JP2007519404A

JP2007519404A - 組換えアリールスルファターゼａの製造及び精製

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Publication number: JP2007519404A
Application number: JP2006549877A
Authority: JP
Inventors: フォー，イエンス; アンデルソン，クラエス; ウェイゲルト，セシリア; モラー，クリスター; ハイデン，ピア
Original assignee: ザイメネックスエイ／エス
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-30
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2025-01-30
Also published as: ZA200606201B; NZ576986A; AU2005209360B2; CA2554883C; NZ548871A; US20140072548A1; JP4586027B2; ES2687671T3; NZ589037A; CA2554883A1; US20080003211A1; EP2532742A1; AU2005209360A1; US9957489B2; US8536315B2; EP1713904A1; EP1713904B1; JP2010059176A; EP2532742B1; WO2005073367A1

Abstract

本発明は、細胞培養系において組換えアリールスルファターゼAを産生する方法に関し、該方法は、rASAを産生可能な哺乳動物細胞を、1又はそれより多いバイオリアクタを含む系において液体培地中で培養し；1またはそれより多いクロマトグラフィの工程を含む精製方法によりrASAを濃縮し、精製し及び調剤することを含む。本発明の別の観点は、インビボでマンノース-6-ホスフェート受容体経路を介して効率的にエンドサイトーシスされるrASAを含む医薬組成物、並びにrhASA医薬及び対象の末梢神経系及び中枢神経系の標的細胞内のガラクトシルスルファチドレベルを減少させる医薬の製造のためのrhASAの使用を提供する。本発明の最後の観点は、治療を必要とする対象を治療する方法を提供し、該方法は、該対象にrhASAを含む医薬組成物を投与し、それにより対象の標的細胞におけるガラクトシルスルファチドレベルの減少を得る。
【選択図】図７

Description

発明の分野
本発明は、組換えアリールスルファターゼA (rASA)酵素の製造及び精製の方法、並びにこの方法により得られたrASAの、異染色性白質ジストロフィーに関連する症状の予防又は緩和のための使用に関する。

発明の背景
ミエリン代謝及び異染色性白質ジストロフィー
異染色性白質ジストロフィー (MLD)は、リソソーム酵素であるアリールスルファターゼA (ASA)における常染色体上の劣性遺伝子異常により引き起こされ、ミエリン鞘の膜の進行性損傷（髄膜脱落）、並びに中枢神経系(CNS)及び末梢神経系の両方の白質でのガラクトシルスルファチド（セレブロシド硫酸）の蓄積をもたらす。組織学標本においては、ガラクトシルスルファチドは、異染性に染色する球形の顆粒状の塊を形成する。ガラクトシルスルファチドは、腎臓、胆嚢及びある他の内臓の内部にも蓄積し、尿中に過剰に排出される。

多種スルファターゼ欠損症(MSD)は、ムコ多糖沈着症(MPS)の特徴をも含むMLDの希な形である。MSDは、既知のスルファターゼ全ての活性の低下を特徴とする。MSDの臨床上の表現型は、硫酸化された糖脂質及びグリコサミノグリカンの損なわれたリソソーム異化作用の結果として、MLDの特徴をMPSの特徴と組み合わせている。

ガラクトシルスルファチドは、通常、リソソーム酵素であるアリールスルファターゼA (EC 3.1.6.8) (Austinら Biochem J. 1964, 93, 15C〜17C)とサポシンBとよばれるスフィンゴ脂質アクチベータタンパク質との組み合わされた作用を介して、3-O-スルフェート結合の加水分解により代謝されて、ガラクトセレブロシドを形成する。アリールスルファターゼAの深在性の欠失は、乳児後期、若年期及び成人の形態のMLDの患者の全ての組織におこる（以下を参照されたい）。以下では、アリールスルファターゼAタンパク質を「ASA」、サポシンBを「Sap-B」とよぶ。ASAの深在性の欠失は、MLDの患者の全ての組織に発生する。

ASAは、ヒトの肝臓、胎盤及び尿を含む種々の起源から精製されている。これは、低い等電点を有する酸性糖タンパク質である。pH 6.5を超えると、酵素は約100 kDaの分子量を有するモノマーとして存在する。ASAは、pH 4.5でダイマーを形成するpH依存性重合を受ける。ヒトの尿において、この酵素は、63及び54 kDaの2つの等しくないサブユニットからなる。ヒトの肝臓、胎盤及び繊維芽細胞から精製されたASAも、55及び64 kDaの間で変化するわずかに異なるサイズの2つのサブユニットからなる。他のリソソーム酵素の場合と同様に、ASAは、グリコシル化された前駆体として膜結合リボソーム上で合成される。次いで、これは小胞体及びゴルジを通過し、ここでそのN-結合オリゴ糖が、複合型のリン酸化及び硫酸化オリゴ糖の形成とともにプロセシングを受ける(Waheed Aら Biochim Biophys Acta. 1985, 847, 53〜61, Braulke Tら Biochem Biophys Res Commun. 1987, 143, 178〜185)。通常の培養繊維芽細胞においては、62 kDaの前駆体ポリペプチドが産生され、これがマンノース-6-ホスフェート受容体結合を介して(Braulke Tら J Biol Chem. 1990, 265, 6650〜6655)酸性プレリソソームエンドソームに移行（translocate）する(Kelly BMら Eur J Cell Biol. 1989, 48, 71〜78)。

ヒトASAシグナルペプチドの長さ（18アミノ酸）は、共通配列及びシグナル配列についての特定のプロセシング部位に基づく。よって、推定ヒトASA cDNA (EMBL GenBank アクセッション番号J04593及びX521151、以下を参照)からは、第18残基(Ala)の後で全ての細胞においてシグナルペプチドの切断が行われて、ヒトASAの成熟形となるはずである。以下において、組換えアリールスルファターゼAをrASAと省略する。ヒトASAの成熟形を含むアリールスルファターゼAの成熟形を「mASA」とよび、成熟組換えヒトASAを「mrhASA」とよぶ。

タンパク質の修飾が、2つの真核生物のスルファターゼ(ASA及びアリールスルファターゼB (ASB))及び緑藻Volvox carteriからの1つにおいて同定されている(Schmidt Bら Cell. 1995, 82, 271〜278, Selmer Tら Eur J Biochem. 1996, 238, 341〜345)。この修飾は、既知のスルファターゼ間で保存されているシステイン残基の2-アミノ-3-オキソプロピオン酸残基への変換を導く(Schmidt Bら Cell. 1995, 82, 271〜278)。新規なアミノ酸誘導体は、Cα-ホルミルグリシン(FGly)としても認識される。MSD細胞由来のASA及びASBにおいて、Cys-69残基は保持されている。よって、Cys-69のFGly-69への変換が、触媒活性なASA及びASBを発生するのに必要とされ、このタンパク質修飾の欠失が、MSDの原因であることが提案されている。Cys-69は、18残基のシグナルペプチドを有する前駆体ASAを参照する。mASAでは、上記のシステイン残基はCys-51である。さらなる研究により、mASAにおいてCys-51を囲んでいる16残基の直鎖配列が変換を起こすのに充分であり、タンパク質修飾は、ポリペプチドがその天然の構造にまだ折りたたまれていないときの小胞体への翻訳と同時のタンパク質移行（co-translational protein translocation）の後期又はその後に起こることが示された(Dierks Tら Proc Natl Acad Sci. 1997, 94, 11963〜1196, Wittke, D.ら (2004), Acta Neuropathol. (Berl.), 108, 261〜271)。

ASAの多数の形が、ヒトの尿、白血球、血小板、培養繊維芽細胞及び肝臓からの酵素調製物の電気泳動及び等電点電気泳動で証明されている。エンドグリコシダーゼH、シアリダーゼ及びアルカリホスファターゼでの処理により、電気泳動パターンの分子サイズ及び複雑度（complexity）が減少し、このことは、ASAの電荷不均質性の多くが、酵素の炭水化物含量における変動によることを示唆する。

MLDの臨床症状
中枢神経系は脳及び脊髄からなり、白質及び灰白質に分けることができる。白質は神経細胞からなり、MLDでは、損傷がまず神経細胞に発生する。神経細胞が損傷を受けると、これらは神経インパルスを筋肉、皮膚及び内臓にもはや伝導できなくなる。

MLDの場合、ミエリン代謝に影響するASAに異常がある。MLDの患者でのこの酵素の欠乏は、ミエリンの分解及び神経細胞の不全を導く。付随して起こる神経細胞における特別の種類の脂肪の蓄積もMLDにおいて観察される。発症の年齢の3つの形態によって、疾患の3つの形態に区別できる：乳児後期、若年期及び成人（20歳より後）。疾患の経過は、異なる種類において変動する。小児早期に起こる種類は最も一般的であり、最も迅速に進行して顕著な身体障害及び死を導く。

MLDの幼児期形態では、疾患のいくつかの段階がある。第一段階は、腕及び脚の筋肉弛緩（緊張低下）を特徴とする。歩行低下かつ小児は歩行に支えを必要とする。病像は、平衡障害（運動失調）及び低下した筋肉反射作用によりしばしば複合化している。発症から約1年〜1年半の第二段階において、小児はもはや起立できないが、まだ座ることができる。以前の筋肉弛緩は痙攣性となる。平衡障害は悪化し、腕及び脚の痛みがよく観察される。疾患は、さらなる3〜6ヶ月後に第三段階に進行し、ここでは小児は全ての四肢の麻痺が増大し、もはや座ることができない。小児は徐々に全てに関して介助が必要となり、視力が低下し、運動が困難になる。

若年型のMLDは、5〜10歳の間に始まる。進行は乳児型と類似するが、より遅い。情動不安定及び視力の低下が、疾患の最初の症状であり得る。成人型のMLDでは、通常の成長後の20歳より後に症状が現れる。症状は、認知及び行動の異常である。

MLDの発生率
ノルウェーでは、毎年約1人のMLDの小児が出生し、すなわち約1:50000の頻度である。同様の結果は北スウェーデンでも得られ、ここではこの個体群での乳児後期MLDの出生時発生率は約40000人当たり1人と算出できる。上記の地域で同じ期間に若年性MLDの対象は1人だけ出生した。このことは、若年型MLDが乳児型よりもかなり希であることを示す。

MDLの動物モデル
ASAノックアウトマウスは疾患を発現し、これはMLDに相当する(Hessら 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14821〜14826, Gieselmann, V.ら 1989 J. Inherit. Metab. Dis., 21, 564〜574, Gieselmann, V.ら 2003, Acta Paediatr. Suppl., 92, 74〜79)。つまり、これらは、患者におけるのと実質的に同じ分布及び超微細構造を有する貯蔵沈着（storage deposits）を示す。マウスは、歩行障害、運動調整能力の低下及び活動亢進を含むヒトの疾患を思い起こさせる神経症状を発現する(Hessら 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14821〜14826, D'Hooge, R.ら 2001, Brain Res., 907, 35〜43, Matzner, U.ら 2002, Gene Ther., 9, 53〜63)。症状は1歳前後で明らかになってくるが、マウスの期待寿命を減少させない。軽度の表現型は、広範にわたる髄鞘脱落の欠失により説明されている(Hessら 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14821〜14826, Coenen, R.ら 2001, Acta Neuropathol. (Berl.)., 101, 491〜498, Wittke, D.ら 2004, Acta Neuropathol. (Berl.), 108, 261〜271)。マウスでの制限された髄鞘脱落は、短い寿命に帰することができ、これは、髄鞘脱落の原因となる細胞不全の発現を許容しない。よって、ASAノックアウトマウスは、特に、ヒト疾患の早期段階での治療介入探索のための適切な動物モデルである。

MLDの現在の診断
MLDを診断するために、髄液、尿の検査、種々の血液検査及びASA活性の分析を行うことができる。MLD患者からの材料（例えば、末梢白血球及び培養皮膚繊維芽細胞）中のASA活性の欠失を調べることができる。MLD患者からの尿の分析は、ミエリン代謝のレベルでの異常を示すことはできるが、尿の酵素レベルは、通常、非常に変動しやすいので、診断アッセイのための源としては信頼性がより低い。尿中に排出される過剰量のスルファチド及び尿沈渣中の異染顆粒が観察される。さらに、頭部の通常のX線及びコンピュータ断層撮影法(CT)を行うことができる。羊水又は絨毛膜絨毛細胞からの培養細胞中のASA活性を測定することにより出生前診断を行うことが可能なようである。このような細胞でのセレブロシド硫酸の含有量（loading）を用いることもでき、この方法は、家族の中に偽欠損症遺伝子も存在する場合には選択肢の一つである。

MLDの現在の治療
MLDの治療のオプションは、比較的少ない。骨髄移植(BMT)は、MLDの患者の20人を超える人の治療において用いられており(例えばBayever Eら Lancet 1985, 2, 471〜473)、BMTは症状の進行を遅くするようであるが、治療の恩恵は数ヶ月間は見られない。ほとんどの乳児後期患者では、診断のときまでに症状が迅速に進行し、恩恵の可能性よりも手順の危険性のほうがより重要である傾向にある。症状の前に（presymtomatically）診断が行われかつよく適合するドナーがいる場合は、BMTは妥当なアプローチであろう。また、報告された結果は、BMTは、高い残存活性を有するMLD患者において、又は疾患の進行の迅速さのために乳児後期型で、症状の前の段階で行われる場合においてのみ効果があることを示唆する。骨髄移植を用いる展望は、それが中枢神経系における症状を低減させるのみでありかつ末梢神経系での症状を緩和するためには補足的な治療が必要であるという事実により、さらに制限される。

細胞培養モデルは、システインプロテアーゼ阻害剤治療(von Figura Kら Am J Hum Genet 1986, 39, 371〜382)、チオ硫酸治療(Eto Yら Biochem Biophys Res Commun 1982, 106, 429〜434)、酵素補充（enzyme replacement）(Porter MT Science 1971, 172 (989),1263〜1265)、及び遺伝子置換療法(Sangalli Aら Hum Gene Ther 1998, 9, 2111〜2119)が効果的であり得ることを示唆する。いくつかの可能な遺伝子治療アプローチが提案されている。

これらのアプローチの一つにおいて、ASA酵素を分泌する、移植されたポリマーカプセル化異種導入細胞系統が用いられている。このアプローチは、筋萎縮性側索硬化症及びパーキンソン病のような他の神経疾患の治療において、以前に用いられている。半透膜に囲まれた約106の遺伝的に改変された細胞を含有するカテーテルを通された（cathetered）装置を脳室空間（ventricular space）に移植することが提案されており、このことは、脳脊髄液中に直接ASAをゆっくりと連続して放出することを提供する。この遺伝子移入技術のために、C2C12マウス筋原細胞が用いられる(Deglonら Hum Gene Ther 1996, 7, 2135〜2146)。半透膜は、細胞の免疫拒絶を防ぎ、細胞と宿主の間の生理的な境界を介在させる。さらに、ASA投与による副作用が起こった場合は、この装置と細胞は取り出す（retrieve）ことができる。

別のアプローチにおいて、ASA遺伝子は、組換えアデノウイルスを用いて脳に直接送達される(Ohashiら Acta Paediatr Jpn. 1996, 38, 193〜201)。組換えアデノウイルス(Adex1SRLacZ)は、乏突起膠細胞を非常に効率よく形質導入できることが示された。遺伝子治療が組織の酵素レベルの満足できる増加を導くという事実にもかかわらず、研究により、腎臓のような重要な組織において、酵素レベルの増加に応答してのスルファチドレベルの著しい減少がないことが明らかになったので、このアプローチでの成功は制限されるようである。この期待はずれの結果は、アリールスルファターゼA のリソソームへの不充分な移行によるのであろう。

アリールスルファターゼAの全身注入に基づく通常の酵素補充療法（Enzyme Replacement Therapy）は、患者にとってほとんど不便でなく合併症の危険性も低い、MLDの経済的な治療を明らかに提供するであろう。遺伝子治療とは反対に、酵素補充療法は、いずれの倫理上の問題もない。しかし、MLDの治療における酵素補充療法の適用は、充分な比活性を有しかつ臨床適用に必要な品質で大量のアリールスルファターゼAを製造することの困難性により、妨げられている。さらに、酵素補充療法は、伝統的に、末梢神経系におけるスルファチドレベルの減少にのみ効果的であると考えられている。なぜなら、アリールスルファターゼは、そのサイズのために、中枢神経系にアクセスしにくいとみられるからである。

発明の要約
本質において、本発明の発明概念は、連続細胞増殖を許容する系で培養された哺乳動物細胞系からの組換えアリールスルファターゼAの単離、及び特定のクロマトグラフィ工程の連続による精製が、発現レベル及び組換えタンパク質の収率の増大、並びに得られるrASAの純度の増大を含むいくつかの重要な利点を示すという発見に基づく。さらに、バッチ培養とは反対に、連続方法での産生は、生産パラメータの厳格なコントロールを促進し得るので、正確な翻訳後修飾及び得られる酵素の機能性を含む高品質で均質な産物を確実にする。このような精製された組換えアリールスルファターゼAは、医薬製剤における使用に適し、血液脳関門を通過しうる形態で産生され得る。

よって、本発明は、細胞培養系における組換えアリールスルファターゼAの連続生産の方法に関係し、該方法は：
i) rASAを産生可能な哺乳動物細胞を、1つ以上のバイオリアクタを含む系において液体培地中で培養し；
ii) アフィニティクロマトグラフィ及び／又はイオン交換クロマトグラフィの1又はそれより多い工程を含む精製方法によりrASAを濃縮し、精製して調剤する（formulating）
ことを含む。

好ましい実施形態において、ii)の濃縮及び精製方法は、以下の工程を含む。
I) タンジェンシャルフローろ過により液体培地中に存在するrASAを濃縮し；
II) 工程Iで得られたrASA含有上清を平衡化したクロマトグラフィカラムにロードして、rASAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出し；
III) 工程IIからのフラクションを別の平衡化したクロマトグラフィカラムにロードして、rASAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出し；
IV) タンジェンシャルフローろ過により工程IIIからのフラクション中に存在するrASAを精製し；
V) 工程IVからのrASAの調製物を、各工程が該調製物を平衡化したクロマトグラフィカラムにロードして、rASAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出することを含む1又は2以上の連続工程において洗練し（polishing）；
VI) 工程Vからのフラクションをウイルス低減フィルタを通過させ；
VII) 適切な調剤バッファー（formulation buffer）中でrASA調製物を得るために工程VIからのフラクションを調剤し；
VIII) 任意に、rASAの調剤された調製物で適切な容器を満たし、試料を凍結乾燥する。

本発明の別の観点は、インビボでマンノース-6-ホスフェート受容体経路を介して効率的にエンドサイトーシスされるrASAを含む医薬組成物、並びに医薬用のrASA及び対象の末梢神経系及び／又は中枢神経系における標的細胞内のガラクトシルスルファチドのレベルを低減するための医薬を製造するためのrASAの使用を提供する。

本発明の最後の観点は、治療を必要とする対象の治療方法を提供し、該方法は、該対象にrASAを含有する医薬組成物を投与することにより、対象の標的細胞でのガラクトシルスルファチドのレベルの減少を得ることを含む。

発明の詳細な説明
本明細書において、「酵素」の用語は、そのものの代わりになる関係する酵素又はその酵素的に等価な一部分若しくはアナログのいずれかを意味する。酵素の酵素的に等価な一部分の例は、酵素のドメイン又はサブシーケンスであり得、これは該ドメイン又はサブシーケンスが全長酵素と実質的に同じ酵素活性を発揮することを可能にするのに必要な触媒部位を含む。

酵素の酵素的に等価なアナログの例は、機能的な形で酵素の触媒部位を含む融合タンパク質であり得るが、別の種に由来する酵素の相同な変異型でもあり得る。また、関係する酵素の比酵素活性を模倣する完全に合成の分子も「酵素的に等価なアナログ」を構成する。

「汚染物質」は、所望のポリペプチド物質とは異なる物質である。汚染物質は、所望のポリペプチドの変異型（例えば所望のポリペプチドの脱アミノ化変異型又はアミノ−アスパルテート変異型）又は別のポリペプチド、核酸、エンドトキシンなどであり得る。

ポリペプチドと1種又はそれより多い汚染物質とを含む組成物からポリペプチドを「精製する」とは、組成物から少なくとも1種の汚染物質を除去する（完全又は部分的に）ことにより、組成物中のポリペプチドの純度を増加させることを意味する。「精製工程」は、興味対象のポリペプチドを、組成物の全重量に基づいて少なくとも約20重量%、好ましくは少なくとも約30重量%含む組成物をもたらす全体の精製方法の一部分であり得る。

「治療」とは、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方のことをいう。治療が必要なものとは、疾患をすでに有するもの及び疾患を予防しようとするものを含む。

本発明は、MLDの治療のストラテジに関し、それによると、組換えアリールスルファターゼA (rASA)が、関係する標的細胞に到達するために、例えば全身投与により対象に投与される。脳内の基本的に全ての細胞がASAを欠失しているので、特に興味のある細胞の種類は、中枢神経系内のニューロンの髄鞘形成の原因である乏突起神経膠細胞又は乏突起神経膠及び神経細胞である。末梢神経系(PNF)の髄鞘形成の原因であるシュヴァン細胞は、中枢神経系外での主要な標的細胞の一つである(BBB)。

rASA酵素のいくつかの異なる送達方法を、BBB及び／又は細胞膜を介したその輸送を促進するために適用することが、以前に提案されている。このような方法の例を、次の段落に簡単に記載する。
1) rASAが哺乳動物細胞系で発現されるときに、ゴルジ体でホスホトランスフェラーゼ及びホスホグリコシダーゼの組み合わせた作用による翻訳後修飾として産生されるマンノース-6-ホスフェートタグの使用。タグをつけた種の酵素は、マンノース-6-ホスフェート受容体取り込みを介して細胞膜を横切る能力を有する。

2) 細胞膜及び／又はBBBを超えての通過による標的細胞へのrASAの通過のためのビヒクルとしてのペプチド及びタンパク質：
動物でのいくつかの初期の研究は、あるタンパク質及び／又はペプチドがBBBの通過のためにビヒクルとして作用し得ることを示している。例えば、インシュリンフラグメントで修飾されたタンパク質(Fukutaら Phaomacol Res 11: 1681〜1688)又はトランスフェリン受容体への抗体(Fridenら Proc Natl Acad Sci USA 88: 4771〜4775)は、血液脳関門を通過し得る。また、ポリアミンへの結合により修飾されたタンパク質(Poduslo及びCurran. J Neurochem 66: 1599〜1606)は、血液脳関門を通過すると報告されている。

本発明に特に関係するものとしては、膜破壊（membrane-disrupting）又はタンパク質導入（protein-transducing）ドメインであり、ここで焦点は、長さ10〜30残基の短いペプチドである。タンパク質分子に共有結合されている場合、これらのペプチドは、一般に、血液脳関門を横切って、また細胞膜を横切って分子を輸送することができる(Schwarzeら,Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290〜295; Lindgrenら, Trends Pharmacol. Sci. 2000; 21(3): 99〜103)。このようなペプチド配列を含有する修飾rASA分子は、発現技術を用いてつくることができる。タンパク質形質導入プロセスは、細胞種特異的ではなく、それが起こる機構も完全に明らかにされていないが、受容体に依存しないある種の膜の混乱及び透過プロセスにより起こると考えられている。分子の部分的に折りたたまれていない状態は、該プロセスを促進し得るが、必須ではない。

タンパク質導入ドメインは、一般的に、ウイルス又は他の非ヒトタンパク質分子に由来する（かつ免疫原性になる可能性を有する）。このようなドメインの例は、次を含む：
HIV TATタンパク質からの11残基の塩基性ペプチド−YGRKKRRQRRR (Schwarzeら,Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290〜295)。このペプチドは、細胞外マトリックス関連ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)に結合し、細胞膜を横切って広範囲の大きい分子及び小さい分子を輸送する。最初の侵入は小胞性であり、導入された分子は外部の濃度が減少したときに細胞外に戻る。ペプチドは、アミノ酸残基の逆の順序であってさえも、分子が曝露される限りは、分子内のどこにでも存在し得る。ヒトは全て、IgMアイソタイプであるTATのこの塩基性ドメインに対する低い力価の内生的な抗体を有する(Schwarzeら, Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290〜295)。

該配列により高いαへリックス性及び両親媒性を与える合成された種類のTAT−YARAAARQARA (Hoら, Cancer Res. 2001; 61(2):474〜477)。このペプチドは、TATよりもかなり効率的であり、インビボで文書に記録された効果をも有する。このペプチドは、天然のTAT配列の場合と同様に古典的な核局在シグナルを有さず、異なる免疫エピトープを提示する。

他のアミノ酸との組み合わせでのポリ−R又は塩基性−R及び−K残基の混合物で構成される合成リーダーペプチド。

ベータ−3インテグリン又はカポジ肉腫FGFのいずれかからの疎水性シグナル配列部分に基づくペプチド(Dunicanら Biopolymers 2001; 60(1): 45〜60)。これらは膜透過性配列とよばれ、塩基性配列よりもむしろ疎水性である。これらはヒトタンパク質由来であるので、これらの免疫原的潜在性は低いであろう。

他のタグは、キャリア媒介輸送により関係する標的細胞内へ酵素を指向させる能力を有するであろう。これらのタグは、特定の受容体についてのアフィニティを有するペプチド又はタンパク質あるいはペプチド又はタンパク質の機能的部分であり得る。このような受容体の例は、神経生長因子(NGF)又は脳由来神経向性因子(BDNF)の受容体であり得る。

BBBを横切るタンパク質のより効率的な輸送を確実にする一つの方法は、特異的輸送系を用いることである。このような系の例は、トランスフェリン及びメラノトランスフェリンをBBBを横切って輸送するように通常は機能するトランスフェリン受容体である(Rothenbergerら, Brain Res. 1996, 712, 117〜21; Demeuleら, J Neurochem 2002, 83, 924〜33)。rASAに結合する場合、該受容体についてのアフィニティを有する全長又は合成タンパク質若しくはペプチドは、血液脳関門を越えて修飾rASAを「引っぱる」。代わりのアプローチは、p55及びp75受容体によるTNF-αの輸送を例とする、血液脳関門を越えての特異的サイトカインの受容体媒介輸送の使用である(Panら, Exp Neurol. 2002 Apr;174(2):193〜200; Panら, Arch Physiol Biochem. 2001 Oct;109(4):350〜353)。

3) 細胞膜及び／又はBBBを越えての通過による標的細胞へのrASAの通過のためのビヒクルとしてのトキシン：
種々の細菌、植物及び動物はトキシンを産生する。トキシンは、腸（エンテロトキシン）、神経又はシナプス（ニューロトキシン）のような多くの異なる標的を有する。トキシンは、受容体媒介プロセスを介して細胞膜を横切ることができ、本発明の実施形態は、細胞膜及び／又はBBBを越えての標的細胞へのrASAの通過のためのビヒクルとしてのトキシンの使用である。異染色性白質ジストロフィー(MLD)の治療における療法の送達のためのトキシンの使用は、特に適切である。なぜなら、トキシンの好ましい標的細胞は、中枢神経系及び／又は末梢神経系の細胞だからである。実際上の考察及び安全面の理由から、トキシンの細胞膜及び／又はBBBを越えての移行に関係するアミノ酸ペプチドのみが用いられる。

Corynebacterium Diptheriaeからのジフテリアトキシン(DT)は、ビヒクルとして用いうるトキシンのよい例である。細菌トキシンは、広範囲の毒性を示し、構造及び機能により、群の中に入る。トキシンは標的細胞に結合して受容体を介して細胞内に進入し、還元されてフラグメントを分離する。プロセシングを受けたトキシンは、次の3つのドメインに分けられる：触媒ドメイン(C)、受容体ドメイン(R)及び移行ドメイン(T)である。

本発明の主な観点は、組換えアリールスルファターゼA又はその酵素的に等価な一部分若しくはアナログの産生及び精製の方法に関し、これはMLD及び／又はこの疾患に関係する症状の予防又は治療に用いることができる。しかし、このストラテジの成功は、高純度で均一な品質のrASAの調製物を入手可能とすることに大きく依存する。よって、ガラクトシルスルファチドのガラクトセレブロシドへの細胞内代謝において触媒として作用でき、それにより、MLDの特徴の1つである欠損rASAを補充するrASAの品質を提供することも本発明の観点の範囲内である。さらなる観点において、血液脳関門を横切ることができるアリールスルファターゼAの組換え型、及び脳内の標的細胞中への侵入のための特異的タグを有するrASAの形を提供することも本発明の範囲内である。しかし、本発明の好ましい実施形態は、酵素がその標的細胞内へマンノース-6-ホスフェート受容体媒介侵入により侵入することを許容する、マンノース-6-ホスフェートのタグのパターンを有するrASAの産生及び精製である。特に、本発明の目的は、マンノース-6-ホスフェート経路を介してインビボで効率的にエンドサイトーシスされるrASAを提供することである。

成熟ヒトASAは、3つの推定N-グリコシル化部位、すなわちAsn158、Asn184及びAsn 350を有し、これらはマンノース-6-Pタグを形成できる。Asn158、Asn184及びAsn350は、18残基のシグナルペプチドを有する前駆体ASAを参照する。成熟ASAにおいて、上記のアスパラギン残基は、それぞれAsn140、Asn166及びAsn332である。N-グリコシル化部位の2つ(Asn140及びAsn332)のみがリン酸化を受け、2つの別々の酵素的工程を経て、これら2つの部位で正しいマンノース-6-Pタグ及びマンノース-6-P合成を獲得できる。

グリコシル化されたポリペプチドの発現用の適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株及び変異体並びにSpodoptera frugiperda (イモムシ)、Aedes aegypti (カ)、Aedes albopictus (カ)、Drosophila melanogaster (ショウジョウバエ)及びBombyx moriのような宿主からの対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用の種々のウイルス株、例えばAutographa californica NPVのL-1変異体及びBombyx mori NPVのBm-5株が公共で利用可能であり、このようなウイルスは、本発明による本明細書においてウイルスとして、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクション用に用いることができる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養も宿主として用いることができる。

しかし、脊椎動物細胞に対する興味が最大であり、脊椎動物細胞の培養での増殖（組織培養）は、日常的な手法になってきている。有用な哺乳動物宿主細胞系統の例は、SV40 (COS-7)で形質転換されたサル腎臓CVI系統；ヒト胚性腎臓系統(293細胞又は浮遊培養での増殖のためにサブクローニングされた293細胞)；ベビーハムスター腎細胞(BHK)；チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR (CHO)；マウスセルトリ細胞(TM4)；マウス腎細胞(CV I)；アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76)；ヒト子宮頸癌腫細胞(HELA)；イヌ腎細胞(MDCK)；バッファローラット肝細胞(BRL 3A)；ヒト肺細胞(W138)；ヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065)；マウス乳腺癌(MMT 060562)；TRI細胞；MRC 5細胞；FS4細胞；及びヒト肝癌系統(Hep G2)である。

本発明は、連続細胞培養系においてrASAを製造する方法を提供し、該方法は：
i) rASAを産生可能な哺乳動物細胞を液体培地中で1つ以上のバイオリアクタを含む系において培養し；
ii) アフィニティクロマトグラフィ及び／又はイオン交換クロマトグラフィの1以上の工程を含む精製方法によりrASAを濃縮し、精製して調剤する
ことを含む。

より具体的には、該方法は、培養系でrASAを合成可能な哺乳動物細胞系統の増殖を含み、これは連続細胞増殖及び一連のクロマトグラフィ工程での得られるrASAのその後の抽出及び精製を許容する。簡単な概略として表すと、rASAの産生及び精製の方法は、次の一般的な工程の1つまたはそれより多くを含み得る。
A. 連続細胞増殖を許容する細胞培養系でのrASAを産生可能な哺乳動物細胞の培養。
B. 上清からのrASAの濃縮、及びサイズによるタンパク質の分離に基づくろ過工程を補充した一連のクロマトグラフィ工程によるrASAの精製（ここで、タンパク質はそれらの正味電荷又はリガンドへのアフィニティにより分離される）。
C. 調剤、充填及び凍結乾燥。
延長した期間にわたる細胞培養の増殖を許容する細胞培養系におけるrASAの

細胞が：
(a) 配列番号2のアミノ酸配列；
(b) 組換えヒトアリールスルファターゼAと酵素的に等価な(a)の配列の一部分；
(c) (a)又は(b)の配列のいずれか1つと少なくとも75%の配列同一性を有しかつ同時に組換えヒトアリールスルファターゼAと酵素的に等価なアミノ酸配列を含むアミノ酸配列アナログ
をコードする核酸配列を含むのが好ましい。

本発明の関係において、アミノ酸配列又はアミノ酸配列の一部分は、本出願の実施例1に記載されるようなアリールスルファターゼA活性の測定アッセイにおいて測定されるときに、アリールスルファターゼAの基質pNCSのある量を37℃で少なくとも20 U/mg-ポリペプチド（好ましくは50 U/mg-ポリペプチド）の比活性に相当する速度で加水分解できるポリペプチドであるか、及び／又は本発明の実施例2に記載されるようなアッセイにおいて25 mU/mlの用量レベルでインキュベーションすることによりアッセイしたときに、MLD繊維芽細胞にロードした標識されたアリールスルファターゼA基質 fx. ¹⁴Cパルミトイルスルファチドの少なくとも40%を加水分解できるポリペプチドである。

同様に好ましいのは、
(a) 配列番号1の核酸配列；
(b) 組換えヒトアリールスルファターゼAと酵素的に等価なアミノ酸配列をコードする(a)の配列の一部分；
(c) (a)又は(b)の配列のいずれか1つと少なくとも75%の配列同一性を有しかつ同時に組換えヒトアリールスルファターゼAを酵素的に等価なアミノ酸配列をコードする核酸配列アナログ
を含む細胞を組み込んだ方法である。

本発明による細胞に含まれる核酸配列と配列番号1との配列同一性の程度は、少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%が好ましい。上記の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と配列番号2との配列同一性の程度は、同様に、少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%が好ましい。

本発明の目的のために、アリールスルファターゼAは組換え酵素が好ましく、特に好ましくは組換えヒトアリールスルファターゼA (rhASA)である。
rASAは、哺乳動物細胞又は細胞系統において産生されるのが好ましく、該哺乳動物細胞又は細胞系統は、マンノース-6-ホスフェート受容体経路を介してインビボで効率的にエンドサイトーシスされるrASAのグリコフォームを産生するのが好ましい。具体的には、rASAの好ましいグリコフォームは、曝露されたマンノース-6-ホスフェートのある量を含み、これは、マンノース-6-ホスフェート経路を介してインビボでrASAの効率的なエンドサイトーシスを許容する。

CHO、COS及びBHK細胞のいずれかでのrASAの発現が、分子上への正しいマンノース-6-ホスフェートのタグ付けを確実にし、このことが効率的な受容体媒介取り込みを確実にすることが以前に考えられていた(Steinら J Biol Chem.1989, 264, 1252〜1259)。このことはインビトロでのエンドサイトーシスには正しいようであるけれども、本発明者らは、BHK及びCOS細胞で産生されたrASAのインビボでのエンドサイトーシスに比べると、CHO細胞で産生されたrASAのインビボでのエンドサイトーシスが著しく増大することを観察している。酵素の効率的なエンドサイトーシスは、体の末梢神経系及び内臓でのスルファチドレベルの所望の修正を得るために欠くことができない。よって、rASAの産生されたグリコフォームの少なくとも1つは、CHO細胞で産生されたグリコフォームに類似することが好ましい。

本発明者らは、酵素の正しい翻訳後プロセシングを確実にするために、産生が最適化されなければならないことをさらに観察している。特に、高すぎる速度及び強度（intensity）での酵素の産生は、グリコシル化、リン酸化及びホルミル化の点で最適以下の品質の産物を導く。よって、アリールスルファターゼA又はその等価物の産生は、低い濃度のPNGアーゼFでの処理後に、MALDI-TOF分析で測定されるして、4つのグリコシル化された中間体を有する酵素のグリコフォームを含む産物をもたらす速度及び条件下で行われることがさらに好ましい。さらに好ましくは、アリールスルファターゼA又はその等価物の獲得された炭化水素部分が、3〜8 kDaの複合質量（combined mass）を有する条件下が好ましい。アリールスルファターゼA又はその等価物の産生が、マンノース-6-ホスフェート受容体媒介侵入を介する酵素の効率的なエンドサイトーシスを許容するようにリン酸化される、高マンノース及び／又は複合オリゴ糖のパターンを有する酵素のグリコフォームを含む産物をもたらす速度及び条件下で行われるのも好ましい。

説明したように、成熟ヒトアリールスルファターゼAの51位でのシステイン残基の翻訳後修飾は、酵素の活性に重要である。よって、本発明の好ましい実施形態において、アリールスルファターゼA又はその等価物の産生は、配列番号2のCys-69に相当するアミノ酸が配列番号3のFgly-51に相当するホルミルグリシンに変換されている酵素のアイソフォームを含む産物をもたらす速度及び条件下で行われる。配列番号4は、18アミノ酸のシグナルペプチドの切断後であるがC-51の修飾の前の成熟ヒトアリールスルファターゼAを表す。

よって、この実施形態は、産生されるアリールスルファターゼA又はその酵素的等価物が：
(a) 配列番号3のアミノ酸配列；
(b) 組換えヒトアリールスルファターゼAと酵素的に等価な(a)の配列の一部分；
(c) (a)又は(b)の配列のいずれか1つと少なくとも75%の配列同一性を有しかつ同時に組換えヒトアリールスルファターゼAと酵素的に等価であるアミノ酸配列アナログ
からなる群より選択される方法に関係する。

本発明により産生される酵素と配列番号3又は配列番号4との配列同一性の程度は、少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%が好ましい。

用語「配列同一性」は、等しい長さの2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列間の相同性の程度の定量的尺度を示す。比較されるべき2つの配列が等しい長さでない場合は、ギャップの挿入あるいはポリペプチド配列又はヌクレオチド配列の末端で短縮を許容して、最良の可能な適合を与えるように整列されなければならない。配列の同一性は、
（式中、N_difは、整列したときの2つの配列における非同一残基の総数であり、N_refは、配列のうちの一つでの残基の数である）として算出できる。よって、DNA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCと75%の配列同一性を有する(N_dif=2及びN_ref=8)。ギャップは、非同一の具体的な残基として数えられ、すなわちDNA配列AGTGTCは、DNA配列AGTCAGTCと75%の配列同一性を有する(N_dif=2及びN_ref=8)。

本発明のポリペプチド又はアミノ酸に基づく全ての実施形態において、1又はそれより多い配列間の配列同一性のパーセンテージは、プログラムのデフォルト設定を用いるclustalWソフトウェア(http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html)により行われるそれぞれの配列のアラインメントに基づく。これらの設定は、次のとおりである：Alignment=3Dfull, Gap Open 10.00, Gap Ext. 0.20, Gap separation Dist. 4, Protein weight matrix: Gonnet。本発明のヌクレオチドに基づく実施形態については、1又はそれより多い配列間の配列同一性のパーセンテージも、デフォルト設定を用いるclustalWソフトウェアを用いるアラインメントに基づく。ヌクレオチド配列アラインメントについて、これらの設定は：Alignment=3Dfull, Gap Open 10.00, Gap Ext. 0.20, Gap separation Dist. 4, DNA weight matrix: identity (IUB)である。

インビボでの酵素の生物学的活性及び効果は、充分な量の酵素が上記のようなグリコシル化パターンを獲得しかつ51位で翻訳後に修飾されていることを必要とする。よって、産生される酵素の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%又は98%が上記のグリコフォーム／アイソフォームであることが重要である。

本発明による方法で用いられる哺乳動物細胞は、ヒト又は霊長類起源であることが好ましい。現在最も好ましい実施形態において、哺乳動物細胞はCHO細胞であり、これらの細胞はCHO-DG44細胞であることがさらに好ましい。別の好ましい実施形態においては、ヒト細胞系統が用いられる。

本発明の好ましい実施形態において、rASAの産生（roduction）に用いられる細胞は、配列番号2によるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。さらに好ましい実施形態において、rASAは配列番号1によりコードされる。

本発明による方法において、上記の系ではrASAが培地中に分泌されるので、タンパク質精製は単純化される。
細胞培養系は、新鮮な培地の源及び細胞を回収しかつ培地を収集できる系に接続された1つ又はそれより多い通常のバイオリアクタに基づく。この系の一部分は、細胞保持機構（cell retention device）であり得る。好ましくは、この系のこれらの異なる部分は、新鮮な培地が添加されかつ細胞から分泌された1種又はそれより多い生合成産物と共に細胞を含有する培地が連続ベースで収集され得る様式で相互に連結されている。マンノース-6-ホスフェートタグ付加mASAは培地中に分泌され、任意に、rASAの精製は、培養工程においてアンモニウム塩(NH₄Cl)を使用することにより促進される。

バッチ系に比較したこの系の直接の利点の一つは、より長時間にわたって効率的な産生段階を許容することである。よって、1週間、好ましくは2週間、より好ましくは3週間、さらにより好ましくは4週間にわたる期間において連続的に系を操作することは、本発明の範囲内である。細胞は37℃で増殖できるが、系の生産性を増加させるために、産生段階のプラトーに達するときは33〜35℃の温度に低下させることが好ましい。

本発明のある好ましい実施形態において、この系は、1 Lの容量のバイオリアクタの使用に基づく。あるいは、5Lの容量のバイオリアクタ又は約4 Lの培地を保持できるバイオリアクタが好ましい。しかしながら、この系は、より大きい容積を有するrASAの産生及びそれにより製薬工業において必要とされるような大規模生産へのスケールアップのベースとしても意図することが理解できる。本発明の別の好ましい実施形態は、10L、より好ましくは50L、200L、1000Lの容積を有するバイオリアクタ又は醗酵槽である。現時点では、100 L、400 L、又は700 Lのバイオリアクタの容量が好ましい。産生段階が少なくとも2週間にわたることがさらに好ましく、さらに、1〜2又は4までのリアクタ容量の細胞培養物が各日に回収される方法が考えられる。

好ましい実施形態において、本発明による方法は、細胞保持機構及び再循環ループを備えた1つ又はそれより多いバイオリアクタを用いて行われる。

本発明のポリペプチドを産生するのに用いられる細胞系統は、種々の培地中で培養できる。市販の培地、例えばHam's F 10 (Sigma)、最小必須培地((MEM)、Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及びダルベッコ変法イーグル培地((DMEM)、Sigma)が、宿主細胞の培養に適する。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又はその他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン又は上皮成長因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩）、緩衝剤（例えばHEPES）、核酸（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン）、微量要素（マイクロモル濃度の範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要により補充することができる。その他の必要な補充物を、当業者に公知であろう適切な濃度で含有することもできる。温度、pHなどの培養条件は、酵素の発現用に選択された、細胞系統に以前に用いられたものであり、当業者には明らかである。

しかし、培養培地中の望まれないタンパク質のレベルをコントロールするために、分子量が10 kDa未満の組換えヒトタンパク質のみを含有する血清フリー培地中で細胞を培養するために系が開発されることが好ましい。全タンパク質濃度は、10 mg/ml未満から100 ug/ml未満、例えば1 mg/ml未満である。本発明の好ましい実施形態において、細胞系統は、インシュリン様成長因子-1 (IGF-1)を補った血清フリーExcell 302培地中で培養される。

精製方法用の原料は、細胞粗抽出物であり得るが、rASAは細胞により分泌されかつその後細胞培養上清から精製されるのが好ましい。精製方法は、限定されないが以下の一般的な工程を含み得る。
1) 濃縮及びダイアフィルトレーション工程、
2) 捕捉工程（イオン交換クロマトグラフィ）、
3) 中間体精製工程（クロマトグラフィ）、
4) 酸性ろ過（acidic filtration）、
5) 洗練（クロマトグラフィ）、
6) ウイルス除去、
7) 調剤
8) 充填及び凍結乾燥。

さらに、1又はそれより多いバッファー交換工程を組み入れることができ、任意に、濃縮及びダイアフィルトレーション工程を省略できる。これは、上記の工程ii)の濃縮及び精製方法が膨張層クロマトグラフィ（Expanded Bed Chromatography）の1又はそれより多い工程を含む場合に特に適する。好ましくは、膨張層クロマトグラフィ工程は、捕捉工程として行われる。

さらに、(ii)の濃縮及び精製方法は、アリールスルファターゼAがアフィニティクロマトグラフィ樹脂若しくはメンブレン及び／又はカチオンクロマトグラフィ樹脂若しくはメンブレンを通過する受動工程（passive step）と、アリールスルファターゼAがアニオン交換メンブレン又は樹脂の内部にとどまりかつその後そこから溶出される能動工程（active step）とを含む洗練工程を含むことが好ましい。受動及び能動工程のこの組み合わせは、ほとんどの汚染タンパク質はアニオン交換マトリックスに5.8未満のpH値、好ましくは5.5〜5.7付近のpH値で結合するが、アリールスルファターゼAはカチオン交換マトリックスを通過しかつその後アニオン交換樹脂に結合するという驚くべき発見から示唆される。5.8未満のpH値での酵素のダイマーからオクタマーへの構造変化が、この驚くべき効果の原因であると考えられる。この構造変化は、該酵素がリソソームにおいて低pHで活性であるので、生理的に適切である。

本発明の実施形態において、上記の工程ii)の濃縮及び精製方法は、次の工程を含む。
I) タンジェンシャルフローろ過により液体培地中に存在するrASAを濃縮し；
II) 工程Iで得られたrASA含有上清を平衡化したクロマトグラフィカラムにロードして、rASAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出し；
III) 工程IIからのフラクションを別の平衡化したクロマトグラフィカラムにロードして、rASAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出し；
IV) タンジェンシャルフローろ過により工程IIIからのフラクションに存在するrASAを精製し；
V) 工程IVからのrASAの調製物を、各工程が該調製物を平衡化したクロマトグラフィカラムにロードして、rASAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出することを含む1又は2以上の連続工程において洗練し；
VI) 工程Vからのフラクションをウイルス低減フィルタに通過させ；
VII) 適切な調剤バッファーでrhASAの調製物を得るために工程VIからのフラクションを調剤し；
VIII) 任意に、rASAの調剤された調製物を適切な容器に充填し、試料を凍結乾燥する。

上記に概説した精製方法の全般的かつ具体的な工程の全てを行う必要はないであろうことが考えられる。例えば、医薬用に適する最終産物を提供することが目的でなければ、調剤工程並びに充填及び凍結乾燥を省略することができる。

上記のように、上記に概説した方法の工程Iを省略できる。よって、ii)の濃縮及び精製方法が以下の工程を含むのが好ましい。
II) アリールスルファターゼA含有上清を平衡化したクロマトグラフィカラムと接触させ、アリールスルファターゼAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出し；
III) 工程IIからのフラクションを別の平衡化したクロマトグラフィカラムにロードして、アリールスルファターゼAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出し；
IV) タンジェンシャルフローろ過により工程IIIからのフラクションに存在するアリールスルファターゼAのバッファー交換を行い；
V) 工程IVからのアリールスルファターゼAの調製物を、各工程が該調製物を平衡化したクロマトグラフィカラムにロードして、アリールスルファターゼAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出することを含む1又は2以上の連続工程において洗練し；
VI) 工程Vからのフラクションをウイルス低減フィルタに通過させ；
VII) 適切な調剤バッファーでアリールスルファターゼAの調製物を得るために工程VIからのフラクションを調剤し；
VIII) 任意に、アリールスルファターゼAの調剤された調製物を適切な容器に充填し、試料を凍結乾燥する。

該方法の工程I)において、材料中のrASAの濃度は、その後の精製手順の工程のクロマトグラフィカラムにロードするのに便利なように充分小さい容量中のrASAの溶液を得る目的とともに増加する。好ましくは、rASAは、容量で5〜50倍、より好ましくは10〜20倍に、タンジェンシャルフローろ過により濃縮される。種々の名目上の（nominal）重量カットオフを有する種々の異なるメンブレンを用い得ることは、当業者には明らかである。名目上の重量カットオフは、よって、10〜100 kDaの範囲であり得るが、本発明においては30 KDaのメンブレンを用いるのが好ましい。

工程I)のさらなる部分は、rASA含有溶液のダイアフィルトレーションを含み、これはその後のクロマトグラフィ工程においてローディングバッファーとして適切なバッファー中のrASA溶液を得るために行われる。ダイアフィルトレーションは、市販の装置を用いて当業者に公知の標準的な手順に従って行われる。

好ましい実施形態において、この方法の工程IIは、アニオン交換クロマトグラフィに基づく。アニオン樹脂は、正味の正電荷を有するタンパク質と一般的に結合する。負に荷電したか又は中性のタンパク質はマトリックスを通過し、正に荷電したタンパク質（種々の荷電の程度）は、系の対イオン電荷を塩を用いて徐々に（直線的に又は段階的な直線的に）変化させることにより区別して溶出できる。

当業者に知られているように、イオン交換体は、マトリックス及び結合している荷電基に関して種々の材料に基づくことができる。例えば、次のマトリックスを用いることができ、記載される材料は多少架橋されていてもよい：アガロースベース（例えばSepharose CL-6B（登録商標）、Sepharose Fast Flow（登録商標）及びSepharose High Performance（登録商標））、セルロースベース（例えばDEAE Sephacel（登録商標））、デキストランベース（例えばSephadex（登録商標））、シリカベース及び合成ポリマーベース。アニオン交換樹脂について、マトリックスに共有結合している荷電基は、例えばジエチルアミノエチル(DEAE)、四級アミノエチル(QAE)及び／又は四級アンモニウム(Q)であり得る。本発明の方法の好ましい実施形態において、用いられるアニオン交換樹脂は、DEAE Sepharoseカラムであり、より具体的には、DEAE Sepharose Fast Flow（登録商標）又はDEAE Streamalineカラムであり得るが、その他のアニオン交換体も用いることができる。

イオン交換樹脂は、既知の方法に従って準備される。多くの場合、樹脂がその対イオンに結合するのを許容する平衡化バッファーを、ポリペプチド及び1種又はそれより多い汚染物質を含む組成物を樹脂にロードする前に、イオン交換樹脂に通過させる。簡便には、平衡化バッファーはローディングバッファーと同じであるが、このことは必須ではない。

rASA及び汚染物質を含む水溶液は、ポリペプチド及び汚染物質がアニオン交換樹脂に結合するような塩濃度及び／又はpHを有するローディングバッファーを用いて、アニオン樹脂にロードされる。樹脂は、1カラム容量又はそれより多いローディングバッファー、続いて塩濃度を増加させた1カラム容量又はそれより多い洗浄バッファーを用いて洗浄される。最後に、rASAは、塩濃度をさらに増加させることにより溶出される。任意に、酵素の溶出は、徐々に又は段階的にpHを低下させることにより媒介してもよい。rASA活性を有するフラクションを収集してさらなる精製のために一緒にする。

ローディング、洗浄及び溶出工程において多数の異なるバッファーを用い得ることは、当業者には明らかである。本発明の好ましい実施形態において、5〜100 mM Tris-HCl、pH 7.0〜8.0を含むローディングバッファー（以下、「標準バッファー」という）を用いる。あるいは、10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5のようなリン酸ナトリウムバッファーを標準バッファーとして精製方法の間じゅう用いることができる。なぜなら、これは、マンノース-6-ホスフェートのリン酸基を切り離し得るいずれの残存ホスファターゼを阻害するからである。NaCl濃度は、洗浄及び溶出工程においてそれぞれ0.05〜0.15 M及び0.2〜0.4 Mに増加させる。

本発明の任意の実施形態において、イオン交換樹脂は、カラムを再利用できるように、ポリペプチドの溶出後に再生バッファーを用いて再生させる。一般に、再生バッファーの塩濃度及び／又はpHは、イオン交換樹脂から実質的に全ての汚染物質及び興味対象のポリペプチドが溶出されるようなものである。一般に、再生バッファーは、イオン交換樹脂から汚染物質及びポリペプチドを溶出させるために非常に高い塩濃度を有する。

精製方法の工程IIIは、好ましくは疎水的相互作用クロマトグラフィ(HIC)であるさらなるクロマトグラフィ工程を含む。HICは、極性又は非極性環境についての所定の分子の誘引（attraction）を利用しており、この傾向は、タンパク質に関しては、タンパク質の露出されている外表面の残基の疎水性又は親水性により支配される。よって、タンパク質は、疎水性マトリックス、典型的には鎖長が2〜18炭素のアルキルリンカーの腕を有する不活性支持体へのそれらの種々の誘引の程度に基づいて分画される。固定相は、親水性ポリマーの骨格（例えば架橋セファロース、デキストラン又はアガロース）に結合した小さい非極性基（ブチル、オクチル又はフェニル）からなる。よって、HICカラムは、ブチルセファロースカラム又はフェニルセファロースカラムが好ましく、最も好ましくはブチルセファロースカラムである。

HICにおけるローディング、洗浄及び溶出は、上記のイオン交換クロマトグラフィについて記載したのと同じ原理に基本的に基づくが、しばしば、イオン交換クロマトグラフィに用いるのとはほぼ正反対の条件が適用される。つまり、HICプロセスは、タンパク質をほどいて疎水性部位を露出させる塩の高いローディングバッファーの使用を含む。タンパク質は、カラムの疎水性リガンドにより保持され、塩濃度が減少するバッファー勾配に曝露される。塩濃度が減少するにつれて、タンパク質はその天然のコンホメーションに戻り、最終的にはカラムから溶出される。あるいは、タンパク質はPEGを用いて溶出され得る。

HICにおける固相としてのブチルセファロース及びオクチルセファロースの使用は、本発明において好ましい。ここで再び、厳密な条件並びにローディング、洗浄及び溶出プロセスに用いられるバッファー及びバッファーの組み合わせについて、多数の異なる可能性が存在することが明らかである。好ましい実施形態において、カラムは、0.25〜1 MのNa₂SO₄を加えた上記の標準バッファーで平衡化される。洗浄は、1〜2カラム洗浄（column wash）の平衡化バッファー、続いて1〜5カラム容量の標準バッファーpH 7.5中の1.0〜3.0 M NaCl又は1.8 M 酢酸Na を用いて行われる。rASAは、0.25〜0.75 M NaCl又は1〜5カラム洗浄の標準バッファーpH 7.5中の0.9 M 酢酸Naを用いて溶出される。

本発明のさらに好ましい実施形態において、HICによるrASAの精製に続いて、最初の捕捉工程において行われるようなイオン交換クロマトグラフィによる精製が行われる。しかし、2つの工程を逆の順序で行うことが考えられるが、これはおそらくより低い収率に導くであろう。

本発明のさらなる実施形態において、精製方法の工程IVにおける試料の精製は、タンジェンシャルフローろ過により達成される。
精製方法の工程IVにおいて、rASAは、タンジェンシャルフローろ過による酸性環境下でのサイズによる汚染物質からの分離により精製される。rASAは、低pHではオクタマーを形成し、480 kDaの理論上の分子量を有するので、比較的開放されたメンブレンにより保持されるが、ほとんどの汚染物質はこのメンブレンを通過する(Sommerladeら, (1994) Biochem. J., 297; 123〜130; Schmidtら, (1995) Cell, 82 271〜278; Lukatelaら, (1998) Biochemistry, 37, 3654〜3664)。この方法の原料は、方法の前の工程のクロマトグラフィカラムから溶出されたrASA懸濁物であるので、この懸濁物のpHは、0.2〜1 M酢酸Na、pH 4.5の添加により4〜5に調整される。次いで、当業者に公知の方法において、1〜10バッファー容量の酢酸Na pH 4.0〜5.5に対してダイアフィルトレーションが行われる。このろ過は、20〜450 kDaの範囲の名目上の重量カットオフを有するいくつかの異なるタイプのフィルタを用いて行うことができるが、100〜300 kDaの範囲のカットオフ値を有するフィルタを用いるのが好ましい。rASA含有溶液のさらなるプロセシングのために、Trisベースを約20〜50 mMの最終濃度まで添加することにより、pHを7〜8の範囲内の値に調整する。

上記の酸性タンジェンシャルフローろ過の代わりに、汚染物質からのrASAの分離は、本質的に同じ条件及びバッファーの組成を用いて、酸性ゲルろ過により得ることができる。ろ過は、低pHの溶液で平衡化したゲルろ過カラムを通して低pHで行われる。現在の手順において、0.2〜0.9 Mの酢酸Na溶液pH 4〜5。選択として、ゲルろ過の前に、20〜50 kDaのフィルタを通してタンジェンシャルフローろ過によりrASAの溶液を濃縮する。濃縮の程度は、rASAが約0.1 mg/ml〜約50 mg/ml、好ましくは約5 mg/mlに濃縮され得るようにかなり変動してもよい。

現在好ましい手順において、工程IIIからの試料のプールはBiomax A-screen、30 kDaに対して濃縮される。ダイアフィルトレーションは、3〜5カラム洗浄の20 mM酢酸Na、pH 5.4〜5.7に対して行われる。最も好ましくは、タンジェンシャルフローろ過がBiomax A-screenに対して起こる方法である。

洗練工程（精製方法の工程V）についてはいくつかの選択が存在する。この工程は、上記で実質的に記載したイオン交換クロマトグラフィを用いる精製を含み得る。簡便のために、前の工程の精製方法からのバッファー中の試料がロードされる。別の実施形態においては、セラミックヒドロキシアパタイトカラムのクロマトグラフィを用い得る。

ヒドロキシアパタイト(HAP)は、通常、リン酸カルシウムの結晶形のことをいう。HAPの機構は、負に荷電したタンパク質のカルボキシル基と樹脂の正に荷電したカルシウムイオンとの、及び正に荷電したタンパク質のアミノ基と樹脂の負に荷電したリン酸イオンとの非特異的相互作用を伴う。塩基性又は酸性タンパク質は、バッファーのpHを調整することによりカラム上に選択的に吸着できる。溶出は、バッファーの塩濃度を変動させることにより達成できる。ここで再び、多くのバッファー組成及びバッファーの組み合わせを用いることができることは明らかである。しかし、好ましくは、カラムは1〜100 mM Tris-HCl、pH 7.0〜8.0を含むバッファーの1〜10カラム洗浄を用いて平衡化するのが好ましい。簡便のために、試料は、精製方法の前の工程からのバッファー中でロードされる。カラムを平衡化に用いたバッファーの1〜10カラム容量で洗浄し、試料をこのバッファーと100〜800 mMリン酸ナトリウムを含むバッファーとの混液中で溶出する。任意に、カラムを1〜10カラム容量の100〜800 mMリン酸ナトリウムを用いる洗浄により再構築する。

クロマトグラフィ工程において、クロマトグラフィカラムに詰められるときに用いられる樹脂の適切な容量は、カラムの寸法、すなわちカラムの直径、樹脂の高さを反映し、例えばアプライされる溶液中のタンパク質の量及び用いられる樹脂の結合能に応じて変動する。しかし、工業的規模でのrASAの生産及び精製を得るために生産方法及び精製方法の規模を増加させることは、本発明の範囲内である。よって、カラムのサイズ、直径及び流速などのパラメータは、このような大規模生産の速度及び効率に従うために増大させることができる。50〜100 mmの範囲の直径を有するカラムであれば、100〜300 mlのサイズの容量及び40〜400 cm/時又は5〜100 mlの流速である。

現在好ましい種類において、工程Vの手順は、次のようなrASAの特徴に基づく。理論的及び実際的に、rASAは、pH 6.0付近の等電点を有する。このことは、タンパク質がアニオン交換体に6.5より高いpHで、かつカチオン交換体に5.5より低いpHで結合することを意味する。本発明者らは、実験的にカチオン交換体へのそのような結合を確認し、ここで、原則として、pH 5.6ではrASAは結合しないことが見いだされる。いずれのrASAの約50%がpH 5.2で結合し、100%がpH 4.8で結合する。しかし、アニオン交換体については、rASAは、7.2から4.8までの範囲内の試験したいずれのpH値においても結合する。よって、原則として、rASAは正に荷電したアニオン交換体にpH 4.8で結合し、ここで酵素自体も正に荷電されるはずであることがわかる。同じ条件下において、酵素は、カチオン交換体にも同様によく結合する。これらの予期せぬ結合特性は、酵素が強力に「正に荷電した」側鎖と強力に「負に荷電した」側鎖とを有して極度に分極していることが原因であると考えられる。あるいは、この結合特性は、酵素が5.8のpH値でダイマーからオクタマーに変化することにより説明されるだろう。

工程5の現在好ましい手順は、これらの予期せぬ特徴を利用する。よって、洗練工程は、酵素が第一のアフィニティクロマトグラフィ樹脂又は第一のカチオン交換体（受動工程）に結合しないpH 6.0で開始される。しかし、この工程は、多くの宿主細胞の汚染タンパク質を除去する。医薬製剤において用いられるべき調製物については、このようなタンパク質の量は最小限でなければならない。

アフィニティ又はカチオン樹脂を通す通過に続いて、rASAは、その後のアニオン交換樹脂と結合するが、これはカチオン樹脂と連続して連結していてもよい。2つの樹脂を連結する場合、その後、カチオン交換樹脂を外し、アニオン交換体をpH 4.8付近で洗浄してrASAを樹脂に結合させたままにする。pH 4.8でrASAが樹脂に結合したままであるという事実は、非常に予期できないことであり、この能力は、他のわずかなタンパク質とのみ共有されるが、それは、効率的にはそれらは4.2未満の等電点を有するべきであるからである。

よって、現時点で最も好ましい本発明の実施形態において、精製方法の工程Vにおける2つ又はそれより多い連続工程は、rASAがカチオンクロマトグラフィ樹脂又はメンブレンを通過する受動工程と、rASAがアニオン交換メンブレン又は樹脂の内部にとどまりかつその後そこから溶出される能動工程とを含む。アニオン交換メンブレン又は樹脂は、高分解（high resolving）アニオン交換体であり得る。

さらに、カチオンクロマトグラフィメンブレン又は樹脂及びアニオン交換メンブレン又は樹脂は、連続して連結又は接続されるのがさらに好ましい。この関係において、アフィニティ又はカチオンクロマトグラフィ及びアニオンイオン交換クロマトグラフィに関して用いられる場合の用語「連続して連結又は接続」とは、アフィニティ又はカチオンクロマトグラフィ樹脂を通過するタンパク質が、バッファー又はその他の条件を変化させずにアニオンイオン交換樹脂に直接ロードされることを意味する。

現時点で最も好ましい本発明の実施形態において、カチオンクロマトグラフィメンブレン又は樹脂は、Mustang（商標）Sメンブレン、S-セファロース樹脂又はBlue Sepharose樹脂であり、上記のアニオン交換メンブレン又は樹脂は、Mustang（商標）Qメンブレン又はSource（商標）Q樹脂である。

本発明の具体的な実施形態において、カラムは、10カラム容量より多い20〜100 mM 酢酸NA pH 4.5〜8.5、好ましくは20〜100 mM 酢酸ナトリウムpH 5.5〜7.7を用いて平衡化される。工程4からの試料のプールをカラムにロードし、rASAをカチオン交換カラムを通過させた後に、2つのカラムの連結を外し、アニオン交換体を2〜4カラム容量の50〜75 mM 酢酸Na pH 4.8で洗浄する。アニオン交換体を10カラム容量より多い20 mM Tris-HCL pH 7.5 (標準バッファー)で平衡化する。カラムを標準バッファー中の0.1 mM NaClで洗浄し、rASAを標準バッファー中の0.1〜0.3 M NaClの直線勾配で溶出させる。

現時点で好ましい実施形態において、アニオン及び／又はカチオン樹脂又はメンブレンは、2〜4カラム洗浄の20〜70 mM 酢酸ナトリウムpH 4.8 31.で洗浄される。アニオン交換メンブレン又は樹脂が少なくとも11カラム洗浄の10 mM リン酸ナトリウム pH 7.5で平衡化され、続いて10 mM リン酸ナトリウム pH 7.5中の60 mM NaCLで洗浄されるのが同様に好ましい。最後に、アリールスルファターゼAがアニオン交換樹脂から10 mM リン酸ナトリウムpH 7.5中の60〜500 mM NaClの直線勾配を用いて溶出されるのが現時点で好ましい。

精製方法において、ウイルス不活性化又はウイルスろ過の1又はそれより多い工程をさらに組み込む。これらの方法は、感染性ウイルスを実質的に含まず、「ウイルス安全産物」と表示できる酵素の調製物を得ることを意図すると理解される。さらに、種々の方法を独立して又は組み合わせて用い得ることが考えられる。好ましくは、ウイルスろ過は、クロマトグラフィの数工程による酵素の精製の後に行われる。好ましい実施形態において、ウイルスろ過工程は、精製方法の工程5により得られたrASA含有溶液を滅菌フィルタを通過させ、続いて滅菌ろ過した溶液をナノフィルタを通過させることにより行われる。「滅菌フィルタ」とは、増殖するか及び／又は感染を引き起こすことができる全ての微生物を実質的に除去するフィルタを意味する。フィルタが0.1ミクロンのポアサイズを有するのが好ましいが、ポアサイズは0.05〜0.3ミクロンの範囲であり得る。

ウイルスろ過に加えてまたはこれの代わりに、酵素を含む溶液に1種又はそれより多い「ウイルス不活性化剤」を加えることにより、ウイルス不活性化を達成できる。好ましくは、ウイルス不活性化工程は、医薬品として用いられるか又は産物が医薬品の製造に用いられるときに産物の安全性を損なう該剤がいずれの量又は濃度においても最終産物に存在しないことを確実にするために、精製方法の前に行われる。「ウイルス不活性化剤」の用語は、脂肪包膜ウイルス及び非脂肪包膜ウイルスを不活性化するのに用いることができる剤又は方法を意味することを意図する。用語「ウイルス不活性化剤」は、適切である場合にはそのような剤及び／又は方法の組み合わせ、並びにそのような剤又は方法の1種のみの両方を含むと理解される。

精製方法の工程VIにおいて行われる試料のウイルスろ過を、好ましくは精製方法の工程Vの前又は工程IIの前に、試料を界面活性剤と接触させることで置き換えるか又はそれと組み合わせることも可能である。

好ましいウイルス不活性化剤は、界面活性剤及び／又は溶剤であり、最も好ましくは界面活性剤−溶剤混合物である。ウイルス不活性化剤は、任意に、1種又はそれより多い界面活性剤の1種又はそれより多い溶剤との混合物であることが理解される。広い種類の界面活性剤及び溶剤をウイルス不活性化のために用いることができる。界面活性剤は、非イオン性及びイオン性界面活性剤からなる群より選択することができ、実質的に非変性で選択される。好ましくは、その後の精製工程においてrASA調製物からの界面活性剤のその後の除去が促進されるので、非イオン性界面活性剤が用いられる。適切な界面活性剤は、Shanbromらにより米国特許第4,314,997号及び米国特許第4,315,919号に記載される。好ましい界面活性剤は、Triton X-100及びTween 20又はTween 80の商標の下で販売されるものである。ウイルス不活性化剤に用いられる好ましい溶剤は、Neurath及びHorowitzにより米国特許第4,764,369号に記載されるようなジ-又はトリアルキルホスフェートである。好ましい溶剤は、トリ(n-ブチル)ホスフェート (TNBP)である。本発明の実施に特に好ましいウイルス不活性化剤はTween 20であるが、その他の剤又は剤の組み合わせを用いることができる。好ましい剤は、rASA含有溶液中のTween-20の濃度が0.5〜4.0重量%の範囲、好ましくは約1重量%の濃度であるような容量で加えられる。

ウイルス不活性化工程は、包膜ウイルスを不活性化し、実質的にウイルスから安全なrASA含有溶液を得る条件下で行われる。一般的に、このような条件は、4〜37℃、例えば19〜28℃、23〜27℃、好ましくは約25℃の温度、及び確認実験により有効であると見出されたインキュベーション時間を含む。一般的に、1〜24時間のインキュベーション時間で充分であり、好ましくは10〜18時間、例えば約14時間が充分なウイルス不活性化を確実にする。しかし、適切な条件（温度及びインキュベーション時間）は、用いられるウイルス不活性化剤、pH、及び溶液のタンパク質濃度及び脂質含量に依存する。

ウイルスの除去又は不活性化のためのその他の方法、例えばメチレンブルーの添加とそれに続く紫外線光の照射による不活性化も、ウイルスから安全な産物を得るのに用いることができる。

好ましい実施形態において、本発明による方法は、適切な量の生理活性組換えアリールスルファターゼAを含む産物又は製剤、特に、逆相HPLCにより測定される産物又は製剤中の全タンパク質の量が少なくとも90%、例えば少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%又は少なくとも99.9%である組換えヒトアリールスルファターゼAを含む産物又は製剤をもたらす。

異種分子と任意に接合された（conjugated）ポリペプチドを含む治療用製剤は、所望の純度を有するポリペプチドを、任意に、医薬的に許容される担体、賦形剤又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で製造することができる。「医薬的に許容される」担体、賦形剤又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸及びその他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；及びm-クレゾール）；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及びその他の炭水化物；キレート剤、例えばEDTA；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばZn-タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN、PLURONICST又はポリエチレングリコール(PEG)を含む。

有効成分は、例えばコアセルベーション法又は界面重合、例えばそれぞれコロイドドラッグデリバリーシステム（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルション中のヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルにより製造されたマイクロカプセル中に捕捉され得る。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences l6th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。

徐放性製剤を製造することができる。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチド変異形を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、該マトリックスが成型体、例えばフィルム又はマイクロカプセルであるものを含む。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ(メタクリル酸2-ヒドロキシエチル)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸及びL-グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT （商標）(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドとからなる注射可能なマイクロスフェア)、及びポリ-D-(-)3-ヒドロキシ酪酸を含む。

本明細書に開示される精製されたポリペプチド又は該ポリペプチド及び医薬的に許容される担体を含む組成物は、次いで、種々の診断、治療、又はこのようなポリペプチド及び組成物について知られるその他の使用に用いられる。例えば、該ポリペプチドは、該ポリペプチドの治療上有効量を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物の疾患を治療するのに用いることができる。

本発明の具体的な実施形態において、rASAは、等張溶液、例えば0.9% NaCl及び10〜50 mM リン酸ナトリウムpH 6.5〜8.0又はリン酸ナトリウム、グリシン、マンニトール又は対応するカリウム塩中に処方される。別の実施形態において、rASAは、生理的バッファー、例えば：
a) 調剤バッファーI (mMで)：Na₂HPO₄ (3.50〜3.90)、NaH₂PO₄ (0〜0.5)、グリシン(25〜30)、マンニトール(230〜270)、及び注射のための水を含む；又は
b) 調剤バッファーII (mMで)：Tris-HCl (10)、グリシン(25〜30)、マンニトール(230〜270)及び注射のための水を含む
中に処方される。

さらなる実施形態において、rASAは、ガラクトシド及び／又はホスファチジルコリン及び／又はホスファチジルエタノールアミンを含む脂肪小胞中に調剤される。
本発明のさらなる実施形態は、rASAが、生分解性マイクロスフェア、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸又はこれらの混合物を含むマイクロスフェアを含む徐放性製剤として調剤される方法である。

血液脳関門の浸透圧開放を起こすためにrASAを高張液と調剤すること、及びrASAを鼻投与のための相乗剤を含む溶液中に調剤することがさらに好ましい。
rASAを、血流中でのその半減期を増加させるか及び／又は腎臓を介しての浄化（clearing）を低減させるか及び／又は肝臓を介しての拡張された摂取を防止するように調剤する特定の実施形態が考えられる

最後に、本発明による方法は、rASAの酵素等価物であるタンパク質の産生、精製及び調剤をもたらす。この酵素は、その構造の点では配列番号3によるrASAからは異なるであろう。Cys-51の周囲のアミノ酸残基の配列が同一であるか又は配列番号3の相当する配列との配列同一性が高いことが有利であろう。よって、アリールスルファターゼA 中のCys-51の周囲の20アミノ酸、例えば19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5又は4アミノ酸残基の直鎖配列は、配列番号3の対応する配列と同一であるか、又は少なくとも90%同一、例えば95%、96%、97%、98%又は99%同一であるのが好ましい。リソソーム中のrASAの活性型はオクタマーであるので、本発明のさらなる目的は、生理条件下でオクタマーであるか又はオクタマーへ組み立てられるrASAを提供することである。

本発明の別の観点は、各精製工程の効率及び得られるrASA調製物の品質を例えば酵素活性、全タンパク質及びrASA濃度、純度及びエンドトキシンレベルについて試験する分析方法を含む。

rASAの触媒活性と理解される酵素活性は、検出可能な基質又は検出可能な最終産物に導く基質のいずれかのrASA媒介加水分解に基づく酵素アッセイにおいて測定できる。好ましい観点において、該アッセイは、合成の色素産生基質であるパラニトロカテコールサルフェート(pNCS)の加水分解に基づき、これは、515 nmで光を吸収するパラニトロカテコール(pNC)を最終産物とする。

処理中（in-process）の試料及び最終産物における全タンパク質濃度は、アルカリ媒体中のタンパク質によるCu²⁺のCu⁺への還元の原理を用いる市販のアッセイ（ビウレット反応）により測定できる。この方法は、当業者に公知である。

精製方法の種々の工程の後で収集される試料中のrASAの濃度は、rASA酵素結合免疫吸着法(ELISA)において評価できる。ELISAによるタンパク質の定量的測定は、当業者に公知の通常の方法である。しかし、酵素を特異的ポリクローナル免疫グロブリンで捕捉し、その後捕捉された酵素を特異的モノクローナル抗体で検出することに基づくrASAの検出についての特異的ELISAを提供することは、本発明の範囲内である。

rASAの種々の調製物の純度及び個性（identity）は、当業者に公知の方法、例えばrpHPLC、SDS-PAGE及びウェスタンブロットrASAにより測定できる。さらに、rASA調製物中の全細胞タンパク質の量(HCP)は、ELISA及びウェスタンブロッティング法の使用により、市販の抗体を用いて測定できる。好ましくは、上記の全ての方法は、簡便のためにマイクロタイタープレートで行われるように適合される。

バッチ培養に比べて、本発明の連続培養方法は、均質な高品質の酵素の調製物及び製剤を提供するように、プロセスパラメータの厳密な制御を許容する。本発明の酵素産物及び酵素産物を含む製剤の性質並びにMLDの予防又は治療におけるその適用可能性は、上記の生産及び精製の方法に大きく依存する。本発明の別の主要な観点は、よって、上記の方法により得ることができるか又は得られるアリールスルファターゼAの製剤及びアリールスルファターゼA産物に関係する。

酵素補充療法におけるアリールスルファターゼAの治療効率を増大させるために、細胞送達のためのビヒクル及び膜透過剤を含む種々の添加物の使用が提案されているが、インビボ実験は、本発明による酵素調製物又は製剤が、そのような添加剤を用いない場合に非常に効率的であることを驚くべきことに示している。よって、アリールスルファターゼAの製剤は次の：
a) 酵素(アリールスルファターゼA)の中枢神経系への送達のためのペプチド又はポリペプチドのようなビヒクル、
b) 脳血液関門の開放又は破壊を引き起こし得る成分、
c) 無損傷の細胞
を含まないことが、現在、好ましい。

ペプチド、例えばインシュリンフラグメント、ウイルス又は細菌由来のペプチド及びタンパク質、抗体又は抗体フラグメント、例えばトランスフェリン受容体抗体及びトキシンを含むいくつかのビヒクルを本明細書の前の部分で記載している。また、当該技術分野においては、形質導入された細胞、例えば形質導入された自己細胞、例えば形質導入された繊維芽細胞又は末梢血リンパ球を含む無損傷の細胞の使用が提案されている。特に、アリールスルファターゼAを髄液中に分泌する、ポリマーに包埋した細胞系統の移植が提案されている。さらに、例えばチオサルフェートのようないくつかの剤又は化学薬品は、血液脳関門の一時的な破壊を引き起こすことが知られている。本発明によるアリールスルファターゼA又はアリールスルファターゼAの製剤は、もちろん、そのようなビヒクル、剤、化学薬品又は細胞系と組み合わせることができる。上記のように、高張液中のアリールスルファターゼAの調剤は、中枢神経系への近づきやすさを増大させるために提案されている。しかし、本発明の好ましい実施形態において、このような既知のビヒクル、剤、化学薬品、製剤又は細胞系のいずれか又は全ての本発明の酵素調製物との使用は、ここに放棄する。

さらに、例えば脊髄又は髄腔内注射による、酵素調製物の血液脳関門を直接横切る投与が従来技術において議論されている。しかし、本発明によるアリールスルファターゼAの製剤は、全身送達、例えば静脈内投与用であるのが好ましい。

本発明によるアリールスルファターゼA産物及びアリールスルファターゼAを含む製剤は、それらの特徴の一つとして、宿主細胞タンパク質の含量が非常に低いことが挙げられる。医薬組成物を意図する産物又は製剤、又は医薬組成物の製造における使用を意図する産物において、このようなタンパク質の含量は、これらが免疫原性効果を有すると考えられるので、重要である。本発明の好ましい実施形態において、最終産物又は製剤は、1.5%未満の全細胞タンパク質、例えば1%未満、例えば0.75%未満、又は0.5%未満、又は0.25%未満の全細胞タンパク質を含有する。該産物又は製剤は、主要成分の酵素的に不活性な変異型の形で不純物をさらに含有していてもよい。好ましい実施形態において、本発明による産物又は製剤は、少なくとも90%、例えば92%又は94%の酵素的に活性なrASAを含有する。さらに好ましい実施形態においては、酵素的に活性なrASAの相対的な量は、逆相HPLCで測定して少なくとも95%、例えば96%又は97%又は98%又は99%である。

本発明の方法に加えて、インビボでマンノース-6-ホスフェート受容体経路を介して効率的にエンドサイトーシスされるrASAを含む製剤又は医薬組成物を提供することが、本発明の目的である。rASAのエンドサイトーシスに適用されるときに、用語「効率的に」とは、rASAの単回投与(40 mg/kg)の静脈内注射の8日後にMLDマウスの腎臓、腕神経叢及び坐骨神経の細胞でのrASAの濃度が少なくとも100倍増加することに導くエンドサイトーシスのことをいう。

精製方法の上記の効率によると、この製剤又は組成物は、逆相HPLCで測定して少なくとも98%の生理活性rASAを含むのが好ましい。本発明の方法に従って製造された酵素又は製剤のさらなる特徴は、その比活性のレベルが高いことである。よって、本発明による製剤又は医薬組成物は、少なくとも10 U/mg、少なくとも20 U/mg、少なくとも25 U/mg、少なくとも30 U/mg、少なくとも40 Umg、少なくとも50 U/mg、少なくとも60 U/mg、少なくとも70 U/mg、少なくとも75 U/mg、少なくとも80 U/mg、少なくとも85 U/mg、少なくとも90 U/mg、少なくとも100 U/mg、少なくとも150 U/mg、少なくとも200 U/mg、少なくとも250 U/mg又は少なくとも300 U/mg-タンパク質の比活性を有するrASAを含む。

本発明の別の主要な観点は、医薬用のアリールスルファターゼA又は有効量のアリールスルファターゼAを含む製剤である。rASAは、上記の特徴のいずれを有していてもよく、よって、アリールスルファターゼA又は製剤は本発明による方法により得ることができるか又は実際に得られることが好ましい。具体的には、本発明の目的は、異染色性白質ジストロフィーを罹患しているか及び／又は異染色性白質ジストロフィーと診断された対象において、スフィンゴ脂質3-O-スルホガラクトシルセラミド (ガラクトシルスルファチド)のレベルを末梢神経系及び／又は中枢神経系の細胞の内部で減少させるための医薬として用いるためのrASAを提供することである。

本明細書の開示によると、このrASAの投与は、運動学習技能欠陥の減少及び／又は神経運動伝導速度及び／又は神経伝導振幅（amplitude）の増加を導く。
最近の文献によると、組換えヒトα-L-イズロニダーゼ(rhIDU)の髄腔内注入（髄液への直接の注入）が、ムコ多糖沈着症(MPL)のイヌモデルの脳組織における炭水化物の貯蔵を減少させることができる(Kakkis, 2003)。これらの知見に基づいて、本発明は：
(a) 任意に、骨髄移植による治療の補助として、末梢神経系内部の標的細胞でのガラクトシルスルファチドのレベルを減少させるために、本発明による医薬組成物を静脈内投与するか、及び／又は
(b) 末梢及び中枢神経系の両方の標的細胞でのガラクトシルスルファチドのレベルを減少させるために、本発明による医薬組成物を静脈内投与するか、及び／又は
(c) 中枢神経系内部の標的細胞でのガラクトシルスルファチドのレベルを減少させるために、本発明による医薬組成物の髄腔内注入と任意に組み合わせて、末梢神経系内部の標的細胞でのガラクトシルスルファチドのレベルを減少させるために、本発明による医薬組成物を静脈内投与する
ことを含む治療方法を提供する。

よって、本発明による方法は、上記の医薬組成物を静脈内及び脊髄注入により投与して、上記の対象における末梢神経系内の標的細胞及び中枢神経系内の標的細胞におけるガラクトシルスルファチドのレベルを減少させることを含むのが好ましい。
本発明のさらに好ましい実施形態によると、該方法は、上記の医薬組成物を上記対象の静脈内に投与し、上記の対象における末梢神経系内の標的細胞及び中枢神経系内の標的細胞におけるガラクトシルスルファチドのレベルを減少させることを含むのが好ましい。

本発明のさらに好ましい実施形態は、肝臓、腎臓、脾臓、心臓を含む群から選択される組織内の標的細胞へインビボでrASAが効率よくエンドサイトーシスされる方法である。
当業者により知られるように、上記の中枢神経系内の標的細胞が好ましくは乏突起膠細胞であり、上記の末梢神経系内の標的細胞が好ましくはシュヴァン細胞である。

本発明による方法に基づく治療計画の厳密な性質は、治療されるべき対象の年齢、性別及び疾患の段階のような因子に依存し、最適投与計画及び投与頻度は、経験をもとに決定されるのが有利であることが考えられる。しかし、本発明のある好ましい実施形態において、上記の医薬組成物は、1又はそれより多い投与量で投与され、各投与量は0.1〜100 mg/kg-体重の範囲内、例えば0.25〜50、1〜25、1〜10又は1〜5 mg/kg-体重の範囲内のrASAの量を含む。
また、上記の医薬組成物は、毎日、毎週、2週間毎又は毎月ベースで投与されるのが好ましい。

上記の記載によると、上記の医薬組成物の静脈内又は髄腔内注射は、骨髄移植の補助として行うことができる。

ガラクトシルスルファチドのリソソーム蓄積の増加を特徴とする疾患の治療に対するアプローチとして酵素補充療法が提案されているが、酵素の全身投与に基づく通常の酵素補充療法の治療効果が末梢神経系に限定されることが事実として受け入れられている。本発明の興味深い観点は、アリールスルファターゼAを含有する製剤の投与により、定期的に繰り返す場合、末梢神経系だけでなく中枢神経系においても貯蔵脂質のレベルが減少するという驚くべき発見に関係する。本発明のこの観点は、有効量のアリールスルファターゼAを含む製剤の、異染色性白質ジストロフィーに罹患しているか及び／又は異染色性白質ジストロフィーと診断された対象における中枢神経系内の細胞におけるガラクトシルスルファチドのレベルを減少させるための医薬の製造のための使用である。本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明による方法は、組織及び血液におけるスルファチドのクリアランスにより引き起こされるウォッシュアウト効果により完全に又は部分的に創られた中枢神経系内の標的細胞におけるガラクトシルスルファチドのレベルの減少に導く。スルファチドは、組織及び血液中のスルファチドのクリアランスから得られる濃度勾配により部分的に脳から浄化される。

脳内の細胞において酵素レベルのわずかな増加しか観察されないことと一致して、CNSにおける治療効果は、酵素の有効量の全身投与により引き起こされるような、循環又は内臓における酵素の効果的レベルの維持を主な原因とする。よって、アリールスルファターゼAの有効量は、上記の製剤の全身及び好ましくは静脈内注射の後に：
a) 酵素の有効レベルが循環中に8日間以上維持されるか、及び／又は
b) 酵素の有効レベルが内臓、坐骨神経及び腕神経叢に8日間以上維持されるか、及び／又は
c) 酵素の有効レベルが肝臓に8日間以上維持される
ようなものである。

アリールスルファターゼAの投与後にみられる効果は一過性であるようなので、アリールスルファターゼAの効果的な量は、毎週、2週間毎又は毎月ベースでの製剤の反復静脈内投与により：
a) 酵素の有効レベルが循環中に維持されるか、及び／又は
b) 酵素の有効レベルが内臓、坐骨神経及び腕神経叢で維持されるか、及び／又は
c) 酵素の有効レベルが肝臓及び／又は腎臓で維持される
ようなものでなければならない。この関係において、用語「有効レベル」は、40 mg/kg-体重の量でのアリールスルファターゼAの静脈内投与の8日後にTLCで測定して、腎臓を含む内臓の細胞での貯蔵スフィンゴ脂質3-O-スルホガラクトシルセラミド (ガラクトシルスルファチド)の少なくとも10%の減少を引き起こすのに効果的なアリールスルファターゼAのレベルと理解される。ガラクトシルスルファチドの減少が、酵素の投与前に存在するレベルに比べて少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%又は少なくとも40%であるのが好ましい。また、アリールスルファターゼAは、体重1 kg当たり5〜100 mgの酵素、例えば10 mg/kg-体重、20 mg/kg-体重、30 mg/kg-体重、50 mg/kg-体重、60 mg/kg-体重、70 mg/kg-体重、80 mg/kg-体重、又は90 mg/kg-体重の量で投与されるのが好ましい。CNSでの効果は、酵素の質に大きく依存するようであるので、アリールスルファターゼA製剤は、上記の製剤であるのが好ましい。

酵素は高い比活性を有することがさらに重要であり、アリールスルファターゼAが少なくとも20 U/mg、例えば少なくとも30 U/mg、少なくとも40 U/mg、少なくとも50 U/mg、少なくとも60 U/mg、少なくとも70 U/mg、少なくとも80 U/mg又は少なくとも90 U/mgの比活性を有するのが好ましい。

巨大分子の中枢神経系への送達を促進する能力が知られている化合物又は製剤のような添加物の使用は、中枢神経系での観察される効果を得るために必要ではないと考えられる。よって、好ましい実施形態においては、医薬は次の成分：
a) 中枢神経系への酵素(アリールスルファターゼA)の送達のためのビヒクル、例えばペプチド又はポリペプチド、及び
b) 血液脳関門の開放又は破壊を引き起こし得る成分、及び
c) 形質導入細胞、例えば形質導入自己細胞、例えば形質導入繊維芽細胞又は末梢血リンパ球を含む無損傷の細胞
のいずれも含まない。

上記の剤又は成分のいずれを用いる補助的な治療も必要ではないことも明らかである。よって、医薬は、スフィンゴ脂質3-O-スルホガラクトシルセラミドレベルの減少のために：
a) 中枢神経系への酵素(アリールスルファターゼA)の送達のためのビヒクル、例えばペプチド又はポリペプチドを含む製剤の投与、及び
b) 血液脳関門の開放又は破壊を引き起こし得る製剤の投与、及び
c) 形質導入細胞、例えば形質導入自己細胞、例えば形質導入繊維芽細胞又は末梢血リンパ球を含む無損傷の細胞の投与
を含むいずれの付加的な医学的治療を受けない対象に対する投与用である。

本発明のさらに別の観点は、治療を必要とする対象を治療する方法であり、該方法は、該対象に、上記のいずれの特徴をも有し得るrASAを含む医薬組成物を投与し、それにより対象の標的細胞のガラクトシルスルファチドの減少を得る。

本発明のこの観点は、スフィンゴ脂質3-O-スルホガラクトシルセラミドのリソソームでの貯蔵の増加に関係する疾患(異染色性白質ジストロフィー)の症状の治療／緩和の方法に関し、該方法は、対象に、本発明の方法により得られるか又は得ることができるアリールスルファターゼAの製剤を投与し、それにより該対象の細胞でのガラクトシルスルファチドのレベルを減少させることを含む。この治療方法が標的とする細胞は、末梢神経系及び／又は中枢神経系の内部の細胞であるか又はそれらを含むことが理解される。疾患は、異染色性白質ジストロフィー (MLD)又は多種スルファターゼ欠損症(MSD)である。

上記のように、アリールスルファターゼAの製剤である医薬の投与は、中枢神経系の機械的、化学的又は生物学的侵襲を含まない。これらの用語は、血液脳関門を横切っての医薬の直接の投与、並びに血液脳関門を横切って巨大分子の送達を促進する能力が知られた添加物及び／又は製剤の使用を含む。

よって、本発明の治療方法は、好ましくは、脳室、脊髄、髄腔内又は頭蓋内以外の経路、例えば静脈内、動脈内、経口、皮下、腹腔内、筋肉内、実質内、粘膜、鼻及び直腸投与からなる群より選択される経路によるアリールスルファターゼAの製剤の投与を含む。

最も重要なことには、本発明による治療方法は、異染色性白質ジストロフィーの治療に対する効果的なアプローチを提供することが認められなければならない。よって、好ましい実施形態において、アリールスルファターゼAの製剤の投与を含む本発明による治療を受ける対象は、上記のアリールスルファターゼAの製剤の投与の前、同時又は後に、次の治療：
a) 脳室内、脊髄、髄腔内又は頭蓋内投与からなる群より選択される経路によるアリールスルファターゼAの製剤の投与、
a) 中枢神経系への酵素の送達のためのビヒクルの投与、
b) 骨髄又は骨髄幹細胞の移植、
c) 内因性及び／又は外因性アリールスルファターゼAを発現する細胞の投与、
d) 血液脳関門の開放又は破壊を引き起こし得る医薬、例えばチオサルフェートナトリウム、あるいは血液脳関門の透過性を増大させ得る高張液の投与、
f) 形質導入された細胞、例えば形質導入された自己細胞、例えば形質導入された繊維芽細胞又は末梢血リンパ球を含む無損傷の細胞の全身又は髄腔内の投与、
g) 遺伝子治療
のいずれも受けない対象である。

アリールスルファターゼA欠損マウスの中枢神経系におけるリソソームのスルファチド貯蔵の局所的分布は、Wittke, D.ら 2004, Acta Neuropathol 108, 261〜271に記載される。この関係において、中枢神経系内でのスルファチドの貯蔵の減少は、特に、活性ミクログリア細胞を含む食細胞、ニューロン及び乏突起膠細胞においてみられる。中枢神経系内でのスルファチドレベルの減少は、次の領域：脊髄、脳幹、小脳、前脳、核及び大脳皮質のいずれか1つのうちの白質又は灰白質内に位置する細胞において主にみられる。
上記のような中枢神経系内の細胞でのスルファチドレベルの減少に加えて、末梢神経系において、特にシュヴァン細胞で対応する減少がみられる。

本発明のさらなる実施形態において、血液脳関門の浸透圧開放を引き起こすために、医薬組成物は高張液をさらに含むか、又は高張液と共に投与される。

rASAが、その触媒特性を維持したまま細胞膜を超えて標的細胞内へ侵入する能力は、Kudoh及びWenger. J. Clin. Invest. 1982. 70(1): 89〜97に記載されるように、酵素に対する適切な基質を含有する細胞の培養物を用いてインビトロで測定できる。本テキストの実施例2は、そのようなモデル系の例を提供し、上記の方法により得られたrASAの調製物についての試験結果を示す。

よって、本発明のある観点は、外因性ASAによるスルファチドの分解を測定できる哺乳動物細胞の培養物を含むモデル系を含む。この実施形態の好ましい観点において、これらの細胞は、MLD患者由来の繊維芽細胞であり、よってこれらは内因性の機能的ASAを欠いている。しかし、欠失ASA活性及びASAの検出可能な基質の蓄積能力を特徴とするその他の細胞（以下、ASAの発現及び／又は機能を低減させるか又は廃止するように遺伝的に改変された細胞）が、このようなアッセイのベースを形成できることは容易に明らかである。この実施形態の別の好ましい観点において、この系において基質として用いられるスルファチドは、その後の検出のために放射性又は非放射性化合物の付加により標識される。最も好ましい観点において、rASAの基質は、パルミトイルスルファチドであり、等しく好ましい観点において、基質は¹⁴Cで標識される。

本発明のさらなる実施形態は、rASAの調製物であって、これは、上記の系で分析されるときに1種又はそれより多いその基質の細胞含量を減少させることができる。好ましくは、酵素は培養培地に0〜100 mU/mlの範囲の濃度で加えられ、好ましくは20%、より好ましくは30%、さらにより好ましくは40%、さらにより好ましくは50%、さらにより好ましくは60%、最も好ましくは70%より多くに相当する細胞内基質レベルの減少に導く。

本発明の最後の観点は、本発明の方法について記載したような連続細胞培養系を提供する。
本発明の種々の観点及びこれらの観点の具体的な実施形態の記載について、ある観点及び／又は本発明のある観点のある実施形態に関連して記載されたか又は参照されたいずれの特徴及び性質は、記載される本発明のいずれの又は全ての他の観点及び／又は実施形態にも同様に適用されることが理解されるべきである。

本発明による目的又はその特徴若しくは特性の一つが単数形である場合、これは複数での目的又はその特徴若しくは特性のこともいう。例えば、「細胞（a cell）」という場合、1又はそれより多い細胞のことをいうと理解されるべきである。

本明細書において、用語「含む」又は「含み」若しくは「含んで」などの変形は、記載した要素、整数又は工程、あるいは要素、整数又は工程の群を含むことを意図するが、いずれの他の要素、整数又は工程、あるいは要素、整数又は工程の群を除外することを意図しないと理解される。

以下のテキストは、培養系における連続細胞増殖によるrASAの産生及び上記で概説した精製手順の工程1〜5による産物の精製の例を与える（実施例1及び2）。精製rASAの生理活性は、上記のようなインビトロ系で評価される。さらに、本発明によるrASAのインビボでの投与の効果は、ASA(-/-) (ノックアウト)マウス（MLD-マウスともいう）により行われる一連の実験において評価される。これらのインビトロ及びインビボ実験の結果を、実施例3〜6に示す。

これらの実施例は、本発明のさらなる特徴づけを提供するものであるが、本発明の範囲を限定することを意図しない。

添付の図面の簡単な説明
図1：(A) 連続細胞増殖系の概略図。(B) 精製方法の概説。
図2：rhASAのイオン交換クロマトグラフィバッチ試験。
図3：(A) 本発明による精製手順の工程(V)の完了後のrhASAのHPLC-クロマトグラム。(B) (A)のHPLCクロマトグラムの拡大。

図4：rhASAと24時間インキュベーションした後に放射性標識したスルファチドをロードしたMLD-繊維芽細胞におけるスルファチドのクリアランス。
図5：rhASAと6、24及び48時間インキュベーションした後に放射性標識したスルファチドをロードしたMLD-繊維芽細胞におけるスルファチドのクリアランス。
図6：rhASAの静脈内注射の10分後のrhASAの血清レベル。

図7：CHO-rhASAのインビトロ分析。(A) 天然(-)及び脱グリコシル化(+)酵素のSDS-PAGE。ゲルは、クーマシーブルーで染色した。タンパク質スタンダード(std)の質量を記載する。PNGアーゼFでの処理により、N-結合炭水化物の損失によるASAバンドのシフトがおこる。(B) ELISAにより分析されたBHK細胞によるM6P-依存性のCHO-rhASAのエンドサイトーシス。BHK細胞は、1 mlの培地当たり1μg CHO-rhASAと20時間、10 mM M6Pの存在下又は不在下でインキュベートした。他のディッシュは、コントロールとして10 mM グルコース6-ホスフェート (G6P)を補った。M6Pによるエンドサイトーシスの完全なブロックは、BHK細胞がCHO-rhASAをM6P受容体を介して取り込むことを示唆する。このことは、M6P残基がCHO-rhASAに存在することを示唆する。データは平均±SD、n = 3として表す。

図8: (A) MALDI-TOF分析。CHO細胞の分泌物から単離されたrhASAは、57 kDaの正しいサイズを示し、酵素調製物は主要な汚染物質を含まない。29 kDaでのマイナーピーク(ASA/2)は、二重荷電分子（doubly charged molecule）を表す。(B) 低濃度のPNGアーゼFで処理したCHO-rhASA のMALDI-TOF分析。制限された脱グリコシル化は4つの産物を生じる。これらはおそらく、3つ、2つ、1つ又は0のN-グリカンをもつrhASAを表す。よって質量パターンは、CHO-rhASAの可能なN-グリコシル化部位の3つ全てがグリコシル化されていることを示唆する。

図9：ASA-欠損マウスの尾静脈への単回注射後のCHO-rhASAの薬物動態学。全てのデータは、平均±SDで表す。(A) 20 mg/kg (塗りつぶした丸、n = 9)又は40 mg/kg (白丸、n = 11)の注射後の最初の1時間での血漿中のrhASAレベル。濃度は、ELISAにより測定した。(B) 40 mg/kgの投与後の種々の時間での肝臓におけるrhASAレベル。濃度は、ELISAにより測定した(n = 3)。(C) ELISA (n = 3)により測定した、40 mg/kgを投与した後の腎臓(白いバー)、坐骨神経(斜線のバー)及び脳(塗りつぶしたバー)でのrhASAの組織動態学。nd - 測定せず。

図10：ASA-欠損マウスの尾静脈への単回注射後のCHO-rhASAの薬物動態学。全てのデータは平均±SDで表す。(A) 異なる酵素投与量の注射の8日後のrhASAの組織レベル(n = 5)。濃度は、腎臓(白いバー)、腕神経叢(塗りつぶしたバー)及び坐骨神経(斜線のバー)についてELISAにより測定した。未処理の野生型マウス及び模擬処理したASAノックアウトマウスからの組織を、ネガティブコントロールとして分析した。坐骨神経からのコントロールのホモジネートは、処理したマウスからの非常に小さい神経試料中の特異的免疫反応性を定量するためにインキュベーション時間を延長しなければならなかったので、いくらかの非特異的バックグラウンドシグナルを示した。(B) 20 mg/kgの注射の8日後のrhASAの相対的組織分布。rhASA濃度はELISAにより測定し、肝臓におけるレベルに標準化した(n = 3)。

図11：ASA-欠損マウスをCHO-rhASAで単回処理した後の組織からのスルファチドのクリアランス。スルファチド(塗りつぶしたバー)、コレステロール(白いバー)及びスフィンゴミエリン(斜線のバー)のレベルをTLCにより測定し、任意の単位の平均±SDで表す。星印は、模擬処理コントロールからの統計的に有意な差を示す(スチューデントのt検定、p＜0.05)。(A) TLCによる腎臓脂質の分析。脂質は、異なる実験群の腎臓から抽出し、アルカリ条件下でインキュベートしてホスホグリセロ脂質及びコレステリルエステルを加水分解した。反応産物をTLCにより分離し、デンシトメトリにより視覚化して分析した。ローディング容量は、脂質抽出に用いた組織粗ホモジネートのタンパク質濃度について標準化した。スタンダードとして、増加する量でコレステロール(chol)、スルファチド(sulf)及びスフィンゴミエリン(sm)をロードした。(B) 40 mg/kgの注射後の異なる時間での腎臓における脂質レベル(n = 3)。(C) 異なる用量の酵素を注射して8日後の腎臓における脂質レベル(n = 5)。

図12：ASA-欠損マウスをCHO-rhASAで単回処理した後の組織からのスルファチドのクリアランス。スルファチド(塗りつぶしたバー)、コレステロール(白いバー)及びスフィンゴミエリン(斜線のバー)のレベルをTLCにより測定し、任意の単位の平均±SDで表す。星印は、模擬処理コントロールからの統計的に有意な差を示す(スチューデントのt検定、p＜0.05)。(A) 40 mg/kgの注射後の異なる時間での脳における脂質レベル(n = 3)。(B) 異なる投与量の酵素を投与して8日後の坐骨神経における脂質レベル(n = 5)。(C) 異なる投与量の酵素を投与して8日後の腕神経叢における脂質レベル(n = 5)。

図13：週1回の20 mg CHO-rhASA/kgの反復投与の後の(A) 腎臓、(B) 脳、(C) 坐骨神経及び(D) 腕神経叢における脂質レベル。ノックアウトマウスをCHO-rhASAの4回までの注入で処理した。コントロールは、バッファーの4回の注射を行った模擬処理であった。スルファチド(塗りつぶしたバー)、コレステロール(白いバー)及びスフィンゴミエリン(斜線のバー)のレベルを最終投与の8日後に分析し、平均±SDで表す(n = 3)。星印は、模擬処理コントロールと比較してスルファチドレベルにおける有意な差を示す(スチューデントのt検定、p < 0.05)。

図14：アルシアンブルーを用いるインキュベーションにより組織化学的に証明されるCNSにおけるスルファチドの貯蔵(方法を参照)。模擬処理したASAノックアウトマウス(A, C, E, G)及び酵素処理したASAノックアウトマウス(B, D, F, H)の脳幹を通る冠状厚層切片(100μm)。(A, B) 下の顕微鏡写真において、より高倍率で示す領域を概説するための全体像。7n - 顔面神経根、CbN - 小脳核、icp - 下小脳脚、PnC - 橋網様核、VC - 腹側蝸牛神経核、Ve - 前庭神経核。(C, D) 外転神経核(6N)及び近接領域。7g - 顔面神経膝。模擬処理マウスにおいて、親アルシアン性（alcianophilic）物質(スルファチド)が多くの細胞においてみられ、それらのうち食細胞及びニューロンが同定できる（図内挿入図においてそれぞれ三角及び丸で印をつける）rhASA-処理マウスにおいては、親アルシアン性物質が主にニューロンにおいてみられる。(E, G)及び(F, H) 白質の路（tract）の例としての下小脳脚(icp)。模擬処理マウスにおいて、多数の親アルシアン性の食細胞がみられ、それらのうちいくつかがGにおいて光学焦点があっている(いくつかに丸で印をつける)。小さい親アルシアン性の顆粒が乏突起神経膠細胞に結合しているが、これらはこの倍率では確認できない。rhASA-処理マウスにおいて、icpはわずかな親アルシアン性の構造しか示さず、このことはスルファチドを貯蔵する食細胞がサイズ及び／又は数において減少したことを示唆する。Fにおける小脳核及び前庭神経核の全体的な染色は減少する。なぜなら、親アルシアン性がニューロンに主に限定され、食細胞からはほとんど消失したからである。バー：A及びBでは500μm；C及びDでは100μm；E及びFでは200μm；G、H並びにC及びDの図内挿入図では10μm。

図15：100μmの切片をアルシアンブルーとインキュベーションすることにより組織化学的に証明される腎臓におけるスルファチドの貯蔵(方法を参照)。(A) 野生型マウス；髄質外部（outer medulla）の内側の縞（inner stripe）(iS-oM)において弱い染色が見られるが、髄質外部の外側の縞(oS-oM)及び皮質(C)は染色されない。(B, C) 模擬処理ASAノックアウトマウス。著しいスルファチド貯蔵(親アルシアン性物質)が髄質外部の内部の縞の細管においてみられる。外側の縞及び皮質においてはいくつかのプロフィールがスルファチドの貯蔵を示す。(D, E) 20 mg CHO-rhASA/kgの4回の投与で処理したASAノックアウトマウス。皮質には、親アルシアン性物質がない。外側の縞においては染色が減少している。内側の縞においては、模擬処理動物と比べて染色に変化がないようである。バーはA、B、Dでは500μm及びC、Eでは200μmを示す。(F - J) トルイジンブルーで染色したセミシン（Semithin）切片。(F, H) 模擬処理ASAノックアウトマウス、外側の縞の太い上行脚(TAL)及び皮質の遠位尿細管(DCT)。強く染色された細胞質封入体は、以前に示されたようなスルファチドで満たされたリソソームに相当する(Lullmann-Rauch, R.ら, Histochem. Cell Biol., 116, 161〜169)。(G, J) 20 mg CHO-rhASA/kgの4回の投与で処理したASAノックアウトマウス、ネフロンの代表的なセグメントは、F及びHにおけるものに相当する。貯蔵物質はTALにおいては減少し、DCTプロフィールにはない。G - 糸球体、PT - 近位尿細管。F〜Jにおいてバーは20μmを示す。

図16：週1回の20 mg CHO-rhASA/kgでの反復投与の機能的効果。(A) 野生型マウス(塗りつぶしたバー)、模擬処理ASAノックアウトマウス(白いバー)及びCHO-rhASAの4回の注射の6日後のASAノックアウトマウス(斜線のバー)で測定された神経生理学パラメータ。記載したパラメータは、坐骨神経の遠刺激後に内在性の足筋系において測定した。データは平均±SDで表す(n = 7〜8)。星印は有意な差を示す(スチューデントのt検定、p＜0.05)。(B) 平均齢約9 mo (9.2±1.1 mo)のマウスのロータロッド（Rotarod）性能。ASAノックアウトマウス(塗りつぶした三角、n = 7)を、20 mg CHO-rhASA/kgでの3回目の処理の2及び3日後に分析した。年齢を合わせた野生型マウス(丸、n = 10)及び模擬処理ASAノックアウトマウス(白い三角、n = 10)をコントロールとして平行して分析した。ゆっくり回転するロッド上で少なくとも4分間バランスを保つことができたマウスのパーセンテージを、4回の連続する試験において測定した。(C) 平均齢12 mo (11.8±1.1 mo)のマウスのロータロッド性能。この実験においても、処理したマウスを20 mg CHO-rhASA/kgでの3回目の処理の2及び3日後に試験した。凡例及び群のサイズは、rhASA-処理ノックアウトマウスについてn = 14である以外はBと同じである。

図17：神経運動伝導についての研究からの電気生理学的パラメータの表示(図16のパネル(A)に部分的に相当する)。

実施例
実施例1：連続細胞増殖
大規模生産（カラム規模＞2L）へのスケールアップを意図する連続細胞増殖及び200〜400 mlカラム規模での小〜中サイズのrhASAの精製方法を開発する。系の概略を図1に示す。最終産物(rhASA)の質及び純度は非常に高く、毒性試験に適し(工程1〜4＋7を含む)、臨床試験にも最終的に適する(記載する全ての工程を含む)。上記のように、方法は捕捉工程、1〜2つの中間精製工程、1つの洗練工程、1〜2つのウイルス除去工程及び1つの調剤工程を含む。1又はそれより多いバッファー交換工程も含まれる。

実験の設計：いくつかの異なるクロマトグラフィのゲルを試験し、以下に簡単に記載する一連の分析方法を用いて、異なる工程の性能（汚染物質の除去、収率及び純度の点で）を分析する。

分析方法
酵素活性：アリールスルファターゼアッセイ
全タンパク質濃度： BCA分析
rhASA濃度： rhASA ELISA
純度： rpHPLC、
SDS-PAGE
性質： rpHPLC、
ウェスタンブロットrhASA
HCPタンパク質： HCP-ELISA、
ウェスタンブロットHCPタンパク質

エンドトキシンレベル：欧州薬局方(Ph. Eur.) 2.6.14法による。i.v.投与について、許容値は5 IU/kg/hである。最大用量は1 mg/kg/hであり、物質の濃度は5 mg/mlであり、限界は25 IU/mlである。
浸透度： Ph. Eur. 2.2.35法による。まさにこの物質についての許容値が欧州薬局方に記載されていないので、インビボでよく許容されるNaCl (0.9%)の等張液に匹敵することから、値(250〜350 mOsmol/kg)を規定する。
DNA含量： DNA閾値
pH： Ph. Eur. 2.2.3法による。まさにこの物質についての許容値が欧州薬局方に記載されていないので、中性pHでありかつインビボでよく許容されることから、値(7.0〜8.0)を規定する。

細菌含量： Ph. Eur. 2.6.12法(メンブレンろ過)を、API及びバルク物質を試験するのに用いる。まさにこの物質についての許容値は、欧州薬局方に記載されていない。滅菌前の適切な最小限の汚染微生物数を確実にするように値(≦10 cfu/ml)を規定する。i.v.投与についての最終産物は、滅菌されてPh.Eur. 2.6.1法に従って試験される。

分析方法の説明
アリールスルファターゼアッセイ
天然の基質に加えて、ASAは、合成の発色性基質であるパラニトロカテコールサルフェート(pNCS)の加水分解も触媒できる。図を参照。産物であるパラニトロカテコール(pNC)は、515 nmで光を吸収する。この方法は、Fluhartyら 1978, Meth. Enzymol. 50:537〜47により記載される。

材料及び装置
Molecular Devicesからの分光光度計Spectra MAX Plus又は同等物。
515 nmに適する、光路長1 cmのキュベット1 ml (ガラス又はプラスチック)。
平底96ウェルマイクロタイタープレート。

化学薬品及び試薬
pNCS - p-ニトロカテコールサルフェート(no.N-7251, Sigma)
BSA - ウシ血清アルブミンFrac. V
NaAc - 酢酸ナトリウム三水和物
Triton X-100
Tris-HCl 分子生物学グレード
PBS, pH 7.4 w/o Ca²⁺, Mg²⁺：0.20 g/l KCl, 0.20 g/l KH₂PO₄, 8 g/l NaCl,
1.15 g/l Na₂HPO₄。pHを調整。
その他の全ての溶剤及び化学薬品は、p.a.品質(Merck)のものであった。
a. 2×ASA 基質溶液：0.5 M NaAc pH 5.0中に30 mM pNCS、10 % (w/v) NaCl及び1 mg/ml BSA。
b. TBS, pH 7.5：H₂O中に10 mM Tris-HCl及び150 mM NaCl。
c. 停止溶液：1 M NaOH。

多くのアニオン及びカチオン、例えばSO₄ ^2-、PO₄ ^3-、SO₃ ^2-、F^-、Ag⁺、Cu²⁺及びHg²⁺は、ミリモル濃度又はそれより低い範囲の濃度で酵素の阻害剤であるので、活性を測定する前に試料を適切なバッファー(例えばTBS)に移す。これは、透析又はゲルろ過カラム(例えばAmersham Pharmacia BiotechからのPD10)でのバッファー交換により行う。

a. 細胞上清でのASA活性測定
用いた培地を遠心し(110×g、5分)、上清を清潔なチューブに移す。バッファーを透析又はゲルろ過カラムを用いることによりTBSに変える。

b. 細胞内ASA活性の測定
懸濁液中の細胞をPBSで1回、次いでTBSで1回洗浄した後に細胞を0.5 ml TBS＋0.5 % TritonX-100中に10分間RTで溶解させる。ボルテックス後、溶解物を遠心し(13,200 rpm、10分)、上清を清潔なチューブに集める。あるいは、細胞をTBSに再懸濁し、ついで凍結−融解を繰り返すことにより溶解する。

c. 処理中の試料及び最終産物中のASA活性の測定
活性を測定する前にバッファーをTBSに変え、試料中のタンパク質濃度をBCA Protein Assay Reagentキット(以下を参照)を用いて測定する。
直線性を確実にするために、最終吸光度0.1〜2 (参考文献2を参照)を目標とする。資料は、必要に応じてTBSで希釈する。
a. 試料希釈液(TBS又はTBS＋TritonX-100) 50μlをマイクロタイタープレートに少なくとも二重に加え、ブランクとして用いる。
b. 試料又は希釈した試料50μlを二重にマイクロタイタープレートに加える。
c. 2×ASA基質溶液50μlを各ウェルに加える。プレートを密閉し、正確に30分間37±0.5℃でインキュベートする。
d. 反応を、全てのウェルに停止溶液(1 M NaOH) 50μlを加えることにより停止する。
e. ウェル当たり0.15 mlのMilliQ水を満たしたマイクロタイタープレートを用いて、散乱効果を補正するために予備読み取りを行う。その後、515 nmでの吸光度を、プレートリーダーを用いて30分以内に測定する。吸光度は、マイクロタイタープレートから1 cm光路でPath Checkとよばれるアプリケーションを用いて測定した。
f. デルタ吸光度(ΔA)は、各試料の測定された吸光度からブランクの吸光度の値を引くことにより算出される。産物pNCについてのモル吸光係数（εM）は12 400 M^-1 cm^-1である。

計算
定義：酵素活性1単位(1 U)は、37℃、pH 5.0で1分当たりに1μmolのpNCSを加水分解すると定義される。
以下の等式は、加水分解されたpNCSμmol／min×ml (=単位/ml)での酵素活性を算出するのに用いられる。
（式中：
ΔA= 試料の吸光度−ブランクの吸光度；
Vtot (ml) = mlでの全反応容量(この場合0.15 ml)；
Vsample (ml) = mlでの加えた試料の容量(この場合0.05 ml)；
εM = 産物pNCのモル吸光係数、この場合は12 400 M^-1 cm^-1

等式1は：
ΔA×(0.15 / (12 400/1000×0.05×30)) = X μmol / (分×ml) (=単位/ml) (1)
と書くことによってより単純化できる。

消費したμmol pNC /(分×mg) (=単位/mg)で比活性を算出するためには、等式1を、試料中のタンパク質濃度で除する：
Eq. 1 / タンパク質濃度(mg/ml) = Yμmol / (分×mg) = 単位/mg (2)

BCA分析
市販のキット(Pierce BCA Proteinアッセイキット, no. 23225)を、製造業者の使用説明に従って用いる。

rhASA濃度を測定するためのrhASA ELISA
この方法は、組換えヒトアリールスルファターゼ(rhASA)を溶液中、例えばバッファー、細胞培養液及び血清中で定量的に測定するための酵素結合免疫吸着法(ELISA)である。
rhASAは、アフィニティ精製したrhASAに対するウサギ抗血清のIgGフラクションでコートしたマキシソープ96ウェルプレートに捕捉する。捕捉されたrhASAは、rhASAに対するモノクローナル抗体を用いて、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-コンジュゲート抗マウス免疫グロブリンにより検出される。HRPは、基質であるテトラメチルベンジジン(TMB)を青色の産物に変換し、これが酸化により黄色に変わる。吸光度を450 nmで測定し、既知のrhASA濃度からの標準曲線を用いて試料のrhASA濃度を算出する。

装置
プレート用の分光光度計、すなわちSpectramax Plus, Molecular Devices及び計算のためのSOFTmax PROソフトウェア
プレートウォッシャー
プレートシェイカー
ピペット：シングル及びマルチチャネル

材料
マキシソープ96ウェルプレート
密閉テープ

試薬
コーティングバッファー
Tris-緩衝生理食塩水(TBS)：10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.4.
洗浄バッファー
TBS (コーティングバッファー)に0.1% tween-20を補う。
1 ml tween-20を1リットルのTBSに加える。
ブロッキングバッファー
TBS中のSuperBlockブロッキングバッファー(Pierce)。
希釈バッファー
10 mlブロッキングバッファーを90 ml TBS (コーティングバッファー)に加える。

rhASAに対するポリクローナル免疫グロブリン
rhASA-CHO細胞からの培地を、rhASA (5.7)に対するモノクローナル抗体がプロテインAに架橋されたカラムでアフィニティ精製する。アフィニティ精製されたrhASA (DAKO)を用いてウサギを免疫にし、抗血清がウェスタンブロッティングでrhASAと反応することを確認する。ウサギからの抗血清をHiTrapプロテインGカラムで精製する。
IgGフラクションを50%グリセロール、10 mM Na-Pi、75 mM NaCl、pH 7.2中に4℃で貯蔵する。タンパク質濃度は、BCAプロテインアッセイキットを用いて測定して1.25 mg/mlである。

rhASAスタンダード
バッチM0208の精製したrhASAを、スタンダードとして用いる。スタンダードは、rhASA-CHO細胞上清から3つの連続する精製工程、DEAEセファロース、HICオクチルセファロース及びMustang Qを用いて精製する。
ストックは、50%グリセロール、10 mM Tri-HCl、pH 7.5中に4℃で貯蔵する。BCAプロテインアッセイキットを用いて測定した濃度は、100μg/mlと見積もられる。

rhASAに対するモノクローナル抗体
rhASAモノクローナル抗体(mab)産生ハイブリドーマ(Prof. Gieselmann, Bonnからの19-16-3)からの上清を、HiTrapプロテインAカラムで精製する。
mabは、-20℃で、0.02%アジ化ナトリウムを補った20 mM Na-Pi、0.145 M NaCl、pH 7.2 (PBS)中に貯蔵する。作業部分は4℃で6ヶ月間保持する。

HRP-抗マウス免疫グロブリン
西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートのアフィニティ単離されたヤギ抗マウス免疫グロブリンをDAKO (P 0447)から購入し、4℃で貯蔵する。
TMB基質
3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を含むOne-Step SubstrateシステムをDAKO (S 1600)から購入し、4℃で貯蔵する。
停止溶液
1 M H₂SO₄

方法
コーティング
抗rhASAポリクローナルIgGのストックを1：1000にTBS中で希釈して1.25μg/mlとし、100μl/ウェルをマキシソープ96ウェルプレートに加える。プレートを室温で一晩インキュベートし、〜250μlの洗浄バッファーで2回洗浄する。

ブロッキング
ウェル当たりブロッキングバッファー200μlを加え、その後、室温で振動させながら少なくとも15〜60分間インキュベートする。
rhASAの捕捉
希釈バッファー100μlを全てのウェルに加える。

rhASAスタンダード：rhASAスタンダードストック溶液を希釈バッファー中、2000倍に三重で50 ng/mlまで希釈する。三重の100μlのスタンダードを96ウェルプレートに移し、2倍の連続希釈をつくる。
試料：試料を希釈バッファー中に三重で希釈して、見積もりのrhASA濃度が約25 ng/mlとなるようにする。各試料100μlを96ウェルプレートに移す。プレートに2〜8の2倍希釈をつくる。

プレートを室温で振動下に100〜140分間インキュベートし、その後〜250μlの洗浄バッファーで4回洗浄する。
モノクローナル抗体での検出
rhASAに対するモノクローナル抗体(mab)を1:2000に185 ng/mlまで希釈バッファー中に希釈し、100μlを各ウェルに加える。プレートを、室温で振動下に70〜120分間インキュベートし、その後〜250μlの洗浄バッファーで4回洗浄する。

抗マウスIgG-HRPを用いる複合（complexed）mabの検出
抗マウスIgG-HRPを1:2000に500 ng/mlまでTBS (コーティングバッファー)中に希釈し、100μlを各ウェルに加える。プレートを室温で振動下に70〜120分間インキュベートし、その後、上記のようにして4回洗浄する。
発色
TMB基質(100μl)を各ウェルに加え、プレートを室温で振動せずに15分間インキュベートする。100μl/ウェルで1 M H₂SO₄ (停止溶液)を加えることによる反応、そして吸光度を450 nmで、プレート分光光度計で終点を読み取ることにより測定する。

評価
rhASA濃度は、製造業者の使用説明に従ってSOFTmax PROソフトウェア(....)を用いて算出する。
標準曲線の直線部分を1次回帰を用いてプロットし、未知の試料の濃度を標準曲線から読み取る。

rhASA分析のための逆相HPLC
アリールスルファターゼA (rhASA)の純度を、UV吸収を220 nmで監視しながら逆相HPLCで測定する。有機変性剤（アセトニトリル）の濃度が移動相中に増加した溶出物が得られる。試料中のrhASA及びその他の成分の保持時間は、それらの非極性固定相への吸着及び脱着の能力に依存し、よってタンパク質のコンホメーション、疎水性及び配列のような因子に依存する。

材料及び装置
HP Chemstation バージョンA.06.03により制御されるターシャリーポンプシステム、オートインジェクタ、ダイオードアレイ検出器を備えたHewlett Packardモデル1090 HPLCシステム。同等なHPLCシステムは、システムの適切性試験が適切な性能を証明する限り用いることができる。

試料濃縮用のフィルタ：Centriplus YM-30、Millipore corp。
分析カラム：Zorbax 300SB-C18、2.1*150mm 5-ミクロン, Rockland Technologies Scientific, Inc。
インラインフィルタ：インラインフィルタA-102X及びインラインフィルタカートリッジ1*1 mm、Upchurch Scientific, Inc。
試料調製用のフィルタ：Whatman Anatope 10 LC

化学薬品及び試薬
Milli-Q水、HPLCグレードの水又は同等物。
アセトニトリル、遠UV、HPLCグレード(VWR, LiChrosolve又は同等物)
トリフルオロ酢酸(TFA)、アンプル10×1 g (Pierce)
トリスベースp.a.クオリティ(Angus又は同等物)
塩化グアニジン（guanidinium chloride）p.a.クオリティ(VWR生化学グレード又は同等物)

移動相A：1アンプルのTFA (1 g)を1リットルのMilli-Q水に溶解させる。
移動相B：1アンプルのTFA (1 g)を1リットルのアセトニトリルに溶解させる。
試料希釈液：20 mM Tris-HCl、pH 7.5
カラム浄化溶液1：水中の50%イソプロパノールp.a.クオリティ
カラム浄化溶液2：6 M 塩化グアニジン

rhASAスタンダード(mabASA/プロテインA Sepharoseカラムで精製。Exp. No: M-6の実験要旨に報告する)。アフィニティ精製されたrhASAが入手可能でない場合は、rhASA精製スキームからのより純度の低い試料をスタンダードとして用い得る。
特に記載しない場合は、全ての他の化学薬品及び試薬はp.a.クオリティであり、一般的な市場での入手元から購入する。

方法
装置条件
移動相組成： A：水、0.1% TFA
B：アセトニトリル(AcN)、0.1% TFA
流速 0.2 ml/min
温度＋40℃
試料注入容量：
粗抽出物： 20μl (0.3 mg/mlに濃縮した場合)
処理中の試料： 20μl (0.3 mg/mlに濃縮した場合)
アフィニティ精製した試料： 5μl (1.0 mg/mlの場合)

勾配
時間（分） %A %B
1.00 70 30
10.00 40 60
15.00 5 95
20.00 5 95
25.00 70 30
30.00 (後時間) 70 30

カラム洗浄（5回の注入ごとに行う）：
試料として50%イソプロパノール(p.a.グレード) 25μlを注入、カラムを洗浄するために上記の勾配の運転。
試料及びスタンダードの調製
100μg/ml未満のタンパク質濃度のrhASA試料を、Centriplus遠心ろ過装置(モデルYM-30, Millipore Corp.)で濃縮する。
得られた抽残液（retentate）をタンパク質濃度1.0〜0.3 mg/mlに20 mM Tris-HCl pH 7.5を用いて調整し、いずれの粒子及び沈殿したタンパク質を除くために0.22μmフィルタでろ過する。試料容量が小さい場合は、ろ過は10,000gで10分間の遠心で置き換えることができる。

クロマトグラフィ
試料をロードし、温度を可能であれば低く（+8℃）に保ってクロマトグラフを行う。
積分及び純度の計算
rhASAピークについて220 nmで測定した曲線下面積を計算し、全積分面積と関連付ける。純度は、全タンパク質のrhASAのパーセンテージとして表す。積分のベースとして、付録の積分パラメータを使用する（Hewlett Packard/ Agilent Chemstation 06.03ソフトウェアについて設計）。rhASAメインピークの積分は、予め設定された積分パラメータとともにいつも最適というわけではないので、手動の積分が必要であろう。異なるHPLCソフトウェアは異なる積分パラメータを必要とするはずなので、これは各システムについて個別に試験されなければならない。

評価
同定：試料のメインピークの保持は、rhASAスタンダードに比べて±0.5分以内であるべきである。
純度：試料の純度は、全積分面積と比較してメインピークの積分面積を比較することにより測定する。純度は、%メインピーク(rhASA)として表す。
未処理データ
未処理データは、サーバー又はCD-ROMディスクに保存する。

付録
積分パラメータ
積分パラメータは、装置及びシステムに大きく依存し、かつ異なる使用するシステムについて評価されなければならない。以下の積分パラメータは、Agilent/ Hewlett Packard ChemStation HPLCソフトウェアバージョン06.03について最適化されている。
事象値時間
傾斜感度 10.0 初期
ピーク幅 0.2 初期
却下面積（Area reject） 5.0 初期
却下高さ 1.0 初期
検出肩ドロップ初期
積分 OFF 0.000
積分 ON 5.000

連続細胞増殖の概要
連続哺乳動物細胞増殖を、AppliSensからのBio-Sep細胞保持機構を備えたB. Braun 5Lバイオリアクタで開発した。方法の原理を図2に概説した。哺乳動物細胞は、バイオリアクタ又は大規模醗酵槽での懸濁培養としての増殖及び外来タンパク質の産生が可能な細胞である。

方法の開発の間に、細胞系統は、Excell 302培地(JRH Biosciencesからのカタログ番号81045)で維持しかつ増殖する。これは血清フリー培地であり、動物又はヒト起源のタンパク質を含まない。さらに、フェノールレッドを含まないこの培地は、インシュリン様成長因子-1 (IGF-1)及びグルコースが補充されている。グルコース濃度は監視され、方法の間に最適レベルに調整される。

B. Braun 5Lバイオリアクタでの連続培養方法により生産された組換えヒトASAは、ここで、CHO DG44細胞で発現される。融解後のCHO細胞の増殖は、Tフラスコで開始し、後に細胞をスピナーフラスコに移す。分割してバイオリアクタ培養に植菌する前に、スピナー培養は、1.3 10⁶ 細胞/mlの細胞密度及び96%の細胞生存度を有する。

培養方法のための準備において、細胞をスピナーフラスコからバイオリアクタに移す。植菌の前及び後のバイオリアクタ内の細胞密度のデータは、以下の表1から導き出すことができる。生存度、グルコース、撹拌、pH、pO₂及び温度についての一般的な初期値も報告する。
上記のようにして増殖及び維持するときに、細胞は凝集せず、懸濁培養として増殖及び生産する。

CHO DG44培養からの増殖、維持及び生産の一部分は、1日当たり1〜4リアクタ容量の培地の回収である。回収を補うために、一日毎に新鮮な培地を同じ量培養に補充する。
連続培養方法は、500時間を超える期間にわたって維持することができ、2週間又はそれより多い生産段階が好ましい。収率を増大させるために、生産段階が一旦プラトーに達したら、温度を37℃から32〜35℃に下げることが望ましい。1.2×10⁷細胞/ml及びそれを超える細胞密度が得られ、＞20 mg rhASA/Lをもたらす3.0 pg/細胞/日を超える生産性がこの系において証明される。プロセスの間、グルコース、ラクテート、グルタミン、アンモニウム及び浸透度のパラメータを測定して制御する。

表1：細胞培養系の主なパラメータ。パーセンテージで報告される細胞保持効率(Cell Retention Efficiency；CRE)は、細胞保持機構を用いて細胞が培地から分離されかつ細胞を培養容器に戻す効率の尺度である。放出（Bleeding）は、細胞含有培地の計画的な回収である。比例積分微分(PID)パラメータは、プロセスが規定された設定点に到達しかつ維持する様式を制御するときに適切である。生産定常状態（Steady production-state）は、最適生産を支持すると考えられるので選択されたプロセスパラメータの組である。目的は、プロセスをこれらのパラメータにより長い期間、生産定常状態に維持し、この期間の間に産物を回収することである。細胞培養は、血清を含まず、分子量が10 kDa未満の組換えヒトタンパク質を1 mg/L未満添加した培地で行う。

精製方法の概要
浄化及びウイルス低減
培地20 L (0.3〜1.5 U/mlの範囲のASA活性)を、Milliporeからの一連のデプスフィルタ(Polygard D5 5μm＋Opticap FF及びOpticap 0.45μm)を通して浄化する。ウイルス低減のために、Tween 80を最終濃度1%まで加え、少なくとも30分間(一晩でも可能)、＋4℃で放置する。

15 Lバイオリアクタ中での生産への適用：〜300 L (1〜2 U/ml)の回収／培養(36日間)。いくつのフィルタが必要であるか？提案：潅流の間3日毎に浄化、45 L/ろ過。100 Lバイオリアクタ中での生産への適用：〜2000 L の回収／培養。300 L/ろ過。

タンジェンシャルフローろ過(TFF)を用いる濃縮／ダイアフィルトレーション
ろ液を、Sartoriusフレームを用いるSartoflow システム(Sartorius)で15 psiのトランスメンブレン圧力(TMP)でTFFを用いて、10〜20分の１の容量に濃縮する。0.1 m²面積のMillipore Biomax 30 kDaスクリーンタイプAを用いる。濃縮後、約2容量の20 mM Tris-HCl pH 7.5又は10 mM リン酸ナトリウムバッファー(標準バッファー)、pH 7.5に対して、約4 mS/cmの導電率までダイアフィルトレーションを行う。培地は、最終的に、Opticap 0.45μmフィルタを通してろ過された。

実施例：ろ液20 L (浄化した回収物)に対して0.1m²のメンブレンを用いる。予想収率は90〜100%である。
15 Lバイオリアクタ中での生産への適用：全体で〜300 Lのろ液を〜15 L (20〜40 U/ml)に濃縮し、2容量のバッファーを交換する。提案：潅流の間、6日毎にTFF。培養当たり3〜4回、90 Lを4.5 Lに濃縮。
100 Lバイオリアクタ中での生産への適用：2000 Lから100 Lへ、そして2容量のバッファーを交換。培養当たり3〜4回、300 Lを15 Lへ濃縮。

工程1：捕捉工程−DEAEセファロースFF (Amersham Biotech)
工程1からの試料(50,000 Uの全活性に相当)を、標準バッファーで平衡化した直径70 mmのカラムに充填された800 ml DEAEセファロース(Pharmacia Index 70/500)にアプライする。流速は80〜120 cm/hrである。DEAEゲルに結合したタンパク質を、標準バッファー2〜3カラム容量(CV)、続いて標準バッファー中の0.1 M NaCl 2〜3 CVで洗浄する。

rhASAは、標準バッファー中の0.3 M NaClの3〜4 CVで溶出する。rhASA活性を含むフラクションをプールし、さらなる精製に用いる。通常、収率は90 %であり、純度は約30〜40%である。

大規模生産のために、捕捉工程は、膨張層吸着法、STREAMLINE DEAEを用いて行うのが好ましい。
STREAMLINE DEAEは、Direct STREAMLINEカラム内でリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.1＋200 mMマンニトール(最終濃度)を用いて平衡化する。樹脂は、沈降層容積(SBV)の〜3倍に膨張する。アリールスルファターゼA含有試料を、好ましくはオンラインで300 mMマンニトールと1：1で混合し、カラムにアプライする。あるいは、試料を、混合後にトップスピナーを用いて連続的に撹拌する。導電率は、〜7 mS/cmである。樹脂を2 SBVの平衡化バッファーで、続いて8 SBVのリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.1＋0.06 M NaClで洗浄し、rhASAを8 SBVのリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.1＋0.35 M NaClで溶出させて、4〜6 SBVを収集する。
流れは上方向で300 cm/hrである。
推定収率は95%であり、推定純度は30〜40%である。
結合量（capacity）は、80 U ASA(〜1 mg)/ml-吸着剤である。
直ちにCIPする。

5 L及び15 Lのバイオリアクタでの生産への適用：
1.4 L STREAMLINE Direct 95/1.0 カラム=20 cm 沈降層高さ(〜60 cm膨張時)。回収物は週当たり2回ロードする。15 Lバイオリアクタについて、ロード量は、希釈後に135及び180 Lに相当する。5.5〜8 LのrhASAプールが各運転で溶出される。
カラムの結合量の限界：80 U/ml-吸着剤。1.4 L吸着剤の最大のrhASAロード=112 000 単位(〜1.4 g rhASA)、これは4日プールからの回収物中に最大で1.2 U/ml回収物(比活性が80 U/mgであれば15 mg/L)、及び3日プールから最大で1.7 U/ml (21 mg/L)に相当する。

100 Lバイオリアクタでの生産への適用：
12.3 L STREAMLINE Direct 280カラム= 20 cm 沈降層高さ(〜60 cm膨張時)。
回収物を週当たり2回ロードし、これは希釈後に900〜1200 Lのロード量に相当する。
運転当たり50〜70 L rhASAプールが溶出される。
結合量：984 000 U、これは4日プールからの回収物における1.6 U/ml (20 mg/ml)及び3日プールにおける2.2 U/ml (27 mg/ml)に相当する。
30〜50 cmの層高さ及び15.4〜30.8 L吸着剤を用いる場合、結合量は1.2〜2.5 10⁶ Uであり、2.0〜4.1 U/ml (4日プール)及び2.7〜5.5 U/ml (3日プール)に相当する。

大規模生産には、通常のアニオンクロマトグラフィ(DEAEセファロースFF)を膨張層吸着法で置き換えることが好ましい。なぜなら、これはタンジェンシャルフローろ過(TFF)による前の濃縮／ダイアフィルトレーション(工程1)を余分なものにするからである。

工程2：中間工程1−Butyl Sepharose FF (Amhersam Biotech)
工程2からの試料プールを1：1で照準バッファー中の1.0 M Na₂SO₄と混合し、標準バッファー＋0.5 M Na₂SO₄で平衡化した直径70 mmのカラムに充填した800 mlオクチルセファロースFF (Pharmacia Index 70/50)にアプライする。流速は60〜120cm/hrである。カラムを1〜2 CVの平衡化バッファーで、続いて1-2 CVの標準バッファー中の1.8 M 酢酸Na、pH 7.5で洗浄する。rhASAを、1.5〜3 CVの標準バッファー中の0.9 M 酢酸Na、pH 7.5で溶出させ、活性を有するフラクションをプールしてさらなる精製に用いる。通常、収率は90 %であり、純度は70〜87 %である。
例として、試験した最大の53 000 Uのアリールスルファターゼ活性に相当する工程1からの試料を、600 ml Butyl Sepharose 4FFカラム(Pharmacia Index 70/50カラムに充填)にアプライする。結合量は、100〜300 U/ml-ゲルである。

15 Lバイオリアクタ中での生産への適用：HICカラムの容量は、1.1〜3.5 Lである。工程1からの3つの溶出液を33〜50 Lの1 M Na₂SO₄と混合し、バイオリアクタでの培養当たり2回ロードする。11 L (又は3.5 L)のrhASAプールを溶出／運転する。溶出されたrhASAが細菌汚染の危険性なしに貯蔵できる条件で、HICへの2回の運転をより大きいカラムでの単一の運転、続いての単一の工程で置き換えることができる。
100 Lバイオリアクタでの生産への適用：〜25 (又は8) Lのカラム。

工程3：TFFを用いる濃縮及びダイアフィルトレーション
工程3からの試料プールを、Biomax A-スクリーン, 30 kDaに対してTFFを用いて約1 mg/mlに濃縮する。ダイアフィルトレーションは、3〜5容量の20 mM 酢酸Na、pH 5.4〜5.7に対して行われる。通常の収率は90〜100 %であり、純度は前回の工程と同じである。あるいは、混合物を〜4 mg (全タンパク質)/mlに濃縮し、バッファーを2 mM リン酸ナトリウム、pH 7.5に6容量のダイアフィルトレーションにより変換する。ダイアフィルトレーションは、Biomax 30 kDa、スクリーンA、ポリエーテルスルホンメンブレン(Millipore)を用いて、15 psiのトランスメンブレン圧力(TMP)で行われる。収率は90〜100%であり、純度は工程4と同じである。

15 Lバイオリアクタ中での生産への適用：〜11 Lから〜2 Lまで濃縮し、6容量の2 mM Na-Pi, pH 7.5を用いてバッファーを交換。培養当たり2回。
100 Lバイオリアクタでの生産への適用：〜80 Lから〜16 Lへ濃縮。
任意に、濃縮及びダイアフィルトレーションは、Tween-80によるウイルス不活性化により進められる。
工程2からの溶出液は、最終濃度1%までTween-80 (C₁₈H₁₂₄O₂₆)と混合して、少なくとも1時間放置する。

工程4：洗練工程
Mustang-Sメンブレン又はBlue Sepharose (受動工程)＋アニオン交換体又はメンブレン(能動工程)
簡単な説明：Mustang-Sメンブレン又はBlue Sepharoseは、高分解（high resolving）アニオン交換体(例えばAmhersam BiotechからのSource-Q又はMustang Qメンブレン)と連続して連結される。カラムを＞10 CVの20〜100 mM 酢酸ナトリウム、pH 5.4〜6.0で平衡化する。工程4からの試料のプールを、0.1 M NaAc, pH 5.6と1：1で混合することによりpHを調整した後にカラムにロードする(rhASAは、Mustang-Sメンブレン/Blue Sepharoseを通過し、高分解アニオン交換体に捕捉される)。Mustang- Sメンブレン/Blue Sepharoseの連結を外し、高分解アニオン交換体を2〜10 CVの20〜75 mM 酢酸ナトリウム、pH 4.8で洗浄する。

アニオン交換体を、＞10 CVの20 mM Tris-HCl pH 7.5 (標準バッファー)、又は10カラム容量の10 mM Na-PiバッファーpH 7.5を用いて再平衡化する。カラムを標準バッファー中の0.1 M NaCl、又は10 mM Na-Pi, pH 7.5中の0.06 M NaClで洗浄し、rhASAを、標準バッファー中の0.1〜0.3 M NaClの直線勾配、又はNa-Pi, pH 7.5中の60〜500 mM NaClの勾配で溶出する。活性なrhASAフラクションを回収する。
流速は、100〜120 cm/hrであり、推定収率は90%、純度は98〜100%である。結合量Blue Sepharoseについて＞40 mg/ml及びSource 30Qについて30 mg/ml。

15 Lバイオリアクタ中での生産への適用：培養当たり2回の200 ml Blue Sepharose及び300 ml Source 30Qカラムの運転。4からのプールを、0.1 M NaAc pH 5.6=4 Lとの1：1の希釈によりpHを下げた後にロードする。
100 Lバイオリアクタでの生産への適用：培養当たり2回の〜1.3 L Blue Sepharose及び2 L Source 30Q。

工程5：ウイルスろ過工程
ウイルスろ過は、工程5からの産物プールについて、0.1ミクロンのフィルタ、続いてPallからのDV 20ナノフィルタを用い、20〜50 psiの定常圧力を印加して行う。プロセス規模における推定のフロースルーは25 L/hrである。
あるいは、1%のTween 20又は80を、最初の濃縮及びダイアフィルトレーション工程（工程1）の前に上清に加えることができる（接触時間30〜60分）。

工程6：ダイアフィルトレーション／調剤工程
Millipore Biomax 30 kDa スクリーンタイプAに対する、5-10容量の調剤バッファーに対するタンジェンシャルフローろ過(TFF)を行う。最も適当な調剤バッファーを以下に示す。
調剤バッファー1：
Na₂HPO₄ 3.50〜3.90 mM
NaH₂PO₄ 0〜0.5 mM
グリシン 25〜30 mM
マンニトール 230〜270 mM
注射用の水(WFI)

調剤バッファー2：
Tris-HCl 10 mM
グリシン 25〜30 mM
マンニトール 230〜270 mM
注射用の水(WFI)

調剤バッファー3：
Na₂HPO₄ 3.50〜3.90 mM
NaH₂PO₄ 0〜0.5 mM
グリシン 25〜30 mM
マンニトール 230〜270 mM
注射用の水(WFI)

どちらの製剤バッファーのpH及び浸透度も、7.5±0.2及び300±50 mOsm/kgにそれぞれ保たれる。最終のタンパク質濃度は明細書に従う(＞5 mg/ml)。

工程7：調剤、充填
調剤及び剤形
剤形の開発において、rhASAの安定性は考えるべき重要な因子である。現在、全ての安定性のデータは、安定水溶液のほうに向いている。凍結乾燥粉末が現在のバックアップストラテジーである。
現在のオプションは、工程7に記載した2つの異なる調剤バッファー：調剤バッファー1及び2である。

これらの調剤は両方とも、水溶液及び凍結乾燥粉末中でタンパク質を安定化することが知られている。両方の調剤バッファーのpH及び浸透度は、それぞれ7.5±0.2及び300±50 mOsm/kgに保たれる。最終のタンパク質濃度は明細書に従い、5〜20 mg/mlの範囲である。
rhASAの充填は、クラスAに分類される部屋で、EUのGMPプラクティスに従って産物単位で行われる。生産の間、充填領域は粒子カウント及び沈降プレートを用いて監視される。職員はEU GMPに従って訓練され、各生産の後にグローブプリントを用いて監視される。設備及び材料の滅菌性は、有効滅菌手順により確実にされる。

結論
記載した精製方法は、7工程からなり、バイオリアクタ培養当たり2つのサブバッチが生産される。全体の収率は〜60〜70%である。純度は少なくとも95%である。宿主細胞タンパク質の含量は、＜200 ng/mgであるべきであり、目標値は＜100 ng/mlである。HCPをさらに減少させるために、中間又は洗練工程のいずれかについて収率を減少させる必要があるだろう。

適切な清掃（Clean in place；CIP）手順
工程1：STREAMLINE DEAE：上方向への流れ、100 cm/hr各運転の直後。1 M NaCl 8〜10 SBV、廃棄用1 M NaOH 5 SBV、次いで再循環＞6 hrs、H20、クエン酸/HAc必要に応じて。20% EtOHで貯蔵。
工程2：Butyl Sepharose：上方向への流れ、30 cm/hr。各運転後、1〜2 CV H₂O、1〜2 CV 1 M NaOH (接触時間40分)、1〜2 CV H₂O及び1〜2 CV 20% EtOHを用いて逆の流れでCIP。20% EtOH中に貯蔵。

工程3及び6：TFFメンブレン、Biomax 30 kDa：蒸留水、続いて0.5 M NaOH、及び0.1 M NaOHで洗浄。0.1 M NaOH中に貯蔵。
工程4：Blue Sepharose：各運転後、2 CV 1 M NaCl、2 CV H₂O、1〜2 CV 0.1 M NaOH (接触時間40分)、1〜2 CV H₂O及び1〜2 CV 20% EtOHを用いて逆の流れでCIP。20% EtOH中に貯蔵。
Source Q：上方向への流れ。各運転後、2 CV 2 M NaCl、2 CV H₂O、1〜2 CV 1 M NaOH (接触時間40分)、1〜2 CV H₂O及び1〜2 CV 20% EtOHを用いて、流速〜30 cm/hrで逆の流れでCIP。20% EtOH中に貯蔵。

結果
上記に概説したような精製手順を通して得られるrhASAの調製物のデータを、表5及び6に示す。簡単に、結果は、精製方法の全体の収率が、原料に存在するrhASAの79%に相当することを示す。得られる調製物中のrhASAの純度は、逆相HPLCにより測定して98.0 %に相当する。結果を図3に示す。データが示される手順についての具体的な条件は、次に示すとおりである。

工程1〜3：上記のとおり。
工程4：10 ml Mustang-Sメンブレンを、高分解アニオン交換体(Resource-Q、Amhersam Biotech、6 ml)と連続して連結する。カラムを＞10 CVの20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.5で平衡化する。Tox03HC20からのrhASAは、バッファーを平衡化バッファーに変換し、カラムにロードする。Mustang-Sメンブレンを通過した後、rhASAはResource-Qカラムに捕捉される。Mustang-Sメンブレンは連結を外され、Resource-Qカラムを3 CVの75 mM酢酸ナトリウム、pH 4.8で洗浄する。
Resource-Qカラムを、＞10 CVの20 mM Tris-HCl pH 7.5 (標準バッファー)で、正しいpHに到達するまで洗浄する。カラムを、標準バッファー中の0.1 M NaClで洗浄し、rhASAを標準バッファー中の0.1〜0.3 M NaClの直線勾配で溶出する。活性rhASAを含むフラクションを収集する。

産物の詳述
i.v.用のバルク物質の詳述。組換えヒトアリールスルファターゼA (rhASA)の毒性試験。分析試験は、滅菌ろ過及び精製方法の最後の充填の前に行われる。
記載：
i.v.投与用の溶液中の組換えヒトアリールスルファターゼA (rhASA) 。
貯蔵寿命は、-20℃で貯蔵する場合に生産から6ヶ月である。使用できる期間（In-use time）は、+5℃で貯蔵する場合、融解から1週間である。

実施例2：カチオン交換樹脂及びアニオン交換樹脂へのrhASAの結合の試験
実験の説明：
rhASA (Tox03HC20) 5 mg/mlを1：10でpH 4.8〜7.2のバッファーと混合した。
カチオン交換体(Unosphere-S, BioRad)＋アニオン交換体(DEAE FF, Amhersam Biotech)を試験管に分け、20 mM 酢酸Na pH 4.8、5.2、5.6及び6.05又は20 mM Tris-HCl pH 7.2で平衡化した(約100 ul IEX媒体/チューブ)。1:10でresp.バッファー中の170 ul rhASAをIEX媒体に同じpHで加え、かつ空の参照チューブにも加える。数回混合し、約30分間静置する。スピンダウンし、上清の活性を測定する。

結論：
rhASAは、予想通りカチオン交換体に結合するが、アニオン交換体には結合しない。pH 4.8であってもrhASAは、樹脂に強力に予期せぬことに結合する。この結合は、強い極性、あるいは露出された荷電基の変化を誘導するpH 5.8より下でのダイマーからオクタマーへの変化により説明できる。結果は図2に示す。

実施例3：rhASAによる繊維芽細胞内の天然スルファチドの分解
用量／応答実験：
実験の設計
ヌル突然変異を持つMLD患者からの繊維芽細胞(GM00243、Coriell Cell Repository, USAから購入)を、25 cm²フラスコで熱失活胎児ウシ血清(FCS)を含有する培地中にほぼ集密まで増殖させる。細胞に、天然基質¹⁴C-パルミトイルスルファチド(15μM)をロードする。40時間のインキュベーションのあと、培地をrhASA含有培地(それぞれ0、25、50及び100 mU/mlのアフィニティ精製したrhASA)に変換する。24時間後、細胞を回収して、クロロホルム−メタノール抽出により脂質抽出物を細胞から調製する。脂質フラクションをTLCクロマトグラフィにより、放射活性標識された参照と比較することにより分析する。TLC板をX線フィルムに露光し、TLC板からの異なる脂質フラクションを液体シンチレーションカウントを用いて定量する。データは、残存及び代謝されたスルファチドの放射活性のパーセントとして表す。

結果
この実験からのデータ(表3及び図4)は、用いたrhASAの全ての用量レベル(0.25、2.5、25、50及び100 mU/ml)が、MLD繊維芽細胞内に負荷された¹⁴C標識スルファチドの約40〜70%を代謝することを示す。基質の分解のバックグラウンドは、rhASAでインキュベートされていない細胞において約15%である。このバックグラウンドは、MLD細胞内でのスルファターゼの低い残存活性により説明されるか、又は細胞又はFCSにおいてASA活性は検出できないが、熱失活血清からのいくらかのスルファターゼ活性により説明される。このことは、rhASAを加えていないコントロール細胞での低いスルファチド代謝をも説明する。

時間経過実験
実験の設計
細胞に、上記のようにして¹⁴C-パルミトイルスルファチド(15μM)をロードする。培地は、25 mU/mlのアフィニティ精製されたrhASAを含有する培地に交換し、6、24及び48時間に回収する。脂質抽出物は、上記のようにして調製して分析する。データは、残存及び代謝されたスルファチドの放射活性のパーセントとして表す。

結果
この実験からのデータは、MLD繊維芽細胞内へロードされた¹⁴C標識化スルファチドの代謝が、アフィニティ精製されたrhASAの添加後48時間にわたって増加することを示す。データを図5に示す。
結論：
これらのデータから、rhASAはMLD患者からの繊維芽細胞により効率的に摂取され、これらの繊維芽細胞にロードされたスルファチドは、低い用量及び数時間のインキュベーションの後であっても外因性rhASAにより効率的に代謝され得ると結論付けることができる。

実施例4：大規模で生産及び精製されたCHO-rhASAの特徴付け及び使用
CHO-rhASAの特徴付け
ヒトASAを、発現プラスミドpASAExp1からヒトASAを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Zymenex A/S, Hillerod, Denmark - 以前のHemeBiotech A/S)の分泌物から精製した。酵素調製物の比活性は、60 U/mgを超えていた。CHO-rhASAを、1×TBS pH 7.4中に2.5〜4.3 mg/mlの濃度に再緩衝し、SDS-PAGE及びMALDI-TOF分光法により分析した。MALDI質量スペクトルは、337 nmの窒素レーザを備えたVoyager-DE STR BioSpectrometryワークステーション(Perspective Biosystems, Inc., Framingham, USA)を用いて収集した。測定は手動で、一次で（in linear）、20〜24 kV加速電圧、90%グリッド電圧及び200 nsの遅延イオン抽出での陽イオンモードで行った。得られた各質量スペクトルは、同じ調製試料に対する300の選択していないレーザプロフィールの合計であった。シナピン酸をマトリックスとして用いた。CHO-rhASAの部分的又は完全な脱グリコシル化のために、1μgの酵素を1又は500 mU PNGアーゼF (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)と37℃で20時間反応させた。エンドサイトーシスアッセイを、培地1 ml当たり1μg CHO-rhASAを用いて、上記のようにして20時間行った(Matzner, U.ら Gene Ther., 7, 805〜812)。ASAは、間接サンドウィッチELISA及び活性アッセイにより測定した(Matzner U,ら (2000) Gene Ther. 7(14):1250〜7, Baum, H.ら (1959). Clin. Chim. Acta., 4, 453〜455)。

結果
CHO-rhASA 調製物のSDS-PAGE及びMALDI-TOF分析は、正しいサイズの化合物及び汚染物質の不在を検出した(図7A及び8A)。野生型ヒトASAは、約5〜6 kDaの複合分子質量を有する3つのN-結合炭水化物を有する(Gieselmann, V.ら (1992), J. Biol. Chem., 267, 13262-13266)。PNGアーゼFを用いる処理によりCHO-rhASAの見掛けの分子質量は減少し、組換え酵素のグリコシル化を示唆する(図7A)。CHO-rhASAを低濃度のPNGアーゼFと反応させた後、MALDI-TOF分析により4つの脱グリコシル化中間体が明らかにされ(図8B)、おそらく、3つ、2つ、1つ及び0のN-結合グリカンに結合したポリペプチドを表している。最大及び最小質量の産物の間の質量の差は、5 kDa程度であり、酵素の完全なグリコシル化を示唆する。CHO-rhASAのマンノースリン酸化を評価するために、酵素のマンノース 6-ホスフェート (M6P)-依存性エンドサイトーシスを、インビトロ供給（feeding）アッセイにより評価した。このアッセイにより、BHK細胞によるCHO-rhASAの効率的なエンドサイトーシスが明らかになった(図7B)。さらに、摂取はM6Pにより完全にブロックされ得るが、グルコース 6-ホスフェートによってはブロックされない。CHO-rhASAがM6P残基を有すると結論付けることができる。

考察
細胞培養実験により、CHO-rhASAがM6P残基を有しかつM6P受容体依存性経路を細胞侵入のために用いることが明らかになった(図7B)。このインビトロアッセイで用いたBHK細胞は、リソソーム酵素について他の受容体を発現しない。よって、その他の受容体、例えばマンノース受容体又はアシアロ糖タンパク質受容体が、インビボ条件下では置換CHO-rhASAの結合及びエンドサイトーシスについて競合することが可能である。

実施例6：アリールスルファターゼA欠損マウスへの組換えヒトrhASAの投与
材料及び方法
ヒト組換えアリールスルファターゼAを、実施例1に記載のようにして製造した。動物実験に用いるrhASAのバッチは、G0301 (濃度は4 mg/mlであり、酵素活性は166 U/mlであった)及びG0302 (濃度は4.3 mg/mlであり、酵素活性は242 U/mlであった)を含んでいた。rhASAを-20℃で貯蔵した。実験の開始前に、酵素のバッチを融解してプールし、タンパク質含量及び酵素活性を分析した。このプールのrhASAをTBSで希釈して、注射容量を、全ての動物群において250〜300μlとした。希釈は、注射の直前に作製した。体重及び投与容量を各動物について記載した。

マウスの処置
C57Bl/6J×129olaの混合遺伝的背景のASAノックアウトマウス及び野生型コントロール(Hess B,ら (1996) Proc Natl Acad Sci U S A. 93(25):14821〜6)を、動物の保護に関する現在のドイツでの法に従う標準的な飼育条件下に維持した。全ての実験は、動物福祉の地方委員会により承認された(Bezirksregierung Koln, 参照番号50.203.2-BN 24, 18/04)。実験は、8〜12 mo（月）齢の動物を用いて行った。動物の体重及びCHO-rhASAストックの濃度に応じて、200〜300μlの酵素溶液(1×TBS pH 7.4中のCHO-rhASA)を、尾静脈への静脈内大量注射により投与した。コントロール動物には、250μlの1×TBS pH 7.4を注射した。

マウスの分析
処置期間の間、尾静脈から血液を採取した。最終分析のために、マウスにトリブロモエタノールの腹腔内注射を用いて深く麻酔をかけ、経心的に潅流した。組織学的研究のために、マウスをまずPBSで、次いで100 mM リン酸バッファーpH 7.4中の6%グルタルアルデヒドで潅流した。次いで、組織を解剖し、下記のようにして処理した。生化学的分析のために、マウスをPBSでのみ潅流した。腎臓、肝臓、脳、腕神経叢及び坐骨神経を解剖し、秤量して凍結させた。組織試料を1×TBS pH 7.4中でホモジナイズした。ホモジネートの一定量を、脂質抽出（下記を参照）、タンパク質測定(BioRad Dcアッセイ、BioRad, Hercules, USA)及びELISAによるASAの測定(9)に用いた。

脂質分析
組織ホモジネート（上記を参照）の一定量を、100,000×gで1時間遠心し、ペレットをまず5 mlのクロロホルム/メタノール(C/M) 2：1 (v/v)で、次いで5 mlのC/M 1：1で、それぞれの場合について60℃で4時間ずつ抽出した。溶剤の蒸発に続いて、乾燥した脂質を5 ml MeOHに再溶解させた。アルカリメタノリシスを、125μlの4 N NaOHを37℃で用いて開始し、2時間後に20μlの100%酢酸で停止した。脂質を乾燥させ、1 ml MeOHに溶解させた。逆相クロマトグラフィによる脱塩のために、1 mlのベッドボリュームのLichroprep RP-18カラム(Merck, Darmstadt, Germany)をC/M/0.1M KCl 6：96：94で平衡化した。1容量の0.3 M酢酸アンモニウムを脂質溶液に加えた後に、混液をカラムにロードした。6 ml H₂Oで洗浄後、脂質を1 ml MeOHで、次いで6 ml C/M 1：1で溶出させた。脂質抽出液の一定量を、シリカゲル60プレート(Merck)に、CAMAG (Muttenz, Switzerland)からのオートマチックTLCサンプラー4を用いて噴霧した。ロードする容量は、脂質抽出用の粗ホモジネートのタンパク質濃度について標準化した。異なる量(0.5〜8μg)の脂質スタンダード(コレステロール、スフィンゴミエリン、スルファチド、全てのスタンダードはSigmaから)を、別のレーンにロードした。溶媒系としてC/M/H₂O 70：30：4を用いる薄層クロマトグラフィ(TLC)の後に、脂質をYao及びRastetter (33)に従って視覚化した。プレートを、平面スキャナ(UMAX Data Systems, Hsinchu, TaiwanからのPowerLook III)を用いてスキャンし、脂質のバンドの強度を、解析ソフトウェアAida 2.11 (Raytest, Straubenhardt, Germany)を用いて測定した。コレステロール、スフィンゴミエリン及びスルファチドの量は、バックグラウンド補正後のそれぞれのTLCのバンドの強度を表す任意の単位で示す。スチューデントのt検定を用いて、統計的分析を行った。

組織学
腎臓、脊髄及び脳を、潅流固定したマウスから解剖した。スルファチドの検出のために、組織切片(厚さ100μm)を、ビブラトームを用いて作製し、アルシアンブルー(Alcec Blue, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)と記載されているようにしてインキュベートした(Wittke, D.ら Acta Neuropathol. (Berl.)., 108, 261〜271)。組織学条件(pH 5.7、300 mM MgCl₂)は、スルファチドの特異的染色を保証するようなものであった(Scott, J.E.及びDorling, J. (1965), Histochemie, 5, 221〜233)。腎臓ブロックからのパラフィン切片をアルシアンブルーとの包埋前（pre-embedding）インキュベーションの後に作製した。坐骨神経及び腎臓の試料を、アルシアンブルーとの包埋前インキュベーションを行うか又は行わずに、セミシン切片を作製する通常の方法に従って、アラルダイト中に包埋した。

結果：
単回投与後のCHO-rhASAの薬物動力学及び生体内分布
ASAノックアウトマウスを、まず、尾静脈へのCHO-rhASAの単回注入により処置した。
循環からのrhASAクリアランスの速度を測定するために、酵素の血漿レベルを、体重kg当たり20又は40 mgの酵素の注入の後に異なる時間で分析した(図9A)。両方の用量について、血漿レベルは、注入後の最初の数分で最大に到達し、そこから下落した。投与した用量に関係なく、rhASAは、約40分間の半減時間（a half time）で血漿から浄化された。組織への摂取の動力学を評価するために、マウスを注入の後に異なる時間で潅流し、いくつかの器官をrhASA濃度について分析した。rhASAについての免疫反応性は、全ての組織において、40 mg/kgを用いて単回処置した10分後にはすでに検出可能であった(図9B及びC)。最高濃度の酵素を獲得した（下記を参照）肝臓において、酵素レベルはその後5時間以内に約4倍に増加し、その後、第14日まで、最大レベルの約4%まで下落した(図9B)。動力学は、腎臓、坐骨神経及び脳について類似していた(図9C)。組織特異的摂取速度間の違いに関係なく、酵素は、同等の時間経過のうちに全ての組織から排出された。よって、肝臓、腎臓、坐骨神経及び脳における免疫学的に検出可能なrhASAの半減期は、約4日程度であった(図9B及びC)。rhASAの最大濃度が、注入の5時間後に肝臓と脳との間で3桁を超えて異なることは、著しい(図9B及びC)。rhASAの生体内分布をより詳細に分析するために、ASAノックアウトマウスに増加する用量のrhASAを注入し、8日後に組織をELISAで分析した。酵素濃度のほぼ直線的な用量依存性の増加が、腎臓及び末梢神経において検出できた(図10A)。しかし、注入した酵素の大部分は、肝臓で見出された(図10Bにおいて20 mg/kgについて示す)。肝臓に比較すると、rhASA濃度は腎臓で約7%、脳で＜0.05%、並びに坐骨神経及び腕神経叢で12〜15%であった。これらの組織の異なる質量を考慮に入れると、回収可能な酵素の約97%が肝臓で、約3%が腎臓で、そして0.1%未満がCNS及び末梢神経で見出されたと計算できる。

CHO-rhASAの単回投与後のスルファチドレベルの減少
CHO-rhASA治療の治療能力を評価するために、ASAノックアウトマウスに、体重kg当たり40 mg CHO-rhASAの単回投与量を静脈内注入し、8日後に腎臓から脂質を抽出した。脂質抽出物についてのTLCにより、模擬処理コントロールに比べてスルファチドレベルの顕著な下落が明らかになった(図11A)。
スルファチド減少の時間依存性を、第二の実験において調べた。この目的のために、40 mg/kgの注射後の異なる時間で腎臓におけるスルファチドレベルを測定した(図11B)。スルファチドのかなりのクリアランスが注入の5時間後にすでに検出でき、減少の程度は第8日まで増加した。そのときには、過剰のスルファチドの約2／3が腎臓から浄化された。6日後に、スルファチドは再び出現し、残存平均スルファチドレベルは約22 %上昇した。スルファチド減少の用量依存性を測定するために、マウスを異なる投与量のCHO-rhASAで処置して8日後に分析した。10 mg/kgですでに、腎臓におけるスルファチド貯蔵のかなりの下落がもたらされた(図11C)。スルファチドクリアランスの程度は、投与量の増加と共に増大し、投与量とスルファチドの損失との間のほぼ直線的な関係が検出できた。

神経系の脂質異化作用についての酵素補充の影響を評価するために、種々に処置された動物からの脳全体、坐骨神経及び腕神経叢も分析した。老化した（aged）ASAノックアウトマウスでスルファチドレベルが約10倍に増加した腎臓(図11B及びC)に比べて、神経系ではスルファチドレベルのほぼ2倍の増加しか示さなかった(図12A〜C及び図13B〜D)。40 mg/kgの単回投与は、脳におけるスルファチドの貯蔵に効果を示さなかった(図12A)。しかし、40 mg/kgの投与後に、かなりの下落が坐骨神経(図12B)及び腕神経叢(図12C)で検出可能であった。また、10及び20 mg/kgの酵素レベルは、末梢神経において平均スルファチド貯蔵を減少させたが、コントロール組織に対する差異は統計的に有意ではなかった(図12B及びC)。

CHO-rhASAの反復投与後のスルファチド貯蔵の減少
末梢組織でのスルファチドレベルの減少における酵素の単回投与の予期せぬ高い効果は、反復注射の治療能力を評価する根拠を提供した。1週間に1回の20 mgのCHO-rhASA/kgの4回までの注射に基づく治療スケジュールを選択した。スルファチドレベルを、1、2、3又は4回の注射で処置されたマウスの腎臓、末梢神経及び脳において、最終の注射の8日後に分析した(図13)。

TLCにより、全ての末梢組織における注入の数が増えるにつれてスルファチドが段々に減少したことが示された。4回目の処置の後に、過剰のスルファチドの〜65%が腎臓及び腕神経叢から(図13A及びD)、〜82%が坐骨神経から(図13C)それぞれ浄化された。脳においては、1、2及び3回目の処置の後にスルファチドの下落は検出できなかった(図13B)。しかし、4回目の処置の後に、スルファチドレベルは平均で13%著しく減少した。このことは、脳から過剰スルファチドの30%のクリアランスを表す。

4回の注射で処置されたマウスの中枢神経系におけるスルファチドの減少を確かめるために、脳及び脊髄の組織学的分析を行った。模擬処置ノックアウトマウスのCNSの白質及び灰白質において、スルファチド貯蔵パターンは、ASAノックアウトマウスについて以前に記載されたパターンと同じであり(Wittke, D.ら Acta Neuropathol. (Berl.)., 108, 261〜271)、貯蔵物質の2つの形態学的種類を区別できた(図14)。大きい(＞20μm)沈着物は食細胞及びニューロンに典型的であり、小さい貯蔵顆粒は乏突起膠細胞の特徴である(図14C及びG)。食細胞は、以前に、活性ミクログリア細胞として同定されている(Hess B,ら (1996) Proc Natl Acad Sci U S A. 93(25):14821〜6)。食細胞とニューロンとにおける貯蔵は、ニューロンにおける親アルシアン性物質のより密でなく（less compact）かつより輪形状の見かけにより区別される(図14C挿入図)。rhASA-処理マウスの脳及び脊髄において、スルファチドは、白質及び灰白質の両方での食細胞から大きく浄化された(図14 A〜H)が、ニューロン及び乏突起膠細胞の染色は変化せず、模擬処置マウスのものと同じであった(脳について図14D及びHに示す)。

神経系とは別に、腎臓も組織学的に分析した。模擬処置マウスの腎臓は、以前に記載されたものと同じスルファチド貯蔵パターンを示した(Lullmann-Rauch, R.ら (2001),. Histochem. Cell Biol., 116, 161〜169)。貯蔵は、細い脚及び太いヘンレ係蹄上行脚において強く、遠位尿細管及び集合管（collecting ducts）において中ぐらいであった(図15)。4回の酵素注射の後に、貯蔵物質はほぼ完全に遠位尿細管から浄化され(図15J)、貯蔵は太い上行脚の上部において明らかに減少した(図15G)。しかし、細い脚及び集合管における貯蔵は持続し、模擬処置マウスのものに似ていた(図15B〜E)。

腎臓の分析は、野生型コントロールに比べて9ヶ月齢のASAノックアウトマウスにおいて、腎臓の湿潤重量が1.4倍に著しく増加したことを示した（データ示さず）。興味深いことに、酵素補充が減少し、増加した腎臓のサイズを部分的に標準化した。減少の程度は、3回目及び4回目の処置の後に統計的に有意であり(スチューデントのt検定、p＜0.05)、腎臓重量は、4回の注射の後に、正常の1.2倍に減少した（データ示さず）。第二の独立した実験において、12ヶ月齢のノックアウトマウスの平均腎臓重量は、野生型マウスに比べて1.5倍増加した（示さず）。これは、酵素の4回の注射のあとに、通常の1.1倍まで有意に(スチューデントのt検定、p＜0.05)減少した（示さず）。肝臓及び脳をコントロールとして秤量し、これらの器管について実験群間で大きい差異は検出できなかった（示さず）。

考察
注射したrhASAの全量の約30%を、40 mg/kgの静脈内注射の5時間後に解剖されたマウスの器官から回収することができた（示さず）。回収可能なフラクションのうち、90%より多くは肝臓に局在したが、腎臓及び末梢神経は、残りの酵素の大多数を共有した(図10B)。野生型マウスにおけるASA活性に関する以前のデータと比べると(Matzner U,ら (2000) Gene Ther. 7(14):1250〜7)、rhASA処置後の酵素レベルは、平均で通常の〜95倍(肝臓)、〜1.2倍(腎臓)、〜0.6倍(末梢神経)及び〜0.001倍(脳)であることが示唆された。

rhASAの1回の静脈内注射がすでに、腎臓及び末梢神経におけるスルファチド貯蔵の明白な時間依存性及び用量依存性の下落を導いた(図11)。このことは、ASAを用いるERTがインビボにおけるスルファチド貯蔵の減少に効果的であることの最初の証明である。明らかに、40 mg/kgの注射のすでに5時間後に、腎臓におけるスルファチド貯蔵のかなりの減少が検出できた(図11B)。処置の8日後に、貯蔵は最小限まで減少し、70%までの過剰のスルファチドが腎臓(図11B)及び末梢神経(図12B及びC)から消滅した。

TLCにおいて全腎臓でのスルファチドの平均濃度の著しい減少が証明されなかった以前の遺伝子治療実験に比べると(Matzner U,ら (2002) Gene Ther 9(1):53〜63)、貯蔵の減少の速度及び程度は驚くべきものである。2つの実験の違いは顕著である。なぜなら、移植により達成された腎臓におけるhASAの安定状態のレベルは、平均で通常の1.3倍であり、これは40 mg CHO-rhASA/kgの単回注射により達成された最大レベルと実質的に同じであったからである(上記を参照)。つまり、2、3日しか腎臓に存在しないCHO-rhASAは、過剰のスルファチドの2／3より多くを排除するが、約1年にわたって造血系の細胞により安定に発現される酵素は、同じ量でも平均貯蔵量を減少させなかった。酵素を発現する細胞の種類についての治療効果の依存性は、ヒトASAの生合成における細胞種特異的な違いを示す。細胞培養研究は、ヒトASAが造血系の細胞により非効率的にリン酸化されるが、CHO及びBHK細胞により効率的にリン酸化されることを示唆した(Muschol, N.ら 2002, Biochem. J., 368, 845〜853及び図7B)。しかし、リン酸化は、ASAノックアウトマウスにおける治療効果に対して重要であるとみられる。造血細胞によるヒトASAの低いリン酸化、及びCHO細胞による高いリン酸化は、骨髄幹細胞遺伝子治療の部分的な失敗及びASAノックアウトマウスにおける酵素補充治療の成功を説明するであろう。

単回投与実験は、貯蔵のクリアランスが一過性であり、スルファチドが処置後の第2週目に再蓄積したことを示した(図11B)。貯蔵の部分的な再蓄積は、内在化されたrhASAの限定された半減期（たった4日間程度であった）により説明できる(9B及びC)。スルファチドの再蓄積は、長期間にわたって貯蔵の減少を維持又は増強するために、反復酵素注射に基づくレジメンを必要とする。kg当たり20 mgのCHO-rhASAの反復処置は、末梢組織におけるスルファチド貯蔵の段階的な下落をもたらした(図13A、C及びD)。過剰のスルファチドの65%及び82%までが、4回の注射により腎臓及び末梢神経からそれぞれ排出されることができた。腎臓の組織学的分析は、皮質におけるスルファチド貯蔵の最も顕著な下落を証明した(図15)。ここで、遠位尿細管及び太いヘンレ系蹄上行脚の上部において、貯蔵はなくなったか又は大きく減少された。現在、なぜ、ネフロンのこれらのセグメントが他のセグメントよりもより明確にERTに応答するのかが不明である。おそらく、領域特異性が、rhASAをエンドサイトーシスする受容体の発現パターンにより決定される。

驚くべきことに、反復投与は、末梢組織だけでなくCNSにおいても貯蔵を減少させた。このことは、4回目の処置のあとに13%のスルファチドの下落を示した(図13B)脳脂質のTLCにより初めて証明された。しかし、CNS貯蔵の減少は、形態学的分析により、より明確に示される。脳及び脊髄の組織学は、CNSにわたって肥大スルファチド貯蔵食細胞の頻度が明らかに減少したことを証明した(脳幹について図14に示す)。よって、CNSにおけるスルファチドレベルの減少は、ニューロン又は乏突起膠細胞からよりはむしろ、主に、活性ミクログリア細胞を提示するこれらの食細胞からの脂質クリアランスによるとみられる(Hess B,ら (1996) Proc Natl Acad Sci U S A. 93(25):14821〜6)。クラッベ及びサンドホフ病の動物モデルにおいて、ミクログリアの活性化が、これらの関係するスフィンゴ脂質貯蔵疾患の病理に主要な役割を演じていることが最近示されている(Matsushima, G.K.ら (1994), Cell, 78, 645〜656., Wada, R.ら Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 10954〜10959)。ミクログリアの活性化は、2歳のASAノックアウトマウスにおいても顕著である(Hess B,ら (1996) Proc Natl Acad Sci U S A. 93(25):14821〜6)。ミクログリア細胞におけるスルファチド貯蔵の減少は、よって、他のグリア細胞及びニューロンからのスルファチドの検出可能なクリアランスがなくても、利益があると期待することができる。

血液脳関門は、循環からCNSへのrhASAの移動を妨げるので、脳は、4週間の処置期間の間に、通常の0.1%を超える酵素レベルを獲得しなかった(図9C及び10B及び示さず)。低い濃度のために、CNSに存在するアリールスルファターゼAは、食細胞からのスルファチドの観察されたクリアランスの全ての原因ではないようである。クリアランスに貢献し得る第二の機構は、CNSへの移入に先立っての食細胞への酵素のエンドサイトーシスに関する。しかし、CNS食細胞(すなわちミクログリア)の集合の大部分は、寿命の早期にCNSに移入してきたマクロファージ前駆細胞に由来する自律性の自己更新性（autonomous, self-renewing）細胞集団を示し、非神経組織に存在する血液の単球／マクロファージとは区別されると考えられている。3つ目の貢献し得る機構は、脳細胞から末梢細胞へのスルファチドの移出に関することにある。この移出の推進力は、末梢でのASAにより触媒されるスルファチドの加水分解による、CNSと末梢組織とにおけるスルファチド貯蔵の平衡の不均衡の増大であるようである。

実施例6：神経学パラメータの研究−ロータロッド研究
ASAノックアウトマウスは、神経伝導障害及びいくつかの神経学的症状を発生する。神経学パラメータに対する推定の治療効果を測定するために、ロータロッド性能を試験した。
以前の行動試験は、ゆっくり回転するロッド上で平衡を保つことについてのASAノックアウトマウスの進行性の欠損を証明した(D'Hooge, R.ら Brain Res., 907, 35〜43, Matzner U,ら (2002) Gene Ther 9(1):53〜63)。運動調整（motor coordination）に対する治療の効果を決定するために、マウスを、CHO-rhASAの1回目の注入の前及び3回目の注入の後にロータロッド実験により試験した。第一の実験において、約9ヶ月の平均齢のマウスを分析した。処置前の試験において、野生型マウスは40回の試験のうち32回で成功(80%)したが、（まだ処置していない）ASAノックアウトマウスの2つの群は、44回の試験のうち22回(55%)及び40回のうち25回(63%)で成功した(示さず)。つまり、ASAノックアウトマウスの行動欠損はすでに検出可能であるが、9ヶ月の齢では比較的穏やかであることがデータにより示された(D'Hooge,ら Brain Res., 907, 35〜43)。ノックアウトマウスの1群を20 mg CHO-rhASA/kgの3回の毎週の投与量で処置したあとに、同じ3群を〜4週後に再び分析した。1回目の試験に比べて、rhASA処置マウスの平均成功率は、27%向上して82%に達した。この群とは対照的に、野生型及び模擬処置コントロールは、それぞれ10%及び5%向上しただけであった(図16B)。よって、治療及びトレーニングの組み合わせにより、9ヶ月齢のASAノックアウトマウスは、同じ年齢のトレーニングしていない野生型マウスよりも高い頻度でロッド上にとどまる能力を獲得した。

より進行した運動調整障害に対する効果を調べるために、12ヶ月齢のマウス（上記より3ヶ月年上である）を、第二の実験において分析した。今回、処置前の成功したマウスのパーセンテージは、平均で43% (野生型コントロール)、18% (模擬処置用のASAノックアウトマウス)及び10% (rhASAでの処置用のASAノックアウトマウス)であった（示さず）。処置後に、65%の野生型コントロール及び13%の模擬処置ASAノックアウトマウスが成功した(図16C)。しかし、rhASA処置ノックアウトマウスの平均パーセンテージは、31%に増加した。よって、進行した調整障害を有する年上のマウスにおいても、CHO-rhASAの3回の投与により運動調整が実質的に改善されることができた。

実施例7：神経運動伝導速度についての研究
神経学パラメータについての推定の治療効果をさらに測定するために、坐骨神経の複合運動活動電位(CMAP)神経伝導を、確立された電気生理学的方法により麻酔下に研究した(Zielasek, J.ら Muscle Nerve, 19, 946〜952)。簡単に、複合運動活動電位(CMAP)を、くるぶしでの脛骨神経の遠刺激及び坐骨切痕での坐骨神経の筋刺激の後に、2本の針電極を用いて足の筋肉において記録した。統計学的分析を、スチューデントのt検定を用いて行った。

坐骨神経についての神経生理学的研究を、12月齢のマウスの4回目の処置の6日後に行った。遠刺激の後、年齢を合わせた野生型コントロール動物は、振幅（amplitude）19.0±1.7 mV (平均±SD、n=8)、潜伏時間（latency）0.84±0.11 msec及び持続時間（duration）3.3±0.36 msecの通常のCMAPを示した(図16A及び図17)。模擬処置ASA欠損動物は、平均振幅(15.6±3.9 mV、p<0.05)が有意に減少し、かつ持続期間(4.1±0.31 msec、p < 0.01)が有意に増加した、より密でない（less compact）運動応答を示した。平均潜伏時間及び神経伝導速度は、それぞれ0.81±0.09 msec及び45.4±8.8 m/secであり、野生型マウスのものと大きく違わなかった(図16A、図17及び示さず)。CHO-rhASAでの処置により、振幅は通常の値まで増加し(20.4±5.9 mV、p<0.05)、かつ持続時間は有意に減少した(3.8±0.35 msec、p<0.05)。つまり、坐骨神経の損なわれた伝導は、rhASAでの処置の後に実質的に標準化された。類似のデータが近刺激の後に得られ、別の一連の処置のマウスを用いる独立した実験において、データが再現された（データ示さず）。

電気生理学的パラメータの測定

結果
- ノックアウトマウスの電気生理学的パターンにおける以下の変化が、統計的に有意である（野生型vs模擬処置ノックアウト)：
・（遠刺激後の振幅の）持続時間が増加する
・遠刺激後の振幅（高さ）が減少する
・近刺激後の潜伏時間が減少する
・近刺激後の振幅（高さ）が減少する。

- 処理により、以下の統計的に有意な変化がパターンにおいてもたらされる（模擬処置ノックアウトvs rhASA処置ノックアウト）
・（遠刺激後の振幅の）持続時間が、通常の値の方へ減少する
・遠刺激後の振幅（高さ）が、通常の値の方へ増加する

(1) 振幅は、個別の軸策電位の結果（合計）である。もし全ての軸策電位が記録電極を同じ時点で通過するならば、振幅は短くかつ高いであろう。もし電位が異なる時点で該電極を通過するならば（いくつかの軸策は伝導が速く、他のものは遅いので）、振幅は広くかつ低いであろう。野生型マウスに比べて、ASAノックアウトマウスの振幅は、より平坦でかつ伸びている。

(2) 神経伝導速度の測定のために、刺激と振幅の開始との間の時間を測定する。この時間は、ノックアウトと野生型マウスとで実質的に同じである。ノックアウトマウスは、通常の伝導速度を有する神経線維を有すると結論付けることができる。

(1)及び(2)から、ノックアウトマウスは速伝導繊維（通常の神経伝導速度）を有するが、伝導速度が多少減少された（平坦で伸長された振幅）繊維の実質的なフラクションも有すると結論付けることができる。

処置は、持続時間及び振幅の高さの著しい改善をもたらす。未処置のASAノックアウトマウスの坐骨神経におけるCMAPの記録は、軸策繊維のサブセットの伝導が損なわれていることを示唆する。このことは、通常の神経伝導速度の存在下での著しく低くかつ広い振幅により示唆された(図16A及び図17)。処理により持続期間が減少し、平坦な振幅の高さが増加し、阻害効果の廃止を証明した。この修正効果は、パラノード軸策膠接合部（paranodal axoglial junctions）の機構及び軸策鞘に沿った電圧ゲート制御されるNa⁺及びK⁺チャネルにおけるスルファチドの重要な役割と関係するのだろう。組換え酵素に対する比較的短い曝露によりCMAPの変化を逆にする可能性は、MLDの治療に大きい意味を有するだろう。PNS症状はMLDの最終段階の前に現れるので、ERTは疾患の進行を実質的に遅らせ、生活の質を向上させるであろう。この考えは、疾患の早期及びより進行した段階の両方で運動調整の改善を示すマウスでのロータロッドにより支持される(図16B及びC)。

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(A) 連続細胞増殖系の概略図。(B) 精製方法の概説。 rhASAのイオン交換クロマトグラフィバッチ試験。 (A) 本発明による精製手順の工程(V)の完了後のrhASAのHPLC-クロマトグラム。(B) (A)のHPLCクロマトグラムの拡大。 rhASAと24時間インキュベーションした後に放射性標識したスルファチドをロードしたMLD-繊維芽細胞におけるスルファチドのクリアランス。 rhASAと6、24及び48時間インキュベーションした後に放射性標識したスルファチドをロードしたMLD-繊維芽細胞におけるスルファチドのクリアランス。 rhASAの静脈内注射の10分後のrhASAの血清レベル。 CHO-rhASAのインビトロ分析。(A) 天然(-)及び脱グリコシル化(+)酵素のSDS-PAGE。(B) ELISAにより分析されたBHK細胞によるM6P-依存性のCHO-rhASAのエンドサイトーシス。 (A) MALDI-TOF分析。(B) 低濃度のPNGアーゼFで処理したCHO-rhASA のMALDI-TOF分析。 ASA-欠損マウスの尾静脈への単回注射後のCHO-rhASAの薬物動態学。(A) 20 mg/kg (塗りつぶした丸、n = 9)又は40 mg/kg (白丸、n = 11)の注射後の最初の1時間での血漿中のrhASAレベル。(B) 40 mg/kgの投与後の種々の時間での肝臓におけるrhASAレベル。(C) ELISA (n = 3)により測定した、40 mg/kgを投与した後の腎臓(白いバー)、坐骨神経(斜線のバー)及び脳(塗りつぶしたバー)でのrhASAの組織動態学。 ASA-欠損マウスの尾静脈への単回注射後のCHO-rhASAの薬物動態学。(A) 異なる酵素投与量の注射の8日後のrhASAの組織レベル(n = 5)。(B) 20 mg/kgの注射の8日後のrhASAの相対的組織分布。 ASA-欠損マウスをCHO-rhASAで単回処理した後の組織からのスルファチドのクリアランス。(A) TLCによる腎臓脂質の分析。(B) 40 mg/kgの注射後の異なる時間での腎臓における脂質レベル(n = 3)。(C) 異なる用量の酵素を注射して8日後の腎臓における脂質レベル(n = 5)。 ASA-欠損マウスをCHO-rhASAで単回処理した後の組織からのスルファチドのクリアランス。(A) 40 mg/kgの注射後の異なる時間での脳における脂質レベル(n = 3)。(B) 異なる投与量の酵素を投与して8日後の坐骨神経における脂質レベル(n = 5)。(C) 異なる投与量の酵素を投与して8日後の腕神経叢における脂質レベル(n = 5)。週1回の20 mg CHO-rhASA/kgの反復投与の後の(A) 腎臓、(B) 脳、(C) 坐骨神経及び(D) 腕神経叢における脂質レベル。アルシアンブルーを用いるインキュベーションにより組織化学的に証明されるCNSにおけるスルファチドの貯蔵。 100μmの切片をアルシアンブルーとインキュベーションすることにより組織化学的に証明される腎臓におけるスルファチドの貯蔵。週1回の20 mg CHO-rhASA/kgでの反復投与の機能的効果。(A) 野生型マウス(塗りつぶしたバー)、模擬処理ASAノックアウトマウス(白いバー)及びCHO-rhASAの4回の注射の6日後のASAノックアウトマウス(斜線のバー)で測定された神経生理学パラメータ。(B) 平均齢約9 mo (9.2±1.1 mo)のマウスのロータロッド（Rotarod）性能。(C) 平均齢12 mo (11.8±1.1 mo)のマウスのロータロッド性能。神経運動伝導についての研究からの電気生理学的パラメータの表示(図16のパネル(A)に部分的に相当する)。

Claims

i) アリールスルファターゼAを産生可能な哺乳動物細胞を液体培地中で1つ以上のバイオリアクタを含む系において培養し；
ii) アフィニティクロマトグラフィ及び／又はイオン交換クロマトグラフィの1以上の工程を含む精製方法によりrhASAを濃縮し、精製して調剤する
ことを含む連続細胞培養系で組換えアリールスルファターゼAを産生する方法。
前記哺乳動物細胞が：
(a) 配列番号2のアミノ酸配列；
(b) 組換えヒトアリールスルファターゼAと酵素的に等価な(a)の配列の一部分；
(c) (a)又は(b)の配列のいずれか1つと少なくとも75%の配列同一性を有しかつ同時に組換えヒトアリールスルファターゼAと酵素的に等価であるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列アナログ
をコードする核酸配列を含む請求項1に記載の方法。
アリールスルファターゼA又はその等価物が、低濃度のPNGアーゼFを用いる処理の後にMALDI-TOF分析により測定して4つのグリコシル化中間体を有する酵素のグリコフォームを含む産物をもたらす割合及び条件下で産生される請求項1又は2に記載の方法。
アリールスルファターゼA又はその等価物の炭水化物部分が、3〜8 kDaの複合質量を有する請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
アリールスルファターゼA又はその等価物が、マンノース-6-ホスフェート受容体媒介進入を介する酵素の効率的なエンドサイトーシスを許容するようにリン酸化された、高マンノース及び／又は複合オリゴ糖のパターンを有する酵素のグリコフォームを含む産物をもたらす割合及び条件下で産生される請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
アリールスルファターゼA又はその等価物が、配列番号2のCys-69に対応するアミノ酸が配列番号3のFgly-51に対応するホルミルグリシンに変換された酵素のアイソフォームを含む産物をもたらす割合及び条件下で産生される請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
産生されるアリールスルファターゼAが：
(a) 配列番号3のアミノ酸配列；
(b) 組換えヒトアリールスルファターゼAと酵素的に等価な(a)の配列の一部分；
(c) (a)又は(b)の配列のいずれか1つと少なくとも75%の配列同一性を有しかつ同時に組換えヒトアリールスルファターゼAと酵素的に等価であるアミノ酸配列アナログ
からなる群より選択される請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
前記哺乳動物細胞が、ヒト又は霊長類を起源とする請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法。
ii)の濃縮及び精製方法が、膨張層クロマトグラフィの1以上の工程を含む請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
ii)の濃縮及び精製方法が、アリールスルファターゼAがアフィニティクロマトグラフィ樹脂若しくはメンブレン及び／又はカチオンクロマトグラフィ樹脂又はメンブレンを通過する受動工程と、アリールスルファターゼAがアニオン交換メンブレン又は樹脂の内部にとどまりかつその後そこから溶出される能動工程とを含む洗練工程を含む請求項1〜9のいずれか1つに記載の方法。
ii)の濃縮及び精製方法が、次の工程：
II) アリールスルファターゼA含有上清を平衡化したクロマトグラフィカラムと接触させ、アリールスルファターゼAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出し；
III) 工程IIからのフラクションを別の平衡化したクロマトグラフィカラムにロードして、アリールスルファターゼAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出し；
IV) タンジェンシャルフローろ過により工程IIIからのフラクションに存在するアリールスルファターゼAのバッファー交換を行い；
V) 工程IVからのアリールスルファターゼAの調製物を、各工程が該調製物を平衡化したクロマトグラフィカラムにロードして、アリールスルファターゼAを含有する1つ又はそれより多いフラクションを溶出することを含む1又は2以上の連続工程において洗練し；
VI) 工程Vからのフラクションをウイルス低減フィルタに通過させ；
VII) 適切な調剤バッファー中でアリールスルファターゼAの調製物を得るために工程VIからのフラクションを調剤し；
VIII) 任意に、アリールスルファターゼAの調剤された調製物を適切な容器に充填し、試料を凍結乾燥する
を含む請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。
タンジェンシャルフローろ過によりアリールスルファターゼAを濃縮する最初の工程I)をさらに含む請求項11に記載の方法。
精製方法の工程IIで用いられるクロマトグラフィカラムが、アニオン交換カラムである請求項11又は12に記載の方法。
前記アニオン交換カラムが、DEAE Sepharoseカラム又はDEAE Streamlineカラムである請求項13に記載の方法。
精製方法の工程IIIで用いられるクロマトグラフィカラムが、疎水性相互作用カラムである請求項11〜14のいずれか1つに記載の方法。
精製方法の工程IVの試料の精製が、タンジェンシャルフローろ過により達成される請求項11〜15のいずれか1つに記載の方法。
洗練工程で用いられる前記カチオンクロマトグラフィメンブレン又は樹脂及び前記アニオン交換メンブレン又は樹脂が、連続して接続される請求項10〜16のいずれか1つに記載の方法。
精製方法の工程VIで行われるような試料のろ過が、精製方法の好ましくは工程Vの前又は好ましくは工程IIの前に、試料を界面活性剤と接触させることで置き換えられるか又はそれと組み合わされる請求項11〜17のいずれか1つに記載の方法。
請求項1〜18のいずれか1つに記載の方法により得ることができるか又は得られるアリールスルファターゼAの製剤。
逆相HPLCにより測定して少なくとも98%の生理活性アリールスルファターゼAを含む請求項19に記載の製剤。
前記アリールスルファターゼAが、少なくとも20 U/mg、好ましくは50 U/mgの比活性を有する請求項19又は20に記載の製剤。
a) アリールスルファターゼAを中枢神経系へ送達するためのビヒクル、例えばペプチド又はポリペプチド、
b) 血液脳関門の開放又は破壊を引き起こすことができる成分、
c) 無損傷の細胞
を含まない請求項19〜21のいずれか1つに記載の製剤。
請求項1〜18のいずれか1つに記載の方法により得ることができる、医薬として使用するためのアリールスルファターゼAの有効量を含む製剤。
異染色性白質ジストロフィーに罹患しているか及び／又はそれと診断された対象における末梢神経系及び／又は中枢神経系の細胞内のスフィンゴリピド3-O-スルホガラクトシルセラミドのレベルを低減させるための医薬として使用するための請求項23に記載のアリールスルファターゼAの製剤。
アリールスルファターゼAの有効量を含む製剤の、異染色性白質ジストロフィーに罹患しているか及び／又はそれと診断された対象における中枢神経系の内部の細胞でのガラクトシルスルファチドのレベルを低減させるための医薬を製造するための使用。
アリールスルファターゼAの有効量が、前記製剤の静脈内投与に続いて：
a) 酵素の有効レベルが循環中で8日以上維持され、及び／又は
b) 酵素の有効レベルが内臓、坐骨神経及び腕神経叢で8日以上維持され、及び／又は
c) 酵素の有効レベルが肝臓で8日以上維持される
ようなものである請求項25に記載の使用。
アリールスルファターゼAの有効量が、毎週、2週間毎又は毎月のベースでの前記製剤の反復静脈内投与により：
a) 酵素の有効レベルが循環内で維持され、及び／又は
b) 酵素の有効レベルが内臓、坐骨神経及び腕神経叢で維持され、及び／又は
c) 酵素の有効レベルが肝臓で維持される
ようなものである請求項25又は26に記載の使用。
前記アリールスルファターゼA製剤が、請求項19〜24のいずれか1つに記載の製剤である請求項25〜27のいずれか1つに記載の使用。
有効量が、体重1 kg当たり酵素5〜100 mgのアリールスルファターゼAの投与量に相当する請求項25〜28のいずれか1つに記載の使用。
アリールスルファターゼAが、少なくとも50 U/mgの比活性を有する請求項25〜29のいずれか1つに記載の使用。
前記医薬が、スフィンゴリピド3-O-スルホガラクトシルセラミドのレベルの低減のために：
a) 酵素(アリールスルファターゼA)を中枢神経系へ送達するためのビヒクル、例えばペプチド又はポリペプチドを含む製剤の投与と、
b) 血液脳関門の開放又は破壊を引き起こすことができる製剤の投与と、
c) 無損傷の細胞の投与と
を含む他の医学的治療のいずれも受けない対象への投与用である請求項25〜30のいずれか1つに記載の使用。
請求項1〜18のいずれか1つに記載の方法により得られるか又は得ることができるアリールスルファターゼAの製剤を対象に投与し、それにより該対象の内部の細胞におけるガラクトシルスルファチドのレベルの低減を得ることを含む、スフィンゴリピド3-O-スルホガラクトシルセラミドの増加したリソソームでの貯蔵に関係する疾患の症状を治療／緩和する方法。
前記細胞が、末梢神経系内部の細胞及び／又は中枢神経系内部の細胞である請求項32に記載の方法。
前記アリールスルファターゼAの製剤の、脳室内、脊髄、鞘内又は頭蓋内投与以外の経路による投与を含む請求項33に記載の方法。
前記アリールスルファターゼA製剤が、請求項19〜24のいずれか1つに記載の製剤である請求項32〜34のいずれか1つに記載の方法。