EA030551B1

EA030551B1 - Способы очистки арилсульфатазы а

Info

Publication number: EA030551B1
Application number: EA201590826A
Authority: EA
Inventors: Дэйв Николс; Игорь Кинонес-Гарсия; Би Линь Чен; Мэй Хуэй Джан
Original assignee: Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк.
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2014-01-09
Publication date: 2018-08-31
Also published as: JP7407161B2; AU2014205441A1; JP2022023225A; US11884945B2; AU2020201079B2; CA2896979A1; MX2015008875A; WO2014110246A1; AU2020201079A1; EP2943568B1; EP2943568A1; CN104903442A; BR112015015948B1; JP2024001160A; HK1214622A1; JP2018171067A; US20150353904A1; US20230235303A1; CA2896979C; JP2016504040A

Abstract

В изобретении предложены, помимо прочего, усовершенствованные способы очистки белка арилсульфатазы А (АСА), полученного рекомбинантно для ферментозаместительной терапии. Настоящее изобретение частично основано на открытии, что рекомбинантный белок АСА можно очищать из необработанных биологических материалов, таких как АСА-содержащая культуральная клеточная среда, при помощи способа, включающего применение не более четырех хроматографических колонок и только один этап ультрафильтрации/диафильтрации после хроматографии.

Description

Настоящее изобретение частично основано на открытии, что рекомбинантный белок АСА можно очищать из необработанных биологических материалов, таких как АСА-содержащая культуральная клеточная среда, при помощи способа, включающего применение не более четырех хроматографических колонок и только один этап ультрафильтрации/диафильтрации после хроматографии.

030551 B1

030551

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Заявка испрашивает приоритет в соответствии с 35 U.S.C. § 119(e) по предварительной заявке на патент США № 61/750,693, зарегистрированной 9 января 2013 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

Уровень техники

Метахроматическая лейкодистрофия (МЛ) представляет собой аутосомное рецессивное нарушение, возникающее вследствие недостатка фермента арилсульфатазы А (АСА). АСА, кодируемая в организме человека геном ARSA, представляет собой фермент, который расщепляет цереброзид-3-сульфат или сфинголипид 3-О-сульфогалактозилцерамид (сульфатид) на цереброзид и сульфат. В отсутствие данного фермента сульфатиды накапливаются в нервной системе (например, в миелиновых оболочках, нейронах и глиальных клетках) и, в меньшей степени, во внутренних органах. Следствием этих молекулярных и клеточных явлений является прогрессирующая демиелинизация и потеря аксонов в ЦНС и ПНС, что клинически сопровождается тяжелой двигательной и когнитивной дисфункцией. Определяющим клиническим признаком этого нарушения является дегенерация центральной нервной системы (ЦНС), которая приводит к когнитивным нарушениям (например, и помимо прочего, к умственной отсталости, нервным расстройствам и слепоте).

МЛ может проявляться у маленьких детей (поздняя инфантильная форма), при этом симптомы у пораженных детей, как правило, начинают проявляться только после первого года жизни (например, в возрасте около 15-24 месяцев), и в общем случае они не живут более 5 лет. МЛ может проявляться у детей (ювенильная форма), при этом у пораженных детей, как правило, проявляются когнитивные нарушения в возрасте около 3-10 лет, а продолжительность жизни может варьироваться (например, в диапазоне 10-15 лет после появления симптомов). МЛ может проявляться у взрослых (приобретенная форма), и может появляться у людей разного возраста (например, и, как правило, в возрасте 16 лет и позже), а развитие заболевания может в большой степени различаться.

Ферментозаместительная терапия (ФЗТ) одобрена для применения при лечении МЛ и включает введение экзогенного заместительного фермента АСА, в частности, рекомбинантной арилсульфатазы А (рАСА) (например, рекомбинантной человеческой арилсульфатазы А (рчАСА)), пациентам с МЛ.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении предложены, помимо прочего, усовершенствованные способы очистки белка АСА, полученного рекомбинантно для ферментозаместительной терапии. Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии, что рекомбинантный белок АСА можно очищать из необработанных биологических материалов, таких как АСА-содержащая культуральная клеточная среда, при помощи способа, включающего после хроматографии только один этап ультрафильтрации/диафильтрации, что приводит к получению фармацевтически приемлемого лекарственного вещества непосредственно в конечном буфере лекарственного препарата. Как описано в приведенных ниже примерах, этот одноэтапный процесс УФ/ДФ достигается просто объединением элюата после хроматографических этапов и доведением pH объединенного элюата до около 6,0. До настоящего изобретения способы очистки рекомбинантно полученного белка рАСА включали после хроматографии по меньшей мере два этапа ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Как описано в разделе примеров, рекомбинантный белок АСА, очищенный при помощи одноэтапного процесса УФ/ДФ в соответствии с изобретением, обладает степенью очистки, активностью и выходом, сравнимыми с рекомбинантными белками АСА, очищенными при помощи нескольких этапов УФ/ДФ. Например, рекомбинантный фермент АСА, очищенный в соответствии с настоящим изобретением, содержит не более чем 100 пг/мг ДНК клетки-хозяина, сохраняет высокую специфическую активность (например, около 50-140 Е/мг) и обладает другими отличительными характеристиками, которые могут способствовать биодоступности и/или лизосомному нацеливанию рекомбинантного белка АСА. Следовательно, этот упрощенный способ является более быстрым, менее дорогостоящим и одинаково эффективным при очистке рекомбинантного белка АСА. В особенности этот способ выгоден в комбинации с хроматографическими этапами с высокой емкостью загрузки для облегчения крупномасштабного производства рекомбинантного белка АСА.

Таким образом, в одном аспекте в настоящем изобретении предложен способ очистки рекомбинантного белка арилсульфатазы А (АСА), включающий этапы выделения рекомбинантного белка арилсульфатазы А (АСА) из неочищенного препарата при помощи проведения одного или более хроматографических этапов; объединения элюата после одного или более хроматографических этапов; доведения pH объединенного элюата до уровня pH, составляющего или превышающего величину около 5,8, 5,9 или 6,0; и проведения ультрафильтрации и/или диафильтрации элюата с доведенным уровнем pH. В некоторых вариантах реализации изобретения уровень pH доводят до около 5,8-7,0 (например, около 5,8-6,8, около 5,8-6,6, около 5,8-6,4, около 5,8-6,2, около 5,8-6,1, около 5,8-6,0, около 5,9-7,0, около 5,9-6,8, около 5,9-6,6, около 5,9-6,4, около 5,9-6,2, около 5,9-6,1, около 5,9-6,0, около 5,95-6,20, около 5,95-6,15, около 5,95-6,10 или около 5,95-6,05). В некоторых вариантах реализации изобретения уровень pH доводят до около 6,0.

В некоторых вариантах реализации изобретения уровень pH доводят, применяя буфер, содержащий фосфат натрия, хлорид натрия или цитрат натрия с pH 7,0. В некоторых вариантах реализации изобрете- 1 030551

ния буфер содержит около 0,1-0,5 М (например, около 0,1-0,4 М, 0,1-0,3 М, 0,2-0,4 М или 0,2-0,3 М) фосфата натрия, около 0,5-2,5 М (например, около 0,5-2,0 М, 0,5-1,5 М, 0,75-2,5 М, 0,75-2,0 М, 0,75-1,5 М, 1,0-2,5 М, 1,0-2,0 М или 1,0-1,5 М) хлорида натрия и около 0,1-0,6 М (например, около 0,1-0,5 М, 0,10,4 М, 0,2-0,5 М, 0,2-0,4 М, 0,3-0,5 М или 0,3-0,4 М) цитрата натрия с pH около 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5. В некоторых вариантах реализации изобретения буфер содержит около 0,25 М фосфата натрия, около 1,33 М хлорида натрия и около 0,34 М цитрата натрия с pH около 7,0.

В некоторых вариантах реализации изобретения перед этапом ультрафильтрации и диафильтрации проводят вирусную фильтрацию. В некоторых вариантах реализации изобретения проводят один этап ультрафильтрации и/или диафильтрации. В некоторых вариантах реализации изобретения один этап ультрафильтрации и/или диафильтрации включает только диафильтрацию. В различных вариантах реализации изобретения ультрафильтрация представляет собой тангенциальную поточную ультрафильтрацию.

В некоторых вариантах реализации изобретения один или более хроматографических этапов включают катионообменную хроматографию. В некоторых вариантах реализации изобретения катионообменная хроматография является последним хроматографическим этапом, а элюат после катионообменной хроматографии объединяют перед доведением уровня pH. В некоторых вариантах реализации изобретения перед проведением катионообменной хроматографии проводят один или более этапов из анионообменной хроматографии, хроматографии с комбинированным режимом и хроматографии с гидрофобным взаимодействием.

В некоторых вариантах реализации изобретения один или более хроматографических этапов включают аффинную хроматографию. В некоторых вариантах реализации изобретения первым этапом является аффинная хроматография. В некоторых вариантах реализации изобретения аффинная хроматография является последним хроматографическим этапом, а элюат после аффинной хроматографии объединяют перед доведением уровня pH. В некоторых вариантах реализации изобретения перед проведением аффинной хроматографии проводят один или более этапов из анионообменной хроматографии, хроматографии с комбинированным режимом и хроматографии с гидрофобным взаимодействием. В некоторых вариантах реализации изобретения после проведения аффинной хроматографии проводят один или более этапов из анионообменной хроматографии, хроматографии с комбинированным режимом и хроматографии с гидрофобным взаимодействием. В некоторых вариантах реализации изобретения анионообменная хроматография представляет собой Q хроматографию. В некоторых вариантах реализации изобретения анионообменная хроматография включает применение смолы ТМАЕ (например, FRACTOGEL® ТМАЕ). В некоторых вариантах реализации изобретения после загрузки неочищенным препаратом смолу ТМАЕ промывают первым промывочным буфером, содержащим MES-Tris с уровнем pH около 7,0. В определенных вариантах реализации изобретения первый промывочный буфер содержит около 20-75 мМ MESTris (например, около 30-60 мМ, 40-70 мМ или 40-60 мМ). В определенных вариантах реализации изобретения первый промывочный буфер содержит около 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 55 мМ, 60 мМ, 65 мМ, 70 мМ или 75 мМ MES-Tris.

В некоторых вариантах реализации изобретения смолу ТМАЕ промывают вторым промывочным буфером, содержащим MES-Tris и NaCl с уровнем pH около 7,0. В некоторых вариантах реализации изобретения второй промывочный буфер содержит около 5-75 мМ MES-Tris (например, около 5-70 мМ, 5-60 мМ, 5-50 мМ, 5-40 мМ, 5-30 мМ, 10-60 мМ, 10-50 мМ, 10-40 мМ, 10-30 мМ или 15-25 мМ) и около 50150 мМ NaCl (например, около 50-140 мМ, 50-130 мМ, 50-120 мМ, 50-110 мМ, 75-150 мМ, 75-140 мМ, 75-130 мМ, 75-120 мМ или 75-110 мМ) с уровнем pH около 7,0. В некоторых вариантах реализации изобретения второй промывочный буфер содержит около 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 30 мМ, 40 мМ, 50 мМ, 60 мМ или 75 мМ MES-Tris и около 50 мМ, 60 мМ, 70 мМ, 80 мМ, 90 мМ, 100 мМ, 110 мМ, 120 мМ, 130 мМ, 140 мМ или 150 мМ NaCl с уровнем pH около 7,0. В некоторых вариантах реализации изобретения второй промывочный буфер содержит около 20 мМ MES-Tris и около 100 мМ NaCl с уровнем pH около 7,0.

В некоторых вариантах реализации изобретения после загрузки неочищенным препаратом смолу ТМАЕ элюируют при помощи элюирующего буфера, содержащего MES-Tris и NaCl с уровнем pH около 7,0. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирующий буфер содержит около 5-75 мМ MESTris (например, около 5-70 мМ, 5-60 мМ, 5-50 мМ, 5-40 мМ, около 5-30 мМ, 10-75 мМ, 10-60 мМ, 10-50 мМ, 10-40 мМ или 10-30 мМ) и около 150-300 мМ NaCl (например, около 150-250 мМ, около 180-260 мМ, около 200-280 мМ, 200-260 мМ, 200-240 мМ, 210-300 мМ, 210-280 мМ, 210-260 мМ или 210-240 мМ) с уровнем pH около 7,0. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирующий буфер содержит около 10 мМ, 20 мМ, 30 мМ, 40 мМ, 50 мМ, 60 мМ, 70 мМ или 75 мМ MES-Tris и около 150 мМ, 180 мМ, 200 мМ, 210 мМ, 220 мМ, 230 мМ, 240 мМ, 250 мМ, 260 мМ, 270 мМ, 280 мМ, 290 мМ или 300 мМ NaCl с уровнем pH около 7,0. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирующий буфер содержит около 20 мМ MES-Tris и около 220 мМ NaCl с уровнем pH около 7,0.

В некоторых вариантах реализации изобретения в анионообменной хроматографии применяют колонку, выбранную из группы, состоящей из Q SEPHAROSE™ Fast Flow, Q SEPHAROSE™ High Performance, Q SEPHAROSE™ XL, CAPTO™ Q, DEAE, TOYOPEARL GIGACAP® Q, FRACTOGEL® TMAE,

- 2 030551

ESHMUNO™ Q, NUVIA™ Q или UNOSPHERE™ Q.

В некоторых вариантах реализации методом хроматографии с комбинированным режимом, подходящим в целях настоящего изобретения, является хроматография с гидроксиапатитом (HA-хроматография). В некоторых вариантах реализации методом хроматографии с гидрофобным взаимодействием, подходящим в целях настоящего изобретения, является хроматография с фенилом.

В некоторых вариантах реализации изобретения хроматографические этапы проводят в следующем порядке: анионообменная хроматография (например, со смолой ТМАЕ), хроматография с комбинированным режимом (например, HA-хроматография), хроматография с гидрофобным взаимодействием (например, хроматография с фенилом) и катионообменная хроматография (например, SP-хроматография).

В некоторых вариантах реализации в подходящем в целях настоящего изобретения методе аффинной хроматографии применяют антитело к арилсульфатазе А (например, антитело к арилсульфатазе А человека).

В некоторых вариантах реализации изобретения в подходящем методе анионообменной хроматографии применяют колонку с загрузочной емкостью, большей, чем около 4,5 г/л (например, большей, чем около 5 г/л, 6 г/л, 7 г/л, 8 г/л, 9 г/л, 10 г/л, 11 г/л, 12 г/л, 13 г/л, 14 г/л или 15 г/л). В некоторых вариантах реализации изобретения в подходящем методе анионообменной хроматографии применяют колонку с загрузочной емкостью в диапазоне, составляющем около 4,5-20 г/л (например, в диапазоне, составляющем около 5-20 г/л; 5-19 г/л, 5-18 г/л, 5-17 г/л, 5-16 г/л, 5-15 г/л, 7,5-20 г/л, 7,5-19 г/л, 7,5-18 г/л, 7,5-17 г/л, 7,5-16 г/л, 7,5-15 г/л, 10-20 г/л, 10-19 г/л, 10-18 г/л, 10-17 г/л, 10-16 г/л или 10-15 г/л). В конкретных вариантах реализации изобретения подходящая загрузочная емкость колонки составляет около 10-15 г/л.

В некоторых вариантах реализации изобретения ультрафильтрацию неочищенного препарата проводят перед одним или более хроматографическими этапами. В некоторых вариантах реализации этапом ультрафильтрации, подходящим в целях настоящего изобретения, является тангенциальная поточная ультрафильтрация. В определенных вариантах реализации изобретения в подходящем методе ультрафильтрации применяют мембранный фильтр, имеющий размер пор с отсечением по молекулярной массе, составляющим по меньшей мере около 10 кДа, по меньшей мере около 20 кДа, по меньшей мере около 30 кДа, по меньшей мере около 40 кДа, по меньшей мере около 50 кДа. В определенных вариантах реализации изобретения по меньшей мере 75% рекомбинантного АСА остается в неочищенном препарате. В определенных вариантах реализации изобретения по меньшей мере 75% рекомбинантного АСА проникает через фильтр. В определенных вариантах реализации изобретения на подходящем этапе ультрафильтрации применяют мембрану из полиэфирсульфона или целлюлозы.

В некоторых вариантах реализации изобретения перед ультрафильтрацией неочищенного препарата проводят осветление неочищенного препарата. В некоторых вариантах реализации на этапе осветления, подходящем в целях настоящего изобретения, проводят фильтрацию при помощи одного или более глубинных фильтров. В некоторых определенных вариантах реализации изобретения фильтрацию неочищенного препарата проводят, применяя группу глубинных фильтров. В некоторых определенных вариантах реализации изобретения в подходящей группе глубинных фильтров используется мембрана, содержащая целлюлозу, диатомитовую землю, полиэфирсульфон или их комбинацию.

В некоторых вариантах реализации изобретения за ультрафильтрацией следует один или более этапов глубинной фильтрации и/или вирусной инактивации. В некоторых вариантах реализации изобретения за одним или более этапами глубинной фильтрации и/или вирусной инактивации следует один или более хроматографических этапов. В некоторых вариантах реализации изобретения этап вирусной инактивации включает добавление детергента в неочищенный препарат.

В некоторых вариантах реализации способ в соответствии с настоящим изобретением можно применять для очистки рекомбинантного белка АСА, вырабатываемого клетками млекопитающих, культивируемыми в суспензии. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки млекопитающих культивируют в биореакторе. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют среду на основе сыворотки. В некоторых вариантах реализации изобретения применяемая среда является бессывороточной. В некоторых вариантах реализации изобретения бессывороточная среда является химически определенной средой.

В некоторых вариантах реализации изобретения неочищенный препарат представляет собой поток поступающего материала из перфузионного биореактора. В некоторых вариантах реализации изобретения неочищенный препарат получен из среды (например, на основе сыворотки или бессывороточной), содержащей рекомбинантный белок АСА, секретируемый клетками млекопитающих. В некоторых вариантах реализации изобретения неочищенный препарат получают, размораживая замороженный препарат среды.

В некоторых вариантах реализации изобретения этап ультрафильтрации и/или диафильтрации включает перенос очищенного рекомбинантного белка АСА в буфер лекарственной формы.

В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 1.

- 3 030551

В некоторых вариантах реализации очищенный рекомбинантный белок АСА в соответствии с настоящим изобретением содержит менее чем около 150 нг/мг, 140 нг/мг, 130 нг/мг, 120 нг/мг, 110 нг/мг, 100 нг/мг, 90 нг/мг, 80 нг/мг, 70 нг/мг, 60 нг/мг, 50 нг/мг, 40 нг/мг, 30 нг/мг, 20 нг/мг или 10 нг/мг белка клетки-хозяина (БКХ). В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный рекомбинантный белок АСА при проведении ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси голубым не имеет новых полос с интенсивностью большей, чем 1,0% контрольной пробы.

В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный рекомбинантный белок АСА содержит менее чем около 150 пг/мг, 140 пг/мг, 130 пг/мг, 120 пг/мг, 110 пг/мг, 100 пг/мг, 90 пг/мг, 80 пг/мг, 70 пг/мг, 60 пг/мг, 50 пг/мг, 40 пг/мг, 30 пг/мг, 20 пг/мг или 10 пг/мг ДНК клетки-хозяина.

В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен способ очистки рекомбинантного белка арилсульфатазы А (АСА), включающий этапы выделения рекомбинантного белка арилсульфатазы А (АСА) из неочищенного препарата при помощи проведения одного или более хроматографических этапов, при этом на первом хроматографическом этапе применяют колонку с загрузочной емкостью, большей, чем около 4,5 г белка/л смолы (например, большей, чем около 5 г/л, 6 г/л, 7 г/л, 8 г/л, 9 г/л, 10 г/л, 11 г/л, 12 г/л, 13 г/л, 14 г/л, 15 г/л, 16 г/л, 17 г/л, 18 г/л, 19 г/л или 20 г/л); объединения элюата после одного или более хроматографических этапов; доведения pH объединенного элюата до уровня pH, составляющего или превышающего величину около 6,0; и проведения ультрафильтрации и/или диафильтрации элюата с доведенным уровнем pH. В некоторых вариантах реализации изобретения проведение одного или более хроматографических этапов включает проведение этапов в следующем порядке: первого этапа ионообменной хроматографии, хроматографии с комбинированным режимом, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и второго этапа ионообменной хроматографии.

В некоторых вариантах реализации изобретения один или более хроматографических этапов включает аффинную хроматографию. В некоторых определенных вариантах реализации изобретения аффинную хроматографию проводят перед первым этапом ионообменной хроматографии. В некоторых определенных вариантах реализации изобретения аффинную хроматографию проводят после проведения второго этапа ионообменной хроматографии. В некоторых вариантах реализации изобретения аффинную хроматографию проводят между первым этапом ионообменной хроматографии и вторым этапом ионообменной хроматографии.

В некоторых вариантах реализации изобретения проведение одного или более хроматографических этапов включает проведение этапов в следующем порядке: анионообменная хроматография, хроматография с комбинированным режимом, хроматография с гидрофобным взаимодействием и катионообменная хроматография. В некоторых вариантах реализации изобретения проведение одного или более хроматографических этапов включает проведение этапов в следующем порядке: аффинная хроматография, анионообменная хроматография, хроматография с комбинированным режимом, хроматография с гидрофобным взаимодействием и катионообменная хроматография.

В некоторых вариантах реализации изобретения проведение одного или более хроматографических этапов включает проведение этапов в следующем порядке: анионообменная хроматография, хроматография с комбинированным режимом, хроматография с гидрофобным взаимодействием, катионообменная хроматография и аффинная хроматография.

В некоторых вариантах реализации изобретения в методе анионообменной хроматографии применяют колонку со смолой ТМАЕ. В определенных вариантах реализации изобретения ТМАЕ-колонка обладает загрузочной емкостью, составляющей около 5-20 г белка/л смолы (например, около 5-19 г/л, 5-18 г/л, 5-17 г/л, 5-16 г/л, 5-15 г/л, 7,5-20 г/л, 7,5-19 г/л, 7,5-18 г/л, 7,5-17 г/л, 7,5-16 г/л, 7,5-15 г/л, 10-20 г/л, 10-19 г/л, 10-18 г/л, 10-17 г/л, 10-16 г/л или 10-15 г/л). В некоторых вариантах реализации изобретения один этап ультрафильтрации и/или диафильтрации проводят после одного или более хроматографических этапов.

Помимо прочего, в настоящем изобретении предложен рекомбинантный белок арилсульфатазы А (АСА), очищенный в соответствии с описанным в данном документе способом согласно изобретению, и содержащий его фармацевтический состав.

В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен состав, содержащий очищенную рекомбинантную арилсульфатазу А (АСА), имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 1, причем очищенная рекомбинантная АСА обладает специфический активностью, составляющей по меньшей мере 50 Е/мг, и при этом очищенная рекомбинантная АСА содержит менее чем 150 нг/мг белка клетки-хозяина (БКХ) и/или 150 пг/мг ДНК клетки-хозяина (ДКХ). В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная рекомбинантная АСА имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная рекомбинантная АСА содержит менее чем около 140 нг/мг, 130 нг/мг, 120 нг/мг, 110 нг/мг, 100 нг/мг, 90 нг/мг, 80 нг/мг, 70 нг/мг, 60 нг/мг, 50 нг/мг, 40 нг/мг, 30 нг/мг, 20 нг/мг или 10 нг/мг белка клеткихозяина (БКХ). В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная рекомбинантная АСА содержит менее чем около 140 пг/мг, 130 пг/мг, 120 пг/мг, 110 пг/мг, 100 пг/мг, 90 пг/мг, 80 пг/мг, 70 пг/мг, 60 пг/мг, 50 пг/мг, 40 пг/мг, 30 пг/мг, 20 пг/мг или 10 пг/мг ДНК клетки-хозяина.

- 4 030551

В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная рекомбинантная АСА обладает специфической активностью, составляющей по меньшей мере около 50 Е/мг, 60 Е/мг, 70 Е/мг, 80 Е/мг, 90 Е/мг, 100 Е/мг, 110 Е/мг, 120 Е/мг, 130 Е/мг, 140 Е/мг. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная рекомбинантная АСА обладает специфической активностью в диапазоне, составляющем около 50-200 Е/мг (например, около 50-190 Е/мг, 50-180 Е/мг, 50-170 Е/мг, 50-160 Е/мг, 50-150 Е/мг, 50-140

Е/мг, 50-130 Е/мг, 50-120 Е/мг, 50-110 Е/мг, 50-100 Е/мг, 60-140 Е/мг, 60-130 Е/мг, 60-120 Е/мг, 60-110

Е/мг, 60-100 Е/мг, 70-140 Е/мг, 70-130 Е/мг, 70-120 Е/мг, 70-110 Е/мг, 70-100 Е/мг, 80-140 Е/мг, 80-130

Е/мг, 80-120 Е/мг, 80-110 Е/мг, 80-100 Е/мг, 90-140 Е/мг, 90-130 Е/мг, 90-120 Е/мг, 90-110 Е/мг, 90-100

Е/мг, 100-140 Е/мг, 100-130 Е/мг, 100-120 Е/мг, 100-110 Е/мг, 110-140 Е/мг, 110-130 Е/мг, 110-120 Е/мг, 120-140 Е/мг, 120-130 Е/мг или 130-140 Е/мг). В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен состав, содержащий очищенную рекомбинантную арилсульфатазу А (АСА), имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 1, при этом очищенная АСА характеризуется картой гликанов, содержащей одну или более групп пиков, выбранных из групп пиков, характерных для нейтральных (группа пиков 1), моносиалированных (группа пиков 2), кэпированных манноза6-фосфатированных (группа пиков 3), дисиалированных (группа пиков 4), моно-манноза-6фосфатированных (группа пиков 5), гибридных (группа пиков 6) и ди-манноза-6-фосфатированных (группа пиков 7) гликанов. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная АСА характеризуется картой гликанов, содержащей по меньшей мере две или более, три или более, четыре или более, пять или более, шесть или более или семь или более групп пиков 1-7. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная рекомбинантная АСА имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложена лекарственная форма, содержащая описанный в данном документе состав и физиологически приемлемый носитель. В некоторых вариантах реализации изобретения указанная лекарственная форма подходит для внутривенного введения. В некоторых вариантах реализации изобретения указанная лекарственная подходит для интратекального введения. В некоторых вариантах реализации изобретения указанная лекарственная подходит для подкожного введения.

Помимо прочего, в настоящем изобретении предложены способы лечения метахроматической лейкодистрофии, включающие введение нуждающемуся в лечении субъекту описанных в данном документе очищенного рекомбинантного белка АСА, фармацевтического состава или лекарственной формы. Употребляемые в данном документе термины "белок АСА", "АСА", "фермент АСА" или их грамматические эквиваленты, относятся к препарату молекул рекомбинантного белка АСА, если специально не оговорено другое. Употребляемые в данном документе термины "около" и "приблизительно" используются как эквивалентные. Подразумевается, что любые приведенные в данной заявке числовые значения с или без около/приблизительно включают любые нормальные отклонения, приемлемые для специалиста в соответствующей области техники.

Другие особенности, объекты и преимущества настоящего изобретения станут понятны после прочтения нижеприведенного подробного описания. При этом следует понимать, что, несмотря на то, что подробное описание указывает варианты реализации настоящего изобретения, оно приведено исключительно в иллюстративных, но не ограничительных целях. Из подробного описания специалистам в данной области техники станет очевидна возможность внесения различных изменений и модификаций в рамках данного изобретения.

Краткое описание графических материалов

Нижеописанные фигуры, которые вместе составляют графические материалы, приведены исключительно в иллюстративных, но не ограничительных целях.

Фиг. 1 иллюстрирует обобщенную схему типового процесса очистки.

Фиг. 2 иллюстрирует обобщенную схему типового процесса очистки, включающего этап объединения элюата после катионообменной колонки и доведения уровня pH объединенного элюата.

На фиг. 3 приведены типовые результаты, иллюстрирующие корреляцию между скоростью потока поступающего материала, трансмембранным давлением (ТМД) и удельной производительностью для каждой мембраны.

На фиг. 4 проиллюстрированы типовые ДСН-ПААГ гели (с серебром), демонстрирующие сходные профили для полос Fractogel и Q FF на протяжении всего процесса.

На фиг. 5 проиллюстрированы типовые результаты, демонстрирующие, что в испытаниях по осуществимости, включающих один этап УФДФ или УФДФДФ, и контрольных испытаниях наблюдали такой же набор полос, что и в случае стандартного образца (линия 3), что свидетельствует о том, что лекарственное вещество во всех испытаниях демонстрировало сопоставимо низкие уровни БКХ.

На фиг. 6 проиллюстрированы типовые результаты, демонстрирующие сопоставимость между экспериментальными (по осуществимости) и контрольными испытаниями и стандартным образцом, а также то, что при помощи ДСН-ПААГ (с кумасси) не было зарегистрировано никаких новых наборов полос.

- 5 030551

Определения

Для того чтобы настоящее изобретение было более понятным, ниже приведены определения некоторых терминов. Дополнительные определения для следующих терминов и других терминов приведены в тексте описания. Приблизительно или около: Употребляемый в данном документе термин "приблизительно" или "около", применяемый к одной или более представляющим интерес величинам, относится к величине, сходной с установленной исходной величиной. В определенных вариантах реализации изобретения термин "приблизительно" или "около" относится к диапазону величин, составляющему 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в обе стороны (больше или меньше) от установленной исходной величины, если не указано иное или иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое числовое значение превышает 100% от возможной величины).

Биологически активный.

Употребляемое в данном документе выражение "биологически активный" относится к характеристике любого вещества, которое обладает активностью в биологической системе и, в частности, в организме. Например, вещество, которое при введении в организм оказывает на этот организм биологическое воздействие, считается биологически активным. В конкретных вариантах реализации изобретения, если белок или полипептид является биологически активным, часть такого белка или полипептида, которая обладает по меньшей мере одним видом биологической активности белка или полипептида, как правило, называется "биологически активной" частью.

Катион-независимый рецептор манноза-6-фосфата (CI-MPR).

Употребляемый в данном документе термин "катион-независимый рецептор манноза-6-фосфата (CI-MPR)" относится к клеточному рецептору, который связывает метки манноза-6 фосфата (М6Р) на предшественниках кислой гидролазы в аппарате Гольджи, которые предназначены для осуществления транспорта к лизосоме. Кроме манноза-6-фосфата CI-MPR также связывает другие белки, включая IGFII. CI-MPR также известен как "рецептор M6P/IGF-II", "рецептор CI-MPR/IGF-II", "рецептор IGF-II" или "рецептор IGF2". Эти термины и их аббревиатуры взаимозаменяемо употребляются в данном документе.

Хроматография.

Употребляемый в данном документе термин "хроматография" относится к способу разделения смесей. Как правило, смесь растворяют в жидкости, называемой "подвижной фазой", при помощи которой ее проводят через структуру, содержащую другое вещество, называемое "стационарной фазой". Колоночная хроматография представляет собой способ разделения, в котором неподвижный слой находится в трубке, т.е., колонке.

Разбавитель.

Употребляемый в данном документе термин "разбавитель" относится к фармацевтически приемлемому (например, безопасному и нетоксичному для применения на людях) веществу для разбавления, применяемому для получения восстановленного препарата. Типовые разбавители включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекций (БВДИ), pH буферные растворы (например, фосфатносолевой буферный раствор), стерильный солевой раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.

Элюирование.

Употребляемый в данном документе термин "элюирование" относится к процессу экстракции одного вещества из другого путем промывки раствором. Например, в ионообменной хроматографии элюирование - это процесс, предназначенный для промывки загруженных смол для удаления захваченных ионов.

Элюат.

Употребляемый в данном документе термин "элюат" относится к комбинации "носителя" подвижной фазы и анализируемого материала, который выявляют в результате хроматографии, как правило, в результате элюирования.

Ферментозаместителъная терапия (ФЗТ).

Употребляемый в данном документе термин "ферментозаместительная терапия (ФЗТ)" относится к любой лечебной стратегии, которая ликвидирует дефицит ферментов путем введения необходимых ферментов. После введения фермент захватывается клетками и транспортируется к лизосоме, где фермент действует таким образом, чтобы уничтожить материал, который накопился в лизосомах вследствие дефицита ферментов. Как правило, для того, чтобы лизосомная ферментозаместительная терапия была эффективной, терапевтический фермент доставляют в лизосомы соответствующих клеток тканей-мишеней, в которых проявляется дефект накопления. Описанный в данном документе способ очистки можно применять для очистки и получения препарата рекомбинантной арилсульфатазы А в виде лекарственного вещества для ФЗТ МЛ.

Уравновешивать или уравновешивание.

Употребляемые в данном документе применительно к хроматографии термины "уравновешивать" и "уравновешивание" относятся к процессу приведения первой жидкости (например, буфера) в баланс с другой, в общем случае для того, чтобы достичь стабильного и одинакового распределения компонентов жидкости (например, буфера). Например, в некоторых вариантах реализации изобретения хроматогра- 6 030551

фическую колонку можно уравновешивать, пропуская через колонку один или более объемов необходимой жидкости (например, буфера).

Улучшаться, повышаться или снижаться.

Употребляемые в данном документе термины "улучшаться", "повышаться" или "снижаться" или их грамматические эквиваленты дают возможность оценивать величины относительно базового измерения, такого как измерение, проведенное для одной и той же особи до начала лечения, описанного в данном документе, или измерение, проведенное для контрольной особи (или нескольких контрольных особей) в отсутствие лечения, описанного в данном документе. "Контрольной особью" является особь, пораженная той же самой формой лизосомной болезни накопления, что и проходящая лечение особь, приблизительно того же возраста, что и проходящая лечение особь (для гарантии того, что стадии заболевания у проходящей лечение особи и контрольной особи(ей) сравнимы).

Примеси.

Употребляемый в данном документе термин "примеси" относится к веществам, находящимся в ограниченном объеме жидкости, газа или твердого тела, которые отличаются по химическому составу от целевого вещества или соединения. Примеси называют также загрязняющими веществами.

Загрузка.

Употребляемый в данном документе применительно к хроматографии термин "загрузка" относится к добавлению в колонку содержащей образец жидкости или твердой фазы. В некоторых вариантах реализации изобретения загружаемые в колонку определенные компоненты образца захватываются при прохождении загруженного образца через колонку. В некоторых вариантах реализации изобретения загружаемые в колонку определенные компоненты образца не захватываются или "протекают через" колонку при прохождении загруженного образца через колонку.

Полипептид.

В контексте данного документа "полипептид" в общем случае представляет собой цепь из по меньшей мере двух аминокислот, соединенных друг с другом пептидной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид может содержать по меньшей мере 3-5 аминокислот, каждая из которых соединена с другими посредством по меньшей мере одной пептидной связи. Специалистам в данной области техники понятно, что иногда полипептиды включают аминокислоты "неприродного происхождения" или, необязательно, другие соединения, которые способны интегрироваться в полипептидную цепь.

Объединение.

Употребляемый в данном документе в отношении хроматографии термин "объединение" относится к смешиванию одной или более фракций жидкости, которые вместе прошли через колонку. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения одну или более фракций, которые содержат необходимый компонент образца, который был выделен при помощи хроматографии (например, "пиковые фракции"), можно "объединять" вместе для получения единой "объединенной" фракции (или "пула").

Заместительный фермент.

Употребляемый в данном документе термин "заместительный фермент" относится к любому ферменту, который может действовать таким образом, чтобы по меньшей мере частично заместить дефицитный или отсутствующий фермент при заболевании, лечение которого проводится. В некоторых вариантах реализации изобретения термин "заместительный фермент" относится к любому ферменту, который может действовать таким образом, чтобы по меньшей мере частично заместить дефицитный или отсутствующий лизосомный фермент при лизосомной болезни накопления, лечение которой проводится. В некоторых вариантах реализации изобретения заместительный фермент (например, рАСА) способен снижать количество накопленного материала в лизосомах млекопитающих или может снимать или облегчать один или более симптомов лизосомной болезни накопления (например, МЛ). Заместительные ферменты, подходящие в целях данного изобретения, включают лизосомные ферменты, как дикого типа, так и модифицированные, и могут быть получены при помощи рекомбинантных и синтетических методов или выделены из природных источников. Заместительный фермент может быть рекомбинантным, синтетическим, генно-активируемым или природным ферментом.

Растворимый.

Употребляемый в данном документе термин "растворимый" относится к способности терапевтического вещества образовывать гомогенный раствор. В некоторых вариантах реализации изобретения растворимость терапевтического вещества в растворе, в который оно введено и посредством которого оно доставляется к целевому участку действия, достаточна для того, чтобы сделать возможной доставку терапевтически эффективного количества терапевтического вещества к целевому участку действия. На растворимость терапевтических веществ могут влиять несколько факторов. Например, соответствующие факторы, которые могут влиять на растворимость белка, включают ионную силу, аминокислотную последовательность и наличие других совместно растворяемых веществ или солей (например, солей кальция). В некоторых вариантах реализации изобретения терапевтические вещества в соответствии с настоящим изобретением растворяются в соответствующих фармацевтических составах.

Стабильность.

- 7 030551

Употребляемый в данном документе термин "стабильность" относится к способности терапевтического вещества (например, рекомбинантного фермента) сохранять терапевтическую эффективность (например, всю или большую часть своей предполагаемой биологической активности и/или физиохимической целостности) на протяжении длительных периодов времени. Стабильность терапевтического вещества и способность фармацевтического состава поддерживать стабильность такого терапевтического вещества может быть достигнута на протяжении длительных периодов времени (например, на протяжении по меньшей мере 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 месяцев или более). В контексте составления лекарственных форм стабильной лекарственной формой является та, в которой терапевтическое вещество в значительной степени сохраняет свою физическую и/или химическую целостность и биологическую активность при хранении и во время обработки (такой как замораживание/размораживание, механическое смешивание и лиофилизация). Стабильность белков можно определить по образованию высокомолекулярных (ВМ) агрегатов, потере ферментативной активности, образованию пептидных фрагментов и сдвигу зарядных профилей.

Вирусная обработка.

Употребляемый в данном документе термин "вирусная обработка" относится к "вирусному удалению", во время которого вирусы просто удаляют из образца (например, вирусной фильтрации), или "вирусной инактивации", во время которой вирусы остаются в образце, но в неинфицирую щей форме. В некоторых вариантах реализации изобретения для вирусного удаления, помимо прочего, можно применять нанофильтрацию и/или хроматографические методы. В некоторых вариантах реализации изобретения для вирусной инактивации, помимо прочего, можно применять инактивацию раствором, инактивацию детергентом, пастеризацию, инактивацию кислотным pH и/или инактивацию ультрафиолетом.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предложены, помимо прочего, усовершенствованные способы очистки белка АСА, полученного рекомбинантно для ферментозаместительной терапии. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен способ выделения рекомбинантного белка АСА из неочищенного препарата (например, необработанных биологических материалов, таких как АСАсодержащая культуральная клеточная среда), применяя процесс, включающий после хроматографии только один этап ультрафильтрации/диафильтрации. В некоторых вариантах реализации изобретения этот одноэтапный процесс УФ/ДФ достигается объединением элюата после хроматографических этапов и доведением pH объединенного элюата до около 6,0. В некоторых вариантах реализации этот упрощенный способ комбинируют с хроматографическими этапами с высокой загрузочной емкостью для облегчения крупномасштабного производства рекомбинантного белка АСА. В следующих подразделах подробно описаны различные аспекты данного изобретения. Использование подразделов не ограничивает изобретение.

Каждый подраздел можно применять в отношении любого аспекта изобретения. В данной заявке употребление "или" обозначает "и/или", если не указано иное.

Арилсульфатаза А.

Арилсульфатаза А (АСА, ARSA или цереброзид-сульфатаза) представляет собой фермент, который расщепляет цереброзид-3-сульфат (или сульфатид) на цереброзид и сульфат. В частности, галактозилсульфатид нормально метаболизируется в ходе гидролиза соединения 3-0-сульфат с образованием галактоцереброзида при совместном воздействии лизомосного фермента арилсульфатазы А (EC3.1.6.8) (Austin et al., Biochem J. 1964, 93, 15C-17C) и белка-активатора сфинголипидов, называемого сапозином В. Дефицит арилсульфатазы А возникает во всех тканях у пациентов с поздней инфантильной, ювенальной и приобретенной формой метахроматической лейкодистрофии (МЛ). При употреблении в данном документе белок арилсульфатазы А обозначается как "АСА" или "ARSA", a сапозин В обозначается как "Sap-B".

Арилсульфатаза А является кислым гликопротеином с низкой изоэлектрической точкой. При уровне pH около 6,5 фермент существует в виде мономера с молекулярной массой, составляющей приблизительно 100 кДа. В кислых условиях АСА существует в виде 480 кДа октамера фЖоколо 5,0), но диссоциирует на димеры при нейтральных уровнях pH. В моче человека фермент состоит из двух неидентичных субъединиц по 63 и 54 кДа (Laidler PM et al., Biochim Biophys Acta. 1985, 827, 73-83). Арилсульфатаза А, выделенная из печени, плаценты и фибробластов человека также состоит из двух субъединиц немного разных размеров, варьирующихся от 55 до 64 кДа (Draper RK et al., Arch Biochemica Biophys 1976, 177, 525-538, Waheed A et al., Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1982, 363, 425-430, Fujii T et al., Biochim Biophys Acta. 1992, 15 1122, 93-98). Как и в случае других лизосомных ферментов, арилсульфатаза А синтезируется на мембраносвязанных рибосомах в виде гликозилированного предшественника. Затем она проходит через эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи, где происходит процессинг Nсвязанных олигосахаридов с образованием фосфорилированного и сульфированного олигосахарида комплексного типа (Waheed A et al., Biochim Biophys Acta. 1985, 847, 53-61, Braulke T et al., Biochem Biophys Res Commun. 1987, 143, 178-185). В нормальных культивируемых фибробластах вырабатывается полипептид-предшественник размером 62 кДа, который транслоцируется через связывание рецептора манноза-6-фосфата (Braulke T et al., J Biol Chem. 1990, 265, 6650-6655) в кислую прелизосомную эндосому

- 8 030551

(Kelly BM et al., Eur J Cell Biol. 1989, 48, 71-78).

Описанные в данном документе способы можно применять для выделения арилсульфатазы А из любого источника, например, из тканей или культивируемых клеток (например, клеток человека (например, фибробластов), которые рекомбинантно вырабатывают арилсульфатазу А). Арилсульфатазу А любого происхождения, включая, но не ограничиваясь этим, людей и других животных, таких как млекопитающие, можно получить описанными в данном документе способами. Длина (18 аминокислот) сигнального пептида человеческой арилсульфатазы А связана с консенсусной последовательностью и специфическим сайтом процессинга сигнальной последовательности. Следовательно, из расшифрованной кДНК человеческой АСА (EMBL номера доступа в GenBank J04593 и Х521151) следует, что отщепление сигнального пептида происходит во всех клетках после остатка номер 18 (Ala), что приводит к образованию зрелой формы человеческой арилсульфатазы А. При употреблении в данном документе рекомбинантная арилсульфатаза А обозначается аббревиатурой "рАСА". Зрелая форма арилсульфатазы А, включая зрелую форму человеческой арилсульфатазы А, обозначается "зАСА", а зрелая рекомбинантная человеческая АСА обозначается "зрчАСА". Множественные формы арилсульфатазы А были выявлены при помощи электрофореза и изоэлектрического фокусирования ферментных препаратов из человеческой мочи (Luijten JAFM et al., J Mol Med. 1978, 3, 213), лейкоцитов (Dubois et al., Biomedicine. 1975, 23, 116-119, Manowitz P et al., Biochem Med Metab Biol. 1988, 39, 117-120), тромбоцитов (Poretz et al., Biochem J. 1992, 287, 979-983), культивированных фибробластов (Waheed A et al., Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1982, 363, 425-430, Stevens RL et al., Biochim Biophys Acta. 1976, 445, 661-671, Farrell DF et al., Neurology. 1979, 29, 16-20) и печени (Stevens RL et al., Biochim Biophys Acta. 1976, 445, 661-671, Farrell DF et al., Neurology. 1979, 29, 16-20, Sarafian ТА et al., Biochem Med. 1985, 33, 372-380). Обработка эндогликозидазой Н, сиалидазой и щелочной фосфатазой снижает молекулярный размер и сложность электрофоретического спектра, что позволяет предположить, что зарядовая гетерогенность арилсульфатазы А обусловлена в основном различиями в углеводном содержании фермента. Активный сайт арилсульфатазы А содержит незаменимый остаток гистидина (Lee GD and Van Etten RL, Arch Biochem Biophys. 1975, 171, 424-434) и два или более остатков аргинина (James GT, Arch Biochem Biophys. 1979, 97, 57-62).

Многие анионы являются ингибиторами фермента в концентрациях, соответствующих миллимолярному диапазону или ниже.

Была описана структура гена человеческой арилсульфатазы А. При употреблении в данном документе этот ген обозначается как "ARSA". При этом, в некоторых случаях, "ARSA" может также относиться к белку арилсульфатазы А. Ген ARSA расположен вблизи конца длинного плеча хромосомы 22 (22q13.31-qter), он простирается на 3,2 т.п.н. (Kreysing et al., Eur J Biochem. 1990, 191, 627-631) и состоит из восьми экзонов, определяющих единицу фермента из 507 аминокислот (Stein et al., J Biol Chem. 1989, 264, 1252-1259). В клетках фибробластов были зарегистрированы информационные РНК размером 2,1, 3,7 и 4,8 т.п.н. с участком в 2,1 т.п.н., который очевидно отвечает за объем активной арилсульфатазы А, вырабатываемый клеткой (Kreysing et al., Eur J Biochem. 1990, 191, 627-631). Последовательность ARSA была помещена в EMBL GenBank под номером доступа Х521150. Отличия между опубликованной кДНК и кодирующей частью ARSA были описаны у Kreysing et al. (Eur J Biochem. 1990, 191, 627-631). Последовательность кДНК, изначально описанная Stein et al., (J Biol Chem. 1989, 264, 1252-1259) и последовательность кДНК, описанная Kreysing et al., (Eur J Biochem. 1990, 191, 627-631) была помещены в EMBL GenBank под следующими номерами доступа: J04593 и Х521151, соответственно. В гене ARSA определили наличие нескольких полиморфизмов и более 40 мутаций, связанных с заболеваниями (Gieselmann et al., Hum Mutat. 1994, 4, 233-242, Barth et al., Hum Mutat. 1995, 6, 170-176, Draghia et al., Hum Mutat. 1997, 9, 234-242). Связанные с заболеваниями мутации в гене ARSA можно разделить на две больших группы, которые хорошо коррелируют с клиническим фенотипом МЛ. Одна группа (I) не вырабатывает активного фермента, иммунореактивного белка и не проявляет активности АСА при внесении в культивируемые животные клеточные линии. Другая группа (А) вырабатывает в культивируемых клетках небольшие количества перекрестно реагирующего материала и низкие уровни функционального фермента. У особей, гомозиготных в отношении мутации группы (I) или несущих две разные мутации из этой группы, проявляется поздняя инфантильная МЛ. У большинства особей с одной мутацией группы (I) и одной мутацией группы (А) развивается форма с ювенильным началом, в то время как у тех, кто несет две мутации группы (А) в общем случае проявляется взрослая форма МЛ. Некоторые мутации обнаруживаются относительно часто, в то время как другие наблюдали только в случаях единичных семейств. Специфические мутации можно отслеживать по представителям многих семейств, однако общее исследование на носительство на данный момент неосуществимо.

Кроме вышеописанных мутаций, связанных с заболеваниями, в гене ARSA обнаружили несколько полиморфизмов. У некоторых клинически здоровых родителей пациентов с МЛ, а также среди населения в целом, была обнаружена крайне низкая активность АСА. Этот так называемый псевдодефицит АСА связан с обычным полиморфизмом гена ARSA (Gieselmann et al., Dev Neurosci. 1991, 13, 222-227).

Рекомбинантный белок АСА.

Употребляемый в данном документе термин "рекомбинантный белок АСА" относится к любой молекуле или части молекулы, которая может восполнить, по меньшей мере частично, активность белка

- 9 030551

арилсульфатазы А (АСА) природного происхождения или устранить один или более из фенотипов или симптомов, связанных с дефицитом АСА. Употребляемые в данном документе термины "рекомбинантный фермент АСА" и "рекомбинантный белок АСА" и их грамматические эквиваленты используются взаимозаменяемо. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение применяют для очистки рекомбинантного белка АСА, который представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность в значительной степени сходную или идентичную зрелому белку АСА человека. Как правило, человеческая АСА вырабатывается в виде молекулы-предшественника, которая процессируется в зрелую форму. Это процесс в общем случае происходит за счет удаления 18-аминокислотного сигнального пептида. Обычно форму белка-предшественника также называют полноразмерным предшественником или полноразмерным белком АСА, который содержит 507 аминокислот. 18 N-терминальных аминокислот отщепляются, что приводит к образованию зрелой формы длиной в 489 аминокислот. Таким образом, предполагается, что 18 N-терминальных аминокислот в общем случае не являются необходимыми для активности белка АСА. Аминокислотные последовательности зрелой формы (SEQ ID NO: 1) и полноразмерного предшественника (SEQ ID NO: 2) типичного человеческого белка АСА дикого типа или природного происхождения приведены в табл. 1.

Таблица 1. Человеческая арилсульфатаза А.

Зрелая форма

RPPNIVLIFADDLGYGDLGCYGHPSSTTPNLDQLAAGGLRFTDFYVPVSLCTPS RAALLTGRLPVRMGMYPGVLVPSSRGGLPLEEVTVAEVLAARGYLTGMAGKWHL GVGPEGAFLPPHQGFHRFLGIPYSHDQGPCQNLTCFPPATPCDGGCDQGLVPIP LLANLSVEAQPPWLPGLEARYMAFAHDLMADAQRQDRPFFLYYASHHTHYPQFS GQSFAERSGRGPFGDSLMELDAAVGTLMTAIGDLGLLEETLVIFTADNGPETMR MSRGGCSGLLRCGKGTTYEGGVREPALAFWPGHIAPGVTHELASSLDLLPTLAA LAGAPLPNVTLDGFDLSPLLLGTGKSPRQSLFFYPSYPDEVRGVFAVRTGKYKA HFFTQGSAHSDTTADPACHASSSLTAHEPPLLYDLSKDPGENYNLLGGVAGATP EVLQALKQLQLLKAQLDAAVTFGPSQVARGEDPALQICCHPGCTPRPACCHCPD РИА (SEQ ID N0:1)

Полноразмерный предшественник

MGAPRSLLLALAAGLAVARPPNIVLIFADDLGYGDLGCYGHPSSTTPNLDQLAA GGLRFTDFYVPVSLCTPSRAALLTGRLPVRMGMYPGVLVPSSRGGLPLEEVTVA EVLAARGYLTGMAGKWHLGVGPEGAFLPPHQGFHRFLGIPYSHDQGPCQNLTCF PPATPCDGGCDQGLVPIPLLANLSVEAQPPWLPGLEARYMAFAHDLMADAQRQD RPFFLYYASHHTHYPQFSGQSFAERSGRGPFGDSLMELDAAVGTLMTAIGDLGL LEETLVIFTADNGPETMRMSRGGCSGLLRCGKGTTYEGGVREPALAFWPGHIAP GVTHELASSLDLLPTLAALAGAPLPNVTLDGFDLSPLLLGTGKSPRQSLFFYPS YPDEVRGVFAVRTGKYKAHFFTQGSAHSDTTADPACHASSSLTAHEPPLLYDLS KDPGENYNLLGGVAGATPEVLQALKQLQLLKAQLDAAVTFGPSQVARGEDPALQ ICCHPGCTPRPACCHCPDPHA (SEQ ID N0:2)

Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, представляет собой зрелый человеческой белок АСА (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, может являться гомологом или аналогом зрелого человеческого белка АСА. Например, гомолог или аналог зрелого человеческого белка АСА может представлять собой модифицированный зрелый человеческой белок АСА, содержащий одну или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с белком АСА дикого типа или природного происхождения (например, SEQ ID NO: 1), и при этом в значительной степени сохранять активность белка АСА. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, является в значительной степени гомологичным зрелому человеческому белку АСА (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичную SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, является в значительной степени идентичным зрелому человеческому белку АСА (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, содержит фрагмент или часть зрелого человеческого белка АСА. В другом варианте рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, представляет собой полноразмерный белок АСА. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА может являться гомологом или аналогом полноразмерного человеческого белка АСА. Например, гомолог или аналог полноразмерного человеческого белка АСА может представлять собой модифицированный полноразмерный человеческой белок АСА, содержащий одну или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с полнораз- 10 030551

мерным белком АСА дикого типа или природного происхождения (например, SEQ ID NO: 2), и при этом в значительной степени сохранять активность белка АСА. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, является в значительной степени гомологичным полноразмерному человеческому белку АСА (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичную SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, является в значительной степени идентичным SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА, очищенный согласно вариантам реализации настоящего изобретения, содержит фрагмент или часть полноразмерного человеческого белка АСА. Упоминаемый в данном документе полноразмерный белок АСА, как правило, содержит сигнальную пептидную последовательность. Гомологи или аналоги человеческих белков АСА можно получить в соответствии со способами изменения полипептидной последовательности, известными специалисту в данной области техники, такими как те, которые приведены в ссылках, которые описывают такие способы. В некоторых вариантах реализации изобретения консервативные замены аминокислот, включают замены, проведенные среди аминокислот в пределах следующих групп: (a) М, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; и (g) E, D. В некоторых вариантах реализации изобретения выражение "консервативная аминокислотная замена" относится к аминокислотной замене, которая не приводит к изменению относительного заряда или размерных характеристик белка, в котором проведена аминокислотная замена. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантные белки АСА могут содержать компонент, который связывается с рецептором на поверхности клеток-мишеней для облегчения клеточного поглощения и/или лизосомного нацеливания. Например, таким рецептором может быть катион-независимый рецептор манноза-6-фосфата (CI-MPR), который связывает остатки манноза-6-фосфата (М6Р). Кроме того, CI-MPR также связывает другие белки, включая IGF-II. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА содержит на поверхности остатки М6Р. В частности, рекомбинантный белок АСА может содержать бис-фосфорилированные олигосахариды, которые обладают более высокой аффинностью связывания с CI-MPR. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящий фермент в среднем содержит по меньшей мере около 20% бисфосфорилированных олигосахаридов на фермент. В других вариантах реализации изобретения подходящий фермент может содержать около 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% бис-фосфорилированных олигосахаридов на фермент.

В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантные ферменты АСА могут быть слитыми с нацеленным на лизосомы компонентом, который способен связываться с рецептором на поверхности клеток-мишеней. Подходящими нацеленными на лизосомы компонентами могут быть IGF-I, IGFII, RAP, p97, а также их варианты, гомологи и фрагменты (например, включая те пептиды, которые имеют последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичную пептидной последовательности зрелых человеческих IGF-I, IGF-II, RAP, p97 дикого типа). Нацеленный на лизосомы компонент может быть конъюгирован или слит с белком или ферментом АСА в N-конце, С-конце или внутренним образом.

Получение рекомбинантных белков АСА

Настоящее изобретение можно применять для очистки рекомбинантного белка АСА, полученного разными способами. Например, белок АСА может быть получен рекомбинантно при помощи системы клетки-хозяина, сконструированной для экспрессии кодирующей АСА нуклеиновой кислоты. В другом варианте белок АСА может быть получен путем активации эндогенного гена АСА. Предполагается, что настоящее изобретение можно применять для очистки рекомбинантного белка АСА, полученного при помощи разных экспрессионных систем. Подходящие экспрессионные системы включают, например, яйцеклетки, клетки бакуловирусов, растений, дрожжей или млекопитающих. В некоторых вариантах реализации изобретения ферменты АСА получают в клетках млекопитающих. Неограничивающие примеры клеток млекопитающих, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, включают линию миеломы мышей штамма BALB/c (NSO/l, ECACC No: 85110503); ретинобласты человека (PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands); почечную линию обезьян CV1, трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); эмбриональную почечную линию человека (клетки HEK293 или 293, субклонированные для выращивания в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клеточную линию фибросаркомы человека (например, HT1080); клетки почек новорожденного хомяка (BHK21, ATCC CCL 10); клетки яичников китайского хомяка +/-DHFR (СНО, Urlaub and Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); клетки почек обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки

- 11 030551

(VERO-76, ATCC CRL-1 587); клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, ATCC CCL 2); клетки почек собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени серой крысы (BRL 3А, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); клетки MRC 5; клетки FS4; и линию гепатомы человека (Hep G2).

В некоторых вариантах реализации изобретения способы в соответствии с настоящим изобретением применяют для очистки рекомбинантных ферментов АСА, полученных из клеток человека (например, HT1080). В некоторых вариантах реализации изобретения способы в соответствии с настоящим изобретением применяют для очистки рекомбинантных ферментов АСА, полученных из клеток CHO. Как правило, клетки, которые сконструированы для экспрессии рекомбинантной АСА, могут содержать трансген, который кодирует описанный в данном документе рекомбинантный белок АСА. Следует учитывать, что нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантную АСА, могут содержать регуляторные последовательности, генные контрольные последовательности, промоторы, некодирующие последовательности и/или другие подходящие последовательности для экспрессии рекомбинантной АСА. Как правило, кодирующая область функционально связана с одним или более из этих компонентов нуклеиновой кислоты. "Регуляторные последовательности", как правило, относятся к нуклеотидным последовательностям, расположенным выше (5' некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3' некодирующие последовательности) кодирующей последовательности, которые оказывают влияние на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или трансляцию ассоциированной с ней кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать промоторы, трансляционные лидерные последовательности, интроны и последовательности узнавания полиаденилирования. В некоторых случаях "регуляторные последовательности" также называют "генными контрольными последовательностями".

"Промотором", как правило, называют нуклеотидную последовательность, способную управлять экспрессией кодирующей последовательности или функциональной РНК. В общем случае кодирующая последовательность расположена в направлении 3' относительно последовательности промотора. Последовательность промотора состоит из близкорасположенных и более удаленных вышележащих элементов, при этом последние часто называют энхансерами. Соответственно, "энхансер" представляет собой нуклеотидную последовательность, которая может стимулировать активность промотора и может являться природным элементом промотора или гетерологичным элементом, добавленным для того, чтобы повысить уровень или тканевую специфичность промотора. Промоторы могут быть целиком получены из нативного гена или могут быть составлены из разных элементов, полученных из разных промоторов природного происхождения, или даже содержать синтетические нуклеотидные сегменты. Специалистам в данной области техники понятно, что разные промоторы могут управлять экспрессией гена в разных тканях или типах клеток, или на разных стадиях развития, или в ответ на разные внешние условия.

"3' некодирующими последовательностями" обычно называются нуклеотидные последовательности, расположенные ниже кодирующей последовательности, и включающие последовательности узнавания полиаденилирования и другие последовательности, кодирующие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию генов. Сигнал полиаденилирования обычно характеризуется влиянием на добавление трактов полиадениловой кислоты к 3' концу предшественника мРНК. "Трансляционной лидерной последовательностью" или "5' некодирующими последовательностями" обычно называется нуклеотидная последовательность, расположенная в гене между последовательностью промотора и кодирующей последовательностью. Трансляционная лидерная последовательность присутствует в полностью процессированной мРНК выше последовательности инициации трансляции. Трансляционная лидерная последовательность может влиять на процессинг первичного транскрипта в мРНК, стабильность мРНК или трансляционную эффективность.

Как правило, термин "функционально связанный" относится к соединению двух или более нуклеотидных фрагментов в один нуклеотидный фрагмент таким образом, что один фрагмент влияет на функционирование другого. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он способен влиять на экспрессию этой кодирующей последовательности (т.е., если кодирующая последовательность находится под транскрипционным управлением промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации. Кодирующая область трансгена может содержать одну или более молчащих мутаций для оптимизации частоты использования кодонов для конкретного типа клеток. Например, кодоны трансгена АСА можно оптимизировать для экспрессии в клетках позвоночных. В некоторых вариантах реализации изобретения кодоны трансгена АСА можно оптимизировать для экспрессии в клетках млекопитающих. В некоторых вариантах реализации изобретения кодоны трансгена АСА можно оптимизировать для экспрессии в клетках человека. Необязательно, конструкция может содержать дополнительные компоненты, такие как один или более из следующих элементов: сайт сплайсинга, последовательность энхансера, ген селектируемого маркера под управлением соответствующего промотора, ген амплифицируемого маркера под управлением соответствующего промотора и участок прикрепления к матриксу (УПМ) или любой другой известный в данной области техники элемент, который повышает экспрессию области, в которую он вставлен.

- 12 030551

После трансфицирования или трансдуцирования в клетки-хозяев подходящий вектор может экспрессировать внехромосомно (эписомально) или интегрироваться в геном клетки-хозяина.

Среды и условия для культивирования клеток

Для получения рекомбинантного белка АСА можно применять различные среды и условия для культивирования клеток. Например, рекомбинантный белок АСА можно получить в содержащей сыворотку или бессывороточной среде. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА получают в бессывороточной среде. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА получают в неживотной среде, т.е., среде, в которой отсутствуют компоненты животного происхождения. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА получают в химически определенной среде. Употребляемый в данном документе термин "химически определенная питательная среда" относится к среде, практически все химические компоненты которой известны. В некоторых вариантах реализации изобретения химически определенная питательная среда не содержит компонентов животного происхождения, таких как сыворотка, сывороточные белки (например, альбумин или фетуин) и другие компоненты. В некоторых случаях химически определенная среда содержит один или более белков (например, белковых факторов роста или цитокинов). В некоторых случаях химически определенная питательная среда содержит один или более гидролизатов белка. В других случаях химически определенная питательная среда является безбелковой средой, т.е., бессывороточной средой, которая не содержит белков, гидролизатов или компонентов с неизвестным составом.

В некоторых вариантах реализации изобретения химически определенная питательная среда может быть дополнена одним или более компонентами животного происхождения. Такие компоненты животного происхождения включают, но не ограничиваются этим, фетальную телячью сыворотку, лошадиную сыворотку, козлиную сыворотку, ослиную сыворотку, человеческую сыворотку и сывороточные белки, такие как альбумины (например, бычий сывороточный альбумин или человеческий сывороточный альбумин). Наряду с тем, что добавление сыворотки является желательным, так как она содержит такие компоненты, как витамины, аминокислоты, факторы роста и гормоны, она также является концентрированным источником экзогенного белка, который может блокировать очистку рекомбинантного белка. Например, белки фетуина относятся к семейству родственных сывороточных белков, секретируемых клетками, главным образом, гепатоцитами, и содержат три характеристических домена (Brown WM, et al., Eur J Biochem. 1992 Apr 1;205(1):321-31). Фетуины присутствуют в большом количестве во время эмбрионального периода жизни и, следовательно, часто присутствуют в большом количестве в коммерчески доступных полученных из эмбрионов сыворотках и являются основным загрязняющим белковым веществом во время очистки. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения подходящая среда является средой, не содержащей ксенобиотиков, например, средой, которая не содержит ни бычьей сыворотки, ни компонентов, полученных из бычьей сыворотки. Например, среда, не содержащая ксенобиотиков, может содержать один или более компонентов из человеческого сывороточного альбумина, человеческого трансферрина, человеческого инсулина и человеческих липидов. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящая среда содержит сыворотку без фетуина. Фетуин можно удалить из сыворотки различными известными в данной области техники способами. Например, фетуин можно удалить из сыворотки при помощи аффинной хроматографии с применением антител. (Смотрите, например, Toroian D and Price PA, Calcif Tissue Int (2008) 82:116-126). В некоторых вариантах реализации изобретения подходящая среда не содержит фетуина.

Для крупномасштабного получения рекомбинантных белков АСА можно применять различные условия клеточного культивирования, включая, но не ограничиваясь этим, культивирование в роллерных флаконах, периодическое культивирование в биореакторах и периодическое культивирование с подпиткой в биореакторах. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА получают при помощи клеток, культивируемых в суспензии. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА получают при помощи адгезивных клеток.

Очистка рекомбинантной арилсульфатазы А

Варианты реализации изобретения включают способы очистки для получения арилсульфатазы А ("АСА"), в частности, лекарственных веществ на основе рекомбинантной человеческой АСА ("рчАСА"). Для получения очищенного лекарственного вещества АСА можно применять большое количество методик, в целом или частично, необязательно, с описанными в данном документе модификациями. Например, на фиг. 1 проиллюстрирована обобщенная схема варианта реализации данного изобретения. Данный типовой процесс очистки начинают с размораживания и объединения неочищенной массы (НМ) рчАСА, которую затем захватывают и фильтруют путем ультрафильтрации и диафильтрации ("УФДФ"). После фильтрации захваченный материал можно подвергать вирусной инактивации (не показано) перед хроматографической очисткой. В конкретном проиллюстрированном варианте реализации изобретения на последующих четырех этапах очистки применяют подряд четыре хроматографические колонки: анионообменную колонку (например, колонку Q Sepharose Fast Flow ("Q-FF")), колонку с керамическим гидроксиапатитом (HA) типа I, колонку с фенилом и катионообменную (например, SP) колонку. После четвертого и конечного этапа хроматографии SP-элюат концентрируют и диафильтруют путем тангенциальной поточной ультрафильтрации. Затем проводят вирусную фильтрацию (например, через вирусный фильтр

- 13 030551

Planova® 20N) полученного в результате фильтрата с последующим вторым этапом концентрации и диафильтрации для получения требуемой конечной концентрации белка. Для сравнения на фиг. 2 проиллюстрирован другой типовой вариант реализации изобретения. Данный процесс происходит так, как показано на фиг. 1, необязательно, с применением одной или более отличных хроматографических смол (например, анионообменной смолы ТМАЕ). При этом после четвертого и конечного этапа хроматографии SP-элюат объединяют и доводят его уровень pH. В некоторых вариантах реализации изобретения уровень pH доводят до величины между 5,5 и 6,5 (например, около 6,0). Затем проводят вирусную фильтрацию полученного в результате катионообменного элюата с доведенным pH с последующим одним этапом концентрации и диафильтрации для получения требуемой конечной концентрации белка. Необязательные усовершенствования этих процессов и дополнительные варианты реализации изобретения описаны в данном документе.

При употреблении в данном документе "загрязняющее вещество" представляет собой материал, отличный от требуемого полипептидного продукта, например, арилсульфатазы А (АСА). Загрязняющее вещество может являться вариантной формой требуемого полипептида (например, деамидированным вариантом или амино-аспартатным вариантом требуемого полипептида) или другой молекулой, например, полипептидом, нуклеиновой кислотой и эндотоксином. При употреблении в данном документе под "очисткой" полипептида из состава или образца, содержащего полипептид и одно или более загрязняющих веществ, подразумевается повышение степени очистки полипептида в составе или образце путем удаления (полного или частичного) по меньшей мере одного загрязняющего вещества из состава или образца. "Этап очистки" может быть частью общего процесса очистки, который приводит к получению состава, содержащего по меньшей мере около 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% или 99,9% по массе представляющего интерес полипептида относительно общей массы состава. Степень очистки арилсульфатазы А можно определить, например, одним или более способами: вестерн-блоттингом для определения содержания белка клетки-хозяина (БКХ), ДСНПААГ с окрашиванием кумасси, ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром, обратно-фазовой ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ. Например, при определении при помощи описанного в данном документе метода, в некоторых вариантах реализации изобретения специфическая активность очищенной арилсульфатазы А составляет по меньшей мере около 50 Е/мг, 60 Е/мг, 70 Е/мг, 80 Е/мг, 90 Е/мг, 100 Е/мг, 110 Е/мг, 120 Е/мг, 130 Е/мг, 140 Е/мг. Например, при определении при помощи описанного в данном документе метода, в некоторых вариантах реализации изобретения специфическая активность очищенной арилсульфатазы А соответствует диапазону, составляющему около 50-200 Е/мг (например, около 50-190 Е/мг, 50-180 Е/мг, 50-170 Е/мг, 50-160 Е/мг, 50-150 Е/мг, 50-140 Е/мг, 50-130 Е/мг, 50-120 Е/мг, 50-110 Е/мг, 50-100

Е/мг, 60-140 Е/мг, 60-130 Е/мг, 60-120 Е/мг, 60-110 Е/мг, 60-100 Е/мг, 70-140 Е/мг, 70-130 Е/мг, 70-120

Е/мг, 70-110 Е/мг, 70-100 Е/мг, 80-140 Е/мг, 80-130 Е/мг, 80-120 Е/мг, 80-110 Е/мг, 80-100 Е/мг, 90-140

Е/мг, 90-130 Е/мг, 90-120 Е/мг, 90-110 Е/мг, 90-100 Е/мг, 100-140 Е/мг, 100-130 Е/мг, 100-120 Е/мг, 100110 Е/мг, 110-140 Е/мг, 110-130 Е/мг, 110-120 Е/мг, 120-140 Е/мг, 120-130 Е/мг или 130-140 Е/мг).

Исходным материалом в процессе очистки является любой неочищенный препарат. Например, неочищенным препаратом могут быть необработанная клеточная культуральная среда, содержащая рекомбинантный белок АСА, секретируемый клетками (например, клетками млекопитающих), вырабатывающими белок АСА, или сырые клеточные лизаты, содержащие белок АСА. В некоторых вариантах реализации изобретения неочищенным препаратом могут быть частично обработанная клеточная среда или клеточные лизаты. Например, клеточную среду или клеточные лизаты можно концентрировать, разводить, обрабатывать путем вирусной инактивации, вирусной обработки или вирусного удаления. В некоторых вариантах реализации изобретения для вирусного удаления, помимо прочего, можно применять нанофильтрацию и/или хроматографические методы. В некоторых вариантах реализации изобретения для вирусной инактивации, помимо прочего, можно применять инактивацию раствором, инактивацию детергентом, пастеризацию, инактивацию кислотным pH и/или инактивацию ультрафиолетом. Клеточную среду или клеточные лизаты также можно обрабатывать протеазами, ДНКазами и/или РНКазами для того, чтобы снизить уровень белка и/или нуклеиновых кислот (например, ДНК или РНК) клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации изобретения необработанные или частично обработанные биологические материалы (например, клеточную среду или клеточный лизат) можно замораживать и хранить при выбранной температуре (например, 2-8°C, -4°C, -25°C, -75°C) на протяжении некоторого времени, а затем размораживать для очистки. В контексте данного документа неочищенным препаратом также называют исходный материал или загрузочный материал.

Описанные в данном документе способы очистки могут включать, без ограничений, один или более из следующих этапов: глубинную фильтрацию, вирусную инактивацию, ионообменную хроматографию (например, анионообменную хроматографию и/или катионообменную хроматографию), хроматографию с комбинированным режимом, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, ультрафильтрацию/диафильтрацию и фильтрацию в целях удаления вирусов. В некоторых вариантах реализации изобретения описанные в данном документе способы очистки дополнительно включают аффинную хроматографию. Во время хроматографических этапов подходящий объем смолы, применяемый для загрузки в хроматографическую колонку, зависит от размеров колонки, т.е., диаметра колонки и высоты столба

- 14 030551

смолы, и варьируется в зависимости от, например, количества белка в применяемом растворе и связывающей способности применяемой смолы. При этом в объем настоящего изобретения входит увеличение масштаба процесса производства, а также процесса очистки для достижения производства и очистки АСА в промышленных масштабах. Соответственно, такие параметры, как размер колонки, диаметр колонки и скорость потока, могут быть увеличены, чтобы соответствовать скорости и эффективности такого крупномасштабного производства. В некоторых вариантах реализации изобретения диаметр колонки соответствует диапазону, составляющему около 50-100 мм, объем соответствует диапазону, составляющему около 100-300 мл, а скорость потока составляет около 40-400 см/ч (например, между около 100 см/ч и 150 см/ч) или от около 5 до 100 мл.

Ультрафильтрация - захват

В некоторых вариантах реализации изобретения описанные в данном документе способы очистки включают один или более этапов предварительной ультрафильтрации для захвата АСА (например, человеческой рекомбинантной АСА), полученной в перфузионном биореакторе. При употреблении в данном документе ультрафильтрация относится к мембранной фильтрации с применением фильтров с размерами пор в диапазоне от 0,001 и 0,1 мкм, которые можно использовать для концентрации и обессоливания растворенных молекул (белков, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов и других биомолекул), обменных буферов и крупных фракций. Способы ультрафильтрации, применимые в вариантах реализации изобретения, включают тангенциальную поточную фильтрацию или перекрестную фильтрацию. При употреблении в данном документе тангенциальная поточная фильтрация и ультрафильтрация относятся к таким схемам, в которых поток поступающего материала проходит параллельно поверхности мембраны, при этом одна часть проходит через мембрану (пермеат), в то время как оставшаяся (ретентат) возвращается обратно в резервуар с материалом. В некоторых вариантах реализации изобретения размер пор фильтра для тангенциальной поточной ультрафильтрации подбирают так, чтобы рекомбинантная АСА могла проникать через фильтр. В других вариантах реализации изобретения размер пор подбирают так, чтобы практически вся АСА оставалась в потоке поступающего материала при прохождении через фильтр. Как упоминалось в другом месте данного текста, в кислотных условиях (pH<5,0) АСА существует в виде 480 кДа октамера, но диссоциирует на димеры при нейтральных уровнях pH. Таким образом, pH поступающего материала можно доводить так, чтобы в комбинации с подобранным размером пор можно было как удерживать АСА на мембране фильтра, так и позволять ей проходить через мембрану в виде пермеата. Размер пор можно подбирать так, чтобы отсечение по молекулярной массе составляло по меньшей мере 10 кДа, по меньшей мере 20 кДа, по меньшей мере 30 кДа, по меньшей мере 40 кДа, по меньшей мере 50 кДа, по меньшей мере 60 кДа, по меньшей мере 70 кДа, по меньшей мере 80 кДа, по меньшей мере 90 кДа, по меньшей мере 100 кДа, по меньшей мере 300 кДа, по меньшей мере 400 кДа или по меньшей мере 500 кДа. Например, фильтр с размером пор, составляющим по меньшей мере 10 кДа, будет удерживать в материале большинство белков с молекулярными массами, составляющими приблизительно 11 кДа и более. В другом примере фильтр с размером пор, составляющим по меньшей мере 400 кДа, будет удерживать большинство белков с молекулярными массами, превышающими 400 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения уровень удержания материала составляет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или более. Аналогично, размер пор можно подобрать так, чтобы выделять пермеаты конкретного размера. Например, фильтр с размером пор, составляющим по меньшей мере 500 кДа, даст возможность большинству белков с молекулярными массами, составляющими менее 500 кДа, проникать через него. В некоторых вариантах реализации изобретения уровень проницаемости составляет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или более.

Площадь фильтрации или фильтрующую способность также можно оптимизировать для применения в описанном в данном документе способе. Факторы, влияющие на выбор площади фильтрации, включают прочность, стоимость, скорость потока поступающего материала (т.е., скорость перекрестного потока), трансмембранное давление, удельную производительность мембраны, оборудование и производительность. В некоторых вариантах реализации изобретения удельная производительность мембраны составляет около 50-100 литров на метр в час ("ЛМЧ"). В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока поступающего материала составляет около 250-600 ЛМЧ включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока поступающего материала составляет около 250-350 ЛМЧ включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока поступающего материала составляет около 175-245 ЛМЧ включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока поступающего материала составляет около 170-230 ЛМЧ включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока поступающего материала составляет около 120160 ЛМЧ включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока поступающего материала составляет около 15-30 ЛМЧ включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока поступающего материала составляет около 11-21 ЛМЧ включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения площадь фильтрации составляет около 0,02 м², около 0,14 м², около 0,7 или около 3,5 м². В конкретных вариантах реализации изобретения трансмембранное давление составляет около 55-60 фунт/кв. дюйм включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения трансмем- 15 030551

бранное давление составляет около 15-25 фунт/кв. дюйм включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения трансмембранное давление составляет около 10-20 фунт/кв. дюйм включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения трансмембранное давление составляет около 5-15 фунт/кв. дюйм. Фильтры для ультрафильтрации, применимые в вариантах реализации изобретения, могут содержать известные специалистам в данной области техники мембранные материалы, включая, но не ограничиваясь этим, полиэфирсульфон и целлюлозу. Одним типовым кассетным фильтром, применимым в вариантах реализации изобретения, является Sartorius ECO®. Другим типовым кассетным фильтром, применимым в вариантах реализации изобретения, является 30 кД стандартная мембрана Sartorius HYDROSART®.

Глубинная фильтрация

Описанные в данном документе способы очистки могут включать один или более этапов глубинной фильтрации. Глубинные фильтры представляют собой разнообразные фильтры, в которых используется пористая фильтрационная среда для того, чтобы удерживать частицы по всему объему среды, а не только на поверхности среды. Они содержат фильтрационную среду с градиентом плотности, который создает возможность захвата более крупных частиц вблизи поверхности, в то время как более мелкие частицы проникают через более крупные открытые площади на поверхности фильтра и захватываются более мелкими отверстиями ближе к центру фильтра. Хотя в некоторых вариантах реализации изобретения применяют этапы глубинной фильтрации только во время предварительной восстановительной фазы (т.е., перед последующими этапами хроматографической очистки), в других вариантах реализации изобретения глубинные фильтры применяют во время одного или более дополнительных фаз очистки. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют глубинный фильтр Cuno Zeta Plus.

Необязательно, после глубинной фильтрации можно проводить фильтрацию при помощи мембраны с размером пор в 0,45 микронов (±2 мкм), чтобы удалить твердые частицы и уменьшить бионагрузку препарата для последующей обработки.

Вирусная инактивация

Описанные в данном документе способы очистки могут включать один или более этапов вирусной инактивации. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная инактивация включает применение растворителя и/или детергента. Растворитель или детергент могут включать, например, полисорбат 80, три-н-бутилфосфат (ТнБФ) или оба эти вещества. Вирусная инактивация может включать 3-24 ч инкубации в растворителе или детергенте. В другом варианте реализации изобретения вирусная инактивация включает вирусную фильтрацию, например, с применением фильтра Planova™.

Понятно, что эти методы предназначены для получения ферментного препарата, который является в значительной степени свободным от инфицирующих вирусов и который можно назвать "безопасным в отношении вирусов продуктом". Кроме того, предполагается, что различные способы можно применять независимо или в комбинации.

Вирусную инактивацию можно осуществить, добавляя в содержащий фермент раствор один или более "антивирусных средств". В некоторых вариантах реализации изобретения этап вирусной инактивации проводят до этапов хроматографической очистки (т.е., перед загрузкой неочищенного препарата в первую хроматографическую колонку), чтобы гарантировать, что данное вещество не присутствует в конечном продукте в любых количествах или концентрациях, которые ставят под сомнение безопасность продукта при применении его в качестве лекарственного средства или при использовании продукта для изготовления лекарственного средства; в других вариантах реализации изобретения во время одной или более дополнительных фаз очистки применяют глубинные фильтры. Например, в некоторых вариантах реализации способ в соответствии с изобретением дополнительно включает этап вирусного удаления после последней хроматографической колонки.

Термином "антивирусное средство" обозначают вещество (например, детергент) или способ, который можно применять для инактивации вирусов с липидной оболочкой, а также вирусов с нелипидной оболочкой. Термин "антивирусное средство" следует понимать, как включающий комбинацию таких веществ и/или способов там, где это целесообразно, или только один тип такого вещества или способа.

Типовыми антивирусными средствами являются детергенты и/или растворители, чаще - смеси детергент-растворитель. Следует понимать, что антивирусное средство, необязательно, представляет собой смесь одного или более детергентов с одним или более растворителем. Для вирусной инактивации можно применять широкий спектр детергентов и растворителей. Детергент можно выбрать из группы, состоящей из неионных и ионных детергентов, и выбирают его так, чтобы он был практически неденатурирующим. Как правило, неионный детергент применяют потому, что он облегчает последующее удаление детергента из содержащего рАСА препарата на последующих этапах очистки. Подходящие детергенты описаны, например, у Shanbrom et al., в патенте США 4,314,997 и патенте США 4,315,919. Типовыми детергентами являются имеющиеся в продаже детергенты под торговыми марками Тритон Х-100 и Твин 20 или Твин 80. Предпочтительными растворителями для применения в антивирусных средствах являются ди- или три-алкилфосфаты, описанные, например у Neurath и Horowitz в патенте США 4,764,369. Типовым растворителем является три(н-бутил)фосфат (ТнБФ). В особенности предпочтитель- 16 030551

ным антивирусным средством для практической реализации настоящего изобретения является Твин 80, но, в других вариантах, можно применять и другие средства или комбинации средств. Типовое средство добавляют в таком объеме, чтобы концентрация Твин 80 в содержащем АСА растворе соответствовала диапазону около 0,5-0,4% по массе, предпочтительно - в концентрации около 1% по массе. Затем можно добавлять ТнБФ до конечной концентрации 0,3%, рассчитанной на основании нового объема образца, содержащего АСА.

Этап вирусной инактивации проводят в условиях, инактивирующих оболочечные вирусы, что приводит к получению практически безопасного в отношении вирусов содержащего рчАСА раствора. В общем случае такие условия включают температуру 4-37°C, например 19-28°C, 23-27°C, как правило, около 25°C, и время инкубации, являющееся эффективным согласно валидационным исследованиям. В общем случае для гарантии приемлемой вирусной инактивации достаточно времени инкубации, составляющего 1-24 ч, предпочтительно - 10-18 ч, например, около 14 ч. При этом соответствующие условия (температура и времена инкубации) зависят от применяемого антивирусного средства, pH, а также концентрации белка и содержания липидов в растворе.

Предполагается, что для получения безопасного в отношении вирусов продукта можно применять также другие способы удаления или инактивации вирусов, такие как добавление метиленового голубого с последующей инактивацией ультрафиолетом.

Описанные в данном документе способы очистки могут включать один или более этапов вирусной фильтрации. Как правило, вирусную фильтрацию проводят после очистки фермента на одном или более хроматографических этапах. В некоторых вариантах реализации изобретения этап вирусной фильтрации проводят, пропуская содержащий АСА раствор, который является результатом этапа очистки, через стерильный фильтр и далее пропуская стерильный отфильтрованный раствор через нанофильтр. Под "стерильным фильтром" подразумевается нанофильтр, который в значительной степени удаляет все микроорганизмы, способные распространять и/или вызывать инфекцию. Поскольку обычно фильтр характеризуется размером пор около 0,1 мкм, размер пор может соответствовать диапазону от около 0,05 до 0,3 мкм. Может быть целесообразным в процессе очистки заменить или объединить вирусную фильтрацию образца с приведением образца в контакт с детергентом. Некоторые варианты реализации изобретения включают по меньшей мере два этапа вирусной инактивации и/или фильтрации. Например, вирусную инактивацию перед колоночной хроматографией можно комбинировать с вирусным удалением после завершения всех хроматографических этапов. Вирусное удаление после хроматографии можно осуществлять до или после одного или более этапов ультрафильтрации/диафильтрации (УФДФ) (например, тангенциальной поточной ультрафильтрации). В конкретном примере элюат получают после конечного этапа хроматографической очистки (например, катионообменной (SP) хроматографии) и доводят уровень pH объединенного элюата до около 5,5, около 6,0, около 6,5 или около 7,0 с последующей вирусной фильтрацией. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения одному этапу УФДФ предшествует вирусная фильтрация (например, с применением фильтра Planova™). В другом примере элюат получают после конечного этапа хроматографической очистки (например, катионообменной (SP) хроматографии), подвергают первому этапу УФДФ без доведения уровня pH с последующей вирусной фильтрацией и вторым этапом УФДФ.

В определенных вариантах реализации изобретения катионообменный объединенный элюат с доведенным уровнем pH подвергают вирусной фильтрации на фильтре Planova 20N. В некоторых вариантах реализации изобретения согласно данным по поглощения А280 выход относительно исходного объема после вирусной фильтрации катионообменного элюата с доведенным уровнем pH составляет около 90100%; т.е., около 90%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения во время вирусной фильтрации практически нет потерь рекомбинантной АСА. Выход в случае вирусной фильтрации является существенным показателем, так как он подтверждает, что доведение уровня pH до около 6,0 позволяет октамерам АСА (диаметр которых составляет около 20 нм) диссоциировать в димерную форму. Таким образом, размер пор вирусного фильтра можно подобрать так, чтобы гарантировать, что только димерная форма проходит через фильтр (т.е., что октамерная форма может удерживаться фильтром или приводить к закупорке вирусного фильтра). Например, вирусный фильтр с размером пор 20 нм будет удерживать октамерную форму АСА, но пропускать димерную форму.

Аффинная хроматография

Описанные в данном документе способы очистки могут включать один или более этапов аффинной хроматографии (например, иммуно-аффинную хроматографию, аффинную хроматографию на иммобилизованных ионах металла и/или аффинную хроматографию на иммобилизованных лигандах). Вкратце, аффинная хроматография представляет собой хроматографический метод, основанный на высокоспецифических взаимодействиях, таких как, например, между рецептором и лигандом, антигеном и антителом или ферментом и субстратом. Как известно специалисту в данной области техники, селективные молекулы, применяемые на этапе аффинной хроматографии в описанных в данном документе способах очистки, можно выбирать на основании различных свойств (например, трехмерной структуры, гликозилирования и т.д.) рекомбинантно полученной АСА, которые могут использоваться селективной молекулой. Типо- 17 030551

вые селективные молекулы (или захватывающие реагенты), которые можно применять на этапе аффинной хроматографии, включают протеин А, протеин G, антитело, ион металла (например, никеля), специфический субстрат, лиганд или антиген. В некоторых вариантах реализации подходящая для этапа аффинной хроматографии согласно настоящему изобретению селективная молекула включает антитело к арилсульфатазе А (например, античеловеческое антитело к арилсульфатазе А). Подходящие антитела к арилсульфатазе А можно приобрести на коммерческой основе или путем иммунизации животных за исключением человека (например, мыши, кролика, крысы, цыпленка, козы, овцы, лошади или другого животного, подходящего для выработки антител против человеческого белка).

В общем случае представляющая интерес молекула (например, рекомбинантной АСА) захватывается твердой или стационарной фазой или средой вследствие взаимодействия с селективной молекулой, в то время как другие, нежелательные молекулы не захватываются, так как они не связываются селективной молекулой (селективными молекулами). Затем твердую среду можно удалить из смеси, необязательно, промыть, и освободить из ловушки представляющую интерес молекулу элюированием. В некоторых вариантах реализации изобретения аффинные колонки можно элюировать, градиентно изменяя ионную силу. Например, для разделения или для формирования градиента для разделения можно применять концентрации солей, pH, pI и ионную силу.

В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок АСА можно получить так, чтобы он содержал метку для облегчения очистки аффинной хроматографией. Как известно специалисту в данной области техники, белковые метки могут включать, например и помимо прочего, глутатион-Sтрансферазу (GST), гексагистидин (His), мальтоза-связывающий белок (МБР). В некоторых вариантах реализации изобретения в аффинной хроматографии для разделения компонентов в образце применяют лектины. Например, определенные лектины специфически связывают конкретную углеводную молекулу и могут быть использованы для отделения гликопротеинов от негликозилированных белков или одной гликоформы от другой гликоформы.

Ионообменная хроматография

Описанные в данном документе способы очистки могут включать один или более этапов ионообменной хроматографии (например, анионообменную хроматографию и/или катионообменную хроматографию).

Как известно специалисту в данной области техники, ионообменники (например, анионообменники и/или катионообменники) могут состоять из разных материалов в отношении матрицы, а также присоединенных заряженных групп. Например, можно применять следующие матрицы, в которых упомянутые материалы могут быть в большей или меньшей степени перекрестно сшитыми: на основе арагозы (такие как SEPHAROSE™ CL-6B, SEPHAROSE™ Fast Flow и SEPHAROSE™ High Performance), на основе целлюлозы (такие как DEAE SEPHACEL®), на основе декстрана (такие как SEPHADEX®), на основе кремния и на основе синтетических полимеров.

Ионообменную смолу можно получить в соответствии с известными способами. Как правило, равновесный буфер, который создает возможность связывания смолой своих противоионов, можно пропускать через ионообменную смолу перед загрузкой в смолу образца или состава, содержащего полипептид и одно или более загрязняющих веществ. Удобно, чтобы равновесный буфер был таким же самым, что и загрузочный буфер, но это не является необходимостью. В необязательном варианте реализации изобретения ионообменную смолу можно восстанавливать при помощи восстанавливающего буфера после элюирования полипептида таким образом, чтобы колонку можно было использовать повторно. В общем случае концентрация соли и/или уровень pH восстанавливающего буфера могут быть такими, чтобы элюировать из ионообменной смолы практически все загрязняющие вещества и представляющий интерес полипептид. В общем случае восстанавливающий буфер характеризуется очень высокой концентрацией соли для элюирования загрязняющих веществ и полипептида из ионообменной смолы.

Анионообменная хроматография

Варианты реализации изобретения включают, например, получение образца арилсульфатазы А (например, рекомбинантной арилсульфатазы А) и проведение для образца анионообменной хроматографии, например, описанной в данном документе анионообменной хроматографии. В случае анионообменной смолы заряженными группами, ковалентно присоединенными к матрице, могут быть, например, диэтиламиноэтил (ДЭАЭ или DEAE), четвертичный аминоэтил (ЧАЭ или QAE) и/или четвертичный аммоний (Q). В некоторых вариантах реализации изобретения применяемой анионообменной смолой является колонка Q-сефарозы. Анионообменную хроматографию можно проводить, применяя, например, Q SEPHAROSE™ Fast Flow, Q SEPHAROSE™ High Performance, Q SEPHAROSE™ XL, CAPTO™ Q, DEAE, TOYOPEARL GIGACAP® Q, FRACTOGEL® TMAE (триметиламиноэтил - четвертичную аммониевую смолу), ESHMUNO™ Q, NUVIA™ Q или UNOSPHERE™ Q. Другие анионообменники, которые можно применять в рамках данного изобретения, включают, но не ограничиваются этим, четвертичные аминосмолы или "Q-смолы" (например, CAPTO™-Q, Q-SEPHAROSE®, QAE SEPHADEX®); диэтиламиноэтановые (DEAE) смолы (например, DEAE-TRISACRYL®, DEAE SEPHAROSE®, бензоилированный, нафтоилированный DEAE, диэтиламиноэтил SEPHACEL®); смолы AMBERJET®; смолы AMBERLYST®;

- 18 030551

смолы AMBERLITE® (например, AMBERLITE® IRA-67, сильноосновную AMBERLITE®, слабоосновную AMBERLITE®), холестираминовую смолу, смолы ProPac® (например, PROPAC® SAX-10, PROPAC® WAX-10, PROPAC® WCX-10); смолы TSK-GEL® (например, TSKgel DEAE-NPR; TSKgel DEAE-5PW); и смолы ACCLAIM®. В некоторых вариантах реализации изобретения анионообменную хроматографию образца арилсульфатазы А проводят при температуре около 23°C или менее, около 18°C или менее или около 16°C или менее, например, около 23°C, около 20°C, около 18°C или около 16°C. Типичные подвижные фазы для анионообменной хроматографии включают относительно полярные растворы, такие как вода, ацетонитрил, органические спирты, такие как метанол, этанол и изопропанол, или растворы, содержащие 2-(Ы-морфолино)-этансульфоновую кислоту (МЭС или MES). Таким образом, в определенных вариантах реализации изобретения подвижная фаза содержит около 0%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или около 100% полярного раствора. В определенных вариантах реализации изобретения подвижная фаза содержит от около 1% до около 100%, от около 5% до около 95%, от около 10% до около 90%, от около 20% до около 80%, от около 30% до около 70% или от около 40% до около 60% полярного раствора в любое заданное время на протяжении этапа разделения.

В определенных вариантах реализации изобретения рАСА загружают при связывающей способности, составляющей около 23 ОЕ/л смолы или менее, например, около 19 ОЕ/л смолы или менее, около 15 ОЕ/л смолы или менее или около 12 ОЕ/л смолы или менее, например, между около 12 ОЕ/л смолы и около 15 ОЕ/л смолы или между около 15 ОЕ/л смолы и около 19 ОЕ/л смолы. В некоторых вариантах реализации изобретения образец арилсульфатазы А загружают в анионообменную хроматографическую колонку при связывающей способности, составляющей по меньшей мере около 4,5 г/л смолы (например, по меньшей мере около 5 г/л смолы, 6 г/л смолы, 7 г/л смолы, 8 г/л смолы, 9 г/л смолы, 10 г/л смолы, 11 вариантах реализации изобретения образец арилсульфатазы А загружают в анионообменную хроматографическую колонку при связывающей способности, соответствующей диапазону, составляющему около 4,5-20 г/л смолы (например, диапазону, составляющему около 5-20 г/л смолы; 5-19 г/л смолы, 5-18 г/л смолы, 5-17 г/л смолы, 5-16 г/л смолы, 5-15 г/л смолы, 7,5-20 г/л смолы, 7,5-19 г/л смолы, 7,5-18 г/л смолы, 7,5-17 г/л смолы, 7,5-16 г/л смолы, 7,5-15 г/л смолы, 10-20 г/л смолы, 10-19 г/л смолы, 10-18 г/л смолы, 10-17 г/л смолы, 10-16 г/л смолы или 10-15 г/л смолы). Водный раствор, содержащий АСА и загрязняющие вещества можно загружать в анионную смолу в качестве подвижной фазы, применяя загрузочный буфер с такой концентрацией соли и/или pH, при которых полипептид и загрязняющее вещество связываются с анионообменной смолой. Затем смолу можно промывать одним или более объемами колонки загрузочного буфера, а после - одним или более объемами колонки промывочного буфера, в котором содержится повышенная концентрация соли. В конце АСА можно элюировать при помощи элюирующего буфера с возрастающей концентрацией соли. Необязательно, элюирование фермента можно опосредовать, постепенно или пошагово снижая уровень pH. Фракции, обладающие активностью АСА, можно собирать и объединять для дополнительной очистки.

В некоторых вариантах реализации изобретения загрузку образца арилсульфатазы А в анионообменную хроматографическую колонку осуществляют с загрузочным буфером. В одном варианте реализации изобретения загрузочный буфер не содержит хлорида натрия. В одном варианте реализации изобретения загрузочный буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в загрузочном буфере может составлять от около 1 мМ до около 25 мМ, например, от около 1 мМ до около 10 мМ, от около 1 мМ до около 5 мМ или от около 5 мМ до около 10 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация соли в мобильной фазе характеризуется градиентом (например, линейным или нелинейным градиентом). В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация соли в мобильной фазе является постоянной. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация соли в мобильной фазе может пошагово снижаться или повышаться. В некоторых вариантах реализации изобретения загрузку образца арилсульфатазы А в анионообменную хроматографическую колонку осуществляют при pH, составляющем от около 5 до около 9, например, от около 6 до около 8, например, около 7. В некоторых вариантах реализации изобретения анионообменную хроматографическую колонку промывают одним или более промывочными буферами. Например, промывка анионообменной колонки может включать два или более (например, первый и второй) промывочных этапов, на каждом из которых применяют отличный промывочный буфер. В одном варианте реализации изобретения промывочный буфер не содержит хлорида натрия. В другом варианте реализации изобретения промывочный буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в промывочном буфере составляет от около 50 мМ до около 200 мМ, например, от около 50 мМ до около 150 мМ, от около 100 мМ до около 200 мМ или от около 100 мМ до около 150 мМ, например, около 80 мМ, около 100 мМ, около 120 мМ или около 140 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения промывку анионообменной хроматографической колонки осуществляют при pH, составляющем от около 5 до около 9, например, от около 6 до около 8, например, около 7. В одном варианте реализации изобретения элюирующий буфер содержит фосфат натрия. Например, концентрация фосфата натрия в элюирующем буфере составляет от около 20 мМ до около 50 мМ, например, от около 25 мМ до около 45 мМ, например, около 30 мМ, около 35 мМ

- 19 030551

или около 40 мМ. В другом варианте реализации изобретения элюирующий буфер не содержит фосфат натрия. В другом варианте реализации изобретения элюирующий буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в элюирующем буфере составляет от около 200 мМ до около 300 мМ, например, от около 240 мМ до около 280 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование арилсульфатазы А из анионообменной хроматографической колонки осуществляют при pH, составляющем от около 5 до около 9, например, от около 6 до около 8, например, около 7. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование арилсульфатазы А из анионообменной хроматографической колонки включает один или более этапов получения элюционных пиков. Например, получение элюционных пиков начинается на около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, например, от около 100 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, от около 200 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, от около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 100 мОЕ на нисходящей ветви, от около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 200 мОЕ на нисходящей ветви или от около 100 мОЕ на восходящей ветви до около 100 мОЕ на нисходящей ветви, например, согласно данным спектрофотометрии, на 280 нм. Специалисту в данной области техники понятно, что на этапах загрузки, промывки и элюирования можно применять многочисленные отличные буферы. При этом, как правило, колонку можно уравновешивать 1-10 промывками колонки при помощи буфера, содержащего 0,05 М MES-Tris, pH 7,0. Для удобства образец можно загружать в буфер с предыдущего этапа процесса очистки или образец можно загружать при помощи загрузочного буфера. Колонку можно промывать 1-10 объемами колонки буфера, применяемого для уравновешивания, а после этого -промывочным буфером, содержащим 0,02 MES-Tris, 0,12 М NaCl, pH 7,0. В другом варианте колонку можно уравновешивать, загружать и промывать любыми другими описанными в данном документе равновесными, загрузочными и промывочными буферами для анионообменной хроматографии. Образец можно элюировать в буфере, содержащем 0,02 MES-Tris, 0,26 М NaCl, pH 7,0. В другом варианте образец можно элюировать в любом другом описанном в данном документе элюирующем буфере для анионообменной хроматографии.

Описанные в данном документе загрузочный буфер, промывочный буфер и элюирующий буфер могут содержать одно или более буферных веществ. Например, буферным веществом может быть TRIS, HEPES, MOPS, PIPES, SSC, MES, фосфат натрия, ацетат натрия или их комбинация. Концентрация буферного вещества составляет между около 1 мМ и около 500 мМ, например, между около 10 мМ и около 250 мМ, между около 20 мМ и около 100 мМ, между около 1 мМ и 5 мМ, между около 5 мМ и 10 мМ, между около 10 мМ и 50 мМ или между около 50 мМ и около 100 мМ, например, около 1 мМ, около 5 мМ, около 10 мМ, около 20 мМ, около 30 мМ, около 40 мМ или около 50 мМ.

Выход, активность и степень очистки после анионообменной хроматографии могут варьироваться. В некоторых вариантах реализации изобретения выход по активности арилсульфатазы А составляет по меньшей мере около 75%, например, по меньшей мере около 85%, например, между около 85% и около 99% или между около 90% и около 99%. В некоторых вариантах реализации изобретения выход белка (в ОЕ или оптических единицах) составляет от около 10% до 50%, например, от около 20% до около 35% или от около 25% до около 30%, например, согласно данным спектрофотометрии на 280 нм. В некоторых вариантах реализации изобретения (например, в тех, в которых применяют описанную ниже ТМАЕколонку) выход по белковой активности элюционного пула (в ОЕ или оптических единицах) составляет от около 70% до 400%, например, от около 80% до около 390% или от около 90% до около 350%, или от около 100% до 150%, больше, чем по меньшей мере 95%, например, согласно данным спектрофотометрии на 280 нм. В некоторых вариантах реализации изобретения (например, в тех, в которых применяют описанную ниже ТМАЕ-колонку) логарифмическая величина уменьшения (ЛВУ) количества белка клетки-хозяина (БКХ) составляет между около 0,5 и около 1,1, например, между около 0,6 и 0,9 или между около 0,7 и 0,8. В некоторых вариантах реализации изобретения (например, в тех, в которых применяют описанную ниже ТМАЕ-колонку) степень очистки составляет по меньшей мере 75%, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или выше согласно данным, например, капиллярного ДСН-ПААГ-электрофореза. В предпочтительных вариантах реализации изобретения выход по активности, ЛВУ БКХ и степень очистки (согласно данным капиллярного ДСН-ПААГэлектрофореза) после анионообменной хроматографии составляют по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 0,6 и по меньшей мере около 80%, соответственно.

В предпочтительных вариантах реализации изобретения применяют анионообменную колонку с высокой загрузочной емкостью. В определенных вариантах реализации изобретения колонка характеризуется диапазоном загрузки, составляющим около 3-20 г/л (т.е., около 5-15 г/л, около 10-15 г/л, около 1020 г/л). В некоторых вариантах реализации изобретения загрузочная емкость составляет существенно больше, чем 4,3 г/л (например, составляет больше, чем около 10 г/л, 12,5 г/л, 15 г/л, 17,5 г/л или 20 г/л). В определенных вариантах реализации изобретения связывающая способность смолы составляет около 75100 ОЕ/л (например, около 75 ОЕ/л, около 80 ОЕ/л, около 85 ОЕ/л, около 90 ОЕ/л, около 95 ОЕ/л). В определенных вариантах реализации изобретения связывающая способность составляет больше, чем около 80 ОЕ/л. В некоторых вариантах реализации изобретения колонка с высокой загрузочной емкостью представляет собой ТМАЕ-колонку. В конкретных вариантах реализации изобретения колонка выбрана

- 20 030551

из группы, состоящей из колонки Fractogel® ТМАЕ, колонки Nuvia Q, колонки Q Sepharose Fast Flow, колонки Capto Q, колонки Q Sepharose XL, колонки Eshmuno Q, колонки UNOsphere Q или колонки GigaCap Q. В конкретных вариантах реализации изобретения ТМАЕ-колонку предварительно уравновешивают буфером, содержащим около 20 мМ MES-Tris и 1000 мМ NaCl при уровне pH 7,0. В определенных вариантах реализации изобретения колонку уравновешивают буфером, содержащим 50 мМ MES-Tris при уровне pH 7,0. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость загрузочного потока ТМАЕколонки составляет около 75-125 см/ч (т.е., около 75-115 см/ч, около 75-110 см/ч, около 75-105 см/ч, около 75-100 см/ч, около 85-115 см/ч, около 85-110 см/ч, около 85-105 см/ч, около 85-100 см/ч, около 95-115 см/ч, около 95-110 см/ч, около 95-105 см/ч, около 95-100 см/ч, около 100-120 см/ч, около 100-115 см/ч, около 100-110 см/ч, около 100 см/ч). Условия загрузки можно оптимизировать и оценивать по поглощению А280, как описано в данном документе.

В конкретных вариантах реализации изобретения при применении ТМАЕ-колонки (например, колонки Fractogel TMAE) во время загрузки при протекании через колонку происходит потеря очень малой части продукта, даже при загрузочных емкостях, превышающих 15 г/л. Возможность повышения загрузочной емкости и одновременной минимизации потерь при протекании через колонку, является существенным усовершенствованием технологии очистки. В конкретных вариантах реализации изобретения количество потерь продукта при протекании составляет менее 30% от загрузки (например, менее чем около 25%, менее чем около 20%, менее чем около 15%, менее чем около 10% или менее чем около 5%). После загрузки в некоторых вариантах реализации изобретения ТМАЕ-колонку промывают как минимум один раз. В конкретных вариантах реализации изобретения колонку промывают как минимум дважды. Первый или второй промывочный буфер может содержать оптимизированный уровень хлорида натрия. В некоторых вариантах реализации изобретения количество хлорида натрия в первом или втором промывочном буфере составляет около 50-150 мМ (например, около 50-140 мМ, около 50-130 мМ, около 50120 мМ, около 50-110 мМ, около 50-100 мМ, около 50-90 мМ, около 50-80 мМ, около 80-150 мМ, около 80-140 мМ, около 80-130 мМ, около 80-120 мМ, около 80-110 мМ, около 80-100 мМ, около 80-90 мМ, около 80 мМ или около 120 мМ). В некоторых вариантах реализации изобретения первый промывочный буфер содержит 50 мМ MES-Tris при уровне pH 7,0. В некоторых вариантах реализации изобретения второй промывочный буфер содержит 20 мМ MES-Tris, 100 мМ NaCl при уровне pH 7,0. Дополнительная оптимизация промывочных условий, в частности вторых промывочных условий, входит в объем вариантов реализации настоящего изобретения. Например, повышение концентрации соли во время второй промывки может привести к улучшению логарифмической величины уменьшения (ЛВУ) количества белка клетки-хозяина (БКХ) и общей степени очистки, но снижает как активность, так и выход по А280. Как описано в данном документе, конкретные промывочные условия должны быть сбалансированными с элюционными условиями, описанными ниже, с целью обеспечить оптимальную комбинацию степени очистки, активности и выхода.

В вариантах реализации изобретения рекомбинантную АСА, связанную с ТМАЕ-колонкой, элюируют при помощи элюирующего буфера. В некоторых вариантах реализации изобретения количество хлорида натрия в элюирующем буфере оптимизировано. В конкретных вариантах реализации изобретения количество хлорида натрия в элюирующем буфере составляет около 150-300 мМ (например, около 150-290 мМ, около 150-280 мМ, около 150-270 мМ, около 150-260 мМ, около 150-250 мМ, около 150-240 мМ, около 150-230 мМ, около 150-220 мМ, около 150-210 мМ, около 170-290 мМ, около 170-280 мМ, около 170-270 мМ, около 170-260 мМ, около 170-250 мМ, около 170-240 мМ, около 170-230 мМ, около 170-220 мМ, около 170-210 мМ около 180-290 мМ, около 180-280 мМ, около 180-270 мМ, около 180-260 мМ, около 180-250 мМ, около 180-240 мМ, около 180-230 мМ, около 180-220 мМ, около 180-210 мМ, около 180, около 220 или около 260). В конкретном примере элюирующий буфер содержит 50 мМ MESTris и 1М NaCl при уровне pH 7,0. В некоторых вариантах реализации изобретения выход по А280 после элюирования составляет больше, чем 60% от загрузки (например, около 60%, около 70%, около 80% или более). Дополнительная оптимизация условий элюирования входит в объем вариантов реализации настоящего изобретения. Например, повышение концентрации соли (т.е., проводимости) при элюировании обеспечивает лучший выход, но приводит к ухудшению степени очистки и удаления БКХ. Как отмечалось выше, конкретные промывочные условия должны быть сбалансированными с элюционными условиями с целью обеспечить оптимальную комбинацию степени очистки, активности и выхода.

Катионообменная хроматография

В некоторых вариантах реализации изобретения указанный способ дополнительно включает проведение для образца арилсульфатазы А катионообменной хроматографии, например, катионообменной хроматографии с сульфопропилом (SP), например, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения для образца арилсульфатазы А перед катионообменной хроматографией проводят анионообменную хроматографию. В типовом варианте реализации изобретения катионообменная хроматография включает катионообменную хроматографию с сульфопропилом (SP), но можно также применять другие катионные мембраны и смолы для хроматографии, например, мембрану MUSTANG™ S, смолу S-SEPHAROSE™ или смолу Blue SEPHAROSE™. В некоторых вариантах реализации изобрете- 21 030551

ния указанный способ дополнительно включает концентрацию и/или фильтрацию образца арилсульфатазы А, например, путем ультрафильтрации и/или диафильтрации, например, тангенциальной поточной ультрафильтрации. Катионообменную хроматографию можно проводить при оптимальной температуре, например, как описано в данном документе, чтобы усилить нацеленное связывание и/или снизить связывание примесей. Например, катионообменную хроматографию можно проводить при температуре, составляющей около 23°C, 18°C, 16°C или менее. В одном варианте реализации изобретения катионообменная хроматография включает катионообменную хроматографию с сульфопропилом (SP). В другом варианте реализации изобретения катионообменная хроматография представляет собой этап доочистки. Катионообменную хроматографию (например, катионообменную хроматографию с сульфопропилом (SP)) можно проводить с применением, например, одного или более компонентов из: TOYOPEARL® SP650, TOYOPEARL® SP-550, TSKGEL® SP-3PW, TSKGEL® SP-5PW, SP SEPHAROSE™ Fast Flow, SP SEPHAROSE™ High Performance, SP SEPHAROSE™ XL, мембраны SARTOBIND® S, POROS® HS50, UNOSPHERE™ S и MACROCAP™ S. Водный раствор, содержащий арилсульфатазу А и загрязняющие вещества можно загружать в катионную смолу при помощи загрузочного буфера, который характеризуется такими концентрацией соли и/или уровнем pH, при которых полипептид и загрязняющее вещество связываются с катионообменной смолой. Затем смолу можно промыть одним или более объемами колонки равновесного буфера или загрузочного буфера и, необязательно, промыть после этого одним или более объемами колонки промывочного буфера с возрастающей концентрацией соли. В конце арилсульфатазу А можно элюировать в элюирующем буфере. Фракции, обладающие активностью арилсульфатазы А, можно собирать и объединять для дополнительной очистки.

В типовом варианте реализации изобретения концентрация NaCl и/или уровень pH загрузочного буфера, промывочного буфера и/или элюирующего буфера можно оптимизировать, например, как описано в данном документе, чтобы усилить нацеленное связывание и/или снизить связывание примесей. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация NaCl в загрузочном буфере составляет около 20 мМ, 15 мМ, 10 мМ или менее. В некоторых вариантах реализации изобретения загрузочный буфер характеризуется уровнем pH около 4,5, 4,3, 4,0 или менее. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация NaCl в промывочном буфере составляет около 20 мМ, 15 мМ, 10 мМ или менее. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация NaCl в элюирующем буфере составляет около 55 мМ, 50 мМ, 45 мМ, 40 мМ или менее.

В некоторых вариантах реализации изобретения проведение для образца арилсульфатазы А катионообменной хроматографии включает: загрузку образца арилсульфатазы А в катионообменную хроматографическую колонку (например, катионообменную колонку с сульфопропилом (SP)), промывку катионообменной хроматографической колонки и элюирование арилсульфатазы А из колонки. В некоторых вариантах реализации изобретения колонки можно уравновешивать более чем 3, например, от 5 до 10 объемами колонки раствора, содержащего 0,01 М NaAc, 0,01 М NaCl, 0,03 М уксусной кислоты, pH 4,2.

В некоторых вариантах реализации изобретения образец можно загружать в буфер от предыдущего этапа процесса очистки или образец можно загружать при помощи загрузочного буфера. В одном варианте реализации изобретения загрузочный буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в загрузочном буфере составляет от около 1 мМ до около 25 мМ, например, от около 5 мМ до около 20 мМ, например, около 5 мМ, около 10 мМ, около 15 мМ или около 20 мМ. В одном варианте реализации изобретения загрузочный буфер содержит ацетат натрия. Например, концентрация ацетата натрия в загрузочном буфере составляет от около 10 мМ до около 100 мМ, например, около 20 мМ, около 40 мМ или около 60 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения загрузку образца арилсульфатазы А в катионообменную хроматографическую колонку проводят при уровне pH, составляющем величину между около 3,0 и около 6,0, например, между около 4,0 и около 5,0, например, около 4,0, около 4,3 или около 4,5. В некоторых вариантах реализации изобретения образец арилсульфатазы А загружают в катионообменную хроматографическую колонку при связывающей способности, составляющей около 15 ОЕ/л смолы или менее, например, около 14 ОЕ/л смолы или менее или около 12 ОЕ/л смолы или менее, например, между около 10 ОЕ/л смолы и около 14 ОЕ/л смолы или между около 10 ОЕ/л смолы и около 12 ОЕ/л смолы.

В некоторых вариантах реализации изобретения промывку катионообменной колонки проводят при помощи одного или более промывочных буферов. Например, промывка катионообменной колонки может включать два или более (например, первый и второй) промывочных этапов, на каждом из которых применяется отличный промывочный буфер. Колонку можно промывать 1-10 объемами колонки буфера, применяемого для уравновешивания. В другом варианте колонку можно уравновешивать, загружать и промывать любыми другими равновесными, загрузочными и промывочными буферами, описанными в данном документе для катионообменной хроматографии. В одном варианте реализации изобретения промывочный буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в промывочном буфере составляет от около 1 мМ до около 25 мМ, например, от около 5 мМ до около 20 мМ или от около 10 мМ до около 15 мМ, например, около 5 мМ, около 10 мМ, около 15 мМ или около 20 мМ. В другом варианте реализации изобретения промывочный буфер содержит ацетат натрия. Например, концентрация

- 22 030551

ацетата натрия в загрузочном буфере составляет от около 10 мМ до около 100 мМ, например, около 20 мМ, около 40 мМ или около 60 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения промывку катионообменной хроматографической колонки проводят при уровне pH, составляющем величину между около 3,0 и около 6,0, например, между около 4,0 и около 5,0, например, около 4,0, около 4,3 или около 4,5.

В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование арилсульфатазы А из катионообменной колонки проводят при помощи элюирующего буфера. В одном варианте реализации изобретения элюирующий буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в элюирующем буфере составляет от около 25 мМ до около 75 мМ, например, от около 45 мМ до около 60 мМ, например, около 45 мМ, около 50 мМ, около 55 мМ или около 55 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование арилсульфатазы А из катионообменной колонки проводят при уровне pH, составляющем величину между около 3,0 и около 6,0, например, между около 4,0 и около 5,0, например, около 4,0, около 4,3 или около 4,5. Таким образом, в одном конкретном примере образец можно элюировать в буфере, содержащем 0,02 М NaAc, 0,05 М NaCl, pH 4,5. В другом варианте образец можно элюировать в любом другом элюирующем буфере, описанном в данном документе для катионообменной хроматографии.

В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование арилсульфатазы А из катионообменной хроматографической колонки включает один или более этапов получения элюционных пиков. Например, получение элюционных пиков начинается на около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, например, от около 100 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, от около 200 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, от около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 100 мОЕ на нисходящей ветви, от около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 200 мОЕ на нисходящей ветви или от около 100 мОЕ на восходящей ветви до около 100 мОЕ на нисходящей ветви, например, согласно данным спектрофотометрии, на 280 нм. Полученные для элюата пики можно объединять.

В некоторых вариантах реализации изобретения катионообменную хроматографию для образца арилсульфатазы А проводят при температуре около 23 °C или менее, около 18°C или менее или около 16°C или менее, например, около 23°C, около 20°C, около 18°C или около 16°C. В некоторых вариантах реализации изобретения катионообменную хроматографию для образца арилсульфатазы А проводят при температуре между около 23°C и около 16°C, например, при около 23°C, около 20°C, около 18°C или около 16°C, а загрузку образца арилсульфатазы А в катионообменную хроматографическую колонку проводят при уровне pH, составляющем между около 4,5 и около 4,3, например, при около 4,5, около 4,4 или около 4,3. В некоторых вариантах реализации изобретения катионообменную хроматографию для образца арилсульфатазы А проводят при около 23°C а загрузку образца арилсульфатазы А в катионообменную хроматографическую колонку проводят при уровне pH, составляющем около 4,5. В некоторых вариантах реализации изобретения катионообменную хроматографию для образца арилсульфатазы А проводят при около 23°C а загрузку образца арилсульфатазы А в катионообменную хроматографическую колонку проводят при уровне pH, составляющем около 4,3. В некоторых вариантах реализации изобретения катионообменную хроматографию для образца арилсульфатазы А проводят при около 18°C а загрузку образца арилсульфатазы А в катионообменную хроматографическую колонку проводят при уровне pH, составляющем около 4,5. В некоторых вариантах реализации изобретения катионообменную хроматографию для образца арилсульфатазы А проводят при около 18°C а загрузку образца арилсульфатазы А в катионообменную хроматографическую колонку проводят при уровне pH, составляющем около 4,3.

Выход после катионообменной хроматографии может варьироваться. В некоторых вариантах реализации изобретения выход по активности арилсульфатазы А составляет по меньшей мере около 75%, например, по меньшей мере около 80%, например, между около 80% и около 105%. В некоторых вариантах реализации изобретения выход белка (в ОЕ или оптических единицах) составляет от около 65% до 100%, например, от около 70% до около 95%, например, согласно данным спектрофотометрии на 280 нм.

Степень очистки и активность после катионообменной хроматографии значительно улучшаются. В некоторых вариантах реализации изобретения логарифмическая величина уменьшения (ЛВУ) количества белка клетки-хозяина (БКХ) составляет между около 1,0 и около 2,5, например, между около 1,5 и 2,0 или между около 1,7 и 1,9. Специфическая активность очищенной арилсульфатазы А может составлять по меньшей мере от около 50 Е/мг до около 140 Е/мг, например, по меньшей мере около 70 Е/мг, по меньшей мере около 90 Е/мг, по меньшей мере около 100 Е/мг или по меньшей мере около 120 Е/мг, например, согласно описанному в данном документе способу. В некоторых вариантах реализации изобретения степень очистки арилсульфатазы А составляет по меньшей мере около 95%, по меньшей мере око- 23 030551

ло 98%, по меньшей мере около 99%, по меньшей мере около 99,5%, по меньшей мере около 99,6%, по меньшей мере около 99,7%, по меньшей мере около 99,8% или по меньшей мере около 99,9%. Степень очистки арилсульфатазы А можно определить, например, одним или более способами: вестернблоттингом для определения содержания белка клетки-хозяина (БКХ), ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси, ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром, обратно-фазовой ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ. В определенных вариантах реализации изобретения снижение концентрации соли в загрузочном буфере и снижение его уровня pH усиливает связывание АСА с катионообменной колонкой, но не влияет на связывание примесей. Другими словами, оптимальный баланс между концентрацией соли и уровнем pH, как указано выше, может повысить выход после катионообменной хроматографии, не оказывая негативного влияния на степень очистки.

В некоторых вариантах реализации изобретения можно доводить уровень pH катионообменного элюционного пула. В определенных вариантах реализации изобретения уровень pH доводят непосредственно перед вирусной фильтрацией. Уровень pH катионообменного элюата (например, SP-элюата) можно доводить до около 5,5, около 6,0 около 6,5 или около 7,0 при помощи поддерживающего уровень pH буфера, содержащего 0,25 М фосфата натрия, 1,33 М хлорида натрия, 0,34 М цитрата натрия, pH 7,0. В определенных вариантах реализации изобретения проводят вирусную фильтрацию SP-элюционного пула с доведенным уровнем pH на фильтре Planova 20N. В некоторых вариантах реализации изобретения согласно данным по поглощения А280 выход относительно исходного объема после вирусной фильтрации катионообменного элюата с доведенным уровнем pH составляет около 90-100%; т.е., около 90%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более. Выход в случае вирусной фильтрации является существенным показателем, так как он подтверждает, что доведение уровня pH до около 6,0 позволяет октамерам АСА (диаметр которых составляет около 20 нм) диссоциировать в димерную форму. Таким образом, размер пор вирусного фильтра можно подобрать так, чтобы гарантировать, что только димерная форма проходит через фильтр (т.е., что октамерная форма может удерживаться фильтром или приводить к закупорке вирусного фильтра). Например, вирусный фильтр с размером пор 20 нм будет удерживать октамерную форму АСА, но пропускать димерную форму.

Хроматография с комбинированным режимом

Описанные в данном документе способы очистки могут включать один или более этапов хроматографии с комбинированным режимом. Хроматография с комбинированным режимом представляет собой такой тип хроматографии, в котором применяют несколько режимов сепарации для разделения смеси из разных молекул, как правило, в жидкостной хроматографии. Например, сепарация с комбинированным режимом может включать комбинационные фазы с ионообменными и обратно-фазовыми характеристиками в одно и то же время. Эти стационарные фазы с более чем одним типом взаимодействия предоставляются несколькими производителями колонок.

В одном аспекте в изобретении описан способ очистки арилсульфатазы А из образца, при этом указанный способ включает, например, получение образца арилсульфатазы А (например, рекомбинантной арилсульфатазы А) и проведение для образца арилсульфатазы А хроматографии с комбинированным режимом, например, описанной в данном документе хроматографии с комбинированным режимом, например, это способ, включающий хроматографию с керамическим гидроксиапатитом (HA), например, хроматографию с гидроксиапатитом типа I или типа II. В некоторых вариантах реализации изобретения хроматографию с комбинированным режимом проводят с применением одного или более компонентов из: CHT™ среды, содержащей керамический гидроксиапатит типа I, CHT™ среды, содержащей керамический гидроксиапатит типа II, BIO-GEL® HT гидроксиапатита и BIO-GEL® HTP гидроксиапатита.

В некоторых вариантах реализации изобретения проведение для образца арилсульфатазы А хроматографии с комбинированным режимом включает: загрузку образца арилсульфатазы А в колонку для хроматографии с комбинированным режимом (например, HA-хроматографии), промывку колонки для хроматографии с комбинированным режимом и элюирование арилсульфатазы А из колонки. В некоторых вариантах реализации изобретения хроматографию с комбинированным режимом для образца арилсульфатазы А проводят при температуре около 23°C или менее, около 18°C или менее или около 16°C или менее, например, около 23°C, около 20°C, около 18°C или около 16°C.

В некоторых вариантах реализации изобретения загрузку образца арилсульфатазы А в колонку для хроматографии с комбинированным режимом проводят при помощи загрузочного буфера. В одном варианте реализации изобретения загрузочный буфер содержит фосфат натрия. Например, концентрация фосфата натрия в загрузочном буфере составляет от около 1 мМ до около 10 мМ, например, от около 1 мМ до около 5 мМ, от около 5 мМ до около 10 мМ, например, около 1 мМ, около 2 мМ или около 5 мМ. В одном варианте реализации изобретения загрузочный буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в загрузочном буфере составляет от около 100 мМ до около 400 мМ, например, от около 200 до около 300 мМ, например, около 220 мМ, около 240 мМ, около 260 мМ или около 280 мМ.

В некоторых вариантах реализации изобретения загрузку образца арилсульфатазы А в колонку для хроматографии с комбинированным режимом проводят при уровне pH, составляющем от около 5 до

- 24 030551

около 9, например, от около 6 до около 8, например, около 7.

В некоторых вариантах реализации изобретения хроматография с комбинированным режимом включает хроматографию с керамическим гидроксиапатитом (HA). Гидроксиапатитом (HAP) обычно называют кристаллическую форму фосфата кальция. Механизм HAP включает неспецифические взаимодействия между отрицательно заряженными карбоксильными группами белка и положительно заряженными ионами кальция смолы, а также положительно заряженными аминогруппами белка и отрицательно заряженными фосфат-ионами смолы. Основные или кислотные белки можно избирательно адсорбировать на колонке путем доведения уровня pH буфера; элюирования можно достичь, подбирая концентрацию соли в буфере. Кроме того, понятно, что можно применять многочисленные буферные составы, а также комбинации буферов. При этом, как правило, колонку можно уравновешивать 1-10 промывками колонки буфером, содержащим 0,001 М NaPO4, 0,02 М MES-Tris, 0,26 М NaCl, pH 7,0. Для удобства образец можно загружать в буфер с предыдущего этапа процесса очистки или образец можно загружать при помощи загрузочного буфера. Колонку можно промывать 1-10 объемами колонки буфера, применяемого для уравновешивания, а после этого - промывочным буфером, содержащим 0,005 М NaPO₄, 0,02 М MES-Tris, 0,26 М NaCl, pH 7,0. В другом варианте колонку можно уравновешивать, загружать и промывать любыми другими описанными в данном документе равновесными, загрузочными и промывочными буферами для хроматографии с комбинированным режимом. Образец можно элюировать в буфере, содержащем 0,04 М NaPO₄, pH 7,0. Необязательно, колонку можно десорбировать путем промывки 1-10 объемами колонки 0.4 М NaPO4, pH 12. В другом варианте образец можно элюировать в любом другом описанном в данном документе элюирующем буфере для хроматографии с комбинированным режимом. В некоторых вариантах реализации изобретения промывку колонки для хроматографии с комбинированным режимом проводят при помощи одного или более промывочных буферов. Например, промывка колонки для хроматографии с комбинированным режимом может включать два или более (например, первый и второй) промывочных этапа, на каждом из которых применяют отличный промывочный буфер.

В одном варианте реализации изобретения промывочный буфер содержит фосфат натрия. Например, концентрация фосфата натрия в промывочном буфере составляет от около 1 мМ до около 10 мМ, например, от около 1 мМ до около 5 мМ, от около 5 мМ до около 10 мМ, например, около 1 мМ, около 5 мМ или около 10 мМ. В другом варианте реализации изобретения промывочный буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в промывочном буфере составляет от около 50 мМ до около 600 мМ, например, от около 100 мМ до около 500 мМ или от около 200 до около 400 мМ, например, около 220 мМ, около 240 мМ, около 260 мМ или около 280 мМ.

В некоторых вариантах реализации изобретения промывку колонки для хроматографии с комбинированным режимом проводят при уровне pH, составляющем от около 5 до около 9, например, от около 6 до около 8, например, около 7. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование арилсульфатазы А из колонки для хроматографии с комбинированным режимом проводят при уровне pH, составляющем от около 5 до около 9, например, от около 6 до около 8, например, около 7. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование арилсульфатазы А из колонки для хроматографии с комбинированным режимом включает один или более этапов получения элюционных пиков. Например, получение элюционных пиков начинается на около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, например, от около 100 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, от около 200 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, от около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 100 мОЕ на нисходящей ветви, от около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 200 мОЕ на нисходящей ветви или от около 100 мОЕ на восходящей ветви до около 100 мОЕ на нисходящей ветви, например, согласно данным спектрофотометрии, на 280 нм. Описанные в данном документе загрузочный буфер, промывочный буфер и элюирующий буфер могут содержать одно или более буферных веществ. Например, буферным веществом может быть TRIS, HEPES, MOPS, PIPES, SSC, MES, фосфат натрия, ацетат натрия или их комбинация. Концентрация буферного вещества составляет между около 1 мМ и около 500 мМ, например, между около 10 мМ и около 250 мМ, между около 20 мМ и около 100 мМ, между около 1 мМ и 5 мМ, между около 5 мМ и 10 мМ, между около 10 мМ и 50 мМ или между около 50 мМ и около 100 мМ, например, около 1 мМ, около 5 мМ, около 10 мМ, около 20 мМ, около 30 мМ, около 40 мМ или около 50 мМ.

В некоторых вариантах реализации изобретения очистка АСА путем хроматографии с комбинированным режимом превышает по эффективности очистку путем ионообменной хроматографии (например, анионообменной хроматографии). При этом предполагается, что данные этапы можно проводить в обратном порядке. Выход после хроматографии с комбинированным режимом может варьироваться. В некоторых вариантах реализации изобретения выход по активности арилсульфатазы А составляет по меньшей мере около 80%, например, по меньшей мере около 90%, например, между около 80% и около 115%. В некоторых вариантах реализации изобретения выход белка (в ОЕ или оптических единицах) составляет от около 30% до 80%, например, от около 35% до около 75% или от около 50% до около 70%, например, согласно данным спектрофотометрии на 280 нм. Степень очистки после хроматографии с комбинированным режимом значительно улучшается. В некоторых вариантах реализации изобретения специфическая активность очищенной арилсульфатазы А составляет по меньшей мере от около 50 Е/мг

- 25 030551

до около 140 Е/мг, например, по меньшей мере около 70 Е/мг, по меньшей мере около 90 Е/мг, по меньшей мере около 100 Е/мг или по меньшей мере около 120 Е/мг, например, согласно описанному в данном документе способу. В некоторых вариантах реализации изобретения степень очистки арилсульфатазы А составляет по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99%, по меньшей мере около 99,5%, по меньшей мере около 99,6%, по меньшей мере около 99,7%, по меньшей мере около 99,8% или по меньшей мере около 99,9%. Степень очистки арилсульфатазы А можно определить, например, одним или более способами: вестерн-блоттингом для определения содержания белка клетки-хозяина (БКХ), ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси, ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром, обратно-фазовой ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ. В некоторых вариантах реализации изобретения логарифмическая величина уменьшения (ЛВУ) количества белка клетки-хозяина (БКХ) составляет между около 0,3 и около 0,6, например, между около 0,4 и 0,5.

Хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC). Описанные в данном документе способы очистки могут включать проведение для образца арилсульфатазы А хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC). В одном варианте реализации изобретения хроматография с гидрофобным взаимодействием включает хроматографию с фенилом. В других вариантах реализации изобретения хроматография с гидрофобным взаимодействием включает хроматографию с бутилом или хроматографию с октилом. В некоторых вариантах реализации изобретения HIC для образца арилсульфатазы А проводят при температуре, составляющей около 23°C или менее, около 18°C или менее или около 16°C или менее, например, около 23°C, около 20°C, около 18°C или около 16°C. В некоторых вариантах реализации изобретения для образца арилсульфатазы А перед HIC проводят хроматографию с комбинированным режимом. В хроматографии с гидрофобным взаимодействием используется сродство заданной молекулы к полярному или неполярному окружению, а в случае белка эта предрасположенность обусловлена гидрофобностью или гидрофильностью остатков на открытой внешней поверхности белка. Таким образом, белки разделяются на основании различий в их степени сродства к гидрофобной матрице, как правило, нейтральной подложке с алкильными линкерными "ножками", содержащими цепь из 2-18 углеродов. Стационарная фаза состоит из мелких неполярных групп (бутил, октил или фенил), присоединенных к гидрофильному полимерному скелету (например, перекрестносшитые Sepharose™, декстран или арагоза). Таким образом, колонка HIC, как правило, представляет собой колонку SEPHAROSE™ с бутилом или колонку SEPHAROSE™ с фенилом, более часто - колонку SEPHAROSE™ с фенилом. В некоторых вариантах реализации изобретения хроматография с гидрофобным взаимодействием включает хроматографию с фенилом с применением одного или более компонентов из Phenyl SEPHAROSE™ High Performance, Phenyl SEPHAROSE™ 6 Fast Flow (с низкой степенью замещения) или Phenyl SEPHAROSE™ 6 Fast Flow (c высокой степенью замещения).

В некоторых вариантах реализации изобретения проведение для образца арилсульфатазы А хроматографии с гидрофобным взаимодействием включает: загрузку образца арилсульфатазы А в HICколонку, промывку HIC-колонки и элюирование арилсульфатазы А из колонки. При загрузке, промывке и элюировании в HIC следуют в основном тем же принципам, которые описаны выше для ионообменной хроматографии, но часто с применением условий, практически противоположных тем, которые применяют в ионообменной хроматографии. Таким образом, метод HIC включает применение загрузочного буфера с высокой концентрацией соли, который разворачивает белки, открывая гидрофобные участки. Белок удерживается на колонке гидрофобными лигандами и подвергается воздействию градиентных буферов со снижающимися концентрациями соли. По мене снижения концентрации соли белок возвращается к своей природной конформации и в конечном итоге элюируется из колонки. В другом варианте белки можно элюировать при помощи ПЭГ.

В некоторых вариантах реализации изобретения загрузку образца арилсульфатазы А в HIC-колонку проводят при помощи загрузочного буфера В одном варианте реализации изобретения загрузочный буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в загрузочном буфере составляет от около 0,5 М до около 2,5 М, например, около 1 М или около 1,5 М. В другом варианте реализации изобретения загрузочный буфер содержит фосфат натрия. Например, концентрация фосфата натрия в загрузочном буфере составляет от около 10 мМ до около 100 мМ, например, около 25 мМ, около 50 мМ или около 75 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения загрузку образца арилсульфатазы А в HIC-колонку проводят при уровне pH, составляющем от около 5 до около 7, например, от около 5,5 до около 6,5, например, около 5,5, около 6,0 или около 6,5. В некоторых вариантах реализации изобретения образец арилсульфатазы А загружают в HIC-колонку при связывающей способности, составляющей около 12 ОЕ/л смолы или менее, например, около 10 ОЕ/л смолы или менее, около 9 ОЕ/л смолы или менее, около 7 ОЕ/л смолы или менее или около 5 ОЕ/л смолы или менее, например, между около 5 ОЕ/л смолы и около 9 ОЕ/л смолы или между около 5 ОЕ/л смолы и около 7 ОЕ/л смолы. Применение SEPHAROSE™ с фенилом в качестве твердой фазы в HIC является стандартным в настоящем изобретении. Снова же, совершенно очевидно, что существует большое количество возможностей в отношении точных условий, а также буферов и комбинаций буферов, применяемых для загрузки, процессов промывки и элюирования. В типовом варианте реализации изобретения колонку можно уравновешивать в буфере,

- 26 030551

содержащем 0,05 М NaP04, 1 M NaCl, pH 5,5. Для удобства образец можно загружать в буфер с предыдущего этапа процесса очистки или образец можно загружать при помощи загрузочного буфера.

В некоторых вариантах реализации изобретения промывку HIC-колонки проводят при помощи одного или более промывочных буферов. Например, промывка HIC-колонки может включать два или более (например, первый и второй) промывочных этапов, на каждом из которых применяют отличный промывочный буфер. В некоторых вариантах реализации изобретения промывочный буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в промывочном буфере составляет от около 100 мМ до около 1,5 М, например, от около 250 мМ до около 1 М, например, около 250 мМ, около 500 мМ, около 750 мМ или около 1 М. В другом варианте реализации изобретения промывочный буфер содержит фосфат натрия. Например, концентрация фосфата натрия в загрузочном буфере составляет от около 10 мМ до около 100 мМ, например, около 25 мМ, около 50 мМ или около 75 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения промывку HIC-колонки проводят при уровне pH, составляющем от около 5 до около 7, например, от около 5,5 до около 6,5, например, около 5,5, около 6,0 или около 6,5. Например, промывку можно проводить путем 1-2 промывок колонки уравновешивающим буфером, а после этого - 1-5 объемами колонки 0,02 М MES, 0,05 М NaPO₄, 0,5 М NaCl, pH 5,5. В другом варианте колонку можно уравновешивать, загружать и промывать любым другим равновесным, загрузочным и промывочным буфером, описанным в данном документе для HIC. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование арилсульфатазы А из HIC-колонки проводят при помощи элюирующего буфера. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирующий буфер содержит хлорид натрия. Например, концентрация хлорида натрия в элюирующем буфере составляет от около 30 мМ до около 100 мМ, например, от около 45 мМ до около 85 мМ, например, около 50 мМ, около 60 мМ, около 70 мМ или около 80 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование арилсульфатазы А из HIC-колонки проводят при уровне pH, составляющем от около 5 до около 9, например, от около 6 до около 8, например, около 7. Например, арилсульфатазу А можно элюировать при помощи 0,02 М MES-Tris, 0,06 М NaCl, pH 7,0. В другом варианте образец можно элюировать в любом другом элюирующем буфере, описанном в данном документе для HIC. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование арилсульфатазы А из HIC-колонки включает один или более этапов получения элюционных пиков. Например, получение элюционных пиков начинается на около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, например, от около 100 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, от около 200 мОЕ на восходящей ветви до около 50 мОЕ на нисходящей ветви, от около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 100 мОЕ на нисходящей ветви, от около 50 мОЕ на восходящей ветви до около 200 мОЕ на нисходящей ветви или от около 100 мОЕ на восходящей ветви до около 100 мОЕ на нисходящей ветви, например, согласно данным спектрофотометрии, на 280 нм.

В некоторых вариантах реализации изобретения очистка АСА методом HIC превышает по эффективности очистку путем ионообменной хроматографии (например, анионообменной хроматографии) и/или хроматографии с комбинированным режимом. При этом предполагается, что данные этапы можно проводить в обратном порядке.

Выход после HIC может варьироваться. В некоторых вариантах реализации изобретения выход по активности арилсульфатазы А составляет по меньшей мере около 60%, например, по меньшей мере около 70%, например, между около 70% и около 100%. В некоторых вариантах реализации изобретения выход белка (в ОЕ или оптических единицах) составляет от около 45 до 100%, например, от около 50% до около 95% или от около 55% до около 90%, например, согласно данным спектрофотометрии на 280 нм.

Степень очистки после HIC значительно улучшается. В некоторых вариантах реализации изобретения специфическая активность очищенной арилсульфатазы А составляет по меньшей мере от около 50 Е/мг до около 140 Е/мг, например, по меньшей мере около 70 Е/мг, по меньшей мере около 90 Е/мг, по меньшей мере около 100 Е/мг или по меньшей мере около 120 Е/мг, например, согласно описанному в данном документе способу.

В некоторых вариантах реализации изобретения степень очистки арилсульфатазы А составляет по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99%, по меньшей мере около 99,5%, по меньшей мере около 99,6%, по меньшей мере около 99,7%, по меньшей мере около 99,8% или по меньшей мере около 99,9%. Степень очистки арилсульфатазы А можно определить, например, одним или более способами: вестерн-блоттингом для определения содержания белка клетки-хозяина (БКХ), ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси, ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром, обратно-фазовой ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ. В некоторых вариантах реализации изобретения логарифмическая величина уменьшения (ЛВУ) количества белка клетки-хозяина (БКХ) составляет между около 0,6 и около

- 27 030551

1,2, например, между около 0,7 и 0,95.

Ультрафильтрация/диафильтрация

Описанные в данном документе способы очистки могут включать один или более этапов последующей ультрафильтрации и/или диафильтрации. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный способ дополнительно включает концентрацию и/или фильтрацию образца арилсульфатазы А, например, путем ультрафильтрации и/или диафильтрации, например, путем тангенциальной поточной фильтрации.

Ультрафильтрация относится к процессу мембранной сепарации, обусловленной градиентом давления, в котором мембрана разделяет компоненты жидкости в зависимости от размера их сольватов и структуры. Диафильтрация представляет собой специальный тип способа ультрафильтрации, в котором ретентат разбавляют водой и проводят повторную ультрафильтрацию для снижения концентрации растворимых компонентов пермеата и дополнительного повышения концентрации удерживаемых компонентов. Ультрафильтрацию часто комбинируют с диафильтрацией на очистительных этапах ультрафильтрации/диафильтрации (УФДФ). В вариантах реализации изобретения применяют по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или более последующих очистительных этапов УФДФ. Во время проведения этапа УФДФ может происходить один или более этапов диафильтрации (например, УФДФДФ). В некоторых вариантах реализации изобретения выход белка (в ОЕ или оптических единицах) после последующей УФДФ относительно количества после предыдущего этапа очистки составляет от около 90% до 105%, например, от около 95% до около 100%, например, от около 97% до около 99%, согласно данным спектрофотометрии на 280 нм. В некоторых вариантах реализации изобретения практически не происходит потерь белка во время УФДФ. В некоторых вариантах реализации изобретения последующая УФДФ приводит к получению рАСА, степень очистки которого составляет по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более согласно данным эксклюзионной хроматографии-высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЭХ-ВЭЖХ) и/или обратно-фазовой-высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). В некоторых вариантах реализации изобретения степень очистки арилсульфатазы А составляет по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99%, по меньшей мере около 99,5%, по меньшей мере около 99,6%, по меньшей мере около 99,7%, по меньшей мере около 99,8% или по меньшей мере около 99,9%. Степень очистки арилсульфатазы А можно определить, например, одним или более способами: вестерн-блоттингом для определения содержания белка клетки-хозяина (БКХ), ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси, ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром, обратно-фазовой ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ. Специфическая активность рАСА составляет по меньшей мере от около 60 Е/мг до около 100 Е/мг, например, по меньшей мере около 65 Е/мг, по меньшей мере около 90 Е/мг, по меньшей мере около 70 Е/мг или по меньшей мере около 90 Е/мг, например, согласно данным анализа высвобождения сульфатазы, как описано ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения арилсульфатазу А путем сепарации очищают от загрязняющих веществ в соответствии с их размером в кислотном окружении при помощи тангенциальной поточной фильтрации. При низком уровне pH арилсульфатаза А образует октамер с теоретической молекулярной массой в 480 кДа и, следовательно, удерживается относительно открытой мембраной, в то время как большинство загрязняющих веществ проходят через мембрану (Sommerlade et al. (1994) Biochem. J., 297; 123-130; Schmidt et al.(1995) Cell, 82 271-278; Lukatela et al. (1998) Biochemistry, 37, 3654-3664).

В типовом варианте реализации изобретения диафильтрационный буфер содержит 0,01 М фосфатацитрата натрия, 0,137 М NaCl, pH 6,0. В некоторых вариантах реализации изобретения исходным материалом для этого процесса является суспензия арилсульфатазы А, элюированная из хроматографической колонки на предыдущем этапе процесса, при этом уровень pH в этой суспензии доведен до 4-5 добавлением 0,2-1 М ацетата Na, pH 4,5. Затем проводят диафильтрацию против 1-10 объемов буфера ацетата Na, pH 4,0-5,5 способом, хорошо известным специалисту в данной области техники. Фильтрацию можно проводить, применяя несколько различных типов фильтров с величинами номинального отсечения по массе, соответствующими диапазону 20-450 кДа, при этом обычно применяют фильтр с величиной отсечения по массе, соответствующей диапазону 100-300 кДа. Для дополнительной обработки раствора, содержащего арилсульфатазу А, уровень pH доводят до величины в диапазоне между 7 и 8 путем добавления Tris-основания до конечной концентрации, составляющей приблизительно 20-50 мМ.

В качестве альтернативы кислотной тангенциальной поточной фильтрации, которая описана выше, сепарацию АСА от загрязняющих веществ можно осуществить путем кислотной гель-фильтрации, применяя практически те же условия и буферные составы. Фильтрацию проводят при низком уровне pH через гель-фильтрационную колонку, которую уравновешивают раствором при низком уровне pH, например, 0,2-0,9 М раствором ацетата Na при pH 4-5. Необязательно, перед гель-фильтрацией раствор арилсульфатазы А можно концентрировать тангенциальной поточной фильтрацией через 20-50 кДа фильтр. Степень концентрации может сильно варьироваться и, таким образом, арилсульфатазу А можно концентрировать от около 0,1 мг/мл до около 50 мг/мл, предпочтительно до около 5 мг/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения пул образцов концентрируют против Biomax A-screen, 30 кДа. Диафильтрацию проводят против 3-5 промывок колонки 20 мМ ацетата Na, pH 5,4-5,7.

- 28 030551

Получение характеристик очищенного белка АСА

Характеристики очищенного рекомбинантного белка АСА можно получить различными способами. Степень очистки

Степень очистки очищенного рекомбинантного белка АСА обычно определяют по уровню различных примесей (например, белка клетки-хозяина или ДНК клетки-хозяина), присутствующих в конечном продукте. Например, уровень белка клетки-хозяина (БКХ) можно определить при помощи ELISA или ДСН-ПААГ. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный рекомбинантный белок АСА содержит менее 150 нг БКХ/мг белка АСА (например, менее 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 30, 20, 10 нг БКХ/мг белка АСА). В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный рекомбинантный белок АСА содержит менее чем около 150 пг/мг, 140 пг/мг, 130 пг/мг, 120 пг/мг, 110 пг/мг, 100 пг/мг, 90 пг/мг, 80 пг/мг, 70 пг/мг, 60 пг/мг, 50 пг/мг, 40 пг/мг, 30 пг/мг, 20 пг/мг или 10 пг/мг ДНК клетки-хозяина.

В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный рекомбинантный белок АСА при проведении ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым не характеризуется наличием новых полос с интенсивностью большей, чем 0,05%, 0,01%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% или 0,5% контрольного образца. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный рекомбинантный белок АСА при проведении ДСН-ПААГ с вестерн-блоттингом против БКХ не характеризуется наличием полос с интенсивностью большей, чем у 15 кДа контрольного в отношении полос БКХ образца, и новых полос с интенсивностью большей, чем 0,05%, 0,01%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5% или 1,0% контрольного образца. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный рекомбинантный белок АСА при проведении ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром не характеризуется наличием новых полос с интенсивностью большей, чем 0,05%, 0,01%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% или 0,5% контрольного образца. В некоторых вариантах реализации изобретения логарифмическая величина уменьшения (ЛВУ) количества белка клетки-хозяина (БКХ) составляет между около 0,3 и около 0,6, например, между около 0,4 и 0,5. Можно использовать различные контрольные образцы, в частности те, которые утверждены регуляторными органами, такими как FDA.

Степень очистки очищенного рекомбинантного белка также можно определить одним или более методами из эксклюзионной хроматографии-высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЭХВЭЖХ), капиллярного электрофореза-ДСН-ПААГ (КЭ-ДСН-ПААГ) и/или обратно-фазовойвысокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) (например, с применением колонок с октадецил (О8)-связанным силикагелем и проведением при кислотном pH и ТФК в качестве противоиона). В некоторых вариантах реализации изобретения основной пик на хроматограмме принадлежит АСА. Параметры, которые можно изменять или оптимизировать для повышения разделения, включают градиентные условия, органический модификатор, противоион, температуру, размер пор и размер частиц колонки, состав растворителя и скорость потока. Как известно специалистам в данной области техники, уровни очистки можно определить по процентному содержанию основного пика. Например, уровень очистки можно определить, суммируя наблюдаемые основной и боковые пики и рассчитывая процентное содержание основного пика относительно общей площади. В некоторых вариантах реализации изобретения степень очистки АСА, очищенной описанными в данном документе способами, при определении по процентному содержанию основного пика методом ЭХ-ВЭЖХ составляет больше или равно 95% (например, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более). В некоторых вариантах реализации изобретения степень очистки АСА, очищенной описанными в данном документе способами, при определении по процентному содержанию основного пика методом ОФ-ВЭЖХ составляет больше или равно 98% (т.е., около 98%, около 99% или более).

Специфическая активность

Характеристики очищенного рекомбинантного белка АСА также можно получить, оценивая его функциональную и/или биологическую активность. Ферментативную активность состава, содержащего рекомбинантный АСА, можно определить известными в данной области техники методами. Как правило, указанные методы включают определение удаления сульфата из синтетического субстрата, известное под названием анализа высвобождения сульфата. Один из примеров анализа ферментативной активности включает применение ионной хроматографии. В данном методе оценивают количество сульфат-ионов, которые ферментативно высвобождаются рекомбинантным АСА из субстрата. Субстрат может быть природным субстратом или синтетическим субстратом. В некоторых случаях субстратом является гепарин сульфат, дерматан сульфат или их функциональный эквивалент. Как правило, высвобожденные сульфат-ионы анализируют при помощи ионной хроматографии с применением детектора по проводимости. В данном примере результаты можно выражать в Е/мг белка, где 1 единица соответствует количеству фермента, необходимого для высвобождения из субстрата 1 мкмоля сульфат-ионов в час. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная рекомбинантная АСА обладает специфической активностью, составляющей по меньшей мере около 50 Е/мг, 60 Е/мг, 70 Е/мг, 80 Е/мг, 90 Е/мг, 100 Е/мг, 110 Е/мг, 120 Е/мг, 130 Е/мг, 140 Е/мг. В некоторых вариантах реализации изобретения специфическая активность очищенного рекомбинантного белка АСА соответствует диапазону, составляющему около 50-200 Е/мг (например, около 50-190 Е/мг, 50-180 Е/мг, 50-170 Е/мг, 50-160 Е/мг, 50-150 Е/мг, 50-140

- 29 030551

Е/мг, 50-130 Е/мг, 50-120 Е/мг, 50-110 Е/мг, 50-100 Е/мг, 60-200 Е/мг, 60-190 Е/мг, 60-180 Е/мг, 60-170

Е/мг, 60-160 Е/мг, 60-150 Е/мг, 60-140 Е/мг, 60-130 Е/мг, 60-120 Е/мг, 60-110 Е/мг, 60-100 Е/мг, 70-200

Е/мг, 70-190 Е/мг, 70-180 Е/мг, 70-170 Е/мг, 70-160 Е/мг, 70-150 Е/мг, 70-140 Е/мг, 70-130 Е/мг, 70-120

Е/мг, 70-110 Е/мг, 70-100 Е/мг, 80-200 Е/мг, 80-190 Е/мг, 80-180 Е/мг, 80-170 Е/мг, 80-160 Е/мг, 80-150

Е/мг, 80-140 Е/мг, 80-130 Е/мг, 80-120 Е/мг, 80-110 Е/мг, 80-100 Е/мг, 90-200 Е/мг, 90-190 Е/мг, 90-180

Е/мг, 90-170 Е/мг, 90-160 Е/мг, 90-150 Е/мг, 90-140 Е/мг, 90-130 Е/мг, 90-120 Е/мг, 90-110 Е/мг, 90-100

Е/мг, 100-200 Е/мг, 100-190 Е/мг, 100-180 Е/мг, 100-170 Е/мг, 100-160 Е/мг, 100-150 Е/мг, 100-140 Е/мг, 100-130 Е/мг, 100-120 Е/мг, 100-110 Е/мг, 110-200 Е/мг, 110-190 Е/мг, 110-180 Е/мг, 110-170 Е/мг, 110160 Е/мг, 110-150 Е/мг, 110-140 Е/мг, 110-130 Е/мг, 110-120 Е/мг, 120-200 Е/мг, 120-190 Е/мг, 120-180 Е/мг, 120-170 Е/мг, 120-160 Е/мг, 120-150 Е/мг, 120-140 Е/мг, 120-130 Е/мг, 130-200 Е/мг, 130-190 Е/мг, 130-180 Е/мг, 130-170 Е/мг, 130-160 Е/мг, 130-150 Е/мг или 130-140 Е/мг).

В другом примере ферментативную активность состава, содержащего рекомбинантную АСА, можно определить, оценивая удаление сульфата из субстрата 4-метилумбеллиферил-сульфата (4-MUFсульфата) с образованием флуоресцентного 4-метилумбеллиферила. В этом примере по флуоресцентному сигналу от исследуемого образца можно рассчитать ферментативную активность (в мЕ/мл), используя стандарт для 4-MUF. Одна миллиединица активности соответствует количеству фермента, необходимого для превращения 1 наномоля 4-MUF-сульфата в 4-MUF за одну минуту при 37°C. Затем специфическую активность можно определить, разделив ферментативную активность на концентрацию белка.

В некоторых вариантах реализации изобретения активность определяют по гидролизу синтетического хромогенного субстрата - пара-нитрокатехол сульфата (pNCS), конечный продукт которого - паранитрокатехол (pNC) - поглощает свет на 515 нм. Нижеприведенное уравнение можно применять для расчета ферментативной активности в микромолях гидролизированного pNCS/мин-мл (=Единицах/мл):

Уобгц (мл)_ ΧΔΑ = Единиц/мл (1)

εΜ /1000 х Уобразца (мл) х Время инкубации (мин)

где AA = поглощение образца - поглощение пустого образца;

V общ (мл) = общий объем реакции в мл (в данном случае - 0,15 мл);

V образца (мл) = добавленный объем образца мл (в данном случае - 0,05 мл);

еМ = коэффициент молярной экстинкции для продукта pNC, который в данном случае составляет 12400 М^-1 см^-1.

Уравнение 1 можно упростить в виде:

AAx(0,15/(12400/1000x0,05x30))=X мкмоль/(мин-мл) (=Единиц/мл) (1).

Чтобы рассчитать специфическую активность в микромолях израсходованного pNC/(мин·мг) (=Единиц/мг), уравнение 1 делят на концентрацию белка в образце:

Ур. 1 / Конц, белка, (мг/мл) = Y мкмоль / (минуту х мг) = Единиц/мг (2)

В любом из примеров концентрацию белка в составе, содержащем рекомбинантную АСА, можно определять любым подходящим методом, известным в данной области техники для определения концентраций белка. В некоторых случаях концентрацию белка определяют методом поглощения ультрафиолетового света. Такие методы анализа поглощения, как правило, проводят на длине волны около 280 нм (А280).

В некоторых вариантах реализации изобретения специфическая активность очищенного рекомбинантного белка АСА на субстрате из 4-метилумбеллиферил-сульфата соответствует диапазону, составляющему от около 1,0х10³ мЕ/мг до 100,0х10³ мЕ/мг, от около 1,0х10³ мЕ/мг до 50,0х10³ мЕ/мг, от около 1,0х10³ мЕ/мг до 40,0х10³ мЕ/мг, от около 1,0х10³ мЕ/мг до 30,0х10³ мЕ/мг, от около 1,0х10³ мЕ/мг до 20,0х10³ мЕ/мг, от около 1,0х10³ мЕ/мг до 10,0х10³ мЕ/мг, от около 4,0х10³ мЕ/мг до 8,0х10³ мЕ/мг, от около 4,0х10 мЕ/мг до 10,0х10 мЕ/мг, от около 4,5х10 мЕ/мг до 10,0х10 мЕ/мг, от около 5,0х10 мЕ/мг до 10,0х10³ мЕ/мг, от около 5,5х10³ мЕ/мг до 15,0х10³ мЕ/мг или от около 4,0х10³ мЕ/мг до 20,0х10³мЕ/мг. В некоторых вариантах реализации изобретения специфическая активность очищенного рекомбинантного белка АСА на субстрате из 4-метилумбеллиферил-сульфата составляет около 1,0х10³ мЕ/мг, д д д д д

около 2,0х10 мЕ/мг, около 3,0х10 мЕ/мг, около 4,0х10 мЕ/мг, около 5,0х10 мЕ/мг, около 10,0х10 мЕ/мг, около 15,0х10³ мЕ/мг, около 20,0х10³ мЕ/мг, около 25,0х10³ мЕ/мг, около 30,0х10³ мЕ/мг, около 35,0х10³ мЕ/мг, около 40,0х10³ мЕ/мг, около 45,0х10³ мЕ/мг, около 50,0х10³ мЕ/мг или более.

Профиль заряда

Очищенную рекомбинантную АСА можно охарактеризовать по связанному с белком профилю заряда. Как правило, профиль заряда белка отражает схему зарядов боковых цепей, которые обычно присутствуют на поверхности белка. Профиль заряда можно определить путем проведения для белка ионообменной (ИО) хроматографии (например, ВЭЖХ). В некоторых вариантах реализации изобретения "профилем заряда" называют группу величин, представляющих количество белка, элюированного из ионообменной колонки в момент времени после добавления в колонку подвижной фазы, содержащей обменные ионы. Как правило, подходящей ионообменной колонкой является анионообменная колонка. Например, профиль заряда можно определить при помощи сильной анионообменной хроматографии

- 30 030551

(САХ), применяя систему для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В общем случае рекомбинантная АСА адсорбируется на фиксированном положительном заряде сильной анионообменной колонки, а градиент возрастающей ионной силы с применением подвижной фазы с заданной скоростью потока элюирует группы рекомбинантной АСА из колонки пропорционально силе их ионного взаимодействия с положительно заряженной колонкой. Более отрицательно заряженные (более кислые) группы АСА элюируются позже, чем менее отрицательно заряженные (менее кислые) группы АСА. Концентрацию белков в элюате определяют по поглощению ультрафиолетового света (на 280 нм).

В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная АСА адсорбируется при значении pH около 8,0 в 20 мМ TRIS-HCl на фиксированном положительном заряде колонки Mini Q РЕ, а градиент возрастающей ионной силы с применением подвижной фазы, содержащей 20 мМ TRIS-HCl, 1 М хлорид натрия, pH 8,0, при скорости потока 0,8 мл/мин элюирует группы рекомбинантной АСА из колонки пропорционально силе их ионного взаимодействия с положительно заряженной колонкой.

В некоторых вариантах реализации изобретения профиль заряда может быть подан в виде хроматограммы, иллюстрирующей зависимость оптических единиц поглощения от времени, прошедшего после элюирования из ВЭЖХ-колонки. Хроматограмма может содержать группу из одного или нескольких пиков, где каждый пик в группе соответствует субпопуляции рекомбинантных АСА в составе, которые имеют одинаковые поверхностные заряды.

Картирование гликанов

В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный рекомбинантный белок АСА можно охарактеризовать по составу его протеогликанов, а соответствующий способ обычно называют картированием гликанов. Не привязываясь к какой-либо конкретной теории, считается, что гликановые связи вместе с формой и сложностью разветвленной структуры могут влиять на in vivo выведение, лизосомное нацеливание, биодоступность и/или эффективность.

Как правило, карту гликанов можно получить посредством ферментного расщепления и последующего хроматографического анализа. Для ферментного расщепления можно применять различные ферменты, включая, но не ограничиваясь этим, подходящие гликозилазы, пептидазы (например, эндопептидазы, экзопептидазы), протеазы и фосфатазы. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящим ферментом является щелочная фосфатаза. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящим ферментом является нейраминидаза. Гликаны (например, фосфогликаны) можно детектировать при помощи хроматографического анализа. Например, фосфогликаны можно детектировать при помощи высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (ВЭАОХ-ИАД) или эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Количество гликанов (например, фосфогликанов), представляемое каждым пиком на карте гликанов, можно рассчитать при помощи стандартной кривой гликанов (например, фосфогликанов) в соответствии с известными в данной области техники и раскрытыми в данном документе способами.

В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный рекомбинантный белок АСА согласно настоящему изобретению характеризуется картой гликанов, содержащей группы из семи пиков, соответствующих нейтральному (группа пиков 1), моносиалированному (группа пиков 2), кэпированному манноза-6-фосфатированному (группа пиков 3), дисиалированному (группа пиков 4), моно-манноза-6фосфатированному (группа пиков 5), гибридному (группа пиков 6) и ди-манноза-6-фосфатированному (группа пиков 7) белку АСА, соответственно.

Картирование пептидов

В некоторых вариантах реализации изобретения можно применять пептидное картирование для характеристики аминокислотного состава, посттрансляционных модификаций и/или клеточного процессинга, такого как отщепление сигнального пептида, преобразование в формилглицин и/или гликозилирование. Как правило, рекомбинантный белок можно разбить на отдельные пептидные фрагменты путем контролируемого или случайного разделения для того, чтобы получить соответствующую схему или пептидную карту. В некоторых случаях перед аналитической оценкой очищенный белок АСА можно подвергать сначала ферментному расщеплению. Расщепление перед аналитической оценкой можно проводить, применяя пептидазу, гликозидгидролазу, фосфатазу, липазу или протеазу и/или их комбинации. Структурный состав пептидов можно определить хорошо известными в данной области техники методами. Типовые методы включают, но не ограничиваются этим, масс-спектрометрию, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) или вэжх.

Анализ содержания металлов

В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный рекомбинантный белок АСА можно охарактеризовать при помощи анализа содержания металлов. В данной области техники известны различные методы анализа следовых металлов в очищенных лекарственных веществах, которые можно применять в практической реализации настоящего изобретения.

В некоторых вариантах реализации изобретения измеряют и сравнивают с контрольным образцом количество остаточного фосфора. Не привязываясь к какой-либо конкретной теории, предполагается, что остаточный фосфор влияет на поддержание уровня pH лекарственного вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения количество остаточного фосфора составляет между 10-50 м.д. (т.е., между около

- 31 030551

10-45 м.д., около 10-40 м.д., около 10-30 м.д., около 20-50 м.д. около 20-45 м.д., около 20-40 м.д., около 20-30 м.д., около 30-50 м.д., около 30-40 м.д.). В некоторых вариантах реализации изобретения диапазон уровней pH рекомбинантной АСА, очищенной в соответствии с раскрытыми в данном документе способами, соответствует величинам между около 5-7 (т.е., между около 5,5-7,0, около 5,5-6,5, около 5,5-6,0, около 6,0-7,0, около 6,0-6,5, около 6,0-6,4, около 6,0-6,3, около 6,0-6,2, около 6,0-6,1, около 6,1-6,2).

В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная АСА, очищенная в соответствии с раскрытыми в данном документе способами, содержит кальций. Не привязываясь к какой-либо конкретной теории, предполагается, что ионы кальция, присутствующие в составе активного участка АСА, необходимы для ферментативной активности. В некоторых вариантах реализации изобретения кальций присутствует на уровне между около 1-20 м.д. (т.е., между около 1-15 м.д., около 1-10 м.д., около 5-15 м.д., около 5-10 м.д., около 10-20 м.д., около 10-15 м.д., около 10-14 м.д., около 10-13 м.д., около 10-12 м.д.).

Фармацевтический состав и введение

Очищенный рекомбинантный белок АСА можно вводить пациенту с МЛ в соответствии с известными способами. Например, очищенный рекомбинантный белок АСА может быть доставлен внутривенным, подкожным, внутримышечным, парентеральным, трансдермальным или трансмукозальным (например, оральным или назальным) путем.

В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантную АСА или содержащий ее фармацевтический состав вводят субъекту путем внутривенного введения.

В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантную АСА или содержащий ее фармацевтический состав вводят субъекту путем интратекального введения. Употребляемый в данном документе термин "интратекальное введение" или "интратекальная инъекция" относится к инъекции в спинномозговой канал (интратекальное пространство, окружающее спинной мозг). Можно применять различные способы, включая, без ограничений, латеральную церебровентрикулярную инъекцию через отверстие бора или цистернальную или поясничную пункцию и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения "интратекальное введение" или "интратекальная доставка" в соответствии с настоящим изобретением относится к ИТ введению или доставке через поясничную область или участок, т.е., поясничному ИТ введению или доставке. Употребляемый в данном документе термин "поясничная область" или "поясничный участок" относится к области между третьим и четвертым поясничными (нижняя часть спины) позвонками и, более точно, к L2-S1 участку позвоночника. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантную АСА или содержащий ее фармацевтический состав вводят субъекту путем интратекального введения, описанного в международных публикациях согласно PCT WO2011/163648 и WO2011/163650, которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантную АСА или содержащий ее фармацевтический состав вводят субъекту путем подкожного (т.е., под кожный покров) введения. В данном случае препарат можно инжектировать при помощи шприца. При этом доступны и другие устройства для введения препарата, такие как устройства для инъекций (например, устройства Inject-ease и Genject); ручки-инъекторы (такие как GenPen); безыгольные устройства (например, MediJector и BioJector); и подкожные системы доставки на основе пластыря.

В некоторых вариантах реализации изобретения интратекальное введение можно применять совместно с другими способами введения (например, внутривенным, подкожным, внутримышечным, парентеральным, трансдермальным или трансмукозальным (например, оральным или назальным)). В настоящем изобретении предполагается как одноразовое, так и многоразовое введение терапевтически эффективного количества рекомбинантной АСА или содержащего ее фармацевтического состава, описанного в данном документе. Рекомбинантную АСА или содержащий ее фармацевтический состав можно вводить через регулярные интервалы в зависимости от природы, тяжести и продолжительности патологического состояния субъекта (например, лизосомной болезни накопления). В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантную АСА или содержащий ее фармацевтический состав можно вводить периодически через регулярные интервалы (например, раз в год, раз в шесть месяцев, раз в пять месяцев, раз в три месяца, каждые два месяца (раз в два месяца), ежемесячно (раз в месяц), каждые две недели (раз в две недели), каждую неделю, ежедневно или постоянно). Рекомбинантную АСА или содержащий ее фармацевтический состав можно смешивать с физиологически приемлемым носителем или вспомогательным веществом для получения фармацевтического состава. Носитель и терапевтическое вещество могут быть стерильными. Препарат должен соответствовать пути введения. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются этим, воду, солевые растворы (например, NaCl), физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, спирты, глицерол, этанол, гуммиарабик, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, желатин, углеводы, такие как лактоза, амилоза или крахмал, сахара, такие как маннит, цукроза или другие, декстрозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вазелин, парфюмерное масло, эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпиролидон и т.д., а также их комбинации. Фармацевтические препараты при необходимости можно смешивать со вспомогательными веществами (например, лубрикантами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими агентами, эмульсификаторами, солями для изменения осмотиче- 32 030551

ского давления, буферами, красителями, ароматизаторами и/или ароматическими веществами и т.д.), которые не вступают в нежелательные реакции с активными компонентами или не влияют на их активность. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют водорастворимый носитель, подходящий для внутривенного введения.

Состав или лекарственный препарат при необходимости может также содержать небольшие количества смачивающих и эмульсифицирующих агентов или буферных агентов для поддержания pH. Состав может представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетку, пилюлю, капсулу, препарат с замедленным высвобождением или порошок. Также состав может быть изготовлен в виде суппозитория с традиционными связывающими веществами и носителями, такими как триглицериды. Препарат для перорального применения может содержать стандартные носители, такие как имеющие фармацевтическую степень чистоты маннит, лактоза, крохмал, стеарат магния, поливинилпироллидон, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.д.

Состав или лекарственный препарат можно изготовить в соответствии со стандартными процедурами в виде фармацевтического состава, подходящего для введения людям. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения состав для внутривенного введения, как правило, представляет собой раствор в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости состав также может содержать растворитель и местный анестетик для снижения болевых ощущений в месте инъекции. В общем случае ингредиенты или добавляют отдельно, или смешивают вместе в единичную лекарственную форму, например, как в случае сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или пакет с указанием количества активного вещества. Если состав предназначен для инфузионного введения, его можно развести в инфузионном флаконе, содержащем стерильную имеющую фармацевтическую степень чистоты воду, солевой раствор или декстрозу/воду. Если состав предназначен для инъекционного введения, к нему может прилагаться ампула со стерильной водой для инъекции или солевым раствором, чтобы ингредиенты можно было смешивать перед введением.

В некоторых вариантах реализации изобретения арилсульфатазу А получают в изотоническом растворе, таком как 154 мМ NaCl или 0,9% NaCl и 10-50 мМ фосфата натрия, pH 6,5-8,0, глицина, манита или соответствующих солей калия. В другом варианте реализации изобретения АСА получают в физиологическом буфере, таком как:

a) рецептурный буфер I, содержащий (в мМ): Na₂HPO₄ (3,50-3,90), NaH₂PO₄ (0 - 0,5), глицин (2530), маннит (230-270) и воду для инъекций; или

b) рецептурный буфер II, содержащий (в мМ): Tris-HCl (10), глицин (25-30), маннит (230-270) и воду для инъекций.

Арилсульфатазу А, очищенную описанным в данном документе способом, можно применять в качестве лекарственного препарата для снижения уровней сфинголипида 3-O-сульфогалактозилцерамида (галактозилсульфатида) в клетках периферической нервной системы и/или центральной нервной системы у субъекта, страдающего от и/или имеющего диагноз метахроматической лейкодистрофии. Применение АСА приведет к снижению нарушений в усвоении двигательных навыков и/или к повышению скорости проведения нервного двигательного импульса и/или амплитуды проведения нервного импульса. Употребляемое в данном документе выражение "терапевтически эффективное количество" определяется, главным образом, на основании общего количества терапевтического вещества, содержащегося в фармацевтических составах согласно настоящему изобретению. В общем случае терапевтически эффективного количества достаточно, чтобы достичь заметного положительного эффекта у субъекта (например, лечения, модуляции, исцеления, предотвращения и/или облегчения первопричинного заболевания или патологического состояния). Например, терапевтически эффективное количество может представлять собой количество, достаточное для достижения требуемого терапевтического и/или профилактического эффекта, такое как количество, достаточное для модуляции лизосомных ферментных рецепторов или их активности, которая приводит к лечению лизосомной болезни накопления или ее симптомов (например, снижению в или исключению присутствия или появления "пенистых клеток" или клеточной вакуолизации после введения субъекту составов согласно настоящему изобретению). В общем случае количество терапевтического вещества (т.е., рекомбинантного лизосомного фермента), водимого нуждающемуся в этом субъекту, зависит от характеристик субъекта. Такие характеристики включают патологическое состояние, тяжесть заболевания, общее состояние здоровья, возраст, пол и массу тела субъекта. Для специалиста в данной области техники не составит труда определить соответствующие дозировки в зависимости от этих и других факторов. Кроме того, для определения оптимальных диапазонов дозировок можно применять как объективный, так и субъективный анализ.

Терапевтически эффективное количество обычно вводят в режиме дозирования, который может включать многоразовое дозирование. Терапевтически эффективное количество (и/или соответствующая единичная дозировка в рамках эффективного режима дозирования) может варьироваться для каждого конкретного терапевтического белка, например, в зависимости от способа введения или от комбинирования с другими фармацевтическими веществами. Также определенное терапевтически эффективное количество (и/или единичная дозировка) в случае каждого конкретного пациента может зависеть от множест- 33 030551

ва факторов, включая нарушение, лечение которого проводится, и степень тяжести этого нарушения; активность определенного применяемого фармацевтического вещества; определенный применяемый состав; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и образ питания пациента; время введения, путь введения и/или скорость выведения или метаболизма определенного применяемого слитого белка; продолжительность лечения; и тому подобные факторы, что хорошо известно в области техники медицины.

Также следует понимать, что в случае каждого конкретного субъекта соответствующие режимы дозирования должны быть со временем согласованы в соответствии с индивидуальными требованиями и профессиональной оценкой специалиста, осуществляющего применение или контролирующего применение ферментозаместительной терапии, а приведенные в данном документе диапазоны дозировок являются только примерами и не ограничивают объема или практической реализации заявляемого изобретения.

Примеры

Пример 1. Тангенциальная поточная ультрафильтрация - захват.

В данном примере демонстрируется, что для захвата рекомбинантного белка АСА непосредственно из производственного биореактора можно применять тангенциальную поточную ультрафильтрацию (также известную под названием перекрестной фильтрации).

В частности, методом тангенциальной поточной ультрафильтрации проводили захват неочищенной массы материала из производственного перфузионного биореактора. Тангенциальную поточную фильтрацию осуществляли при помощи стандартной 30 кДа мембраны Sartorius Hydrosart®, следуя рекомендациям производителя.

Проводили дополнительные эксперименты, в которых тангенциальную поточную фильтрацию осуществляли при помощи мембраны Sartorius HYDROSART® ECO, при этом состав и отсечение по молекулярной массе оставались такими же самыми. Мембрана ECO дает возможность применять в процессе более низкие скорости перекрестного потока.

Величины удельной производительности мембраны (ЛМЧ), полученные для двенадцати разных условий испытаний, проводимых с применением мембраны ECO и стандартной мембраны, анализировали методом построения контурной функции. Эта функция иллюстрирует контур откликов одновременно на два фактора. В данном исследовании скорость потока поступающего материала и трансмембранное давление ("ТМД") сравнивали с удельной производительностью каждой мембраны. Типовые результаты проиллюстрированы на фиг. 3.

Как можно видеть на контурном графике для испытаний с мембраной ECO и стандартной мембраной, мембрана ECO обеспечивала намного более устойчивый исходящий поток при заданных исследуемых параметрах. В пределах рабочего диапазона мембрана ECO была способна обеспечивать более высокие скорости исходящего потока при более низкой скорости потока поступающего материала.

В частности, на основании анализа данных расчетных испытаний, степень извлечения по титрам ELISA соответствовала диапазону от около 92% до около 132%. Логарифмическая величина уменьшения (ЛВУ) количества белка клетки-хозяина (БКХ) соответствовала диапазону около 0,11-0,38. Степень извлечения по титрам ELISA, логарифмическую величину уменьшения (ЛВУ) количества белка клеткихозяина (БКХ) и процент выхода по активности определяли методом, описанным в другом месте данной заявки.

Результаты этого эксперимента демонстрировали возможность осуществления этапа УФДФ-захвата в фазе III процесса очистки арилсульфатазы А. Согласно данным по параллельным испытаниям УФДФ, мембрана ECO была в особенности эффективной, так как она была способна обеспечивать более высокие скорости исходящего потока при более низкой скорости потока поступающего материала в пределах рабочего диапазона. Также проводили расчетные эксперименты с применением мембраны ECO, чтобы оценить потенциальное влияние рабочих параметров, таких как условия загрузки, ТМД, скорость потока поступающего материала, коэффициент концентрации и температура обработки, на проведение захвата рчАСА. На содержание белка клетки-хозяина, определяемое методом ELISA, и выход по активности на этапе рабочие параметры мембраны ECO существенно не влияли.

Пример 2. Глубинная фильтрация и вирусная инактивация.

Данный эксперимент иллюстрирует условия, которые во время процесса очистки можно применять для глубинной фильтрации и вирусной инактивации Например, захваченную неочищенную массу материала размораживали при 2-8°C на протяжении <120 ч. Температуру неочищенного материала доводили до около 18±2°C и проводили фильтрацию через глубинный фильтр Cuno Zeta Plus с последующей окончательной фильтрацией. Sartorious Maxicap Sartopore 2, 0,45±0,2 мкм капсулу для окончательной фильтрации, размещали после глубинного фильтра для удаления твердых частиц и снижения бионагрузки в препарате для дальнейшей обработки. Фильтры промывали водой для инъекций ("ВДИ"), а после этого равновесным раствором MES-Tris, pH 7,1.

После фильтрации проводили конечную промывку для извлечения удерживаемого материала из фильтрационной системы. После завершения фильтрации фильтрационную систему промывали при по- 34 030551

мощи промывочного раствора, содержащего 0,05 MES-Tris, pH 7,0. Собранный после промывки материал добавляли к отфильтрованной объединенной массе материала.

После этого отфильтрованную, но неочищенную массу подвергали этапу вирусной инактивации путем добавления полисорбата 80 и три-н-бутилфосфата (ТнБФ) с последующей инкубацией на протяжении около 3-24 ч, как описано ниже. Полисорбат 80 добавляли из 10% (об./об.) исходного раствора в 0,05 М MES-Tris, pH 7,1, к отфильтрованной объединенной неочищенной массе до достижения конечной концентрации в 1%. Затем добавляли три-н-бутилфосфат (ТнБФ) до конечной концентрации около 0,3, рассчитанной на основе нового объема неочищенной массы, содержащей полисорбат 80. Полученный в результате пул смешивали для получения необходимой консистенции и инкубировали с постоянным перемешиванием на протяжении около 3-24 ч.

После завершения вирусной инактивации пул пропускали через 0,2 мкм поливинилидендифторидовый (ПВДФ) фильтр перед загрузкой в первую хроматографическую колонку. В данном эксперименте отфильтрованный и прошедший вирусную инактивацию пул загружали в Q-колонку (как описано ниже) на протяжении 28 часов со времени начала инкубации на этапе вирусной инактивации. Прошедший вирусную инактивацию промежуточный материал фильтровали, а в конце фильтрации фильтр промывали буфером, содержащим 0,05М MES-Tris, pH 7,0, для максимизации степени извлечения продукта.

Пример 3. Анионообменная хроматография.

Данный пример иллюстрирует типовые условия для анионообменной хроматографии, в частности, для случая применения анионообменной хроматографии в качестве первого этапа. В этом конкретном примере в процессе анионного обмена четвертичных аминов, проводимого в режимах связывания и элюирования, применяли смолу Q SEPHAROSE™ Fast Flow (Q FF).

Колонки Q FF готовили, применяя стандартные методы. АСА связывалась с Q-колонкой при pH 7,0 и элюировалась при помощи 0,02 М MES-Tris, 0,26 М NaCl при pH 7,1. Загрузку, промывку и элюирование проводили при скорости потока, составляющей около 100. Рабочий диапазон температур составлял 16-23°C. Q-элюирование оценивали по поглощению на 280 нм (А280) с заданными точками от 0,5 ОЕ/см на восходящей ветви пика до 0,25 ОЕ/см на нисходящей ветви пика. Типовые условия, применяемые для анионообменных колонок, приведены в табл. 2.

Таблица 2. Типовые условия, применяемые для анионообменных колонок

Растворы	Применение
0,5 М NaOH	Обеззараживание
0,02 М MES-Tris, 1 М NaCl, pH 7,0	Предварительное уравновешивание и десорбция
0,05 М MES-Tris, pH 7,0	Уравновешивание и промывка1
0,02 М MES-Tris, 0,12 М NaCl, pH 7,1	Промывка 2
0,02 М MES-Tris, 0,26 М NaCl, pH 7,1	Элюирование и прочистка фильтра после использования
0,5 М NaOH, 3 М NaCl	Очистка
0,01 М NaOH	Хранение

Для сравнения типовых анионообменных смол в отношении степени очистки, активности и производительности (например, при заданной загрузочной емкости) проводили дополнительные эксперименты. В частности, в целях увеличения масштаба в данном исследовании изучали и оценивали несколько высокопроизводительных анионообменных смол.

После "упаковки" смолу уравновешивали, загружали, промывали и элюировали с применением условий, приведенных в табл. 3. В данном исследовании условия связывания были такими же, как и в описанном выше процессе Q FF. Собирали фракции, полученные при протекании (Прот.), промывке (Пром.) и элюировании/десорбции (Эл./десорбция), и проводили анализ методами поглощения А280, анализа титров и ДСН-ПААГ (с окрашиванием кумасси или серебром).

Таблица 3. Типовые условия

Этап	Буфер или материал
У равновешивание	50 мМ MES-Tris, pH 7,0
Загрузка	Atlas GMP-1 Η19/20, НМ
Промывка	50 мМ MES-Tris, pH 7,0
Элюирование/десорбция	50 мМ MES-Tris, 1 M NaCl, 7,0

Кроме Q FF оценивали еще семь смол для определения связывающей способности, избирательности и степени извлечения. Общий выход был сопоставим в случае всех смол и соответствовал диапазону 80-83%, что свидетельствует об одинаковой степени извлечения и согласованном проведении экспериментов. Некоторые смолы обладали меньшей связывающей способностью, чем Q FF, в то время как другие имели большую связывающую способность. В частности, Fractogel демонстрировал самую высокую связывающую способность, наилучшую избирательность среди всех исследуемых смол и сопоставимую степень извлечения. Более того, в случае Fractogel наблюдали очень малые потери отфильтрованного

- 35 030551

материала при загрузке в 15 г/л.

Типовые результаты, демонстрирующие выход и связывающую способность смол Q FF и Fractogel, приведены в табл. 4.

Таблица 4. Типовые результаты по связывающей способности и выходу

Смола	Выход по А280	Связывание (ОЕ/л)
Прот.	Промывка	Эл./десорбция	Всего
QFF	37%	2%	42%	82%	62
Fractogel	17%	2%	62%	81%	83

Параллельные испытания на соответствие

Для проверки эффективности способа с применением смолы Fractogel и оценки ее влияния на последующие этапы очистки и конечное лекарственное вещество ("ЛВ") проводили параллельные испытания процесса с применением Fractogel TMAE и Q FF, начиная с неочищенной массы материала и заканчивая лекарственным веществом, включая хроматографические этапы, описанные в приведенных примерах. Дополнительные этапы очистки после анионообменной хроматографии соответствовали нижеописанным (представлены в порядке проведения): хроматография с комбинированным режимом на HAколонке, хроматография с гидрофобным взаимодействием на колонке с фенилом, катионообменная хроматография на SP-колонке и два этапа ультрафильтрации/диафильтрации с промежуточным этапом вирусной фильтрации.

Оба показателя - по А280 и титрам выхода - были сопоставимы.

Снижение количества БКХ также было сходным для данных колонок. Кроме того, данные по ДСНПААГ-гелям (с серебром) (фиг. 4) показывали сходные профили полос для Fractogel и Q FF на протяжении всего процесса. Данные по КЭ-ДСН показывали лучшую степень очистки для Fractogel по сравнению с Q FF на первом этапе и сопоставимые результаты после этапа с применением колонки с фенилом. Это подтверждало соотношение БКХ/рчАСА. Оценивали качественные характеристики SP-элюата из обоих колонок, а также SP-элюата из контрольного испытания. Процессы с применением Fractogel и Q FF приводили к получению одинаково чистого и приемлемого SP-элюата, хотя некоторые характеристики немного отличались от контроля вследствие различий в неочищенных загрузочных исходных материалах.

В целом, применение Fractogel в качестве первой колонки обеспечивает сопоставимые с контрольным способом с применением Q FF показатели (выход, снижение БКХ) и качественные характеристики после SP-этапа, что подтверждают вышеприведенные результаты. При этом колонка Fractogel обеспечивает более высокую загрузочную емкость и повышенную производительность. В заключение можно сказать, что параллельные испытания на соответствие показали, что способ с применением Fractogel TMAE обеспечивает показатели (выход, снижение БКХ), сопоставимые со способом с применением Q FF, и вместе с этим обеспечивает дополнительное преимущество в виде более высокой заданной загрузочной емкости (например, составляющей по меньшей мере 10 г рчАСА/л). В исследуемом диапазоне загрузки, составляющем 5-20 г/л, не наблюдали значительных потерь по выходу. Качественные характеристики SP-элюата в эксперименте с Fractogel также были сопоставимы с контрольным экспериментом с Q FF.

Пример 4. Хроматография с комбинированным режимом с гидроксиапатитом (HA).

Данный пример иллюстрирует типовые условия для хроматографии с комбинированным режимом с гидроксиапатитом, которые можно применять при очистке рекомбинантного белка АСА.

В частности, элюат после анионообменной хроматографии, полученный так, как описано выше, последовательно очищали при помощи хроматографии с гидроксиапатитом (HA). Применяли колонку с коммерчески доступной смолой керамического гидроксиапатита типа 1. В данном примере колонку предварительно уравновешивали буфером, содержащим 0,250 М фосфата натрия, pH 7,0. НА-колонку эксплуатировали в режимах связывания и элюирования.

Сначала анионообменный элюат нагревали до температуры окружающей среды, а затем доводили до около 0,001 фосфата натрия перед загрузкой в HA-колонку. рчАСА связывалась с колонкой при pH 7,0 и элюировалась из колонки при помощи около 0,04 М фосфата натрия, pH 7,1. Загрузку, промывку и элюирование проводили при скорости потока, составляющей около 150 см/ч. HA-элюирование оценивали по поглощению на 280 нм (А280) с заданными точками от 0,5 ОЕ/см на восходящей ветви пика до 0,25 ОЕ/см на нисходящей ветви пика. Типовые условия, применяемые для HA-колонок, приведены в табл. 5.

- 36 030551

Таблица 5. Типовые условия, применяемые для HA-колонок.

Растворы	Применение
0,5 М NaOH	Обеззараживание
0,25 М фосфата натрия, pH 7,0	Доведение заряда и загрузки
0,001 М фосфата натрия, 0,02 М MES-Tris, 0,26 М NaCl, pH 7,0	Уравновешивание и промывка1
0,005 М фосфата натрия, 0,02 М MES-Tris, 0,26 М NaCl, pH 7,0	Промывка 2
0,04 М фосфата натрия, pH 7,1	Элюирование и прочистка фильтра после использования
0,4 М фосфата натрия, pH 12	Десорбция
0,5 М NaOH	Очистка
0,1 М NaOH	Хранение

Пример 5. Хроматография с гидрофобным взаимодействием (с фенилом). Данный пример иллюстрирует типовые условия для хроматографии с гидрофобным взаимодействием (с фенилом), которые можно применять при очистке рекомбинантного белка АСА.

В частности, элюат после HA-хроматографии, полученный так, как описано выше, последовательно очищали при помощи колоночной хроматографии с фенилом. Для очистки рчАСА паковали и готовили коммерчески доступную колонку Sepharose Fast Flow с фенилом.

Колонку с фенилом эксплуатировали в режиме связывания и элюирования. После нагревания до температуры окружающей среды HA-элюат доводили до около 1,1 М NaCl и до pH около 5,6 при помощи 0,5 М MES, свободной кислоты, перед загрузкой в колонку с фенилом. рчАСА связывалась с колонкой при pH 5,6 и элюировалась из колонки при помощи 0,02 М MES-Tris, 0,06 М NaCl, pH 7,1. Загрузку, промывку и элюирование проводили при скорости потока, составляющей около 150 см/ч. Фенил-элюат оценивали по поглощению на 280 нм (А280) с заданными точками от 0,5 ОЕ/см на восходящей ветви пика до 0,25 ОЕ/см на нисходящей ветви пика. Типовые условия для колонок с фенилом приведены в табл. 6.

Таблица 6. Типовые условия для колонок с фенилом

Растворы	Применение
0,5 М NaOH	Обеззараживание и очистка
0,05 М фосфата натрия, 1М NaCl, pH 5.6	Уравновешивание и промывка1
5 М NaCl	Доведение загрузки
0,5 М MES, свободной кислоты	Доведение загрузки
0,02 М MES, 0,05 М фосфата натрия 0,5 М NaCl, pH 5,6	Промывка 2
0,02 М MES-Tris, 0,06 М NaCl, pH 7.1	Элюирование и прочистка фильтра после использования
ВДИ	Десорбция
0,01 М NaOH	Хранение

Пример 6. Катионообменная хроматография.

Данный пример иллюстрирует типовые условия для катионообменной хроматографии, которые можно применять при очистке рекомбинантного белка АСА. В частности, элюат после колоночной хроматографии с фенилом, полученный так, как описано выше, последовательно очищали при помощи катионообменной хроматографии. В данном примере паковали и готовили колонку SP-650M (TOYOPEARL).

SP-колонку эксплуатировали в режиме связывания и элюирования. Элюат из колонки с фенилом нагревали до температуры 16-23°C, а затем разбавляли ВДИ, чтобы уменьшить проводимость, и доводили при помощи около 1 М уксусной кислоты до pH 4,2 перед загрузкой в SP-колонку. рчАСА связывалась с колонкой при pH 4,2 и элюировалась из колонки при помощи около 0,01 М ацетата натрия, 0,01 М уксусной кислоты, 0,05 М NaCl, pH 4,5. Загрузку, промывку и элюирование проводили при скорости потока, составляющей около 150 см/ч. SP-элюирование оценивали по поглощению на 280 нм (А280) с заданными точками от 0,25 ОЕ/см на восходящей ветви пика до 0,25 ОЕ/см на нисходящей ветви пика. Типовые условия, применяемые для SP-колонок, приведены в табл. 7.

- 37 030551

Таблица 7. Типовые условия для SP-колонок

Растворы	Применение
0,5 М NaOH	Обеззараживание и
0,013 М ацетата натрия, 0,007 М уксусной кислоты, 1 М NaCl, pH 4,5	Предварительное уравновешивание и десорбция
0,01 М ацетата натрия, 0,01 М NaCl, 0,03 М уксусной	Уравновешивание и промывка
0,01 М ацетата натрия, 0,01 М уксусной кислоты, 0,05 М NaCl, pH 4,5	Элюирование и прочистка фильтра после использования
1 М уксусной кислоты	Доведение загрузки
ВДИ	Доведение загрузки
0,01 М NaOH	Хранение

Пример 7. Ультрафильтрация/диафильтрация и вирусная фильтрация.

Данный пример иллюстрирует типовые условия для ультрафильтрации/диафильтрации, а также вирусной фильтрации, которые можно применять при очистке рекомбинантного белка АСА.

Ультрафильтрация/диафильтрация 1

Элюционный пул после SP концентрировали и диафильтровали при помощи 10 кДа мембраны Hydrosart Sartocon. Объединенный продукт концентрировали приблизительно до 15 мг/мл и диафильтровали 6-8 объемами 0,01 М фосфата натрия цитрата натрия, 0,137 М NaCl, pH 6,0. Концентрированный и диафильтрованный объединенный продукт затем пропускали через 0,2 мкм фильтр. Концентрированный/диафильтрованный пул пропускали через 0,2 мкм фильтр и хранили при 2-8°C, как правило, менее чем около 24 ч.

Вирусная фильтрация

Процедуру вирусной фильтрации можно проводить после ультрафильтрации/диафильтрации 1 для удаления любых вирусоподобных частиц из рабочего потока. Например, установка состояла из фильтрационной системы с насосом, фильтра Planova и манометра. Фильтр промывали 1 л 0,154 М NaCl со стороны ретентата, а затем более чем 3 л со стороны пермеата при заданном давлении в 11,0 фунт/дюйм². После завершения фильтр промывали 4 л 0,154 М NaCl для повышения степени извлечения продукта. После применения на фильтре проводили тест с частицами золота, чтобы гарантировать сохранность целостности фильтра.

Ультрафильтрация/диафильтрация 2

Прошедший вирусную фильтрацию материал концентрировали до 15-30 мг/мл и диафильтровали 68 диаобъемами диафильтрационного буфера, содержащего 0,154 М NaCl, при помощи 10 кДа УФДФ мембраны Hydrosart Sartocon. После завершения диафильтрации материал дополнительно концентрировали до 48-50 мг/мл. Затем систему промывали диафильтрационным буфером. Затем соответствующее количество промывочного раствора для системы возвращали в концентрат продукта до достижения заданной конечной концентрации, составляющей приблизительно 40 мг/мл.

Пример 8. Типовой процесс, состоящий из одной ультрафильтрации/диафильтрации.

Способ, описанный в примере 7 включает ультрафильтрацию/диафильтрацию ("УФДФ") элюата из SP-колонки (УФДФ1), вирусную фильтрацию концентрата УФДФ1 и конечный этап УФДФ фильтрата после вирусной очистки (УФДФ2) для получения предварительного лекарственного вещества (ЛВ). Типовая схема такого способа приведена на фиг. 1. В данном примере проводили дополнительные эксперименты для того чтобы определить, возможно ли убрать один из процессов УФДФ для сокращения общего рабочего времени, стоимости и потенциального увеличения выхода данного процесса. Таким образом, проводили исследования, чтобы оценить возможность осуществления проведения вирусной фильтрации SP-элюата с доведенным pH и последующего одного процесса УФДФ для получения предварительного отфильтрованного лекарственного вещества ("ЛВ").

В исследованиях применяли частично очищенные исходные материалы, которые были предварительно выделены из неочищенной массы материала ("НМ") в виде SP-элюата, как описано выше. SPэлюат применяли как загрузочный в трех испытаниях по УФДФ, проводимых в рамках данного исследования, включая два экспериментальных испытания по осуществимости и одно контрольное испытание с двойным процессом УФДФ, как описано выше. Два экспериментальных испытания (по осуществимости) состояли из одного этапа УФДФ с последующим доведением pH объединенного SP-элюата и одной ультрафильтрацией/двойной диафильтрацией ("УФДФДФ"). pH SP-элюата в испытаниях по осуществимости доводили до 6,0 и после этого фильтровали при помощи, например, вирусного фильтра Planova 20N.

- 38 030551

Экспериментальные испытания сравнивали с контрольным испытанием, включавшим УФДФ1-вирусную фильтрацию-УФДФ2, как описано выше. SP-элюат доводили до pH 6,0, проводили вирусную фильтрацию и разделяли на два одинаковых объема; в каждом экспериментальном испытании по осуществимости использовали один из двух пулов, прошедших вирусную фильтрацию. Типовой состав буфера для доведения pH объединенного SP-элюата приведен в табл. 8. Метод добавления по объему 0,075 л буфера для доведения/л SP-элюата позволял получить заданный pH около 6,0.

Таблица 8. Типовой буфер для доведения pH

Химический компонент	Концентрация (г/л)	Концентрация (мМ)
Фосфат натрия, одноосновный	4	30
Фосфат натрия, двухосновный	58	220
Цитрат натрия, дигидрат	10	34
Хлорид натрия	77	1330

После включения объединенного SP-элюата в экспериментальные испытания проводили доведение pH до 6,0; доведение приводило к получению SP-элюата с pH 5,98. Затем для SP-элюата с доведенным pH проводили вирусную фильтрацию на фильтре Planova 20N.

В табл. 9 приведены обобщенные результаты по выходу на этапе для отдельных типовых процессов. Как видно, испытания по УФДФ демонстрировали сходный выход по степени извлечения согласно данным А280. Экспериментальный типовой процесс вирусной фильтрации имел выход на этапе, составляющий 106,6%, что свидетельствует о том, что во время фильтрации не было потерь А280поглощающего белка. Выход для вирусной фильтрации являлся существенным показателем, так как он подтверждает, что доведение pH до около 6,0 позволяло октамерным молекулам рчАСА с диаметром 20 нм диссоциировать в димерную форму. Считалось, что в кислотных условиях (pH 5,0) молекула рчАСА существует в виде октамера, но при нейтральном pH она диссоциирует в димерную форму. Так как размер пор фильтра Planova 20N составлял 20 нм, было важно, чтобы молекулярная конформация белка рчАСА не соответствовала октамерной форме, так как октамерная рчАСА с большой вероятностью удерживалась/оставалась бы в вирусном фильтре. Данные по выходу на этом этапе подтвердили возможность осуществления вирусной фильтрации перед проведением УФДФ путем доведения pH SP-элюата. Эти данные по выходу свидетельствуют о том, что во время вирусной фильтрации не происходило потерь рчАСА, а доведение pH являлось важным этапом как для эффективности очистки, так и для pH заданной формы лекарственного состава.

Таблица 9. Обобщенные результаты по выходу на этапе

Испытание	Выход на этапе
Осуществимость вирусной фильтрации	106,6%
Экспериментальное испытание 1 - УФДФДФ	97,5%
Экспериментальное испытание 2 - УФДФ	99,6%
Контрольная УФДФ1	99,3%
Контрольная УФДФ2	98,0%

После завершения вирусной фильтрации прошедший вирусную фильтрацию пул делили на две равных части. Одну часть использовали в качестве исходного материала в Экспериментальном испытании 1 (УФДФДФ), а другую - в Экспериментальном испытании 2 (УФДФ).

Как видно из нижеприведенных данных, оба экспериментальных испытания показывали сходную среднюю проницаемость во время УФ и начальным сегментом ДФ. Кроме того, в Экспериментальном испытании 1 для второго сегмента ДФ наблюдали среднюю проницаемость, сходную с УФ и начальным сегментом ДФ. Оба контрольных испытания - УФДФ1 и УФДФ2 - показывали более низкие значения средней проницаемости по сравнению с испытаниями по осуществимости, причиной чего могут быть изменения в применяемых масштабах и устройствах.

Таблица 10. Средняя проницаемость и общее время обработки

Испытание	Средняя проницаемость УФ	Средняя проницаемость ДФ1	Средняя проницаемость ДФ2	Общее время обработки
Испытание 1; УФДФДФ	2,5	2,4	2,3	86
Испытание 2; УФДФ	2,5	2,6	Нет данных	60
Контрольная УФДФ1	1,6	1,5	Нет данных	58
Контрольная УФДФ2	1,6	1,3	Нет данных	48

Качество лекарственного вещества, полученного в ходе контрольного испытания и экспериментальных испытаний, сравнивали при помощи серии аналитических методов, включая: ЭХ-ВЭЖХ, ОФВЭЖХ, оценку активности, ДСН-ПААГ/вестерн-блоттинг для определения БКХ, ДСН-ПААГ (с кумасси), картирование гликанов, картирование пептидов и анализ содержания металлов.

- 39 030551

ЭХ-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ

В табл. 11 приведены результаты по эксклюзионной (ЭХ-ВЭЖХ) и обратно-фазовой (ОФ-ВЭЖХ) хроматографии. Данные ЭХ и ОФ свидетельствуют о пренебрежительно малой разнице между лекарственными веществами, полученными в ходе экспериментальных испытаний и контрольного испытания, что означает, что в обоих экспериментальных испытаниях было получено лекарственное вещество, для которого процентное содержание основного пика ЭХ и ОФ было сопоставимо с аналогичной характеристикой для лекарственного вещества из контрольного испытания. Эти данные демонстрируют возможность применения процесса согласно любому из экспериментальных испытаний вместо контрольного процесса, включающего двойной этап УФДФ, так как никакой существенной разницы в степени очистки не было выявлено.

Таблица 11. Результаты ЭХ-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ

Партия ЛВ	Основной пик ЭХ %	Основной пик ОФ %
Испытание 1; УФДФДФ	98	99
Испытание 2; УФДФ	98	99
Контроль	98	99

Активность

В табл. 12 приведены данные по активности (Е/мл) и специфической активности (Е/мг); при этом концентрацию (мг/мл) определяли путем деления поглощения (ОЕ) на известный коэффициент экстинкции, равный 0,67. Хотя для Экспериментального испытания 1 (УФДФДФ) наблюдали самое низкое значение специфической активности, оно попадало в необходимый нормативный диапазон, составляющий 50-140 Е/мг. Для Экспериментального испытания 2 (ФУДФ) наблюдали специфическую активность, сопоставимую с контрольным испытанием. Значения для всех трех испытаний, двух экспериментальных и одного контрольного, были сопоставимы, что свидетельствует о том, что способ получения формы лекарственного вещества не влияет на активность лекарственного вещества.

Таблица 12. Результаты по активности и специфической активности

Партия ЛВ	Активность (Е/мл)	Концентрация (мг/мл)	Специфическая активность (Е/мг)
Осуществимость 1; УФДФДФ	2683	38,7	69,3
Осуществимость 2; УФДФ	3320	39,5	84,1
Контроль	3658	40,4	90,5

Вестерн-блоттинг для определения белка клетки-хозяина (БКХ) и ДСН-ПААГ (кумасси)

На фиг. 5 и 6 проиллюстрированы гель ДСН-ПААГ/вестерн-блоттинг для определения БКХ и гель ДСН-ПААГ (с кумасси), соответственно. Как видно на фиг. 5, образцы, соответствующие экспериментальным (по осуществимости) и контрольному испытаниям (линии 5, 7, 9) демонстрировали набор полос, сходный со стандартным образцом (линия 3), что свидетельствует о том, что в лекарственном веществе, полученном в ходе всех испытаний, наблюдали сопоставимо низкие уровни БКХ. Фигура 6 также демонстрирует сопоставимость между экспериментальными (по осуществимости) и контрольным испытаниями и стандартным образцом; при помощи ДСН-ПААГ (с кумасси) не было зарегистрировано новых полос. Эти данные свидетельствуют о том, что качество лекарственного вещества, полученного в условиях экспериментальных испытаний, было сопоставимо с качеством в случае контрольного испытания согласно результатам ДСН-ПААГ/вестерн-блоттинга для определения БКХ и ДСН-ПААГ (с кумасси). При проведении вестерн-блоттинга для определения БКХ не наблюдали полос БКХ с интенсивностью, превышающей интенсивность полосы 15 кДа БКХ для контрольного образца; также не наблюдали новых полос, с интенсивностью, составляющей более 1% контрольного образца.

Картирование гликанов

В табл. 13 представлена типовая карта гликанов. Было обнаружено, что все гликозилированные формы присутствуют на сходных уровнях во всех исследуемых образцах. Результаты, свидетельствуют о том, что качество лекарственного вещества, полученного в ходе экспериментальных (по осуществимости) испытаний, было сравнимо с лекарственным веществом из контрольного испытания.

Таблица 13. Результаты , картирования гликанов

Форма	Группа пиков
Нейтральная	1
1-СА	2
Кэпированная М6Ф	3
2-СА	4
1-М6Ф	5
Гибридная	6
2-М6Ф	7

- 40 030551

Анализ содержания металлов и уровня pH

Также, чтобы определить уровень остаточного фосфата, для лекарственных веществ (ЛВ), полученных в экспериментальных и контрольном испытании, проводили анализ содержания металлов. В табл. 14 представлены значения по содержанию остаточного фосфора и конечному уровню pH для каждого из лекарственных образцов. Было обнаружено, что содержание остаточного фосфора сопоставимо для всех экспериментальных условий. Также было обнаружено, что уровень pH является сходным вне зависимости от экспериментальных условий. Предполагалось, что остаточный фосфат влияет на поддержание уровня pH лекарственного вещества, а результаты по содержанию остаточного фосфата согласуются с тем, что pH в случае всех трех партий лекарственных веществ сохранялся. Эти данные свидетельствуют о том, что оба экспериментальных (по осуществимости) испытания демонстрируют уровни остаточного фосфата в лекарственном веществе, сходные с контрольным испытанием, а все три партии лекарственных веществ были способны сохранять в конечной форме заданный уровень pH, составляющий около 6,0 (т.е., 5,5-6,5).

Также в ходе анализа содержания металлов были зафиксированы повышенные уровни содержания кальция, что показано в табл. 14. Уровни кальция были достаточно постоянны для всех образцов. Предварительные исследования показали, что ионы кальция присутствуют в составе активного участка рчАСА, который важен для ферментативной активности.

Таблица 14. Результаты по содержанию остаточного фосфора, кальция, и pH

Партия ЛВ	Фосфор (м.д.)	Кальций (м.д.)	pH
Осуществимость 1; УФДФДФ	29	11	6,2
Осуществимость 2; УФДФ	31	10	6,1
Контроль	33	11	6,2

Картирование пептидов

Проводили анализ методом картирования пептидов. Все образцы снова демонстрировали сходные профили, из чего можно заключить, что все исследуемые экспериментальные условия приводили к получению пептидной карты рчАСА, сравнимой с контролем.

Заключение

В вышеописанных экспериментах оценивали возможность осуществления вирусной фильтрации перед проведением УФДФ путем доведения pH SP-элюата, возможность осуществления одного этапа УФДФ вместо двух этапов УФДФ и возможность осуществления одного этапа диафильтрации (вместо двойной фильтрации) в рамках этапа УФДФ после вирусной фильтрации. Высокий выход на этапе проведения типового процесса вирусной фильтрации в экспериментальных испытаниях по осуществимости демонстрирует возможность осуществления вирусной фильтрации перед проведением УФДФ. Так как вирусная фильтрация обеспечивала возможность попадания молекул рчАСА в фильтрат, проводили два экспериментальных испытания по осуществимости УФДФ. Так как все параметры качества и проведения процесса свидетельствовали о сравнимости обоих экспериментальных испытаний и контроля, было определено, что один этап УФДФ является осуществимым. Результаты также продемонстрировали возможность осуществления одного этапа диафильтрации непосредственно в конечный раствор для лекарственной формы (0,9% солевой раствор) (экспериментальное испытание по осуществимости 2), так как указанным способом можно получить лекарственное вещество с качественными характеристиками, сопоставимыми с теми, которые обеспечивают контроль и эксперимент с двойной диафильтрацией (экспериментальное испытание по осуществимости 1).

На основании этих данных было определено, что доведение уровня pH до около 6,0 при помощи, например, буферного состава, приведенного в табл. 4, приводит к получению SP-элюата с доведенным pH, подходящего для проведения вирусной фильтрации перед конечными процессами УФДФ. Было показано, что этот способ, проиллюстрированный на фиг. 2, является возможной заменой способам, включающим этап УФДФ, за которым следует вирусная фильтрация, за которой следует еще один этап УФДФ. Было продемонстрировано, что способ, включающий доведение уровня pH-вирусную фильтрацию-УФДФ, обеспечивает получение лекарственного вещества, имеющего качественные характеристики и степень очистки, сопоставимые с теми, что получают более сложными, дорогостоящими и времязатратными способами.

Пример 9. Лекарственное вещество, содержащее рекомбинантную человеческую арилсульфатазу А (рчАСА).

рчАСА, очищенную в соответствии с вышеописанным способом, концентрировали до 35-45 мг/мл и добавляли в буфер, содержащий 154 мМ NaCl, с pH около 5,5-6,5.

Карты пептидов и гликанов для конечного лекарственного вещества соответствовали тем, что описаны в примере 8. Остаточная ДНК клетки-хозяина присутствовала в количествах <100 пг/мг согласно данным метода анализа ДНК THRESHOLD®. Степень очистки, которую определяли методами обратнофазовой и эксклюзионной ВЭЖХ, соответствовала площадям основных пиков, составляющим более 98%

- 41 030551

и более 95%, соответственно. Методом вестерн-блоттинга не было выявлено полос белка клетки-хозяина (БКХ) с интенсивностью, превышающей полосу приблизительно 15 кДа БКХ контрольного образца. Было зарегистрировано не более трех полос БКХ. Данные анализа ДСН-ПААГ (с кумасси; восстановительный) соответствовали стандартному образцу и не содержали новых полос с интенсивностью, превышающей 1% контрольного образца. Специфическая активность была определена на уровне 50-140 Е/мг.

Эквиваленты и объем изобретения

Специалистам в данной области техники очевидно или они могут при помощи стандартных экспериментов установить существование многих эквивалентов описанным в данном документе конкретным вариантам реализации изобретения.

Объем настоящего изобретения не ограничен вышеприведенным описанием, но определен нижеприведенной формулой изобретения.

Употребление порядковых терминов, таких как "первый", "второй", "третий" и т.д. в формуле изобретения в целях модификации элемента формулы изобретения не указывает само по себе на какой-либо приоритет, первоочередность или порядок одного элемента формулы изобретения по отношению к другому или временной порядок действий при осуществлении способа, а применяется в качестве обозначений для возможности отличать один элемент формулы изобретения, имеющий определенное название, от другого элемента, имеющего такое же название (но обозначенное порядковым термином), для различия элементов формулы изобретения. Употребляемое в данном документе в описании изобретения и в формуле изобретения единственное число, если четко не указано иное, подразумевает и множественные объекты. Пункты формулы изобретения или описания, которые содержат "или" между одним или более членами группы, считаются удовлетворительными, если один, более чем один или все члены группы присутствуют, задействованы или каким-либо другим способом связаны с данным продуктом или процессом, если не указано обратное или иное не очевидно из контекста. Изобретение включает варианты реализации, в которых только один член из группы присутствует, задействован или каким-либо другим способом связан с данным продуктом или процессом. Изобретение также включает варианты реализации, в которых более одного или все члены группы присутствуют, задействованы или каким-либо другим способом связаны с данным продуктом или процессом. Кроме того, следует понимать, что изобретение включает в себя все вариации, комбинации и перестановки, в которых одно или более ограничений, элементов, пунктов, описательных терминов и т. д. из одного или более перечисленных пунктов формулы изобретения вставлены в другой пункт, зависимый от того же основного пункта (или, в зависимости от содержания, от любого другого пункта), если не указано иное или если для специалиста в данной области техники очевидно, что может возникнуть противоречие или несогласованность. Там, где элементы представлены в виде списка (например, в виде группы Маркуша или в подобном формате), следует понимать, что каждая подгруппа элементов также раскрывается, а любой элемент(ы) можно удалить из группы. Следует понимать, что, в общем случае, там, где говорится, что изобретение или аспекты изобретения содержит/содержат конкретные элементы, особенности и т.д., определенные варианты реализации изобретения или аспекты изобретения состоят или преимущественно состоят из таких элементов, особенностей и т.д. Для упрощения в данном документе такие варианты реализации изобретения не были отдельно подробно описаны в каждом из случаев. Также следует понимать, что любой вариант реализации или аспект изобретения может быть полностью исключен из формулы изобретения вне зависимости от того, присутствует ли это конкретное исключение в описании изобретения. Публикации, вебсайты и другие ссылочные материалы, упоминаемые в данном документе для описания уровня техники изобретения и дополнительных подробностей в отношении его практической реализации, включены в данный текст посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Шир Хьюман Дженетик Терапис, ИНК.

<120> СПОСОБЫ ОЧИСТКИ АРИЛСУЛЬФАТАЗЫ А

<130> 2006685-0433

<140> Будет присвоен

<141> 2014-01-09

<150> 61/750693

<151> 2013-01-09

<160> 2

<170> PatentIn версия 3.5

- 42 030551

<210> 1

<211> 489

<212> БЕЛОК <213> Homo sapiens

<400> 1

Arg 1

Pro

Asn

Ile Val 5

Leu

Ile

Phe

Ala 10

Asp

Leu

Gly

Tyr 15

Gly

Asp

Leu

Gly

Cys

Tyr

Gly

His

Pro

Ser

Thr

Pro

Asn

Leu

Asp

20

25

30

Gln

Leu

Ala

Gly

Leu

Arg

Phe

Thr

Asp

Phe

Tyr

Val

Pro

Val

35

40

45

Ser

Leu

Cys

Thr

Pro

Ser

Arg

Ala

Leu

Thr

Gly

Arg

Leu

Pro

50

55

60

Val

Arg

Met

Gly

Met

Tyr

Pro

Gly

Val

Leu

Val

Pro

Ser

Arg

Gly

65

70

75

80

Gly

Leu

Pro

Leu

Glu

Val

Thr

Val

Ala

Glu

Val

Leu

Ala

Arg

85

90

95

Gly

Tyr

Leu

Thr

Gly

Met

Ala

Gly

Lys

Trp

His

Leu

Gly

Val

Gly

Pro

100

105

110

Glu

Gly

Ala

Phe

Leu

Pro

His

Gln

Gly

Phe

His

Arg

Phe

Leu

Gly

115

120

125

Ile

Pro

Tyr

Ser

His

Asp

Gln

Gly

Pro

Cys

Gln

Asn

Leu

Thr

Cys

Phe

130

135

140

Pro

Ala

Thr

Pro

Cys

Asp

Gly

Cys

Asp

Gln

Gly

Leu

Val

Pro

145

150

155

160

Ile

Pro

Leu

Ala

Asn

Leu

Ser

Val

Glu

Ala

Gln

Pro

Trp

Leu

165

170

175

Pro

Gly

Leu

Glu

Ala

Arg

Tyr

Met

Ala

Phe

Ala

His

Asp

Leu

Met

Ala

180

185

190

Asp

Ala

Gln

Arg

Gln

Asp

Arg

Pro

Phe

Leu

Tyr

Ala

Ser

His

195

200

205

His

Thr

His

Tyr

Pro

Gln

Phe

Ser

Gly

Gln

Ser

Phe

Ala

Glu

Arg

Ser

210

215

220

- 43 030551

Gly Arg 225

Gly

Pro

Phe

Gly 230

Asp

Ser

Leu

Met

Glu 235

Leu Asp

Ala

Val 240

Gly

Thr

Leu

Met

Thr

Ala

Ile

Gly

Asp

Leu

Gly

Leu

Glu

Thr

245

250

255

Leu

Val

Ile

Phe

Thr

Ala

Asp

Asn

Gly

Pro

Glu

Thr

Met

Arg

Met

Ser

260

265

270

Arg

Gly

Cys

Ser

Gly

Leu

Arg

Cys

Gly

Lys

Gly

Thr

Tyr

275

280

285

Glu

Gly

Val

Arg

Glu

Pro

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp

Pro

Gly

His

Ile

290

295

300

Ala

Pro

Gly

Val

Thr

His

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

Asp

Leu

Pro

305

310

315

320

Thr

Leu

Ala

Leu

Ala

Gly

Ala

Pro

Leu

Pro

Asn

Val

Thr

Leu

Asp

325

330

335

Gly

Phe

Asp

Leu

Ser

Pro

Leu

Gly

Thr

Gly

Lys

Ser

Pro

Arg

340

345

350

Gln

Ser

Leu

Phe

Tyr

Pro

Ser

Tyr

Pro

Asp

Glu

Val

Arg

Gly

Val

355

360

365

Phe

Ala

Val

Arg

Thr

Gly

Lys

Tyr

Lys

Ala

His

Phe

Thr

Gln

Gly

370

375

380

Ser

Ala

His

Ser

Asp

Thr

Ala

Asp

Pro

Ala

Cys

His

Ala

Ser

385

390

395

400

Ser

Leu

Thr

Ala

His

Glu

Pro

Leu

Tyr

Asp

Leu

Ser

Lys

Asp

405

410

415

Pro

Gly

Glu

Asn

Tyr

Asn

Leu

Gly

Val

Ala

Gly

Ala

Thr

Pro

420

425

430

Glu

Val

Leu

Gln

Ala

Leu

Lys

Gln

Leu

Gln

Leu

Lys

Ala

Gln

Leu

435

440

445

Asp

Ala

Val

Thr

Phe

Gly

Pro

Ser

Gln

Val

Ala

Arg

Gly

Glu

Asp

450

455

460

Pro

Ala

Leu

Gln

Ile

Cys

His

Pro

Gly

Cys

Thr

Pro

Arg

Pro

Ala

465 470 475 480

- 44 030551

Cys Cys His Cys Pro Asp Pro His Ala 485

<210> 2

<211> 507

<212> БЕЛОК <213> Homo sapiens

<400> 2

Met 1

Gly

Ala

Pro Arg 5

Ser

Leu

Ala 10

Leu

Ala Ala

Gly

Leu 15

Ala

Val

Ala

Arg

Pro

Asn

Ile

Val

Leu

Ile

Phe

Ala

Asp

Leu

Gly

20

25

30

Tyr

Gly

Asp

Leu

Gly

Cys

Tyr

Gly

His

Pro

Ser

Thr

Pro

Asn

35

40

45

Leu

Asp

Gln

Leu

Ala

Gly

Leu

Arg

Phe

Thr

Asp

Phe

Tyr

Val

50

55

60

Pro

Val

Ser

Leu

Cys

Thr

Pro

Ser

Arg

Ala

Leu

Thr

Gly

Arg

65

70

75

80

Leu

Pro

Val

Arg

Met

Gly

Met

Tyr

Pro

Gly

Val

Leu

Val

Pro

Ser

85

90

95

Arg

Gly

Leu

Pro

Leu

Glu

Val

Thr

Val

Ala

Glu

Val

Leu

Ala

100

105

110

Ala

Arg

Gly

Tyr

Leu

Thr

Gly

Met

Ala

Gly

Lys

Trp

His

Leu

Gly

Val

115

120

125

Gly

Pro

Glu

Gly

Ala

Phe

Leu

Pro

His

Gln

Gly

Phe

His

Arg

Phe

130

135

140

Leu

Gly

Ile

Pro

Tyr

Ser

His

Asp

Gln

Gly

Pro

Cys

Gln

Asn

Leu

Thr

145

150

155

160

Cys

Phe

Pro

Ala

Thr

Pro

Cys

Asp

Gly

Cys

Asp

Gln

Gly

Leu

165

170

175

Val

Pro

Ile

Pro

Leu

Ala

Asn

Leu

Ser

Val

Glu

Ala

Gln

Pro

180

185

190

Trp

Leu

Pro

Gly

Leu

Glu

Ala

Arg

Tyr

Met

Ala

Phe

Ala

His

Asp

Leu

195

200

205

- 45 030551

Met

Ala 210

Asp Ala

Gln

Arg

Gln 215

Asp

Arg

Pro

Phe

Phe 220

Leu

Tyr

Ala

Ser

His

Thr

His

Tyr

Pro

Gln

Phe

Ser

Gly

Gln

Ser

Phe

Ala

Glu

225

230

235

240

Arg

Ser

Gly

Arg

Gly

Pro

Phe

Gly

Asp

Ser

Leu

Met

Glu

Leu

Asp

Ala

245

250

255

Ala

Val

Gly

Thr

Leu

Met

Thr

Ala

Ile

Gly

Asp

Leu

Gly

Leu

Glu

260

265

270

Glu

Thr

Leu

Val

Ile

Phe

Thr

Ala

Asp

Asn

Gly

Pro

Glu

Thr

Met

Arg

275

280

285

Met

Ser

Arg

Gly

Cys

Ser

Gly

Leu

Arg

Cys

Gly

Lys

Gly

Thr

290

295

300

Thr

Tyr

Glu

Gly

Val

Arg

Glu

Pro

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp

Pro

Gly

305

310

315

320

His

Ile

Ala

Pro

Gly

Val

Thr

His

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

Asp

Leu

325

330

335

Leu

Pro

Thr

Leu

Ala

Leu

Ala

Gly

Ala

Pro

Leu

Pro

Asn

Val

Thr

340

345

350

Leu

Asp

Gly

Phe

Asp

Leu

Ser

Pro

Leu

Gly

Thr

Gly

Lys

Ser

355

360

365

Pro

Arg

Gln

Ser

Leu

Phe

Tyr

Pro

Ser

Tyr

Pro

Asp

Glu

Val

Arg

370

375

380

Gly

Val

Phe

Ala

Val

Arg

Thr

Gly

Lys

Tyr

Lys

Ala

His

Phe

Thr

385

390

395

400

Gln

Gly

Ser

Ala

His

Ser

Asp

Thr

Ala

Asp

Pro

Ala

Cys

His

Ala

405

410

415

Ser

Leu

Thr

Ala

His

Glu

Pro

Leu

Tyr

Asp

Leu

Ser

420

425

430

Lys

Asp

Pro

Gly

Glu

Asn

Tyr

Asn

Leu

Gly

Val

Ala

Gly

Ala

435

440

445

Thr

Pro

Glu

Val

Leu

Gln

Ala

Leu

Lys

Gln

Leu

Gln

Leu

Lys

Ala

- 46 030551

450 455 460

Gln

Leu

Asp

Ala

Val

Thr

Phe

Gly

Pro

Ser

Gln

Val

Ala

Arg

Gly

465

470

475

480

Glu

Asp

Pro

Ala

Leu

Gln

Ile

Cys

His

Pro

Gly

Cys

Thr

Pro

Arg

485

490

495

Pro

Ala

Cys

His

Cys

Pro

Asp

Pro

His

Ala

500 505

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ очистки рекомбинантного белка арилсульфатазы А (АСА), включающий проведение одного или более хроматографических этапов;

объединение элюата после одного или более хроматографических этапов;

доведение pH объединенного элюата до уровня pH, составляющего или превышающего величину приблизительно 6,0; и

проведение ультрафильтрации и/или диафильтрации элюата с доведенным уровнем pH.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что

(a) pH доводят до приблизительно 6,0 и/или pH доводят при помощи буфера, содержащего фосфат натрия, хлорид натрия и цитрат натрия с pH 7,0;

при этом необязательно буфер содержит приблизительно 0,1-0,5 М фосфата натрия, 0,5-2,5 М хлорида натрия и 0,1-0,6 М цитрата натрия с pH 7,0.
3. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что

(a) вирусную фильтрацию проводят до этапа ультрафильтрации и диафильтрации; и/или проводят один этап ультрафильтрации и/или диафильтрации;

при этом необязательно один этап ультрафильтрации и/или диафильтрации включает только одну диафильтрацию;

при этом необязательно ультрафильтрация представляет собой тангенциальную поточную ультрафильтрацию.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что один или более хроматографических этапов включают катионообменную хроматографию;

при этом необязательно катионообменная хроматография является последним хроматографическим этапом, а элюат после катионообменной хроматографии объединяют перед доведением уровня pH;

при этом необязательно перед проведением катионообменной хроматографии проводят один или более этапов из анионообменной хроматографии, хроматографии с комбинированным режимом и хроматографии с гидрофобным взаимодействием.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что анионообменная хроматография представляет собой

(a) Q хроматографию, или

(b) включает применение смолы ТМАЕ; при этом необязательно

(i) после загрузки неочищенным препаратом смолу ТМАЕ промывают первым промывочным буфером, содержащим MES-Tris с pH 7,0;

при этом возможно первый промывочный буфер содержит приблизительно 20-75 мМ MES-Tris; и/или

(ii) смолу ТМАЕ промывают вторым промывочным буфером, содержащим MES-Tris и NaCl c pH 7,0;

при этом возможно второй промывочный буфер содержит приблизительно 5-75 мМ MES-Tris и приблизительно 50-150 мМ NaCl с pH 7,0; и/или

(iii) после загрузки неочищенным препаратом смолу ТМАЕ элюируют при помощи элюирующего буфера, содержащего MES-Tris и NaCl с pH 7,0;

при этом возможно элюирующий буфер содержит приблизительно 5-75 мМ MES-Tris и приблизительно 150-300 мМ NaCl с pH 7,0.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что в анионообменной хроматографии применяют колонку, выбранную из группы, состоящей из QSepharose™ FastFlow, QSepharose™ HighPerformance, QSepharose™ XL, Capto™ Q, DEAE, TOYOPEARLGigaCap® Q, Fractogel® TMAE, Eshmuno™ Q, Nuvia™ Q или UNOsphere™ Q,

(a) хроматография с комбинированным режимом представляет собой хроматографию с гидроксиа- 47 030551

патитом (HA); и/или

(b) хроматография с гидрофобным взаимодействием представляет собой хроматографию с фенилом.
7. Способ по любому из пп.3-5, отличающийся тем, что:

(a) проведение одного или более хроматографических этапов осуществляют в следующем порядке: анионообменная хроматография со смолой ТМАЕ, HA-хроматография, хроматография с фенилом и катионообменная SP-хроматография; и/или

(b) в анионообменной хроматографии применяют колонку с загрузочной емкостью, превышающей приблизительно 4,5 г/л; при этом загрузочная емкость колонки составляет приблизительно 5-20 г/л.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что ультрафильтрацию неочищенного препарата проводят перед одним или более хроматографическими этапами; при этом

(a) (i) ультрафильтрация представляет собой тангенциальную поточную ультрафильтрацию и/или (ii) для ультрафильтрации применяют мембранный фильтр, имеющий размер пор, соответствующий отсечению по молекулярной массе по меньшей мере в 10 кДа, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 кДа;

(b) по меньшей мере 75% рекомбинантной АСА остается в неочищенном препарате;

(c) по меньшей мере 75% рекомбинантной АСА проникает через фильтр или

(d) ультрафильтрация включает применение полиэфирсульфоновой или целлюлозной мембраны; при этом необязательно после ультрафильтрации осуществляют один или более этапов глубинной

фильтрации и/или вирусной инактивации; при этом

(i) за одним или более этапами глубинной фильтрации и/или вирусной инактивации следует один или более хроматографических этапов и/или

(ii) этап вирусной инактивации включает добавление детергента в неочищенный препарат.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что

(a) рекомбинантный белок АСА вырабатывается клетками млекопитающих, культивируемыми в суспензии;

при этом необязательно клетки млекопитающих культивируют в биореакторе; и/или при этом среда является бессывороточной;

при этом необязательно бессывороточная среда является химически определенной средой; и/или клетки млекопитающих представляют собой клетки человека;

(b) неочищенный препарат представляет собой поток поступающего материала из перфузионного биореактора;

(c) неочищенный препарат получают из бессывороточной среды, содержащей рекомбинантный белок АСА, секретируемый клетками млекопитающих;

при этом необязательно неочищенный препарат получают, размораживая замороженный препарат среды;

(d) этап ультрафильтрации и/или диафильтрации включает перенос очищенного рекомбинантного белка АСА в буфер лекарственной формы;

(e) рекомбинантный белок АСА имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO: 1 (соответствующей человеческому белку АСА дикого типа);

при этом необязательно рекомбинантный белок АСА имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 1;

(f) очищенный рекомбинантный белок АСА содержит менее чем 100 нг/мг или менее чем 60 нг/мг

БКХ;

(g) очищенный рекомбинантный белок АСА при проведении ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси голубым не имеет новых полос с интенсивностью большей, чем 1,0% контрольного образца; и/или

(h) очищенный рекомбинантный белок АСА содержит менее чем 100 пг/мг или менее чем 50 пг/мг ДНК клетки-хозяина.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что на первом хроматографическом этапе применяют колонку с загрузочной емкостью большей, чем приблизительно 4,5 г белка/л смолы; при этом необязательно

(a) проведение одного или более хроматографических этапов осуществляют в следующем порядке: анионообменная хроматография, хроматография с комбинированным режимом, хроматография с гидрофобным взаимодействием и катионообменная хроматография;

при этом необязательно в анионообменной хроматографии применяют колонку со смолой ТМАЕ; при этом необязательно загрузочная емкость колонки ТМАЕ составляет приблизительно 5-20 г белка/л смолы; и/или

(b) единственный этап ультрафильтрации и/или диафильтрации проводят после одного или более хроматографических этапов.
11. Рекомбинантный белок арилсульфатазы А (АСА), очищенный в соответствии со способом по любому из предыдущих пунктов.
12. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный белок АСА по п.11.
13. Фармацевтическая композиция по п.12 для применения в способе лечения метахроматической

- 48 030551

лейкодистрофии.
14. Состав, содержащий очищенную рекомбинантную арилсульфатазу А (АСА), имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO: 1, при этом

(a) очищенная рекомбинантная АСА обладает специфической активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 Е/мг; по меньшей мере приблизительно 70 Е/мг, по меньшей мере приблизительно 100 Е/мг, по меньшей мере приблизительно 120 Е/мг, или специфической активностью в диапазоне, составляющем приблизительно 50-200 Е/мг; и дополнительно очищенная рекомбинантная АСА содержит меньше чем 150 нг/мг, 100 нг/мг или 60 нг/мг белка клетки-хозяина (БКХ) и/или меньше чем 150 пг/мг, 100 пг/мг или 50 пг/мг ДНК клетки-хозяина (ДКХ), или

(b) указанная очищенная АСА характеризуется картой гликанов, содержащей семь или менее групп пиков, выбранных из групп пиков, характерных для нейтральных (группа пиков 1), моносиалированных (группа пиков 2), копированных манноза-6-фосфатированных (группа пиков 3), дисиалированных (группа пиков 4), мономанноза-6-фосфатированных (группа пиков 5), гибридных (группа пиков 6) и диманноза-6-фосфатированных (группа пиков 7) гликанов.
15. Состав по п.14, отличающийся тем, что указанная очищенная рекомбинантная АСА имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 1.
16. Состав по п.14, отличающийся тем, что указанная очищенная рекомбинантная АСА имеет последовательность аминокислот, идентичную SEQ ID NO: 1.
17. Лекарственная форма, содержащая состав по п.14 и физиологически приемлемый носитель, необязательно отличающаяся тем, что подходит для внутривенного, интратекального или подкожного введения.

- 49 030551