CN110681362A - 以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质,包括层析基质和配基,层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球,配基为经烯丙基溴活化后偶联的(1H‑吲哚‑3‑羰基)半胱氨酸、(2‑(1H‑吲哚‑3‑基)乙酰基)半胱氨酸、(3‑(1H‑吲哚‑3‑基)丙酰基)半胱氨酸或(4‑(1H‑吲哚‑3‑基)丁酰基)半胱氨酸。本发明的混合模式层析介质具有对人血白蛋白吸附容量大、选择性高、耐盐性好的优点,制备简便,性质稳定,可以用于从分离人血白蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质,属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。
背景技术
人血白蛋白是人血浆中含量最丰富的蛋白质,具有维持血液渗透压、运输内源性和外源性物质、调控血液中的脂肪酸、激素、药物等功能,在临床治疗中有着重要的用途,用于治疗低蛋白血症、失血、创伤、烧伤、脑水肿、肝硬化等。目前临床上使用的人血白蛋白是从血浆中分离而得,存在病原体感染等风险,且国内血浆有限,导致人血白蛋白产品供应紧张。利用基因工程技术生产重组人血白蛋白具有良好的应用前景,但纯度要求极高,分离难度大,成本高。
专利CN1191545报道了采用阳离子交换介质SP Sepharose FF从酵母发酵液中捕获重组人血白蛋白,由于离子交换介质耐盐性差,需要将酵母发酵液稀释至电导率低于5.5mS/cm,导致蛋白浓度低,处理量大,吸附效率降低。专利CN1854155报道了采用高盐阳离子交换层析介质CST-II FF从重组发酵液中捕获人血白蛋白,由于CST-II FF介质吸附选择性低,同时吸附有大量的色素、糖、核酸、宿主细胞蛋白等杂质,需要在洗脱前采用高浓度的NaCl溶液淋洗去除杂质。专利CN102532254和专利CN103880947报道了采用混合模式层析介质Capto MMC从人血白蛋白粗提物中捕获人血白蛋白,由于Capto MMC选择性较低,需要在洗脱前采用1M NaCl溶液淋洗去除杂质。专利CN107033236和文章(Ind.Eng.Chem.Res.,58(8):3238–3248,2019)报道了将溶液pH调至4.0-4.5之后,采用混合模式层析介质MX-Trp-650M分离重组人血白蛋白,得到人血白蛋白纯度约95%。专利CN106749623和文章(Ind.Eng.Chem.Res.,57(3):1039-1047,2018)报道了以色氨酸及其衍生物为功能配基的混合模式吸附剂,采用扩张床吸附直接从酵母发酵液中捕获重组人血白蛋白,得到人血白蛋白纯度约95%。
研发对人血白蛋白吸附容量大、选择性高、耐盐性好的新型层析介质具有重要意义,有助于从发酵液中高效分离重组人血白蛋白,提高分离效率,降低分离成本。针对人血白蛋白的药物结合位点II,设计和筛选了大量配基,通过分子模拟研究,发现羧基和吲哚基是两个最重要的基团,羧基提供静电相互作用,吲哚基提供疏水相互作用,合理调整羧基和吲哚基的分子间距可以提高配基与人血白蛋白的结合自由能。经分子模拟优化设计,获得(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸、(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸、(3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基)半胱氨酸和(4-(1H-吲哚-3-基)丁酰基)半胱氨酸四个混合模式配基,能与位点II稳定结合,结合自由能高,可作为人血白蛋白分离的混合模式配基。
发明内容
本发明的目的是提供一种以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质。
以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质包括层析基质和配基,所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球,所述的配基为经烯丙基溴活化后偶联的(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸、(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸、(3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基)半胱氨酸或(4-(1H-吲哚-3-基)丁酰基)半胱氨酸中的一种。
当配基为(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸时,层析介质的结构组成为:
当配基为(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸时,层析介质的结构组成为:
当配基为(3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基)半胱氨酸时,层析介质的结构组成为:
当配基为(4-(1H-吲哚-3-基)丁酰基)半胱氨酸时,层析介质的结构组成为:
所述的层析介质的结构组成中仅给出了层析基质和一个配基分子结构,仅仅是示例说明,层析基质的表面和内部孔道表面具有大量的配基分子。
所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球,结构式如下:
所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
所述的层析介质的配基密度为50-250μmol/ml。
所述的以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质的制备方法包括如下步骤:
1)活化:取层析基质,抽干,加入0.1-1倍层析基质质量的20%(v/v)二甲基亚砜、0.1-1倍层析基质质量的烯丙基溴和0.05-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠,置于25℃、150rpm的摇床中反应24小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到活化的层析基质;
2)溴代醇化:取活化的层析基质,加入0.1-0.5倍层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺和1.5倍层析基质质量的50%(v/v)丙酮,置于25℃、150rpm的摇床中反应3小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到溴代醇化的层析基质;
3)偶联:取溴代醇化的层析基质,加入0.1-0.3倍层析基质质量的具有羧基和吲哚基的配基和2-6倍层析基质质量的1M碳酸钠溶液,置于25℃、150rpm摇床中反应48小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质。
本发明研制的以羧基和吲哚基为功能基团的新型层析介质,可以用于混合模式层析分离,特别是从酵母发酵液中直接捕获重组人血白蛋白,具有以下优点:(1)人血白蛋白的吸附容量大,处理能力强,静态吸附容量可达160mg/g;(2)人血白蛋白的选择性高,分离效果好;(3)耐盐性好,吸附过程受盐浓度影响小,在NaCl浓度为1M时,吸附容量仍可达到120mg/g,无需对料液进行稀释,可直接从发酵液中捕获重组人血白蛋白;(4)性质稳定,采用烯丙基溴活化并偶联配基,所得介质的配基稳定,清洗再生方便,可重复使用。本发明所研制的新型混合模式层析介质,以羧基和吲哚基为功能基团,羧基提供静电相互作用,吲哚基提供疏水相互作用,合理调节二者的距离,实现羧基和吲哚基的协同作用,具有显著的混合模式吸附蛋白和层析分离特点,对人血白蛋白具有很高的吸附能力和选择性,可以用于重组人血白蛋白的规模化制备。
附图说明
图1是实施例4中的配基为(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸的混合模式层析介质对人血白蛋白的吸附容量分布图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述:
实施例1
取抽干琼脂糖凝胶10g,加入10g 20%(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠,置于25℃、150rpm的摇床中反应24小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到活化的琼脂糖凝胶;取10g活化的琼脂糖凝胶,加入5g N-溴代丁二酰亚胺和15g 50%(v/v)丙酮,置于25℃、150rpm的摇床中反应3小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到溴代醇化的琼脂糖凝胶;取10g溴代醇化的琼脂糖凝胶,加入3g(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸和60g 1M碳酸钠溶液,置于25℃、150rpm摇床中反应48小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到以琼脂糖凝胶为基质、(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸为配基的混合模式层析介质,配基密度为223μmol/ml。
实施例2
取抽干琼脂糖凝胶10g,加入5g 20%(v/v)二甲基亚砜、5g烯丙基溴和2.5g氢氧化钠,置于25℃、150rpm的摇床中反应24小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到活化的琼脂糖凝胶;取10g活化的琼脂糖凝胶,加入2.5g N-溴代丁二酰亚胺和15g 50%(v/v)丙酮,置于25℃、150rpm的摇床中反应3小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到溴代醇化的琼脂糖凝胶;取10g溴代醇化的琼脂糖凝胶,加入1.5g(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸和30g 1M碳酸钠溶液,置于25℃、150rpm摇床中反应48小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到以琼脂糖凝胶为基质、(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸为配基的混合模式层析介质,其配基密度为115μmol/ml。
实施例3
取抽干琼脂糖凝胶10g,加入1g 20%(v/v)二甲基亚砜、1g烯丙基溴和0.5g氢氧化钠,置于25℃、150rpm的摇床中反应24小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到活化的琼脂糖凝胶;取10g活化的琼脂糖凝胶,加入1g N-溴代丁二酰亚胺和15g 50%(v/v)丙酮,置于25℃、150rpm的摇床中反应3小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到溴代醇化的琼脂糖凝胶;取10g溴代醇化的琼脂糖凝胶,加入1g(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸和20g 1M碳酸钠溶液,置于25℃、150rpm摇床中反应48小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到以琼脂糖凝胶为基质、(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸为配基的混合模式层析介质,其配基密度为50μmol/ml。
实施例4
取抽干琼脂糖凝胶10g,加入10g 20%(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠,置于25℃、150rpm的摇床中反应24小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到活化的琼脂糖凝胶;取10g活化的琼脂糖凝胶,加入5g N-溴代丁二酰亚胺和15g 50%(v/v)丙酮,置于25℃、150rpm的摇床中反应3小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到溴代醇化的琼脂糖凝胶;取10g溴代醇化的琼脂糖凝胶,加入3g(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸和60g 1M碳酸钠溶液,置于25℃、150rpm摇床中反应48小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到以琼脂糖凝胶为基质、(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸为配基的混合模式层析介质,其配基密度为205μmol/ml。在不同pH和NaCl浓度下,测定了介质对人血白蛋白的吸附容量,吸附容量分布图见图1。横坐标为pH,纵坐标为NaCl浓度,颜色由浅到深表示吸附容量由低到高,吸附容量单位为mg/g介质。从图1可以发现,在pH为3.0-5.0、NaCl浓度为0-1000mM范围内时,人血白蛋白的吸附容量均大于100mg/g,最高达到160mg/g,吸附容量大;NaCl浓度在0~1000mM范围内,人血白蛋白的吸附容量基本保持不变,说明吸附过程受盐浓度影响小,耐盐性好;当pH大于7.0时,吸附容量显著下降,可以实现人血白蛋白的有效解吸。
实施例5
取抽干琼脂糖凝胶10g,加入10g 20%(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠,置于25℃、150rpm的摇床中反应24小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到活化的琼脂糖凝胶;取10g活化的琼脂糖凝胶,加入5g N-溴代丁二酰亚胺和15g 50%(v/v)丙酮,置于25℃、150rpm的摇床中反应3小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到溴代醇化的琼脂糖凝胶;取10g溴代醇化的琼脂糖凝胶,加入3g(3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基)半胱氨酸和60g 1M碳酸钠溶液,置于25℃、150rpm摇床中反应48小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到以琼脂糖凝胶为基质、(3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基)半胱氨酸为配基的混合模式层析介质,其配基密度为212μmol/ml。
实施例6
取抽干琼脂糖凝胶10g,加入10g 20%(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠,置于25℃、150rpm的摇床中反应24小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到活化的琼脂糖凝胶;取10g活化的琼脂糖凝胶,加入5g N-溴代丁二酰亚胺和15g 50%(v/v)丙酮,置于25℃、150rpm的摇床中反应3小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到溴代醇化的琼脂糖凝胶;取10g溴代醇化的琼脂糖凝胶,加入3g(4-(1H-吲哚-3-基)丁酰基)半胱氨酸和60g 1M碳酸钠溶液,置于25℃、150rpm摇床中反应48小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到以琼脂糖凝胶为基质、(4-(1H-吲哚-3-基)丁酰基)半胱氨酸为配基的混合模式层析介质,其配基密度为230μmol/ml。
实施例7
取抽干纤维素微球10g,加入10g 20%(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠,置于25℃、150rpm的摇床中反应24小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到活化的纤维素微球;取10g活化的纤维素微球,加入5g N-溴代丁二酰亚胺和15g 50%(v/v)丙酮,置于25℃、150rpm的摇床中反应3小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到溴代醇化的纤维素微球;取10g溴代醇化的纤维素微球,加入3g(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸和60g 1M碳酸钠溶液,置于25℃、150rpm摇床中反应48小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到以纤维素微球为基质、以(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸为配基的混合模式层析介质,其配基密度为250μmol/ml。
Claims (4)
1.以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质,其特征在于包括层析基质和配基,所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球,所述的配基为经烯丙基溴活化后偶联的(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸、(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸、(3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基)半胱氨酸或(4-(1H-吲哚-3-基)丁酰基)半胱氨酸中的一种;
当配基为(1H-吲哚-3-羰基)半胱氨酸时,层析介质的结构组成为:
当配基为(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)半胱氨酸时,层析介质的结构组成为:
当配基为(3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基)半胱氨酸时,层析介质的结构组成为:
当配基为(4-(1H-吲哚-3-基)丁酰基)半胱氨酸时,层析介质的结构组成为:
2.根据权利要求1所述的以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质,其特征在于所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。
3.根据权利要求1所述的以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质,其特征在于所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
4.根据权利要求1所述的以羧基和吲哚基为功能基团的混合模式层析介质,其特征在于所述的层析介质的配基密度为50-250μmol/ml。
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CN116693659A (zh) * | 2023-07-11 | 2023-09-05 | 浙江大学 | 一种分离重组人血白蛋白的两步混合模式层析方法 |
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Publication number | Publication date |
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CN110681362B (zh) | 2020-09-11 |
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