JP2022023225A - アリールスルファターゼａの精製方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】アリールスルファターゼＡの精製方法を提供すること。【解決手段】本発明は、とりわけ、酵素補充療法のために組換え技術によって生成されたアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製するための改善された方法を提供する。本発明は、一部分において、組換えＡＳＡタンパク質が、わずか４つのクロマトグラフィーカラムとワンステップのみのクロマトグラフィー後の限外濾過／透析濾過とを含むプロセスを用いて、未処理の生体材料、例えば、ＡＳＡを含有する細胞培養培地から精製され得るという、驚くべき発見に基づいている。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下で、２０１３年１月９日に出願された米国仮出願第６１／７５０，６９３号の利益を主張するものであり、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）は、酵素アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）の欠乏に起因する常染色体劣性疾患である。ヒトにおけるＡＲＳＡ遺伝子によりコードされるＡＳＡは、セレブロシド３－硫酸塩またはスフィンゴリピド３－Ｏ－スルホガラクトシルセラミド（スルファチド）をセレブロシドおよび硫酸塩に分解する酵素である。酵素の非存在下では、スルファチドは、神経系（例えば、ミエリン鞘、ニューロン、およびグリア細胞）内に蓄積するが、内臓中に蓄積する程度は低い。これらの分子および細胞性事象の結果は、ＣＮＳおよびＰＮＳ内の進行性脱髄および軸索損失であって、重度の運動および認知機能障害を伴う。
この障害の明確な臨床的特徴は、中枢神経系（ＣＮＳ）変性であって、これは認知障害（例えば、精神遅滞、神経障害、および失明等）をもたらす。
ＭＬＤは、それ自体、幼児において発症し得る（後期乳児型）が、この場合、罹患小児は、典型的には、出生の初めの年（例えば、約１５～２４ヶ月）の直後に症状を示し始め、一般的に、５歳を過ぎては生存しない。ＭＬＤは、それ自体、小児において発症し得る（若年型）が、この場合、罹患小児は、典型的には、約３～１０歳までに認知障害を示し、寿命は、異なり得る（例えば、症状開始後１０～１５年の範囲）。ＭＬＤは、それ自体、成年において発症し得（成年開始型）、あらゆる年齢（例えば、典型的には、１６歳以降）の個人に現れ得、疾患の進行は大きく異なり得る。
酵素補充療法（ＥＲＴ）は、ＭＬＤを治療するために認可された療法であり、ＭＬＤに罹患している患者に、外因性補充ＡＳＡ酵素、具体的には、組換えアリールスルファターゼＡ（ｒＡＳＡ）（例えば、組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ））を投与することを含む。
本発明は、とりわけ、酵素補充療法のために組換え技術によって生成されたＡＳＡタンパク質を精製するための改善された方法を提供する。本発明は、一部分において、組換えＡＳＡタンパク質が、クロマトグラフィー後の限外濾過／透析濾過の単一ステップのみを含むプロセスを用いて、未処理の生体材料、例えば、ＡＳＡを含有する細胞培養培地から精製され得、最終製剤緩衝液に直接薬学的に許容される原薬を生じるという、驚くべき発見に基づいている。以下の実施例に記載されるように、この単一ステップＵＦ／ＤＦプロセスは、クロマトグラフィーステップからの溶出物を単にプールし、プールした溶出物のｐＨを約６．０に調整することにより達成される。本発明前に、組換え技術により生成されたｒＡＳＡタンパク質を精製するためのプロセスは、クロマトグラフィー後の限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）の少なくとも２つのステップを含んだ。実施例の項に記載されるように、本発明に従ってワンステップのＵＦ／ＤＦプロセスを用いて精製された組換えＡＳＡタンパク質は、複数のＵＦ／ＤＦステップを用いて精製された組換えＡＳＡタンパク質と比較して、同等の純度、活性、および収率を有する。例えば、本発明に従って精製された組換えＡＳＡ酵素は、１００ｐｇ／ｍｇ以下の宿主細胞ＤＮＡを有し、高比活性（例えば、約５０～１４０Ｕ／ｍｇ）ならびに組換えＡＳＡタンパク質のバイオアベイラビリティおよび／またはリソソームターゲッティングを促進し得る他の異なる特徴を保有する。したがって、この簡易化されたプロセスは、組換えＡＳＡタンパク質を精製する際に、より迅速で、より安価であり、かつ同等に有効である。このプロセスは、高い負荷容量のあるクロマトグラフィーステップと組み合わせて、大規模な組換えＡＳＡタンパク質の生成を促進するときに特に有用である。
それ故に、一態様において、本発明は、組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製する方法であって、１つ以上のクロマトグラフィーステップを行うことにより不純調製物から組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製するステップと、１つ以上のクロマトグラフィーステップからの溶出物をプールするステップと、プールした溶出物のｐＨを約５．８、５．９、または６．０以上のｐＨに調整するステップと、ｐＨを調整した溶出物を限外濾過および／または透析濾過に供するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約５．８～７．０（例えば、約５．８～６．８、約５．８～６．６、約５．８～６．４、約５．８～６．２、約５．８～６．１、約５．８～６．０、約５．９～７．０、約５．９～６．８、約５．９～６．６、約５．９～６．４、約５．９～６．２、約５．９～６．１、約５．９～６．０、約５．９５～６．２０、約５．９５～６．１５、約５．９５～６．１０、または約５．９５～６．０５）に調整される。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約６．０に調整される。
いくつかの実施形態において、ｐＨは、ｐＨ７．０を有するリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびクエン酸ナトリウムを含む緩衝液を用いて調整される。いくつかの実施形態において、緩衝液は、ｐＨ約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５を有する約０．１～０．５Ｍ（例えば、約０．１～０．４Ｍ、０．１～０．３Ｍ、０．２～０．４Ｍ、または０．２～０．３Ｍ）のリン酸ナトリウム、約０．５～２．５Ｍ（例えば、約０．５～２．０Ｍ、０．５～１．５Ｍ、０．７５～２．５Ｍ、０．７５～２．０Ｍ、０．７５～１．５Ｍ、１．０～２．５Ｍ、１．０～２．０Ｍ、または１．０～１．５Ｍ）の塩化ナトリウム、および約０．１～０．６Ｍ（例えば、約０．１～０．５Ｍ、０．１～０．４Ｍ、０．２～０．５Ｍ、０．２～０．４Ｍ、０．３～０．５Ｍ、または０．３～０．４Ｍ）のクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、緩衝液は、ｐＨ約７．０を有する約０．２５Ｍのリン酸ナトリウム、約１．３３Ｍの塩化ナトリウム、および約０．３４Ｍのクエン酸ナトリウムを含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス濾過は、限外濾過および透析濾過のステップ前に行われる。いくつかの実施形態において、限外濾過および／または透析濾過の単一ステップが行われる。いくつかの実施形態において、限外濾過および／または透析濾過の単一ステップは、１つの透析濾過のみを含む。様々な実施形態において、限外濾過は、接線流限外濾過である。
いくつかの実施形態において、１つ以上のクロマトグラフィーステップは、陽イオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、最後のクロマトグラフィーステップであり、陽イオン交換クロマトグラフィーからの溶出物は、ｐＨを調節する前にプールされる。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上が、陽イオン交換クロマトグラフィーを行う前に行われる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のクロマトグラフィーステップは、親和性クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、親和性クロマトグラフィーは、第１のクロマトグラフィーステップである。いくつかの実施形態において、親和性クロマトグラフィーは、最後のクロマトグラフィーステップであり、親和性クロマトグラフィーからの溶出物は、ｐＨを調整する前にプールされる。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上が、親和性クロマトグラフィーを行う前に行われる。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上が、親和性クロマトグラフィーを行った後に行われる。
いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｑクロマトグラフィーである。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＴＭＡＥ樹脂（例えば、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＴＭＡＥ）を含む。いくつかの実施形態において、ＴＭＡＥ樹脂は、一旦不純調製物で負荷されると、ｐＨ約７．０のＭＥＳ－Ｔｒｉｓを含む第１の洗浄緩衝液を用いて洗浄される。ある実施形態において、第１の洗浄緩衝液は、約２０～７５ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ（例えば、約３０～６０ｍＭ、４０～７０ｍＭ、または４０～６０ｍＭ）を含む。ある実施形態において、第１の洗浄緩衝液は、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、または７５ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＭＡＥ樹脂は、ｐＨ約７．０を有するＭＥＳ－ＴｒｉｓおよびＮａＣｌを含む第２の洗浄緩衝液を用いて洗浄される。いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝液は、ｐＨ約７．０を有する約５～７５ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ（例えば、約５～７０ｍＭ、５～６０ｍＭ、５～５０ｍＭ、５～４０ｍＭ、５～３０ｍＭ、１０～６０ｍＭ、１０～５０ｍＭ、１０～４０ｍＭ、１０～３０ｍＭ、または１５～２５ｍＭ）および約５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約５０～１４０ｍＭ、５０～１３０ｍＭ、５０～１２０ｍＭ、５０～１１０ｍＭ、７５～１５０ｍＭ、７５～１４０ｍＭ、７５～１３０ｍＭ、７５～１２０ｍＭ、または７５～１１０ｍＭ）を含む。いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝液は、ｐＨ約７．０を有する約５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ＭＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、または７５ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓおよび約５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、または１５０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝液は、ｐＨ約７．０を有する約２０ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓおよび約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＭＡＥ樹脂は、一旦不純調製物で負荷されると、ｐＨ約７．０を有するＭＥＳ－ＴｒｉｓおよびＮａＣｌを含む溶出緩衝液を用いて溶出される。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、ｐＨ約７．０を有する約５～７５ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ（例えば、約５～７０ｍＭ、５～６０ｍＭ、５～５０ｍＭ、５～４０ｍＭ、約５～３０ｍＭ、１０～７５ｍＭ、１０～６０ｍＭ、１０～５０ｍＭ、１０～４０ｍＭ、または１０～３０ｍＭ）および約１５０～３００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約１５０～２５０ｍＭ、約１８０～２６０ｍＭ、約２００～２８０ｍＭ、２００～２６０ｍＭ、２００～２４０ｍＭ、２１０～３００ｍＭ、２１０～２８０ｍＭ、２１０～２６０ｍＭ、または２１０～２４０ｍＭ）を含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、ｐＨ約７．０を有する約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、または７５ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓおよび約１５０ｍＭ、１８０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、または３００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、ｐＨ約７．０を有する約２０ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓおよび約２２０ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＸＬ、ＣＡＰＴＯ（商標）Ｑ、ＤＥＡＥ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧＩＧＡＣＡＰ（登録商標）Ｑ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＴＭＡＥ、ＥＳＨＭＵＮＯ（商標）Ｑ、ＮＵＶＩＡ（商標）Ｑ、またはＵＮＯＳＰＨＥＲＥ（商標）Ｑからなる群から選択されるカラムを使用する。
いくつかの実施形態において、本発明に適している混合モードクロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーである。
いくつかの実施形態において、本発明に適している疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニルクロマトグラフィーである。
いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＴＭＡＥ樹脂を用いた）、混合モードクロマトグラフィー（例えば、ＨＡクロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルクロマトグラフィー）、および陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＳＰクロマトグラフィー）は、その順で行われる。
いくつかの実施形態において、本発明に適している親和性クロマトグラフィーは、抗アリールスルファターゼＡ抗体（例えば、抗ヒトアリールスルファターゼＡ抗体）を使用する。
いくつかの実施形態において、好適な陰イオン交換クロマトグラフィーは、約４．５ｇ／Ｌ超（例えば、約５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、または１５ｇ／Ｌ超）の負荷容量を有するカラムを使用する。いくつかの実施形態において、好適な陰イオン交換クロマトグラフィーは、約４．５～２０ｇ／Ｌの範囲（例えば、約５～２０ｇ／Ｌ、５～１９ｇ／Ｌ、５～１８ｇ／Ｌ、５～１７ｇ／Ｌ、５～１６ｇ／Ｌ、５～１５ｇ／Ｌ、７．５～２０ｇ／Ｌ、７．５～１９ｇ／Ｌ、７．５～１８ｇ／Ｌ、７．５～１７ｇ／Ｌ、７．５～１６ｇ／Ｌ、７．５～１５ｇ／Ｌ、１０～２０ｇ／Ｌ、１０～１９ｇ／Ｌ、１０～１８ｇ／Ｌ、１０～１７ｇ／Ｌ、１０～１６ｇ／Ｌ、または１０～１５ｇ／Ｌの範囲）の負荷容量を有するカラムを使用する。特定の実施形態において、カラムの好適な負荷容量は、約１０～１５ｇ／Ｌである。
いくつかの実施形態において、不純調製物の限外濾過が、１つ以上のクロマトグラフィーステップ前に行われる。いくつかの実施形態において、本発明に適している限外濾過ステップは、接線流限外濾過である。ある実施形態において、好適な限外濾過は、少なくとも約１０ｋＤＡ、少なくとも約２０ｋＤＡ、少なくとも約３０ｋＤＡ、少なくとも約４０ｋＤＡ、少なくとも約５０ｋＤＡの分子量カットオフを有する細孔径を含む膜フィルターを使用する。ある実施形態において、組換えＡＳＡの少なくとも７５％は、不純調製物中に保持される。ある実施形態において、組換えＡＳＡの少なくとも７５％は、フィルターを透過する。ある実施形態において、好適な限外濾過ステップは、ポリエーテルスルホンまたはセルロース膜を使用する。
いくつかの実施形態において、不純調製物の浄化は、不純調製物の限外濾過前に行われる。いくつかの実施形態において、本発明に適している浄化ステップは、１つ以上の深層フィルター（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）を用いて濾過を行なうことである。いくつかのある実施形態において、不純調製物の濾過は、一連の深層フィルターを用いて行われる。いくつかのある実施形態において、好適な一連の深層フィルターは、セルロース、珪藻土、ポリエーテルスルホン、またはそれらの組み合わせを含む膜を使用する。
いくつかの実施形態において、限外濾過に続いて、深層濾過および／またはウイルス不活性化の１つ以上のステップが行われる。いくつかの実施形態において、深層濾過および／またはウイルス不活性化の１つ以上のステップに続いて、１つ以上のクロマトグラフィーステップが行われる。いくつかの実施形態において、ウイルス不活性化のステップは、洗剤を不純調製物に添加することを含む。
いくつかの実施形態において、本発明による方法は、懸濁液中で培養された哺乳動物細胞により生成される組換えＡＳＡタンパク質を精製するために使用され得る。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、バイオリアクター中で培養される。いくつかの実施形態において、培地は、血清系である。いくつかの実施形態において、培地は、無血清である。いくつかの実施形態において、無血清培地は、既知組成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）である。
いくつかの実施形態において、不純調製物は、潅流バイオリアクター（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）からの供給流である。いくつかの実施形態において、不純調製物は、哺乳動物細胞から分泌された組換えＡＳＡタンパク質を含有する培地（例えば、血清系または無血清培地）から調製される。いくつかの実施形態において、不純調製物は、冷凍培地の調製物から解凍される。
いくつかの実施形態において、限外濾過および／または透析濾過のステップは、精製された組換えＡＳＡタンパク質を製剤緩衝液に交換することを含む。
いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明による精製された組換えＡＳＡタンパク質は、約１５０ｎｇ／ｍｇ、１４０ｎｇ／ｍｇ、１３０ｎｇ／ｍｇ、１２０ｎｇ／ｍｇ、１１０ｎｇ／ｍｇ、１００ｎｇ／ｍｇ、９０ｎｇ／ｍｇ、８０ｎｇ／ｍｇ、７０ｎｇ／ｍｇ、６０ｎｇ／ｍｇ、５０ｎｇ／ｍｇ、４０ｎｇ／ｍｇ、３０ｎｇ／ｍｇ、２０ｎｇ／ｍｇ、または１０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する。
いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、クマシーブルー染色を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供するとき、１．０％のアッセイ対照を超える強度を有する新しいバンドを有しない。
いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、約１５０ｐｇ／ｍｇ、１４０ｐｇ／ｍｇ、１３０ｐｇ／ｍｇ、１２０ｐｇ／ｍｇ、１１０ｐｇ／ｍｇ、１００ｐｇ／ｍｇ、９０ｐｇ／ｍｇ、８０ｐｇ／ｍｇ、７０ｐｇ／ｍｇ、６０ｐｇ／ｍｇ、５０ｐｇ／ｍｇ、４０ｐｇ／ｍｇ、３０ｐｇ／ｍｇ、２０ｐｇ／ｍｇ、または１０ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製する方法であって、１つ以上のクロマトグラフィーステップを行うことにより不純調製物から組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製するステップであり、第１のクロマトグラフィーステップは、約４．５ｇ以上のタンパク質／Ｌ樹脂（例えば、約５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、または２０ｇ／Ｌ超）の負荷容量を有するカラムを使用する、精製するステップと、１つ以上のクロマトグラフィーステップから溶出物をプールするステップと、プールした溶出物のｐＨを約６．０以上のｐＨに調整するステップと、ｐＨを調整した溶出物を限外濾過および／または透析濾過に供するステップと、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のクロマトグラフィーステップを行うステップは、第１のイオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および第２のイオン交換クロマトグラフィーを、その順で行うことを含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のクロマトグラフィーステップは、親和性クロマトグラフィーを含む。いくつかのある実施形態において、親和性クロマトグラフィーは、第１のイオン交換クロマトグラフィーステップ前に行われる。いくつかのある実施形態において、親和性クロマトグラフィーは、第２のイオン交換クロマトグラフィーステップを行った後に行われる。いくつかの実施形態において、親和性クロマトグラフィーは、第１のイオン交換クロマトグラフィーステップと第２のイオン交換クロマトグラフィーステップとの間で行われる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のクロマトグラフィーステップを行うステップは、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーを、その順で行うことを含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のクロマトグラフィーステップを行うステップは、親和性クロマトグラフィー 陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーを、その順で行うことを含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のクロマトグラフィーステップを行うステップは、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーを、その順で行うことを含む。
いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＴＭＡＥ樹脂を用いたカラムを使用する。ある実施形態において、ＴＭＡＥカラムは、約５～２０ｇのタンパク質／Ｌ樹脂（例えば、約５～１９ｇ／Ｌ、５～１８ｇ／Ｌ、５～１７ｇ／Ｌ、５～１６ｇ／Ｌ、５～１５ｇ／Ｌ、７．５～２０ｇ／Ｌ、７．５～１９ｇ／Ｌ、７．５～１８ｇ／Ｌ、７．５～１７ｇ／Ｌ、７．５～１６ｇ／Ｌ、７．５～１５ｇ／Ｌ、１０～２０ｇ／Ｌ、１０～１９ｇ／Ｌ、１０～１８ｇ／Ｌ、１０～１７ｇ／Ｌ、１０～１６ｇ／Ｌ、または１０～１５ｇ／Ｌ）の負荷容量を有する。
いくつかの実施形態において、限外濾過および／または透析濾過の単一ステップが、１つ以上のクロマトグラフィーステップ後に行われる。
とりわけ、本発明は、本明細書に記載される本発明の方法により精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質およびそれを含有する薬学的組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）を含む組成物を提供し、精製された組換えＡＳＡは、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇの比活性であり、さらに、精製された組換えＡＳＡは、１５０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および／または１５０ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）を含む。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、約１４０ｎｇ／ｍｇ、１３０ｎｇ／ｍｇ、１２０ｎｇ／ｍｇ、１１０ｎｇ／ｍｇ、１００ｎｇ／ｍｇ、９０ｎｇ／ｍｇ、８０ｎｇ／ｍｇ、７０ｎｇ／ｍｇ、６０ｎｇ／ｍｇ、５０ｎｇ／ｍｇ、４０ｎｇ／ｍｇ、３０ｎｇ／ｍｇ、２０ｎｇ／ｍｇ、または１０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、約１４０ｐｇ／ｍｇ、１３０ｐｇ／ｍｇ、１２０ｐｇ／ｍｇ、１１０ｐｇ／ｍｇ、１００ｐｇ／ｍｇ、９０ｐｇ／ｍｇ、８０ｐｇ／ｍｇ、７０ｐｇ／ｍｇ、６０ｐｇ／ｍｇ、５０ｐｇ／ｍｇ、４０ｐｇ／ｍｇ、３０ｐｇ／ｍｇ、２０ｐｇ／ｍｇ、または１０ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含有する。
いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、７０Ｕ／ｍｇ、８０Ｕ／ｍｇ、９０Ｕ／ｍｇ、１００Ｕ／ｍｇ、１１０Ｕ／ｍｇ、１２０Ｕ／ｍｇ、１３０Ｕ／ｍｇ、１４０Ｕ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、約５０～２００Ｕ／ｍｇの範囲（例えば、約５０～１９０Ｕ／ｍｇ、５０～１８０Ｕ／ｍｇ、５０～１７０Ｕ／ｍｇ、５０～１６０Ｕ／ｍｇ、５０～１５０Ｕ／ｍｇ、５０～１４０Ｕ／ｍｇ、５０～１３０Ｕ／ｍｇ、５０～１２０Ｕ／ｍｇ、５０～１１０Ｕ／ｍｇ、５０～１００Ｕ／ｍｇ、６０～１４０Ｕ／ｍｇ、６０～１３０Ｕ／ｍｇ、６０～１２０Ｕ／ｍｇ、６０～１１０Ｕ／ｍｇ、６０～１００Ｕ／ｍｇ、７０～１４０Ｕ／ｍｇ、７０～１３０Ｕ／ｍｇ、７０～１２０Ｕ／ｍｇ、７０～１１０Ｕ／ｍｇ、７０～１００Ｕ／ｍｇ、８０～１４０Ｕ／ｍｇ、８０～１３０Ｕ／ｍｇ、８０～１２０Ｕ／ｍｇ、８０～１１０Ｕ／ｍｇ、８０～１００Ｕ／ｍｇ、９０～１４０Ｕ／ｍｇ、９０～１３０Ｕ／ｍｇ、９０～１２０Ｕ／ｍｇ、９０～１１０Ｕ／ｍｇ、９０～１００Ｕ／ｍｇ、１００～１４０Ｕ／ｍｇ、１００～１３０Ｕ／ｍｇ、１００～１２０Ｕ／ｍｇ、１００～１１０Ｕ／ｍｇ、１１０～１４０Ｕ／ｍｇ、１１０～１３０Ｕ／ｍｇ、１１０～１２０Ｕ／ｍｇ、１２０～１４０Ｕ／ｍｇ、１２０～１３０Ｕ／ｍｇ、または１３０～１４０Ｕ／ｍｇ）の比活性を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）を含む組成物であって、精製されたＡＳＡは、中性（ピーク群１）、モノシアル化（ピーク群２）、キャップされたマンノース－６－リン酸化（ピーク群３）、ジシアル化（ピーク群４）、モノ－マンノース－６－リン酸化（ピーク群５）、ハイブリッド（ピーク群６）、およびジ－マンノース－６－リン酸化（ピーク群７）を示すピーク群から選択される１つ以上のピーク群を含むグリカンマップで特徴付けられる。いくつかの実施形態において、精製されたＡＳＡは、ピーク群１～７のうちの少なくとも２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上を含むグリカンマップで特徴付けられる。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される組成物および生理学的に許容される担体を含む製剤を提供する。いくつかの実施形態において、製剤は、静脈内投与に適している。いくつかの実施形態において、製剤は、髄腔内投与に適している。いくつかの実施形態において、製剤は、皮下投与に適している。
とりわけ、本発明は、異染性白質萎縮症を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、本明細書に記載される精製された組換えＡＳＡタンパク質、薬学的組成物、または製剤を投与することを含む。
本明細書中で用いる場合、「ＡＳＡタンパク質」、「ＡＳＡ」、「ＡＳＡ酵素」、または文法的等価物は、特に具体的な記載のない限り、組換えＡＳＡタンパク質分子の調製物を指す。
本出願中で用いる場合、「約」および「およそ」という用語は、等価物として使用される。約／およその有無に関係なくこの出願で用いられるいかなる数字も、関連分野の当業者により理解されるいかなる正常な変動を含むものとする。
本発明の他の特性、目的、および利点は、以下の詳細な説明において明白になる。しかしながら、この詳細な説明は、本発明の実施形態を示しているが、限定ではなく例示としてのみ提供されるものであることを理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製する方法であって、
１つ以上のクロマトグラフィーステップを行うことにより不純調製物から組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製することと、
前記１つ以上のクロマトグラフィーステップからの溶出物をプールすることと、
前記プールした溶出物のｐＨを約６．０以上のｐＨに調整することと、
前記ｐＨを調整した溶出物を限外濾過および／または透析濾過に供することと、を含む、方法。
（項目２）
前記ｐＨが、約６．０に調整される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ｐＨが、ｐＨ７．０を有するリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびクエン酸ナトリウムを含む緩衝液を用いて調整される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記緩衝液が、ｐＨ７．０を有する約０．１～０．５Ｍのリン酸ナトリウム、０．５～２．５Ｍの塩化ナトリウム、および０．１～０．６Ｍのクエン酸ナトリウムを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
ウイルス濾過が、限外濾過および透析濾過の前記ステップ前に行われる、項目１～４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
限外濾過および／または透析濾過の単一ステップが行われる、項目１～５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
限外濾過および／または透析濾過の前記単一ステップが、１つの透析濾過のみを含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記限外濾過が、接線流限外濾過である、項目１～７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記１つ以上のクロマトグラフィーステップが、陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、項目１～８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、最後のクロマトグラフィーステップであり、前記陽イオン交換クロマトグラフィーからの溶出物が、前記ｐＨを調整する前にプールされる、項目９に記載の方法。
（項目１１）
陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上が、前記陽イオン交換クロマトグラフィーを行う前に行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、Ｑクロマトグラフィーである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、ＴＭＡＥ樹脂を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＴＭＡＥ樹脂が、一旦前記不純調製物で負荷されると、ｐＨ７．０を有するＭＥＳ－Ｔｒｉｓを含む第１の洗浄緩衝液を用いて洗浄される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記第１の洗浄緩衝液が、約２０～７５ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＴＭＡＥ樹脂が、ｐＨ７．０を有するＭＥＳ－ＴｒｉｓおよびＮａＣｌを含む第２の洗浄緩衝液を用いて洗浄される、項目１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記第２の洗浄緩衝液が、ｐＨ７．０を有する約５～７５ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓおよび約５０～１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＴＭＡＥ樹脂が、一旦前記不純調製物で負荷されると、ｐＨ７．０を有するＭＥＳ－ＴｒｉｓおよびＮａＣｌを含む溶出緩衝液を用いて溶出される、項目１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記溶出緩衝液が、ｐＨ７．０を有する約５～７５ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓおよび約１５０～３００ｍＭのＮａＣｌを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ、ＤＥＡＥ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ
ＧｉｇａＣａｐ（登録商標）Ｑ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標）Ｑ、Ｎｕｖｉａ（商標）Ｑ、またはＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑからなる群から選択されるカラムを使用する、項目１１に記載の方法。
（項目２１）
前記混合モードクロマトグラフィーが、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーである、項目１１～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フェニルクロマトグラフィーである、項目１１～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
１つ以上のクロマトグラフィーステップを行うことが、ＴＭＡＥ樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ＨＡクロマトグラフィー、フェニルクロマトグラフィー、および陽イオン交換ＳＰクロマトグラフィーを、その順で行うことを含む、項目９～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、約４．５ｇ／Ｌ超の負荷容量を有するカラムを用いることを含む、項目９～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記カラムの前記負荷容量が、約５～２０ｇ／Ｌである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記不純調製物の限外濾過が、前記１つ以上のクロマトグラフィーステップ前に行われる、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記限外濾過が、接線流限外濾過である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
限外濾過が、少なくとも１０ｋＤＡの分子量カットオフを有する細孔径を含む膜フィルターを使用する、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９）
限外濾過が、少なくとも３０ｋＤＡの分子量カットオフを有する細孔径を含む膜フィルターを使用する、項目２６または２７に記載の方法。
（項目３０）
限外濾過が、少なくとも５０ｋＤＡの分子量カットオフを有する細孔径を含む膜フィルターを使用する、項目２６または２７に記載の方法。
（項目３１）
前記組換えＡＳＡの少なくとも７５％が、前記不純調製物中に保持される、項目２６または２７に記載の方法。
（項目３２）
前記組換えＡＳＡの少なくとも７５％が、前記フィルターを透過する、項目２６または２７に記載の方法。
（項目３３）
限外濾過が、ポリエーテルスルホンまたはセルロース膜を含む、項目２６または２７に記載の方法。
（項目３４）
前記限外濾過に続いて、深層濾過および／またはウイルス不活性化の１つ以上のステップが行われる、項目２６～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
深層濾過および／またはウイルス不活性化の前記１つ以上のステップに続いて、前記１つ以上のクロマトグラフィーステップが行われる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
ウイルス不活性化の前記ステップが、洗剤を前記不純調製物に添加することを含む、項目３４または３５に記載の方法。
（項目３７）
前記組換えＡＳＡタンパク質が、懸濁液中で培養された哺乳動物細胞により生成される、項目１～３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記哺乳動物細胞が、バイオリアクター中で培養される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記培地が、無血清である、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４０）
前記無血清培地が、既知組成培地である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、項目３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記不純調製物が、潅流バイオリアクターからの供給流である、項目１～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記不純調製物が、前記哺乳動物細胞から分泌された組換えＡＳＡタンパク質を含有する前記無血清培地から調製される、項目１～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記不純調製物が、冷凍培地の調製物から解凍される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
限外濾過および／または透析濾過の前記ステップが、前記精製された組換えＡＳＡタンパク質を製剤緩衝液に交換することを含む、項目１～４４のいずれか一項に記載の方法。（項目４６）
前記組換えＡＳＡタンパク質が、配列番号１（野生型ヒトＡＳＡタンパク質に対応する）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、項目１～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記組換えＡＳＡタンパク質が、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する、項目１～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記精製された組換えＡＳＡタンパク質が１００ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する、項目１～４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記精製された組換えＡＳＡタンパク質が６０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する、項目１～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記精製された組換えＡＳＡタンパク質が、クマシーブルー染色を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供するとき、１．０％のアッセイ対照を超える強度を有する新しいバンドを有しない、項目１～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記精製された組換えＡＳＡタンパク質が、１００ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含有する、項目１～５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記精製された組換えＡＳＡタンパク質が、５０ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含有する、項目１～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製する方法であって、
１つ以上のクロマトグラフィーステップを行うことにより不純調製物から組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製することであり、前記第１のクロマトグラフィーステップが約４．５ｇ以上のタンパク質／Ｌ樹脂の負荷容量を有するカラムを使用する、精製することと、
前記１つ以上のクロマトグラフィーステップからの溶出物をプールすることと、
前記プールした溶出物のｐＨを約６．０以上のｐＨに調整することと、
前記ｐＨを調整した溶出物を限外濾過および／または透析濾過に供することと、を含む、方法。
（項目５４）
１つ以上のクロマトグラフィーステップを行う前記ステップが、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーを、その順で行うことを含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、ＴＭＡＥ樹脂を含むカラムを使用する、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ＴＭＡＥカラムが、約５～２０ｇタンパク質／Ｌ樹脂の負荷容量を有する、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
限外濾過および／または透析濾過の単一ステップが、前記１つ以上のクロマトグラフィーステップ後に行われる、項目５３～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
項目１～５７のいずれか一項に記載の方法により精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質。
（項目５９）
項目５８に記載の組換えＡＳＡタンパク質を含む、薬学的組成物。
（項目６０）
治療を必要とする対象に、項目５９に記載の薬学的組成物を投与することを含む、異染性白質萎縮症を治療する方法。
（項目６１）
配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）を含む組成物であって、
前記精製された組換えＡＳＡが、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇの比活性を有し、
さらに、前記精製された組換えＡＳＡが、１５０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および／または１５０ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）を含有する、組成物。
（項目６２）
前記精製された組換えＡＳＡが、１００ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する、項目６１に記載の組成物。
（項目６３）
前記精製された組換えＡＳＡが、６０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する、項目６１または６２に記載の組成物。
（項目６４）
前記精製された組換えＡＳＡが、１００ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤを含有する、項目６１～６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６５）
前記精製された組換えＡＳＡが、５０ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤを含有する、項目６１～６４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６６）
前記精製された組換えＡＳＡが、少なくとも約７０Ｕ／ｍｇの比活性を有する、項目６１～６５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６７）
前記精製された組換えＡＳＡが、少なくとも約１００Ｕ／ｍｇの比活性を有する、項目６１～６６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６８）
前記精製された組換えＡＳＡが、少なくとも約１２０Ｕ／ｍｇの比活性を有する、項目６１～６７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６９）
前記精製された組換えＡＳＡが、約５０～２００Ｕ／ｍｇの範囲の比活性を有する、項目６１～６８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７０）
前記精製された組換えＡＳＡが、約５０～１４０Ｕ／ｍｇの範囲の比活性を有する、項目６１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７１）
配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）を含む組成物であって、
前記精製されたＡＳＡが、中性（ピーク群１）、モノシアル化（ピーク群２）、キャップされたマンノース－６－リン酸化（ピーク群３）、ジシアル化（ピーク群４）、モノ－マンノース－６－リン酸化（ピーク群５）、ハイブリッド（ピーク群６）、およびジ－マンノース－６－リン酸化（ピーク群７）を示すピーク群から選択される７つ以下のピーク群を含むグリカンマップで特徴付けられる、組成物。
（項目７２）
前記精製された組換えＡＳＡが、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、項目７１に記載の組成物。
（項目７３）
前記精製された組換えＡＳＡが、配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、項目７１または７２に記載の組成物。
（項目７４）
前記精製された組換えＡＳＡが、配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、項目７１～７３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７５）
前記精製された組換えＡＳＡが、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する、項目７１～７４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７６）
項目７１～７５のいずれか一項に記載の組成物および生理学的に許容される担体を含む、製剤。
（項目７７）
前記製剤が、静脈内投与に適している、項目７６に記載の製剤。
（項目７８）
前記製剤が、髄腔内投与に適している、項目７６に記載の製剤。
（項目７９）
前記製剤が、皮下投与に適している、項目７６に記載の製剤。
図面と一緒に作成する以下に記載される図は、限定ではなく、例示のみを目的とするものとする。
例示的な精製プロセスの汎用フローダイヤグラムを示す。 陽イオン交換カラムからの溶出物をプールするステップと、プールした溶出物のｐＨを調整するステップとを含む、例示的な精製プロセスの汎用フローダイヤグラムを示す。 各膜についての供給流速、膜間圧（ＴＭＰ）、および透過流束の間の相関関係を示す例示的な結果を示す。 全プロセスを通してＦｒａｃｔｏｇｅｌとＱ ＦＦとの両方に対して同様のバンドプロファイルを示す例示的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ（銀）ゲルを示す。 単一ＵＦＤＦまたはＵＦＤＦＤＦステップを含む実現可能性の実行および対照実行が、参照基準（レーン３）と同様のバンドパターンを示す例示的な結果を示し、すべての実行からの原薬が比較的低いレベルのＨＣＰを示したことを示す。 参照基準に対する実験（実現可能性）実行と対照実行との間の同等性、ならびに何の追加のバンドパターンもＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クマシー）により検出されなかったことを示す、例示的な結果を示す。
定義
本発明についてより容易に理解するために、一定の用語をまず以下で定義する。以下の用語および他の用語に関する付加的な定義は、本明細書全体を通して記述されている。
およそまたは約：本明細書中で用いる場合、「およそ」または「約」という用語は、１つ以上の対象となる値に適用される場合、記述された参照値と類似する値を指す。ある実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、特に指定のない限り、あるいはそうでない場合は文脈から明らかな記述された参照値のいずれかの方向で（より大きいかまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下内にある範囲の値を指す（このような数が考えられる値の１００％を超える場合を除く）。
生物学的に活性な：本明細書中で用いる場合、「生物学的に活性な」という語句は、生物系において、特に生物体において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物体に投与される場合、その生物体に生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると見なされる。タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態において、当該タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部分は、典型的には、「生物学的に活性な」部分と称される。
陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸塩受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）：本明細書中で用いる場合、「陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸塩受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）」という用語は、リソソームへの輸送を定められているゴルジ装置における酸加水分解酵素前駆体上のマンノース－６－リン酸塩（Ｍ６Ｐ）タグを結合する細胞受容体を指す。マンノース－６－リン酸塩に加えて、ＣＩ－ＭＰＲはまた、ＩＧＦ－ＩＩを含む他のタンパク質をも結合する。ＣＩ－ＭＰＲはまた、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ－ＩＩ受容体」、「ＣＩ－ＭＰＲ／ＩＧＦ－ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ－ＩＩ受容体」、または「ＩＧＦ２受容体」としても知られている。これらの用語およびその略語は、本明細書中で相互交換可能に用いられる。
クロマトグラフィー：本明細書中で用いる場合、「クロマトグラフィー」という用語は、混合物の分離における技術を指す。典型的には、混合物を、「移動相」と呼ばれる液体に溶解し、「固定相」と呼ばれる別の材料を固定する構造を通してそれを運ぶ。カラムクロマトグラフィーは、固定床がチューブ、すなわちカラム内にある分離技術である。
希釈剤：本明細書中で用いる場合、「希釈剤」という用語は、再構成製剤の調製のために有用な薬学的に許容される（例えば、ヒトへの投与のために安全かつ非毒性の）希釈物質を指す。例示的な希釈剤には、滅菌水、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩溶液、リンガー溶液、またはデキストロース溶液が含まれる。
溶出：本明細書中で用いる場合、「溶出」という用語は、溶剤で洗浄することにより、別の材料からある材料を抽出するプロセスを指す。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、溶出は、負荷した樹脂を洗浄して、捕捉したイオンを除去するプロセスである。
溶出物：本明細書中で用いる場合、「溶出物」という用語は、移動相「担体」と、典型的には、溶出の結果として、クロマトグラフィーから現れる分析材料の組み合わせを指す。
酵素補充療法（ＥＲＴ）：本明細書中で用いる場合、「酵素補充療法（ＥＲＴ）」という用語は、不足している酵素を提供することにより酵素欠乏症を是正する任意の治療戦略を指す。一旦投与されると、酵素は細胞により取り込まれ、リソソームに運ばれて、そこで酵素は、酵素欠乏のためにリソソーム中に蓄積された物質を除去するよう作用する。典型的には、有効であるリソソーム酵素補充療法に関して、治療用酵素は、貯蔵欠陥が明らかである標的組織中の適切な細胞中のリソソームに送達される。本明細書に記載される精製プロセスは、ＭＬＤのＥＲＴに対する原薬として組換えアリールスルファターゼＡを精製し、製剤化するために使用され得る。
平衡化するまたは平衡：本明細書中で用いる場合、クロマトグラフィーに関して「平衡化する」または「平衡」という用語は、一般に、液体（例えば、緩衝液）の成分の安定かつ公平な分配を達成するために、第１の液体（例えば、緩衝液）を別のものを用いてバランスをもたらすプロセスを指す。例えば、いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーカラムは、１カラム体積以上の所望の液体（例えば、緩衝液）を、カラムを通過させることにより平衡化され得る。
改善する、増大する、または低減する：本明細書中で用いる場合、「改善する」、「増大する」、または「低減する」という用語、あるいは文法的等価物は、ベースライン測定値、例えば、本明細書に記載される治療の開始前の同一の個人における測定値、または本明細書に記載される治療の非存在下で、一対照個人（または複数の対照個人）における測定値と比較した値を示す。「対照個人」は、治療されるべき個人と同一型のリソソーム蓄積症に罹患している個人であり、治療されるべき個人とほぼ同年齢である（治療された個人および対照個人（複数を含む）における疾患の段階が比較可能であることを保証するため）。
不純物：本明細書中で用いる場合、「不純物」という用語は、標的材料または化合物の化学組成物とは異なる、密閉された量の液体、気体、または固体中の物質を指す。不純物はまた、混入物質とも称される。
負荷：本明細書中で用いる場合、「負荷」という用語は、クロマトグラフィーにおいて、試料を含有する液体または固体をカラムに添加することを指す。いくつかの実施形態において、負荷された試料がカラムを通過するとき、カラム上に負荷された試料の特定の成分が、捕捉される。いくつかの実施形態において、負荷された試料がカラムを通過するとき、カラム上に負荷された試料の特定の成分が、カラムにより捕捉されないか、または「フロースルーする（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）」。
ポリペプチド：本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」は、概して、ペプチド結合により互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸の鎖である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも３～５つのアミノ酸を含み得、これらのそれぞれは、少なくとも１つのペプチド結合により他のものと結合される。ポリペプチドは、時として、「非天然」アミノ酸、あるいはそれでも任意にポリペプチド鎖に一体化し得る他の実体を包含することが、当業者により理解されよう。
プール：本明細書中で用いる場合、クロマトグラフィーに関して「プール」という用語は、一緒にカラムを通過した１つ以上の画分の液体を組み合わせることを指す。例えば、いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーにより分離されている試料の所望の成分を含有する１つ以上の画分（例えば、「ピーク画分」）は、一緒に「プールされて」単一の「プールされた」画分を形成し得る。
補充酵素：本明細書中で用いる場合、「補充酵素」という用語は、治療されるべき疾患において欠乏しているかまたは失われている酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態において、「補充酵素」という用語は、治療されるべきリソソーム蓄積症において欠乏しているかまたは失われている酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態において、補充酵素（例えば、ｒＡＳＡ）は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を低減させることができるか、あるいは１つ以上のリソソーム蓄積症（例えば、ＭＬＤ）の症状を救済または回復させ得る。本発明に適している補充酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を含み、組換えおよび合成方法を用いて生成され得るか、天然供給源から精製され得る。補充酵素は、組換え、合成、遺伝子活性化、または天然酵素であり得る。
可溶性：本明細書中で用いる場合、「可溶性」という用語は、均質溶液を形成する治療剤の能力を指す。いくつかの実施形態において、それが投与され、それが標的作用部位に輸送される溶液中の治療剤の溶解度は、標的作用部位への治療有効量の治療剤の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が治療剤の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響を及ぼし得る関連因子には、イオン強度、アミノ酸配列、および他の同時可溶化剤または塩（例えば、カルシウム塩）の存在が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明による治療剤は、その対応する薬学的組成物中で可溶性である。
安定性：本明細書中で用いる場合、「安定性」という用語は、長期間にわたって、その治療効力（例えば、その意図された生物学的活性および／または物理化学的完全性のすべてまたは大部分）を維持する治療剤（例えば、組換え酵素）の能力を指す。治療剤の安定性、ならびにこのような治療剤の安定性を維持する薬学的組成物の能力は、長期間（例えば、少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月間またはそれ以上）にわたって評価され得る。製剤の文脈において、安定な製剤は、貯蔵時およびプロセス（例えば、冷凍／解凍、機械的混合および凍結乾燥）中に、その中の治療剤が本質的にその物理的および／または化学的完全性および生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、高分子量（ＨＭＷ）集合体の形成、酵素活性の損失、ペプチド断片の生成、および電荷プロファイルの移動により測定され得る。
ウイルス処理：本明細書中で用いる場合、「ウイルス処理」という用語は、ウイルスが試料から単に除去される「ウイルス除去」（例えば、ウイルス濾過）、またはウイルスが試料中に留まるが非感染型である「ウイルス不活性化」を指す。いくつかの実施形態において、ウイルス除去は、とりわけ、ナノ濾過および／またはクロマトグラフィー技術を使用し得る。いくつかの実施形態において、ウイルス不活性化は、溶剤不活性化、洗剤不活性化、低温殺菌、酸性ｐＨ不活性化、および／または紫外線不活性化等を使用し得る。
詳細な説明
本発明は、とりわけ、酵素補充療法のために組換え技術によって生成されたＡＳＡタンパク質を精製するための改善された方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、クロマトグラフィー後の限外濾過／透析濾過の単一ステップのみを含むプロセスを用いて、不純調製物（例えば、未処理の生体材料、例えば、ＡＳＡを含有する細胞培養培地）からの組換えＡＳＡタンパク質を精製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、この単一ステップＵＦ／ＤＦプロセスは、クロマトグラフィーステップからの溶出物をプールし、プールした溶出物のｐＨを約６．０以上に調節することにより達成される。いくつかの実施形態において、この簡易化プロセスは、高負荷容量のクロマトグラフィーステップと組み合わせて、大規模な組換えＡＳＡタンパク質の生成を促進する。
本発明の様々な態様は、以下の下位項目にさらに詳細に記載されている。下位項目の使用は、本発明を限定することを意味しない。それぞれの下位項目は、本発明の任意の態様に適用し得る。本出願において、「または」の使用は、特に指定のない限り、「および／または」を意味する。
アリールスルファターゼＡ
アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ、ＡＲＳＡ、またはセレブロシド－スルファターゼ）は、セレブロシド３－硫酸塩（またはスルファチド）をセレブロシドおよび硫酸塩に分解する酵素である。具体的には、ガラクトシルスルファチドは、通常、リソソーム酵素であるアリールスルファターゼＡ（ＥＣ３．１．６．８）（Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９６４，９３，１５Ｃ－１７Ｃ）とサポシンＢと呼ばれるスフィンゴ脂質アクチベータタンパク質との組み合わされた作用を介して、３－Ｏ－硫酸塩結合の加水分解により代謝されて、ガラクトセレブロシドを形成する。アリールスルファターゼＡの欠失は、乳児後期、若年期、および成年の形態の異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）の患者のすべての組織に起こる。本明細書中で用いる場合、アリールスルファターゼＡタンパク質は、「ＡＳＡ」または「ＡＲＳＡ」と称され、サポシンＢは、「Ｓａｐ－Ｂ」と称される。
アリールスルファターゼＡは、低い等電点を有する酸性糖タンパク質である。ｐＨ６．５を超えると、酵素は、ほぼ１００ｋＤａの分子量を有するモノマーとして存在する。ＡＳＡは、酸性条件下（ｐＨ≦約５．０）、４８０ｋＤａの八量体として存在するが、中性ｐＨレベルで二量体に解離する。ヒトの尿において、この酵素は、６３および５４ｋＤａの２つの等しくないサブユニットからなる（Ｌａｉｄｌｅｒ ＰＭ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９８５，８２７，７３－８３）。ヒトの肝臓、胎盤、および繊維芽細胞から精製されたアリールスルファターゼＡもまた、５５～６４ｋＤａの間で変化するわずかに異なるサイズの２つのサブユニットからなる（Ｄｒａｐｅｒ
ＲＫ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９７６，１７７，５２５－５３８、Ｗａｈｅｅｄ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８２，３６３，４２５－４３０、Ｆｕｊｉｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９２，１５ １１２２，９３－９８）。他のリソソーム酵素の場合と同様に、アリールスルファターゼＡは、グリコシル化された前駆体として膜結合リボソーム上で合成される。次いで、小胞体およびゴルジを通過し、ここで、そのＮ結合オリゴ糖が、複合型のリン酸化および硫酸化オリゴ糖の形成とともにプロセシングを受ける（Ｗａｈｅｅｄ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９８５，８４７，５３－６１、Ｂｒａｕｌｋｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８７，１４３，１７８－１８５）。通常の培養繊維芽細胞においては、６２ｋＤａの前駆体ポリペプチドが産生され、マンノース－６－リン酸塩受容体結合（Ｂｒａｕｌｋｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９０，２６５，６６５０－６６５５）を介して酸性プレリソソームエンドソームに移行する（Ｋｅｌｌｙ ＢＭ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８９，４８，７１－７８）。
本明細書に記載される方法は、任意の源から、例えば、組織または培養細胞（例えば、アリールスルファターゼＡを組み換え技術により生成するヒト細胞（例えば、繊維芽細胞））からアリールスルファターゼＡを精製するために使用され得る。ヒトおよび他の動物、例えば、哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない、任意の起源のアリールスルファターゼＡが、本明細書に記載される方法により生成され得る。
ヒトアリールスルファターゼＡのシグナルペプチドの長さ（１８アミノ酸）は、共通配列およびシグナル配列についての特定のプロセシング部位に基づく。したがって、推定ヒトＡＳＡ ｃＤＮＡ（ＥＭＢＬ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０４５９３およびＸ５２１１５１）からは、残基番号１８（Ａｌａ）後ですべての細胞においてシグナルペプチドの切断が行われて、ヒトアリールスルファターゼＡの成熟型をもたらす。本明細書中で用いる場合、組換えアリールスルファターゼＡを「ｒＡＳＡ」と省略する。ヒトアリールスルファターゼＡの成熟型を含むアリールスルファターゼＡの成熟型を「ｍＡＳＡ」と称し、成熟組換えヒトＡＳＡを「ｍｒｈＡＳＡ」と称する。
アリールスルファターゼＡの複数の型は、ヒトの尿（Ｌｕｉｊｔｅｎ ＪＡＦＭ ｅｔ
ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１９７８，３，２１３）、白血球（Ｄｕｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９７５，２３，１１６－１１９、Ｍａｎｏｗｉｔｚ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｅｄ Ｍｅｔａｂ Ｂｉｏｌ．１９８８，３９，１１７－１２０）、血小板（Ｐｏｒｅｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９９２，２８７，９７９－９８３）、培養線維芽細胞（Ｗａｈｅｅｄ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８２，３６３，４２５－４３０、Ｓｔｅｖｅｎｓ ＲＬ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９７６，４４５，６６１－６７１、Ｆａｒｒｅｌｌ ＤＦ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９７９，２９，１６－２０）、および肝臓（Ｓｔｅｖｅｎｓ ＲＬ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９７６，４４５，６６１－６７１、Ｆａｒｒｅｌｌ ＤＦ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９７９，２９，１６－２０、Ｓａｒａｆｉａｎ ＴＡ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｅｄ．１９８５，３３，３７２－３８０）からの酵素調製物の電気泳動および等電点電気泳動で立証されている。エンドグリコシダーゼＨ、シアリダーゼ、およびアルカリホスファターゼでの処理により、電気泳動パターンの分子サイズおよび複雑度が減少し、このことは、アリールスルファターゼＡの電荷不均質性の多くが、酵素の炭水化物含量における変動によることを示唆する。
アリールスルファターゼＡの活性部位は、必須ヒスチジン残基（Ｌｅｅ ＧＤ ａｎｄ
Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎ ＲＬ，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９７５，１７１，４２４－４３４）および２つ以上のアルギニン残基（Ｊａｍｅｓ ＧＴ，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９７９，９７，５７－６２）を含有する。多くの陰イオンは、ミリモル範囲以下の濃度で酵素の阻害剤である。
ヒトアリールスルファターゼＡ遺伝子構造が、記載されている。本明細書中で用いる場合、この遺伝子を、「ＡＲＳＡ」と称する。しかしながら、「ＡＲＳＡ」はまた、場合によっては、アリールスルファターゼＡタンパク質を指し得る。ＡＲＳＡ遺伝子は、染色体２２（２２ｑｌ３．３１－ｑｔｅｒ）の長いアームの末端付近に位置し、３．２ｋｂにわたり（Ｋｒｅｙｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９１，６２７－６３１）、５０７アミノ酸酵素ユニットを特定化する８つのエクソンからなる（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８９，２６４，１２５２－１２５９）。２．１、３．７、および４．８ｋｂのメッセンジャーＲＮＡは、細胞により生成された活性アリールスルファターゼＡの大部分に明らかに関与する２．１ｋｂのメッセージを有する線維芽細胞中で検出された（Ｋｒｅｙｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９１，６２７－６３１）。ＡＲＳＡ配列は、アクセッション番号Ｘ５２１１５０を有するＥＭＢＬ ＧｅｎＢａｎｋで寄託されている。公開されたｃＤＮＡとＡＲＳＡのコード部分との差は、Ｋｒｅｙｓｉｎｇら（Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９１，６２７－６３１）により記載された。Ｓｔｅｉｎら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８９，２６４，１２５２－１２５９）により最初に記載されたｃＤＮＡ配列およびＫｒｅｙｓｉｎｇら（Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９１，６２７－６３１）により記載されたｃＤＮＡ配列は、それぞれ、アクセッション番号Ｊ０４５９３およびＸ５２１１５１を有するＥＭＢＬ ＧｅｎＢａｎｋで寄託されている。
いくつかの多型および４０超の疾患関連突然変異は、ＡＲＳＡ遺伝子において特定された（Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．１９９４，４，２３３－２４２、Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．１９９５，６，１７０－１７６、Ｄｒａｇｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．１９９７，９，２３４－２４２）。ＡＲＳＡ遺伝子遺伝子における疾患関連突然変異は、ＭＬＤの臨床上の表現型と公平にうまく相関する２つの幅広い群に分類され得る。一方の群（Ｉ）は、培養された動物細胞株に導入されたとき、活性酵素がなく、免疫反応性タンパク質がなく、ＡＳＡ活性を示さない。他方の群（Ａ）は、培養細胞中に少量の交差反応性物質および低レベルの機能酵素を生じる。群（Ｉ）突然変異に対して同型であるか、またはこの群から２つの異なる突然変異を有する個人は、乳児後期ＭＬＤと表す。１つの群（Ｉ）型および１つの群（Ａ）型の突然変異を有するほとんどの個人は、若年性発症型に発生し、２つの群（Ａ）型の突然変異を有するものは、概して、成人ＭＬＤを発症する。突然変異の一部は、比較的頻繁に見出されるが、その他は、単一のファミリーにおいてのみ検出される。多くの家族メンバーを通して特定の突然変異を追跡することは可能であるが、一般の担体スクリーニングは、依然として、実行可能ではない。
上述の疾患関連突然変異に加えて、いくつかの多型がＡＲＳＡ遺伝子において特定されている。非常に低いＡＳＡ活性は、ＭＬＤ患者のいくつかの臨床的に正常な患者においておよび一般集団においても見出された。このいわゆる偽欠損症ＡＳＡは、ＡＲＳＡ遺伝子の一般的な多型と関連している（Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９１，１３，２２２－２２７）。
組換えＡＳＡタンパク質
本明細書中で用いる場合、「組換えＡＳＡタンパク質」という用語は、天然に存在するアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質の少なくとも部分活性に代わる、あるいはＡＳＡ欠乏に関連する１つ以上の表現型または症状を救済することができる任意の分子または分子の一部を指す。本明細書中で用いる場合、「組換えＡＳＡ酵素」および「組換えＡＳＡタンパク質」という用語、ならびに文法的等価物は、交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、本発明は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質と実質的に同様または同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである組換えＡＳＡタンパク質を精製するために使用される。
典型的には、ヒトＡＳＡは、成熟型に対して処理される前駆体分子として生成される。このプロセスは、概して、１８アミノ酸シグナルペプチドを除去することにより起こる。典型的には、前駆体型はまた、５０７アミノ酸を含有する、完全長前駆体または完全長ＡＳＡタンパク質とも称される。Ｎ末端１８アミノ酸が切断され、４８９のアミノ酸長さである成熟型をもたらす。それ故に、Ｎ末端１８アミノ酸は、概して、ＡＳＡタンパク質活性に必要でないことが企図される。典型的な野生型または天然に存在するヒトＡＳＡタンパク質の成熟型（配列番号１）および完全長前駆体（配列番号２）のアミノ酸配列を、表１に示す。
Figure 2022023225000001
それ故に、いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号１）である。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、成熟ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体は、野生型または天然に存在するＡＳＡタンパク質（例えば、配列番号１）と比較して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む修飾された成熟ヒトＡＳＡタンパク質であり得るが、実質的なＡＳＡタンパク質の活性を保持する。それ故に、いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号１）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質の断片および一部を含む。
代替として、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、完全長ＡＳＡタンパク質である。いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、完全長ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、完全長ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体は、野生型または天然に存在するＡＳＡタンパク質（例えば、配列番号２）と比較して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む修飾された完全長ヒトＡＳＡタンパク質であり得るが、実質的なＡＳＡタンパク質の活性を保持する。それ故に、いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、完全長ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号２）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号２と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態により精製された組換えＡＳＡタンパク質は、完全長ヒトＡＳＡタンパク質の断片および一部を含む。本明細書中で用いる場合、完全長ＡＳＡタンパク質は、典型的には、シグナルペプチド配列を含む。
ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体は、そのような方法をまとめる参考文献に見出されるような当業者に知られているポリペプチド配列を変化させるための方法に従って調製され得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸の保存的置換は、以下の群、（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、および（ｇ）Ｅ、Ｄ内で、アミノ酸間でなされる置換を含む。いくつかの実施形態において、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的電荷またはサイズの特性を変化させない、アミノ酸置換を指す。
いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、細胞取り込みおよび／またはリソソームターゲッティングを促進するために標的細胞の表面上の受容体と結合する部分を含有し得る。例えば、そのような受容体は、マンノース－６－リン酸塩（Ｍ６Ｐ）残基と結合する陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸塩受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）であり得る。加えて、ＣＩ－ＭＰＲは、ＩＧＦ－ＩＩを含む他のタンパク質とも結合する。いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、タンパク質の表面上にＭ６Ｐ残基を含有する。特に、組換えＡＳＡタンパク質は、ＣＩ－ＭＰＲに対してより高い結合親和性を有するビス－ホスホリル化オリゴ糖を含有し得る。いくつかの実施形態において、好適な酵素は、酵素あたり約少なくとも２０％のビス－ホスホリル化オリゴ糖のほぼ平均まで含有する。他の実施形態において、好適な酵素は、１酵素あたり約１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％のビス－ホスホリル化オリゴ糖を含有し得る。
いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡ酵素は、標的細胞の表面上に受容体と結合することができるリソソームターゲッティングと融合し得る。好適なリソソームターゲッティング部分は、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７、およびその変異体、相同体、または断片（例えば、野生型成熟ヒトＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７ペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一の配列を有するこれらのペプチドを含む）であり得る。リソソームターゲッティング部分は、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部でＡＳＡタンパク質または酵素と共役されるか、または融合され得る。
組換えＡＳＡタンパク質の生成
本発明は、様々な手段により生成される組換えＡＳＡタンパク質を精製するために使用され得る。例えば、ＡＳＡタンパク質は、操作された宿主細胞系を使用して、ＡＳＡをコードする核酸を発現させることにより組み換え技術により生成され得る。代替として、ＡＳＡタンパク質は、内因性ＡＳＡ遺伝子を活性化することにより生成され得る。
本発明は、様々な発現系を用いて生成される組換えＡＳＡタンパク質を精製するために使用され得ることが企図される。好適な発現系には、例えば、卵細胞、バキュロウイルス、植物、酵母、または哺乳動物細胞が含まれる。
いくつかの実施形態において、ＡＳＡ酵素は、哺乳動物細胞において生成される。本発明に従って使用され得る哺乳動物細胞の非限定例には、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚性腎臓株（懸濁液培養中での増殖のためにサブクローン化されたＨＥＫ２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９，１９７７）、ヒト繊維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）、ハムスター幼仔腎細胞（ＢＨＫ２１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６，１９８０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１，１９８０）、サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）、ヒト子宮頚部癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８，１９８２）、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）が含まれる。
いくつかの実施形態において、本発明による発明方法は、ヒト細胞（例えば、ＨＴ１０８０）から産生される組換えＡＳＡ酵素を精製するために用いられる。いくつかの実施形態において、本発明による発明方法は、ＣＨＯ細胞から産生される組換えＡＳＡ酵素を精製するために用いられる。
典型的には、組換えＡＳＡを発現するように操作される細胞は、本明細書に記載される組換えＡＳＡタンパク質をコードするトランス遺伝子を含み得る。組換えＡＳＡをコードする核酸が、調節配列、遺伝子制御配列、プロモーター、非コード配列、および／または組換えＡＳＡを発現するための他の適切な配列を含み得ることを理解すべきである。典型的には、コード領域は、これらの核酸成分のうちの１つ以上と作動可能に連結される。
「調節配列」は、典型的には、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列を含み得る。時として、「調節配列」はまた、「遺伝子制御配列」とも称される。
「プロモーター」は、典型的には、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができるヌクレオチド配列を指す。概して、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流因子からなり、後者の因子は、しばしば、エンハンサーと称される。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるヌクレオチド配列であり、プロモーターの本質的な因子であっても、プロモーターのレベルまたは組織特異性を高めるために挿入された非相同因子であってもよい。プロモーターは、天然遺伝子からそれらの全体が由来するものであってもよく、あるいは自然界で見出される異なるプロモーターに由来する異なる因子から構成されてもよく、あるいは合成ヌクレオチド部分を含む。異なるプロモーターが異なる組織もしくは細胞型で、または成長の異なる段階で、または異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を指示することができることが当業者により理解される。
「３’非コード配列」は、典型的には、コード配列の下流に位置するヌクレオチド配列を指し、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列および他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクト（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことにより特徴付けられる。
「翻訳リーダー配列」または「５’非コード配列」は、典型的には、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡの安定性、または翻訳効率に影響を及ぼし得る。
典型的には、「作動的に連結される」または「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響を受けるように、単一の核酸断片上での２つ以上の核酸断片の会合を指す。例えば、プロモーターは、それが、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能であるとき、コード配列と作動的に連結される（すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で、調節配列に作動的に連結され得る。
トランス遺伝子のコード領域は、特定の細胞型に対するコドン使用頻度を最適化するために１つ以上のサイレント突然変異を含み得る。例えば、ＡＳＡトランス遺伝子のコドンは、脊椎動物細胞における発現のために最適化され得る。いくつかの実施形態において、ＡＳＡトランス遺伝子のコドンは、哺乳動物細胞における発現のために最適化され得る。いくつかの実施形態において、ＡＳＡトランス遺伝子のコドンは、ヒト細胞における発現のために最適化され得る。
任意に、構築物は、スプライス部位、エンヘンサー配列、適切なプロモーターの制御下での選択可能なマーカー遺伝子、適切なプロモーターの制御下での増幅可能なマーカー、およびマトリックス接着領域（ＭＡＲ）またはそれが挿入される領域の発現を増強する当該技術分野で知られている他の因子、のうちの１つ以上のようなさらなる成分を含有し得る。
一旦宿主細胞にトランスフェクトまたは形質導入されると、好適なベクターは、染色体外に（エピソームに）発現し得るか、または宿主細胞のゲノムに一体化され得る。
細胞培養培地および条件
様々な細胞培養培地および条件が、組換えＡＳＡタンパク質を生成するために使用され得る。例えば、組換えＡＳＡタンパク質は、血清含有または無血清培地中で生成され得る。いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、無血清培地中で生成される。いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、アニマルフリー培地、すなわち、動物由来成分を欠いている培地中で生成される。いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、既知組成培地中で生成される。本明細書中で用いる場合、「既知組成栄養培地」という用語は、実質的には、化学成分のすべてが知られている培地を指す。いくつかの実施形態において、既知組成栄養培地は、血清、血清由来タンパク質（例えば、アルブミンまたはフェツイン）、および他の成分等の動物由来成分がない。場合によっては、既知組成培地は、１つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質成長因子またはサイトカイン）を含む。場合によっては、既知組成栄養培地は、１つ以上のタンパク質加水分解物を含む。別の場合では、既知組成栄養培地は、無タンパク質培地、すなわち、タンパク質、加水分解物、または未知の組成物の成分を含有しない無血清培地である。
いくつかの実施形態において、既知組成培地は、１つ以上の動物由来成分が補充され得る。そのような動物由来成分には、ウシ胎仔血清、ウマ血清、ヤギ血清、ロバ血清、ヒト血清、およびアルブミン等の血清由来タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）が含まれるが、これらに限定されない。血清の添加は、それが構成成分、例えば、ビタミン、アミノ酸、成長因子、およびホルモンを含有するため所望であるが、それはまた、組換えタンパク質の精製を妨げ得る外因性タンパク質濃縮源も構成する。例えば、フェツインタンパク質は、細胞、主に肝細胞により分泌され、３つの特徴のあるドメインを有する関連血清タンパク質ファミリーである（Ｂｒｏｗｎ ＷＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２ Ａｐｒ １；２０５（１）：３２１－３１）。フェツインは、胎児期中豊富であり、したがって、しばしば、市販の胎児由来血清中で豊富であり、精製中、主要タンパク質の混入物質を構成する。それ故に、いくつかの実施形態において、好適な培地は、ゼノフリー（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）培地、例えば、いかなるウシ血清もウシ血清由来成分も含有しない培地である。例えば、ゼノフリー培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、およびヒト脂質のうちの１つ以上を含有し得る。いくつかの実施形態において、好適な培地は、フェツイン枯渇血清を含有する。フェツインは、当該技術分野で知られている様々な方法を用いて血清から激減され得る。例えば、フェツインは、抗体親和性クロマトグラフィーにより血清から激減され得る。（例えば、Ｔｏｒｏｉａｎ Ｄ ａｎｄ Ｐｒｉｃｅ ＰＡ，Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ（２００８）８２：１１６－１２６を参照のこと）。いくつかの実施形態において、好適な培地は、フェツインフリーである。
様々な細胞培養条件は、ローラーボトル培養、バイオリアクター培養、およびバイオリアクターバッチ培養、およびバイオリアクター供給バッチ培養が含まれるが、これらに限定されない、大規模に組換えＡＳＡタンパク質を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、懸濁液中で培養された細胞により生成される。いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、付着細胞により生成される。
組換えアリールスルファターゼＡの精製
本発明の実施形態は、アリールスルファターゼＡ（「ＡＳＡ」）、具体的には、組換えヒトＡＳＡ（「ｒｈＡＳＡ」）、原薬の生成のための精製プロセスを含む。様々な技術が、全体または一部において、任意に本明細書に記載される修飾を伴って、精製されたＡＳＡ原薬を生成するために使用され得る。例えば、図１は、本発明の実施形態の汎用フローダイヤグラムを示す。この例示的な精製プロセスは、ｒｈＡＳＡ未精製バルク（ＵＰＢ）の解凍およびプールから始まり、次いで、捕捉され、限外濾過および透析濾過（「ＵＦＤＦ」）により濾過される。濾過後、捕捉された物質は、クロマトグラフィー精製前に、ウイルス不活性化（示されず）され得る。特定の示された実施形態において、次の４つの精製プロセスステップが、一連の４つのクロマトグラフィーカラム：陰イオン交換カラム（例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（「Ｑ－ＦＦ」）カラム）、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩ（ＨＡ）カラム、フェニルカラム、および陽イオン交換（例えば、ＳＰ）カラムを使用する。４番目および最終のクロマトグラフィーステップ後、ＳＰ溶出物を濃縮し、接線流限外濾過を用いて透析濾過する。次いで、結果として得られた濾液を濾過し（例えば、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎウイルス減少フィルターを通して）、続いて、第２の濃縮および限外濾過ステップにより、標的タンパク質濃度を達成する。なお、図２は、本発明の別の例示的な実施形態を示す。このプロセスは、図１のように任意に、１つ以上の異なるクロマトグラフィー樹脂（例えば、ＴＭＡＥ陰イオン交換樹脂）を用いて開始する。４番目および最終のクロマトグラフィーステップ後、ＳＰ溶出物をプールし、プールのｐＨを調整する。いくつかの実施形態において、ｐＨは、５．５～６．５（例えば、約６．０）に調整される。次いで、結果として得られたｐＨを調整した陽イオン交換をウイルス濾過し、続いて、単一の濃縮および透析濾過ステップにより、最終的な標的タンパク質濃度を達成する。これらのプロセスの任意の改善およびさらなる実施形態が、本明細書に記載される。
本明細書中で用いる場合、「混入物質」は、所望のポリペプチド生成物、例えば、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）とは異なる物質である。混入物質は、所望のポリペプチドの変異体（例えば、所望のポリペプチドの脱アミド化変異体またはアミノ－アスパラギン酸塩変異体）または別の分子、例えば、ポリペプチド、核酸、およびエンドトキシン等であり得る。
本明細書中で用いる場合、ポリペプチドおよび１つ以上の混入物質を含む組成物または試料からポリペプチドを「精製する」とは、組成物または試料から少なくとも１つの混入物質を除去する（完全にまたは部分的に）ことにより組成物または試料中のポリペプチドの純度を増加させることを意味する。「精製ステップ」は、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、９９重量％、９９．５重量％、９９．６重量％、９９．７重量％、９９．８重量％、または９９．９重量％の対象となるポリペプチドを含む組成物をもたらす全精製プロセスの一部であり得る。アリールスルファターゼＡの純度は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウェスタンブロット、ＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除ＨＰＬＣのうちの１つ以上により測定され得る。いくつかの実施形態において、精製されたアリールスルファターゼＡの比活性は、例えば、本明細書に記載される方法により測定されるように、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、７０Ｕ／ｍｇ、８０Ｕ／ｍｇ、９０Ｕ／ｍｇ、１００Ｕ／ｍｇ、１１０Ｕ／ｍｇ、１２０Ｕ／ｍｇ、１３０Ｕ／ｍｇ、１４０Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、例えば、本明細書に記載される方法により測定されるように、約５０～２００Ｕ／ｍｇの範囲（例えば、約５０～１９０Ｕ／ｍｇ、５０～１８０Ｕ／ｍｇ、５０～１７０Ｕ／ｍｇ、５０～１６０Ｕ／ｍｇ、５０～１５０Ｕ／ｍｇ、５０～１４０Ｕ／ｍｇ、５０～１３０Ｕ／ｍｇ、５０～１２０Ｕ／ｍｇ、５０～１１０Ｕ／ｍｇ、５０～１００Ｕ／ｍｇ、６０～１４０Ｕ／ｍｇ、６０～１３０Ｕ／ｍｇ、６０～１２０Ｕ／ｍｇ、６０～１１０Ｕ／ｍｇ、６０～１００Ｕ／ｍｇ、７０～１４０Ｕ／ｍｇ、７０～１３０Ｕ／ｍｇ、７０～１２０Ｕ／ｍｇ、７０～１１０Ｕ／ｍｇ、７０～１００Ｕ／ｍｇ、８０～１４０Ｕ／ｍｇ、８０～１３０Ｕ／ｍｇ、８０～１２０Ｕ／ｍｇ、８０～１１０Ｕ／ｍｇ、８０～１００Ｕ／ｍｇ、９０～１４０Ｕ／ｍｇ、９０～１３０Ｕ／ｍｇ、９０～１２０Ｕ／ｍｇ、９０～１１０Ｕ／ｍｇ、９０～１００Ｕ／ｍｇ、１００～１４０Ｕ／ｍｇ、１００～１３０Ｕ／ｍｇ、１００～１２０Ｕ／ｍｇ、１００～１１０Ｕ／ｍｇ、１１０～１４０Ｕ／ｍｇ、１１０～１３０Ｕ／ｍｇ、１１０～１２０Ｕ／ｍｇ、１２０～１４０Ｕ／ｍｇ、１２０～１３０Ｕ／ｍｇ、または１３０～１４０Ｕ／ｍｇ）の比活性を有する。
精製プロセスのための出発材料は、任意の不純調製物である。例えば、不純調製物は、ＡＳＡタンパク質を生成する細胞（例えば、哺乳動物細胞）から分泌される組換えＡＳＡタンパク質を含有する未処理の細胞培養培地またはＡＳＡタンパク質を含有する生の細胞溶解物であり得る。いくつかの実施形態において、不純調製物は、部分的に処理された細胞培地または細胞溶解物であり得る。例えば、細胞培地または細胞溶解物は、ウイルス不活性化、ウイルス処理、またはウイルス除去により濃縮、希釈、処理され得る。いくつかの実施形態において、ウイルス除去は、とりわけ、ナノ濾過および／またはクロマトグラフィー技術を使用し得る。いくつかの実施形態において、ウイルス不活性化は、溶剤不活性化、洗剤不活性化、低温殺菌、酸性ｐＨ不活性化、および／または紫外線不活性化を使用し得る。細胞培地または細胞溶解物はまた、宿主細胞タンパク質および／または核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）のレベルを減少させるために、プロテアーゼ、ＤＮａｓｅｓ、および／またはＲＮａｓｅｓにより処理され得る。いくつかの実施形態において、未処理または部分的に処理された生体材料（例えば、細胞培地または細胞溶解物）は、期間中、冷凍され、所望の温度（例えば、２～８℃、－４℃、－２５℃、－７５℃）で保存され、精製のために解凍され得る。本明細書中で用いる場合、不純調製物はまた、出発材料または負荷材料とも称される。
本明細書に記載される精製方法としては、深層濾過、ウイルス不活性化、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、および／または陽イオン交換クロマトグラフィー）、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、限外濾過／透析濾過、およびウイルス除去濾過、のステップのうちの１つ以上が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される精製方法は、親和性クロマトグラフィーをさらに含む。
クロマトグラフィーステップにおいて、クロマトグラフィーカラムに充填されるとき使用された適切な量の樹脂は、カラムの寸法、すなわち、カラムの直径および樹脂の高さが反映され、例えば、適用された溶液中のタンパク質の量および使用された樹脂の結合能力に応じて異なる。しかしながら、工業規模でのＡＳＡの製造および精製を得るために、製造プロセスおよび精製プロセスの規模を増大させることは、本開示の範囲内である。したがって、カラムのサイズ、直径、および流量等のパラメーターは、そのような大規模な製造の速度および効率と適合させるために増大させ得る。いくつかの実施形態において、カラムの直径は、約５０～１００ｍｍの範囲であり、体積は、約１００～３００ｍｌの範囲であり、流量は、約４０～４００ｃｍ／時（例えば、約１００ｃｍ／時～１５０ｃｍ／時）または約５～１００ｍｌの範囲である。
限外濾過－捕捉
本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に開示される精製方法は、潅流バイオリアクターから生成されたＡＳＡ（例えば、ヒト組換えＡＳＡ）を捕捉するために、上流の限外濾過の１つ以上のステップを含む。限外濾過は、本明細書中で用いる場合、溶解分子（タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、および他の生体分子）を濃縮および脱塩する、緩衝液を交換する、および全体の分別のために使用され得る０．００１～０．１μｍの大きさのフィルター細孔径を用いる膜濾過を指す。本発明の実施形態で用いる限外濾過方法は、接線流限外濾過または交差流濾過を含む。
接線流濾過および限外濾過は、本明細書中で用いる場合、一部分は膜（透過する）を通過するが、残り（保有する（ｒｅｔｅｎａｔｅ））は供給容器に戻って再循環するとき、供給流が膜面に対して平行に通過する配置を指す。いくつかの実施形態において、接線流限外濾過フィルターの細孔径は、組換えＡＳＡがフィルターを通って透過することができるように選択される。他の実施形態において、細孔径は、フィルター上を通過する供給において実質的には、すべてのＡＳＡを保有するように選択される。他の箇所に記述されるように、ＡＳＡは、酸性条件下（ｐＨ≦約５．０）、４８０ｋＤａの八量体として存在するが、中性ｐＨレベルで二量体に解離する。したがって、供給のｐＨは、フィルター膜上にＡＳＡを保持するか、またはそれを透過物として通過を可能にするために、適切な細孔径の選択と組み合わせて調整され得る。
少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａ、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも３００ｋＤａ、少なくとも４００ｋＤａ、または少なくとも５００ｋＤａの分子量カットオフを有する細孔径が、選択され得る。例えば、少なくとも１０ｋＤａの細孔径を有するフィルターは、供給において、約１１ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質の大部分を保持する。別例として、少なくとも４００ｋＤａの細孔径のフィルターは、４００ｋＤａ超の分子量を有するタンパク質の大部分を保持する。いくつかの実施形態において、供給保持率は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上である。同様に、細孔径は、特定の大きさの透過物の単離のために選択され得る。例えば、少なくとも５００ｋＤａの細孔径を有するフィルターは、５００ｋＤａ未満の分子量を有するタンパク質の大部分の透過を可能にする。いくつかの実施形態において、透過率は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上である。
濾過面積または容量はまた、本明細書に開示されるプロセスで用いるために最適化され得る。濾過面積の選択に影響を及ぼす考慮には、ロバスト性、費用、供給流速（すなわち、交差流速）、膜間圧、透過流束速度、設備の適合、およびスループットが含まれる。いくつかの実施形態において、透過流束は、約５０～１００リットル／ｍ２／時（「ＬＭＨ」）である。いくつかの実施形態において、供給流は、合計約２５０～６００ＬＭＨである。いくつかの実施形態において、供給流は、合計約２５０～３５０ＬＭＨである。いくつかの実施形態において、供給流は、合計約１７５～２４５ＬＭＨである。いくつかの実施形態において、供給流は、合計約１７０～２３０ＬＭＨである。いくつかの実施形態において、供給流は、合計約１２０～１６０ＬＭＨである。いくつかの実施形態において、供給流は、合計約１５～３０ＬＭＨである。いくつかの実施形態において、供給流は、合計約１１～２１ＬＭＨである。いくつかの実施形態において、濾過面積は、約０．０２ｍ２、約０．１４ｍ２、約０．７、または約３．５ｍ２である。特定の実施形態において、膜間圧は、合計約５５～６０ｐｓｉである。いくつかの実施形態において、膜間圧は、合計約１５～２５ｐｓｉである。いくつかの実施形態において、膜間圧は、合計約１０～２０ｐｓｉである。いくつかの実施形態において、膜間圧は、約５～１５ｐｓｉである。
本発明の実施形態で用いるための限外濾過フィルターは、ポリエーテルスルホンおよび安定化セルロースが含まれるが、これらに限定されない、当業者に知られている膜材料を含み得る。本発明の実施形態で用いるためのある例示的なフィルターカセットは、ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＥＣＯ（登録商標）である。本発明の実施形態で用いるためのある別の例示的なフィルターカセットは、ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＨＹＤＲＯＳＡＲＴ（登録商標）３０ｋＤの標準的な膜である。
深層濾過
本明細書に記載される精製方法は、深層濾過の１つ以上のステップを含み得る。深層フィルターは、媒体の表面の直上というよりむしろ、媒体を通して粒子を保持するために多孔質濾過媒体を用いる様々なフィルターである。深層フィルターは、段階的密度を有する濾過媒体を含み、より大きな粒子がフィルターの表面付近で捕捉する一方、より小さい粒子はフィルターの表面でより大きな開口した領域を透過し、フィルターの中央により近い、より小さい開きのみで捕捉することが可能になる。ある実施形態が、上流回復段階中（すなわち、その後のクロマトグラフィーの精製ステップ前）のみ深層濾過ステップを用いるが、他の実施形態は、精製の１つ以上のさらなる段階中、深層フィルターを用いる。本発明のいくつかの実施形態において、Ｃｕｎｏ Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ深層フィルターが使用される。
深層濾過の後には、任意に、０．４５ミクロン（±２μｍ）の濾過を行い、下流処理プロセスのための調製において、微粒子を除去し、バイオバーデンを減少させ得る。
ウイルス不活性化
本明細書に記載される精製方法は、ウイルス不活性化の１つ以上のステップを含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルス不活性化は、溶剤および／または洗剤を含む。溶剤または洗剤は、例えば、ポリソルベート８０、トリ－ｎ－ブチル－リン酸塩（ＴｎＢＰ）、またはその両方を含み得る。ウイルス不活性化は、溶剤または洗剤中の３～２４時間のインキュベーションを含み得る。別の実施形態において、ウイルス不活性化は、例えば、Ｐｌａｎｏｖａ（商標）フィルターを用いることによるウイルス濾過を含む。
これらの方法は、酵素の調製物を生じさせることを目的とし、実質的には、感染性ウイルスがなく、「ウイルス安全性製品」と示され得ることが理解される。加えて、様々な方法は、独立して、または組み合わせて使用され得ることが企図される。
ウイルス不活性化は、酵素を含む溶液への１つ以上の「ウイルス不活性化剤」の添加により達成され得る。いくつかの実施形態において、薬剤が医薬品として使用されるとき、または製品が医薬品の調製のために使用されるとき、製品の安全性を危うくするであろう任意の量または濃度で最終製品中に存在しないことを保証するために、ウイルス不活性化ステップは、クロマトグラフィー精製ステップ前（すなわち、第１のクロマトグラフィーカラム上に不純調製物を負荷する前）に行われ、他の実施形態は、精製の１つ以上のさらなる段階中、深層フィルターを使用する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明による発明方法は、最後のクロマトグラフィーカラム後のウイルス除去のステップをさらに含む。
「ウイルス不活性化剤」という用語は、脂質エンベロープウイルスならびに非脂質エンベロープウイルスを不活性化するために使用され得る薬剤（例えば、洗剤）または方法を示すことを目的とする。「ウイルス不活性化剤」という用語は、それが適切であればいつでも、そのような薬剤および／または方法の組み合わせ、並びにそのような薬剤または方法の１つの種類のみの両方を包含するとして理解されるべきである。
典型的なウイルス不活性化剤は、洗剤および／または溶剤、最も典型的には、洗剤－溶剤の混合物である。ウイルス不活性化剤は、任意に、１つ以上の洗剤と１つ以上の溶剤の混合物であることを理解されるべきである。様々な洗剤および溶剤は、ウイルス不活性化のために使用され得る。洗剤は、非イオン性およびイオン性洗剤からなる群から選択され得、実質的には、非変性であるように選択される。典型的には、非イオン性洗剤は、その後の精製ステップにおいてｒＡＳＡ調製物から洗剤のその後の排除を促進するために使用される。好適な洗剤は、例えば、Ｓｈａｎｂｒｏｍらの米国特許第４，３１４，９９７号および米国特許第４，３１５，９１９号において記載されている。典型的な洗剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００およびＴｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０の商標下で販売されるものである。ウイルス不活性化剤で用いるために好ましい溶剤は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｈｏｒｏｗｉｔｚにより米国特許第４，７６４，３６９号において記載されるようなジまたはトリアルキルリン酸塩である。典型的な溶剤は、トリ（ｎ－ブチル）リン酸塩（ＴｎＢＰ）である。本発明の実践のために特に好ましいウイルス不活性化剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０であるが、代替として、他の薬剤または薬剤の組み合わせが使用され得る。典型的な薬剤は、ＡＳＡを含有する溶液中のＴｗｅｅｎ－８０の濃度が、約０．５～４．０重量％の範囲内で、好ましくは、約１重量％の濃度であるような体積で添加された。次いで、ＴｎＢＰは、ＡＳＡを含有する試料の新しい体積に基づいて計算された０．３％の最終濃縮物に添加され得る。
ウイルス不活性化ステップは、実質的にはウイルス安全性のあるｒｈＡＳＡ含有溶液をもたらすエンベロープウイルスを不活性化する条件下で行われる。概して、そのような条件には、４～３７℃の温度、例えば、１９～２８℃、２３～２７℃、典型的には、約２５℃、および検証研究により有効であることが見出されるインキュベーション時間が含まれる。概して、十分なウイルス不活性化を保証するためには、１～２４時間のインキュベーション時間、好ましくは、１０～１８時間、例えば、約１４時間が十分である。しかしながら、適切な条件（温度およびインキュベーション時間）は、使用されるウイルス不活性化剤、ｐＨ、ならびに溶液のタンパク質濃度および脂質含量により異なる。
ウイルスの除去または不活性化のための他の方法はまた、紫外線を用いた放射によるその後の不活性化を伴うメチレンブルーの添加等のウイルス安全性製品を生成するために使用され得る。
本明細書に記載される精製方法は、ウイルス除去濾過の１つ以上のステップを含み得る。典型的には、ウイルス濾過は、クロマトグラフィーの１つ以上のステップによる酵素の精製後に行われる。いくつかの実施形態において、ウイルス濾過ステップは、滅菌フィルターを通した精製ステップの結果である溶液を含有するＡＳＡの通過、続いて、ナノフィルターを通した滅菌濾過された溶液の通過フィルターにより行われる。「滅菌フィルター」とは、実質的には、感染を伝播および／または生じることが可能なすべての微生物を除去するフィルターを意味する。フィルターが約０．１ミクロンの細孔径を有することが典型であるのに対して、この細孔径は約０．０５～０．３ミクロンの範囲であり得る。試料を洗剤と接触させる精製プロセスにおいて行われるように、試料のウイルス濾過を置き換える、または合わせることは実行可能であり得る。
本発明のいくつかの実施形態は、ウイルス不活性化および／または濾過の少なくとも２つのステップを含む。例えば、カラムクロマトグラフィー前のウイルス不活性化は、クロマトグラフィーステップのすべてが完了した後のウイルス除去と組み合わせられ得る。クロマトグラフィー後のウイルス除去は、限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）の１つ以上のステップ（例えば、接線流限外濾過）の前または後に行われ得る。特定の例において、溶出物は、クロマトグラフィー精製の最終ステップ（例えば、陽イオン交換（ＳＰ）クロマトグラフィー）から得られ、溶出プールのｐＨは、約５．５、約６．０、約６．５、または約７．０に調整され、続いて、ウイルス濾過を行う。それ故に、ある特定の実施形態において、ＵＦＤＦの単一ステップは、ウイルス濾過（例えば、Ｐｌａｎｏｖａ（商標）フィルターを用いて）により始まる。他の例において、クロマトグラフィー精製の最終ステップ（例えば、陽イオン交換（ＳＰ）クロマトグラフィー）から得られる溶出物は、ｐＨ調整なしにＵＦＤＦの第１のステップに供され、続いて、ウイルス濾過およびＵＦＤＦの第２のステップに供される。
ある実施形態において、ｐＨを調整した陽イオン交換の溶出物プールは、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎフィルター上でウイルス濾過される。いくつかの実施形態において、Ａ２８０吸光度により評価されるように、ｐＨを調整した陽イオン交換の溶出物のウイルス濾過後のインプットと比較した収率は、約９０～１００％、すなわち、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上である。それ故に、いくつかの実施形態において、本質的には、ウイルス濾過中に失われる組換えＡＳＡはない。約６．０に調整したｐＨが、ＡＳＡの八量体（直径約２０ｎｍである）を二量体形に解離することができることを実証するように、ウイルス濾過に対する収率は、有意である。それ故に、ウイルスフィルターの細孔径は、二量体形のみが濾過される（すなわち、八量体形がフィルターにより保持され得るか、またはウイルスフィルターの閉塞を生じる）ことを確保するために選択され得る。例えば、２０ｎｍの細孔径を有するウイルスフィルターは、ＡＳＡの八量体形を保持するが、二量体形は保持しない。
親和性クロマトグラフィー
本明細書に記載される精製方法は、親和性クロマトグラフィー（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー、および／または固定化リガンド親和性クロマトグラフィー）の１つ以上のステップを含み得る。
簡潔に言えば、親和性クロマトグラフィーは、例えば、受容体とリガンド、抗原と抗体、または酵素と基質との間のような高度に特異的な相互作用に依存するクロマトグラフィー技術である。当業者により知られているように、本明細書に記載される精製方法において親和性クロマトグラフィーステップに使用される選択的分子は、選択的分子により利用され得る組み換え技術により生成されるＡＳＡの様々な特性（例えば、三次元構造、グリコシル化等）に基づき得る。親和性クロマトグラフィーステップにおいて使用され得る例示的な選択的分子（または捕捉試薬）には、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、抗体、金属イオン（例えば、ニッケル）、特異的基質、リガンド、または抗原が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明の親和性クロマトグラフィーステップに適している選択的分子は、抗アリールスルファターゼＡ抗体（例えば、抗ヒトアリールスルファターゼＡ抗体）を使用する。好適な抗アリールスルファターゼＡ抗体は、商業的に得られても、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、またはヒトタンパク質に対して抗体を生成するための他の好適な動物）の免疫化を通して得られてもよい。
概して、対象となる分子（例えば、組換えＡＳＡ）は、選択的分子との相互作用を通して固体または固定相または培地上で捕捉される一方、他の望ましくない分子は、選択的分子（複数を含む）により結合されない場合、捕捉されない。次いで、固体培地は、混合物から除去され、任意に洗浄され、対象となる分子が溶出による取り込みから放出され得る。いくつかの実施形態において、親和性カラムは、勾配を通してイオン強度を変化させることにより溶出され得る。例えば、塩濃度、ｐＨ、ｐＩ、およびイオン強度は、分離するまたは勾配を形成して分離するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、親和性クロマトグラフィーにより精製を促進するために、タグを用いて生成され得る。当業者により知られているように、タンパク質タグには、とりわけ、例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等が含まれ得る。いくつかの実施形態において、レクチンは、試料内の成分を分離するために、親和性クロマトグラフィーにおいて使用される。例えば、ある特定のレクチンは、特定の炭水化物分子と特異的に結合し、糖タンパク質を非グリコシル化タンパク質から、またはある糖型を別の糖型から分離するために使用され得る。
イオン交換クロマトグラフィー
本明細書に記載される精製方法は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／または陽イオン交換クロマトグラフィー）の１つ以上のステップを含み得る。
当業者に知られているように、イオン交換体（例えば、陰イオン交換体および／または陽イオン交換体）は、マトリックスならびに付着した電荷基に対して様々な材料に基づき得る。例えば、アガロース系（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＣＬ－６Ｂ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ ＦｌｏｗおよびＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ等）、セルロース系（ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＣＥＬ（登録商標）等）、デキストラン系（ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）等）、シリカ系、および合成ポリマー系のマトリックスが使用され得、言及される材料がほぼ架橋され得る。
イオン交換樹脂は、既知の方法に従って調製され得る。典型的には、樹脂がその対イオンと結合することができる平衡緩衝液は、樹脂上にポリペプチおよび１つ以上の混入物質を含む試料または組成物を負荷する前にイオン交換樹脂を通過させることができる。便宜上、平衡緩衝液は、負荷緩衝液と同一であり得るが、これは必要ではない。
本発明の任意の実施形態において、イオン交換樹脂は、ポリペプチドの溶出後の再生緩衝液で再生され得、そのため、このカラムは再利用され得る。概して、再生緩衝液の塩濃度および／またはｐＨは、実質的にすべての混入物質および対象となるポリペプチドがイオン交換樹脂から溶出されるようなものであり得る。概して、再生緩衝液は、イオン交換樹脂から混入物質およびポリペプチドを溶出するために非常に高い塩濃度を有する。
陰イオン交換クロマトグラフィー
本発明の実施形態は、例えば、アリールスルファターゼＡ（例えば、組換えアリールスルファターゼＡ）の試料を提供することと、試料を陰イオン交換クロマトグラフィー、例えば、本明細書に記載される陰イオン交換クロマトグラフィーに供することと、を含む。陰イオン交換樹脂のために、マトリックスに共有結合される電荷基は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）、および／または第４級アンモニウム（Ｑ）である得る。いくつかの実施形態において、使用される陰イオン交換樹脂は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムである。陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＸＬ、ＣＡＰＴＯ（商標）Ｑ、ＤＥＡＥ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧＩＧＡＣＡＰ（登録商標）Ｑ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル、第４級アンモニア樹脂）、ＥＳＨＭＵＮＯ（商標）Ｑ、ＮＵＶＩＡ（商標）Ｑ、またはＵＮＯＳＰＨＥＲＥ（商標）Ｑを用いて行われ得る。他の陰イオン交換体は、本発明の範囲内で使用され得、これには、第４級アミン樹脂または「Ｑ－樹脂」（例えば、ＣＡＰＴＯ（商標）－Ｑ、Ｑ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標））；ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）樹脂（例えば、ＤＥＡＥ－ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ（登録商標）、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、ベンゾイル化ナフトイル化ＤＥＡＥ、ジエチルアミノエチルＳＥＰＨＡＣＥＬ（登録商標））；ＡＭＢＥＲＪＥＴ（登録商標）樹脂；ＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）樹脂；ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）樹脂（例えば、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＩＲＡ－６７、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）強塩基性、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）弱塩基性）、コレスチラミン樹脂、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）樹脂（例えば、ＰＲＯＰＡＣ（登録商標）ＳＡＸ－１０、ＰＲＯＰＡＣ（登録商標）ＷＡＸ－１０、ＰＲＯＰＡＣ（登録商標）ＷＣＸ－１０）；ＴＳＫ－ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ－ＮＰＲ；ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ－５ＰＷ）；ならびにＡＣＣＬＡＩＭ（登録商標）樹脂が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を陰イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約２３℃以下、約１８℃以下、約１６℃以下、例えば、約２３℃、約２０℃、約１８℃、または約１６℃の温度で行われる。
陰イオン交換クロマトグラフィーのための典型的な移動相は、比較的極性な溶液、例えば、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、およびイソプロパノール等の有機アルコール、または２－（Ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含む溶液を含む。それ故に、ある特定の実施形態において、移動相は、約０％、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％の極性溶液を含む。ある実施形態において、移動相は、分離の経過中、任意の所定の時間で、約１％～約１００％、約５％～約９５％、約１０％～約９０％、約２０％～約８０％、約３０％～約７０％、または約４０％～約６０％の極性溶液を含む。
ある実施形態において、ｒＡＳＡは、約２３ＡＵ／Ｌ樹脂以下、例えば、約１９ＡＵ／Ｌ樹脂以下、約１５ＡＵ／Ｌ樹脂以下、または約１２ＡＵ／Ｌ樹脂以下、例えば、約１２ＡＵ／Ｌ樹脂～約１５ＡＵ／Ｌ樹脂、または約１５ＡＵ／Ｌ樹脂～約１９ＡＵ／Ｌ樹脂の結合容量で負荷される。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料は、少なくとも約４．５ｇ／Ｌ樹脂（例えば、少なくとも約５ｇ／Ｌ樹脂、６ｇ／Ｌ樹脂、７ｇ／Ｌ樹脂、８ｇ／Ｌ樹脂、９ｇ／Ｌ樹脂、１０ｇ／Ｌ樹脂、１１ｇ／Ｌ樹脂、１２ｇ／Ｌ樹脂、１３ｇ／Ｌ樹脂、１４ｇ／Ｌ樹脂、または１５ｇ／Ｌ樹脂）の結合容量で陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上に負荷される。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料は、約４．５～２０ｇ／Ｌ樹脂の範囲（例えば、約５～２０ｇ／Ｌ樹脂；５～１９ｇ／Ｌ樹脂、５～１８ｇ／Ｌ樹脂、５～１７ｇ／Ｌ樹脂、５～１６ｇ／Ｌ樹脂、５～１５ｇ／Ｌ樹脂、７．５～２０ｇ／Ｌ樹脂、７．５～１９ｇ／Ｌ樹脂、７．５～１８ｇ／Ｌ樹脂、７．５～１７ｇ／Ｌ樹脂、７．５～１６ｇ／Ｌ樹脂、７．５～１５ｇ／Ｌ樹脂、１０～２０ｇ／Ｌ樹脂、１０～１９ｇ／Ｌ樹脂、１０～１８ｇ／Ｌ樹脂、１０～１７ｇ／Ｌ樹脂、１０～１６ｇ／Ｌ樹脂、または１０～１５ｇ／Ｌ樹脂の範囲）の結合容量で陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上に負荷される。
ＡＳＡおよび混入物質（複数を含む）を含む水溶液は、ポリペプチドおよび混入物質が陰イオン交換樹脂と結合するように、塩濃度および／またはｐＨを有する負荷緩衝液を用いて移動相として陰イオン樹脂に負荷させ得る。次いで、樹脂を、１つ以上のカラム体積の負荷緩衝液で洗浄し、続いて、１つ以上のカラム体積の洗浄緩衝液で洗浄し、塩濃度を増加させ得る。最終的に、ＡＳＡは、塩濃度を増加させる溶出緩衝液により溶出され得る。任意に、酵素の溶出はまた、徐々にまたは段階的にｐＨを減少させることにより媒介され得る。ＡＳＡ活性を含む画分は、さらなる精製のために回収され、組み合わせられ得る。
いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料の陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上への負荷は、負荷緩衝液を用いて行われる。一実施形態において、この負荷緩衝液は、塩化ナトリウムを含有しない。別の実施形態において、この負荷緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、負荷緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、例えば、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、または約５ｍＭ～約１０ｍＭである。いくつかの実施形態において、移動相における塩濃度は、勾配（例えば、線形または非線形勾配）である。いくつかの実施形態において、移動相における塩濃度は、一定である。いくつかの実施形態において、移動相における塩濃度は、段階的に増加または減少し得る。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料の陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上への負荷は、約５～約９、例えば、約６～約８、例えば、約７のｐＨで行われる。
いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムの洗浄は、１つ以上の洗浄緩衝液を用いて行われる。例えば、陰イオン交換カラムの洗浄は、２つ以上の（例えば、第１および第２の）洗浄ステップを含むことができ、それぞれ、異なる洗浄緩衝液を用いる。一実施形態において、この洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含有しない。別の実施形態において、この洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、洗浄緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、例えば、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、例えば、約８０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、または約１４０ｍＭである。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムの洗浄は、約５～約９、例えば、約６～約８、例えば、約７のｐＨで行われる。
一実施形態において、この溶出緩衝液は、リン酸ナトリウムを含有する。例えば、溶出緩衝液のリン酸ナトリウム濃度は、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、例えば、約２５ｍＭ～約４５ｍＭ、例えば、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、または約４０ｍＭである。別の実施形態において、この溶出緩衝液は、塩化ナトリウムを含有しない。さらに別の実施形態において、この溶出緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、溶出緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、例えば、約２４０ｍＭ～約２８０ｍＭである。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからのアリールスルファターゼＡの溶出は、約５～約９、例えば、約６～約８、例えば、約７のｐＨで行われる。
いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからのアリールスルファターゼＡの溶出は、１つ以上のステップの溶出ピーク回収を含む。例えば、溶出ピーク回収は、例えば、分光測光により、例えば、２８０ｎＭで測定されるように、上昇する面で約５０ｍＡＵから始まり、下降する面で約５０ｍＡＵまで、例えば、上昇する面で約１００ｍＡＵから下降する面で約５０ｍＡＵまで、上昇する面で約２００ｍＡＵから下降する面で約５０ｍＡＵまで、上昇する面で約５０ｍＡＵから下降する面で約１００ｍＡＵまで、上昇する面で約５０ｍＡＵから下降する面で約２００ｍＡＵまで、または上昇する面で約１００ｍＡＵから下降する面で約１００ｍＡＵまでである。
多くの異なる緩衝液が、負荷、洗浄、および溶出ステップにおいて使用され得ることは、当業者には明らかである。しかしながら、典型的には、カラムは、０．０５ＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０を含む緩衝液の１～１０カラムの洗浄で平衡化され得る。便宜上、試料を、精製プロセスの前述のステップからの緩衝液中に負荷し得るか、または試料を、負荷緩衝液を用いて負荷し得る。カラムは、平衡化のために使用される１～１０カラム体積の緩衝液で洗浄され、続いて、０．０２ＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、０．１２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含む洗浄緩衝液で洗浄され得る。代替として、カラムは、陰イオン交換クロマトグラフィーのために、本明細書に記載される任意の他の平衡、負荷、および洗浄緩衝液を用いて平衡化、負荷、および洗浄され得る。試料は、０．０２ＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、０．２６ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含む緩衝液中に溶出され得る。代替として、試料は、陰イオン交換クロマトグラフィーのために、本明細書に記載される任意の他の溶出緩衝液中に溶出され得る。
本明細書に記載される負荷緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含み得る。例えば、緩衝剤は、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせであり得る。緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～５ｍＭ、約５ｍＭ～１０ｍＭ、約１０ｍＭ～５０ｍＭ、または約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。
陰イオン交換クロマトグラフィー後の収率、活性、および純度は、変化し得る。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの活性収率は、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８５％、例えば、約８５％～約９９％、または約９０％～約９９％である。いくつかの実施形態において、タンパク質の収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、例えば、分光測光により、例えば、２８０ｎｍで測定されるように、約１０％～５０％、例えば、約２０％～約３５％、または約２５％～約３０％である。いくつかの実施形態において（例えば、以下に記載されるＴＭＡＥカラムを用いるもの）、溶出プールタンパク質の活性収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、例えば、分光測光により、例えば、２８０ｎｍで測定されるように、約７０％～４００％、例えば、約８０％～約３９０％、または約９０％～約３５０％、または約１００％～１５０％、少なくとも９５％超である。いくつかの実施形態において（例えば、以下に記載されるＴＭＡＥカラムを用いるもの）、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）は、約０．５～約１．１、例えば、約０．６～０．９、または約０．７～０．８である。いくつかの実施形態において（例えば、以下に記載されるＴＭＡＥカラムを用いるもの）、純度は、例えば、キャピラリー電気泳動－ＳＤＳ ＰＡＧＥにより測定されるように、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれ以上である。好ましい実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー後の活性収率、ＨＣＰ ＬＲＶ、および純度（キャピラリー電気泳動－ＳＤＳ ＰＡＧＥにより測定されるように）は、それぞれ、少なくとも約９０％、少なくとも約０．６、および少なくとも約８０％である。
本発明の好ましい実施形態において、高い負荷容量を有する陰イオン交換カラムが使用される。本発明の実施形態において、カラムは、約３～２０ｇ／Ｌの充填範囲（すなわち、約５～１５ｇ／Ｌ、約１０～１５ｇ／Ｌ、約１０～２０ｇ／Ｌ）により特徴付けられる。いくつかの実施形態において、負荷容量は、４．３ｇ／Ｌよりも著しく多い（例えば、約１０ｇ／Ｌ、１２．５ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１７．５ｇ／Ｌ、または２０ｇ／Ｌ以上である）。ある実施形態において、樹脂の結合容量は、約７５～１００ＡＵ／Ｌ（例えば、約７５ＡＵ／Ｌ、約８０ＡＵ／Ｌ、約８５ＡＵ／Ｌ、約９０ＡＵ／Ｌ、約９５ＡＵ／Ｌ）である。ある実施形態において、負荷容量は、約８０ＡＵ／Ｌ超である。いくつかの実施形態において、高い負荷容量のカラムは、ＴＭＡＥカラムである。特定の実施形態において、カラムは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥカラム、Ｎｕｖｉａ Ｑカラム、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム、Ｃａｐｔｏ Ｑカラム、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬカラム、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｑカラム、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｑカラム、またはＧｉｇａＣａｐ Ｑカラムからなる群から選択される。
本発明の特定の実施形態において、ＴＭＡＥカラムは、ｐＨ７．０で、約２０ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓおよび１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて予め平衡化される。ある実施形態において、カラムは、ｐＨ７．０で、５０ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓを含む緩衝液を用いて平衡化される。いくつかの実施形態において、ＴＭＡＥカラムの負荷流量は、約７５～１２５ｃｍ／時（すなわち、約７５～１１５ｃｍ／時、約７５～１１０ｃｍ／時、約７５～１０５ｃｍ／時、約７５～１００ｃｍ／時、約８５～１１５ｃｍ／時、約８５～１１０ｃｍ／時、約８５～１０５ｃｍ／時、約８５～１００ｃｍ／時、約９５～１１５ｃｍ／時、約９５～１１０ｃｍ／時、約９５～１０５ｃｍ／時、約９５～１００ｃｍ／時、約１００～１２０ｃｍ／時、約１００～１１５ｃｍ／時、約１００～１１０ｃｍ／時、約１００ｃｍ／時）である。負荷条件は、本明細書に記載されるように、最適化され、Ａ２８０の吸光度により評価され得る。
ＴＭＡＥカラム（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥカラム）を使用する特定の実施形態において、生成物は、１５ｇ／Ｌ超の負荷容量であっても、負荷中のフロースルーで失われる生成物はほとんどない。フロースルーの損失を最小限に抑えつつ、負荷容量を増加させる能力は、精製方法論において著しい改善である。本発明の特定の実施形態において、フロースルー製品損失の量は、負荷の３０％未満（例えば、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満）である。
いくつかの実施形態において、負荷後、ＴＭＡＥカラムは、少なくとも１回洗浄される。特定の実施形態において、カラムは、２回洗浄される。第１または第２の洗浄緩衝液は、最適化レベルの塩化ナトリウムを含み得る。いくつかの実施形態において、第１または第２の洗浄緩衝液である塩化ナトリウムの量は、約５０～１５０ｍＭ（例えば、約５０～１４０ｍＭ、約５０～１３０ｍＭ、約５０～１２０ｍＭ、約５０～１１０ｍＭ、約５０～１００ｍＭ、約５０～９０ｍＭ、約５０～８０ｍＭ、約８０～１５０ｍＭ、約８０～１４０ｍＭ、約８０～１３０ｍＭ、約８０～１２０ｍＭ、約８０～１１０ｍＭ、約８０～１００ｍＭ、約８０～９０ｍＭ、約８０ｍＭ、または約１２０ｍＭ）である。いくつかの実施形態において、第１の洗浄緩衝液は、ｐＨ７．０で５０ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓを含む。いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝液は、ｐＨ７．０で２０ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌを含む。洗浄条件、具体的には、第２の洗浄条件のさらなる最適化が、本発明の実施形態内に包含される。例えば、第２の洗浄の塩濃度の増加は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）および全純度を改善し得るが、活性およびＡ２８０の収率の両方を減少させる。本明細書に記載されるように、特定の洗浄条件は、純度、活性、および収率の最適な組み合わせを提供するために、以下に記載される溶出条件により平衡を保ち得る。
本発明の実施形態において、ＴＭＡＥカラムと結合する組換えＡＳＡは、溶出緩衝液で溶出される。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液中の塩化ナトリウムの量は最適化される。特定の実施形態において、溶出緩衝液中の塩化ナトリウムの量は、約１５０～３００ｍＭ（例えば、約１５０～２９０ｍＭ、約１５０～２８０ｍＭ、約１５０～２７０ｍＭ、約１５０～２６０ｍＭ、約１５０～２５０ｍＭ、約１５０～２４０ｍＭ、約１５０～２３０ｍＭ、約１５０～２２０ｍＭ、約１５０～２１０ｍＭ、約１７０～２９０ｍＭ、約１７０～２８０ｍＭ、約１７０～２７０ｍＭ、約１７０～２６０ｍＭ、約１７０～２５０ｍＭ、約１７０～２４０ｍＭ、約１７０～２３０ｍＭ、約１７０～２２０ｍＭ、約１７０～２１０ｍＭ 約１８０～２９０ｍＭ、約１８０～２８０ｍＭ、約１８０～２７０ｍＭ、約１８０～２６０ｍＭ、約１８０～２５０ｍＭ、約１８０～２４０ｍＭ、約１８０～２３０ｍＭ、約１８０～２２０ｍＭ、約１８０～２１０ｍＭ、約１８０、約２２０、または約２６０）である。特定の例において、溶出緩衝液は、ｐＨ７．０で５０ｍＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓおよび１ＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、溶出後のＡ２８０の収率は、負荷の６０％超（例えば、約６０％、約７０％、約８０％またはそれ以上）である。溶出条件のさらなる最適化が、本発明の実施形態内に包含される。例えば、溶出塩濃度の増加（すなわち、伝導性）は、より良好な収率を提供するが、より不良な純度およびＨＣＰ除去をもたらす。上述のように、特定の洗浄条件は、純度、活性、および収率の最適な組み合わせを提供するために、溶出条件により平衡を保たなければならない。
陽イオン交換クロマトグラフィー
いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、本明細書に記載されるように、アリールスルファターゼＡの試料を、陽イオン交換クロマトグラフィー、例えば、スルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換クロマトグラフィーに供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料は、陽イオン交換クロマトグラフィー前に、陰イオン交換クロマトグラフィーに供される。典型的な実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、スルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換クロマトグラフィーを含むが、他の陽イオンクロマトグラフィー膜または樹脂は、例えば、ＭＵＳＴＡＮＧ（商標）Ｓメンブレン、Ｓ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）樹脂、またはＢｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）樹脂を使用することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、限外濾過および／または透析濾過により、例えば、接線流限外濾過によりアリールスルファターゼＡの試料を濃縮および／または濾過することをさらに含む。陽イオン交換クロマトグラフィーは、標的結合を増強する、および／または不純物結合を減少させるために、例えば、本明細書に記載されるように、最適温度で行われ得る。例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーは、約２３℃、１８℃、１６℃、またはそれ以下の温度で行われ得る。
一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、スルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換クロマトグラフィーを含む。別の実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、仕上げ精製（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）ステップである。陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、スルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換クロマトグラフィー）は、例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＳＰ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＳＰ－５５０、ＴＳＫＧＥＬ（登録商標）ＳＰ－３ＰＷ、ＴＳＫＧＥＬ（登録商標）ＳＰ－５ＰＷ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＸＬ、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ（登録商標）Ｓメンブレン、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０、ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ（商標）Ｓ、およびＭＡＣＲＯＣＡＰ（商標）Ｓ、のうちの１つ以上を用いて行われ得る。
アリールスルファターゼＡおよび混入物質（複数を含む）を含む水溶液は、ポリペプチドおよび混入物質が陽イオン交換樹脂と結合するように、塩濃度および／またはｐＨを有する負荷緩衝液を用いて陽イオン樹脂上に負荷させ得る。次いで、樹脂を、１つ以上のカラム体積の平衡化バターまたは負荷緩衝液、続いて、１つ以上のカラム体積の洗浄緩衝液を用いて洗浄し、塩濃度を増加させ得る。最終的に、アリールスルファターゼＡは、溶出緩衝液中に溶出され得る。アリールスルファターゼＡ活性を含む画分は、さらなる精製のために回収され、組み合わせられ得る。
典型的な実施形態において、負荷緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度および／またはｐＨは、標的結合を増強する、および／または不純物結合を減少させるために、例えば、本明細書に記載されるように、最適化され得る。いくつかの実施形態において、負荷緩衝液中のＮａＣｌ濃度は、約２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭまたはそれ以下である。いくつかの実施形態において、負荷緩衝液は、約４．５、４．３、４．０またはそれ以下のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液中のＮａＣｌ濃度は、約２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭまたはそれ以下である。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液中のＮａＣｌ濃度は、約５５ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭまたはそれ以下である。
いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することには、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオンクロマトグラフィーカラム（例えば、スルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換カラム）上に負荷させることと、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを洗浄することと、カラムからアリールスルファターゼＡを溶出することと、を含む。いくつかの実施形態において、カラムは、３超、例えば、５～１０カラム体積の０．０１ＭのＮａＡｃ、０．０１ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍの酢酸、ｐＨ４．２で平衡化され得る。
いくつかの実施形態において、試料を、精製プロセスの前述のステップからの緩衝液中に負荷し得るか、または試料を、負荷緩衝液を用いて負荷し得る。一実施形態において、負荷緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、負荷緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、例えば、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、例えば、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、または約２０ｍＭである。別の実施形態において、負荷緩衝液は、酢酸ナトリウムを含有する。例えば、負荷緩衝液の酢酸ナトリウム濃度は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約６０ｍＭである。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムへの負荷は、約３．０～約６．０、例えば、約４．０～約５．０、例えば、約４．０、約４．３、または約４．５のｐＨで行われる。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料は、約１５ＡＵ／Ｌ樹脂以下、例えば、約１４ＡＵ／Ｌ樹脂以下、または約１２ＡＵ／Ｌ樹脂以下、例えば、約１０ＡＵ／Ｌ樹脂～約１４ＡＵ／Ｌ樹脂、または約１０ＡＵ／Ｌ樹脂～約１２ＡＵ／Ｌ樹脂の結合容量で、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に負荷される。
いくつかの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの洗浄は、１つ以上の洗浄緩衝液を用いて行われる。例えば、陽イオン交換カラムの洗浄は、２つ以上の（例えば、第１および第２の）洗浄ステップを含むことができ、それぞれ、異なる洗浄緩衝液を用いる。カラムは、１～１０カラム体積の平衡のために使用される緩衝液を用いて洗浄され得る。代替として、カラムは、陽イオン交換クロマトグラフィーのために、本明細書に記載される任意の他の平衡、負荷、および洗浄緩衝液を用いて平衡化、負荷、および洗浄され得る。一実施形態において、洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、洗浄緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、例えば、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、または約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、例えば、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、または約２０ｍＭである。別の実施形態において、洗浄緩衝液は、酢酸ナトリウムを含有する。例えば、負荷緩衝液の酢酸ナトリウム濃度は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約６０ｍＭである。いくつかの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの洗浄は、約３．０～約６．０、例えば、約４．０～約５．０、例えば、約４．０、約４．３、または約４．５のｐＨで行われる。
いくつかの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムからのアリールスルファターゼＡの溶出は、溶出緩衝液を用いて行われる。一実施形態において、溶出緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、溶出緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約２５ｍＭ～約７５ｍＭ、例えば、約４５ｍＭ～約６０ｍＭ、例えば、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、または約５５ｍＭである。いくつかの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムからのアリールスルファターゼＡの溶出は、約３．０～約６．０、例えば、約４．０～約５．０、例えば、約４．０、約４．３、または約４．５のｐＨで行われる。それ故に、１つの特定の例として、試料は、０．０２ＭのＮａＡｃ、０．０５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５を含む緩衝液中に溶出され得る。代替として、試料は、陽イオン交換クロマトグラフィーのために、本明細書に記載される任意の他の溶出緩衝液中に溶出され得る。
いくつかの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムからのアリールスルファターゼＡの溶出は、溶出ピーク回収の１つ以上のステップを含む。例えば、溶出ピーク回収は、例えば、分光測光により、例えば、２８０ｎＭで測定されるように、上昇する面で約５０ｍＡＵから始まり、下降する面で約５０ｍＡＵまで、例えば、上昇する面で約１００ｍＡＵから下降する面で約５０ｍＡＵまで、上昇する面で約２００ｍＡＵから下降する面で約５０ｍＡＵまで、上昇する面で約５０ｍＡＵから下降する面で約１００ｍＡＵまで、上昇する面で約５０ｍＡＵから下降する面で約２００ｍＡＵまで、または上昇する面で約１００ｍＡＵから下降する面で約１００ｍＡＵまでである。回収された溶出ピークは、プールされ得る。
本明細書に記載される負荷緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含み得る。例えば、この緩衝剤は、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせであり得る。緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～５ｍＭ、約５ｍＭ～１０ｍＭ、約１０ｍＭ～５０ｍＭ、または約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。
いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約２３℃以下、約１８℃以下、約１６℃以下、例えば、約２３℃、約２０℃、約１８℃、または約１６℃の温度で行われる。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約２３℃～約１６℃、例えば、約２３℃、約２０℃、約１８℃、または約１６℃で行われ、アリールスルファターゼＡの試料の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムへの負荷は、約４．５～約４．３、例えば、約４．５、約４．４、または約４．３のｐＨで行われる。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約２３℃で行われ、アリールスルファターゼＡの試料の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムへの負荷は、ｐＨ約４．５で行われる。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約２３℃で行われ、アリールスルファターゼＡの試料の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムへの負荷は、ｐＨ約４．３で行われる。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約１８℃で行われ、アリールスルファターゼＡの試料の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムへの負荷は、ｐＨ約４．５で行われる。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約１８℃で行われ、アリールスルファターゼＡの試料の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムへの負荷は、ｐＨ約４．３で行われる。
陽イオン交換クロマトグラフィー後の収率は変化し得る。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの活性収率は、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、約８０％～約１０５％である。いくつかの実施形態において、タンパク質収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、例えば、分光測光により、例えば、２８０ｎｍで測定されるように、約６５％～１００％、例えば、約７０％～約９５％である。
陽イオン交換クロマトグラフィー後の純度および活性は、大いに改善される。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）は、約１．０～約２．５、例えば、約１．５～約２．０、または約１．７～約１．９である。精製されたアリールスルファターゼＡの比活性は、例えば、本明細書に記載される方法により測定されるように、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ～約１４０Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも約７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約１００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約１２０Ｕ／ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％まで精製される。アリールスルファターゼＡの純度は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウェスタンブロット、ＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除ＨＰＬＣのうちの１つ以上により測定され得る。ある実施形態において、負荷緩衝液の塩濃度の減少およびそのｐＨの低下は、陽イオン交換カラムへのＡＳＡの結合を増強するが、不純物の結合に影響を及ぼさない。換言すれば、上述のように、塩濃度およびｐＨの最適バランスは、純度に悪影響を及ぼすことなく、陽イオン交換クロマトグラフィー後の収率を増加させ得る。
いくつかの実施形態において、陽イオン交換溶出プールのｐＨは調整され得る。ある実施形態において、ｐＨは、ウイルス濾過直前に調整される。陽イオン溶出物（例えば、ＳＰ溶出物）は、０．２５Ｍのリン酸ナトリウム、１．３３Ｍの塩化ナトリウム、０．３４Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含むｐＨ調整緩衝液を用いて、ｐＨを約５．５、約６．０ 約６．５、または約７．０に調整され得る。ある実施形態において、ｐＨを調整したＳＰ溶出物プールは、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎフィルター上でウイルス濾過される。いくつかの実施形態において、Ａ２８０吸光度により評価されるように、ｐＨを調整した陽イオン交換の溶出物のウイルス濾過後のインプットと比較した収率は、約９０～１００％、すなわち、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上である。約６．０に調整したｐＨが、ＡＳＡの八量体（直径約２０ｎｍである）を二量体形に解離することができることを実証するように、ウイルス濾過に対する収率は、有意である。それ故に、ウイルスフィルターの細孔径は、二量体形のみが濾過される（すなわち、八量体形がフィルターにより保持され得るか、またはウイルスフィルターの閉塞を生じる）ことを確保するために選択され得る。例えば、２０ｎｍの細孔径を有するウイルスフィルターは、ＡＳＡの八量体形を保持するが、二量体形は保持しない。
混合モードクロマトグラフィー
本明細書に記載される精製方法は、混合モードクロマトグラフィーの１つ以上のステップを含み得る。混合モードクロマトグラフィーは、一種のクロマトグラフィーであり、典型的には、液体クロマトグラフィーにおいて、いくつかの分離様式を適用して、異なる分子の混合物を還元する。例えば、混合モードの分離は、同時に、イオン交換を用いた組み合わせ相および逆相の特徴を含み得る。１つを超える相互作用型を有するこれらの固定相は、いくつかのカラム製造業者から入手可能である。
一態様において、本開示は、試料からアリールスルファターゼＡを精製する方法を特徴とし、本方法は、例えば、アリールスルファターゼＡ（例えば、組換えアリールスルファターゼＡ）の試料を提供することと、アリールスルファターゼＡの試料を混合モードクロマトグラフィー、例えば、セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー、例えば、ヒドロキシアパタイトタイプＩまたはタイプＩＩクロマトグラフィーを含む方法等の本明細書に記載される混合モードクロマトグラフィーに供することと、を含む。いくつかの実施形態において、混合モードクロマトグラフィーは、ＣＨＴ（商標）セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩ培地、ＣＨＴ（商標）セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩＩ培地、ＢＩＯ－ＧＥＬ（登録商標）ＨＴヒドロキシアパタイト、およびＢＩＯ－ＧＥＬ（登録商標）ＨＴＰヒドロキシアパタイトのうちの１つ以上を用いて行われる。
いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を、混合モードクロマトグラフィーを供することには、アリールスルファターゼＡの試料を混合モードクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＡクロマトグラフィー）上に負荷させることと、混合モードクロマトグラフィーカラムを洗浄することと、カラムからアリールスルファターゼＡを溶出することと、を含む。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を、混合モード交換クロマトグラフィーを供することは、約２３℃以下、約１８℃以下、約１６℃以下、例えば、約２３℃、約２０℃、約１８℃、または約１６℃の温度で行われる。
いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を混合モードクロマトグラフィーカラム上に負荷することは、負荷緩衝液を用いて行われる。一実施形態において、負荷緩衝液は、リン酸ナトリウムを含有する。例えば、負荷緩衝液のリン酸ナトリウム濃度は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約２ｍＭ、または約５ｍＭである。別の実施形態において、負荷緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、負荷緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、例えば、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、例えば、約２２０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２６０ｍＭ、または約２８０ｍＭである。
いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料の混合モードクロマトグラフィーカラム上への負荷は、約５～約９、例えば、約６～約８、例えば、約７のｐＨで行われる。
いくつかの実施形態において、混合モードクロマトグラフィーは、セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーを含む。ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）は、通常、リン酸カルシウムの結晶形態を指す。ＨＡＰの機構は、樹脂上の負電荷を持つタンパク質カルボキシル基と正電荷を持つカルシウムイオン、および樹脂上の正電荷を持つタンパク質アミノ基と負電荷を持つリン酸イオンとの間の非特異的な相互作用を含む。塩基性または酸性タンパク質は、緩衝液のｐＨを調整することによりカラム上に選択的に吸着され得、溶出は、緩衝液の塩濃度を変化させることにより達成され得る。さらに、多くの緩衝液組成物ならびに緩衝液の組み合わせが使用され得ることが明らかである。しかしながら、典型的には、カラムは、０．００１ＭのＮａＰＯ４、０．０２ＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、０．２６ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含む緩衝液の１～１０カラム洗浄で平衡化され得る。便宜上、試料を、精製プロセスの前述のステップからの緩衝液中に負荷し得るか、または試料を、負荷緩衝液を用いて負荷し得る。カラムは、平衡化のために使用される１～１０カラム体積の緩衝液で洗浄され、続いて、０．００５ＭのＮａＰＯ４、０．０２ＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、０．２６ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含む洗浄緩衝液で洗浄され得る。代替として、カラムは、混合モードクロマトグラフィーのために、本明細書に記載される任意の他の平衡、負荷、および洗浄緩衝液を用いて平衡化、負荷、および洗浄され得る。試料は、０．０４ＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．０を含む緩衝液中に溶出され得る。任意に、カラムは、１～１０カラム体積の０．４ＭのＮａＰＯ４、ｐＨ１２で洗浄することにより取り除かれ得る。代替として、試料は、混合モードクロマトグラフィーのために、本明細書に記載される任意の他の溶出緩衝液中に溶出され得る。
いくつかの実施形態において、混合モードクロマトグラフィーカラムの洗浄は、１つ以上の洗浄緩衝液を用いて行われる。例えば、混合モードクロマトグラフィーカラムの洗浄は、２つ以上の（例えば、第１および第２の）洗浄ステップを含むことができ、それぞれ、異なる洗浄緩衝液を用いる。
一実施形態において、洗浄緩衝液は、リン酸ナトリウムを含有する。例えば、洗浄緩衝液のリン酸ナトリウム濃度は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、または約１０ｍＭである。別の実施形態において、洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、洗浄緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約５０ｍＭ～約６００ｍＭ、例えば、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、または約２００～約４００ｍＭ、例えば、約２２０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２６０ｍＭ、または約２８０ｍＭである。
いくつかの実施形態において、混合モードクロマトグラフィーカラムの洗浄は、約５～約９、例えば、約６～約８、例えば、約７のｐＨで行われる。
いくつかの実施形態において、混合モードクロマトグラフィーカラムからのアリールスルファターゼＡの溶出は、約５～約９、例えば、約６～約８、例えば、約７のｐＨで行われる。いくつかの実施形態において、混合モードクロマトグラフィーカラムからのアリールスルファターゼＡの溶出は、溶出ピーク回収の１つ以上のステップを含む。例えば、溶出ピーク回収は、例えば、分光測光により、例えば、２８０ｎＭで測定されるように、上昇する面で約５０ｍＡＵから始まり、下降する面で約５０ｍＡＵまで、例えば、上昇する面で約１００ｍＡＵから下降する面で約５０ｍＡＵまで、上昇する面で約２００ｍＡＵから下降する面で約５０ｍＡＵまで、上昇する面で約５０ｍＡＵから下降する面で約１００ｍＡＵまで、上昇する面で約５０ｍＡＵから下降する面で約２００ｍＡＵまで、または上昇する面で約１００ｍＡＵから下降する面で約１００ｍＡＵまでである。
本明細書に記載される負荷緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含み得る。例えば、緩衝剤は、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせであり得る。緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～５ｍＭ、約５ｍＭ～１０ｍＭ、約１０ｍＭ～５０ｍＭ、または約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。
いくつかの実施形態において、混合モードクロマトグラフィーによるＡＳＡの精製は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）による精製の後に続く。しかしながら、これらのステップは、逆の順序で行われ得る。
混合モードクロマトグラフィー後の収率は、変化し得る。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの活性収率は、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、約８０％～約１１５％である。いくつかの実施形態において、タンパク質収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、例えば、分光測光により、例えば、２８０ｎｍで測定されるように、約３０％～８０％、例えば、約３５％～約７５％、または約５０％～約７０％である。
混合モードクロマトグラフィー後の純度は、大いに改善される。いくつかの実施形態において、精製されたアリールスルファターゼＡの比活性は、例えば、本明細書に記載される方法により測定されるように、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ～約１４０Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも約７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約１００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約１２０Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％まで精製される。アリールスルファターゼＡの純度は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウェスタンブロット、ＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除ＨＰＬＣのうちの１つ以上により測定され得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）は、約０．３～約０．６、例えば、約０．４～０．５である。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
本明細書に記載される精製方法は、アリールスルファターゼＡの試料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供することを含み得る。一実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニルクロマトグラフィーを含む。他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ブチルクロマトグラフィーまたはオクチルクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料をＨＩＣに供することは、約２３℃以下、約１８℃以下、または約１６℃以下、例えば、約２３℃、約２０℃、約１８℃、または約１６℃の温度で行われる。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料は、ＨＩＣ前に混合モードクロマトグラフィーに供される。
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、極性または非極性環境における所与の分子の引力を利用し、タンパク質に関して、この傾向は、タンパク質の曝露された外表面上で残基の疎水性または親水性により制御される。それ故に、タンパク質は、疎水性マトリックスへの引力の変化する度合い、典型的には、２～１８個の炭素の鎖長のアルキルリンカーアームを有する不活性な支持体に基づいて分画される。固定相は、親水性ポリマー骨格（例えば、架橋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、デキストラン、またはアガロース）に結合した小さな非極性基（ブチル、オクチル、またはフェニル）からなる。それ故に、ＨＩＣカラムは、典型的には、ブチルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラムまたはフェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラム、最も典型的には、フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラムである。いくつかの実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｌｏｗ ｓｕｂ）、またはフェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）のうちの１つ以上を用いるフェニルクロマトグラフィーを含む。
いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することは、アリールスルファターゼＡの試料をＨＩＣカラム上に負荷することと、ＨＩＣカラムを洗浄することと、カラムからアリールスルファターゼＡを溶出することと、を含む。ＨＩＣにおける負荷、洗浄、および溶出は、基本的に、イオン交換クロマトグラフィーについて上述されるものと同じ原理が続くが、しばしば、イオン交換クロマトグラフィーにおいて使用されるものとほぼ反対の条件が適用される。それ故に、ＨＩＣのプロセスは、タンパク質をほぐして、疎水性部位を露出させる高塩濃度負荷緩衝液の使用を伴う。タンパク質は、カラムの疎水性リガンドにより保持され、塩濃度が低下しつつある緩衝液勾配にさらされる。塩濃度が低下すると、タンパク質は、その自然な構造に戻り、最終的には、カラムから溶出する。代替として、タンパク質は、ＰＥＧで溶出され得る。
いくつかの実施形態において、ＨＩＣカラム上へのアリールスルファターゼＡの試料の負荷は、負荷緩衝液を用いて行われる。一実施形態において、負荷緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、負荷緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約０．５Ｍ～約２．５Ｍ、例えば、約１Ｍまたは約１．５Ｍである。別の実施形態において、負荷緩衝液は、リン酸ナトリウムを含有する。例えば、負荷緩衝液のリン酸ナトリウム濃度は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約７５ｍＭである。いくつかの実施形態において、ＨＩＣカラム上へのアリールスルファターゼＡの試料の負荷は、約５～約７、例えば、約５．５～約６．５、例えば、約５．５、約６．０、または約６．５のｐＨで行われる。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの試料は、約１２ＡＵ／Ｌ樹脂以下、例えば、約１０ＡＵ／Ｌ樹脂以下、約９ＡＵ／Ｌ樹脂以下、約７ＡＵ／Ｌ樹脂以下、または約５ＡＵ／Ｌ樹脂以下、例えば、約５ＡＵ／Ｌ樹脂～約９ＡＵ／Ｌ樹脂、または約５ＡＵ／Ｌ樹脂～約７ＡＵ／Ｌ樹脂の結合容量で負荷される。
ＨＩＣにおける固相としてフェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）の使用は、本開示では、一般的である。さらに、正確な条件、ならびに負荷、洗浄、および溶出プロセスに使用される緩衝液および緩衝液の組み合わせになるとき、多数の異なる可能性が存在することが容易に理解されよう。典型的な実施形態において、カラムは、０．０５ＭのＮａＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含有する緩衝液中に平衡化され得る。便宜上、試料を、精製プロセスの前述のステップからの緩衝液中に負荷し得るか、または試料を、負荷緩衝液を用いて負荷し得る。
いくつかの実施形態において、ＨＩＣカラムの洗浄は、１つ以上の洗浄緩衝液を用いて行われる。例えば、ＨＩＣカラムの洗浄は、２つ以上の（例えば、第１および第２の）洗浄ステップを含むことができ、それぞれ、異なる洗浄緩衝液を用いる。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、洗浄緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約１００ｍＭ～約１．５Ｍ、例えば、約２５０ｍＭ～約１Ｍ、例えば、約２５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約７５０ｍＭ、または約１Ｍである。別の実施形態において、洗浄緩衝液は、リン酸ナトリウムを含有する。例えば、負荷緩衝液のリン酸ナトリウム濃度は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約７５ｍＭである。いくつかの実施形態において、ＨＩＣカラムの洗浄は、約５～約７、例えば、約５．５～約６．５、例えば、約５．５、約６．０、または約６．５のｐＨで行われる。例えば、洗浄は、平衡緩衝液の１～２カラム洗浄を用いて行われ、続いて、１～５カラム体積の０．０２ＭのＭＥＳ、０．０５ＭのＮａＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を用いて行われ得る。代替として、カラムは、ＨＩＣのために本明細書に記載される任意の他の平衡、負荷、および洗浄緩衝液を用いて平衡化、負荷、および洗浄され得る。
いくつかの実施形態において、ＨＩＣカラムからのアリールスルファターゼＡの溶出は、溶出緩衝液を用いて行われる。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、溶出緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば、約４５ｍＭ～約８５ｍＭ、例えば、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、または約８０ｍＭである。いくつかの実施形態において、ＨＩＣカラムからのアリールスルファターゼＡの溶出は、約５～約９、例えば、約６～約８、例えば、約７のｐＨで行われる。例えば、アリールスルファターゼＡは、０．０２ＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、０．０６ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて溶出され得る。代替として、試料は、ＨＩＣのために本明細書に記載される任意の他の溶出緩衝液中に溶出され得る。
いくつかの実施形態において、ＨＩＣカラムからのアリールスルファターゼＡの溶出は、溶出ピーク回収の１つ以上のステップを含む。例えば、溶出ピーク回収は、例えば、分光測光により、例えば、２８０ｎＭで測定されるように、上昇する面で約５０ｍＡＵから始まり、下降する面で約５０ｍＡＵまで、例えば、上昇する面で約１００ｍＡＵから下降する面で約５０ｍＡＵまで、上昇する面で約２００ｍＡＵから下降する面で約５０ｍＡＵまで、上昇する面で約５０ｍＡＵから下降する面で約１００ｍＡＵまで、上昇する面で約５０ｍＡＵから下降する面で約２００ｍＡＵまで、または上昇する面で約１００ｍＡＵから下降する面で約１００ｍＡＵまでである。
いくつかの実施形態において、ＨＩＣによるアリールスルファターゼＡの精製は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）および／または混合モードクロマトグラフィーによる精製の後に続く。しかしながら、これらのステップは、逆の順序で行われ得る。
本明細書に記載される負荷緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含み得る。例えば、緩衝剤は、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせであり得る。緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～５ｍＭ、約５ｍＭ～１０ｍＭ、約１０ｍＭ～５０ｍＭ、または約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。
ＨＩＣ後の収率は、変化し得る。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡの活性収率は、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、約７０％～約１００％である。いくつかの実施形態において、タンパク質収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、例えば、分光測光により、例えば、２８０ｎｍで測定されるように、約４５％～１００％、例えば、約５０％～約９５％、または約５５％～約９０％である。
ＨＩＣ後の純度は、大いに改善される。いくつかの実施形態において、精製されたアリールスルファターゼＡの比活性は、例えば、本明細書に記載される方法により測定されるように、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ～約１４０Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも約７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約１００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約１２０Ｕ／ｍｇである。
いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％まで精製される。アリールスルファターゼＡの純度は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウェスタンブロット、ＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除ＨＰＬＣのうちの１つ以上により測定され得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）は、約０．６～約１．２、例えば、約０．７～０．９５である。
限外濾過／透析濾過
本明細書に記載される精製方法は、下流限外濾過および／または透析濾過の１つ以上のステップを含み得る。いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、限外濾過および／または透析濾過により、例えば、接線流限外濾過によりアリールスルファターゼＡの試料を濃縮および／または濾過することをさらに含む。
限外濾過は、圧力勾配により駆動され、膜がそれらの溶媒和された大きさおよび構造の機能として液体の成分を分画する、膜分離プロセスを指す。透析濾過は、可溶性透過成分の濃度を低下させ、保有する成分の濃度をさらに増加させるために、残余分を、水で希釈し、再限外濾過する、特殊化したタイプの限外濾過プロセスである。限外濾過は、しばしば、透析濾過と、限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）の精製ステップに組み合わせられる。
本発明の実施形態は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたはそれ以上の下流ＵＦＤＦの精製ステップを用いる。１つ以上の透析濾過は、ＵＦＤＦステップ（例えば、ＵＦＤＦＤＦ）内で起こり得る。いくつかの実施形態において、下流ＵＦＤＦ後のタンパク質収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、前述の精製ステップからの量と比較して、例えば、分光測光により、例えば、２８０ｎｍで測定されるように、約９０％～１０５％、例えば、約９５％～約１００％、または約９７％～約９９％である。いくつかの実施形態において、本質的には、ＵＦＤＦ中に失われているタンパク質はない。
本発明のいくつかの実施形態において、下流ＵＦＤＦは、サイズ排除クロマトグラフィー－高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）および／または逆相－高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により測定されるように、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれ以上の純度であるｒＡＳＡをもたらす。いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％まで精製される。アリールスルファターゼＡの純度は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウェスタンブロット、ＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除ＨＰＬＣのうちの１つ以上により測定され得る。下述されるように、ｒＡＳＡの比活性は、例えば、スルファターゼ放出アッセイにより測定されるように、少なくとも約６０Ｕ／ｍｇ～約１００Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも約６５Ｕ／ｍｇ、少なくとも約９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約７０Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約９０Ｕ／ｍｇである。
いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡは、接線流限外濾過により酸性環境下、それらの大きさに従って混入物質からの分離により精製される。アリールスルファターゼＡは、低ｐＨで、４８０ｋＤａの理論的分子量を有する八量体を形成し、したがって、比較的に広い膜により保持されつつ、混入物質のほとんどがこの膜を通過するであろう（Ｓｏｍｍｅｒｌａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９７；１２３－１３０、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃｅｌｌ，８２ ２７１－２７８、Ｌｕｋａｔｅｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，３６５４－３６６４）。
典型的な実施形態において、透析濾過緩衝液は、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム－クエン酸塩、０．１３７ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を含む。
いくつかの実施形態において、プロセスの前述ステップにおいてクロマトグラフィーカラムから溶出される場合、このプロセスのための出発材料としては、アリールスルファターゼＡの懸濁液があり、この緩衝液中のｐＨは、０．２～１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５の添加により４～５に調整される。次いで、当業者によく知られている様式で、透析濾過は、１～１０の緩衝体積の酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０～５．５に対して行われる。濾過は、２０～４５０ｋＤａの範囲内の公称重量カットオフ値を有するいくつかの異なるフィルタータイプの適用により行われ得るが、１００～３００ｋＤａの範囲内のカットオフ値を有するフィルターを用いるのが典型的である。アリールスルファターゼＡを含有する溶液のさらなる処理のために、約２０～５０ｍＭの最終濃度までＴｒｉｓ系の添加により、ｐＨが７～８の範囲内の値に調整される。
上述のように酸性の接線流限外濾過の代替物として、混入物質からのＡＳＡの分離は、本質的に緩衝液の同じ条件および組成物を用いて酸性ゲル濾過により得ることができる。濾過は、低ｐＨでの溶液、例えば、ｐＨ４～５での０．２～０．９Ｍの酢酸ナトリウム溶液を用いて平衡化されるゲル濾過カラムを通して低ｐＨで行われる。選択肢として、アリールスルファターゼＡの溶液は、ゲル濾過前に、２０～５０ｋＤａのフィルターを通して接線流限外濾過により濃縮され得る。濃度範囲は、アリールスルファターゼＡが約０．１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｍｇ／ｍｌまで濃縮され得るように大幅に変化し得る。
いくつかの実施形態において、試料プールは、Ｂｉｏｍａｘ Ａ－スクリーン、３０ｋＤａに対して濃縮される。透析濾過は、ｐＨ５．４～５．７で２０ｍＭの酢酸ナトリウムの３～５のカラム洗浄に対して行われる。
精製されたＡＳＡタンパク質の特徴付け
精製された組換えＡＳＡタンパク質は、様々な方法を用いて特徴付けられ得る。
純度
精製された組換えＡＳＡタンパク質の純度は、典型的には、最終生成物中に存在する様々な不純物（例えば、宿主細胞タンパク質または宿主細胞ＤＮＡ）のレベルにより測定される。例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定され得る。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、１５０ｎｇ未満のＨＣＰ／ｍｇ ＡＳＡタンパク質（例えば、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、３０、２０、１０ｎｇ未満のＨＣＰ／ｍｇ ＡＳＡタンパク質）を含有する。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、約１５０ｐｇ／ｍｇ、１４０ｐｇ／ｍｇ、１３０ｐｇ／ｍｇ、１２０ｐｇ／ｍｇ、１１０ｐｇ／ｍｇ、１００ｐｇ／ｍｇ、９０ｐｇ／ｍｇ、８０ｐｇ／ｍｇ、７０ｐｇ／ｍｇ、６０ｐｇ／ｍｇ、５０ｐｇ／ｍｇ、４０ｐｇ／ｍｇ、３０ｐｇ／ｍｇ、２０ｐｇ／ｍｇ、または１０ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含有する。
いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、クマシーブリリアントブルー染色を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供するとき、０．０５％、０．０１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のアッセイ対照を超える強度を有する新しいバンドを有しない。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、ＨＣＰに対してウェスタンブロットを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供するとき、１５ｋＤａのＨＣＰバンドのアッセイ対照を超える強度を有するバンドを有せず、０．０５％、０．０１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、または１．０％のアッセイ対照を超える強度を有する新しいバンドを有しない。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、銀染色を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供するとき、０．０５％、０．０１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のアッセイ対照を超える強度を有する新しいバンドを有しない。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）は、約０．３～約０．６、例えば、約０．４～０．５である。様々なアッセイ対照、特に、ＦＤＡ等の管理機関に許容されるものが使用され得る。
精製された組換えＡＳＡタンパク質の純度はまた、サイズ排除クロマトグラフィー－高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動－ＳＤＳ ＰＡＧＥ（ＣＥ－ＳＤＳ ＰＡＧＥ）、および／または逆相－高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）（例えば、オクタデシル（Ｃ１８）結合シリカのカラムを用いて、対イオンとしてＴＦＡを用いる酸性ｐＨで行われる）のうちの１つ以上により測定され得る。本発明のいくつかの実施形態において、クロマトグラム中の主なピークは、ＡＳＡである。解像度を増加させるために変化または最適化され得るパラメーターは、勾配条件、有機修飾剤、対イオン、温度、カラム細孔径および粒径、溶媒組成、および流量を含む。純度レベルは、当業者に知られているように、主なピークパーセンテージにより識別され得る。例えば、純度は、観察された主および副ピークを積分し、総面積の主ピークのパーセンテージを計算することにより測定され得る。本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法により精製され、ＳＥＣ－ＨＰＬＣの主なピークのパーセンテージにより測定されるようなＡＳＡの純度は、９５％以上（例えば、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上）である。本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法により精製され、ＲＰ－ＨＰＬＣの主なピークのパーセンテージにより測定されるようなＡＳＡの純度は、９８％以上（すなわち、約９８％、約９９％またはそれ以上）である。
比活性
精製された組換えＡＳＡタンパク質はまた、機能的および／または生物学的活性を評価することにより特徴付けられ得る。組換えＡＳＡ組成物の酵素活性は、当該技術分野で知られている方法を用いて測定され得る。典型的には、本方法は、合成基質からの硫酸の除去を検出することを含み、これは硫酸放出アッセイとして知られている。酵素活性アッセイの一例は、イオンクロマトグラフィーの使用を含む。この方法は、基質から組換えＡＳＡにより酵素的に放出される硫酸イオンの量を定量化する。基質は、天然基質であっても、合成基質であってもよい。場合によっては、基質は、ヘパリン基質、デルマタン基質、またはそれらの機能的等価物である。典型的には、放出された硫酸イオンは、電導度検出器を用いてイオンクロマトグラフィーにより分析される。この例において、結果は、Ｕ／ｍｇのタンパク質として表され得、１単位は、基質から１時間あたり１μモルの硫酸イオンを放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、７０Ｕ／ｍｇ、８０Ｕ／ｍｇ、９０Ｕ／ｍｇ、１００Ｕ／ｍｇ、１１０Ｕ／ｍｇ、１２０Ｕ／ｍｇ、１３０Ｕ／ｍｇ、１４０Ｕ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、約５０～２００Ｕ／ｍｇ（例えば、約５０～１９０Ｕ／ｍｇ、５０～１８０Ｕ／ｍｇ、５０～１７０Ｕ／ｍｇ、５０～１６０Ｕ／ｍｇ、５０～１５０Ｕ／ｍｇ、５０～１４０Ｕ／ｍｇ、５０～１３０Ｕ／ｍｇ、５０～１２０Ｕ／ｍｇ、５０～１１０Ｕ／ｍｇ、５０～１００Ｕ／ｍｇ、６０～２００Ｕ／ｍｇ、６０～１９０Ｕ／ｍｇ、６０～１８０Ｕ／ｍｇ、６０～１７０Ｕ／ｍｇ、６０～１６０Ｕ／ｍｇ、６０～１５０Ｕ／ｍｇ、６０～１４０Ｕ／ｍｇ、６０～１３０Ｕ／ｍｇ、６０～１２０Ｕ／ｍｇ、６０～１１０Ｕ／ｍｇ、６０～１００Ｕ／ｍｇ、７０～２００Ｕ／ｍｇ、７０～１９０Ｕ／ｍｇ、７０～１８０Ｕ／ｍｇ、７０～１７０Ｕ／ｍｇ、７０～１６０Ｕ／ｍｇ、７０～１５０Ｕ／ｍｇ、７０～１４０Ｕ／ｍｇ、７０～１３０Ｕ／ｍｇ、７０～１２０Ｕ／ｍｇ、７０～１１０Ｕ／ｍｇ、７０～１００Ｕ／ｍｇ、８０～２００Ｕ／ｍｇ、８０～１９０Ｕ／ｍｇ、８０～１８０Ｕ／ｍｇ、８０～１７０Ｕ／ｍｇ、８０～１６０Ｕ／ｍｇ、８０～１５０Ｕ／ｍｇ、８０～１４０Ｕ／ｍｇ、８０～１３０Ｕ／ｍｇ、８０～１２０Ｕ／ｍｇ、８０～１１０Ｕ／ｍｇ、８０～１００Ｕ／ｍｇ、９０～２００Ｕ／ｍｇ、９０～１９０Ｕ／ｍｇ、９０～１８０Ｕ／ｍｇ、９０～１７０Ｕ／ｍｇ、９０～１６０Ｕ／ｍｇ、９０～１５０Ｕ／ｍｇ、９０～１４０Ｕ／ｍｇ、９０～１３０Ｕ／ｍｇ、９０～１２０Ｕ／ｍｇ、９０～１１０Ｕ／ｍｇ、９０～１００Ｕ／ｍｇ、１００～２００Ｕ／ｍｇ、１００～１９０Ｕ／ｍｇ、１００～１８０Ｕ／ｍｇ、１００～１７０Ｕ／ｍｇ、１００～１６０Ｕ／ｍｇ、１００～１５０Ｕ／ｍｇ、１００～１４０Ｕ／ｍｇ、１００～１３０Ｕ／ｍｇ、１００～１２０Ｕ／ｍｇ、１００～１１０Ｕ／ｍｇ、１１０～２００Ｕ／ｍｇ、１１０～１９０Ｕ／ｍｇ、１１０～１８０Ｕ／ｍｇ、１１０～１７０Ｕ／ｍｇ、１１０～１６０Ｕ／ｍｇ、１１０～１５０Ｕ／ｍｇ、１１０～１４０Ｕ／ｍｇ、１１０～１３０Ｕ／ｍｇ、１１０～１２０Ｕ／ｍｇ、１２０～２００Ｕ／ｍｇ、１２０～１９０Ｕ／ｍｇ、１２０～１８０Ｕ／ｍｇ、１２０～１７０Ｕ／ｍｇ、１２０～１６０Ｕ／ｍｇ、１２０～１５０Ｕ／ｍｇ、１２０～１４０Ｕ／ｍｇ、１２０～１３０Ｕ／ｍｇ、１３０～２００Ｕ／ｍｇ、１３０～１９０Ｕ／ｍｇ、１３０～１８０Ｕ／ｍｇ、１３０～１７０Ｕ／ｍｇ、１３０～１６０Ｕ／ｍｇ、１３０～１５０Ｕ／ｍｇ、または１３０～１４０Ｕ／ｍｇ）の範囲の比活性を有する。
別例において、組換えＡＳＡ組成物の酵素活性は、蛍光メチルウンベリフェロンを形成するための４－メチルウンベリフェリル－硫酸塩（４－ＭＵＦ－硫酸塩）基質からの硫酸の除去を測定することにより測定され得る。この例において、試験試料により発生した蛍光シグナルは、４－ＭＵＦの標準を用いて酵素活性（ｍＵ／ｍＬ）を計算するために使用され得る。１ミリ単位の活性は、３７℃で、１分間で１ナノモルの４－ＭＵＦ－硫酸塩を４－ＭＵＦに変換するのに必要とされる酵素の量として定義される。次いで、比活性は、酵素活性をタンパク質濃度で割ることにより計算され得る。
いくつかの実施形態において、活性は、５１５ｎｍで光を吸収する最終生成物であるパラニトロカテコール（ｐＮＣ）を有する合成発色基質であるパラニトロカテコール硫酸塩（ｐＮＣＳ）の加水分解により測定される。以下の等式を用いて、加水分解されたｐＮＣＳ（μｍｏｌ）／分×ｍｌ（＝Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）の酵素活性を計算し得る：
Ｖｔｏｔ（ｍｌ） ×ΔＡ＝Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ（１）
εＭ／１０００×Ｖ試料（ｍｌ）×インキュベーション時間（分） 式中：
ΔＡ＝試料の吸光度－ブランクの吸光度
Ｖｔｏｔ（ｍｌ）＝全反応体積（ｍｌ）（この場合、０．１５ｍｌ）
Ｖ試料（ｍｌ）＝添加された試料体積（ｍｌ）（この場合、０．０５ｍｌ）
εＭ＝生成物ｐＮＣに対するモル吸光係数、この場合、１２ ４００Ｍ－１ｃｍ－１。
等式１は、
ΔＡ×（０．１５／（１２ ４００／１０００×０．０５×３０））＝
Ｘμｍｏｌ／（分×ｍｌ）（＝Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）（１）のように簡易化され得る。
消費されたｐＮＣ（μｍｏｌ）／（分×ｍｇ）（＝Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）で比活性を計算するために、等式１を、試料のタンパク質濃度で割る：
等式１／タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝Ｙμｍｏｌ／（分×ｍｇ）＝Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ（２）
任意の例において、組換えＡＳＡ組成物のタンパク質濃度は、タンパク質濃度を測定するために当該技術分野で知られている任意の好適な方法により測定され得る。場合によっては、タンパク質濃度は、紫外線吸収アッセイにより測定される。そのような吸収アッセイは、典型的には、約２８０ｎｍの波長（Ａ２８０）で行われる。
いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ～１００．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ～５０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ～４０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ～３０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ～２０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ～１０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４．０×１０３ｍＵ／ｍｇ～８．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４．０×１０３ｍＵ／ｍｇ～１０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４．５×１０３ｍＵ／ｍｇ～１０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ～１０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約５．５×１０３ｍＵ／ｍｇ～１５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、または約４．０×１０３ｍＵ／ｍｇ～２０．０×１０３ｍＵ／ｍｇの範囲内で４－メチルウンベリフェロン基質において比活性を有する。いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡは、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約２．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約３．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約２０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約２５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約３０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約３５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約５０．０×１０３ｍＵ／ｍｇまたはそれ以上の４－メチルウンベリフェロン基質において比活性を有する。
電荷プロファイル
精製された組換えＡＳＡは、タンパク質と関連する電荷プロファイルにより特徴付けられ得る。典型的には、タンパク質の電荷プロファイルは、典型的には、タンパク質の表面上に存在する残基の側鎖電荷パターンに反映する。電荷プロファイルは、タンパク質におけるイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）アッセイを行うことにより決定され得る。いくつかの実施形態において、「電荷プロファイル」とは、交換イオンを含有する移動相のカラムに添加後の時点でイオン交換カラムから溶出するタンパク質の量を示す一連の値を指す。
典型的には、好適なイオン交換カラムは、陰イオン交換カラムである。例えば、電荷プロファイルは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系を用いて強陰イオン交換（ＳＡＸ）クロマトグラフィーにより決定され得る。概して、組換えＡＳＡは、固定化された正電荷の強陰イオン交換カラムに吸着し、既定の流速で移動相を用いてイオン強度を増加させる勾配は、正電荷を持つカラムとのそれらのイオン相互作用の強度に比例して、カラムから組換えＡＳＡ種を溶出する。さらに負電荷を持つ（さらに酸性の）ＡＳＡ種は、あまり負電荷を持たない（低酸性の）ＡＳＡ種よりも後に溶出する。溶出物中のタンパク質濃度は、紫外線吸収（２８０ｎｍで）検出される。
いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡは、固定化された正電荷のＭｉｎｉ Ｑ ＰＥカラム上に約ｐＨ８．０で２０ｍＭのＴＲＩＳ－ＨＣｌに吸着させ、０．８ｍｌ／分の流速で、２０ｍＭのＴＲＩＳ－ＨＣＬ、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８．０からなる移動相を用いてイオン強度を増加させる勾配は、正電荷を持つカラムとのそれらのイオン相互作用の強度に比例して、カラムから組換えＡＳＡ種を溶出する。
いくつかの実施形態において、電荷プロファイルは、ＨＰＬＣカラムからの溶出後、吸光度単位対時間のクロマトグラムにより示され得る。クロマトグラムは、一連の１つ以上のピークを含み得、セットにおけるそれぞれのピークが同様の表面電荷を有する組成物の組換えＡＳＡの亜集団を特定する。
グリカンマッピング
いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、典型的には、グリカンマッピングと称される、そのプロテオグリカン組成物により特徴付けられ得る。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、分岐構造の形状および複雑性は、インビボでのクリアランス、リソソーム標的、バイオアベイラビリティ、および／または有効性に影響を及ぼし得ると考えられる。
典型的には、グリカンマップは、酵素消化およびその後のクロマトグラフィー分析により決定され得る。様々な酵素は、好適なグリコシラーゼ、ペプチダーゼ（例えば、エンドペプチダーゼ、エクソペプチダーゼ）、プロテアーゼ、およびホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない、酵素消化に使用され得る。いくつかの実施形態において、好適な酵素は、アルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態において、好適な酵素は、ノイラミニダーゼである。グリカン（例えば、ホスホグリカン）は、クロマトグラフィー分析により検出され得る。例えば、ホスホグリカンは、パルスアンペロメトリック検出器付き高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ－ＰＡＤ）またはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検出され得る。グリカンマップ上のそれぞれのピークにより表されるグリカン（例えば、ホスホグリカン）の量は、当該技術分野で知られており、本明細書に開示される方法に従って、グリカン（例えば、ホスホグリカン）の標準曲線を用いて計算され得る。
いくつかの実施形態において、本発明による精製された組換えＡＳＡタンパク質は、それぞれ、中性（ピーク群１）、モノシアル化（ピーク群２）、キャップされたマンノース－６－リン酸化（ピーク群３）、ジシアル化（ピーク群４）、モノ－マンノース－６－リン酸化（ピーク群５）、ハイブリッド（ピーク群６）、およびジ－マンノース－６－リン酸化（ピーク群７）ＡＳＡタンパク質を示す少なくとも７つのピーク群を含むグリカンマップを用いて特徴付けられる。
ペプチドマッピング
いくつかの実施形態において、ペプチドマッピングは、シグナルペプチドの切断および／またはグリコシル化等の、アミノ酸組成、翻訳後修飾、および／または細胞プロセシングを特徴付けるために使用され得る。典型的には、組換えタンパク質は、制御されたまたはランダムな切断を通して、個々のペプチド断片に分解されて、パターンまたはペプチドマップを生成し得る。場合によっては、精製されたＡＳＡタンパク質は、まず、分析的分析前に、酵素消化に供され得る。消化は、分析的分析前に、ペプチダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ、もしくはプロテアーゼ、および／またはこれらの組み合わせを用いて行われ得る。ペプチドの構造組成は、当該技術分野でよく知られている方法を用いて決定され得る。例示的な方法には、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはＨＰＬＣが含まれるが、これらに限定されない。
金属分析
いくつかの実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、金属分析により特徴付けられ得る。精製された原薬中の微量金属を分析する様々な方法が、当該技術分野で知られており、本発明を実践するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、残留リン酸を測定し、参照試料と比較する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、残留リン酸が原薬のｐＨを維持するのに貢献することが仮定される。本発明のいくつかの実施形態において、残留リン酸は、約１０～５０ｐｐｍ（すなわち、約１０～４５ｐｐｍ、約１０～４０ｐｐｍ、約１０～３０ｐｐｍ、約２０～５０ｐｐｍ 約２０～４５ｐｐｍ、約２０～４０ｐｐｍ、約２０～３０ｐｐｍ、約３０～５０ｐｐｍ、約３０～４０ｐｐｍ）である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法に従って精製された組換えＡＳＡのｐＨ範囲は、約５～７（すなわち、約５．５～７．０、約５．５～６．５、約５．５～６．０、約６．０～７．０、約６．０～６．５、約６．０～６．４、約６．０～６．３、約６．０～６．２、約６．０～６．１、約６．１～６．２）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法に従って精製された組換えＡＳＡは、カルシウムを含有する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＡＳＡの活性部位中に存在するカルシウムイオンは、酵素活性には不可欠であり得ることが仮定される。本発明のいくつかの実施形態において、カルシウムは、約１～２０ｐｐｍ（すなわち、約１～１５ｐｐｍ、約１～１０ｐｐｍ、約５～１５ｐｐｍ、約５～１０ｐｐｍ、約１０～２０ｐｐｍ、約１０～１５ｐｐｍ、約１０～１４ｐｐｍ、約１０～１３ｐｐｍ、約１０～１２ｐｐｍ）のレベルで存在する。
薬学的組成物および投与
精製された組換えＡＳＡタンパク質は、既知の方法に従ってＭＬＤ患者に投与され得る。例えば、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮、または経粘膜（例えば、経口もしくは経鼻））に送達され得る。
いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡまたはそれを含む薬学的組成物は、対象に、静脈内投与により投与される。
いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡまたはそれを含む薬学的組成物は、対象に、髄腔内投与により投与される。本明細書中で用いる場合、「髄腔内投与」または「髄膜注射」という用語は、脊柱管（脊髄周辺の髄腔内の空洞）への注入を指す。穿頭孔または脳槽内または腰椎穿刺等を通して外側脳室注射を含むが、これに限定されない様々な技術が、使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明による「髄腔内投与」または「髄腔内送達」は、腰部または領域を介するＩＴ投与または送達、すなわち、腰部のＩＴ投与または送達を指す。本明細書中で用いる場合、「腰領域」または「腰部」という用語は、第３と第４の腰部（腰背部）の椎骨との間の領域、ならびにより包括的に、脊椎のＬ２－Ｓ１領域を指す。いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡまたはそれを含む薬学的組成物は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１１／１６３６４８号および同第ＷＯ２０１１／１６３６５０号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、髄腔内投与により、対象に投与される。
いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡまたはそれを含む薬学的組成物は、皮下（すなわち、皮膚の下での）投与により、対象に投与される。そのような目的の場合、製剤は、注射器を用いて注入され得る。しかしながら、製剤の投与のための他の器具は、注射器具（例えば、Ｉｎｊｅｃｔ－ｅａｓｅおよびＧｅｎｊｅｃｔ器具）、ペン型注射器（ＧｅｎＰｅｎ等）、無針器具（例えば、ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒおよびＢｉｏＪｅｃｔｏｒ）、ならびに皮下パッチ送達系等が利用可能である。
いくつかの実施形態において、髄腔内投与は、投与の他の経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮、または経粘膜（例えば、経口もしくは経鼻））とともに使用され得る。
本発明は、本明細書に記載される、治療有効量の組換えＡＳＡまたはそれを含む薬学的組成物の単一および複数の投与を企図する。組換えＡＳＡまたはそれを含む薬学的組成物は、対象の状態（例えば、リソソーム蓄積症）の性質、重症度、および範囲に応じて、一定間隔で投与され得る。いくつかの実施形態において、治療有効量の組換えＡＳＡまたはそれを含む薬学的組成物は、一定間隔で周期的に（例えば、１年に１回、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、３ヶ月に１回、隔月（２ヶ月に１回）、毎月（１ヶ月に１回）、隔週（２週間に１回）、毎週、毎日、または連続的に）投与され得る。
組換えＡＳＡまたはそれを含む薬学的組成物は、薬学的組成物を調製するために生理的に活性な許容される担体または賦形剤を用いて製剤化され得る。担体および治療剤は、滅菌であり得る。製剤は、投与方法に適したものでなければならない。
好適な薬学的に許容される担体には、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、もしくはデンプン等の炭水化物、マンニトール、スクロース等の糖類、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。薬学的調製物は、所望により、活性組成物と有害に反応しない、またはそれらの活性により妨害しない補助剤（例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色剤、香料、および／または芳香性物質等と混合され得る。いくつかの実施形態において、静脈内投与に適している水溶性担体が使用される。
組成物または医薬はまた、所望により、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。組成物は、液体溶液、懸濁液、乳化剤、錠剤、ピル、カプセル、持続放出製剤、または粉末であり得る。組成物はまた、トリグリセリド等の従来的な結合剤および担体とともに、坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含み得る。
組成物または医薬は、ヒトへの投与に適合した薬学的組成物として、通常の手順に従って製剤化され得る。例えば、いくつかの実施形態において、静脈内投与のための組成物は、典型的には、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔薬も含み得る。一般に、成分は、別々にまたは単位剤形で一緒に混合されてのいずれかで、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェといった密封シールされた容器内の乾燥凍結粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、これは、滅菌医薬品グレードの水、生理食塩水、またはデキストロース／水を含有する注入ボトルで分注され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
いくつかの実施形態において、アリールスルファターゼＡは、１５４ｍＭのＮａＣｌ、または０．９％のＮａＣｌ、および１０～５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．５～８．０、またはリン酸ナトリウム、グリシン、マンニトール、または対応するカリウム塩等の等張溶液中で製剤化される。別の実施形態において、ＡＳＡは、例えば、
ａ）Ｎａ２ＨＰＯ４（３．５０～３．９０）、ＮａＨ２ＰＯ４（０～０．５）、グリシン（２５～３０）、マンニトール（２３０～２７０）、および注射用水を含有する（ｍＭ）製剤緩衝液Ｉ、または
ｂ）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１０）、グリシン（２５～３０）、マンニトール（２３０～２７０）、および注射用水を含有する（ｍＭ）製剤緩衝液ＩＩ等の生理学的緩衝液中で製剤化される。
本明細書中の方法により精製されたアリールスルファターゼＡは、異染性白質萎縮症を患っているおよび／またはそれと診断されている対象において、末梢神経系における細胞内および／または中枢神経系内のスフィンゴ脂質３－Ｏ－スルホガラクトシルセラミド（ガラクトシルスルファチド）のレベルを低下させるための医薬として使用され得る。ＡＳＡの投与は、運動学習の機能障害およびまたは神経運動伝導速度および／または神経伝導振幅の増加をもたらす。本明細書中で用いる場合、「治療有効量」という用語は、主として、本発明の薬学的組成物中に含まれる治療剤の総量に基づいて決定される。概して、治療有効量は、対象への有意な利点を達成する（例えば、基礎疾患または状態を治療する、調節する、治癒する、予防する、および／または改善する）のに十分である。例えば、治療有効量は、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、リソソーム酵素受容体またはそれらの活性を調節し、それにより、そのようなリソソーム蓄積症またはその症状を治療（例えば、本発明の組成物の対象への投与後の「ゼブラ小体」または細胞の空胞変性の存在または発生の減少もしくは排除）するのに十分な量であり得る。概して、それを必要とする対象に投与される治療剤（例えば、組換えリソソーム酵素）の量は、対象の特徴により異なる。そのような特徴には、対象の状態、疾患重症度、一般的健康状態、年齢、性別、および体重が含まれる。当業者は、これらおよび他の関連因子に応じて適切な投薬量を容易に決定することができる。加えて、客観的および主観的アッセイは両方とも、任意に、最適な投薬量範囲を特定するために使用され得る。
治療有効量は、一般に、複数の単位用量を含み得る投与レジメンにおいて投与される。任意の特定の治療タンパク質に関しては、治療有効量（および／または有効な投与レジメン内の適切な単位用量）は、他の薬学的薬剤と組み合わせて、投与経路に応じて異なり得る。また、任意の特定の患者のための特定の治療有効量（および／または単位用量）は、治療すべき疾患、疾患の重症度、使用される特定の薬学的薬剤の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別、および食事、使用される特定の融合タンパク質の投与時間、投与経路、および／または排出もしくは代謝速度、治療期間、ならびに医療分野でよく知られているような因子を含む、様々な因子に応じて異なり得る。
任意の特定の対象に関して、具体的な投与量レジメンは、個体の必要性、ならびに酵素補充療法の投与を施すかまたは指図する専門家の判断により経時的に調整されるべきであり、本明細書中に記述される投与量範囲は単なる例であって、本発明の範囲または実行を限定するものではないことをさらに理解されたい。
実施例１．接線流限外濾過－捕捉
この実施例は、接線流限外濾過（交差流濾過としても知られている）を用いて、生産バイオリアクターから直接組換えＡＳＡタンパク質を捕捉することができることを示す。
具体的には、未精製のバルク材が、接線流限外濾過により生産豊富なバイオリアクターから捕捉された。接線流濾過は、製造業者の仕様書内のＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）３０ｋＤの標準的な膜において行われた。
接線流濾過がＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＨＹＤＲＯＳＡＲＴ（登録商標）ＥＣＯ膜を用いて行われるさらなる実験が行われた一方、同一の組成物およぶ分子量カットオフを維持した。ＥＣＯ膜により、このプロセスがより低い交差流速を使用することを可能にした。
ＥＣＯおよび標準的な膜を用いて行われた１２の偏位実験条件から得られた透過流束値（ＬＭＨ）が、輪郭プロファイル機能を用いて分析された。この機能は、同時に２つの因子に対する応答輪郭を示した。この研究において、供給流速および膜間圧（「ＴＭＰ」）がそれぞれの膜に対する透過流束と比較された。例示的な結果を図３に示す。
ＥＣＯ対標準的な膜の偏位実験の輪郭プロットに見られるように、ＥＣＯ膜は、試験した所与のパラメーター範囲でのさらによりロバストな流束出力を示した。ＥＣＯ膜は、動作範囲内でより低い供給流速でより高い流束速度を達成することができた。
より具体的には、設計実験からデータ分析に基づいて、タイターＥｌｉｓａ回収は、約９２％～１３２％の範囲である。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値は、約０．１１～０．３８の範囲である。タイターＥＬＩＳＡ回収、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）、およびパーセント活性回収は、本出願中の他の箇所に記載されるように測定された。
この実験からの結果は、アリールスルファターゼＡのＩＩＩ段階の精製プロセスにおいてＵＦＤＦ捕捉ステップを実行する実現可能性を示した。比較ＵＦＤＦ偏位実験に基づいて、ＥＣＯ膜は、動作範囲内でより低い供給流速でより高い流束速度を達成することができたため、特に有効であった。設計実験はまた、負荷チャレンジ、ＴＭＰ、供給流速、初期濃度係数、およびｒｈＡＳＡ捕捉プロセスの性能における処理温度の動作パラメーターにおける潜在的効果を評価するために、ＥＣＯ膜を用いて行われた。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のＥＬＩＳＡおよび活性ステップの収率は、ＥＣＯ膜の動作パラメーターによりあまり影響を受けなかった。
実施例２．深層濾過およびウイルス不活性化
この実験は、精製プロセス中に実行され得る深層濾過およびウイルス不活性化の条件を示す。
例えば、捕捉された未精製のバルク材は、２～８℃で１２０時間以内解凍された。バルク材の温度は、約１８±２℃に調整され、Ｃｕｎｏ Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ深層フィルターを通して濾過され、仕上げ（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）濾過を行った。Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ
Ｍａｘｉｃａｐ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２、０．４５±０．２μｍの仕上げ濾過カプセルを、深層フィルターの下流に接続し、下流処理プロセスのための調製において、微粒子を除去し、バイオバーデンを減少させた。フィルターを注射用蒸留水（「ＷＦＩ」）で洗い流し、続いて、ＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．１平衡溶液で洗い流す。
濾過後、最終のすすぎを行い、濾過トレーンからホールドアップ材を回収した。一旦濾過が完了すると、フィルタートレーンを０．０５ＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０の洗い流し液で洗い流した。回収した洗い流し液を濾過し、プールしたバルク材に添加した。
その後、濾過されたが、未精製のバルクを、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０およびトリ－ｎ－ブチル－リン酸塩（ＴｎＢＰ）の添加によりウイルス不活性化ステップを通して処理し、その後、以下のように、約３～２４時間のインキュベーションを行った。Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０を、０．０５ＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．１中の１０％（ｖ／ｖ）の原液から濾過され、プールされた未精製のバルクに添加して、１％の最終濃度を達成した。次いで、トリ－ｎ－ブチル－リン酸塩（ＴｎＢＰ）を、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０を含有する新しい体積の未精製バルクに基づいて計算された約０．３％の最終濃縮物に添加した。結果として得られたプールを混合して、一様性を得、約３～２４時間継続的に混合してインキュベートした。
ウイルス不活性化が完了したとき、第１のクロマトグラフィーカラム上に負荷される前に、プールを、二フッ化ポリビニリジン（ＰＶＤＦ）の０．２μｍフィルターを通して処理した。この実験において、濾過されたウイルス不活性化プールを、ウイルス不活性化のインキュベーション開始時間の約２８時間以内に、Ｑカラム（下述のように）に適用した。ウイルス不活性化した中間体を濾過し、濾過の終わりに、フィルターを０．０５ＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０の緩衝液で洗い流して、生成物の回収を最大限にした。
実施例３．陰イオン交換クロマトグラフィー
この実施例は、具体的には、陰イオン交換クロマトグラフィーを第１のクロマトグラフィーステップとして使用したときの、陰イオン交換クロマトグラフィーに対する例示的な条件を示す。この特定の実施例において、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｑ ＦＦ）樹脂を、結合および溶出モードで動作された第４級アミン陰イオン交換において使用した。
標準的方法を用いて、Ｑ ＦＦカラムを調製した。ＡＳＡをｐＨ７．０でＱカラムに結合し、ｐＨ７．１で、０．０２ＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、０．２６ＭのＮａＣｌで溶出した。負荷、洗浄、および溶出を約１００の流速で行った。動作温度は、１６～２３℃の範囲である。Ｑ溶出は、上昇する面のピークで０．５ＡＵ／ｃｍから下降する面のピークで０．２５ＡＵ／ｃｍの設定点を有する２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）により回収された。陰イオン交換カラムに使用された例示的な条件を表２に示す。
Figure 2022023225000002
純度、活性、およびスループット（例えば、標的負荷容量）に対して例示的な陰イオン交換樹脂と比較するために、さらなる実験を行った。特に、拡大を促進するために、いくつかの高容量の陰イオン交換樹脂をスクリーニングし、この研究において評価した。
一旦「充填される」と、樹脂は、表３に示される条件を用いて平衡化、負荷、洗浄、および溶出された。この研究において、結合条件は、上述のＱ ＦＦプロセスと同じものを維持した。フロースルー（ＦＴ）、洗浄（Ｗ）、および溶出／ストリップ（ｓｔｒｉｐ）（ＥＬ／ストリップ）の画分を回収し、Ａ２８０吸光度、タイターアッセイ、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クマシーおよび銀染色）を用いて分析した。
Figure 2022023225000003
Ｑ ＦＦに加えて７つの樹脂を評価して、結合容量、選択性、および回収を判定した。全収率は、８０～８３％の範囲ですべての樹脂で同等であり、同様の回収および一貫した実験動作を示した。樹脂は、Ｑ ＦＦほど結合容量を有さなかったものもあれば、より高い結合容量を有したものもあった。特に、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌは、試験した樹脂のすべての中で最高の結合容量、最良の選択性、および同等の回収を示した。さらに、ほんの少しの製品損失が、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌに対するフロースルーにおいて、１５ｇ／Ｌの負荷で観察された。
Ｑ ＦＦおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ樹脂の収率および結合容量を示す例示的な結果を表４に示す。
Figure 2022023225000004
比較確認実験
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌプロセスを確認し、その後の精製ステップにおけるその影響および最終原薬（「ＤＳ」）の質を評価するために、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ対Ｑ ＦＦの比較精製プロセス未精製のバルク材から原薬まで行われ、これには、本発明の実施例に記載されるクロマトグラフィーステップを含む。陰イオン交換クロマトグラフィー後のさらなる精製ステップは、下述の通りであった（遂行順に示される）：ＨＡカラム混合モードクロマトグラフィー、フェニルカラム疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＳＰカラム陽イオン交換クロマトグラフィー、および介在するウイルス濾過ステップによる限外濾過／透析濾過の２つのステップ。
Ａ２８０およびタイター収率の両方は同等であった。ＨＣＰの減少もまた、カラムを通して同様であった。
さらに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（銀）ゲル（図４）は、全プロセスを通してＦｒａｃｔｏｇｅｌおよびＱ ＦＦの両方に対して同様のバンドプロファイルを示した。ＣＥ－ＳＤＳデータは、第１のステップとしてＱ ＦＦよりもＦｒａｃｔｏｇｅｌに対して良好な純度を示したが、フェニルカラムステップ後、同様の結果を示さなかった。このことは、ＨＣＰ／ｒｈＡＳＡ比により確認された。
品質特性は、両方のカラムからのＳＰ溶出物、ならびに対照実行ＳＰ溶出物に対して評価された。ＦｒａｃｔｏｇｅｌおよびＱ ＦＦプロセスは、同様の純粋かつ許容されるＳＰ溶出物を提供したが、ある特定の特性は、未精製の負荷出発材料の違いにより対照とは若干異なった。
概して、第１のカラムとしてＦｒａｃｔｏｇｅｌの使用は、上の結果により確認されるように、同様のプロセス性能（収率、ＨＣＰの低下）、およびＱ ＦＦを用いた対照プロセスとしてのＳＰの品質特性を提供した。しかしながら、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌカラムは、より高い負荷容量およびスループットの増加を提供した。
結論として、比較確認実行は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥプロセスがＱ ＦＦプロセスに対して同等の性能（収率、ＨＣＰの除去）を示したが、より高い標的負荷容量（例えば、少なくとも１０ｇのｒｈＡＳＡ／Ｌ）のさらなる利点を提供した。５～２０ｇ／Ｌの特徴付けられた負荷範囲に対して有意な収率損失は観察されなかった。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ実行からのＳＰ溶出物の品質特性はまた、対照Ｑ ＦＦ実行と同等であった。
実施例４．混合モードヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー
この実施例は、組換えＡＳＡタンパク質の精製において使用され得る混合モードヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのための例示的な条件を示す。
具体的には、上述のように調製された陰イオン交換クロマトグラフィー溶出物は、その後、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーにより精製された。市販のセラミックヒドロキシアパタイトタイプ１樹脂カラムが調製された。この実施例において、カラムは、０．２５０Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で事前に平衡化した。
ＨＡカラムは、結合および溶出モードで動作された。陰イオン交換溶出物は、まず、周囲温度まで温め、ＨＡカラム上に負荷する前に、約０．００１Ｍのリン酸ナトリウムに調整した。ｒｈＡＳＡを、ｐＨ７．０でカラムに結合し、約０．０４Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１でカラムから溶出した。負荷、洗浄、および溶出を、約１５０ｃｍ／時の流速で行った。ＨＡ溶出は、上昇する面のピークで０．５ＡＵ／ｃｍから下降する面のピークで０．２５ＡＵ／ｃｍの設定点の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）により回収された。ＨＡカラムに使用された例示的な条件を表５に示す。
Figure 2022023225000005
実施例５．疎水性相互作用（フェニル）クロマトグラフィー
この実施例は、組換えＡＳＡタンパク質の精製において使用され得る疎水性相互作用（フェニル）クロマトグラフィーのための例示的な条件を示す。
具体的には、上述のように調製されたＨＡカラムクロマトグラフィーの溶出物は、その後、フェニルカラムクロマトグラフィーにより精製された。市販のフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを、ｒｈＡＳＡの精製のために充填し、調製した。
フェニルカラムは、結合および溶出モードで動作された。周囲温度まで温めた後、フェニルカラム上に負荷する前に、ＨＡ溶出物を、０．５ＭのＭＥＳ、遊離酸を用いて約１．１ＭのＮａＣｌおよびｐＨ約５．６に調整した。ｒｈＡＳＡを、ｐＨ５．６でカラムと結合し、０．０２ＭのＭＥＳ－Ｔｒｉｓ、０．０６ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１を用いてカラムから溶出した。負荷、洗浄、および溶出を、約１５０ｃｍ／時の流速で行った。フェニル溶出は、上昇する面のピークで０．５ＡＵ／ｃｍから下降する面のピークで０．２５ＡＵ／ｃｍの設定点の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）により回収された。フェニルカラムに対する例示的な条件を表６に示す。
Figure 2022023225000006
実施例６．陽イオン交換クロマトグラフィー
この実施例は、組換えＡＳＡタンパク質の精製において使用され得る陽イオン交換クロマトグラフィーのための例示的な条件を示す。
具体的には、上述のように調製されたフェニルカラムクロマトグラフィーの溶出物は、その後、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製された。この実施例において、ＳＰ－６５０Ｍカラム（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）を充填し、調製した。
ＳＰカラムは、結合および溶出モードで動作された。フェニルカラム溶出物を１６～２３℃まで温め、次いで、ＷＦＩで希釈して、伝導度を低下させ、ＳＰカラム上に負荷する前に、約１Ｍの酢酸を用いてｐＨ４．２に調整した。ｒｈＡＳＡを、ｐＨ４．２でカラムと結合し、０．０１Ｍの酢酸ナトリウム、０．０１Ｍの酢酸、０．０５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５を用いてカラムから溶出した。負荷、洗浄、および溶出を、約１５０ｃｍ／時の流速で行った。ＳＰ溶出は、上昇する面のピークで０．２５ＡＵ／ｃｍから下降する面のピークで０．２５ＡＵ／ｃｍの設定点の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）により回収された。ＳＰカラムに対する例示的な条件を表７に示す。
Figure 2022023225000007
実施例７．限外濾過／透析濾過およびウイルス濾過
この実施例は、組換えＡＳＡタンパク質の精製において使用され得る限外濾過／透析濾過およびウイルス濾過のための例示的な条件を示す。
限外濾過／透析濾過１
ＳＰ溶出プールを濃縮し、１０ｋＤａのＨｙｄｒｏｓａｒｔ Ｓａｒｔｏｃｏｎ膜を用いて透析濾過した。生成物プールを約１５ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、６～８体積の０．０１Ｍのリン酸ナトリウム－クエン酸塩、０．１３７ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて透析濾過した。次いで、濃縮および透析濾過した生成物プールを、０．２μｍフィルターを通して処理した。
濃縮／透析濾過したプールは、０．２μｍで濾過し、典型的には、約２４時間以内、２～８℃で保存された。
ウイルス濾過
限外濾過／透析濾過１の後に、ウイルス濾過を行い、プロセス流れから任意のウイルス様粒子を除去し得た。例えば、ポンプ、Ｐｌａｎｏｖａフィルター、および圧力計を有する濾過トレーンが設定された。フィルターは、１１．０ｌｂ／ｉｎ２の標的圧力で、保持側を通って１Ｌの０．１５４ＭのＮａＣｌで洗い流し、次いで、透過側を通って３Ｌ超の０．１５４ＭのＮａＣｌで洗い流した。完了時、フィルターを４Ｌの０．１５４ＭのＮａＣｌで洗い流して、生成物の回収を増大させた。金粒子試験は、フィルターの完全性が維持されたことを確認するために、使用後のフィルターにおいて行った。
限外濾過／透析濾過２
ウイルス濾過した材料を、１５～３０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１０ｋＤａのＨｙｄｒｏｓａｒｔ Ｓａｒｔｏｃｏｎ ＵＦＤＦ膜を用いて、６～８ダイアボリュームの透析濾過緩衝液の０．１５４ＭのＮａＣｌを用いて透析濾過した。透析濾過の完了時、この材料を４８～５０ｍｇ／ｍｌにさらに濃縮した。次いで、このシステムを透析濾過緩衝液で洗い流した。次いで、適切な量のシステム洗い流し液を生成物の濃縮物に戻して添加して、約４０ｍｇ／ｍｌの標的最終濃縮物を達成した。
実施例８．単一の限外濾過／透析濾過の単位動作
実施例７に記載されるプロセスは、事前に最終原薬（ＤＳ）を生成するために、ＳＰカラム溶出物（ＵＦＤＦ１）の限外濾過／透析濾過（「ＵＦＤＦ」）、ＵＦＤＦ１濃縮物のウイルス濾過、およびウイルス濾液（ＵＦＤＦ２）の最終ＵＦＤＦを含む。そのようなプロセスの例示的なフローダイヤグラムを図１に示す。
この実施例において、全体のプロセス時間、費用を軽減し、プロセス収率を潜在的に増加させるために、ＵＦＤＦ単位動作のうちの１つを取り除く実現可能性を決定するために、さらなる実験が行われた。それ故に、ｐＨを調整したＳＰ溶出物のウイルス濾過を行い、続いて、１つの単一ＵＦＤＦ単位動作を行って、事前に最終的に濾過した原薬（「ＤＳ」）を生成する実現可能性を評価するために、研究が行われた。
上述のように、研究は、ＳＰ溶出物を通して未精製のバルク材（「ＵＰＢ」）から予め精製された部分的に精製された原材料を使用した。上述のように、ＳＰ溶出物は、２つの実現可能性実験実行および二重ＵＦＤＦプロセスの１つの対照実行を含む、現在の研究において行われた３つのＵＦＤＦ実験のための負荷として使用された。２つの実験（実現可能性として知られている）実行は、１つのＵＦＤＦ、続いて、ＳＰ溶出プールのｐＨ調整、および１つの限外濾過／二重の透析濾過（「ＵＦＤＦＤＦ」）からなった。実現可能性の実行のためのＳＰ溶出物は、ｐＨを６．０に調整し、その後、例えば、Ｐｌａｎｏｖａ
２０Ｎウイルスフィルターによりウイルス濾過した。上述のように、実験実行は、ＵＦＤＦ１－ウイルス濾過－ＵＦＤＦ２の対照実行と比較した。
ＳＰ溶出物をｐＨ６．０に調整し、ウイルス濾過し、２つの等体積に割り当て、それぞれの実験的実現可能性の実行は、２つのウイルス濾液プールのうちの１つを使用した。例示的なＳＰ溶出プールのｐＨ調整した緩衝製剤を、表８に記載されるように設計した。約０．０７５Ｌの調整緩衝液／ＳＰ溶出物（Ｌ）の体積／体積の添加方法を決定して、約６．０の標的ｐＨを得た。
Figure 2022023225000008
実験実行のためのＳＰ溶出プールの受け取り時、ｐＨが６．０に調整され、この調節により、ｐＨ５．９８を有するＳＰ溶出物を生成した。次いで、ｐＨ調整したＳＰ溶出物を、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎフィルター上でウイルス濾過した。
表９は、個々の単位動作ステップの収率の要約を含む。観察されるように、すべてのＵＦＤＦ実行は、同様のＡ２８０に基づいた回収収率を示した。実験的ウイルス濾過単位動作は、１０６．６％のステップ収率を生じ、濾過中、Ａ２８０を吸収するタンパク質が失われなかったことを示す。約６．０へのｐＨ調整が、直径２０ｎｍのｒｈＡＳＡ八量体分子を二量体形に解離することができることを実証したように、ウイルス濾過に対する収率は、有意であった。酸性条件下（ｐＨ５．０）、ｒｈＡＳＡ分子は、八量体として存在するが、中性ｐＨで、それは、二量体に解離すると考えられた。Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎが２０ｎｍの細孔径を有するので、ｒｈＡＳＡタンパク質の分子配座は、八量体のｒｈＡＳＡがウイルスフィルター内に残留／損失する可能性があり得るため、八量体形ではなかったことは重要であった。ステップの収率データは、ＳＰ溶出物のｐＨを調整することによりＵＦＤＦ動作前にウイルス濾過を行う実現可能性を確認した。これらの収率データは、ｒｈＡＳＡがウイルス濾過中に損失しなかったことを示し、ｐＨ調整は、精製の有効性および原薬製剤ｐＨの標的化の両方において重要なステップであった。
Figure 2022023225000009
ウイルス濾過の完了時、ウイルス濾液プールは、２つの分量に均等に分割された。一方の分量を、実験実行１（ＵＦＤＦＤＦ）に供給し、他方を、実験実行２（ＵＦＤＦ）に供給した。
以下に証明されるように、両方の実験実行は、ＵＦおよび初期ＤＦセグメント中、同様の平均透過性を生じた。さらに、実験１の第２のＤＦセグメントは、ＵＦおよび初期ＤＦセグメントに対して同様の平均透過性を示した。対照実行ＵＦＤＦ１およびＵＦＤＦ２の両方は、実現可能性の実行と比較したとき、一貫して低い平均透過性を生じ、これは使用した器具の尺度内の変動により生じ得る。
Figure 2022023225000010
対照実行および実験実行からの原薬の生成物の質を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、活性、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ＨＣＰウェスタン、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クマシー）、グリカンマッピング、ペプチドマッピング、および金属分析を含む一連の分析アッセイにより比較した。
ＳＥＣ－ＨＰＣＬおよびＲＰ－ＨＰＬＣ
表１１は、サイズ排除（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）および逆相（ＲＰ－ＨＰＬＣ）の結果を提供する。ＳＥＣおよびＲＰデータは両方とも、実験実行と対照実行の原薬との間のわずかな差を示し、これは、両方の実験実行が対照実行からの原薬に匹敵するＳＥＣおよびＲＰの主要ピークパーセンテージを有する原薬を生成したことを示した。これらのデータは、純度における識別できる差が確認されなかったので、二重ＵＦＤＦ対照プロセスの代わりにいずれかの実験実行の使用の実現可能性を示した。
Figure 2022023225000011
活性
表１２は、活性（Ｕ／ｍＬ）および比活性（Ｕ／ｍｇ）を詳述し、濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、吸光度（ＡＵ）を既知の減衰係数０．６７で割ることにより測定された。実験実行１（ＵＦＤＦＤＦ）は、最低の比活性値を生じたことが観察されたが、十分５０～１４０Ｕ／ｍｇの所望の規格範囲内であった。実験実行２（ＵＦＤＦ）は、対照実行に匹敵する比活性を生じた。２つの実験および１つの対照である３つすべての実行が、同等であり、これは、製剤化した原薬を得るための方法が原薬活性に影響を及ぼさないことを示した。
Figure 2022023225000012
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウェスタンおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クマシー）
図５および６は、それぞれ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ＨＣＰウェスタンブロットおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クマシー）のゲル画像を示す。図５に見られるように、実験（実現可能性）および対照実行試料（レーン５、７、９）は、参照基準（レーン３）と同様のバンドパターンを示し、すべての実行からの原薬が比較的低いレベルのＨＣＰを示したことを示した。図６もまた、参照基準に対する実験（実現可能性）実行と対照実行との間の同等性を示し、さらなるバンドパターンがＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クマシー）により検出されなかったことを示した。これらのデータは、実験実行条件からの原薬の生成物の質がＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ＨＣＰウェスタンブロットおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クマシー）分析に基づいて対照実行からのものと同等であったことを示した。１５ｋＤａのＨＣＰバンドの対照の強度よりも高いＨＣＰバンドはＨＰＣウェスタンブロットにおいて観察されず、１％アッセイ対照の強度を超える新しいバンドは観察されなかった。
グリカンマッピング
表１３は、例示的なグリカンマップを示す。すべてのグリコシル化形態は、試験されたすべての試料にわたって同様のレベルで存在することが見出された。これらの結果は、実験（実現可能性）実行からの原薬の生成物の質が対照実行の原薬に匹敵したことを示した。
Figure 2022023225000013
金属分析およびｐＨ
実験および対照を生じた原薬（ＤＳ）における金属分析もまた、残留リン酸塩のレベルを測定するために行われた。表１４は、それぞれの薬物試料の残留リン酸塩および最終ｐＨを示す。残留リン酸塩は、すべての実行条件にわたって同等であることが見出された。ｐＨもまた、実行条件にかかわらず同様であることが見出された。残留リン酸塩は、原薬ｐＨの維持に寄与すると仮定されたため、残留リン酸塩の結果は、原薬の３つのロットすべてのｐＨが維持されたという観察と一致した。これらのデータは、実験（実現可能性）実行が両方とも、原薬中において対照実行と同等のレベルの残留リン酸塩を生じることを示し、３つの原薬ロットのすべてが最終製剤中に約６．０（すなわち、５．５～６．５）の標的ｐＨを維持することができたことを示した。
表１４に示されるように、金属分析もまた、上昇レベルのカルシウムを検出した。カルシウムレベルは、すべての試料にわたってほぼ一定していた。これまでの研究は、カルシウムイオンがｒｈＡＳＡの活性部位に存在し、これは酵素活性に重要であることを示した。
Figure 2022023225000014
ペプチドマッピング
ペプチドマッピング分析が行われた。同様に、すべての試料は同様のプロファイルを生じ、試験した実行条件が対照として同等のｒｈＡＳＡペプチドマップを得たことを示唆している。
結論
上の実験は、ＳＰ溶出物のｐＨ調整によるＵＦＤＦ動作前のウイルス濾過の実現可能性、２つのＵＦＤＦステップの代わりとなる単一ＵＦＤＦステップの実現可能性、およびウイルス濾過後のＵＦＤＦステップ内の単一透析濾過（対二重濾過）の実現可能性を評価した。
実験的実現可能性の実行におけるウイルス濾過単位動作に対する高いステップ収率は、ＵＦＤＦ動作前のウイルス濾過の実現可能性を立証した。ウイルス濾液は、濾液へのｒｈＡＳＡ分子の移行を可能にしたため、２つのＵＦＤＦ実現可能性の実行が遂行された。すべての生成物の質およびプロセス性能の数的指標が、対照に対する両方の実現可能性の実行の同等性を示したため、単一ＵＦＤＦステップは、実行可能であると判断された。結果はまた、プロセスが、対照および二重透析濾過実験（実験的実現可能性の実行１）の両方により生成したものと同等の質の原薬を生成することができるため、最終製剤溶液（０．９％食塩溶液）に直接な単一透析濾過の実現可能性（実験的実現可能性の実行２）を立証した。
これらのデータに基づいて、例えば、表４中に含まれる緩衝液を使用する約６．０へのｐＨ調整は、最終のＵＦＤＦ動作前にウイルス濾過に適しているｐＨ調整したＳＰ溶出物を生成することが見出された。図２に例示されるこのプロセスは、ＵＦＤＦステップ、続いて、ウイルス濾過、続いて、別のＵＦＤＦステップを含むプロセスにおける実行可能な置換であることを示す。ｐＨ調整－ウイルス濾過－ＵＦＤＦプロセスは、より複雑で高価な時間のかかるプロセスにより生成される同等の質および純度の原薬を生成することが立証された。
実施例９．組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の原薬
上述のプロセスに従って精製されたｒｈＡＳＡは、約５．５～６．５のｐＨを有する、１５４ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中に３５～４５ｍｇ／ｍｌを製剤化した。
最終の原薬のペプチドおよびグリカンマップは、実施例８に記載されるものであることが確認された。残留宿主細胞ＤＮＡは、ＴＨＲＥＳＨＯＬＤ（登録商標）ＤＮＡアッセイにより測定されるように、１００ｐｇ／ｍｇ以下の量で存在した。逆相およびサイズ排除ＨＰＬＣにより測定された純度は、それぞれ、９８％超および９５％超の主要ピーク領域を示した。ウェスタンブロットは、アッセイ対照における約１５ｋＤａのＨＣＰバンドの強度を超える強度を有する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）バンドを有しないことを示した。３つ以下のＨＣＰバンドが検出された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クマシー、還元）分析は、１％のアッセイ対照を超える強度を有する新しいバンドを有しない参照基準であることを確認した。比活性は、５０～１４０Ｕ／ｍｇであることを測定した。
同等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識、または日常の実験のみを使用して究明可能であるだろう。本発明の範囲は、上の発明を実施するための形態に限定されることを意図しないが、以下の特許請求に記載される通りである。
特許請求要素を修飾するための特許請求の範囲における「第１の」、「第２の」、「第３の」等の序数用語の使用は、それ自体、ある特許請求書要素の別の順序に優る優先順位、先行、または順序、あるいは方法の行為が実行される時間的な順序を暗示しておらず、単に、特定の名称を有するある特許請求項要素を、同じ名称を有する（が序数用語の使用のための）別の要素から区別し、特許請求要素を区別するための標識として使用されている。
本出願および特許請求において、本明細書で使用される「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、特にそれとは反対に明確に示されない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。群の１つ以上の構成員間に「または」を含む特許請求の範囲または記述は、それとは反対に明確に示されない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、群の構成員のうちの１つ、１つ超、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、またはそうでなければそれに関連する場合に満たされると見なされる。本発明は、群の１つのみの構成員が、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、またはそうでなければそれに関連する実施形態を含む。本発明は、群の１つ超の構成員、または群内のすべての構成員が、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、またはそうでなければそれに関連する実施形態も含む。さらに、本発明が、矛盾または不一致が生じることが別途示されない限り、または当業者に明らかでない限り、列記された特許請求の範囲のうちの１つ以上に由来する１つ以上の制限、要素、付記、記述用語等が、同一の基礎となる特許請求の範囲に依存する別の特許請求の範囲（または、関連した任意の他の特許請求の範囲）に導入される、すべての変形、組み合わせ、および並び替えを包含することを理解されたい。要素が一覧表で（例えば、マーカッシュ群または同様の書式で）示される場合、それらの要素のそれぞれの下位群も開示され、任意の要素（複数を含む）がその群から取り除かれ得ることを理解されたい。概して、本発明または本発明の態様が、特定の要素、特徴等を含むと見なされる場合、本発明のある実施形態または本発明の態様が、そのような要素、特徴等から構成されるか、または本質的に構成されることを理解されるべきである。単純化のために、それらの実施形態は、あらゆる場合において、本明細書において非常に多くの単語で具体的に説明されていない。具体的な除外が本明細書において列挙されるかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様が特許請求の範囲から明確に除外され得ることも理解されるべきである。本発明の背景を説明するために、および本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するため本明細書において参照される刊行物、ウェブサイト、および他の参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

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  1. 精製されたアリールスルファターゼＡを含む組成物またはアリールスルファターゼＡの精製方法など。
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