JP2021518576A - 顕微鏡において光路を操作する方法および装置、顕微鏡においてスタック画像を撮影する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、顕微鏡（１）、特にライトシート顕微鏡（５）において少なくとも１つの光路（８）を操作する方法、顕微鏡（１）、特にライトシート顕微鏡（５）においてスタック画像（２２４）を撮影する方法、顕微鏡（１）、特にライトシート顕微鏡（５）において少なくとも１つの光路（８）を操作する装置、および不揮発性の機械可読記憶媒体（１６３）に関する。従来技術による構成は、どの浸漬媒体（２３）を用いても試料（２１）を観察することができるというわけではなく、この方法はさらに、小さな開口数（ＮＡ）を有する光学ユニット（９）に限定されている、という欠点を有している。本発明による方法は、以下の方法ステップ、すなわち：−サンプルボリューム（１７）内に配置された試料（２１）および／またはサンプルボリューム（１７）内に配置された光学媒体（３５）の屈折率（ｎ）を検出するステップ；および−検出した屈折率（ｎ）に応じて少なくとも１つの顕微鏡パラメータ（２）を調節し、光路（８）を操作するステップにより、従来技術による構成を改良する。

Description

本発明は、顕微鏡、特にライトシート顕微鏡において少なくとも１つの光路を操作する方法、顕微鏡、特にライトシート顕微鏡においてスタック画像を撮影する方法、顕微鏡、特にライトシート顕微鏡において少なくとも１つの光路を屈折値に応じて操作する装置、および不揮発性の機械可読記憶媒体に関する。

従来技術において目下周知のいわゆる透明化法は、浸漬媒体中の試料を撮影することを可能にするものであり、この場合、浸漬媒体がその屈折率に関して被検試料に適合され得るか、または試料の屈折率が均一化され得る。後者の方法では結果的に、試料の屈折率が媒体の屈折率にも適合されるわけではない。このような、アルコールまたは糖を基礎とし得る浸漬媒体は、多数（２０超）知られている。生きている試料の検査は、この方法では不可能である。それというのも、例えば脂肪の除去により、試料が大幅に化学変化させられるからである。

他方では、屈折率が被検対象に相応する媒体中に、生きている細胞および生物を埋め込むという試みも存在する。それぞれ屈折率が異なる上に、相応する溶媒との混合比も異なる複数の浸漬媒体が使用され得る。その結果、大きな変動が生じ、特に目下使用中の浸漬媒体の屈折率に関する不確実性が生じることになる。

しかしながら浸漬媒体の屈折率は、収差、特に焦点はずれおよび球面収差の発生の大きな原因になる。屈折率に応じたこれらの影響は、顕微鏡写真を悪化させる恐れがある。

浸漬媒体中の試料の検査にいわゆるライトシート顕微鏡が使用される場合、考慮されない屈折率は、検出光学系の焦点面が、浸漬媒体および／または試料の屈折値に基づく屈折の差に基づきずらされ、これにより検出光学系の焦点面がもはや、照射レンズにより発生させられるライトシート（すなわち二次元の照射平面）と一致しなくなる、ということを招く恐れがある。つまり、ライトシート顕微鏡における焦点はずれは、撮影される画像の重大な質の低下を惹起する恐れがある。

この理由から、従来技術において周知の、画像に基づく反復アルゴリズムもしくはこの反復アルゴリズムに基づく方法は、画像の質から出発して少なくとも１つの顕微鏡パラメータの変更を行い、このようにして近似法で、生じる可能性のある収差を補償することができる。

従来技術による透明化法では予防的に、好適には開口数（ＮＡ）の小さな複数の対物レンズが使用される。それというのも、ＮＡが小さなこれらの対物レンズでは、上記の収差を無視することができるからである。例えば単一の対物レンズを使用するため、照射光路と検出光路の両方が同じ「方向」への、すなわち同じ符号を有する収差の影響を受ける共焦点顕微鏡法の場合も、前記収差は無視することができる場合がある。ただし、ＮＡの大きな複数の対物レンズも使用可能であり、これらの対物レンズを用いてより高い分解能を達成し、試料から出る光をより効率的に検出することができるようにする、ということが望ましい。

よって本発明の課題は、任意の浸漬媒体中の試料を観察し、観察に際してＮＡの大きな複数の対物レンズを使用可能にすることにある。

前記課題は、本発明による、少なくとも１つの光路を操作する方法に基づき、以下の方法ステップにより解決される。すなわち：
−サンプルボリューム内に配置された試料および／またはサンプルボリューム内に配置された光学媒体の屈折率を検出するステップ；および
−検出した屈折率に応じて少なくとも１つの顕微鏡パラメータを調節し、光路を操作するステップ。

冒頭で述べた、顕微鏡においてスタック画像を撮影する方法は、当該方法が以下の方法ステップを含んでいることにより、前記課題を解決する。すなわち：サンプルボリューム内に配置された試料および／またはサンプルボリューム内に配置された光学媒体の屈折率を検出するステップ；光学ユニットに対する試料の位置変化を検出しかつ／または少なくとも１つの顕微鏡パラメータを調節する前に励起波長の変化を検出するステップ；および検出した屈折率に応じて少なくとも１つの顕微鏡パラメータを調節し、光路を調節するステップ。

冒頭で述べた本発明による装置は前記課題を、当該装置が試料の屈折率および／またはサンプルボリューム内に配置された光学媒体の屈折率を検出する屈折率検出モジュール；および少なくとも１つの光路を操作するために検出された屈折率に基づき少なくとも１つの顕微鏡パラメータを調節する、少なくとも１つの光路マニピュレータを有していることにより解決する。

冒頭で述べた、不揮発性の機械可読記憶媒体には、本発明による方法を実施するプログラムが含まれており、これにより、前記課題が解決される。

つまり本発明による方法、本発明による装置および該方法を実施する、本発明による不揮発性の機械可読記憶媒体は、これらが、試料および／または浸漬媒体の屈折率に基づく、顕微鏡の少なくとも１つの光路の迅速で、試料を傷めない、確定的かつ非反復的な操作を可能にするという利点を有している。

本発明による方法、本発明による装置および本発明による不揮発性の機械可読記憶媒体は、それぞれ特有の構成により、さらに改良され得る。この場合、本発明の構成の個々の技術特徴は、互いに任意に組み合わされてよくかつ／または、省略される技術特徴により得られる技術効果が重要でない限りは省略されてよい。

本発明による方法は、少なくとも１つの光路のほぼ任意の操作に用いることができるが、特に、試料および／または光学媒体により導入される少なくとも１つの結像誤差を補償するためにも使用され得る。

従来技術に基づく構成に比べ、上述した本発明による方法、本発明による装置および本発明による記憶媒体は、試料および／または試料を包囲する浸漬媒体の屈折率が、自動で測定され得ると共に、測定された屈折率に基づき、すなわち反復法に基づかず確定的に、特に画像の撮影無しで定量的に得られる、という利点を有している。このために、試料がサンプルボリューム内に配置されていることは不要であり、これにより、本発明による方法もしくは本発明による装置が試料を傷めることはない。さらに、本発明による方法は非接触式である。

浸漬媒体とは、サンプルボリューム内で特に試料を包囲するようにこのサンプルボリューム内に存在し得る全ての媒体を意味する。浸漬媒体は同様に、試料と対応する対物レンズの前面レンズとの間の領域に存在していてもよい。

特にライトシート顕微鏡の操作されるべき光路は、例えば照射光路および／または検出光路であってよい。好適には、照射および検出用の２つの光路を操作して、特に各光路に生じる収差を補償することができる。

光学媒体とは、顕微鏡において使用される１つまたは複数の波長に関して透過性でありかつこの波長に関して特徴的な、屈折率および散乱等の光学特性を有する物質を意味する。光学媒体には特に、限定はしないがアルコールまたは糖に基づく前記浸漬媒体が含まれていてよい、しかしまた、水、グリセリンおよび空気も含まれていてよい。よって、本発明による方法もしくは本発明による装置は、浸漬媒体無しでも有効である（対物レンズは空気中に位置している）。

本発明による方法の１つの簡単な構成は、サンプルボリューム内に配置された試料および／またはサンプルボリューム内に配置された光学媒体の屈折率の検出に、ユーザによる、相応する値の入力の方法ステップが含まれることにより達成され得る。このような構成では、ユーザは例えば所与の浸漬媒体の選択リストから屈折率を選択することができるか、またはユーザが規定した屈折率を入力することができる。つまり、既に初めに使用されたひいては既知の浸漬媒体を用いて測定を繰り返す場合には、まさにこの浸漬媒体に対する適合を速めることができる。

１つの別の構成では、スタック画像を撮影する方法に、以下のステップが含まれていてよい。すなわち：（８ａ）第１の光学ユニットの焦点面を事前に調節した走査距離だけ移動させるステップ；（８ｂ）顕微鏡における光路を操作する本発明による方法の１つの構成に基づき、第１の光学ユニットの少なくとも１つの光路を操作して、第１の光学ユニットの結像誤差を補正するステップ；および（８ｃ）方法ステップ（８ｂ）で検出した屈折率に応じた追従距離だけ、第２の光学ユニットの焦点面を移動または追従させるステップ。

当該方法の１つの有利な構成では、当該方法には、スタック画像を生じさせるための画像の撮影および／または記憶が含まれていてよい。特に、スタック画像を形成するｎ個の画像が撮影されかつ／または記憶されてよい。好適には、結像誤差が補正された、すなわち各光路を操作した後の、スタック画像の全ての画像の撮影が行われる。

上述した、スタック画像を撮影する方法は、１つの別の構成では、方法ステップ（８ｃ）において追加的に、顕微鏡における光路を操作する本発明による方法の１つの構成に基づき、第２の光学ユニットの少なくとも１つの光路を操作して、第２の光学ユニットの結像誤差を補正するステップが実施されることにより改良され得る。これにより、顕微鏡において照射光路と検出光路の両方が、未知の媒体、特にその屈折値に適合され得る。

スタック画像を撮影する、本発明による方法の１つの別の可能な構成では、方法ステップ（８ａ）、（８ｂ）および（８ｃ）が、変更された形態で繰り返されてよい。つまり、第１の光学ユニットの少なくとも１つの光路を操作する方法ステップ（８ｂ）において、方法ステップ（８ａ）〜（８ｃ）の二巡目には屈折率を新規に検出しない、ということが可能である。よって、変更された方法ステップ（８ｂ）’は、検出した屈折率に応じて少なくとも１つの顕微鏡パラメータを調節し、光路を操作する方法ステップのみを有しているに過ぎない。このような場合、屈折率は一巡目の方法ステップ（８ｂ）において検出された。このことは、スタック画像の撮影に際して、第１の画像の撮影用にのみ屈折率の検出が行われるに過ぎないのに対し、スタック画像の別の画像の撮影は、（既に検出された）屈折率のさらなる検出を必要としない、という利点を有している。このことは、スタック画像の撮影を速めることができる。

方法ステップ（８ｃ）の後に、好適には画像の撮影がｎ回行われ、この場合のｎは、スタック画像の画像総数を表す。

特に方法ステップ（８ａ）、（８ｂ）および（８ｃ）の実施後に、スタック画像の所望の画像数に従って方法ステップ（８ａ）、（８ｂ’）および（８ｃ）が任意の頻度で（ｎ回）繰り返されてよい。この場合は必ずしも、各画像撮影の前に屈折率の検出が繰り返される必要はない。

ただしスタック画像を撮影する方法の１つの別の構成では、各方法ステップ（８ａ）、（８ｂ）および（８ｃ）を、撮影されるべき画像の予め規定された数に従って任意の頻度で実施することができ、この場合は方法ステップ（８ｃ）の後にその都度画像撮影が行われてよい。本発明による方法のこの構成は、好適には大きな（もしくは検出可能な）屈折値勾配を有する試料において使用され得る。これにより、撮影される全ての平面に場合により生じ得る結像誤差を補正することができる。

スタック画像を包囲する体積の内部の屈折値変化が無視可能である場合には、方法ステップ（８ｂ）において屈折率を一度だけ検出することにより、当該方法を速めることができる。それというのも、引き続く各画像撮影のために屈折率の検出を繰り返す必要がないからである。

スタック画像を撮影する、本発明による方法の１つの別の構成では、ユーザが試料を顕微鏡に入れるとすぐに、最初の画像検出の前に屈折率を検出することができる。この場合は様々なトリガ、例えば新規の投影がユーザにより設定されるとすぐにコンピュータにより発動されるトリガが考えられる。同様に、測定も手動でトリガされ得る。このことは、特に好適には、ユーザが、試料における方向付けのためかつプレビューに基づき測定（すなわちスタック画像の撮影）を実施するために必要なプレビュー画像を見る前に行うことができる。すなわち、補正は既に方向付けの段階の最中に、つまり本来の測定（スタック画像の撮影）の前に行われる。この方向付けの段階において検出された屈折率の値は、スタック画像を撮影する方法用に引き継ぐことができるため、当該方法のこの構成では、屈折率の別個の検出はもはや不要である。

よって当該方法は、屈折率を測定しかつ記憶する方法ステップを含み、この場合、屈折率は複数の異なる励起波長および／または非励起波長に関して測定されかつ／または記憶されてよい。測定において、これらの屈折率の記憶された値は、有利には光学ユニット用に記憶された較正データと共に、以下の利点を有していてよい。すなわち：
−例えば被撮影面の位置が試料に対して相対的に変化した場合または励起波長が変化した場合の、照射光学系の焦点の維持
−検出光路内に屈折率の飛躍が存在する場合に撮影される各画像間の空間距離が正しい状態での、スタック画像の撮影
−補正環付きの光学ユニットを使用した、残存誤差の補償
−前記結像誤差の補正。

つまり、スタック画像を撮影する方法のこのような構成には、以下の方法ステップが含まれていてよい。すなわち：
ｂ１ 屈折率を測定しかつ／または記憶するステップ；
ｂ２ 光学ユニット（例えば照射光学系および／または検出光学系）に対する試料位置の変化を検出しかつ／または励起波長の変化を検出し、方法ステップ（ｂ１）において記憶した測定値および／または予め記憶された較正データを読み出すステップ；および
ｂ３ 検出した屈折率に応じて少なくとも１つの顕微鏡パラメータを調節し、光路を操作するステップ。

好適には、方法ステップ（ｂ２）は前記各変化のうちの１つと同時に、または変化が生じた後に初めて実施され得る。

本発明による方法の１つの別の構成では、検出した屈折率に応じて焦点位置を、以下の方法ステップのうちの少なくとも１つを用いて調節することができる。すなわち：−少なくとも１つの対物レンズの有効焦点距離を変更するステップ；または−少なくとも１つの対物レンズを、該対物レンズのその時々の光軸に沿って移動させるステップ。

これにより、本発明による方法を用いて試料を移動させることが可能であり、この場合、この移動に際して、試料が埋められた浸漬媒体と、照射光学系もしくは照射レンズの前に存在する媒体、例えば空気との間の境界面も移動させられる。第２のステップにおいて、照射光路をその焦点位置に関して操作し、場合により生じる結像誤差を補正することができる。この場合、特に好適には、画像フィールド内の焦点の位置は、不変の位置に留まっていてよい。境界面の位置変化により、既に補正された結像誤差が変化し、これにより当該方法による再補正が必要になる場合がある。

検出光学系と試料との間に、異なる屈折率を有する媒体が存在する場合（例えば照射レンズと検出レンズとの間に位置するキュベット内に配置されている場合）、当該方法はこの別の境界面に、追加的に検出光路がその焦点位置に関して操作され得るようになっていることにより適合され得、この場合、検出光路のこの操作には、検出光学系の結像誤差の補正も含まれていてよい。

この構成は、顕微鏡を、試料自体の屈折率および／または試料を包囲する浸漬媒体に適合させるために、焦点位置の操作を利用することができる、という利点を有している。特に、未知の屈折率により惹起される収差の補償が可能である。特に有利なのは、ライトシート顕微鏡における焦点位置のこのような調節である。それというのもライトシート顕微鏡では、検出レンズの焦点面と照射レンズの照射面とが重なり合うことができるようになっておりひいてはライトシートにより照明される二次元の領域の鮮明な画像が入手可能であるということが保証され得ると有利だからである。

よって、少なくとも１つの対物レンズの有効焦点距離および焦点位置は、可能な顕微鏡パラメータを意味する。これらのパラメータのうちの少なくとも１つは、相応の装置において光路マニピュレータにより調節され得る。

本発明による方法の１つの別の構成では、検出した屈折率に応じて光路を操作することにより、光軸までの距離に応じた光路の光路長の変化による球面結像誤差を補正することができる。

球面結像誤差は、特に光束の非近軸光線に関して発生し、光軸からの距離と共に増大する。よってこの構成により、約１ｃｍ^３以上の体積を有する試料サイズにおいて、光学系をほぼ完全に照明しかつその開口を使用することが可能である。

本発明による方法の１つの別の構成では、このような球面結像誤差を部分的にのみ補償するか、またはそれどころか過補償することもできる。

上述した本発明による方法の１つの特有の構成では、光路長の変化に、少なくとも１つの反射ミラー部分の移動および／または変形可能な透過性媒体の境界面の移動が含まれていてよい。

特に、さらに詳述する１つの構成では、光路長の変化は、ｒ^２およびｒ^４の重み付けがそれぞれ規定された関数関係ｒ^２およびｒ^４の重ね合わせに基づき生じてよく、この場合、ｒは光軸までの距離に相当する。

換言すると、本発明による方法では、光路長（すなわちそれぞれに各部分長にわたり支配的な屈折率を乗じた個々の幾何学的な部分長の和）を、光軸までの距離に応じて（すなわちｒに応じて）増大または減少させることができる。

光路長の変化はΔｘで表すことができ、特に数学的な表現Δｘ＝Ａ＊ｒ^２＋Ｂ＊ｒ^４により表すことができる。この場合、ｒは観察される光学系の瞳における光軸までの距離であり、ＡもしくはＢは、二次もしくは四次（四乗べき）成分の重み付けを可能にする、自由選択可能な前因子である。つまりこの数学的な表現により表される光路長の変化は、未知の屈折値の媒体および／または試料において発生する球面収差を補償するために利用され得る。３次の球面収差は、（ゼルニケ多項式を用いて収差を表す場合）二次および四次成分により表される。３次の球面収差は、この構成の本発明による方法もしくは本発明による装置により補償され得る。

本発明による装置の相応する構成では、光路マニピュレータは、以下の群のうちの少なくとも１つの部材、すなわち：（ａ）電気的に調節可能な焦点距離を有する光学素子；（ｂ）少なくとも１つの光学ユニットを移動させるためのアクチュエータモジュール；（ｃ）補正環；（ｄ）補正板を光路に入れるための補正板モジュール；（ｅ）補正環が装備された対物レンズ；（ｆ）変形可能なミラー；および（ｇ）少なくとも１つの透明な入射面および／または出射面を備えた、透明な液状媒体で満たされた中空部材を有していてよく、この場合、少なくとも１つの透明な入射面および／または出射面は変形可能である。

部材（ａ）、（ｆ）および部材（ｇ）は、少なくとも１つの対物レンズの有効焦点距離を変化させるように形成されていてよい。部材（ｂ）は、少なくとも１つの対物レンズを、対物レンズのその時々の光軸に沿って移動させるように形成されていてよい。

部材（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、光路に球面収差を生じさせるように、すなわち特に球面収差を既に有する光路を、逆方向の球面収差により補正するように形成されていてよい。

部材（ｆ）および（ｇ）は、光軸までの距離に応じた光路長の変化を導入するためにも、（追加的または択一的に）対応する対物レンズの有効焦点距離を変更するためにも使用され得る。

部材（ａ）の特別な構成は、電気的に調節可能なレンズ（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｔｕｎａｂｌｅ ｌｅｎｓ；ＥＴＬ）であってよく、部材（ｄ）は、特に球面収差および／または焦点はずれを補正するための補正板を光路に入れることができる。

部材（ａ）、（ｂ）、（ｆ）および（ｇ）は、可変に調節可能でありひいては本発明による装置のもしくは本発明による方法の使用の、より大きなフレキシビリティを可能にする。特に部材（ｇ）でもって、入射面および／または出射面が変形されてよく、これにより、入射面および／または出射面の半径方向の厚さ断面は、ｒ^２およびｒ^４の重み付けがそれぞれ規定された関数関係ｒ^２およびｒ^４の重ね合わせに相当し得る。

前記部材（ａ）〜（ｇ）は、ダイナミックレンジ（すなわち可変の光路長の範囲）においても、その速度においても異なるため、有利には様々な光路マニピュレータが互いに組み合わされてよい。つまり１つの可能な構成では、補正環（ｃ）による、基本的な結像誤差の低速補正が可能である。特にこの補正環により、特定の屈折率ｎへの補正が可能であり、この場合、前記低速補正は広範なダイナミックレンジで行われる。低速補正は、例えば部材（ｇ）と組み合わせられてよい。部材（ｇ）は、補正環と同じダイナミックレンジを有してこそいないが、残存誤差の大幅に迅速な補正を可能にする。このことは例えば、補正環が、使用された全ての物質の散乱を考慮するわけではなくひいては第２の成分により補償され得る残存誤差を有している場合に有利であり得る。

スタック画像を撮影する、本発明による方法の１つの有利な構成では、前記各部材を、スタック画像を撮影する方法の少なくとも１つの、好適には全ての方法ステップについて有利に使用することができる。つまり例えば、方法ステップ（８ａ）では検出光学系の焦点面を、変形可能なミラーを用いて移動させ、方法ステップ（８ｂ）でもやはり同一の変形可能なミラーが、検出光学系の光路を操作するために使用される。これにより、検出光学系の結像誤差を補正することができる。することができる。第２の光学ユニット、この場合は照射レンズの焦点面の追従は、別の変形可能なミラーを用いて行うことができる。択一的に、別の変形可能なミラーに代えて、傾斜ミラーが使用されてもよい。

本発明による方法は、光路を、波長に応じて以下の方法ステップ、すなわち：（Ａ）本発明による方法の１つの上述した構成に基づき、第１の波長の光の光路を操作するステップ；および（Ｂ）本発明による方法の１つの上述した構成に基づき、少なくとも１つの別の波長を調節し、この別の波長の光の光路をその都度順次操作するステップに基づき操作することにより、さらに改良され得る。

この方法の変化態様では、方法ステップ（Ｂ）において少なくとも１つの別の波長の調節が行われるだけに過ぎず、これにより別の波長においても、この別の波長の光の光路は、方法ステップ（Ａ）において第１の波長に関して測定された屈折率に基づき行われる。

同様に、本発明による方法の別の構成には、以下の方法ステップ、すなわち：（Ａ’）第１の波長の光に関して、サンプルボリューム内に配置された試料および／またはサンプルボリューム内に配置された光学媒体の屈折率を検出するステップ；（Ｂ’）少なくとも１つの別の波長を調節し、この第２の波長の光に関してその都度、サンプルボリューム内に配置された試料および／またはサンプルボリューム内に配置された光学媒体の屈折率を順次検出するステップ；（Ｃ’）本発明による方法の１つの上述した構成に基づき、第１の波長および少なくとも１つの別の波長の光の光路を操作するステップが含まれることも考えられる。

このような波長に応じた補正は、変形可能なミラーまたはＥＴＬ等の、波長とは無関係の典型的な補正部材を用いて行うことができる。これらの補正部材が使用される場合、補正は、補正環の使用とは異なり、一般に複数の波長のそれぞれ異なる色収差を同時に補正することはできない。このような場合、撮影は、異なる波長において連続して行われてよく、この場合、変形可能なミラーまたはＥＴＬ等の極めて高速の部材は、例えば１０ｍｓを大幅に下回るその切替え時間に基づき、連続撮影に場合により生じる時間損失を最小にすることができる。

ここで述べておくと、例えば屈折率が異なる複数の媒体への適合を可能にする補正環も、複数の異なる屈折率に関しては各１つの特定の散乱のみを補正することができる、つまり、水の場合にはｎ＝１．３３の約５００ｎｍの光波長（緑色光）でもってその散乱を補正することができ、グリセロールの場合にはｎ＝１．４２でもってその散乱を補正することができるが、異なる散乱を有する複数の物質のそれぞれの屈折率では補正することができない。同様に、それぞれの屈折率における分散が補正され得る、異なる屈折率を有する物質の数も限定されており、例えばｎ＝１．３３、ｎ＝１．３７、ｎ＝１．４１、ｎ＝１．４５等では、媒体のそれぞれ異なる散乱を補正することはできない。

当該方法では、特に（ユーザにより）予め規定された波長において屈折率を測定することができ、この測定後に波長に応じた補正もしくは操作が、少なくとも１つの光路、例えば照射光路および検出光路において行われてよい。

本発明による方法はさらに、当該方法を予め規定された時間間隔をあけて繰り返すということが想定されていることにより、改良され得る。

このことは特に、例えば蒸発に基づき屈折率の時間的な変化を考慮せねばならない試料および／または浸漬媒体にとって有利であり得る。この構成によりさらに、生きている試料の観察において、試料および／または試料を包囲する浸漬媒体の変化を検出し、相応に補正することができる。

対応する装置の１つの構成では、予め規定された時間間隔で、測定開始用および／または少なくとも１つの光路の操作用のスタート信号を出力するタイマモジュールが設けられていてよい。

本発明による方法の１つの別の構成では、試料および／またはサンプルボリューム内に配置された光学媒体の屈折率の検出に、以下の方法ステップが含まれていてよい。すなわち：
（ｉ）光学ユニットを用いてサンプルボリューム内に測定光を集束させ、このとき測定光は、光学ユニットの試料側において光学媒体および別の光学媒体を透過するステップ；
（ｉｉ）反射部材から反射されかつ別の光学ユニットまたは光学ユニットを透過した測定光を、検出器ユニットにより検出するステップ；
（ｉｉｉ）検出器により検出された測定光に基づき、光学ユニットと反射部材との間の作業間隔を検出し、作業間隔に関して、測定光の焦点をリフレクタに位置させるステップ；
（ｉｖ）以下のパラメータ、すなわち：
・光学ユニットと試料用媒体との間の間隔
・リフレクタと別の光学媒体との間の間隔
・測定光の発散
のうちの少なくとも１つを変化させ、この変化が、測定光の焦点位置の規定された間隔変化量をもたらすステップ；
（ｖ）方法ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）に基づき、別の作業間隔を検出するステップ；
（ｖｉ）作業間隔と別の作業間隔との間の作業間隔変化量を検出するステップ；および
（ｖｉｉ）間隔変化量および作業間隔変化量に基づき屈折値を検出するステップ。

この構成、特に試料の屈折率を検出する方法ステップの構成は、試料またはサンプルボリューム内の散乱媒体無しで屈折率を測定することができるということを可能にするため、有利である。

本発明による方法は、試料および／またはサンプルボリューム内に配置された光学媒体の屈折率を検出するために、択一的または追加的に、さらに以下の方法ステップを有していてよい。すなわち：
Ｉ．光学ユニットを介して、測定光をサンプルボリューム内へ、光軸に対して傾斜させて入射させるステップ；
ＩＩ．サンプルボリューム内で第１の位置に準備された反射部材において入射光を反射させるステップ；
ＩＩＩ．反射光を位置分解検出器に対して結像させるステップ；
ＩＶ．位置分解検出器における反射光の大きさおよび／またはずれに関して検出器により検出された信号を評価するステップ；
Ｖ．光軸に沿って反射部材を第２の位置へ移動させかつ方法ステップ（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を実施するステップ；および
ＶＩ．反射部材の第１および第２の位置に関する反射光の大きさおよび／またはずれに基づき屈折率を検出するステップ。

前記方法が方法ステップ（ｄ）までしか実施されない場合には、位置分解検出器における焦点の大きさが既に、光学ユニットの有効焦点面からの反射部材の間隔を表していてよい。この間隔は、媒体および／または試料の屈折率およびこの媒体および／または試料中を光が進む距離に左右される。

光学ユニットと反射部材との間に、対物レンズが合わせられた屈折率を有する媒体、例えば空気が存在していると、反射部材が焦点面内に位置しているときに、焦点は光軸上に位置することになる。このような測定は、較正に利用され得る。反射部材の移動に応じた、位置分解検出器における焦点の横方向移動は、屈折率を検出することを可能にする。

本発明による方法の１つの別の有利な構成にはさらに、較正データの読み出しが含まれており、この場合、検出された屈折率および／または読み出された較正データに応じて、少なくとも１つの顕微鏡パラメータの調節を行うことができる。

したがって本発明による装置の相応する構成は、メモリモジュールを有していてよく、メモリモジュールには、少なくとも１つの光学ユニットの較正データが記憶されていてよく、この場合、これらの較正データは制御ユニットにより呼出し可能である。

本発明による方法もしくは本発明による装置において較正データが記憶される場合、光学ユニットが有する、屈折率および波長に応じた球面誤差（または焦点はずれ）は既知である。補正値として記憶された屈折率もしくは球面誤差は、使用される補正部材、例えば補正環の調節に関連して記憶されていてもよい。つまり、補償に際してこれらの補正量を考慮することが可能である。これらのデータを、本発明による方法を用いて取得する可能性の他に、これらの部材固有の値は、「工場渡し」で一緒に納入されてもよい。それというのも部材固有の値は、（較正データに記憶された、波長および／または屈折値との関連性は別として）光学ユニットの不変の特性だからである。このような較正データは原則として、光学系、すなわち例えば顕微鏡において使用されるあらゆる光学素子に対して設けられていてよい、すなわちメモリユニット内に記憶されていてよい。

本発明による装置の制御ユニットはさらに、試料および／または浸漬媒体の屈折率を自動または手動で測定しかつ検出した屈折率に応じて顕微鏡における少なくとも１つの光路を操作し、光路を検出した屈折率に適合させるように形成されていてよい。特に好適には、光路の操作により生じる、焦点はずれまたは球面収差等の収差を補償することができる。つまり制御ユニットは、屈折率を検出しかつ少なくとも１つの光路マニピュレータを制御するように形成されていてよい。

同様に、不揮発性の記憶媒体を読み込むパーソナルコンピュータが、本発明による方法の方法ステップを制御し、例えば屈折率を算出することも可能である。従来技術に基づく顕微鏡は、コンピュータに基づく制御および／または評価手段を有することがますます増えているため、本発明による不揮発性の機械可読記憶媒体は特に有利である。それというのも、既存の顕微鏡を改良することを可能にするからである。一般に、従来技術に基づく顕微鏡はさらに、本発明による方法の実施に際して使用され得る、アクチュエータおよび補正環等の可能な光路マニピュレータの、既に特別な構成を有していてよい。

引き続き本発明の対象を、例示的な図面に基づきより詳しく説明する。図面には、本発明の有利な構成の例が示されており、この場合、各構成の技術特徴は、任意に互いに組み合わされてよくかつ／または、省略される各技術特徴により達成される技術効果が重要でない限りは省略されてよい。同一の技術特徴および同一機能の技術特徴には、見やすさのために同一符号を付してある。

従来技術によるライトシート顕微鏡を示す図である。 本発明による装置を示す図である。 本発明による装置、特に屈折値を測定する第１の測定法を示す図である。 本発明による装置、特に屈折値を測定する第１の測定法を示す図である。 第１の測定法により屈折値を測定するための方法ステップを示す図である。 第２の測定法により屈折値を測定するための方法ステップを示す図である。 第２の測定法により屈折値を測定する場合に可能な光路の構成を示す図である。 第２の測定法により屈折値を測定する場合に可能な光路の構成を示す図である。 スタック画像を撮影する方法を示す図である。 スタック画像を撮影する方法を示す図である。

図１に示す顕微鏡１は、共焦点顕微鏡３またはライトシート顕微鏡５として形成されている。顕微鏡１は、照射レンズ７として形成された光学ユニット９を有しており、光学ユニット９は、所定の励起波長２３９の照射光１１を、照射レンズ７の照射側１３から光路８に沿って照射レンズ７の試料側１５に送り、照射光１１をサンプルボリューム１７（破線で図示）内に集束させる。照射レンズの光路８は、照射光路８ａである。

焦点１９は試料２１内に形成され、この場合、試料２１は、浸漬液２３で満たされた試料容器２５内に位置している。焦点１９は焦点面を規定しており、焦点面も符号１９で表される。

浸漬液２３は、屈折値ｎを有する試料用媒体２７と解されてよい。屈折値ｎは、同義的に屈折率ｎと呼んでもよい。

光学ユニット９、試料容器２５および試料容器２５内に含まれる試料用媒体２７を含む光学系２９は、試料用媒体２７の屈折値ｎにより影響を及ぼされ、これにより焦点１９の空間位置３１は、異なる屈折値ｎに対して可変である。

光学ユニット９の試料側１５において、照射光１１は自由光線ボリューム３３（点線により示唆）を通走する。

自由光線ボリューム３３内にも試料容器２５内にも光学媒体３５が位置しており、自由光線ボリューム３３内の光学媒体３５は、図示の例では空気３７であり、試料容器２５内の光学媒体３５は、試料用媒体２７である。

自由光線ボリューム３３内の空気３７は、屈折値ｎ_１を有する別の光学媒体３９に相当する。試料用媒体２７は屈折値ｎ_２を有しており、試料２１は屈折値ｎ_３を有している。全ての屈折値ｎ_１〜ｎ_３は、互いに異なっていてよい。

図１に示す顕微鏡１はさらに、従来技術から周知であり、よって詳述しない検出光学系４１を有している。

調節済みの状態４３において、照射光１１の焦点１９は、光軸５３に沿って正確に検出光学系４１の焦点面４５内に位置しておりかつ（焦点面４５に対して平行な）照明方向に沿って画像フィールドの中央に位置している。屈折値ｎの変更に基づき、調節済みの状態４３からのずれが生じる場合があるため、顕微鏡１により鮮明な画像（図示せず）を得ることはもはや不可能である。

特に図１に示した顕微鏡１は、共焦点顕微鏡３としても、ライトシート顕微鏡５としても使用可能である。（図１に示した）ライトシート顕微鏡５として使用するために、顕微鏡１は、サンプルボリューム１７内に配置された反射部材４９の反射面４７を有しており、この場合、反射部材４９は検出光学系４１の検出レンズ５１に配置されて取り付けられている。つまり反射部材４９は、リフレクタ５５を成している。

図１では照射光１１が反射される、傾斜した反射面４７の他に、反射部材４９は、光学ユニット９および検出レンズ５１の光軸５３に対して実質的に垂直に向けられた、別の反射面４７を有している。図１に示した顕微鏡１の構成では、光学ユニット９の光軸５３と、検出レンズ５１の光軸５３とが一致しているが、別の構成では互いに平行に配置されていてもよい（図３または図４参照）。

図２には、顕微鏡１として形成された、少なくとも１つの光路８を操作する装置８５の概略的な構成が示されている。

さらに図２には、顕微鏡１として形成された本発明による装置８５の制御に用いられかつ本発明による方法を実施するためのプログラムを不揮発性の機械可読記憶媒体１６３から読み取って実行するＰＣ１６２が示されている。

ＰＣ１６２の代わりに、ミニコンピュータ、例えばアルドゥイーノが使用されてもよい。このようなミニコンピュータ（図示せず）は、例えば顕微鏡の制御に用いられるＰＣに追加されて設けられていてもよい。ＰＣ１６２もしくはミニコンピュータ内にはメモリが設けられていてよく、メモリは、光学ユニットおよび／または使用される補正部材の較正データを有しており、顕微鏡に、光路の操作用に提供する。

顕微鏡は、図１に示した構成の他に、長方形の形態で概略的に図示された屈折率検出モジュール５６を有している。屈折率検出モジュール５６は検出器ユニット５７を有していてよく、検出器ユニット５７もやはり、例えばピンホール６１の形態の絞り５９および検出器６３を有していてよい。

屈折率検出モジュールの第２の構成５６ａ（図２の左側に図示）では、検出器ユニット５７の代わりに位置分解検出器５８が使用され得る。両方のケースにおいて、光路８に沿って戻り反射された反射測定光６５ｂは、レンズ１９２を通り、検出器６３または位置分解検出器５８に集束される。

指摘しておくと、図３および図４に示す測定光６５は入射測定光６５ａと呼ばれ、入射測定光６５ａは、反射部材４９において反射しかつ前記反射測定光６５ｂとして屈折率検出モジュール５６または５６ａに到達する。

図２に示す装置８５はさらに、複数の光路マニピュレータ１７０を有している。特に、光路マニピュレータ１７０は変形可能なミラー１７２であり、ミラー１７２は、（少なくとも部分的に）可変に調節可能な湾曲部１７４を有しており、特に検出光学系４１の光路８に関して、変形可能なミラー１７２の縁部領域１７８における光路長１７６、すなわち外側光路長１７６ａを、光路８の中央１８０における光路長１７６、すなわち中央光路長１７６ｂに比べて短縮または延長することを可能にする。

図２に示した装置８５はさらに、焦点距離が電気的に調節可能な光学素子１８２、略してＥＴＬを有している。ＥＴＬ１８２により、検出光学系４１の有効焦点距離（図示せず）を変化させひいては検出光学系４１の焦点１９の、浸漬液２３の屈折率ｎ_２に応じたずれ（図示せず）を補償することが可能である。

したがって光路マニピュレータ１７０により、例えば球面収差または有効焦点距離等の顕微鏡パラメータ２が調節され得る。

検出光学系４１と照射レンズ７とは両方共、補正環１８４（図２に長方形として概略的にのみ図示）を有している。

図２に示す光路マニピュレータ１７０は、装置８５の様々な構成において様々に組み合わされて設けられていてよい。すなわち、変形可能なミラー１７２、ＥＴＬ１８２および１つもしくは複数の補正環１８４は任意である。

ＥＴＬ１８２が実質的に焦点１９のずれを補正することができる一方で、変形可能なミラー１７２と補正環１８４とは両方共、特に光軸５３に対する距離ｒに応じて光路長１７６を変化させることができる。

図３および図４には、本発明による装置８５、特に屈折値ｎを測定する第１の測定法の概略図が示されている。

装置８５は、アクチュエータモジュール８７を介して並進８９を実施することができる光学ユニット９と、反射部材４９が光学ユニット９に対して所定の作業間隔７９をあけて位置決めされている場合に、反射測定光６５ｂを、光学ユニット９を介して検出器ユニット５７の測定面（図示せず）にもしくは位置分解検出器５８（図２参照）において結像させる反射部材４９とを有している。この構成では、光学ユニット９と別の光学ユニット９ａとは同一である。

図示の検出光学系４１は画像フィールド２３７を有しており、画像フィールド２３７は、光路の操作時にも好適には実質的に保持される、つまり変更されない。

少なくとも１つのアクチュエータモジュール８７により、リフレクタ５５と測定光６５の焦点１９との間の間隔９３を変化させることができる。

図３に示す概略図は、測定光６５の焦点１９が反射部材４９から間隔をあけられており、反射部材４９と測定光６５の焦点１９との間の間隔９３が測定可能な場合を表している。

装置８５はさらに、評価ユニット９５を有している（図４に示す装置８５についてのみ詳しく図示）。評価ユニット９５はデータ送信式である、すなわちデータ線路９７を介して検出器ユニット５７もしくは位置分解検出器５８（長方形により概略的にのみ図示）に接続されている。評価ユニット９５には、作業間隔検出モジュール９９および屈折値ｎを測定する屈折値モジュール１０１が含まれており、この場合、屈折値モジュール１０１は、１つもしくは複数のアクチュエータモジュール８７および作業間隔検出モジュール９９にデータ送信式に接続されており、この接続は、中央で制御器１０３、すなわち制御ユニットを介して行われる。別の構成では、屈折値モジュール１０１は、アクチュエータモジュール８７と直接に接続されていてよい。

制御器１０３は、試料を顕微鏡に入れて新規の投影を設定する際に、コンピュータによりまたはユーザにより手動で発生させることができるトリガ信号２４１を受信し得る。コード化されて発生させられたトリガ信号２４１は、本発明による方法のうちの１つをスタートさせることができる。

評価ユニット９５は、屈折率検出モジュール５６の一部であってよい。

さらに作業間隔検出モジュール９９も、制御器１０３を介してアクチュエータモジュール８７に接続されている。制御器１０３はさらに、少なくとも１つの別の操作出力部１８６を介して少なくとも１つの光路マニピュレータ１７０（図２参照）にデータ送信式に接続されていてよい。図示の構成では、制御器は、アクチュエータモジュール８７として形成された光路マニピュレータ１７０に接続されている。

作業間隔検出モジュール９９と屈折値モジュール１０１とは両方共、データ出力部１０５を有している。

評価ユニット９５はさらに、メモリユニット１０７を有していてよく、メモリユニット１０７内には例えば、予め規定された関数１０９または測定値１１１が記憶されているもしくは記憶され得る。さらに、メモリユニット１０７内には較正データ１８８が記憶されていてよく、較正データ１８８には、例えば照射レンズ７および／または検出光学系４１等の使用される光学系に生じ得る結像誤差が含まれており、これにより較正データ１８８は、本発明による方法もしくは本発明による装置に相応して光路８を操作する際に考慮され得る。特に補正部材を備えたレンズの場合には、例えば屈折率ｎを様々に調節するために存在する色依存性が記憶されていてよい。調整可能なレンズの場合は、例えば調節された焦点距離に応じた理想的なレンズからのずれが記憶されていてよい。

図３および図４に示す反射部材４９は、境界面２３５に対して所定の間隔１１３をあけて、光学媒体３５と別の光学媒体３９（この場合は空気３７）との間に位置している。簡単のために、試料容器２５の壁１１５は極薄であると見なし、考慮しない。

光学ユニット９は、試料用媒体２７に対して所定の間隔１１７をあけて位置している（この場合も壁１１５は考慮しない）。

実質的に、図４に示す状態は、光学ユニット９と試料用媒体２７との間の間隔１１７が増大され、次いで検出光学系４１のアクチュエータモジュール８７が光学ユニット９に追従して後から移動させられること、またはリフレクタ５５と別の光学媒体３９との間の間隔１１３が減少させられ、次いでアクチュエータモジュール８７により光学ユニット９がリフレクタ５５から離反する方向に移動させられることにより、図３に示す状態から得られてよい。

ケースａ）は、図３において部分図１１９に基づき示されている。この部分図１１９では、光学ユニット９と試料用媒体２７との間の間隔１１７の変化が、測定光６５の焦点位置１２３の、規定された、すなわち測定可能な間隔変化量１２１をもたらす、ということが認められる。

図３では、反射部材４９は、光学ユニット９の作業間隔７９内に位置しているのに対し、図４では、別の作業間隔１２７を調節するために、間隔１１３および間隔１１７を含む少なくとも１つのパラメータ１２５が変更された。

図３に示す作業間隔７９および図４に示す別の作業間隔１２７は、作業間隔値１３１（電気信号により略示）の形で作業間隔検出モジュール９９から制御器１０３に伝達され、この場合、制御器は計算モジュール（図示せず）を介して作業間隔７９の作業間隔値１３１および別の作業間隔１２７の作業間隔値１３１から作業間隔変化量１２９を算出し、作業間隔変化量１２９は、作業間隔変化値１３３の形で屈折値モジュール１０１に伝達される。さらに、制御器１０３はアクチュエータモジュール８７とのデータ送信式の接続に基づき間隔変化量１２１を検出し、これを間隔変化値１３５の形で屈折値モジュール１０１に伝達する。間隔変化値１３５は図４において、識別用に単に例示的に三角パルスの形で略示されている。

屈折値モジュール１０１は、作業間隔変化値１３３および間隔変化値１３５に基づき屈折値ｎまたは屈折値ｎに比例する測定値を算出し、これを屈折値の数値１３７の形でデータ出力部１０５に供給する。屈折値の数値１３７は、識別用に正弦曲線により略示されている。

図５に基づき、作業間隔７９の検出手段を明示する。図示の、検出器ユニット５７により検出された値１４５（例えば電圧または電流等）は、作業間隔７９および別の作業間隔１２７の両方に関する間隔変化量１２１に依存して示されている。より正確に言うと、図５には、その都度測定値１１１に適合される、予め規定された関数１０９が示されており、この場合、予め規定された関数１０９は、ガウス関数１４７により表されている。

ガウス関数１４７は、単に２つのパラメータ１２５、特に半値幅１４９および中央１５１を有しているだけに過ぎず、この場合、中央はガウス関数１４７の極値１５３に位置している。ガウス関数１４７に関して、パラメータ１２５の数Ｎは２である。予め規定された別の関数１０９が使用される場合、必要な測定値１１１の数は、使用される関数１０９のパラメータ１２５の数Ｎに相当する。

図示の異なるガウス関数１４７は、作業間隔７９、別の作業間隔１２７およびこれらから生じる作業間隔変化量１２９を算出することを可能にする。作業間隔変化量１２９および間隔変化量１２１から、屈折値モジュール１０１（図４参照）は屈折率もしくは屈折値ｎを算出することができる。

図６には、本発明による装置８５の部分図、特に屈折値ｎを測定する第２の測定方法が示されている。

図示の反射部材４９は、右側に示すように検出光学系４１に直接に接して位置していてよく、この場合、反射部材４９は浸漬液２３、すなわち光学媒体３５中に位置している。

検出光路１９０を介して、測定光６５がレンズ１９２を介して、内部に光学媒体３５が存在する試料容器２５内へ導入される。

レンズ１９２と試料容器２５との間に位置する別の光学媒体３９が、光学媒体３５と同じ屈折値ｎ_１（すなわちｎ_１＝ｎ_２）を有している場合には、第１の液浸光路１９４（短鎖線で図示）が得られる。

別の光学媒体３９が、光学媒体３５よりも光学的に密（すなわちｎ_１＞ｎ_２）である場合には、検出光路１９０が屈折させられ、第２の液浸光路１９６（実線で図示）が得られる。

両方の場合において、各液浸光路１９４，１９６は反射部材４９に当たり、反射部材４９により反射され、反射測定光６５ｂは、各測定光路１９８に沿って位置分解検出器５８へ案内される。このことは、反射測定光６５ｂが集束するレンズ１９２を介して同様に行われてもよい。

第１の液浸光路１９４から生じる第１の測定光路２００を観察し、この第１の測定光路２００を、第２の液浸光路１９６から生じる第２の測定光路２０２と比較すると、位置分解検出器５８において第２の測定光路２０２の第２の入射点２０６は、第１の測定光路２００の第１の入射点２０４に対して側方にずれて入射している、ということが明らかになる。

さらに、反射部材４９が第２の位置２０８（点線で図示）に移動させられると、第３の測定光路２１０が生じ、第３の測定光路２１０は、位置分解検出器５８において第３の入射点２１２に入射する。入射点２０４，２０６，２１２の評価および特にこれらの入射点２０４，２０６，２１２の間での変更は、反射部材４９の間隔変化量１２１に応じて光学媒体３５の屈折率ｎ_２をもたらす。

さらに、図６に略示した方法により、自動焦点の調節も実現され得る。このことは従来技術から周知であり、ここでさらに説明はしない。

図７および図８には、図６に示した第２の測定法により屈折値を測定する場合に可能な、複数の光路８（略示）の構成が示されている。簡単のために試料容器は一切図示されておらず、検出光路１９０の反射は、反射部材４９の所定の位置で行われる。

図６に示した構成に加え、これらの図には変向ミラー２１４が示されており、変向ミラー２１４は、測定光６５を反射部材４９に向かって変向させる。

検出光路１９０は、図７では変向ミラー２１４に集束させられている、という点において相違している。その結果、反射測定光６５ｂは、２つのレンズ１９２に基づきコリメートされて、位置分解検出器５８に当たることになる。

この構成において屈折率ｎの変更は、位置分解検出器５８において広幅の光点２１６が全体的にその位置を変化させる、という結果をもたらす。さらに反射部材４９が光軸５３に沿って移動させられると、このことは広幅の光点２１６の縮小または拡大を招く。

これに対して図８に示す検出光路１９０の構成では、検出光路１９０はコリメートされて変向ミラー２１４に当たる。２つのレンズ１９２の結像により、一方では反射部材４９に中間焦点２１７が形成されかつ他方では位置分解検出器５８に焦点１９もしくは集束された光点２１８が形成される。

様々な所要の評価の他に、アルゴリズムが、これら両方の構成はサンプルボリューム内の光強度２２０と検出器に対する光強度２２２の両方を変化させる、ということを可能にする。つまり例えば、測定光６５の強度が極めて小さな場合もしくはサンプルボリューム内の測定光６５が大幅に弱まった場合には、図８に示した構成が優先され得る。

測定光６５の強度が位置分解検出器５８のダイナミックレンジの限界領域内に位置する場合には、図８に示した相関に比べ、図７に示した相関の方が有利である。

図９および図１０を用いて、スタック画像を撮影する方法を簡単に説明する。

図示の装置８５は、サンプルボリューム１７内に位置する試料２１から３Ｄ写真を作成するものである。このことは、試料容器２５の隣に略示したスタック画像２２４の撮影を介して行われる。スタック画像２２４には、多数の個別画像２２５が含まれている。

このようなスタック画像２２４を撮影するためには、例えば検出光学系４１が所定の移動方向２２６に移動させられてよい。図９では、検出光学系４１の焦点１９は、既に試料２１の外側に位置している、すなわち検出光学系４１は、第１の位置２０７（破線で図示）から第２の位置２０８へ移動させられた。

図１０には、検出光学系４１の移動距離ｘが時間ｔにわたり示されており、この場合、走査距離２２９および時間ｔから第１の勾配２２８が生じており、第１の勾配２２８は基本的に、検出光学系４１を移動方向２２６に移動させる速度を示す。

固定された照射レンズ７の場合には照射光１１の焦点１９が横方向ずれ２３０を有している恐れがあるため、照射レンズ７も移動方向２２６に移動させる必要がある。両者の移動には、例えば各１つのアクチュエータモジュール８７が用いられてよい。

ただし検出光学系４１を移動させると、光学媒体中の距離部分１６５と、別の光学媒体中の距離部分１６７とが互いに相対的に変化するため、照射レンズ７を、第１の勾配２２８よりは小さな第２の勾配２３２でもって移動方向２２６に移動させる必要がある。同じ時間ｔ内に、照射レンズ７を追従距離２３３だけ移動させねばならない。光学媒体３５と別の光学媒体３９とが同じ屈折率ｎ_２もしくはｎ_１を有している場合、第１の勾配２２８は第２の勾配２３２に等しくなっている。ただし、光学媒体３５の屈折率ｎ_２が別の光学媒体３９の屈折率ｎ１から相違するとすぐに、勾配２２８，２３２も互いに相違することになる。

図９および図１０を用いて説明したスタック画像を撮影する方法に関して、検出光学系４１は第１の光学ユニット９ｂと見なされ、照射レンズ７は第２の光学ユニット９ｃと見なされる。

この方法の別の構成において、最初に照射レンズ７を移動させる場合（この場合は照射レンズ７が第１の光学ユニット９ｂと呼ばれてよい）には、引き続く方法ステップにおいて検出光学系４１を追従させる。この場合は検出光学系４１が第２の光学ユニット９ｃに相当する。

つまり本発明による方法の１つの構成では、スタック画像２２４の撮影中、各中間位置において、すなわちスタック画像２２４の各画像において、試料２１および／または浸漬媒体２３の屈折率が測定されるのに対し、本発明による方法の別の構成では、試料２１および／または浸漬媒体２３の屈折率が一度だけ測定され、この屈折率から、勾配２２８および２３２における差が検出される。特に上述した、浸漬媒体２３の屈折率ｎを試料２１の屈折率ｎに適合させる透明化法では、本発明による方法の、後に述べた構成が有利である。

１ 顕微鏡
２ 顕微鏡パラメータ
３ 共焦点顕微鏡
５ ライトシート顕微鏡
７ 照射レンズ
８ 光路
８ａ 照射光路
９ 光学ユニット
９ａ 別の光学ユニット
９ｂ 第１の光学ユニット
９ｃ 第２の光学ユニット
１１ 照射光
１３ 照射側
１５ 試料側
１７ サンプルボリューム
１９ 焦点／焦点面
２１ 試料
２３ 浸漬液
２５ 試料容器
２７ 試料用媒体
２９ 光学系
３１ 空間位置
３３ 自由光線ボリューム
３５ 光学媒体
３７ 空気
３９ 別の光学媒体
４１ 検出光学系
４３ 調節済みの状態
４５ 焦点面
４７ 反射面
４９ 反射部材
５１ 検出レンズ
５３ 光軸
５５ リフレクタ
５６ 屈折率検出モジュール
５６ａ 屈折率検出モジュールの第２の構成
５７ 検出器ユニット
５８ 位置分解検出器
５９ 絞り
６１ ピンホール
６３ 検出器
６５ 測定光
６５ａ 入射測定光
６５ｂ 反射測定光
７９ 作業間隔
８５ 装置
８７ アクチュエータモジュール
８９ 並進
９３ リフレクタと測定光の焦点との間の間隔
９５ 評価ユニット
９７ データ線路
９９ 作業間隔検出モジュール
１０１ 屈折値モジュール
１０３ 制御器
１０５ データ出力部
１０７ メモリユニット
１０９ 予め規定された関数
１１１ 測定値
１１３ リフレクタと別の光学媒体との間の間隔
１１５ 壁
１１７ 光学ユニットと試料用媒体との間の間隔
１１９ 部分図
１２１ 間隔変化量
１２３ 焦点位置
１２５ パラメータ
１２７ 別の作業間隔
１２９ 作業間隔変化量
１３１ 作業間隔値
１３３ 作業間隔変化値
１３５ 間隔変化値
１３７ 屈折値の数値
１４７ ガウス関数
１４９ 半値幅
１５１ 中央
１５３ 極値
１６２ ＰＣ
１６３ 不揮発性の機械可読記憶媒体
１６５ 光学媒体中の距離部分
１６７ 別の光学媒体中の距離部分
１７０ 光路マニピュレータ
１７２ 変形可能なミラー
１７４ 湾曲部
１７６ 光路長
１７６ａ 外側光路長
１７６ｂ 中央光路長
１７８ 縁部領域
１８０ 中央
１８２ 電気的に調節可能な焦点距離を有する光学素子
１８４ 補正環
１８６ 操作出力部
１８８ 較正データ
１９０ 検出光路
１９２ レンズ
１９４ 第１の液浸光路
１９６ 第２の液浸光路
１９８ 測定光路
２００ 第１の測定光路
２０２ 第２の測定光路
２０４ 第１の入射点
２０６ 第２の入射点
２０７ 第１の位置
２０８ 第２の位置
２１０ 第３の測定光路
２１２ 第３の入射点
２１４ 変向ミラー
２１６ 広幅の光点
２１７ 中間焦点
２１８ 集束された光点
２２０ サンプルボリューム内の光強度
２２２ 検出器に対する光強度
２２４ スタック画像
２２５ 画像
２２６ 移動方向
２２８ 第１の勾配
２２９ 走査距離
２３０ 横方向ずれ
２３２ 第２の勾配
２３３ 追従距離
２３５ 境界面
２３７ 画像フィールド
２３９ 励起波長
２４１ トリガ信号
ｎ 屈折値
ｎ_１ 別の光学媒体の屈折値
ｎ_２ 試料用媒体の屈折値
ｎ_３ 試料の屈折値
ｒ 距離
ｔ 時間
ｘ 移動距離

Claims (25)

1. 顕微鏡（１）、特にライトシート顕微鏡（５）において少なくとも１つの光路（８）を操作する方法であって、前記方法は、
   −サンプルボリューム（１７）内に配置された試料（２１）および／またはサンプルボリューム（１７）内に配置された光学媒体（３５）の屈折率（ｎ）を検出するステップと、
   −検出した前記屈折率（ｎ）に応じて少なくとも１つの顕微鏡パラメータ（２）を調節し、前記光路（８）を操作するステップと、
   を有する方法。
2. サンプルボリューム（１７）内に配置された試料（２１）および／またはサンプルボリューム（１７）内に配置された光学媒体（３５）の屈折率（ｎ）を検出する前記ステップには、ユーザによる、前記屈折率（ｎ）の相応する値の読み込みの方法ステップが含まれる、
   請求項１記載の方法。
3. 検出した前記屈折率（ｎ）に応じて焦点位置を、
   −少なくとも１つの光学ユニット（９）の有効焦点距離を変更するステップと、
   −少なくとも１つの光学ユニット（９）を、前記光学ユニット（９）のその時々の光軸（５３）に沿って移動させるステップと、
   のうちの少なくとも１つを用いて調節する、
   請求項１または２記載の方法。
4. 前記方法には、
   −前記試料（２１）を移動させ、この移動に際して、前記試料（２１）が埋められた浸漬媒体（２３）と、照射レンズ（７）の前に存在する媒体（３９）、例えば空気と、の間の境界面（２３５）も移動させるステップと、
   −検出した前記屈折率（ｎ）に応じて少なくとも１つの顕微鏡パラメータ（２）を調節し、前記光路（８）を操作するステップと、
   が含まれる、
   請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. 前記方法において、画像フィールド（２３７）内の焦点（１９）の位置は、不変の位置に留まっている、
   請求項４記載の方法。
6. 検出光学系（４１）と前記試料（２１）との間に、試料用媒体（２７）および／または前記浸漬媒体（２３）とは異なる屈折率（ｎ）を有する光学媒体（３５）が存在する場合は、検出光路（１９０）をその焦点位置（１９）に関して操作する方法ステップを実施する、
   請求項４または５記載の方法。
7. 検出した前記屈折率（ｎ）に応じて前記光路（８）を操作することにより、光軸（５３）までの距離（ｒ）に応じた光路（８）の光路長（１７６）の変化による球面結像誤差を補正する、
   請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
8. 前記光路長（１７６）の変化には、少なくとも１つの反射ミラー部分（１７８，１８０）の移動および／または変形可能な透過性媒体の境界面の移動が含まれる、
   請求項７記載の方法。
9. 前記光路長（１７６）の変化は、実質的に、ｒ^２およびｒ^４の重み付けがそれぞれ規定された関数関係ｒ^２およびｒ^４の重ね合わせに基づき生じ、ｒは、前記光軸（５３）までの距離に相当する、
   請求項７または８記載の方法。
10. 前記方法は、前記光路（８）を波長に応じて、
    （Ａ）請求項１から５までのいずれか１項記載の方法に基づき、第１の波長の光（１１）の前記光路（８）を操作するステップと、
    （Ｂ）少なくとも１つの別の波長を調節するステップと、
    により操作する、
    請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
11. 少なくとも１つの別の波長を調節する前記方法ステップには、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法に基づき、前記別の波長の光（１１）の前記光路（８）をその都度順次操作することが含まれる、
    請求項１０記載の方法。
12. 前記方法を、予め規定された時間間隔をあけて繰り返す、
    請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
13. 顕微鏡（１）、特にライトシート顕微鏡（５）においてスタック画像（２２４）を撮影する方法であって、前記方法には、
    −請求項１から１２までのいずれか１項記載の、少なくとも１つの光路を操作する方法を実施するステップと、
    −光学ユニット（９）に対する試料（２１）の位置変化を検出しかつ／または少なくとも１つの顕微鏡パラメータ（２）を調節する前に励起波長（２３９）の変化を検出するステップと、
    が含まれる方法。
14. 顕微鏡（１）、特にライトシート顕微鏡（５）においてスタック画像（２２４）を撮影する方法であって、前記方法には、
    （８ａ）第１の光学ユニット（９ｂ）の焦点面（１９）を事前に調節した走査距離（２２９）だけ移動させるステップと、
    （８ｂ）顕微鏡（１）における光路（８）を操作する本発明による方法の１つの構成に基づき、前記第１の光学ユニット（９ｂ）の少なくとも１つの前記光路（８）を操作して、請求項１から１２までのいずれか１項記載の前記第１の光学ユニット（９ｂ）の結像誤差を補正するステップと、
    （８ｃ）前記方法ステップ（８ｂ）で検出した屈折率（ｎ）に応じた追従距離（２３３）だけ、第２の光学ユニット（９ｃ）の焦点面（１９）を移動または追従させるステップと、
    が含まれる方法。
15. 前記方法には、前記スタック画像（２２４）を生じさせるための画像（２２５）の撮影および／または記憶が含まれる、
    請求項１３または１４記載の方法。
16. 前記方法ステップ（８ｃ）には、請求項１から１２までのいずれか１項記載の、光路（８）を操作する本発明による方法の１つの構成に基づき、前記第２の光学ユニット（９ｃ）の少なくとも１つの光路（８）を操作して、前記第２の光学ユニット（９ｃ）の結像誤差を補正することが含まれる、
    請求項１４または１５記載の方法。
17. 前記方法は、
    −前記方法ステップ（８ａ）、（８ｂ）および（８ｃ）を一度だけ実施し、かつ
    −方法ステップ（８ａ）、（８ｂ）’および（８ｃ）をｎ回繰り返し、その際の前記方法ステップ（８ｂ）’には、検出した屈折率（ｎ）に応じて少なくとも１つの顕微鏡パラメータ（２）を調節し、前記光路（８）を操作することのみが含まれる、
    ということを含む、
    請求項１４から１６までのいずれか１項記載の方法。
18. 前記方法は、別の方法ステップの実施を開始させるトリガ信号（２４１）を検出する方法ステップをさらに含む、
    請求項１３から１７までのいずれか１項記載の方法。
19. 前記試料（２１）および／または前記サンプルボリューム（１７）内に配置された前記光学媒体（３５）の前記屈折率（ｎ）の検出には、
    （ｉ）光学ユニット（９）を用いて前記サンプルボリューム（１７）内に測定光（６５）を集束させ、このとき前記測定光（６５）は、前記光学ユニット（９）の試料側（１５）において前記光学媒体（３５）および別の光学媒体（３９）を透過するステップと、
    （ｉｉ）反射部材（４９）から反射されかつ別の光学ユニットまたは前記光学ユニットを透過した前記測定光（６５ｂ）を、検出器ユニット（５７）または位置分解検出器（５８）により検出するステップと、
    （ｉｉｉ）検出器（６３）により検出された前記測定光（６５）に基づき、前記光学ユニット（９）と前記反射部材（４９）との間の作業間隔（７９）を検出し、前記作業間隔（７９）に関して、前記測定光（６５）の前記焦点（１９）を前記反射部材（４９）に位置させるステップと、
    （ｉｖ）以下のパラメータ、すなわち、
    （ｉｖ．１）前記光学ユニットと前記試料用媒体との間の間隔（１１７）
    （ｉｖ．２）リフレクタと前記別の光学媒体との間の間隔（１１３）
    （ｉｖ．３）前記測定光（６５）の発散
    のうちの少なくとも１つを変化させ、前記変化により、前記測定光（６５）の焦点位置（１２３）の規定された間隔変化量（１２１）をもたらすステップと、
    （ｖ）前記方法ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）に基づき、別の作業間隔（１２７）を検出するステップと、
    （ｖｉ）前記作業間隔（７９）と前記別の作業間隔（１２７）との間の作業間隔変化量（１２９）を検出するステップと、
    （ｖｉｉ）前記間隔変化量（１２１）および前記作業間隔変化量（１２９）に基づき前記屈折率（ｎ）を検出するステップと、
    が含まれる、
    請求項１から１８までのいずれか１項記載の方法。
20. 前記試料（２１）および／または前記サンプルボリューム（１７）内に配置された前記光学媒体（３５）の前記屈折率（ｎ）の検出にはさらに、
    （Ｉ）光学ユニット（９）を介して、前記測定光（６５）を前記サンプルボリューム（１７）内へ、前記光軸（５３）に対して傾斜させて入射させるステップと、
    （ＩＩ）前記サンプルボリューム（１７）内で第１の位置（２０７）に準備された反射部材（４９）において入射光（１１）を反射させるステップと、
    （ＩＩＩ）前記反射光（６５ｂ）を位置分解検出器（５８）に対して結像させるステップと、
    （ＩＶ）前記検出器（５８）により検出された信号を、前記位置分解検出器（５８）における前記反射光（６５ｂ）の大きさおよび／またはずれに関して評価するステップと、
    （Ｖ）前記光軸（５３）に沿って前記反射部材（４９）を第２の位置へ移動させかつ前記方法ステップ（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を実施するステップと、
    （ＶＩ）前記反射部材（４９）の前記第１の位置（２０７）および前記第２の位置（２０８）に関する前記反射光（６５ｂ）の大きさおよび／またはずれに基づき前記屈折率（ｎ）を検出するステップと、
    が含まれる、
    請求項１から１９までのいずれか１項記載の方法。
21. 前記方法には、較正データ（１８８）の読み出しがさらに含まれており、検出された前記屈折率（ｎ）および／または読み出された前記較正データ（１８８）に応じて、前記少なくとも１つの顕微鏡パラメータ（２）の調節を行う、
    請求項１から２０までのいずれか１項記載の方法。
22. 請求項１から２１までのいずれか１項記載の方法を実施するプログラムが含まれている、不揮発性の機械可読記憶媒体（１６３）。
23. 顕微鏡（１）、特にライトシート顕微鏡（５）において少なくとも１つの光路（８）を操作する装置であって、前記装置は、
    −試料（２１）の屈折率（ｎ）および／またはサンプルボリューム（１７）内に配置された光学媒体（３５）の屈折率（ｎ）を検出する屈折率検出モジュール（５６）と、
    −検出した前記屈折率（ｎ）に基づき少なくとも１つの顕微鏡パラメータ（２）を調節し、前記少なくとも１つの光路（８）を操作する、少なくとも１つの光路マニピュレータ（１７０）と、
    を有する装置。
24. 前記光路マニピュレータ（１７０）は、以下の群のうちの少なくとも１つの部材、すなわち、
    −電気的に調節可能な焦点距離を有する光学素子（１８２）、
    −アクチュエータモジュール（８７）、
    −補正環（１８４）、
    −補正板を前記光路に入れるための補正板モジュール、
    −前記補正環（１８４）が装備された光学ユニット（９）、
    −変形可能なミラー（１７２）、
    −少なくとも１つの透明な入射面および／または出射面を備えた、透明な液状媒体で満たされた中空部材であって、前記少なくとも１つの透明な入射面および／または出射面が変形可能である中空部材と、
    を有している、
    請求項２３記載の装置。
25. 前記装置には、予め規定された時間間隔で、前記屈折率（ｎ）の測定開始用および／または前記光路（８）の操作用のスタート信号を出力するタイマモジュールが設けられている、
    請求項２３または２４記載の装置。

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