CN116693659A - 一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法 - Google Patents
一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116693659A CN116693659A CN202310845363.4A CN202310845363A CN116693659A CN 116693659 A CN116693659 A CN 116693659A CN 202310845363 A CN202310845363 A CN 202310845363A CN 116693659 A CN116693659 A CN 116693659A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant human
- serum albumin
- human serum
- mixed mode
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 title claims abstract description 90
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 title claims abstract description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 60
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 36
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 23
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 19
- -1 2- (1H-indol-3-yl) acetyl Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 17
- GECHUMIMRBOMGK-UHFFFAOYSA-N sulfapyridine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC=N1 GECHUMIMRBOMGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 64
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 52
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 40
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 26
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 15
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 12
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 11
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 5
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 claims description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 28
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 25
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 11
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 abstract description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K trisodium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 9
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 9
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 9
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 description 1
- 206010000804 Acute hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 208000034767 Hypoproteinaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010044541 Traumatic shock Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 231100000836 acute liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，属于蛋白质层析分离技术。具体步骤如下：1)发酵液预处理，取含有重组人血白蛋白的酵母发酵液，加入辛酸钠，加热去除杂蛋白和灭活蛋白酶，离心分离，取上清液为料液；2)第一步混合模式层析，采用(2‑(1H‑吲哚‑3‑基)乙酰基)半胱氨酸为配基的介质，上样料液，洗脱收集洗脱液；3)第二步混合模式层析，采用4‑氨基‑N‑(2‑吡啶基)苯磺酰胺为配基的介质，上样条件与第一步洗脱条件一致，收集流穿液，得到重组人血白蛋白。本发明开发了一种两步纯化工艺，采用两种混合模式介质，从酵母发酵液中高效分离重组人血白蛋白，具有分离条件温和、分离效率高、杂质去除率高的特点。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质分离技术领域，涉及一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法。
背景技术
人血白蛋白是人血浆内含量最丰富的蛋白质，由585个氨基酸残基组成，有三个同源区域。主要功能是维持血浆渗透压、运输外源性物质和代谢物。人血白蛋白被广泛用于治疗创伤性休克、烧伤、急性肝功能衰竭和低蛋白血症等，具有广泛的应用价值。近年来，全球对人血白蛋白的需求已超过600吨/年。目前注射用人血白蛋白产品主要是通过人血浆提纯，受限于血浆来源不足和潜在的病原体感染的风险。利用酵母细胞来表达重组人血白蛋白，可避免病原体感染的风险，同时解决血浆来源不足等问题。
专利US5521287公开了一种组合阳离子交换层析、疏水作用层析、金属螯合亲和层析的方法，可以从酵母发酵液中分离得到纯度较高的重组人血白蛋白。专利CN102190722A公开了一种重组人血白蛋白的纯化方法，使用阴离子交换扩张床吸附从酵母发酵液中捕获重组人血白蛋白，再经过加热、疏水作用层析、阳离子交换层析、超滤、螯合、沉淀等多个步骤，可以得到纯度大于99％的重组人血白蛋白，然而该方法步骤多而复杂，收率为32.2％。专利CN1191545公开了一种离子交换层析从酵母发酵液中纯化重组人血白蛋白的方法，由于离子交换介质耐盐性差，发酵液需稀释，导致分离效果较低。专利US5962649使用阳离子交换扩张床吸附来处理酵母发酵液，料液需要稀释并调整pH为酸性条件，导致部分重组人血白蛋白降解。上述方法存在过程复杂、发酵液需要预处理，收率较低等问题，开发出一种选择性高、工艺简单、收率高的分离新方法，将有助于提高过程效率，节省制备成本。
混合模式层析是一种高效的生物分离新技术，配基兼有多种功能基团，分离选择性高，吸附容量大，洗脱条件温和。专利CN110681362A公开了一种以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式介质，表现出对人血白蛋白吸附容量大、选择性高、耐盐性好等优势。文章(Journal of Separation Science,43(21):4028-4035,2020和高校化学工程学报，35(3):492-499,2021)采用(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的混合模式介质，从发酵液中分离重组人血白蛋白，纯度和收率都可达到90％，但仍含有聚集体、色素、宿主细胞蛋白等微量杂质需要去除。
发明内容
针对以上问题，本发明设计了一个分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，第一步为吸附-洗脱模式，采用(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的混合模式介质，直接从酵母发酵液中捕获重组人血白蛋白；第二步为流穿模式，采用4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的混合模式介质，吸附杂质，重组人血白蛋白流穿，得到高纯度的重组人血白蛋白。
本发明方法得到的人血白蛋白纯度大于95％，宿主细胞蛋白去除率达99％。具有分离条件温和、分离效率高、杂质去除率高的特点。
本发明提供了一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，具体包括如下步骤：
1)取含有重组人血白蛋白的酵母发酵液，预处理获得含有重组人血白蛋白的粗品溶液；
2)调节重组人血白蛋白粗品溶液的pH至4.0～5.0，过滤后上样到填充有以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的混合模式介质的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱液；
3)将步骤2)得到的洗脱液上样到填充有以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的混合模式介质的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，重组人血白蛋白流穿，杂质被吸附，收集流穿液，得到重组人血白蛋白溶液。
作为本发明的优选方案，所述的步骤1)中，预处理的方法为：取含有重组人血白蛋白的酵母发酵液，重组人血白蛋白浓度为2～10mg/mL，调节pH至6.0，加入辛酸钠至辛酸钠的浓度为10～20mM，68℃加热30min，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到含有重组人血白蛋白的粗品溶液。
作为本发明的优选方案，所述的调节酵母发酵液pH值所用酸溶液为0.1M乙酸或柠檬酸溶液，所用碱溶液为0.1M氢氧化钠溶液。
作为本发明的优选方案，所述的步骤1)中，含有重组人血白蛋白的酵母发酵液为毕赤酵母发酵液或者酿酒酵母发酵液。
作为本发明的优选方案，所述的步骤2)使用的混合模式介质的配基密度为100～200μmol/L。
作为本发明的优选方案，所述的步骤2)的平衡缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为4.0～5.0。
作为本发明的优选方案，所述步骤2)中的过滤采用0.45μm孔径的滤膜。
作为本发明的优选方案，所述步骤2)的洗脱缓冲液为添加0.2-0.6M NaCl的磷酸盐缓冲液或者添加0.2-0.6M NaCl的Tris-盐酸缓冲液，pH值为8.0～9.0。
作为本发明的优选方案，所述的步骤3)使用的混合模式介质的配基密度为30～100μmol/L。
作为本发明的优选方案，所述步骤3)的平衡缓冲液为添加0.2-0.6M NaCl的磷酸盐缓冲液或者添加0.2-0.6M NaCl的Tris-盐酸缓冲液，pH值为8.0～9.0。
本发明充分利用混合模式层析吸附容量大、选择性好、洗脱条件温和等优势，形成两步混合模式层析，提高分离效率，简化分离步骤，实现从酵母发酵液高效分离重组人血白蛋白。
本发明的优点在于：
1)优化组合吸附洗脱模式和流穿模式，形成两步混合模式层析分离新工艺，过程简便高效；
2)吸附洗脱模式采用(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的混合模式介质，实现重组人血白蛋白初步分离，去除大部分杂质；
3)流穿模式采用4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的混合模式介质，实现残余杂质的高效吸附，宿主细胞蛋白去除率高达99％；
4)两步层析得到重组人血白蛋白的纯度达到95％以上，收率80％以上；
5)两步分离工艺衔接简便，以第一步混合模式层析的洗脱条件作为第二步混合模式层析的上样条件，无需料液预处理或缓冲液置换，其中合适的pH和盐浓度是关键。
附图说明
图1是(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸配基结构示意图；
图2是4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺配基结构示意图；
图3是不同样品的高效液相色谱分析图，分别为重组人血白蛋白粗品溶液、第一步混合模式层析的流穿组分、第一步混合模式层析的洗脱组分和第二步混合模式层析的流穿组分。
具体实施方式
本发明提供了一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法。取含有重组人血白蛋白的酵母发酵液，加入辛酸钠，加热去除杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，离心分离，取上清液；将上清液通过装有(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的混合模式介质的层析柱进行吸附洗脱模式分离，收集洗脱液，将洗脱液通过装有4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的混合模式介质的层析柱进行流穿模式分离，得到重组人血白蛋白。本发明方法得到的人血白蛋白纯度大于95％，宿主细胞蛋白去除率达99％。
分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法包括如下步骤：
1)取含有重组人血白蛋白的酵母发酵液，调节pH为6.0后加入辛酸钠至辛酸钠浓度为10-20mM，68℃加热30min，快速冷却至室温，离心取上清液，得到重组人血白蛋白粗品溶液；
2)调节重组人血白蛋白粗品溶液的pH至4.0～5.0，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的混合模式介质的层析柱中，配基结构如图1所示，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱液；
3)将洗脱缓冲液用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的混合模式介质的层析柱中，配基结构如图2所示，收集流穿峰对应的流穿液，得到重组人血白蛋白溶液；最终蛋白纯度大于95％，宿主细胞蛋白去除率达99％。
实施例1
取含有重组人血白蛋白的毕赤酵母发酵液，电导率约20mS/cm，重组人血白蛋白浓度为2.0mg/mL。调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，沉淀杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到粗品溶液。调节粗品溶液pH值为4.0，0.45μm滤膜过滤，取20mL作为进样样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的层析介质，配基密度为100μmol/L，平衡缓冲液为20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0)，洗脱液为添加0.2M NaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)，收集洗脱组分，取12mL作为后续分离的样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为30μmol/L，平衡缓冲液为添加0.2M NaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)，上样样品，收集流穿液，得到重组人血白蛋白，高效液相色谱分析纯度为95.1％，收率为81.2％，ELISA分析宿主细胞蛋白去除率为99.8％。
实施例2
取含有重组人血白蛋白的毕赤酵母发酵液，电导率约20mS/cm，重组人血白蛋白浓度为2.4mg/mL。调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，沉淀杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到粗品溶液。调节粗品溶液pH值为4.0，0.45μm滤膜过滤，取16mL作为进样样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的层析介质，配基密度为100μmol/L，平衡缓冲液为20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0)，洗脱液为添加0.4M NaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)，收集洗脱组分，取12mL作为后续分离的样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为65μmol/L，平衡缓冲液为添加0.4MNaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)收集流穿液，得到重组人血白蛋白，HPLC分析纯度为95.3％，收率为80.1％，ELISA分析宿主细胞蛋白去除率为99.2％。
实施例3
取含有重组人血白蛋白的毕赤酵母发酵液，电导率约20mS/cm，重组人血白蛋白浓度为5.1mg/mL。调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，沉淀杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到粗品溶液。调节粗品溶液pH值为4.5，0.45μm滤膜过滤，取8.0mL作为进样样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的层析介质，配基密度为100μmol/L，平衡缓冲液为20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5)，洗脱液为添加0.6M NaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)，收集洗脱组分，取8.0mL作为后续分离的样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为100μmol/L，平衡缓冲液为添加0.6MNaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)，收集流穿液，得到重组人血白蛋白，HPLC分析纯度为94.3％，收率为80.2％，ELISA分析宿主细胞蛋白去除率为99.5％。
实施例4
取含有重组人血白蛋白的酿酒酵母发酵液，电导率约20mS/cm，重组人血白蛋白浓度为10mg/mL。调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，沉淀杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到粗品溶液。调节粗品溶液pH值为4.5，0.45μm滤膜过滤，取5mL作为进样样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的层析介质，配基密度为150μmol/L，平衡缓冲液为20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5)，洗脱液为添加0.2M NaCl的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 9.0)，收集洗脱组分，取12mL作为后续分离的样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为30μmol/L，平衡缓冲液为添加0.2M NaCl的20mMTris-盐酸缓冲液(pH 9.0)收集流穿液，得到重组人血白蛋白，HPLC分析纯度为95.1％，收率为81.3％，ELISA分析宿主细胞蛋白去除率为99.5％。
实施例5
取含有重组人血白蛋白的毕赤酵母发酵液，电导率约20mS/cm，重组人血白蛋白浓度为2.4mg/mL。调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，沉淀杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到粗品溶液。调节粗品溶液pH值为4.5，0.45μm滤膜过滤，取20mL作为进样样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的层析介质，配基密度为150μmol/L，平衡缓冲液为20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5)，洗脱液为添加0.2M NaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)，收集洗脱组分，取10mL作为后续分离的样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为65μmol/L，平衡缓冲液为添加0.2MNaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)收集流穿液，得到重组人血白蛋白，HPLC分析纯度为95.1％，收率为81.3％，ELISA分析宿主细胞蛋白去除率为99.5％。不同样品的高效液相色谱分析图见附图3，其中(a)部分为经过步骤1预处理的酵母发酵液样品，可以发现含有较多杂质；(b)部分为经过步骤2层析分离得到的流穿液，可以发现大部分杂质通过流穿被去除；(c)部分为经过步骤2层析分离得到的洗脱液，可以发现得到较纯的重组人血白蛋白；(d)部分为经过步骤3层析分离得到的流穿液，可以发现重组人血白蛋白得到了进一步纯化，杂质含量进一步降低。
实施例6
取含有重组人血白蛋白的毕赤酵母发酵液，电导率约20mS/cm，重组人血白蛋白浓度为5.1mg/mL。调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，沉淀杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到粗品溶液。调节粗品溶液pH值为4.5，0.45μm滤膜过滤，取10mL作为进样样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的层析介质，配基密度为150μmol/L，平衡缓冲液为20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5)，洗脱液为添加0.4M NaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 9.0)，收集洗脱组分，取8.0mL作为后续分离的样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为100μmol/L，平衡缓冲液为添加0.4MNaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 9.0)收集流穿液，得到重组人血白蛋白，HPLC分析纯度为95.0％，收率为80.3％，ELISA分析宿主细胞蛋白去除率为99.1％。
实施例7
取含有重组人血白蛋白的毕赤酵母发酵液，电导率约20mS/cm，重组人血白蛋白浓度为10mg/mL。调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，沉淀杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到粗品溶液。调节粗品溶液pH值为4.5，0.45μm滤膜过滤，取6.0mL作为进样样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的层析介质，配基密度为200μmol/L，平衡缓冲液为20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.5)，洗脱液为添加0.6M NaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)，收集洗脱组分，取12mL作为后续分离的样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为30μmol/L，平衡缓冲液为添加0.6MNaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)收集流穿液，得到重组人血白蛋白，HPLC分析纯度为95.0％，收率为81.0％，ELISA分析宿主细胞蛋白去除率为99.4％。
实施例8
取含有重组人血白蛋白的毕赤酵母发酵液，电导率约20mS/cm，重组人血白蛋白浓度为5.0mg/mL。调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，沉淀杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到粗品溶液。调节粗品溶液pH值为5.0，0.45μm滤膜过滤，取12mL作为进样样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的层析介质，配基密度为200μmol/L，平衡缓冲液为20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.0)，洗脱液为添加0.2M NaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)，收集洗脱组分，取10mL作为后续分离的样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为65μmol/L，平衡缓冲液为添加0.2MNaCl的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)收集流穿液，得到重组人血白蛋白，HPLC分析纯度为95.1％，收率为81.2％，ELISA分析宿主细胞蛋白去除率为99.5％。
实施例9
取含有重组人血白蛋白的酿酒酵母发酵液，电导率约20mS/cm，重组人血白蛋白浓度为5.0mg/mL。调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，沉淀杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到粗品溶液。调节粗品溶液pH值为5.0，0.45μm滤膜过滤，取12mL作为进样样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的层析介质，配基密度为200μmol/L，平衡缓冲液为20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.0)，洗脱液为添加0.6M NaCl的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)，收集洗脱组分，取8.0mL作为后续分离的样品。层析柱(内径0.5cm)中填充1mL的以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为100μmol/L，平衡缓冲液为添加0.6M NaCl的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)收集流穿液，得到重组人血白蛋白，HPLC分析纯度为95.1％，收率为81.1％，ELISA分析宿主细胞蛋白去除率为99.7％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，其特征在于包括如下步骤：
1)取含有重组人血白蛋白的酵母发酵液，预处理获得含有重组人血白蛋白的粗品溶液；
2)调节重组人血白蛋白粗品溶液的pH至4.0～5.0，过滤后上样到填充有以(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的混合模式介质的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱液；
3)将步骤2)得到的洗脱液上样到填充有以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的混合模式介质的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，重组人血白蛋白流穿，杂质被吸附，收集流穿液，得到重组人血白蛋白溶液。
2.如权利要求1所述的一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，其特征在于，所述的步骤1)中，预处理的方法为：取含有重组人血白蛋白的酵母发酵液，调节pH至6.0，加入辛酸钠至辛酸钠的浓度为10～20mM，68℃加热30min，迅速冷却至室温，离心取上清液，得到含有重组人血白蛋白的粗品溶液。
3.如权利要求1所述的一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，其特征在于，所述的步骤1)中，含有重组人血白蛋白的酵母发酵液为毕赤酵母发酵液或者酿酒酵母发酵液。
4.如权利要求2所述的一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，其特征在于所述的调节酵母发酵液pH值所用酸溶液为乙酸或柠檬酸溶液，所用碱溶液为氢氧化钠溶液。
5.如权利要求1所述的一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，其特征在于所述的步骤2)使用的混合模式介质的配基密度为100～200μmol/L。
6.如权利要求1所述的一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，其特征在于所述的步骤2)的平衡缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为4.0～5.0。
7.如权利要求1所述的一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，其特征在于所述步骤2)中的过滤采用0.45μm孔径的滤膜。
8.如权利要求1所述的一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，其特征在于所述步骤2)的洗脱缓冲液为添加0.2-0.6M NaCl的磷酸盐缓冲液或者添加0.2-0.6MNaCl的Tris-盐酸缓冲液，pH值为8.0～9.0。
9.如权利要求1所述的一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，其特征在于所述的步骤3)使用的混合模式介质的配基密度为30～100μmol/L。
10.如权利要求1所述的一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法，其特征在于所述步骤3)的平衡缓冲液为添加0.2-0.6M NaCl的磷酸盐缓冲液或者添加0.2-0.6MNaCl的Tris-盐酸缓冲液，pH值为8.0～9.0。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310845363.4A CN116693659A (zh) | 2023-07-11 | 2023-07-11 | 一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310845363.4A CN116693659A (zh) | 2023-07-11 | 2023-07-11 | 一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116693659A true CN116693659A (zh) | 2023-09-05 |
Family
ID=87839242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310845363.4A Pending CN116693659A (zh) | 2023-07-11 | 2023-07-11 | 一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116693659A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014110246A1 (en) * | 2013-01-09 | 2014-07-17 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Methods for purification of arylsulfatase a |
| CN107033236A (zh) * | 2017-05-05 | 2017-08-11 | 浙江大学 | 一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法 |
| CN110240649A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-09-17 | 浙江大学 | 一种从人血液中分离抗体的混合模式层析方法 |
| CN110681362A (zh) * | 2019-09-26 | 2020-01-14 | 浙江大学 | 以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质 |
-
2023
- 2023-07-11 CN CN202310845363.4A patent/CN116693659A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014110246A1 (en) * | 2013-01-09 | 2014-07-17 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Methods for purification of arylsulfatase a |
| CN107033236A (zh) * | 2017-05-05 | 2017-08-11 | 浙江大学 | 一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法 |
| CN110240649A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-09-17 | 浙江大学 | 一种从人血液中分离抗体的混合模式层析方法 |
| CN110681362A (zh) * | 2019-09-26 | 2020-01-14 | 浙江大学 | 以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Champluvier et al. | Dye‐ligand membranes as selective adsorbents for rapid purification of enzymes: A case study | |
| JP4559216B2 (ja) | 液体中の夾雑物からアルブミンを分離する方法、使用及びキット | |
| CN106008664B (zh) | 一种谷胱甘肽的高效分离纯化方法 | |
| JP2756279B2 (ja) | ヒルジンの単離および精製法 | |
| CN116693659A (zh) | 一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法 | |
| CA1228601A (en) | Purification of l-phenylalanine | |
| CN107033236B (zh) | 一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法 | |
| CN109320630B (zh) | 一种新型仿生亲和纯化材料及其在壳聚糖酶纯化中的应用 | |
| CN113121637A (zh) | 一种重组蛋白的分离纯化方法 | |
| CN110681362B (zh) | 以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质 | |
| CN112125950A (zh) | 一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法 | |
| CN110655554B (zh) | 一种提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的蛋白活性肽及其制备方法与应用 | |
| CN1648257A (zh) | 生产柠檬酸和/或柠檬酸盐的方法 | |
| CN116262774A (zh) | 一种重组蛋白纯化方法 | |
| CN112409426A (zh) | 一种硫酸西索米星的制备方法 | |
| Lehman et al. | A novel process for the large-scale purification of recombinant tick anticoagulant peptide using perfusion chromatography | |
| CN112430252B (zh) | 一种提高目标蛋白回收率的层析方法 | |
| CN114660187A (zh) | 一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法 | |
| CN114249793A (zh) | 重组蛋白纯化方法 | |
| CN102286069B (zh) | 一种有机溶剂沉淀分离初步提纯谷胱甘肽发酵液的方法 | |
| CN106749623B (zh) | 一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法 | |
| US5543313A (en) | Process for the separation and recovery of Aspergillus niger acid protease and glucoamylase | |
| WO2022097216A1 (ja) | 組み換えインスリン様成長因子ｉの製造方法 | |
| CN111499682A (zh) | 细胞发酵液的澄清处理方法及抗体的分离纯化方法 | |
| CN116947934A (zh) | 一种二步分离纯化甘油葡糖苷的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |