵＧＡＡＣＵＧＡＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧ
ＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣ
ＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵ
ＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ（配列番号１１）を含む。
典型的な製造手順

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、標準的なエタノール注入法によって形成される（Ｐｏｎｓａ
，Ｍ．；Ｆｏｒａｄａｄａ，Ｍ．；Ｅｓｔｅｌｒｉｃｈ，Ｊ．“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｏ
ｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ”
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１９９３，９５，５１－５６）。種々の脂質構成成分に対して
、５０ｍｇ／ｍｌのエタノール原液を調製して、そして－２０℃で保管した。下の表５に
載せた各典型的な製剤の調製において、示した脂質構成成分をエタノール溶液へ加え、所
定の終濃度及びモル比を達成して３ｍｌのエタノール最終量を調製した。別々に、ｈＳＭ
Ｎ－１ ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５
）を、１ｍｇ／ｍｌ原液から調製した。脂質溶液を、手作業かシリンジ・ポンプどちらか
で、迅速に水性ｍＲＮＡ溶液へ注入し、そして振り混ぜることで最終の２０％エタノール
懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を、ろ過して、１倍のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対
して透析して、濃縮して、そして２～８℃の間で保管した。ＳＭＮ－１ ｍＲＮＡ濃縮液
をＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）分析で測定した。ｍＲＮ
Ａの封入では、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ１００の存在の有無についてＲ
ｉｂｏｇｒｅｅｎ分析を実施することで、判断した。粒子の大きさ（動的光錯乱法（ＤＬ
Ｓ））及びゼータ電位は、１倍ＰＢＳ及び１ｍＭ ＫＣｌ溶液のそれぞれで、マルバーン
のゼータサイザー装置を用いて、決定した。

実施例２
ｍＲＮＡがロードされたリポソームナノ粒子の脊髄内投与

本実施例は、ｍＲＮＡがロードされたリポソームナノ粒子を髄腔内投与する典型的な方法
、及びニューロン内へ送達されたｍＲＮＡを分析する方法を示す。

全ての研究は、各実験の開始時に、約６～８週齢であるラットかマウスどちらかで実施し
た。実験の開始時に、各動物を吸入によりイソフルランで（１～３％で影響）麻酔をした
。一度麻酔をすると、各動物は、的確な注射部位（Ｌ４～Ｌ５、またはＬ５～Ｌ６）の体
毛をそり落とした。注射針の挿入に続き、反射的な尾のフリックを、硬膜への穿刺を示す
ため、そして髄腔内の配置を確認するために用いた。各動物は、表６に載せた、試験製剤
の１つについて単一のボーラス脊髄内注射を受けた。全ての動物は、注射後２４時間で犠
牲となり、生理食塩水で灌流された。
分析用臓器組織の単離

全ての動物は、全脳及び脊髄を摘出された。脳を長軸方向に切り、一動物につき１つの組
織カセットに置いた。全脊髄を７０％細胞組織用グレードアルコール溶液へ移す前に、１
０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を入れた１５ｍｌ管の環境内で、２４時間以上７２時
間以下の間、保管した。各脊髄サンプルを頸部、胸部、そして腰椎部分へ切り込んだ。各
脊髄部分を半分に切り、両半分を各部位（頸部、胸部、及び腰椎）について、処理するた
めに、別々のカセットに置いた。三つのカセットを全て、動物ごとに１つのパラフィンブ
ロックへと包埋した。適用できる場合は、脳と脊髄の一部を、急速凍結し、－８０℃で保
管した。
ｈＳＭＮ－１ウェスタンブロット分析

通常のウェスタンブロットの手順に続いて、（Ａ）抗ＳＭＮ ４Ｆ１１抗体１：１０００
希釈、（Ｂ）Ｐｉｅｒｃｅ社製ＰＡ５－２７３０９ ａ－ＳＭＮ抗体１：１，０００希釈
、及び（Ｃ）ＬＳＢｉｏ社製Ｃ１３８１４９ ａ－ＳＭＮ抗体１：１，０００希釈などの
、ｈＳＭＮ－１タンパク質を認識する種々の抗体が用いられる。各実験において、ｈＳＭ
Ｎ ｍＲＮＡの１マイクログラムは、リポフェクタミン２０００（登録商標）を用いて、
～１×１０^６のＢＨＫ－２１細胞へ遺伝子導入した。細胞は、ＯｐｔｉＭｅｍ（登録商標
）で処理して、１６～１８時間遺伝子導入後回収した。細胞可溶化物を回収して、処理し
て、そして８～１６％のトリス・グリシン・ゲルにロードした。このゲルを、ＰＶＤＦ膜
を用いて転写し、それぞれ一次抗体で処理した。ヤギ抗マウスＨＲＰ抗体を、室温、４５
分間１：１０，０００で希釈した二次抗体として用いてその後に洗浄して、測定した。デ
ータは、各試験した抗体が未処理のＢＨＫ細胞には、交差反応性シグナルが見られないこ
とが示すように、ｈＳＭＮ－１に強いシグナルを示し、そしてヒトＳＭＮに特異的である
ことを示している（図１）。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）分析

各代表サンプルの生物組織を２つの異なるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用
いて、ｈＳＭＮ－１ ｍＲＮＡを測定した。第１のアプローチとして、手作業によるｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ
Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社）ＺＺプローブ技術を用いて、実施した。プローブ
は、ヒトＳＭＮメッセンジャーＲＮＡのコドン最適化配列（配列番号３）に基づいて、作
成した。手短に言えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）アッセイは、スライドに載せた、
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織中の細胞につき単一のＲＭＡ分子を可視
化するためにデザインされた、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイである。
埋め込まれた各組織サンプルは、メーカーのプロトコルによって前処理を施して、標的で
ある特異的なｈＳＭＮ－１ＲＮＡプローブでインキュベートした。ｈＳＭＮ－１プローブ
は、ヒトＳＭＮ－１に特異的であることと、マウスまたはラットのＳＭＮ－１には交差反
応性がないことを示した。１度結合したあと、ｈＳＭＮ－１プローブは、６周連続した一
連の増幅を通して、シグナル増幅分子のカスケードへハイブリダイズした。次いで、当該
サンプルをシグナル増幅カセットに特異的なＨＲＰ標識プローブで処理して、３，３’－
ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いた、色の可視化によりアッセイした。ユビキチンＣ
に特異的なプローブを、陽性対照として用いた。陽性のＳＭＮシグナルを、未処理のもの
及び、担体制御の処理をしたラットまたはマウスの組織と比較した。着色したサンプルを
、標準的な明視野顕微鏡で見た。

第２のアプローチとして、完全自動化ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析をＬｅ
ｉｃａ ＢｏｎｄＲｘ検出システムで実施した。プローブは、ヒトＳＭＮメッセンジャー
ＲＮＡのコドン最適化配列（配列番号３）に基づいて、作成した。手短に言えば、埋め込
まれた各組織サンプルは、メーカーのプロトコルによって前処理を施して、標的である特
異的なＨＲＰ標識ｈＳＭＮ－１ ＲＮＡプローブでインキュベートした。ユビキチンＣプ
ローブは、陽性対照として用い（図１８）、そしてＤａｐＢプローブを陰性対照プローブ
として用いた（図１７）。アルカリフォスファターゼ染色基質である、ファストレッドを
用いてハイブリダイゼーションをアッセイした。
免疫組織化学的分析

ヒトＳＭＮ－１ ｍＲＮＡがロードされた脂質ナノ粒子は、脊髄内注射によって、ラット
に投与され、組織サンプルを回収し、上に記載した方法により、投与して２４時間後に処
理した。次いで、ラットの脊髄組織サンプルをｈＳＭＮ－１タンパク質の発現用にアッセ
イをした。手短に言えば、パラフィンに包埋した固定組織を、処理して、スライドに載せ
た。当該スライドを、脱脂して、再水和して、そして、クエン酸緩衝液と圧力鍋を用いて
、抗原回復を実施した。種々のブロッキングバッファーを用い、続いて４Ｆ１１抗体を１
：２５００希釈で用いて、一晩の間、４℃にて一次抗体インキュベーションを行った。得
られたスライドを、洗浄して、二次抗体ポリマーによって周囲温度でインキュベートし、
続いて洗浄し、発色現像した。データは、ｈＳＭＮ－１ ｍＲＮＡの脊髄内投与わずか２
４時間で、未処理の対照と比較すると、ヒトＳＭＮ－１タンパク質の染色が認められるこ
とを示している（図２２）。これは、脊髄組織へのｈＳＭＮ－１ ｍＲＮＡの送達を証明
する、先の知見を裏付けるものである。さらに、このデータは、１度ｈＳＭＮ－１細胞へ
送達されると、ｍＲＮＡは、効率的にｈＳＭＮ－１タンパク質を生成するために発現する
ということを示す。
実施例３
ニューロン中でのｍＲＮＡの有効な細胞内送達

本実施例で示されるデータは、ｈＳＭＮ－１ ｍＲＮＡがロードされたリポソーム（脂質
またはポリマー系ナノ粒子）の脊髄内投与は、前角細胞及び背根神経節などの細胞に作用
し難いものを含む、脳及び脊髄中のニューロンにおいて、ｍＲＮＡの細胞内送達に成功し
ている、ということを示す。

この結果は、脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡは、脊髄内投与の結果、ＣＮＳの種々
の細胞組織へと効率的に送達されることができることを示している。表６で開示した１３
の異なる製剤を用いることで、ｍＲＮＡは、２つの独立したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーションアッセイによって証明された様に、脊髄の種々のニューロン（図２Ａ～１４Ｃ
）の中に効率的に送達されて、内在化した。驚くべきことに、脊柱の生物組織内の深部に
位置している、到達が難しい脊髄前角の神経細胞部位にて細胞内ｍＲＮＡ送達が実証され
、タンパク質として発現された（図１９～２２）。マウスまたはラットのＳＭＮ－１にお
いて、バッググラウンドは皆無またはほとんど認められず、ヒトＳＭＮ－１プローブに特
異的であることを示すものであった（図１５～１７）。陽性のＳＭＮシグナルを、未処理
、及び担体制御の処理をしたラットまたはマウスの組織と比較した。着色したサンプルを
、標準的な明視野顕微鏡で見た。

これらのデータは、本明細書に記載されているｍＲＮＡ送達手法に基づく、脂質またはナ
ノ粒子が、複雑かつ高密度である脊髄ニューロンの細胞膜をうまく通過すること、及びニ
ューロン内のコードされたタンパク質の生成のために、ｍＲＮＡのペイロードを送達する
ことが可能であることを示している。本明細書に記載されているｍＲＮＡ送達手法によっ
て、前角細胞及び背根神経節などのニューロンを作用し難いそれらの通過も同様に成功し
たことは、特に驚くべきことである。従って、本明細書で提示したデータは、ｍＲＮＡ送
達方法に基づく脂質またはポリマーナノ粒子が、ＣＮＳ疾患の治療のための有望な選択肢
であることを示している。特に、本発明は、ｈＳＭＮ ｍＲＮＡがロードされたナノ粒子
が、ＳＭＮタンパク質の生成、及び脊髄性筋萎縮症の治療のために、脊髄の運動ニューロ
ンを作用し難いものを含むニューロンへ、効率的に送達され得ることを示している。
実施例４
脳の灰白質及び白質内のｍＲＮＡの有効な細胞内送達

本実施例で提示したデータは、ｈＳＭＮ－１ ｍＲＮＡがロードされたリポソーム（例え
ば、脂質またはポリマー系ナノ粒子）の脊髄内投与が、白質などの脳内深部に位置する、
扱い難い組織を含む、脳内のニューロンにおいて、ｍＲＮＡの細胞内送達に成功している
、ということを示している。

この研究は、上に記載した方法と技術を用いて、各実験の開始時に、約６～８週齢である
ラットで実施された。手短に言えば、実験の開始時に、各動物を吸入によりイソフルラン
で（１～３％で影響）麻酔した。一度麻酔をすると、各動物について、的確な注射部位（
Ｌ４～Ｌ５、またはＬ５～Ｌ６）の体毛をそり落とした。注射針の挿入に続き、反射的な
尾のフリックを、硬膜への穿刺を示すため、そして髄腔内の配置を確認するために用いた
。各動物は、表６に載せた１つの試験製剤について単一のボーラス脊髄内注射を受けた。
全ての動物は、注射後２４時間のうち３０分で犠牲となり、生理食塩水で灌流された。実
施例４で示したデータが、上の表６の製剤１３を用いたｍＲＮＡ送達の結果を説明してい
る。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）分析

ヒトＳＭＮ－１ ｍＲＮＡがロードされた脂質ナノ粒子を、脊髄内注射によってラット
に投与して、組織サンプルを３０分で集め、投与から２４時間後、上に記載したように、
ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社
）ＺＺプローブ技術を用いたｈＳＭＮ－１ ｍＲＮＡで処理し、アッセイした。埋め込ま
れた各組織サンプルは、メーカーのプロトコルによって前処理を施して、標的である特異
的なｈＳＭＮ－１ ＲＮＡプローブでインキュベートした。データは、ｈＳＭＮ－１ ｍ
ＲＮＡの脊髄内投与わずか３０分で、未処理の対照（図２３Ａ）と比較すると、脳組織の
至る所で染色が認められた。これは先の知見を裏付け、ｍＲＮＡ送達方法の速さと有効性
を強調するものであり、この方法はＩＴ送達後わずか３０分でｍＲＮＡを送達する。さら
にこのデータは、本発明によるｍＲＮＡ送達が、灰白質組織（脳の外周部に位置している
）及び白質組織（脳内の深部に位置している）の両方へ効率的にｍＲＮＡ送達をするとい
う、驚くべきかつ予想外の発見であることを示している。従って、本手法は、脳内の到達
しがたい白質組織内の深部に位置する細胞の調節異常の結果として発症した、神経系また
は神経筋の疾患を治療する、実現可能な治療法として役立つことが可能である。
均等物

当業者は、慣例の実験法、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態について、
多くの均等物を用いて、理解しまたは確認し得るだろう。本発明の範囲は、前述の説明に
限定するものではなく、むしろ以下の請求項で記載する。

Claims (1)

1. 本明細書に記載のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を中枢神経系（ＣＮＳ）へ効率的に送達するための方法及び組成物など。
   

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