JP2021516959A - アルケンホスホノチオレートまたはアルキンホスホノチオレートおよびアルケンホスホネートまたはアルキンホスホネートとの化学選択的チオールコンジュゲーション - Google Patents

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Abstract

新規コンジュゲートおよびその調製のための方法を開示する。アルケンホノチオレートまたはアルキンホスホノチオレートおよびアルケンホスホネートまたはアルキンホスホネートの調製のための方法は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表す、式（II）のチオール含有分子と、式（I）の化合物を反応させて、式（III）の化合物を生成させる段階を含む。

Description

背景
タンパク質の部位特異的修飾のための強力なツールとして、化学選択的およびバイオ直交型反応が台頭してきた（Hackenberger, C. P. R.; Schwarzer, D. Angew. Chemie - Int. Ed. 2008, 47 (52), 10030（非特許文献1）；Spicer, C. D.; Davis, B. G. Nat. Commun. 2014, 5, 4740（非特許文献2））。これらの反応により、翻訳後タンパク質修飾に類似の、フルオロフォアおよび他の分光学的標識、ポリマー、毒素、ならびに低分子およびタンパク質のような機能性モジュールを有する、様々なタンパク質コンジュゲートおよび抗体コンジュゲートが利用可能となった。それにより、化学選択的タンパク質修飾技術は、タンパク質の生物学的機能の調査や新しい画像処理技術の開発から診断学における有望な新しい薬物的アプローチ、タンパク質系薬剤の設計、および薬物の標的指向送達におよぶ基本的研究に大いに貢献してきた。
近年、研究者らは、タンパク質修飾のためのバイオ直交型反応の工学技術において、主に2つの異なる局面に集中してきた（Sletten, E. M.; Bertozzi, C. R. Angew. Chemie - Int. Ed. 2009, 48 (38), 6974（非特許文献3））。一方では、多くの努力が、タンパク質側鎖にある特有の官能基の変換のために、反応性の高い出発物質を必要とする高速反応に充てられてきた（Patterson, D. M.; Nazarova, L. A.; Prescher, J. A. ACS Chem. Biol. 2014, 9 (3), 592（非特許文献4）；Lang, K.; Chin, J. W. ACS Chem. Biol. 2014, 9 (1), 16（非特許文献5））。このアプローチは、部位特異的標識を達成するための高度なアンバー変異抑圧技術によるものであり、いくつかの遺伝子コードされた高反応性バイオ直交型レポーターが、歪み促進型アルキン-アジド付加環化または逆電子要求型ディールス・アルダー反応を含む様々な型の付加環化反応を起こす結果となった（Nikic, I.; Plass, T.; Schraidt, O.; Szymaski, J.; Briggs, J. A. G.; Schultz, C.; Lemke, E. A. Angew. Chemie - Int. Ed. 2014, 53 (8), 2245（非特許文献6）；Agard, N. J.; Prescher, J. A.; Bertozzi, C. R. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126 (46), 15046（非特許文献7））。他方で、研究者らは、不可能でなければ退屈な精製段階を避けるために、特に大量の機能性タンパク質コンジュゲートと、理想的には定量的変換とが望まれる場合、高収率のタンパク質修飾反応を開発および適用することに焦点を当ててきた（1）。これを達成するためには、タンパク質発現の高収率が特に重要である。アンバー変異抑圧は発現タンパク質の量の低下を引き起こし得るため、多くの場合、標準の栄養要求性発現系が好ましい。標準のタンパク質発現と組み合わせて部位特異的標識を達成するための一般的なシナリオは、部位特異的変異誘発による選択したタンパク質における特有のCys残基の配置と、それに続くCys修飾戦略である（Chalker, J. M.; Bernardes, G. J. L.; Lin, Y. A.; Davis, B. G. Chem. - An Asian J. 2009, 4 (5), 630（非特許文献8））。または、アジドもしくはアルキン含有アミノ酸を、栄養要求性発現系を用いて組み込むこともでき（Hoesl, M. G.; Budisa, N. Angew. Chemie - Int. Ed. 2011, 50 (13), 2896（非特許文献9））、これはシュタウディンガー連結およびCu触媒によるアジド-アルキン付加環化（CuAAC）を用いて修飾することができる（Artner, L. M.; Merkel, L.; Bohlke, N.; Beceren-Braun, F.; Weise, C.; Dernedde, J.; Budisa, N.; Hackenberger, C. P. R. Chem. Commun. 2012, 48 (4), 522（非特許文献10）；van Kasteren, S. I.; Kramer, H. B.; Jensen, H. H.; Campbell, S. J.; Kirkpatrick, J.; Oldham, N. J.; Anthony, D. C.; Davis, B. G. Nature 2007, 446 (7139), 1105（非特許文献11））。
これらの局面はいずれも、近年、顕著な進歩を見ているが、無金属の化学選択的修飾反応のための高反応性かつ複雑な機能性モジュールの一般的で組み立て式の到達可能性は、難解なままであることが多い。これは、用いる官能基の高反応性および不安定性を考慮すると問題であり得る、反応性構築ブロックの合成において、さらなる保護基操作が必要なためである。例えば、分子画像法のためのXe-クリプトファンを有する高反応性シクロオクチン含有蛍光ペプチドの合成は、直交型保護基の洗練されているが低収率の使用が必要であった（Witte, C.; Martos, V.; Rose, H. M.; Reinke, S.; Klippel, S.; Schroder, L.; Hackenberger, C. P. R. Angew. Chemie - Int. Ed. 2015, 54 (9), 2806（非特許文献12））。
Cys残基のコンジュゲーションのための以前の技術は、主にマレイミドコンジュゲーションに依拠している。しかし、マレイミドコンジュゲートは多くの場合不安定であり、特に、これらはしばしば加水分解する傾向にあり、高チオール濃度下でチオール交換を受けやすい。Cysコンジュゲーション技術に対する最近の包括的概要については、Gunnoo, S. B.; Madder, A.; ChemBioChem. 2016, 17, 529-553（非特許文献13）を参照されたい。代替コンジュゲーション法として。WO 2015/169784（特許文献1）は、C2-ジスルフィド架橋ペプチドおよびタンパク質の調製のための方法を開示し、ここで架橋はアルキンとのチオール-イン反応によって達成される。US2535174（特許文献2）は、エテンホスホン酸のエステルへの飽和脂肪族メルカプタンのアルカリ触媒付加を記載している。J. Bertran-Vicente et al., Nature Comm. 2016, 7, DOI: 10.1038/ncomms12703（非特許文献14）は、保護ホスファイトがまず求電子性ジスルフィドと反応してホスホチオレートエステルを生成し、これは脱保護（例えば、UV光または塩基による）後にリン酸化システインを生じる、連鎖を記載している。この方法は、天然リン酸化システインペプチドの合成に適用されている。
本発明の目的は、コンジュゲートを調製するためのさらなる方法を提供すること、およびさらなるコンジュゲートを提供することである。
Hackenberger, C. P. R.; Schwarzer, D. Angew. Chemie - Int. Ed. 2008, 47 (52), 10030 Spicer, C. D.； Davis, B. G. Nat. Commun. 2014, 5, 4740 Sletten, E. M.; Bertozzi, C. R. Angew. Chemie - Int. Ed. 2009, 48 (38), 6974 Patterson, D. M.; Nazarova, L. A.; Prescher, J. A. ACS Chem. Biol. 2014, 9 (3), 592 Lang, K.; Chin, J. W. ACS Chem. Biol. 2014, 9 (1), 16 Nikic, I.; Plass, T.; Schraidt, O.; Szymaski, J.; Briggs, J. A. G.; Schultz, C.; Lemke, E. A. Angew. Chemie - Int. Ed. 2014, 53 (8), 2245 Agard, N. J.; Prescher, J. A.; Bertozzi, C. R. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126 (46), 15046 Chalker, J. M.; Bernardes, G. J. L.; Lin, Y. A.; Davis, B. G. Chem. - An Asian J. 2009, 4 (5), 630 Hoesl, M. G.; Budisa, N. Angew. Chemie - Int. Ed. 2011, 50 (13), 2896 Artner, L. M.; Merkel, L.; Bohlke, N.; Beceren-Braun, F.; Weise, C.; Dernedde, J.; Budisa, N.; Hackenberger, C. P. R. Chem. Commun. 2012, 48 (4), 522 van Kasteren, S. I.; Kramer, H. B.; Jensen, H. H.; Campbell, S. J.; Kirkpatrick, J.; Oldham, N. J.; Anthony, D. C.; Davis, B. G. Nature 2007, 446 (7139), 1105 Witte, C.; Martos, V.; Rose, H. M.; Reinke, S.; Klippel, S.; Schroder, L.; Hackenberger, C. P. R. Angew. Chemie - Int. Ed. 2015, 54 (9), 2806 Gunnoo, S. B.; Madder, A.; ChemBioChem. 2016, 17, 529-553 J. Bertran-Vicente et al., Nature Comm. 2016, 7, DOI: 10.1038/ncomms12703
WO 2015/169784 US2535174
詳細な説明
定義
当業者であれば、本出願において用いられる用語「1つの（a）」または「1つの（an）」は、状況に応じて、「1つ」、「1つもしくは複数」、または「少なくとも1つ」を意味し得ることを理解するであろう。
ハロゲンは、そうではないと定義されないかぎり、VII族典型元素であり、好ましくは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素であり、より好ましくは、フッ素、塩素、および臭素であり、Mgとの組み合わせでさらにより好ましくは臭素である。
アルキルは、他所でそうではないと定義されないかぎり、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-炭素原子を有する、飽和直鎖または分枝炭化水素基である。例：メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル、ブチルなど。
アルケニルは、他所でそうではないと定義されないかぎり、二重結合を有する、不飽和直鎖または分枝炭化水素基である。アルケニルは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルケニルである。例：エテニル、1-プロペニル、3-ブテニルなど。
アルキニルは、他所でそうではないと定義されないかぎり、三重結合を有する、不飽和直鎖または分枝炭化水素基である。アルキニルは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルキニルである。例：エチニル、1-プロピニルなど。
アルコキシ（アルキル基-O-）は、他所でそうではないと定義されないかぎり、酸素原子（-O-）を介して基本構造に結合されているアルキル基である。アルコキシは、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-アルコキシである。例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、1-メチルエトキシなど。
同様に、アルケノキシおよびアルキノキシは、他所でそうではないと定義されないかぎり、それぞれ-O-を介して基本構造に結合されているアルケニル基およびアルキニル基である。アルケノキシは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-または(C2〜C4)-アルケノキシである。アルキノキシは、好ましくは、(C3〜C10)-、(C3〜C6)-または(C3〜C4)-アルキノキシである。
アルキルカルボニル（アルキル基-C(=O)-）は、そうではないと定義されないかぎり、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-アルキルカルボニルである。ここで、炭素原子の数はアルキルカルボニル基におけるアルキル基を指す。
同様に、アルケニルカルボニルおよびアルキニルカルボニルは、他所でそうではないと定義されないかぎり、それぞれ-C(=O)-を介して基本構造に結合されているアルケニル基およびアルキニル基である。アルケニルカルボニルは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルケニルカルボニルである。アルキニルカルボニルは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルキニルカルボニルである。
アルコキシカルボニル（アルキル基-O-C(=O)-）は、他所でそうではないと定義されないかぎり、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-アルコキシカルボニルである。ここで、炭素原子の数はアルコキシカルボニル基におけるアルキル基を指す。
同様に、アルケノキシカルボニルおよびアルキノキシカルボニルは、他所でそうではないと定義されないかぎり、それぞれ-O-C(=O)-を介して基本構造に結合されているアルケニル基およびアルキニル基である。アルケノキシカルボニルは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルケノキシカルボニルである。アルキノキシカルボニルは、好ましくは、(C3〜C8)-、(C3〜C6)-、または(C3〜C4)-アルキノキシカルボニルである。
アルキルカルボニルオキシ（アルキル基-C(=O)-O-）は、他所でそうではないと定義されないかぎり、カルボニルオキシ基（-C(=O)-O-）を介して酸素により基本構造に結合されているアルキル基である。アルキルカルボニルオキシは、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-アルキルカルボニルオキシである。
同様に、アルケニルカルボニルオキシおよびアルキニルカルボニルオキシは、他所でそうではないと定義されないかぎり、それぞれ(-C(=O)-O-)を介して基本構造に結合されているアルケニル基およびアルキニル基である。アルケニルカルボニルオキシは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルケニルカルボニルオキシである。アルキニルカルボニルオキシは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルキニルカルボニルオキシである。
アルキルチオは、他所でそうではないと定義されないかぎり：-S-を介して基本構造に結合されているアルキル基である。アルキルチオは、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-アルキルチオである。
同様に、アルケニルチオおよびアルキニルチオは、他所でそうではないと定義されないかぎり、それぞれ-S-を介して基本構造に結合されているアルケニル基およびアルキニル基である。アルケニルチオは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルケニルチオである。アルキニルチオは、好ましくは、(C3〜C8)-、(C3〜C6)-、または(C3〜C4)-アルキニルチオである。
他所でそうではないと定義されないかぎり、用いられる用語「置換されている」または「置換されていてもよい」などは、非常に広範な置換パターンを意味する。本発明の開示から見られるとおり、特に位置R1、
Figure 2021516959
、および●は、多くの有機（高）分子による置換を可能にする。これらの分子の構造は、本開示の方法および得られるコンジュゲートに関連がないと言える。したがって、この新しく革新的な概念の原理をいくつかの分子だけに限定するとすれば、それは過度の限定であろう。それにもかかわらず、この用語は、それぞれ有機置換基またはその塩を意味し、これらはそれぞれ、さらなる有機置換基またはその塩でさらに数回置換されていてもよい。そのような複雑な置換基の例が生成され、本出願において示す（例えば、スキーム7、8、図4、および合成例を参照のこと）。好ましくは、用語：置換されているは、ニトロ、シアノ、Cl、F、Cl、Br、-NH-R、NR2、COOH、-COOR、-OC(O)R-NH2、-OH、-CONH2 CONHR、CON(R)2、-S-R、-SH、-C(O)H、-C(O)R、(C1〜C20)-アルキル、(C1〜C20)-アルコキシ、(C2〜C20)-アリル、存在する場合ヘテロ原子がN、O、およびSから独立に選択される3〜8員の（複素）環、5〜12個の環原子を有する（複素）芳香族系（例えば、フェニル、ピリジル、ナフチルなど）から選択される1つまたは複数の置換基で置換されている基を意味し、ここでRは、これらの置換基のうちのいずれかを表すことができ、置換は数回繰り返されることができ、例えば、置換は1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回繰り返されることができ；例えば、
Figure 2021516959
における●置換基を参照されたく、ここで、#は、●がすでに式（I）または（III）などの化合物の一部である場合は、Y（本明細書において使用される化合物中の硫黄または酸素）の位置を表す。しかし、当業者であれば、例えば40単位の多糖で置換されているアルキル鎖は、一般的な置換パターンで単純に記載し得ないことに同意するであろう。
本明細書において用いられる用語「ペプチド」は、ペプチド結合（アミド結合）によって共有結合された2つ以上のアミノ酸を含む有機化合物を意味する。ペプチドは構成アミノ酸の数に関して言及されてもよく、すなわち、ジペプチドは2つのアミノ酸残基を含み、トリペプチドは3つを含み、他も同様である。10個以下のアミノ酸を含むペプチドをオリゴペプチドと呼んでもよいが、10個より多くのアミノ酸残基を有するもの、例えば、最大約30個のアミノ酸残基を有するものはポリペプチドである。アミノ酸は、少なくとも1つの環、または分枝もしくは非分枝鎖、あるいはそれらの組み合わせを形成することができる。タンパク質および抗体はペプチドであり、したがってこの用語に含まれるが、それらの重要度ゆえに別に命名されることもある。
本明細書において用いられる用語「アミノ酸」は、-CH(NH3)-COOH基を有する有機化合物を意味する。1つの態様において、用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸であるアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、およびグリシンを意味する。しかし、この用語は、そのより広い意味において非天然アミノ酸も含む。
本発明のアミノ酸およびペプチドは、官能基において修飾されることもできる。非限定例は、糖類、例えば、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）；または保護基、例えば、フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）-修飾もしくはエステルである。
用語「タンパク質」は、アミノ酸残基の1つまたは複数の長鎖を含むペプチド、例えば、約30個超のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。タンパク質は、代謝反応の触媒、DNA複製、刺激への反応、および分子の輸送、反応の触媒を含む、インビボおよびインビトロでの多くの機能を実施する。タンパク質は特定の3次元構造に折り畳まれる。タンパク質中の残基は（例えば、翻訳後修飾によって）化学的に修飾されることが多く、それによって物理化学的性質、折り畳み、安定性、活性、および最終的にはタンパク質の機能が変わる。タンパク質に非ペプチド性の族/基（これは補欠分子族または補助因子と呼ばれ得る）が結合している場合もある。複数のタンパク質（酵素および補酵素を含む）が特定の機能を達成するように共に作用することもでき、これらは会合して安定なタンパク質複合体を形成することが多い。これらの形態はすべて用語「タンパク質」に含まれる。
本明細書において用いられる用語「タンパク質タグ」は、様々な目的のために本発明のリンカーを介してタンパク質または他のチオール含有化合物に結合し得る、ペプチド配列を意味する。タンパク質タグの非限定例は、アフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、およびレポーター酵素である。
アフィニティータグは、例えば、アフィニティー技術を用いて精製することができるように、本発明のリンカーを介してタンパク質および他のチオール含有化合物に付加される。これらには、例えば、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質（MBP）、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、またはポリ(His)タグが含まれる。
可溶化タグは、タンパク質の適切な折り畳みを補助し、これらが沈澱しないように維持するために用いることができる。これらには、チオレドキシン（TRX）およびポリ(NANP)が含まれる。いくつかのアフィニティータグ（例えば、MBPおよびGST）は、可溶化剤としての二重の役割を有する。
クロマトグラフィータグは、特定の分離技術において異なる分解能を提供するために、タンパク質のクロマトグラフィー特性を変えるために用いられる。多くの場合、これらはポリアニオン性アミノ酸、例えばFLAG-タグからなる。
エピトープタグは、多くの異なる種において高親和性抗体が確実に産生され得るために選択される、短いペプチド配列である。これらは通常はウイルス遺伝子に由来する。エピトープタグには、V5-タグ、Myc-タグ、HA-タグ、およびNE-タグが含まれる。これらのタグは、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光および免疫沈降実験、ならびに抗体精製のために特に有用である。
本明細書において用いられる用語「レポーター酵素」は、生化学的検出においてシグナルの増大を可能にする任意の公知の酵素を意味する。非限定例は、アルカリホスファターゼ（AP）、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）またはグルコースオキシダーゼ（GOX）などの色素生成酵素；緑色蛍光タンパク質（GFP）、レドックス感受性GFP（RoGFP）、AzuriteまたはEmeraldなどの蛍光タンパク質；ルシフェラーゼ、すなわち生物発光を生じる酸化酵素のクラス（例えば、ホタルルシフェラーゼ（EC 1.13.12.7））；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）；β-ガラクトシダーゼ；またはβ-グルクロニダーゼである。
タンパク質タグの非限定例は下記である：AviTag、酵素BirAによるビオチン化を可能にししたがってタンパク質をストレプトアビジンによって単離することができるペプチド
Figure 2021516959
；カルモジュリン-タグ、タンパク質カルモジュリンに結合されるペプチド
Figure 2021516959
；ポリグルタミン酸タグ、Mono-Qなどのアニオン交換樹脂に効率的に結合するペプチド（EEEEEE）；E-タグ、抗体によって認識されるペプチド
Figure 2021516959
；FLAG-タグ、抗体によって認識されるペプチド（DYKDDDDK）；HA-タグ、抗体によって認識されるヘマグルチニン由来ペプチド（YPYDVPDYA）；His-タグ、ニッケルまたはコバルトキレートによって結合される5〜10個のヒスチジン（HHHHHH）；Myc-タグ、抗体によって認識されるc-myc由来ペプチド（EQKLISEEDL）；NE-タグ、モノクローナルIgG1抗体によって認識されウェスタンブロッティングとELISA、フローサイトメトリーと免疫細胞化学と免疫沈降と組換えタンパク質のアフィニティー精製とを含む広範囲の用途において有用である新規18アミノ酸合成ペプチド
Figure 2021516959
；S-タグ、リボヌクレアーゼA由来ペプチド
Figure 2021516959
；SBP-タグ、ストレプトアビジンに結合するペプチド
Figure 2021516959
；哺乳動物発現用のSoftag 1
Figure 2021516959
；原核生物発現用のSoftag 3（TQDPSRVG）；Strep-tag、ストレプトアビジン、またはstreptactinと呼ぶ改変ストレプトアビジンに結合するペプチド（Strep-tag II: WSHPQFEK）；TCタグ、FlAsHおよびReAsH二ヒ素化合物によって認識されるテトラシステインタグ（CCPGCC）；V5タグ、抗体によって認識されるペプチド
Figure 2021516959
；VSV-タグ、抗体によって認識されるペプチド
Figure 2021516959
；Xpressタグ（DLYDDDDK）；Isopepタグ、pilin-Cタンパク質に共有結合するペプチド
Figure 2021516959
；SpyTag、SpyCatcherタンパク質に共有結合するペプチド
Figure 2021516959
；SnoopTag、SnoopCatcherタンパク質に共有結合するペプチド
Figure 2021516959
；BCCP（ビオチンカルボキシル担体タンパク質（Biotin Carboxyl Carrier Protein））、BirAによってビオチン化されて、ストレプトアビジンによる認識を可能にするタンパク質ドメイン；グルタチオン-S-トランスフェラーゼ-タグ、固定グルタチオンに結合するタンパク質；緑色蛍光タンパク質-タグ、自然蛍光性であり、ナノボディによって結合され得るタンパク質；Halo-タグ、HaloLink(商標) Resin（Promega）に共有結合する変異ヒドロラーゼ；マルトース結合タンパク質-タグ、アミロースアガロースに結合するタンパク質；Nus-タグ；チオレドキシン-タグ；Fc-タグ、免疫グロブリンFcドメインに由来し、二量体化および可溶化を可能にし、Protein-A Sepharoseでの精製に用いることができる；無秩序さを促進するアミノ酸（disorder promoting amino acid）（P、E、S、T、A、Q、G、..）を含有するDesigned Intrinsically Disorderedタグ；アルカリホスファターゼ（AP）；西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）グルコースオキシダーゼ（GOX）；緑色蛍光タンパク質（GFP）；レドックス感受性GFP（RoGFP）；Azurite；Emerald；ホタルルシフェラーゼ（EC 1.13.12.7））；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）；β-ガラクトシダーゼ；β-グルクロニダーゼ；チューブリン-チロシンリガーゼ（TTL）。
本明細書において用いられる用語「抗体」は、好ましくは4つのポリペプチド鎖、典型的にはジスルフィド結合によって相互連結された2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖からなる免疫グロブリン分子を指すことが意図されている。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてVHと略す）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、例えば、3つのドメインCH1、CH2、およびCH3を含み得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてVLと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、1つのドメイン（CL）からなる。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端へと、例えば、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配列された、3つのCDRおよび最大4つのFRからなる。
本明細書において用いられる用語「相補性決定領域」（CDR；例えば、CDR1、CDR2、およびCDR3）は、抗原との結合に必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。各可変ドメインは、典型的には、CDR1、CDR2、およびCDR3として特定される3つのCDR領域を有する。各相補性決定領域は、Kabatによって定義された「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域におけるおよその残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、および89〜97（L3）、ならびに重鎖可変領域における31〜35（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）；ならびに/または「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変領域におけるおよその残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、および91〜96（L3）、ならびに重鎖可変領域における26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3））を含み得る。いくつかの場合に、相補性決定領域は、Kabatによって定義されるCDR領域と、超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。
インタクトな抗体を、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて異なる「クラス」に割り付けることができる。インタクトな抗体には、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMという5つの主なクラスがあり、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類され得る。本発明において用いるのに好ましい免疫グロブリンのクラスは、IgGである。
異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、それぞれ［アルファ］、［デルタ］、［イプシロン］、［ガンマ］、および［ミュー］と呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知である。本明細書において用いられる抗体は、慣習的に公知の抗体およびその機能性断片である。
本明細書における抗体/免疫グロブリンの「機能性断片」または「抗原結合性の抗体断片」は、抗原結合領域を保持する抗体/免疫グロブリンの断片（例えば、IgGの可変領域）と定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の1つまたは複数の超可変領域、例えば、CDR1、-2、および/または-3領域において見出されるが；可変「フレームワーク」領域も、CDRの骨格を提供するなどにより、抗原結合において重要な役割を果たし得る。好ましくは、「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽（VL）鎖のアミノ酸残基4〜103および可変重（VH）鎖のアミノ酸残基5〜109、より好ましくはVLのアミノ酸残基3〜107およびVHのアミノ酸残基4〜111を含み、特に、VLおよびVH鎖全体（VLのアミノ酸1〜109位およびVHのアミノ酸1〜113位；WO 97/08320による番号付け）が好ましい。
本発明の「機能性断片」、「抗原結合性の抗体断片」、または「抗体断片」には、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、およびFv断片；二重特異性抗体；単一ドメイン抗体（DAb）、線状抗体；単鎖抗体分子（scFv）；ならびに抗体断片から形成された多重特異性（例えば、二重および三重特異性）抗体が含まれるが、それらに限定されない。「多重特異性」または「多機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位それぞれが同じであることが理解される。CH1ドメインとCLドメインとの間で起こる分子間ジスルフィド相互作用を最小限にするかまたは完全に除去するように、F(ab')2またはFabを操作してもよい。
本明細書における用語「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然配列Fc領域およびバリアントFc領域を含む。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226またはPro230から重鎖のカルボキシル末端におよぶ。しかし、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は存在しても、しなくてもよい。本明細書において特に記載がないかぎり、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、EUインデックスとも呼ばれるEU番号付けシステムによる。
本発明において企図される抗体または抗原結合性の抗体断片のバリアントは、抗体または抗原結合性の抗体断片の結合活性が維持されている分子である。
本発明において企図される「結合タンパク質」は、例えば、Affibody、Adnectin、Anticalin、DARPin、アビマー（Avimer）、ナノボディなどの抗体類似物質である。
本明細書における「ヒト」抗体またはその抗原結合断片は、キメラではなく（例えば、「ヒト化」されておらず）、かつ非ヒト種由来ではない（全体または部分のいずれでも）ものと定義される。ヒト抗体またはその抗原結合断片は、ヒト由来であり得、または合成ヒト抗体であり得る。本明細書における「合成ヒト抗体」は、その全体または一部が、インシリコでの公知のヒト抗体配列の分析に基づく合成配列に由来する配列を有する、抗体と定義される。ヒト抗体配列またはその断片のインシリコ設計は、例えば、ヒト抗体または抗体断片配列のデータベースを解析し、それから得たデータを用いてポリペプチド配列を考案することにより達成され得る。ヒト抗体またはその抗原結合断片の別の例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリ（例えば、ヒト天然供給源から得た抗体に基づいているライブラリ）から単離された核酸によってコードされるものである。
「ヒト化抗体」またはそのヒト化抗原結合断片は本明細書において、（i）非ヒト供給源（例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス）に由来し、その抗体はヒト生殖系配列に基づく；（ii）非ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸が遺伝子操作によってヒトアミノ酸配列に部分的に交換されている、または（iii）可変領域のCDRは非ヒト起源に由来するが、可変領域の1つまたは複数のフレームワークはヒト起源のものであり、（あれば）定常領域はヒト起源のものである、CDRが移植されたものと定義される。
「キメラ抗体」またはその抗原結合断片は本明細書において、可変領域が非ヒト起源に由来し、いくつかまたはすべての定常領域がヒト起源に由来するものと定義される。
本明細書において用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体の集団から得た抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかに存在し得る可能な変異（例えば、自然発生変異）以外は同一である。したがって、用語「モノクローナル」は、抗体の特徴が別々の抗体の混合物ではないことを示す。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する抗体である。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体製剤は、典型的には他の免疫グロブリンが混入していないために有利である。用語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈されるべきではない。用語：モノクローナル抗体は、特にキメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を含む。
「単離された」抗体は、同定され、それを発現した細胞の構成要素から分離されたものである。細胞の混入構成要素は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。
本明細書において用いられる場合、抗体が関心対象の抗原（例えば、腫瘍関連ポリペプチド抗原標的）に「特異的に結合する」、該抗原に「特異的である」、または該抗原を「特異的に認識する」とは、該抗体が、該抗原を発現する細胞または組織を標的とする場合に治療剤として有用であり、かつ他のタンパク質と著しく交差反応しない、または前述の抗原標的のオルソログおよびバリアント（例えば、変異型、スプライスバリアント、またはタンパク質分解により切断された型）以外のタンパク質と著しく交差反応しないような十分な親和性で、抗原と結合するものである。本明細書において用いられる特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープを「特異的に認識する」またはそれに「特異的に結合する」またはそれに対して「特異的である」という用語は、抗体またはその抗原結合断片の抗原に対する一価のKDが、例えば、約10-4M未満、または約10-5M未満、または約10-6M未満、または約10-7M未満、または約10-8M未満、または約10-9M未満、または約10-10M未満、または約10-11M未満、または約10-12M未満、またはそれ未満であることによって示され得る。抗体が抗原と1つまたは複数の基準抗原とを識別し得る場合、そのような抗体はそのような抗原に「特異的に結合する」、該抗原に「特異的である」または該抗原を「特異的に認識する」。その最も一般的な形態で、「特異的結合」、「特異的に結合する」、「特異的である」、または「特異的に認識する」とは、抗体が関心対象の抗原と無関係の抗原とを識別する能力を意味し、例えば、以下の方法のうちの1つにより判定される。そのような方法には、表面プラズモン共鳴法（SPR）、ウェスタンブロット、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-試験およびペプチドスキャンが含まれるが、それらに限定されない。例えば、標準的なELISA法を実施することができる。スコア化は標準的な発色（例えば、二次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼおよびテトラメチルベンジジンと過酸化水素）によって実施してもよい。一定のウェル中の反応を、例えば、450nmの光学密度によりスコア化する。典型的バックグラウンド（＝陰性反応）は0.1 ODであり得；典型的陽性反応は1 ODであり得る。これは、陽性/陰性の差が5倍よりも大きい、10倍よりも大きい、50倍よりも大きい、好ましくは100倍よりも大きいことを意味する。典型的には、結合特異性の判定は、単一の基準抗原ではなく、粉乳、BSA、トランスフェリンなどの、約3〜5つの無関係の抗原のセットを用いて実施する。
「結合親和性」または「親和性」とは、分子の1つの結合部位とその結合相手との間の非共有相互作用の合計の強さを意味する。特に記載がないかぎり、本明細書において用いられる「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）の構成員の間の1：1相互作用を反映する、固有の結合親和性を意味する。解離定数「KD」は一般に、分子（例えば抗体）とその結合相手（例えば抗原）との間の親和性、すなわち、リガンドが特定のタンパク質にいかにしっかりと結合するかを述べる。リガンド-タンパク質親和性は、2つの分子間の非共有分子間相互作用によって影響される。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当技術分野において公知の一般的方法によって測定することができる。1つの態様において、本発明の「KD」または「KD値」は、Biacore T100、Biacore T200、Biacore 2000、Biacore 4000、Biacore 3000のようなBiacore機器（GE Healthcare Biacore, Inc.）、またはProteOn XPR36機器（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を含むが、それらに限定されない、適切な装置を用いた表面プラズモン共鳴アッセイ法を用いて測定する。
本明細書において用いられる用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオシド部分」は、糖基および複素環塩基を含む核酸サブユニット、ならびにそのようなサブユニットの類縁体、例えば、修飾もしくは天然デオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオシドまたはその任意の化学修飾体を意味する。他の基（例えば、保護基）をヌクレオシドの任意の構成要素に結合することができる。ヌクレオシドの修飾には、2'-、3'-および5'-位糖修飾、5-および6-位ピリミジン修飾、2-、6-および8-位プリン修飾、環外アミンの修飾、5-ブロモ-ウラシルの置換などが含まれるが、それらに限定されない。ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマー、H-ホスホネートカップリング、またはリン酸トリエステルカップリングを用いた固相自動合成などの、当技術分野において公知の方法によるオリゴヌクレオチド合成を可能にするよう、ヌクレオシドを適切に保護し、誘導体化することができる。
「ヌクレオチド」または「ヌクレオチド部分」とは、リン酸基、糖基、および複素環塩基を含む核酸のサブユニット、ならびにそのようなサブユニットの類縁体を意味する。他の基（例えば、保護基）をヌクレオチドの任意の構成要素に結合することもできる。用語「ヌクレオチド」は、修飾または天然デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを意味してもよい。ヌクレオチドは、いくつかの場合、プリンおよびピリミジンを含み、これらはチミジン、シチジン、グアノシン、アデニン、およびウリジンを含む。用語「ヌクレオチド」は、公知のプリンおよびピリミジン塩基（例えば、アデニン（A）、チミン（T）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはウラシル（U））を含有する部分だけでなく、修飾されている他の複素環塩基を含有する部分も含むことが意図される。そのような修飾体には、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環が含まれる。そのような修飾には、例えば、ジアミノプリンおよびその誘導体、イノシンおよびその誘導体、アルキル化プリンもしくはピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、チオール化プリンもしくはピリミジンなど、またはアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、9-フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジブチルホルムアミジン、ジメチルアセトアミジン、N,N-ジフェニルカルバメートなどの保護基の付加が含まれる。プリンまたはピリミジン塩基は前述のものの類縁体であってもよく；適切な類縁体は当業者には公知であり、関連する教科書および文献中に記載されている。一般的な類縁体には、1-メチルアデニン、2-メチルアデニン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N6-イソペンチルアデニン、N,N-ジメチルアデニン、8-ブロモアデニン、2-チオシトシン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、5-エチルシトシン、4-アセチルシトシン、1-メチルグアニン、2-メチルグアニン、7-メチルグアニン、2,2-ジメチルグアニン、8-ブロモグアニン、8-クロログアニン、8-アミノグアニン、8-メチルグアニン、8-チオグアニン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、5-エチルウラシル、5-プロピルウラシル、5-メトキシウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)ウラシル、5-(カルボキシメチルアミノメチル)-ウラシル、2-チオウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-(2-ブロモビニル)ウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、1-メチルシュードウラシル、キューオシン、イノシン、1-メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、2-アミノプリン、6-ヒドロキシアミノプリン、6-チオプリンおよび2,6-ジアミノプリンが含まれるが、それらに限定されない。
本明細書において用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、前記で定義されたとおりの複数の連結ヌクレオチド単位から形成されるポリヌクレオチドを意味する。ヌクレオチド単位はそれぞれ、リン酸連結基、またはその類縁体を介して一緒に連結されたヌクレオシド単位を含む。オリゴヌクレオチドなる用語は、ホスホロチオエート連結またはスクアラミド連結などのリン酸連結以外の連結を介して一緒に連結された複数のヌクレオチドも意味する。オリゴヌクレオチドは天然または非天然であり得る。いくつかの場合に、オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドモノマーを含んでもよく（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであってもよく）、かつ/またはデオキシリボヌクレオチドモノマーを含んでもよい。実例として、オリゴヌクレオチドは、2〜50ヌクレオチド単位、例えば2〜40ヌクレオチド単位、例えば5〜35ヌクレオチド単位、例えば10〜35ヌクレオチド単位、例えば15〜30ヌクレオチド単位から構成されていてもよい。
本明細書において用いられる用語「単糖」は、mが3、4、5、6、7、または8であり、かつnが2、3、4、5 6、7、または8である、一般式Cm(H2O)nの鎖状または環式化合物を意味する。しかし、この用語は、OH基がNH2基で置き代えられたこれらの塩基性化合物誘導体（例えば、グルコサミン）、少なくとも1つのOH基がHで置き代えられたデオキシ糖（例えば、デオキシリボース）も含む。単糖の好ましい例は、D-(+)-グリセリンアルデヒド；D-(-)-エリトロース；D-(-)-トレオース；D-(-)-リボース；D-(-)-アラビノース；D-(+)-キシロース；D-(-)-リキソース；D-(+)-アロース；D-(+)-アルトロース；D-(+)-グルコース；D-(+)-マンノース；D-(-)-グロース；D-(-)-イドース；D-(+)-ガラクトース；D-(+)-タロース；ジヒドロキシアセトン；D-エリトルロース；D-リブロース；D-キシルロース；D-プシコース；D-フルクトース；D-ソルボース；D-タガトースである。用語：単糖は、1、2、3または4つのヒドロキシル基が置換されている単糖も含む。
用語「多糖」は、グリコシド結合を介して連結された少なくとも2個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは少なくとも10個の単糖を含む分子を意味する。
本明細書において用いられる糖質は、単糖および多糖ならびにその誘導体を含む。
本明細書において用いられるポリマーは、多くの反復有機サブユニットからなるが、多糖、オリゴヌクレオチド、またはペプチドではない高分子を意味する。ポリマーの例は、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリオキシエチレン（PEO）またはポリグリセロール（例えば、ポリリシノール酸ポリグリセロール（PGPR））である。
用語「フルオロフォア」は当業者に周知であり、光励起後に光を再放射する化学化合物を意味する。非限定例は、CY5、EDANS、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Oregon green、エオシン、Texas red）、シアニン誘導体（例えば、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、メロシアニン）、スクアライン誘導体（例えば、Seta、Se Tau、Square色素）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシルまたはプロダン誘導体）、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体（例えば、DRAQ5、DRAQ7、CyTRAK Orangeなどのアントラキノン）、ピレン誘導体（例えば、cascade blue）、オキサジン誘導体（例えば、Nile red、Nile blue、Cresyl violet）、アクリジン誘導体（例えば、Proflavin、Acridine Orange、Acridine Yellow）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、Crystal Violet、Malachite Green）、またはテトラピロール誘導体（例えば、Parphin、Phthal ocyanine、Bilirubin）である。
本明細書において用いられる用語「脂肪族または芳香族残基」は、脂肪族置換基、例えば、アルキル残基であるが、さらなる脂肪族および/または芳香族置換基で置換されていてもよい残基を意味し、例えば、脂肪族残基は、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素、補酵素、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、多糖、ポリマー、フルオロフォア、置換されていてもよいベンゼンなどであり得る（そのような分子のコア構造への直接連結（R1の場合、例えば、式（I）、（I*）、（III）、または（III*）などの化合物のそれぞれの酸素への直接連結）が脂肪族であるかぎりにおいて）。芳香族残基は、コア構造への該置換基の直接連結が芳香族系の一部である、置換基であり、例えば、コア構造へのペプチドの直接連結が、例えばフェニル残基を介する直接連結である場合は置換されていてもよいフェニルもしくはピリジルもしくはペプチドである。
用語「抗体薬物コンジュゲート」または略してADCは、当業者には周知であり、本明細書において用いられるとおり、抗体またはその抗原結合断片が薬物（例えば、化学療法剤、毒素、免疫療法剤、造影プローブなど）と連結されたものを意味する。本明細書において用いられる用語「リンカー」は、抗体またはその抗原結合断片を薬物に共有結合する任意の化学部分である。リンカーは、当技術分野において公知の任意のリンカーであってもよい。本明細書において用いられる用語「リンカー薬物コンジュゲート」は、本明細書において前記で定義されたとおりのリンカー、および薬物を含むかまたはそれらからなる分子または化学基を意味する。これに関して、用語「リンカー薬物コンジュゲート」は一般には、抗体でもその抗原結合断片でもない抗体薬物コンジュゲートの一部分を意味する。一般に、リンカー薬物コンジュゲートにおいて、リンカーは薬物に共有結合されている。実例として、本発明において用いるリンカーは、自己切断ペプチドを含んでもよく、これは酵素、例えば、カテプシンBによって切断されてもよい。特に、本発明において用いる自己切断ペプチドを含むリンカーは、バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル
Figure 2021516959
、バリン-アラニン-p-アミノベンジルオキシカルボニル
Figure 2021516959
、リジン-フェニルアラニン-p-アミノベンジルオキシカルボニル
Figure 2021516959
、またはバリン-リジン-p-アミノベンジルオキシカルボニル
Figure 2021516959
を含んでもよい。例えば、自己切断ペプチドを含むリンカーは、
Figure 2021516959
であってもよく、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつ*は薬物の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。自己切断ペプチドを有するリンカーは、例えば、米国特許出願公開第2006/0074008号、G.M. Dubowchik et al., Bioconjuate Chem. 2002, 13, 855-869、またはS.O. Doronina et al., Nature Biotechnology, vol. 21, 778-784 (2003)に開示されており、これらの文書の全開示は参照により本明細書に組み入れられる。リンカー-薬物コンジュゲートは、
Figure 2021516959
であってもよく、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。実例として、本発明において用いる薬物は、オーリスタチン、好ましくはモノメチルオーリスタチンE（MMAE）またはモノメチルオーリスタチンF（MMAF）であってもよい。好ましくは、オーリスタチン、特にMMAEまたはMMAFは、例えば、VC-PAB、VA-PAB、KF-PAB、またはVK-PABなどの自己切断ペプチドとの組み合わせで用いてもよい。したがって、本明細書において用いるリンカー薬物コンジュゲートは、VC-PAB-MMAE、VC-PAB-MMAF、VA-PAB-MMAE、VA-PAB-MMAF、KF-PAB-MMAE、KF-PAB-MMAF、VK-PAB-MMAEまたはVK-PAB-MMAFを含んでもよい。特に、リンカー薬物コンジュゲートは、
Figure 2021516959
であってもよく、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。
「抗体フルオロフォアコンジュゲート」、すなわち略してAFCもまた、本明細書において記載され、これは抗体またはその抗原結合断片のフルオロフォア、例えばCy5との連結を意味する。フルオロフォアは抗体またはその抗原結合断片に、リンカーを通じて連結されてもよい。リンカーは、当業者には公知の任意のリンカーであってもよい。抗体フルオロフォアコンジュゲートは「リンカーフルオロフォアコンジュゲート」を含んでもよい。本明細書において用いられる「リンカーフルオロフォアコンジュゲート」なる用語は、本明細書において前記で定義されたとおりのリンカー、およびフルオロフォアを含む、またはそれらからなる分子または化学基を意味する。これに関して、「リンカーフルオロフォアコンジュゲート」なる用語は一般には、抗体またはその抗原結合断片ではない、抗体フルオロフォアコンジュゲートの一部を意味する。一般に、リンカーフルオロフォアコンジュゲートにおいて、リンカーはフルオロフォアに共有結合されている。
本明細書において用いられる「低分子」なる用語は、少なくとも2個の炭素原子を含むが、好ましくは7個以下、12個以下、15個以下、または20個以下の回転可能な炭素結合、より好ましくは7個以下、12個以下、または15個以下の回転可能な炭素結合、さらにより好ましくは7個以下または12個以下の回転可能な炭素結合を含み、100〜2000ダルトン、好ましくは100〜1000ダルトンの範囲の分子量を有し、かつ任意で1つまたは2つの金属原子を含む、有機分子を意味する。低分子の単なる実例として、ビオチンならびにフルオロフォアEDANSおよびCy5が記載されてもよい。
方法
本発明は、チオール含有化合物の、アルケンホスホノチオレートまたはアルキンホスホノチオレートおよびアルケンホスホネートまたはアルキンホスホネートとの新しい反応を提供する。スキーム1は、本発明の一般反応を記載し、実例として、エテニルホスホノチオレートおよびエチニルホスホノチオレートならびにエテニルホスホネートおよびエチニルホスホネートを用いる。
スキーム1：
Figure 2021516959
●＝脂肪族または芳香族残基：例えば、ビオチン、フルオロフォア、低分子、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド
Figure 2021516959
＝チオール含有分子：例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド
R1＝脂肪族または芳香族残基
Y＝S（硫黄）、O（酸素）
本明細書に記載の方法は、大量の異なる有機残基を位置R1、●および
Figure 2021516959
において組み合わせることを可能にすると示されている。特に、本発明の方法は、
Figure 2021516959
がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドである場合に、コンジュゲートの形成に適している。利点として、そのようなアミノ酸、ペプチド、タンパク質もしくは抗体中に存在するチオール基、例えば、システイン残基のチオール基、またはヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド中に存在するチオール基は、アルケンホスホノチオレートもしくはアルキンホスホノチオレートまたはアルケンホスホネートもしくはアルキンホスホネートと化学選択的に反応し、したがって化学選択的修飾法を提供する。そのような化学選択性ゆえに、チオール含有化合物、特にアミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは保護されていなくてもよく、すなわち、保護基は必須ではない。アルケンホスホノチオレートもしくはアルキンホスホノチオレートまたはアルケンホスホネートもしくはアルキンホスホネートは電子不足のアルケンホノチオレートもしくはアルキンホスホノチオレートまたはアルケンホスホネートもしくはアルキンホスホネートであってもよい。
さらに、本発明の方法は、2つの複雑な分子の結合を可能にする。例えば、タンパク質を抗体または別のタンパク質にカップリングしてもよい。
本明細書において以下が示される。
・求電子性のアルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートならびにアルケンホスホネートおよびアルキンホスホネートの合成。
・電子不足のアルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートならびにアルケンホスホネートおよびアルキンホスホネートの、アミノ酸、ペプチド、タンパク質および抗体を含むチオール含有分子とのコンジュゲーション反応。
・生理的に関連する条件下でのこれらのコンジュゲートの安定性。
・コンジュゲーションは、例えば、生理的pHなどの生理的に関連する条件下ではたらく。
本発明は、いくつかの革新的局面を特徴とし、それらは抗体またはタンパク質コンジュゲートなどのコンジュゲートの利用可能性を、以下の新規コンジュゲーション化学によってさらに容易にする。
・様々な化合物、例えば、低分子、タンパク質および抗体中のチオールを修飾するための反応。
・2つの複雑な分子（例えば、フルオロフォアおよびタンパク質または抗体）を単純なコンジュゲーションにより連結することができ、これはペプチド、タンパク質または抗体の場合にはシステイン選択的である。
・通常のマレイミド試薬に対してコンジュゲートの高い安定性；迅速なコンジュゲーション反応。
・ペプチド、タンパク質、および抗体の他の修飾法またはコンジュゲート法に対して、システイン選択性ゆえに、アルケンホスホノチオレートホスホノチオレートもしくはアルキンホスホノチオレートの調製後、またはアルケンホスホネートもしくはアルキンホスホネートの調製後、および/あるいは化学選択的コンジュゲーション後の保護基操作の必要なし。
・不飽和ホスホノチオレートは、対応するホスホネートよりも、チオール付加においてかなり速く反応するため、重要な利点を示す。速い反応速度は、それにより変換と、同じく収率も高まり得るため、バイオコンジュゲーション反応のために非常に望ましい。得られるチオール-ホスホノチオレートコンジュゲートは、生理的に関連する条件下で良好な安定性を示す。
・固相合成後に固体支持体からペプチドを切断するために典型的に用いる、酸性条件下でのホスホノチオレートの高い安定性。
ホスホノチオレート、およびホスホネートへのチオール付加の例は、報告が非常に少なく、例えば、特許文書US3904710A、GB917085、GB863434、DE1064512、ならびにGao et al., Chemistry Eur. J. 2009, 15(9), 2064-2070；Khusinova et al., Russian Chemical Bulletin, International Edition, 2004, vol. 53, no. 10, pp. 2253-2256、およびAcheson et al., Journal of Chemical Research, Synopses, 1986の出版物を参照されたい。しかし、ホスホノチオレートへのチオール付加はこれらの文書ではまったく報告されていない。さらに、これらの文書は、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、またはオリゴヌクレオチドなどの生体分子の修飾には関係しておらず、生理的に関連する条件下での反応速度および安定性の問題にいかなる言及もしていない。
一般に、本発明の方法を実施して、低分子（例えば、置換されていてもよいアルキル、フェニル、または複素環）、ペプチド、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド、または多糖などの異なる化合物を、タグ、タンパク質、オリゴヌクレオチドなどとコンジュゲートさせることができる。したがって、本発明は、式（III）の化合物の調製のための方法に関し、該方法は、
式（I）
Figure 2021516959
の化合物を、式（II）
Figure 2021516959
のチオール含有分子と反応させて、式（III）
Figure 2021516959
の化合物を生成させる段階であって、
式（I）中、
Figure 2021516959
は二重結合または三重結合を表し；
Xは、
Figure 2021516959
が三重結合である場合、R3-Cを表し；
Xは、
Figure 2021516959
が二重結合である場合、(R3R4)Cを表し；
YはSまたはOを表し；
R1は置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表し；
R3はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；
R4はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；かつ
●は脂肪族または芳香族残基を表し、
式（II）中
Figure 2021516959
は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表し、
式（III）中
Figure 2021516959
は、式（I）の化合物中の
Figure 2021516959
が二重結合を表す場合、結合を表すか；または
Figure 2021516959
は、式（I）の化合物中の
Figure 2021516959
が三重結合を表す場合、二重結合を表し；かつ
Figure 2021516959
、●、R1、X、およびYは式（I）および（II）の化合物について定義されたとおりである、
段階を含む。
式（I）の化合物を式（II）の化合物と反応させて式（III）の化合物を得る、本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、
Figure 2021516959
は二重結合を表し、Xは(R3R4)Cを表し、R3およびR4は独立にHまたはC1〜C8-アルキルを表し、かつ
Figure 2021516959
は結合を表す。好ましくは、R3およびR4は独立にHまたはC1〜C6-アルキル、より好ましくはHまたはC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくはHまたはC1〜C2-アルキルを表す。好ましい態様において、R3およびR4は同じである。好ましい態様において、R3およびR4はいずれもHである。
または、式（I）の化合物を式（II）の化合物と反応させて式（III）の化合物を得る、本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、
Figure 2021516959
は三重結合を表し、XはR3-Cを表し、R3はHまたはC1〜C8-アルキルを表し、かつ
Figure 2021516959
は二重結合を表す。好ましくは、R3はHまたはC1〜C6-アルキル、より好ましくはHまたはC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくはHまたはC1〜C2-アルキルを表す。好ましい態様において、R3はHである。
式（I）の化合物を式（II）の化合物と反応させて式（III）の化合物を得る、本発明の方法のうちのいずれか1つにおいて、YはS（硫黄）またはO（酸素）であってもよい。YがSである場合、化合物（I）および（III）はホスホノチオレートを表す。YがOである場合、化合物（I）および（III）はホスホネートを表す。したがって、いくつかの態様において、YはSである。いくつかの態様において、YはOである。式（I）の化合物を式（II）の化合物と反応させて式（III）の化合物を得る、方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、YはSである。本発明者らは、式（II）のチオールの、ホスホノチオレート、すなわちYがSである場合の三重結合または二重結合への付加は、対応するホスホネート、すなわちYがOである場合への付加よりもかなり速いことを見出した。そのような速い反応速度は、それによって変換および収率が高まるため、非常に望ましい。
式（I）の化合物の調製は、式中、R1、X、Y、
Figure 2021516959
、および●が本明細書において前記および下記で定義されたとおりである、式（IV）
Figure 2021516959
の化合物を、酸化剤と反応させて、式（I）の化合物を生成することを含んでもよい。酸化剤は、tert-ブチルヒドロペルオキシド（tBu-OOH）、メタクロロ過安息香酸（mCPBA）、過酸化水素（H2O2）、ヨウ素（I2）、ペルオキシ一硫酸カリウム、または酸素（O2）、例えば、空気からの酸素からなる群より選択されてもよい。好ましくは、酸化剤はtert-ブチルヒドロペルオキシド（tBu-OOH）である。式（IV）の化合物の調製は、三ハロゲン化リン（X）、好ましくはPCl3を、順番に（i）R1-OH（XI）、（ii）R2が独立にC1〜C8-アルキルを表す、
Figure 2021516959
、（iii）Halが、Cl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはBrを表す、
Figure 2021516959
、ならびに（IV）
Figure 2021516959
と反応させて、式（IV）の化合物を生成することを含んでもよく；
ここで、R1、X、Y、
Figure 2021516959
、および●は本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。三ハロゲン化リンはPCl3、PBr3、またはPI3であってもよく、PCl3が好ましい。
Figure 2021516959
中のR2は独立にC1〜C8-アルキル、好ましくはC1〜C6-アルキル、より好ましくはC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくはC1〜C3-アルキルを表す。好ましくは、両方のR2は同じである。さらにより好ましくは、両方のR2はイソプロピルである。好ましくは、
Figure 2021516959
を反応させる段階（iv）を、テトラゾール存在下で実施する。テトラゾールは無置換テトラゾールまたは置換テトラゾールであってもよい。
または、YがSである場合、式（I）の化合物の調製は、
式（V）
Figure 2021516959
の化合物を式（VIa）または（VIb）
Figure 2021516959
の化合物と反応させて、式（I）の化合物を生成することを含んでもよく；
式中、EWGは電子吸引基を表し、該電子吸引基は好ましくは、
Figure 2021516959
からなる群より選択され、ここで#はSの位置を示し；Halは、Cl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClを表し、かつ
ここで、R1、X、
Figure 2021516959
、および●は本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。好ましくは、式（V）の化合物中、両方のR1は同じである。より好ましくは、式（VIa）の化合物を用いる場合、EWGは
Figure 2021516959
である。式（V）の化合物は、例えば、
Figure 2021516959
を
Figure 2021516959
と反応させて式（V）の化合物を得る段階を含む方法によって、調製することができ、ここで、R1、X、および
Figure 2021516959
は本明細書において前記および下記で定義されたとおりであり；かつHal1はCl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClであり；かつHal2はCl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはBrである。式（VIa）の化合物は、例えば、化合物
Figure 2021516959
を
Figure 2021516959
と反応させて式（VIa）の化合物を得ることにより調製することができ、ここで、EWGは電子吸引基、好ましくは
Figure 2021516959
からなる群より選択される電子吸引基であり、ここで#はSの位置を示し、より好ましくは
Figure 2021516959
であり；好ましくは、式（XXX）の化合物中、両方のEWGは同じであり；かつここで●は本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。式VIbの化合物は、文献で公知の手順に従い、例えば、チオール
Figure 2021516959
を塩化スルフリル（例えば、Allared, F. et al, Synthetic Metals, 120(1-3), 1061-1062; 2001参照）もしくは塩化チオニル（例えば、Masaki, Yukio et al, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 33(5), 1930-40; 1985参照）と反応させることにより、またはチオール
Figure 2021516959
をN-クロロスクシンイミド（NCS）（例えば、Kawamura, Takamasa et al. European Journal of Organic Chemistry, 2015(4), 719-722; 2015参照）もしくは塩素（例えば、E. Schneidet, Chemische Berichte 84, 911-916 (1951)参照）と反応させることにより調製することができ、ここで●は本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。
好ましくは、式（I）の化合物を、式（V）の化合物を式（VIa）または（VIb）の化合物と反応させることにより調製する場合、式（V）の化合物中の
Figure 2021516959
は二重結合であり、かつXは(R3R4)Cを表し、ここでR3およびR4は本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。
本発明は、式（III*）の化合物の調製のための方法に関し、該方法は、
式（I*）
Figure 2021516959
の化合物を、式（II）
Figure 2021516959
のチオール含有分子
と反応させて、式（III*）
Figure 2021516959
の化合物を生成させる段階であって、
式（I*）中、
VはC1〜C8-アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し；
Xは(R3R4)Cを表し；
YはSまたはOを表し；
R1は置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表し；
R3はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；
R4はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；かつ
●は脂肪族または芳香族残基を表し、
式（II）中、
Figure 2021516959
はアミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表し、
式（III*）中、
Figure 2021516959
、●、V、R1、X、およびYは式（I*）および（II）の化合物について定義されたとおりである、段階
を含む。
式（I*）の化合物を式（II）の化合物と反応させて式（III*）の化合物を得る、本発明の方法のうちのいずれか1つにおいて、YはS（硫黄）またはO（酸素）であってもよく、すなわち、YがSである場合、化合物（I*）および（III*）はホスホノチオレートを表し、かつYがOである場合、化合物（I*）および（III*）はホスホネートを表す。したがって、いくつかの態様において、YはSである。いくつかの態様において、YはOである。本発明者らは、ホスホノチオレート、すなわちYがSである場合の三重結合または二重結合へのチオールの付加が、対応するホスホネート、すなわちYがOである場合への付加よりもかなり速いことを見出したため、式（I*）の化合物を式（II）の化合物と反応させて式（III*）の化合物を得る、方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、YはSである。
式（I*）の化合物の調製は、式中、Xが(R3R4)Cを表しかつY、R1、R3、R4、V、および●が本明細書において前記および下記で定義されたとおりである、式（IV*）
Figure 2021516959
の化合物を、酸化剤と反応させて、式（I*）の化合物を生成する段階を含んでもよい。酸化剤は、tert-ブチルヒドロペルオキシド（tBu-OOH）、メタクロロ過安息香酸（mCPBA）、過酸化水素（H2O2）、ヨウ素（I2）、ペルオキシ一硫酸カリウム、または酸素（O2）、例えば、空気からの酸素からなる群より選択されてもよい。好ましくは、酸化剤はtert-ブチルヒドロペルオキシド（tBu-OOH）である。式（IV*）の化合物の調製は、三ハロゲン化リン（X）、好ましくはPCl3を、順番に（i）R1-OH（XI）、（ii）R2が独立にC1〜C8-アルキルを表す、
Figure 2021516959
、（iii）Halが、Cl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはBrを表し、かつXが(R3R4)Cを表す、
Figure 2021516959
、ならびに（iv）
Figure 2021516959
と反応させて、式（IV*）の化合物を生成することを含んでもよく；
ここで、R1、R3、R4、V、Y、および●は本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。三ハロゲン化リンはPCl3、PBr3、またはPI3であってもよく、PCl3が好ましい。
Figure 2021516959
中のR2は独立にC1〜C8-アルキル、好ましくはC1〜C6-アルキル、より好ましくはC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくはC1〜C3-アルキルを表す。好ましくは、両方のR2は同じである。さらにより好ましくは、両方のR2はイソプロピルである。好ましくは、
Figure 2021516959
を反応させる段階（iv）を、テトラゾール存在下で実施する。テトラゾールは無置換テトラゾールまたは置換テトラゾールであってもよい。
または、YがSである場合、式（I*）の化合物の調製は、式（V*）
Figure 2021516959
の化合物を式（VIa）または（VIb）の化合物
Figure 2021516959
と反応させて、式（I*）の化合物を生成することを含んでもよく；
式中、EWGは電子吸引基を表し、該電子吸引基は好ましくは、
Figure 2021516959
からなる群より選択され、ここで#はSの位置を示し；Halは、Cl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClを表し、かつ
ここで、Xは(R3R4)Cを表し、かつR1、R3、R4、V、および●は本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。好ましくは、式（V*）の化合物中、両方のR1は同じである。より好ましくは、式（VIa）の化合物を用いる場合、EWGは
Figure 2021516959
である。式（V*）の化合物は、例えば、
Figure 2021516959
を
Figure 2021516959
と反応させて、式（V*）の化合物を得る段階であって、Xが(R3R4)Cを表し、かつR1、R3、R4、およびVが本明細書において前記および下記で定義されたとおりであり；かつHal1が、Cl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClであり；かつHal2が、Cl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはBrである、段階を含む方法によって、調製することができる。式（VIa）および（VIb）の化合物は、例えば、前記および下記の本明細書に記載のとおりに調製することができる。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)n、F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1〜C8-アルキル)H、-NH2、-N3、-N(C1〜C8-アルキル)2、=O、C3〜C8-シクロアルキル、-S-S-(C1〜C8-アルキル)、nが1、2、3、4、5、もしくは6であるヒドロキシ-(C1〜C8-アルコキシ)n、C2〜C8-アルケニル、またはC2〜C8-アルキニルのうちの少なくとも1つで置換されていてもよいC1〜C8-アルキルを表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、
Figure 2021516959
などの置換されていてもよいフェニルを表し、ここで#はOの位置を表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、C1〜C8-アルキル、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8-アルキル)H、-NH2、または-N(C1〜C8-アルキル)2のうちの少なくとも1つで独立に置換されていてもよいフェニルを表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1はピリジルなどの5または6員ヘテロ芳香族系を表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、C1〜C8-アルキル、-S-S-(C1〜C8-アルキル)で置換されたC1〜C8-アルキル、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)nで置換されたC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニルで置換されたC1〜C8-アルキル、またはフェニルもしくは-NO2で置換されたフェニルを表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1はメチル、エチル、プロピル、またはブチル、好ましくはメチルまたはエチルを表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、-S-S-(C1〜C8-アルキル)で置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表す。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR10、R11、R12、およびR13はそれぞれ独立に、水素またはC1〜C8-アルキルを表し；かつ#はOの位置を表す。より好ましい態様において、R10、R11、R12、およびR13はそれぞれ独立に水素、メチルまたはエチルを表す。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR10およびR11は独立に、水素またはC1〜C8-アルキルを表し；かつ#はOの位置を表す。より好ましい態様において、R10およびR11は独立に水素、メチルまたはエチルを表す。さらにより好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR10およびR11は独立に、水素、メチルまたはエチルを表し；かつ#はOの位置を表す。これらの態様のいくつかにおいて、より好ましい態様において、R10およびR11はいずれも水素である。これらの態様のいくつかにおいて、R10は水素であり、かつR11はC1〜C6-アルキルである。これらの態様のいくつかにおいて、R10は水素であり、かつR11はメチルまたはエチルである。これらの態様のいくつかにおいて、R10およびR11は同じである。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR10およびR11は本明細書において前記で定義されたとおりである。別の好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR12およびR13は独立に水素またはC1〜C8-アルキルを表し；かつ#はOの位置を表す。より好ましい態様において、R12およびR13は独立に水素、メチルまたはエチルを表す。さらにより好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR12およびR13は独立に水素、メチルまたはエチルを表し；かつ#はOの位置を表す。これらの態様のいくつかにおいて、R12およびR13はいずれも水素である。これらの態様のいくつかにおいて、R12は水素であり、かつR13はC1〜C6-アルキルである。これらの態様のいくつかにおいて、R12は水素であり、かつR13はメチルまたはエチルである。これらの態様のいくつかにおいて、R12およびR13は同じである。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1はフェニルで置換されたC1〜C8-アルキルを表し、該フェニルは
Figure 2021516959
でさらに置換されており、ここでZはOまたはNHであり、かつここで#は該フェニルの位置を表す。いくつかの態様において、ZはOである。いくつかの態様において、ZはNHである。
Figure 2021516959
中のC1〜C8-アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、またはブチル；好ましくはメチル、エチル、またはプロピル；より好ましくはメチルまたはエチル；最も好ましくはメチルであってもよい。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでC1〜C8-アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、またはブチル；好ましくはメチル、エチル、またはプロピル；より好ましくはメチルまたはエチル；最も好ましくはメチルであってもよく；ここでZはOまたはNHであり、かつここで#はOの位置を表す。別の好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでC1〜C8-アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、またはブチル；好ましくはメチル、エチル、またはプロピル；より好ましくはメチルまたはエチル；最も好ましくはメチルであってもよく；ここでZはOまたはNHであり、かつここで#はOの位置を表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1はフェニルで置換されたC1〜C8-アルキルを表し、該フェニルは
Figure 2021516959
でさらに置換されており、かつここで#は該フェニルの位置を表す。いくつかの態様において、R1はフェニルで置換されたC1〜C8-アルキルを表し、該フェニルは
Figure 2021516959
でさらに置換されており、ここで#は該フェニルの位置を表す。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はOの位置を表す。別の好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はOの位置を表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はOの位置を表し、かつn＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10、好ましくはn＝0、1、2、3、4、5、6；より好ましくはn＝0、1、2、3、4；さらにより好ましくはn＝0、1、2、3、さらに好ましくはn＝0、1、2、さらに好ましくはn＝0、1；および最も好ましくはn＝1である。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、C2〜C8-アルキニルで置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表す。好ましい態様において、R1はホモプロパルギルである。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はOの位置を表し、n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10、好ましくはn＝0、1、2、3、4、5、6；より好ましくはn＝0、1、2、3、4；さらにより好ましくはn＝0、1、2、3、さらに好ましくはn＝0、1、2、さらに好ましくはn＝0、1；および最も好ましくはn＝1であり、すなわち、nが1である場合、R1は
Figure 2021516959
を表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は低分子を表し；ここで任意で●は、Yに結合されているリンカーをさらに含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は、例えば、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、-CH2-フェニル、
Figure 2021516959
などの低分子を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、好ましくは置換されていてもよいC1〜C6-アルキル、より好ましくは置換されていてもよいC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくはC1〜C2-アルキルを表す。いくつかの態様において、●は-CH2-フェニル、すなわちベンジルを表す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。いくつかの態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。いくつかの態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。いくつかの態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は、置換されていてもよいフェニル、好ましくは
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は、放射性または非放射性核種、ビオチン、レポーター酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、CY5またはEDANSなどのフルオロフォア、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよい5または6員ヘテロ芳香族系を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、いくつかの態様において、●は放射性または非放射性核種を表す。好ましい態様において、●はビオチンを表す。いくつかの態様において、●はレポーター酵素を表す。好ましい態様において、●はヌクレオチドを表す。好ましい態様において、●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、●はアミノ酸を表す。好ましい態様において、●はペプチドを表す。好ましい態様において、●は置換されていてもよい5または6員ヘテロ芳香族系を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
本明細書の全体を通して、任意の方法または任意の化合物に関して「任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む」などと示される場合はいつでも、●は実質的に任意のリンカーをさらに含むことができ、リンカーはYに結合されており、該Yは、例えば、式（I）、（I*）、（III）または（III*）の化合物に関して本明細書において示されるとおり、S（硫黄）またはO（酸素）、好ましくはSである。リンカーは当業者には公知の任意のリンカー、例えば、ペプチドリンカーまたは直鎖もしくは分岐炭化水素系部分であってもよい。リンカーは環式部分を含むこともできる。ペプチドリンカーは、例えば、1〜50、1〜40、1〜30、1〜20、1〜10、1〜5、1〜3、または2つ、または1つのアミノ酸を含んでもよい。リンカーが炭化水素系部分である場合、リンカーの主鎖は炭素原子だけを含んでもよいが、酸素（O）、窒素（N）もしくは硫黄（S）原子などのヘテロ原子を含むこともでき、かつ/またはカルボニル基（C=O）を含むこともできる。リンカーは、例えば、C1〜C20炭素原子鎖または-(O-CH2-CH2)-反復単位を有するポリエチレングリコール系鎖などのポリエーテル系鎖であってもよい。炭化水素系リンカーの典型的態様において、連結部分は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、および19個を含む、1〜約150、1〜約100、1〜約75、1〜約50、または1〜約40、または1〜約30、または1〜約20個の主鎖原子を含む。実例として、リンカーは
Figure 2021516959
であってもよく、ここで#はYの位置を示し、かつ*は●の別の部分の位置を示し、ここで該別の部分は、非限定例として、アミノ酸、ペプチド、抗体、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または低分子であってもよく；かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。例えば、本明細書が「リンカー」それ自体に、または、例えば、抗体薬物コンジュゲートの文脈で「リンカー-薬物コンジュゲート」に、または、例えば、抗体フルオロフォアコンジュゲートの文脈で「リンカー-フルオロフォアコンジュゲート」に言及する場合、前述の例示的リンカーを用いてもよい。当業者には、適切なリンカーを選択することは公知である。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は構造（VII）
Figure 2021516959
の環式RGDペプチド（c(RDGfK)）を表し、*はYの位置を表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●はフェニルを表し、該フェニルは、C1〜C8-アルキル、C1〜C8-アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1〜C8-アルキル)、-N(C1〜C8-アルキル)2-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル)、-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、-C(O)N-(C1〜C8-アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4、または5つの置換基で置換されていてもよく、好ましくはC1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよい。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は、C1〜C8-アルキルを表し、該C1〜C8-アルキルが、C3〜C8-シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8-アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8-アルキル)；-N(C1〜C8-アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8-アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8-アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8-アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、好ましくは、C1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2、フェニル、またはヘテロ芳香族系、単糖、多糖、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、アミノ酸、フルオロフォア、タンパク質タグからなる群より選択される少なくとも1つの置換基（置換基第1世代）で置換されていてもよく、ここで置換基第1世代は、C3〜C8-シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8-アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8-アルキル)；-N(C1〜C8-アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8-アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8-アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8-アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、好ましくは、C1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2、フェニル、またはヘテロ芳香族系（置換基第2世代）で再度置換されていてもよく、かつここで置換基第2世代は、同じ群から選択される少なくとも1つの置換基で再度置換されていてもよく、かつここでそのような置換は第3、4、5、6、7、8、9、または10世代までいってもよい。
本発明の方法のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、●はアミノ酸を表す。好ましい態様において、●はペプチドを表す。好ましい態様において、●はタンパク質を表す。好ましい態様において、●は抗体を表す。好ましい態様において、●はヌクレオチドを表す。好ましい態様において、●はオリゴヌクレオチドを表す。いくつかの態様において、●は糖を表す。いくつかの態様において、●は多糖を表す。いくつかの態様において、●はポリマーを表す。いくつかの態様において、●は置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、好ましくは置換されていてもよいC1〜C6-アルキル、より好ましくは置換されていてもよいC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくは置換されていてもよいC1〜C2-アルキルを表す。いくつかの態様において、●は置換されていてもよいフェニルを表す。いくつかの態様において、●は置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、●は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。より好ましい態様において、●はペプチド、タンパク質、抗体、またはオリゴヌクレオチドを表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。好ましい態様において、●はアミノ酸を表す。好ましい態様において、●はペプチドを表す。好ましい態様において、●はタンパク質を表す。好ましい態様において、●は抗体を表す。好ましい態様において、●はヌクレオチドを表す。好ましい態様において、●はオリゴヌクレオチドを表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、●は薬物、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、タンパク質、ペプチド、抗体、またはオリゴヌクレオチドを表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、●は薬物を表す。好ましい態様において、●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、●はリンカー-薬物コンジュゲートを表す。好ましい態様において、●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、●はビオチンを表す。好ましい態様において、●はタンパク質を表す。好ましい態様において、●はペプチドを表す。好ましい態様において、●は抗体を表す。好ましい態様において、●はオリゴヌクレオチドを表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、●はリンカーまたはリンカー-薬物コンジュゲートを表す。好ましい態様において、●は、例えば、VC-PAB、VA-PAB、KF-PAB、またはVK-PABを含むリンカー、好ましくはVC-PABを含むリンカーなどのリンカーを表す。好ましい態様において、●は、例えば、
Figure 2021516959
などのリンカー-薬物コンジュゲートを表し、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。より好ましくは、リンカー-薬物コンジュゲートは、
Figure 2021516959
であり、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。
本発明の方法のうちのいずれか1つに従い、
Figure 2021516959
は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表すこともある。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表す。より好ましい態様において、
Figure 2021516959
は、ペプチド、タンパク質、抗体、またはオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は糖を表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は多糖を表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
はポリマーを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、好ましくは置換されていてもよいC1〜C6-アルキル、より好ましくは置換されていてもよいC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくは置換されていてもよいC1〜C2-アルキルを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は、置換されていてもよいC3〜C8-アルキル、好ましくは置換されていてもよいC3〜C6-アルキル、より好ましくは置換されていてもよいC3〜C4-アルキルを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は、置換されていてもよいC5〜C8-アルキル、好ましくは置換されていてもよいC6〜C7-アルキルを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は置換されていてもよいフェニルを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系を表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
は、抗体、好ましくはIgG抗体、より好ましくはセツキシマブまたはトラスツズマブまたはブレンツキシマブ；タンパク質、好ましくはGFPタンパク質またはeGFP-タンパク質、アルブミン、トリペプチド、好ましくは式（VIII）
Figure 2021516959
、または式（IX）
Figure 2021516959
のペプチドを表し、ここで#はSの位置を表す。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表す。より好ましい態様において、抗体はIgG抗体、さらにより好ましくはセツキシマブまたはトラスツズマブまたはブレンツキシマブを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は、タンパク質、より好ましくはGFPタンパク質またはeGFP-タンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアルブミンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はトリペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は、式（VIII）
Figure 2021516959
のペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は、式（IX）
Figure 2021516959
のペプチドを表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体（例えば、セツキシマブ、トラスツズマブ、またはブレンツキシマブ）を表し、かつ●はタンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質（例えば、GFPタンパク質またはeGFPタンパク質）を表し、かつ●はタンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、抗体、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●は抗体を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はタンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はタンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体（例えば、セツキシマブ、トラスツズマブ、またはブレンツキシマブ）を表し、かつ●はリンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●は、例えば、VC-PAB、VA-PAB、KF-PAB、またはVK-PABを含むリンカー、好ましくはVC-PABを含むリンカーなどのリンカーを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●は薬物を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●は、例えば、
Figure 2021516959
などのリンカー-薬物コンジュゲートを表し、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。より好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●は、例えば、
Figure 2021516959
などのリンカー-薬物コンジュゲートを表し、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、抗体はセツキシマブ、トラスツズマブまたはブレンツキシマブ、好ましくはブレンツキシマブであってもよい。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はペプチド、タンパク質、タンパク質タグ、抗体、オリゴヌクレオチド、CY5またはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●は抗体を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はリンカーを表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はペプチド、タンパク質、タンパク質タグ、抗体、オリゴヌクレオチド、CY5またはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●は抗体を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はリンカーを表す。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、●は、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し、ここでアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは固体支持体に結合されている。いくつかの態様において、●は固体支持体に結合されたアミノ酸またはペプチドを表す。いくつかの態様において、●は固体支持体に結合されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、●は固体支持体に結合されたペプチドを表す。利点として、本発明者らは、本発明のホスホノチオレートは、ペプチドの固体支持体からの切断に典型的に用いられる酸性条件下、例えば、90％トリフルオロ酢酸（TFA）下で非常に安定であることを見出した。固体支持体は、固相ペプチド合成に適した、当業者には公知の任意の固体支持体、または固相オリゴヌクレオチド合成に適した、任意の固体支持体であってもよい。そのような固体支持体は、樹脂としても公知である。固相ペプチド合成に適した固体支持体の実例には、メリフィールドポリスチレン樹脂（スチレンおよび1〜2％ジビニルベンゼンからのコポリマー）、ポリアクリルアミド樹脂、TentaGel（ポリスチレングリコールがポリスチレンに接ぎ木されているグラフトポリマー）、ワング樹脂（典型的には、メリフィールド樹脂におけるなどの、架橋ポリスチレンに基づく）、または無機固体支持体の例として、規定の孔径を有する多孔性ガラスなどの、有機および無機支持体が含まれる。固相ペプチド合成用の市販の固体支持体の実例は、Merck Milliporeによって供給されるRinkアミド樹脂またはNovaSyn(登録商標)TGR樹脂である。固相オリゴヌクレオチド合成に適した固体支持体の実例には、規定の孔径を有するガラス（コントロールドポアガラス、CPG）およびマクロ多孔性ポリスチレン（MPPS）などのポリスチレンが含まれる。任意で、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合されている、前述の態様において、●は、本明細書に開示する式、特に化合物（I）、（III）、（I*）および（III*）のYに結合されているリンカーをさらに含む。加えて、リンカーはアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドに結合されている。したがって、●はリンカー-アミノ酸-固体支持体、リンカー-ペプチド-固体支持体、リンカー-ヌクレオチド-固体支持体、またはリンカー-オリゴヌクレオチド-固体支持体の構造を有してもよい。「リンカー」は実質的に任意のリンカーであり得、リンカーはYに結合されており、該Yは、例えば、式（I）、（I*）、（III）または（III*）の化合物に関して本明細書において示されるとおり、S（硫黄）またはO（酸素）、好ましくはSである。リンカーは当業者には公知の任意のリンカー、例えば、ペプチドリンカーまたは直鎖もしくは分岐炭化水素系部分であってもよい。リンカーは環式部分を含むこともできる。ペプチドリンカーは、例えば、1〜50、1〜40、1〜30、1〜20、1〜10、1〜5、1〜3、または2、または1個のアミノ酸を含んでもよい。リンカーが炭化水素系部分である場合、リンカーの主鎖は炭素原子だけを含んでもよいが、酸素（O）、窒素（N）もしくは硫黄（S）原子などのヘテロ原子を含むこともでき、かつ/またはカルボニル基（C=O）を含むこともできる。リンカーは、例えば、C1〜C20炭素原子鎖または-(O-CH2-CH2)-反復単位を有するポリエチレングリコール系鎖などのポリエーテル系鎖であってもよい。炭化水素系リンカーの典型的態様において、連結部分は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、および19個を含む、1〜約150、1〜約100、1〜約75、1〜約50、または1〜約40、または1〜約30、または1〜約20個の主鎖原子を含む。当業者には、適切なリンカーを選択することは公知である。例えば、いくつかの態様において、リンカーは
Figure 2021516959
であってもよく、ここで#はYの位置を示し、かつ*はアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドはリンカーに、N（窒素）原子を通じて結合され得る。
本発明の方法のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し、ここでアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは固体支持体に結合されている。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は固体支持体に結合されたアミノ酸またはペプチドを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は固体支持体に結合されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は固体支持体に結合されたペプチドを表す。
本発明は、式（I）または式（I*）の化合物の調製のための方法にも関し、該方法は、
（I）式中、Lがアミノ酸への、ペプチドへの、ヌクレオチドへの、またはオリゴヌクレオチドへの結合に適したリンカーを表し；かつ
Figure 2021516959
、X、Y、V、およびR1が本明細書において前記および下記で定義されたとおりである、式（Ia）
Figure 2021516959
または式（I*a）
Figure 2021516959
の化合物を、固体支持体に結合されているアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドと反応させて、式中、Zが、固体支持体に結合されているアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表す、式（Ib）または（I*b）
Figure 2021516959
の化合物を生成させる段階；ならびに
（II）式（Ib）または式（I*b）の化合物を固体支持体から切断して、式（I）または式（I*）
Figure 2021516959
の化合物を得る段階であって、式中、●は、リンカーLを通じてYに結合されたアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し、かつ
Figure 2021516959
、X、Y、V、およびR1は段階（I）における前記で定義されたとおりである、段階を含む。いくつかの態様において、リンカーLは
Figure 2021516959
であり、ここで#はYの位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドはそのようなリンカーに、カルボキシル基を通じて結合されている。いくつかの態様において、式（Ia）または（I*a）の化合物を、固体支持体に結合されたペプチドまたは固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドと反応させ、好ましくは式（Ia）または（I*a）の化合物を、固体支持体に結合されたペプチドと反応させる。いくつかの態様において、段階（II）の切断を、酸性条件下、例えば、水性トリフルオロ酢酸（例えば、90％TFA）を用いて実施する。これに関して、本発明者らは、本発明のホスホノチオレート（Y＝S）は、ペプチドの固体支持体からの切断に特に用いられる酸性条件下で非常に安定であることを見出した。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、方法は、式（I）または式（I*）の化合物を、本明細書において前記および下記で定義されたとおりである式（II）の化合物と反応させる段階をさらに含んでもよい。
本発明の方法の1つの態様において、
Figure 2021516959
および
Figure 2021516959
は同じ分子内に存在する。したがって、本発明は、
Figure 2021516959
および
Figure 2021516959
が、●と
Figure 2021516959
とを連結している弧によって示されるとおり同じ分子内に存在する、式（L）
Figure 2021516959
の化合物を反応させて、式（IIIa）
Figure 2021516959
の化合物を得る方法にも関し、式中、
Figure 2021516959
は、式（XX）の化合物中の
Figure 2021516959
が二重結合を表す場合、結合を表し、かつXは(R3R4)Cを表すか；または
Figure 2021516959
は、式（XX）の化合物中の
Figure 2021516959
が三重結合を表す場合、二重結合を表し、かつXはR3-Cを表すか；かつ
Figure 2021516959
、●、R1、R3、R4、およびYは本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。
本発明は、
Figure 2021516959
および
Figure 2021516959
が、●と
Figure 2021516959
とを連結している弧によって示されるとおり同じ分子内に存在する、式（L*）
Figure 2021516959
の化合物を反応させて、式（III*a）
Figure 2021516959
の化合物を得る方法にも関し、式中、Xは(R3R4)Cであり、かつ
Figure 2021516959
、●、V、R1、R3、R4、およびYは本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。
いくつかの態様において、同じ分子内に
Figure 2021516959
および
Figure 2021516959
を有する化合物（L）は、例えば、BCL9ペプチドなどのペプチドである。したがって、方法によって得られる式（IIIa）の化合物は、例えば、BCL9ペプチドから誘導される環式ペプチドなどの、環式ペプチドであってもよい。いくつかの態様において、同じ分子内に
Figure 2021516959
および
Figure 2021516959
を有する化合物（L*）は、例えば、BCL9ペプチドなどのペプチドである。したがって、方法によって得られる式（III*a）の化合物は、例えば、BCL9ペプチドから誘導される環式ペプチドなどの、環式ペプチドであってもよい。
式（I）、（I*）、（II）、（III）、および（III*）の化合物について本明細書に記載の全ての方法は、式（L）、（L*）、（IIIa）、および（III*a）の化合物と同様に実施することができる。
化合物
本発明は、本明細書に記載の方法のうちのいずれか1つによって得ることができる、または得られている化合物にも関する。また、本発明は、本明細書に記載の方法のうちのいずれか1つにおいて、例えば、出発物質または中間体として用いられる化合物にも関する。特に、本発明は、式（I）、（I*）、（III）、（III*）、（L）、（L*）、（IIIa）、および（III*a）の化合物にも関する。
したがって、本発明は、式（I）
Figure 2021516959
の化合物にも関し、
式中、
Figure 2021516959
は二重結合または三重結合を表し；
Xは、
Figure 2021516959
が三重結合である場合、R3-Cを表し；
Xは、
Figure 2021516959
が二重結合である場合、(R3R4)Cを表し；
YはSまたはOを表し；
R1は置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表し；
R3はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；
R4はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；かつ
●は脂肪族または芳香族残基を表す。
式（I）の化合物のいくつかの態様において、
Figure 2021516959
は二重結合を表し、Xは(R3R4)Cを表し、かつR3およびR4は独立にHまたはまたはC1〜C8-アルキルを表す。好ましくは、R3およびR4は独立にHまたはC1〜C8-アルキル、より好ましくはHまたはC1〜C6-アルキル、さらにより好ましくはHまたはC1〜C4-アルキル、かつさらにより好ましくはHまたはC1〜C2-アルキルを表す。好ましい態様において、R3およびR4は同じである。好ましい態様において、R3およびR4はいずれもHである。
または、式（I）の化合物のいくつかの態様において、
Figure 2021516959
は三重結合を表し、XはR3-Cを表し、かつR3はHまたはC1〜C8-アルキルを表す。好ましくは、R3はHまたはC1〜C8-アルキル、より好ましくはHまたはC1〜C6-アルキル、さらにより好ましくはHまたはC1〜C4-アルキル、かつさらにより好ましくはHまたはC1〜C2-アルキルを表す。好ましい態様において、R3はHである。
本発明は、式（I*）
Figure 2021516959
の化合物にも関し、
式中、
VはC1〜C8-アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し；
Xは(R3R4)Cを表し；
YはSまたはOを表し；
R1は置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表し；
R3はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；
R4はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；かつ
●は脂肪族または芳香族残基を表す。
本発明は、式（III）
Figure 2021516959
の化合物にも関し、
式中、
Figure 2021516959
は結合を表し、かつXは(R3R4)Cを表すか；または
Figure 2021516959
は二重結合を表し、かつXはR3-Cを表し；
YはSまたはOを表し；
R1は置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表し；
R3はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；
R4はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；かつ
●は脂肪族または芳香族残基を表し；
Figure 2021516959
は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表す。
式（III）の化合物のいくつかの態様において、
Figure 2021516959
は結合を表し、Xは(R3R4)Cを表し、かつR3およびR4は独立にHまたはまたはC1〜C8-アルキルを表す。好ましくは、R3およびR4は独立にHまたはC1〜C6-アルキル、より好ましくはHまたはC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくはHまたはC1〜C2-アルキルを表す。好ましい態様において、R3およびR4は同じである。好ましい態様において、R3およびR4はいずれもHである。
または、式（III）の化合物のいくつかの態様において、
Figure 2021516959
は二重結合を表し、XはR3-Cを表し、かつR3はHまたはC1〜C8-アルキルを表す。好ましくは、R3はHまたはC1〜C6-アルキル、より好ましくはHまたはC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくはHまたはC1〜C2-アルキルを表す。好ましい態様において、R3はHである。
本発明は、式（III*）
Figure 2021516959
の化合物にも関し、
式中、
Xは(R3R4)Cを表し；
YはSまたはOを表し；
R1は置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表し；
R3はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；
R4はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；
VはC1〜C8-アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し；
●は脂肪族または芳香族残基を表し；かつ
Figure 2021516959
は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表す。
式（III*）の化合物のいくつかの態様において、R3およびR4は独立にHまたはまたはC1〜C8-アルキルを表す。好ましくは、R3およびR4は独立にHまたはC1〜C6-アルキル、より好ましくはHまたはC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくはHまたはC1〜C2-アルキルを表す。好ましい態様において、R3およびR4は同じである。好ましい態様において、R3およびR4はいずれもHである。
式（I）、（I*）、（III）、または（III*）の化合物のうちのいずれか1つにおいて、YはS（硫黄）またはO（酸素）であり得、すなわち、YがSである場合、化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）はホスホノチオレートを表し、YがOである場合、化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）はホスホネートを表す。したがって、いくつかの態様において、YはSである。いくつかの態様において、YはOである。利点として、本発明者らは、ホスホノチオレートおよびホスホネートはいずれも生理的に関連する条件下で安定であることを示してきた。化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、YはSである。YがSである式（III）および（III*）のホスホノチオレートは、対応するホスホネートよりも速いチオール付加によって利用可能であることが判明している。そのような速い反応速度は、それによってホスホノチオレートの変換および収率が高まるため、非常に望ましい。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)n、F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1〜C8-アルキル)H、-NH2、-N3、-N(C1〜C8-アルキル)2、=O、C3〜C8-シクロアルキル、-S-S-(C1〜C8-アルキル)、nが1、2、3、4、5、もしくは6であるヒドロキシ-(C1〜C8-アルコキシ)n、C2〜C8-アルケニル、またはC2〜C8-アルキニルのうちの少なくとも1つで置換されていてもよいC1〜C8-アルキルを表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）の任意のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は
Figure 2021516959
などの置換されていてもよいフェニルを表し、ここで#はOの位置を表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）の任意のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、C1〜C8-アルキル、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8-アルキル)H、-NH2、または-N(C1〜C8-アルキル)2のうちの少なくとも1つで独立に置換されていてもよいフェニルを表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）の任意のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、ピリジルなどの5または6員ヘテロ芳香族系を表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）の任意のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、C1〜C8-アルキル、-S-S-(C1〜C8-アルキル)で置換されたC1〜C8-アルキル、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)nで置換されたC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニルで置換されたC1〜C8-アルキル、またはフェニルもしくは-NO2で置換されたフェニルを表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、メチル、エチル、プロピル、またはブチル、好ましくはメチルまたはエチルを表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、-S-S-(C1〜C8-アルキル)で置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表す。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR10、R11、R12、およびR13はそれぞれ独立に水素またはC1〜C8-アルキルを表し；かつ#はOの位置を表す。より好ましい態様において、R10、R11、R12、およびR13はそれぞれ独立に水素、メチル、またはエチルを表す。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR10およびR11はｄに水素またはC1〜C8-アルキルを表し；かつ#はOの位置を表す。より好ましい態様において、R10およびR11は独立に水素、メチルまたはエチルを表す。さらにより好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR10およびR11は独立に水素、メチルまたはエチルを表し；かつ#はOの位置を表す。これらの態様のいくつかにおいて、R10およびR11はいずれも水素である。これらの態様のいくつかにおいて、R10は水素であり、かつR11はC1〜C6-アルキルである。これらの態様のいくつかにおいて、R10は水素であり、かつR11はメチルまたはエチルである。これらの態様のいくつかにおいて、R10およびR11は同じである。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR10およびR11は本明細書において前記で定義されたとおりである。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR12およびR13は独立に水素またはC1〜C8-アルキルを表し；かつ#はOの位置を表す。より好ましい態様において、R12およびR13は独立に水素、メチルまたはエチルを表す。さらにより好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでR12およびR13は独立に水素、メチルまたはエチルを表し；かつ#はOの位置を表す。これらの態様のいくつかにおいて、R12およびR13はいずれも水素である。これらの態様のいくつかにおいて、R12は水素であり、かつR13はC1〜C6-アルキルである。これらの態様のいくつかにおいて、R12は水素であり、かつR13はメチルまたはエチルである。これらの態様のいくつかにおいて、R12およびR13は同じである。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1はフェニルで置換されたC1〜C8-アルキルを表し、該フェニルは
Figure 2021516959
でさらに置換されており、ここでZはOまたはNHであり、かつここで#は該フェニルの位置を表す。いくつかの態様において、ZはOである。いくつかの態様において、ZはNHである。
Figure 2021516959
中のC1〜C8-アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、またはブチル；好ましくはメチル、エチル、またはプロピル；より好ましくはメチルまたはエチル；最も好ましくはメチルであってもよい。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでC1〜C8-アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、またはブチル；好ましくはメチル、エチル、またはプロピル；より好ましくはメチルまたはエチル；最も好ましくはメチルであってもよく；ここでZはOまたはNHであり、かつここで#はOの位置を表す。別の好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここでC1〜C8-アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、またはブチル；好ましくはメチル、エチル、またはプロピル；より好ましくはメチルまたはエチル；最も好ましくはメチルであってもよく；ここでZはOまたはNHであり、かつここで#はOの位置を表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1はフェニルで置換されたC1〜C8-アルキルを表し、該フェニルは
Figure 2021516959
でさらに置換されており、かつここで#は該フェニルの位置を表す。いくつかの態様において、R1はフェニルで置換されたC1〜C8-アルキルを表し、該フェニルは
Figure 2021516959
でさらに置換されており、ここで#は該フェニルの位置を表す。好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はOの位置を表す。別の好ましい態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はOの位置を表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はOの位置を表し、かつn＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10、好ましくはn＝0、1、2、3、4、5、6；より好ましくはn＝0、1、2、3、4；さらにより好ましくはn＝0、1、2、3、さらに好ましくはn＝0、1、2、さらに好ましくはn＝0、1；および最も好ましくはn＝1である。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は、C2〜C8-アルキニルで置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表す。好ましい態様において、R1はホモプロパルギルである。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、R1は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はOの位置を表し、n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10、好ましくはn＝0、1、2、3、4、5、6；より好ましくはn＝0、1、2、3、4；さらにより好ましくはn＝0、1、2、3、さらに好ましくはn＝0、1、2、さらに好ましくはn＝0、1；および最も好ましくはn＝1であり、すなわち、nが1である場合、R1は
Figure 2021516959
を表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は低分子を表し；ここで任意で●は、Yに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は、例えば、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、-CH2-フェニル、
Figure 2021516959
などの低分子を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、好ましくは置換されていてもよいC1〜C6-アルキル、より好ましくは置換されていてもよいC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくはC1〜C2-アルキルを表す。いくつかの態様において、●は-CH2-フェニル、すなわちベンジルを表す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。好ましい態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。いくつかの態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。いくつかの態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。いくつかの態様において、●は
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は置換されていてもよいフェニル、好ましくは
Figure 2021516959
を表し、ここで#はYの位置を示す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は放射性または非放射性核種、ビオチン、レポーター酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、CY5またはEDANSなどのフルオロフォア、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよい5または6員ヘテロ芳香族系を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、いくつかの態様において、●は放射性または非放射性核種を表す。いくつかの好ましい態様において、●はビオチンを表す。いくつかの態様において、●はレポーター酵素を表す。いくつかの好ましい態様において、●はヌクレオチドを表す。いくつかの好ましい態様において、●はオリゴヌクレオチドを表す。いくつかの好ましい態様において、●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。いくつかの好ましい態様において、●はアミノ酸を表す。いくつかの好ましい態様において、●はペプチドを表す。いくつかの好ましい態様において、●は置換されていてもよい5または6員ヘテロ芳香族系を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は構造（VII）
Figure 2021516959
の環式RGDペプチド（c(RDGfK)）を表し、*はYの位置を表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●はフェニルを表し、該フェニルは、C1〜C8-アルキル、C1〜C8-アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1〜C8-アルキル)、-N(C1〜C8-アルキル)2-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル)、-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、-C(O)N-(C1〜C8-アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4、または5つの置換基で置換されていてもよく、好ましくはC1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよい。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は、C1〜C8-アルキルを表し、該C1〜C8-アルキルは、C3〜C8-シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8-アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8-アルキル)；-N(C1〜C8-アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8-アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8-アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8-アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、好ましくは、C1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2、フェニル、またはヘテロ芳香族系、単糖、多糖、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、アミノ酸、フルオロフォア、タンパク質タグからなる群より選択される少なくとも1つの置換基（置換基第1世代）で置換されていてもよく、ここで置換基第1世代は、C3〜C8-シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8-アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8-アルキル)；-N(C1〜C8-アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8-アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8-アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8-アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、好ましくは、C1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2、フェニル、またはヘテロ芳香族系（置換基第2世代）で再度置換されていてもよく、かつここで置換基第2世代は、同じ群から選択される少なくとも1つの置換基で再度置換されていてもよく、かつここでそのような置換は第3、4、5、6、7、8、9、または10世代までいってもよい。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つのいくつかの態様において、●は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、●はアミノ酸を表す。好ましい態様において、●はペプチドを表す。好ましい態様において、●はタンパク質を表す。好ましい態様において、●は抗体を表す。好ましい態様において、●はヌクレオチドを表す。好ましい態様において、●はオリゴヌクレオチドを表す。いくつかの態様において、●は糖を表す。いくつかの態様において、●は多糖を表す。いくつかの態様において、●はポリマーを表す。いくつかの態様において、●は置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、好ましくは置換されていてもよいC1〜C6-アルキル、より好ましくは置換されていてもよいC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくは置換されていてもよいC1〜C2-アルキルを表す。いくつかの態様において、●は置換されていてもよいフェニルを表す。いくつかの態様において、●は置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、●は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。より好ましい態様において、●はペプチド、タンパク質、抗体、またはオリゴヌクレオチドを表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。好ましい態様において、●はアミノ酸を表す。好ましい態様において、●はペプチドを表す。好ましい態様において、●はタンパク質を表す。好ましい態様において、●は抗体を表す。好ましい態様において、●はヌクレオチドを表す。好ましい態様において、●はオリゴヌクレオチドを表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、●は、薬物、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、タンパク質、ペプチド、抗体、またはオリゴヌクレオチドを表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、●は薬物を表す。好ましい態様において、●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、●はリンカー-薬物コンジュゲートを表す。好ましい態様において、●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、●はビオチンを表す。好ましい態様において、●はタンパク質を表す。好ましい態様において、●はペプチドを表す。好ましい態様において、●は抗体を表す。好ましい態様において、●はオリゴヌクレオチドを表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、●はリンカーまたはリンカー-薬物コンジュゲートを表す。好ましい態様において、●は、例えば、VC-PAB、VA-PAB、KF-PAB、またはVK-PABを含むリンカー、好ましくはVC-PABを含むリンカーなどのリンカーを表す。好ましい態様において、●は、例えば、
Figure 2021516959
などのリンカー-薬物コンジュゲートを表し、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。より好ましくは、リンカー-薬物コンジュゲートは
Figure 2021516959
であり、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つに従い、
Figure 2021516959
は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表すこともある。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表す。より好ましい態様において、
Figure 2021516959
は、ペプチド、タンパク質、抗体、またはオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は糖を表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は多糖を表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
はポリマーを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、好ましくは置換されていてもよいC1〜C6-アルキル、より好ましくは置換されていてもよいC1〜C4-アルキル、さらにより好ましくは置換されていてもよいC1〜C2-アルキルを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は、置換されていてもよいC3〜C8-アルキル、好ましくは置換されていてもよいC3〜C6-アルキル、より好ましくは置換されていてもよいC3〜C4-アルキルを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は、置換されていてもよいC5〜C8-アルキル、好ましくは置換されていてもよいC6〜C7-アルキルを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は置換されていてもよいフェニルを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系を表す。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
は、抗体、好ましくはIgG抗体、より好ましくはセツキシマブまたはトラスツズマブまたはブレンツキシマブ；タンパク質、好ましくはGFPタンパク質またはeGFP-タンパク質、アルブミン、トリペプチド、好ましくは式（VIII）
Figure 2021516959
、
または式（IX）
Figure 2021516959
のペプチドを表し、ここで#はSの位置を表す。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表す。より好ましい態様において、抗体はIgG抗体、さらにより好ましくはセツキシマブまたはトラスツズマブまたはブレンツキシマブを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質、より好ましくはGFPタンパク質またはeGFP-タンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアルブミンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はトリペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は式（VIII）
Figure 2021516959
のペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は式（IX）
Figure 2021516959
のペプチドを表す。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体（例えば、セツキシマブ、トラスツズマブ、またはブレンツキシマブ）を表し、かつ●はタンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質（例えば、GFPタンパク質またはeGFPタンパク質）を表し、かつ●はタンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、抗体、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●は抗体を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はタンパク質を表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はタンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、抗体、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●は抗体を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はペプチドを表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はタンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はアミノ酸を表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体（例えば、セツキシマブ、トラスツズマブ、またはブレンツキシマブ）を表し、かつ●はリンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●は、例えば、VC-PAB、VA-PAB、KF-PAB、またはVK-PABを含むリンカー、好ましくはVC-PABを含むリンカーなどのリンカーを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●は薬物を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●は、例えば、
Figure 2021516959
などのリンカー-薬物コンジュゲートを表し、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。より好ましい態様において、
Figure 2021516959
は抗体を表し、かつ●は、例えば、
Figure 2021516959
などのリンカー-薬物コンジュゲートを表し、ここで#はY（O（酸素）またはS（硫黄）、好ましくはS）の位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、抗体はセツキシマブ、トラスツズマブまたはブレンツキシマブ、好ましくはブレンツキシマブであってもよい。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はペプチド、タンパク質、タンパク質タグ、抗体、オリゴヌクレオチド、CY5またはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●は抗体を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はヌクレオチドを表し、かつ●はリンカーを表す。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はペプチド、タンパク質、タンパク質タグ、抗体、オリゴヌクレオチド、CY5またはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、または低分子を表し；ここで任意で●はYに結合されているリンカーをさらに含む。したがって、好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はペプチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はタンパク質を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はタンパク質タグを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●は抗体を表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はCY5またはEDANSなどのフルオロフォアを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はビオチンを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●は低分子を表す。任意で、これらの態様のうちのいずれか1つにおいて、●はYに結合されているリンカーをさらに含む。
化合物（III）または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
はオリゴヌクレオチドを表し、かつ●はリンカーを表す。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、●は、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し、ここでアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは固体支持体に結合されている。いくつかの態様において、化合物は式（I）の化合物または式（I*）の化合物である。いくつかの態様において、●は固体支持体に結合されたアミノ酸またはペプチドを表す。いくつかの態様において、●は固体支持体に結合されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、●は固体支持体に結合されたペプチドを表す。利点として、本発明者らは、本発明のホスホノチオレート（Y＝S）は、ペプチドの固体支持体からの切断に典型的に用いられる酸性条件下、例えば、90％トリフルオロ酢酸（TFA）下で非常に安定であることを見出した。固体支持体は、例えば、本明細書において方法の文脈で前述したとおり、固相ペプチド合成に適した、当業者には公知の任意の固体支持体、または固相オリゴヌクレオチド合成に適した、任意の固体支持体であってもよい。任意で、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合されている、前述の態様において、●は、本明細書に開示する式、特に化合物（I）、（III）、（I*）、および（III*）のYに結合されているリンカーをさらに含む。加えて、リンカーはアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドに結合されている。したがって、●はリンカー-アミノ酸-固体支持体、リンカー-ペプチド-固体支持体、リンカー-ヌクレオチド-固体支持体、またはリンカー-オリゴヌクレオチド-固体支持体の構造を有してもよい。「リンカー」は実質的に任意のリンカーであり得、リンカーはYに結合されており、該Yは、例えば、式（I）、（I*）、（III）、または（III*）の化合物に関して本明細書において示されるとおり、S（硫黄）またはO（酸素）、好ましくはSである。リンカーは当業者には公知の任意のリンカー、例えば、ペプチドリンカーまたは直鎖もしくは分岐炭化水素系部分であってもよい。リンカーは環式部分を含むこともできる。ペプチドリンカーは、例えば、1〜50、1〜40、1〜30、1〜20、1〜10、1〜5、1〜3、または2つ、または1つのアミノ酸を含んでもよい。リンカーが炭化水素系部分である場合、リンカーの主鎖は炭素原子だけを含んでもよいが、酸素（O）、窒素（N）もしくは硫黄（S）原子などのヘテロ原子を含むこともでき、かつ/またはカルボニル基（C=O）を含むこともできる。リンカーは、例えば、C1〜C20炭素原子鎖または-(O-CH2-CH2)-反復単位を有するポリエチレングリコール系鎖などのポリエーテル系鎖であってもよい。炭化水素系リンカーの典型的態様において、連結部分は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、および19個を含む、1〜約150、1〜約100、1〜約75、1〜約50、または1〜約40、または1〜約30、または1〜約20個の主鎖原子を含む。当業者には、適切なリンカーを選択することは公知である。例えば、いくつかの態様において、リンカーは
Figure 2021516959
であってもよく、ここで#はYの位置を示し、かつ*はアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、例えば、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドはリンカーに、N（窒素）原子を通じて結合され得る。
化合物（I）、（I*）、（III）、または（III*）のうちのいずれか1つの好ましい態様において、
Figure 2021516959
は、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し、ここでアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは固体支持体に結合されている。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は、固体支持体に結合されたアミノ酸またはペプチドを表す。いくつかの態様において、
Figure 2021516959
は、固体支持体に結合されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表す。好ましい態様において、
Figure 2021516959
は固体支持体に結合されたペプチドを表す。
本発明は、
固体支持体と、
式（I）
Figure 2021516959
の化合物および/または式（I*）
Figure 2021516959
の化合物とを含むキットにも関し、式中、●は、アミノ酸への、ペプチドへの、ヌクレオチドへの、またはオリゴヌクレオチドへの結合に適したリンカーであり；かつ
ここで、
Figure 2021516959
、R1、X、Y、およびVは本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。そのようなキットは、固相ペプチド合成および/またはまたは固相オリゴヌクレオチド合成に適している。本発明者らは、本発明のホスホノチオレート（Y＝S）は、ペプチドの固体支持体からの切断に典型的に用いられる酸性条件下、例えば、90％トリフルオロ酢酸（TFA）下で非常に安定であることを見出したため、好ましくは、キットを固相ペプチド合成のために用いてもよい。固相合成中、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは固体支持体に結合されており、かつ式（I）または式（I*）の化合物のリンカーはアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドに結合されている。
キットの好ましい態様において、リンカーは
Figure 2021516959
であり、ここで#はYの位置を示し、かつmおよびnはそれぞれ独立に、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmは1でありかつnは1である。アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドはそのようなリンカーに、カルボキシル基を通じて結合されている。いくつかの態様において、式（I）の化合物は構造
Figure 2021516959
を有する。
キットは、1つもしくは複数のアミノ酸、1つもしくは複数のペプチド、1つもしくは複数のヌクレオチド、および/または1つもしくは複数のオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよく、これらを固相合成において用いることができる。特に、固相ペプチド合成が好まれる場合、キットは1つまたは複数のアミノ酸を含んでもよい。
本発明は、式（IIIa）
Figure 2021516959
の化合物にも関し、式中、●および
Figure 2021516959
は、
●と
Figure 2021516959
とを連結している弧によって示されるとおり、同じ分子内に存在し、かつここで、●、
Figure 2021516959
、X、Y、およびR1は本明細書において前記および下記で定義されたとおり、特に化合物（III）に関して定義されたとおりである。好ましくは、化合物（IIIa）は、例えば、BCL9ペプチドから誘導される環式ペプチドなどの、環式ペプチドである。
本発明は、式（III*a）
Figure 2021516959
の化合物にも関し、式中、●および
Figure 2021516959
は、
●と
Figure 2021516959
とを連結している弧によって示されるとおり、同じ分子内に存在し、かつここで、●、
Figure 2021516959
、V、X、Y、およびR1は本明細書において前記および下記で定義されたとおり、特に化合物（III*）に関して定義されたとおりである。好ましくは、化合物（III*a）は、例えば、BCL9ペプチドから誘導される環式ペプチドなどの、環式ペプチドである。
さらに、式（I）、（I*）、（III）、（III*）、（IIIa）、または（III*a）の化合物について、本明細書において実施例の項で例として提供される化合物も好ましい。
当業者であれば、本発明の態様は、任意の自然法則に矛盾する組み合わせは除外されることを条件として、互いに組み合わせ得ることを理解するであろう。
任意の方法に関して本明細書に記載する任意の態様、特徴、定義などは、必要な変更を加えて、本明細書に記載の任意の化合物にも適用される。同じように、任意の化合物に関して本明細書に記載する任意の態様、特徴、定義などは、必要な変更を加えて、本明細書に記載の任意の方法に適用される。
三ハロゲン化リンから出発する式（IV）、（IV*）、（I）、および（I*）の化合物の合成
以下の項は、三ハロゲン化リンから出発する式（IV）、（IV*）、（I）、および（I*）の化合物の合成の、いくつかの一般的特徴を提供する。一般に、当業者には、そのような合成を実施するための適切な反応を選択することは公知である。さらなる詳細は以下の実施例の項に示す。
本明細書における前記および下記のとおり、式（IV）または（IV*）の化合物を、段階（i）〜（iv）を含む配列を介して調製することができる。したがって、式（IV）または（IV*）の化合物を、（i）三ハロゲン化リン（X）、好ましくはPCl3を、R1残基を含むアルコール（XI）と反応させる段階、（ii）段階（i）で得た生成物をアミン（XII）と反応させる段階、（iii）段階（ii）で得た生成物をアルケニルマグネシウムハライドもしくはアルキニルマグネシウムハライド（XIII）と、またはアルケニルマグネシウムハライド（XIII*）と反応させる段階、および（iv）段階（iv）で得た生成物を、●残基を含むアルコールまたはチオール（XIV）と反応させて式（IV）または（IV*）の化合物を得る段階によって合成してもよい。式（I）または（I*）の化合物を式（IV）または（IV*）の化合物から、酸化により得ることができる。
段階（i）
段階（i）は、例えば、三ハロゲン化リン（X）、好ましくはPCl3をアルコール（XI）と、例えば、ジエチルエーテルまたはテトラヒドロフランなどの適切な溶媒中、-10℃未満の低温で反応させ、次いで反応混合物を加温することによって行うことができ；例えば、温度範囲は-50℃〜+50℃の間であってもよく；より具体的には、反応を約-40℃または-30℃で行い、次いで室温に加温してもよい。好ましくは、三ハロゲン化リンとアルコールとの反応は、例えば、トリエチルアミンのようなアミン塩基などの弱塩基存在下で実施する。三ハロゲン化リンに対するアルコールのモル比は5：1〜1：5の範囲、好ましくは2：1〜1：2の範囲であるべきであり、より好ましくはモル比は1：1である。トリエチルアミンのようなアミン塩基などの弱塩基を使用する場合、三ハロゲン化リンに対する塩基のモル比は、5：1〜1：5の範囲、例えば、2：1〜1：2の範囲、好ましくは約1：1であってもよい。もちろん、反応時間は反応体積および物質の量に依存する。指標として、加温前の低温での反応時間は、例えば、約10分などの、2分〜2時間であってもよく、加温後の反応時間は、例えば、約1時間などの、15分〜6時間であってもよい。好ましくは、反応は、アルゴンなどの不活性ガス下で実施する。この文脈における「不活性」とは、所与の反応条件下で反応の出発物質または生成物のいずれとも反応しないガスを指す。段階（i）の反応後に得た混合物は、好ましくは、生成物を単離することなく段階（ii）で用いる。任意で、段階（i）の後および段階（ii）の前に、混合物を、例えばセライトろ過によって精製してもよい。
段階（ii）
段階（ii）は、例えば、段階（i）で得た生成物をアミン（XII）、好ましくはジイソプロピルアミンと、例えば、ジエチルエーテルまたはテトラヒドロフランなどの適切な溶媒中で反応させることによって行うことができる。これに関して、溶媒は段階（i）と同じであってもよい。段階（ii）の反応は、-10℃未満の低温で行い、次いで反応を加温することによって行ってもよく；例えば、温度範囲は-50℃〜+50℃の間であってもよく；より具体的には、反応を約-40℃または-30℃で行い、次いで室温に加温してもよい。アミン（XII）のモル比は、段階（i）で用いた三ハロゲン化リン（X）のモル量に基づいていてもよい。したがって、三ハロゲン化リン（X）に対するアミン（XII）のモル比は5：1〜1：5の範囲であるべきであり、好ましくは三ハロゲン化リン（X）に対するアミン（XII）のモル比は約2：1であるべきである。指標として、加温前の低温での反応時間は、例えば、約10分などの、2分〜2時間であってもよく、加温後の反応時間は、例えば、約1時間などの、15分〜6時間であってもよい。好ましくは、反応は、アルゴンなどの不活性ガス下で実施する。段階（ii）の反応後に得た混合物は、好ましくは、生成物を単離することなく段階（iii）で用いる。任意で、段階（ii）の後および段階（iii）の前に、混合物を、例えばセライトろ過によって精製してもよい。段階（ii）において、一般構造
Figure 2021516959
を有する生成物が得られ、ここでHalは、段階1で使用する三ハロゲン化リンに依存して、Cl、BrまたはIなどのハロゲン化物であり、例えば、PCl3を使用する場合、HalはClであり；かつここでR1およびR2は本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。
段階（iii）
段階（iii）は、例えば、段階（ii）で得た生成物をアルケニルマグネシウムハライドもしくはアルキニルマグネシウムハライド（XIII）、またはアルケニルマグネシウムハロゲン化物（XIII*）と、例えば、ジエチルエーテルまたはテトラヒドロフランなどの適切な溶媒中で反応させることによって行うことができる。これに関して、溶媒は段階（ii）と同じであってもよい。段階（ii）の反応は、-50℃未満の低温で行い、次いで反応を加温することによって行ってもよく；例えば、温度範囲は-100℃〜+50℃の間であってもよく；より具体的には、反応は約-78℃で行い、次いで室温に加温してもよい。アルケニルマグネシウムハライドもしくはアルキニルマグネシウムハライド（XIII）、またはアルケニルマグネシウムハライド（XIII*）のモル比は、段階（i）で用いた三ハロゲン化リン（X）のモル量に基づいていてもよい。したがって、アルケニルマグネシウムハライドもしくはアルキニルマグネシウムハライド（XIII）、またはアルケニルマグネシウムハライド（XIII*）の三ハロゲン化リン（X）に対する比は5：1〜1：5の範囲、好ましくは2：1〜1：2の比であるべきであり、より好ましくは、アルケニルマグネシウムハライドまたはアルキニルマグネシウムハライド（XIII）の三ハロゲン化リン（X）に対するモル比は約1：1であるべきである。指標として、加温前の低温での反応時間は、例えば、約10分などの、2分〜1時間であってもよく、加温後の反応時間は、例えば、約1時間などの、15分〜6時間であってもよい。好ましくは、反応は、アルゴンなどの不活性ガス下で実施する。段階（iii）の反応により得た混合物を後処理してもよく、次いで生成物を、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーまたは真空蒸留などの、当業者には一般に公知の方法によって単離してもよい。段階（iii）において、アルケニルマグネシウムハライドもしくはアルキニルマグネシウムハライド（XIII）を用いた場合、一般構造
Figure 2021516959
を有する生成物が得られ、またはアルケニルマグネシウムハライド（XIII*）を用いた場合、一般構造
Figure 2021516959
を有する生成物が得られ、ここでうちのいずれか1つのこれらの構造において、
Figure 2021516959
、R1、R2、X、およびVは本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。
段階（iv）
段階（iv）は、例えば、段階（iii）で得た生成物を、●残基を含むアルコールまたはチオール（XIV）と、例えば、アセトニトリルなどの適切な溶媒中で反応させることによって行うことができる。段階（ii）の反応は、-20℃未満の低温で行い、次いで反応を加温することによって行ってもよく；例えば、温度範囲は-50℃〜+50℃の間であってもよく；より具体的には、反応は約-40℃で行い、次いで室温に加温してもよい。好ましくは、段階（iii）で得た生成物とアルコールまたはチオール（XIV）との反応を、テトラゾール存在下で行う。テトラゾールは無置換テトラゾールまたは置換テトラゾールであってもよい。段階（iii）で得た生成物に対するアルコールまたはチオール（XIV）のモル比は、5：1〜1：5の範囲、好ましくは2：1〜1：2の比であるべきであり、より好ましくはモル比は約1：1である。テトラゾールを用いる場合、段階（iii）で得た生成物に対するテトラゾールのモル比は、5：1〜1：5の範囲であってもよく、好ましくは、段階（iii）で得た生成物に対するテトラゾールのモル比は約2：1であるべきである。指標として、加温前の低温での反応時間は、例えば、約10分などの、2分〜2時間であってもよく、加温後の反応時間は、例えば、約30分または約1時間などの、15分〜6時間であってもよい。反応は、アルゴンなどの不活性ガス下で実施する。
式（I）または（I * ）の化合物の合成のための酸化
段階（iv）は、式（IV）または（IV*）の化合物を生成させる。次いで、式（IV）または（IV*）の化合物をリンで酸化することにより、式（I）または（I*）の化合物を得る。段階（iv）の反応後に得た混合物を、さらなる後処理または精製を行わずに、そのような酸化に用いてもよく、すなわち、酸化剤を、段階（iv）の反応後に得た混合物に直接添加してもよい。例えば、tert-ブチルヒドロペルオキシド（tBu-OOH）、メタクロロ過安息香酸（mCPBA）、過酸化水素（H2O2）、ヨウ素（I2）、ペルオキシ一硫酸カリウム、または酸素（O2）、例えば、空気からの酸素などの、様々な適切な酸化剤を使用してもよい。当業者であれば、適切な酸化剤を容易に決定するであろう。好ましくは、tert-ブチルヒドロペルオキシド（tBu-OOH）を酸化剤として使用してもよい。反応は、0〜60℃の温度で、例えば、室温で行ってもよい。酸化剤のモル比は、段階（iii）で得た生成物のモル量に基づいていてもよい。したがって、段階（iii）で得た生成物に対する酸化剤のモル比は、2：1〜1：2の範囲であるべきであり、好ましくは、段階（iii）で得た生成物に対する酸化剤のモル比は1：1であるべきである。指標として、酸化のための反応時間は、例えば、約10分などの、2分〜2時間であってもよい。反応は、アルゴンなどの不活性ガス下で実施してもよい。酸化によって得た混合物を後処理してもよく、得た式（V）または（V*）の化合物を、当業者には一般に公知の方法によって、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離してもよい。
求電子性ジスルフィドから出発する式（I）または（I*）の化合物の合成
以下の項では、YがS（硫黄）である、求電子性ジスルフィドから出発する式（I）および（I*）の化合物の合成の、いくつかの一般的特徴を示す。一般に、当業者には、そのような合成を実施するための適切な反応条件を選択することは公知である。さらなる詳細は以下の実施例の項に示す。
本明細書における前記および下記のとおり、YがSである、式（I）または（I*）の化合物は、求電子性ジスルフィド（XXX）を、●残基を含むチオール（XXXI）と反応させて、式（VIa）の化合物を得ることによって調製することができる。式（VIb）の化合物は、文献上で公知の手順に従って調製することができる。次いで式（VIa）または（VIb）の化合物を、R1残基を含む式（V）または（V*）のリン(III)化合物と反応させて、式（I）または（I*）の化合物を得る。式（V）の化合物は、R1残基を有する式（XX）のハロゲノホスファイトを式（XXI）のグリニャール化合物と反応させることによって調製することができ、かつ式（V*）の化合物は、式（XX）のハロゲノホスファイトを式（XXI*）のグリニャール化合物と反応させることによって調製することができる。
式（V）または（V * ）の化合物の合成
式（V）または式（V*）の化合物は、例えば、式（XXI）のアルケニルマグネシウムハライドもしくはアルキニルマグネシウムハライド（XXI）-好ましくは式（XXI）のアルケニルマグネシウムハライド-または式（XXI*）のアルケニルマグネシウムハライドを、R1残基を含む式（XX）のハロゲノホスファイトと反応させることによって調製することができる。好ましくは、式（XXI）のアルケニルマグネシウムハライドもしくはアルキニルマグネシウムハライド、または式（XXI*）のアルケニルマグネシウムハライドは、アルケニルマグネシウムブロミドまたはアルキニルマグネシウムブロミドである。好ましくは、式（XX）のハロゲノホスファイトはクロロホスファイトである。適切な溶媒として、例えば、ジエチルエーテルまたはテトラヒドロフランを用いてもよい。好ましくは、反応は-20℃未満の温度、例えば、-100℃〜-40℃の間、好ましくは-90℃〜-50℃の間（例えば、-78℃付近）で行う。好ましくは、反応は、アルゴンなどの不活性ガス下で行う。指標として、反応時間は、例えば、2時間などの、2分〜4時間の範囲であるべきである。式（XXI）のアルケニルマグネシウムハライドもしくはアルキニルマグネシウムハライド、または式（XXI*）のアルケニルマグネシウムハライドの、式（XXI）のハロゲノホスホスファイトに対する比は、例えば、約1：1.2の式（XXI）のアルケニルマグネシウムハライドもしくはアルキニルマグネシウムハライド、または式（XXI*）のアルケニルマグネシウムハライドの、式（XXI）のハロゲノホスホスファイトに対する比などの、5：1〜1：5、例えば、2：1〜1：2、例えば、約1：1の範囲であるべきである。さらなる詳細は、例えば、M. R. J. Vallee, Angewandte Chemie Int. Ed., 2013, 52 (36), 9504に示されている。
式（VIa）または（VIb）の化合物の合成
式（VIa）または（VIb）の化合物は、例えば、式（XXX）の求電子性ジスルフィドを、●残基を含むチオール（XXXI）と反応させることによって調製することができる。反応は、例えば、テトラヒドロフランまたはN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）などの、適切な溶媒中で実施してもよい。好ましくは、式（XXX）の求電子性ジスルフィドとチオール（XXXI）との反応は、例えば、トリエチルアミンのようなアミン塩基などの、弱塩基存在下で行う。反応は、例えば、室温などの、0℃〜60℃の温度で行うことができる。式（XXX）の求電子性ジスルフィドとチオール（XXXI）とのモル比は、例えば、1.2：1の式（XXX）の求電子性ジスルフィドとチオール（XXXI）との比などの、5：1〜1：5の範囲、好ましくは2：1〜1：2の範囲、より好ましくは約1：1であるべきである。トリエチルアミンのようなアミン塩基などの、弱塩基を用いる場合、式（XXXI）のチオールに対する塩基のモル比は5：1〜1：5の範囲であってもよく、好ましくは式（XXXI）のチオールに対する塩基のモル比は約3：1である。反応時間は、例えば、約1時間、または約20分または約10分などの、例えば、2分〜6時間の間であってもよい。反応は、例えば、薄層クロマトグラフィーなどの、適切な方法を用いてモニターしてもよい。反応は、アルゴンなどの不活性ガス下で行ってもよい。●残基を含む式（VIa）の化合物は、当業者には一般に公知の方法によって、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離してもよい。式VIbの化合物は、文献上で公知の手順に従い、例えば、チオール
Figure 2021516959
を、塩化スルフリル（例えば、Allared, F. et al, Synthetic Metals, 120(1-3), 1061-1062; 2001参照）もしくは塩化チオニル（例えば、Masaki, Yukio et al, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 33(5), 1930-40; 1985参照）と反応させることにより、またはチオール
Figure 2021516959
を、N-クロロスクシンイミド（NCS）（例えば、Kawamura, Takamasa et al. European Journal of Organic Chemistry, 2015(4), 719-722; 2015参照）もしくは塩素（例えば、E. Schneider, Chemische Beririchte 84, 911-916 (1951)参照）と反応させることにより、調製することができ、ここで●は本明細書において前記および下記で定義されたとおりである。
式（I）または（I * ）の化合物の合成
YがSである、式（I）または（I*）の化合物は、式（V）または（V*）の化合物を式（VIa）または（VIb）の化合物と反応させることによって調製することができる。好ましくは、式（V）または（V*）の化合物はアルケンホスホニトであり、すなわち式（V）または（V*）の化合物中の
Figure 2021516959
は二重結合である。反応は、例えば、テトラヒドロフランもしくはN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中などの、適切な有機溶媒中、または、例えば、テトラヒドロフランとトルエンとの混合物中などの、溶媒混合物中で行う。反応は、0℃〜60℃の温度、例えば、室温で行ってもよい。好ましくは、反応は、アルゴンなどの不活性ガス下で行ってもよい。式（V）または（V*）の化合物の、式（VIa）または（VIb）の化合物に対するモル比は、例えば、約1.2：1の式（V）または（V*）の化合物の、式（VIa）または（VIb）の化合物に対するモル比などの、5：1〜1：5の範囲、好ましくは2：1〜1：1の範囲、より好ましくは約1：1であるべきである。指標として、反応時間は、例えば、約2時間、約1時間、約30分または約10分などの、例えば、2分〜6時間の間であってもよい。式（I）または（I*）の化合物は、当業者には一般に公知の方法によって、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離することができる。
式（II）の化合物による化合物（I）または（I*）のヒドロチオール化
式（I）または（I*）のホスホノチオレートまたはホスホネートを、適切な溶媒中で式（II）のチオールによるヒドロチオール化反応に供してもよい。溶媒系は、広範な溶媒から選択することができる。溶媒は、テトラヒドロフラン（THF）、ジメチルホルムアミド（DMF）、アセトニトリル（MeCN）、アセトン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、酢酸エチル（EtOAc）、N-エチルピロリドンもしくはその混合物などの極性非プロトン性溶媒系、好ましくはTHF、DMF、DMSO；ヘキサン、トルエン、ベンゼン、1,4-ジオキサン、クロロホルム、ジエチルエーテルもしくはジクロロメタン（DCM）などの非極性溶媒、好ましくはDCM；水、エタノール、イソプロパノール、メタノール、n-ブタノールなどの極性プロトン性溶媒、好ましくはエタノール；またはその混合物であり得る。例えば、ヒドロチオール化は、DMFまたはDMF/水混合物中で行ってもよい。特に、ヒドロチオール化は、例えば、タンパク質、抗体、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドなどの生体分子を反応させる場合に、DMFまたはDMF/水混合物中で行ってもよい。溶媒は、例えば、水または水性緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（PBS）、トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン（TRIS）、炭酸水素塩、EDTA/NH4HCO3緩衝液、リン酸緩衝食塩水（PBS）中のEDTA/NH4HCO3、またはホウ酸塩含有リン酸緩衝食塩水などの、水性媒質であってもよい。緩衝液中で反応を行うことは、例えば、タンパク質、抗体、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドなどの生体分子をヒドロチオール化反応に用いる場合に好ましい。ヒドロチオール化は、前述の水性緩衝液のうちのいずれか1つとDMFとの混合物中で行ってもよい。適切な溶媒および緩衝液は当業者であれば容易に選択されよう。
好ましくは、ホスホノチオレートまたはホスホネートのヒドロチオール化反応は、塩基性条件下、特にわずかに塩基性の条件下で、例えば、7.2〜9のpH、例えば、8または8.5のpHで行う。そのような塩基性条件は、例えば、前述の緩衝液のうちのいずれか1つを用いることなどの、適切な緩衝液系を用いることによって確立してもよい。加えて、または代わりに、ヒドロチオール化反応のための塩基性条件は、弱塩基を用いて確立してもよい。適切な塩基は、例えば、(NH4)2CO3、Na2CO3、Rb2CO3、K2CO3、もしくはCs2CO3などの炭酸塩またはその対応する炭酸水素塩（例えば、NaHCO3など）；およびトリメチルアミンEt3N（25℃でpKa10,76）などの窒素含有弱塩基である。好ましくは、7,5〜11,5の範囲内のpKa値を有する塩基を用いる。適切な塩基は当業者であれば容易に選択されよう。
ヒドロチオール化の反応温度は特に限定されない。例えば、ヒドロチオール化は、0℃〜60℃、0℃〜50℃、0℃〜40℃、0℃〜30℃の範囲の温度、例えば室温、すなわち約25℃、例えば約5℃、または約37℃の生理的に妥当な条件で行ってもよい。反応時間は、温度、反応体積および物質の量に依存する。指標として、反応は、例えば、1分間〜24時間の時間枠で、例えば1分間〜20時間、1分間〜10時間、1分間〜3時間の時間枠で、または1分間〜1時間の時間枠内でも行うことができる。適切な反応温度および反応時間は当業者であれば容易に決定されよう。
ヒドロチオール化反応に関する詳細は、以下の本明細書の実施例の項で示す。
実施例1：アルケンホスホノチオレートの合成
本発明者らは、求電子性ジスルフィドからの1段階反応で、または三塩化リン（PCl3）などの三ハロゲン化リンから出発する、アルケンホスホノチオレートを入手するための2つの異なる合成経路を開発した。両方の経路、ならびに単離した化合物を本明細書に記載し（合成の詳細および特徴決定については、以下の本明細書の実施例10を参照されたい）、スキーム2に示す。単なる実例として、R1がメチルまたはエチルである誘導体の合成を示す（O-エチルおよびO-メチル誘導体（R1＝メチル、エチル）；スキーム2参照）。しかし、いずれの合成経路もこの範囲に限定されない。実施例の項において用いられる「R2」またはいくつかの場合に単に「R」、すなわちSに結合した残基は、本明細書の全体を通して用いられる●に対応する。
Figure 2021516959
スキーム2：アルケンホスホノチオレートの合成
求電子性ジスルフィド経路
アルケンホスホノチオレートを、求電子性ジスルフィドおよびアルケンホスホニトからの1段階反応で得ることができる。いかなる理論にも縛られたくはないが、ホスホニトのリン原子の自由孤立電子対はジスルフィドの求電子性の硫黄を攻撃し、それにより非常に反応性が高い中間体を生成し、これは急速に酸化してホスホノチオレートとなると想定される。
ジエチルアルケンホスホニトを、公開されたプロトコール（M. R. J. Vallee, Angewandte Chemie Int. Ed., 2013, 52 (36), 9504）に従って合成し、異なる脂肪族求電子性ジスルフィドと反応させた、スキーム3参照。求電子性ジスルフィドは、それぞれのチオールと2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)（PNP）との反応から得た。O-エチルアルケンホスホノチオレートを、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離した。収率を表1に示す。
Figure 2021516959
スキーム3：ジエチルアルケンホスホニトと求電子性ジスルフィドとの反応からのO-エチルアルケンホスホノチオレートの合成
（表１）ジスルフィド経路で合成したO-エチルアルケンホスホノチオレートおよび単離収率
Figure 2021516959
PCl3経路
または、PCl3を、いくつかの置換反応と、それに続く酸化剤、例えば、tBuOOHによる酸化で、アルケンホスホノチオレートに変換することができる（スキーム4）。
Figure 2021516959
スキーム4：PCl3からのアルケンホスホノチオレートの合成
この経路を用いて、ベンジルおよびBoc-保護アミン誘導体を生成し、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離した（構造および収率については表2参照）。
（表２）PCl3経路で合成したO-エチルアルケンホスホノチオレートおよび単離収率
Figure 2021516959
実施例2：アルキンホスホノチオレートの合成
アルキンホスホノチオレートを、アルケンホスホノチオレートと同様に、PCl3から出発して得ることができる（前記実施例1および下記スキーム5参照）。
Figure 2021516959
スキーム5：PCl3経路によるアルキンホスホノチオレートの合成
PCl3経路を用いて、本発明者らは所望の生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより単離することができた（スキーム6、ならびに構造および収率については表3参照）。
Figure 2021516959
スキーム6：アルキンホスホノチオレートの合成
（表３）合成したO-メチルアルキン-PTおよび単離収率。*（N,N-ジイソプロピルメチルホスホンアミド酸クロリドから出発）
Figure 2021516959
実施例3：一般的ホスホノチオレート構築ブロックのさらなる官能基付与
一般的炭素環式酸またはアミンホスホノチオレート誘導体を、官能基構築ブロックで、例えば、フルオロフォアEDANSまたはビオチンで、例えば、アミドカップリングによりさらに修飾することができる。2つの実例をスキーム7に示す（さらなる化合物およびアルキン誘導体については、以下の本明細書の実施例14参照）。
Figure 2021516959
スキーム7：一般的ホスホノチオレート構築ブロックの官能基付与のための例。A）カルボン酸誘導体をNHSエステルに活性化し、アミン、例えば、フルオロフォアEDANSとさらに反応させることができる。B）または、再活性化物を、アミンPTをカルボン酸に、例えばビオチンにカップリングさせることにより交換することができる。
実施例4A：ホスホノチオレートへのグルタチオンのチオール付加
不飽和ホスホノチオレートがチオールと反応することを示すための原理の証明として、本発明者らは、塩基性水性緩衝液中でモデルチオール、グルタチオンとのコンジュゲーションを実施して、水溶性ホスホノチオレートコンジュゲートを得た。反応をUV LC-MSおよび31P-NMRでモニターした（アルケンホスホノチオレートについては図1参照）。
図1は、A）グルタチオン-アルケンホスホノチオレートコンジュゲート14の合成を示す。反応をB）UV LC-MSおよびC）31P-NMRでモニターし、単独の生成物の生成を示した。P：生成物14、SM：出発物質＝アルケンホスホノチオレート2、PMe4Br＝臭化テトラメチルホスホニウム、31P-NMRの内部標準。
反応を31P-NMRおよびUPLC-MSでモニターし、単独の生成物（P）が生成するきれいな反応を示した。
前記と同様に、本発明者らは、グルタチオンとのコンジュゲーションを実施してアルキン誘導体を得、すなわち、以下の実施例11からS-ベンジルO-メチルアルキン-PT 7を得た（表3、項目1）（図2A参照）。反応はアルケンホスホノチオレートとの反応よりもかなり速い（反応速度試験も比較、以下の本明細書の実施例5参照）。表示の条件下で、本発明者らは、約1分後にアルキンホスホノチオレートの完全な変換を観察した。2つの二重結合異性体が、約3：1の比で生成する。
図2は、A）グルタチオン-アルキン-PTコンジュゲート15の合成を示す。反応をB）UV LC-MSでモニターし、2つの二重異性体の約3：1の比での生成を示した。イノシンを内部標準として用いた。
実施例4B：アルケンホスホネートへのグルタチオンのチオール付加
本発明者らは、ジエチルアルケンホスホネートのグルタチオンとのチオール付加によるコンジュゲーションを実施して、水溶性コンジュゲートを得た（スキーム1参照）。
Figure 2021516959
スキーム1：グルタチオンホスホネートコンジュゲートの合成
反応を31P-NMRおよびUPLC-MSでモニターし、単独の生成物が生成するきれいな反応を示した。コンジュゲートは半分取HPLC（酸性条件）により60％収率で単離することができた。
実施例5：ホスホノチオレートおよびホスホネートへのチオール付加の反応速度試験
次の段階において、本発明者らは、反応速度データを得るために、不飽和ホスホノチオレートへのチオール付加の速度論の調査に着手した。このために、本発明者らは、アルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートの両方に対し、1当量の還元グルタチオン存在下、室温（約25℃）での、蛍光EDANS誘導体との付加反応を実施した（スキーム8）。本発明者らは、対応するホスホネート誘導体でも同じ試験を実施した。これらの化合物の調製については、以下の本明細書の実施例14を参照されたい。
Figure 2021516959
スキーム8：蛍光アルケンホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートならびにアルケンホスホネートおよびアルキンホスホネートへのグルタチオンのコンジュゲーション
出発物質の減衰を、蛍光検出器を用いたHPLCにより、8時間にわたってモニターした。この試験の結果を添付の図3に示す。2つの傾向が明らかになる。第一に、チオール付加において、アルキン誘導体はアルケン誘導体よりもはるかに速く反応する。第二に、ホスホノチオレートはホスホネートよりも速く反応する。これは、ユーザーが反応を低い濃度で行って、短時間で高い変換率を得ることを可能にし、最終的に反応の収率も高めるため、ホスホノチオレートの重要な利点である。これは、例えば、抗体に対する薬物の高い比が通常望ましい、抗体-薬物コンジュゲートの生成において非常に重要である。
図3は、pH8.5でのアルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートならびにアルケンホスホネートおよびアルキンホスホネートへのグルタチオンの付加についての反応速度試験を示す。出発物質の経時的な減衰が示される。内部標準に対しての残存出発物質の蛍光強度を、蛍光検出器を用いたHPLCにより測定した。各反応を三つ組で実施した。平均値および標準偏差が示される。1.0の出発物質面積は100％の出発物質を示す。
実施例6：ホスホノチオレートコンジュゲートの安定性試験
不飽和ホスホノチオレートをバイオコンジュゲーションハンドルとして用いる場合の重要な考察事項は、得られるチオール付加生成物が生理的に関連する条件下で安定であるかどうかである。この問題に取り組むために、本発明者らは、ダブシル-EDANSのクエンチャー対を用い、それぞれのアルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートのコンジュゲートならびにアルケンホスホネートおよびアルキンホスホネートのコンジュゲートを合成した（図4）。これらの化合物は、細胞溶解物または血清などの複雑なマトリックス中のコンジュゲートの安定性をモニターすることを可能にする。
コンジュゲートが無傷の場合、ダブシルおよびEDANSは近接しており、EDANSの蛍光は消光する。コンジュゲートの切断後、EDANSは遊離され、その蛍光を検出し、定量することができる。
これらのクエンチャー対化合物は、P-S結合の安定性のモニタリングを可能にするだけでなく、チオールコンジュゲートの安定性についても可能となる。これは、逆チオール付加または他のチオールとの交換の可能性もそれによって検出し得るため、重要である。
図4は、EDANS-ダブシルクエンチャー対の設計を示し、これらはホスホノチオレートまたはホスホネートコンジュゲーション化学を介して連結されている。丸で囲んだ部分が切断されて離れれば、EDANSはダブシルから遠くなるため、その蛍光は消光しなくなる。
本発明者らは、アルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートならびにアルケンホスホネートおよびアルキンホスホネートの、以下の条件下での安定性をモニターした。PBS（リン酸緩衝食塩水）pH＝7.4、Hela細胞溶解物、ヒト血清。温度は室温（約25℃）であった。蛍光を約3日間にわたってモニターした。陽性対照として、コンジュゲートされていないEDANSおよび遊離ダブシル-ペプチド（1：1）を、同じ条件下で測定した。結果を図5に示す。右のカラムは左のカラムと同じデータセットのズームを示す。また、対照として、ホスホノチオレートおよびホスホネートを1M NaOHで処理し、ホスホノチオレートおよびホスホネートの急速な切断をきたした。これにより、pH＝7.4のPBS、HeLa細胞溶解物、またはヒト血清を用いたアッセイにおいて、切断は、あったとしても非常に低いレベルで起こるにすぎないことが確認される。
リン酸緩衝液（PBS、pH7.4）中で、すべての誘導体は良好な安定性を示す。Hela細胞溶解物および血清中でも、誘導体は良好な安定性を示し、それによりホスホノチオレート系バイオコンジュゲートおよびホスホネート系バイオコンジュゲートは、生理的に関連する条件下で安定であることを示している。
図5は、ホスホノチオレートコンジュゲートおよびホスホネートコンジュゲートの、表示の条件下での安定性を示す。蛍光の増大はコンジュゲートの切断を意味する。
実施例7：ホスホノチオレートへのタンパク質コンジュゲーション
次に、本発明者らは、アルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートをモデルタンパク質のウシ血清アルブミン（BSA）およびモノクローナル抗体セツキシマブの両方にコンジュゲートさせた。
実施例7A1：ホスホノチオレートへのウシ血清アルブミンのコンジュゲーション
アルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートにコンジュゲートさせるためのモデルタンパク質として、本発明者らはウシ血清アルブミン（BSA）を選択した。この実験により、アルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートはタンパク質レベルのシステイン選択的修飾に適したバイオコンジュゲーションハンドルであることが示されている。BSAは1つの還元システイン残基（Cys58）を有し、これはPTによるアルキル化に利用可能である。他のシステインはジスルフィド橋に存在するため、理論的にホスホノチオレートに対して反応性ではない。
修飾のために、BSAの溶液を過剰のPTと、pH＝7.4〜8.5、4℃で18時間反応させた（スキーム9参照）。
Figure 2021516959
スキーム9： PTによるBSAの修飾
反応後、修飾タンパク質のSDS-PAGEを行い、続いてゲル内トリプシン消化し、得られたペプチドを続いてMS/MS分析に供した。
MS/MS分析の結果を表4にまとめている。BSAの良好な配列カバー度が両方の誘導体で得られた。また、修飾度は高い（アルケンホスホノチオレートについては＞50％、アルキンホスホノチオレートについては＞90％）。アルケンホスホノチオレート誘導体では、他のアミノ酸（His、Ser、Thr、Arg）も幾分低い程度で修飾された。しかし、少ない当量を用いること、および/またはpHを7.4に下げることにより、これらのアミノ酸との反応が低減された。アルキンホスホノチオレートはアルケンホスホノチオレートよりもシステインと選択的に反応することが観察された。
（表４）ホスホノチオレート修飾BSAタンパク質のMS/MS分析の結果
Figure 2021516959
Figure 2021516959
結論として、結果はシステイン選択性を示し、すなわち、望まれるとおり、BSAのシステインはアルケンホスホノチオレートまたはアルキンホスホノチオレートで選択的に修飾された。
実施例7A2：ホスホネートへのウシ血清アルブミンのコンジュゲーション
本発明者らは、ジエチルアルケンホスホネートはモデルタンパク質ウシ血清アルブミン（BSA）に、コンジュゲートのMS/MS分析によって示されるとおり、システイン選択的様式でコンジュゲートし得ることをさらに示すことができた（スキーム10）（表5参照）。BSAは1つの還元システイン残基（Cys58）を有し、これはアルキル化に利用可能である。
Figure 2021516959
スキーム10：ジエチルアルケンホスホネートによるBSAの修飾
（表５）ホスホネート修飾BSAタンパク質のMS/MS分析の結果
Figure 2021516959
結論として、またこれらの結果はシステイン選択性も示しており、すなわち、望まれるとおり、BSAのシステインはアルケンホスホネートまたはアルキンホスホネートで選択的に修飾された。
実施例7B：ホスホノチオレートへの抗体コンジュゲーション
最後に、本発明者らは、この新しいシステイン選択的な一連の反応を、IgG抗体のコンジュゲーションに適用した（スキーム11）。修飾戦略は、以前にマレイミドコンジュゲーションに適用した2段階還元-アルキル化アプローチ（S. O. Doronina, B. E. Toki, M. Y. Torgov, B. A. Mendelsohn, C. G. Cerveny, D. F. Chace, R. L. DeBlanc, R. P. Gearing, T. D. Bovee, C. B. Siegall, J. A. Francisco, A. F. Wahl, D. L. Meyer, P. D. Senter, Nat Biotech, 2003, 21, 778-784.）に依拠している。第一の段階において、抗体を一体にしている鎖間ジスルフィド架橋をジチオスレイトール（DTT）処理によって還元する。次いで、遊離チオールはチオール付加反応においてホスホノチオレートと反応することができる。第一の実験を、ヒト表皮成長因子に対するモノクローナルIgG1抗体のセツキシマブを用いて実施した。
Figure 2021516959
スキーム11：ビオチン修飾アルケンホスホノチオレート4によるシステイン選択的抗体修飾のための2段階還元およびアルキル化アプローチ
原理の証明として、抗体をビオチンアルケン誘導体4で修飾し、SDS-PAGEと、続いて抗ビオチンウェスタンブロッティングで分析した。
抗ビオチンウェスタンブロット分析の結果を図6に示す。抗体断片（重および軽鎖）のビオチンホスホノチオレート誘導体4による、pH＝7.4（レーン3）およびpH＝8.5（レーン5）両方での修飾を確認することができた。収率は高いpH＝8.5の方が高い（レーン3と5とを比較されたい）。ジスルフィドをDTTにより事前に還元していない場合（レーン4および6）、修飾を検出し得なかったことに留意されたい。比較のために、抗体をビオチン-マレイミドでも、pH＝7.4で同じプロトコールを用いて標識した。マレイミドの場合の修飾度は、PTに比べて高いが（レーン1と3とを比較されたい）、非還元抗体についても修飾が検出される（レーン2）ため、反応は明らかにシステインに対して化学選択的ではない。
図6は、SDS-ゲルを還元した後の、セツキシマブコンジュゲーションのウェスタンブロット分析を示す。上図：ブロッティング後の膜のポンソーS染色は、ブロットした抗体の等しい量を示す。下図：ビオチン修飾抗体断片の化学発光検出（Strep-HRP）。還元抗体とビオチン化合物との反応を、pH＝7.4（レーン1〜4）またはpH＝8.5（レーン5〜6）のいずれかで実施した。M＝マーカー（タンパク質ラダー）。
加えて、本発明者らは、セツキシマブのビオチン-ホスホノチオレート誘導体28（アルキン）および13（アルケン）とのpH8.5でのコンジュゲーション（図7A）ならびに比較としてセツキシマブの28とのpH7.4、8.0および8.5でのコンジュゲーション（図7B）も実施した。アルキンホスホノチオレートは、抗体を標識する際に、アルケンホスホノチオレートよりも有効である（図7A）。アルケンホスホノチオレート4（図6）と同様に、アルキンホスホノチオレート28についても、pHが上がるにつれてアルキンホスホノチオレートによる抗体のより多くの標識が得られる。
図7は、SDS-ゲルを還元した後の、セツキシマブコンジュゲーションのウェスタンブロット分析を示す。A）化合物13および28によるpH8.5での修飾。B）化合物28によるpH7.4〜8.5での修飾。
結論として、結果はシステイン選択性を示し、すなわち、望まれるとおり、抗体のシステインはアルケンホスホノチオレートまたはアルキンホスホノチオレートで選択的に修飾された。
実施例8：求電子性ジスルフィドの合成のための手順
一般手順A：2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)からの混合ジスルフィドの合成
Figure 2021516959
火炎乾燥した丸底フラスコに10mlのTHF中1.0mmol（1.0当量（eq.））のチオール（c＝0.1M）を加えた。3.0mmol（3.0当量）のトリエチルアミンおよび1.2mmol（1.2当量）のジスルフィド2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)を続いて加え、反応混合物を室温で10分間撹拌した。反応をTLCによってモニターした。完全変換が達成された時点（約10分）で、揮発性物質を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。
2-(エチルジスルファネイル)-5-ニトロピリジン
Figure 2021516959
2-(エチルジスルファネイル)-5-ニトロピリジンを、エタンチオール（103μl、1.34mmol）から一般手順Aに従って調製した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/EtOAc＝10：1）で精製して、表題化合物を黄色油状物で得た（228mg、1.05mmol、78％）。
Figure 2021516959
2-(ベンジルジスルファネイル)-5-ニトロピリジン
Figure 2021516959
2-(ベンジルジスルファネイル)-5-ニトロピリジンを、ベンジルメルカプタン（48μl、0.41mmol）から一般手順Aに従って調製した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/EtOAc＝10：1）で精製して、表題化合物を無色固体で得た（91mg、0.33mmol、80％）。
Figure 2021516959
3-((5-ニトロピリジン-2-イル)ジスルファネイル)プロパン酸
Figure 2021516959
3-((5-ニトロピリジン-2-イル)ジスルファネイル)プロパン酸を、メルカプトプロピオン酸（250μl、2.85mmol）から一般手順Aに従って調製した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/EtOAc＝1：1＋0.1％ギ酸）で精製して表題化合物を黄色油状物で得た（80mg、1.54mmol、54％）。
Figure 2021516959
2-(ビオチニルジスルファネイル)-5-ニトロピリジン
Figure 2021516959
2-(ビオチニルジスルファネイル)-5-ニトロピリジンを、ビオチンチオール（44mg、0.179mmol）から一般手順Aに従って調製した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH＝20：1〜10：1）で精製して、表題化合物を黄色固体で得た（53mg、0.134mmol、75％）。
Figure 2021516959
実施例9：リン(III)前駆体の合成のための手順
1-エトキシ-1-エチニル-N,N-ジイソプロピルホスファンアミン
Figure 2021516959
火炎乾燥した丸底シュレンクフラスコに三塩化リン（12.5mmol、1090μl）および無水エーテル（50ml）をアルゴン雰囲気で加え、ドライアイス浴中-30℃に冷却した。エタノール（12.5mmol、728μl）およびトリエチルアミン（12.5mmol、1.733ml）を加え、溶液を-30℃で10分間撹拌した後、室温まで加温し、さらに1時間撹拌した。得られた白色懸濁液をセライト上でろ過した。ろ液を火炎乾燥した丸底シュレンクフラスコに回収し、アルゴン雰囲気下で-30℃まで再度冷却した。ジイソプロピルアミン（25mmol、3.528ml）を加え、反応混合物を-30℃で10分間撹拌した後、室温まで加温し、さらに1時間撹拌した。得られた懸濁液を再度セライト上でろ過した。澄明ろ液をアルゴン雰囲気下で-78℃まで冷却し、臭化エチニルマグネシウムの溶液（THF中0.5M、13.75mmol、27.5ml）を加え、-78℃で10分間と、次いで室温でさらに1時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下でおよそ20mlまで濃縮し、飽和NaHCO3水溶液（60ml）で希釈し、EtOAc（3×120ml）で抽出した。合わせた有機層をNaSO4で乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた油性残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を、1Hおよび31P NMRにより判断して純度約80％の黄色油状物で得た（1.236g、6.14mmol、49％）。化合物をそれ以上精製せずに次の段階で用いた。
Figure 2021516959
1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-ビニルホスファンアミン
Figure 2021516959
火炎乾燥した丸底シュレンクフラスコに三塩化リン（12.5mmol、1090μl）および無水エーテル（50ml）をアルゴン雰囲気で加え、ドライアイス浴中-30℃に冷却した。エタノール（12.5mmol、728μl）およびトリエチルアミン（12.5mmol、1.733ml）を加え、溶液を-30℃で10分間撹拌した後、室温まで加温し、さらに1時間撹拌した。得られた白色懸濁液をセライト上でろ過した。ろ液を火炎乾燥した丸底シュレンクフラスコに回収し、アルゴン雰囲気下で-30℃まで再度冷却した。ジイソプロピルアミン（25mmol、3.528ml）を加え、反応混合物を-30℃で10分間撹拌した後、室温まで加温し、さらに1時間撹拌した。得られた懸濁液を再度セライト上でろ過した。澄明ろ液をアルゴン雰囲気下で-78℃まで冷却し、臭化ビニルマグネシウムの溶液（THF中1.0M、13.75mmol、13.75ml）を加え、-78℃で10分間と、次いで室温でさらに1時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下でおよそ20mlまで濃縮し、飽和NaHCO3水溶液（60ml）で希釈し、EtOAc（3×120ml）で抽出した。合わせた有機層をNaSO4で乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた油性残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を、1Hおよび31P NMRにより判断して純度＞95％の無色油状物で得た（852mg、4.19mmol、34％）。
Figure 2021516959
実施例10：アルケンホスホノチオレートの合成のための手順
一般手順B：ジスルフィド経路によるアルケンPTの合成
Figure 2021516959
0.5mmol（1.0当量）の混合ジスルフィドを火炎乾燥したシュレンク管に加え、アルゴン雰囲気下、無水THF/トルエン（2：1、5ml）の混合物中に溶解した。撹拌混合物にジエチルアルケンホスホニトの溶液（THF中約0.6M、0.6mmol、0.6ml、1.2当量）を室温で滴加し、10分間撹拌した。次いで、反応混合物をシリカゲル上に乾燥充填し、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。
O,S-ジエチルアルケン-PT（化合物1）
Figure 2021516959
O,S-ジエチルアルケン-PTを、混合ジスルフィド、2-(エチルジスルファネイル)-5-ニトロピリジン（100mg、0.462mmol）から一般手順Bに従って調製した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/EtOAc＝4：1〜1：1勾配）で精製して、表題化合物を無色油状物で得た（44mg、0.244mmol、53％）。
Figure 2021516959
S-ベンジルO-エチルアルケン-PT（化合物2）
Figure 2021516959
S-ベンジルO-エチルアルケン-PTを、混合ジスルフィド、2-(ベンジルジスルファネイル)-5-ニトロピリジン（100mg、0.359mmol）から一般手順Bに従って調製した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/EtOAc＝4：1〜1：1勾配）で精製して、前述の化合物2を黄色油状物で得た（55mg、0.227mmol、63％）。
Figure 2021516959
O-エチルS-ビオチンアルケン-PT（化合物4）
Figure 2021516959
O-エチルS-ビオチンアルケン-PTを、溶媒混合物THF/DMF=5：1中の混合ジスルフィド、2-(ビオチニルジスルファネイル)-5-ニトロピリジン（40mg、0.100mmol）から一般手順Bに従って調製した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（100％DCM〜DCM/MeOH＝9：1勾配）で精製して、前述の化合物4を黄色固体で得た（21mg、0.0576mmol、58％）。
Figure 2021516959
3-((エトキシ(アルケン)ホスホリル)チオ)プロパン酸（化合物3）
Figure 2021516959
3-((エトキシ(アルケン)ホスホリル)チオ)プロパン酸を、混合ジスルフィド、3-((5-ニトロピリジン-2-イル)ジスルファネイル)プロパン酸（146mg、0.561mmol）から一般手順Bに従って調製した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（酸なしのヘキサン/EtOAc＝4：1〜EtOAc＋0.1％ギ酸）で精製して、化合物3を無色油状物で得た（33.7mg、0.150mmol、27％）。分析上純粋な試料*をその後のHPLC精製（30分間で5〜40％MeCN）により得た。
Figure 2021516959
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3-((エトキシ(アルケン)ホスホリル)チオ)プロパノエート（化合物10）
Figure 2021516959
10mgのカルボン酸、3-((エトキシ(アルケン)ホスホリル)チオ)プロパン酸3（0.0446mmol、1.0当量）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（5.1mg、0.0446mg、1.0当量）を400μlのジオキサン/EtOAc＝1：1混合物に溶解し、0℃まで冷却した。9.2mgのジシクロヘキシルカルボジイミド（0.0446mmol、1.0当量）を撹拌溶液に加え、混合物を室温まで加温した。1時間後、懸濁液をろ過し、澄明残渣を減圧下で乾燥して、12mgの前述の生成物10を得た（0.0374mmol、84％）。
Figure 2021516959
5-((2-(3-((エトキシ(アルケン)ホスホリル)チオ)プロパンアミド)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸（化合物11）
Figure 2021516959
30mgのNHSエステル、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3-((エトキシ(アルケン)ホスホリル)チオ)プロパノエート10（0.0934mmol、1.0当量）および30mgのEDANS（0.103mmol、1.1当量）をエッペンドルフチューブ中の470μl DMFに溶解した。33μl（0.189mmol、2.0当量）のDIPEAを加え、懸濁液を室温で15分間撹拌した。揮発性物質を減圧下で蒸発させ、粗生成物を分取HPLC（40分で5〜60％MeCN、流速16ml/分）で精製して、24mgの前述の化合物11（0.0508mmol、54％）を凍結乾燥後に白色粉末で得た。
Figure 2021516959
一般手順C：PCl 3 経路によるアルケン-PTの合成
丸底フラスコに1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-ビニルホスファンアミン（例えば、0.3mmol）を加え、無水アセトニトリル（3ml）に溶解し、-40℃に冷却した。別に、テトラゾール（MeCN中0.45M、0.6mmol、1.33ml）中のチオール（0.3mmol）の溶液を調製し、撹拌混合物に-40℃で加えた。反応混合物を-40℃で10分間撹拌し、次いで室温まで加温し、さらに30分間撹拌した。この混合物に、tert-ブチルヒドロペルオキシド溶液（H2O中70重量％、0.3mmol、86μl）を室温で加え、10分間撹拌した。次いで、反応混合物をH2O（10ml）で希釈し、DCM（3×30ml）で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
tert-ブチル(2-((エトキシ(ビニル)ホスホリル)チオ)エチル)カルバメート（化合物6）
Figure 2021516959
化合物6を1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-ビニルホスファンアミン（93mg、0.465mmol）およびtert-ブチル(2-メルカプトエチル)カルバメート（82mg、0.465mmol）から出発して、一般手順Cに従って調製した。シリカゲルクロマトグラフィー（100％酢酸エチル）で精製して、所望の化合物を無色油状物で得た（30mg、0.10mmol、22％）。
実施例11：アルキンホスホノチオレートの合成のための手順
S-ベンジルO-メチルエチニル-PT（化合物7）
Figure 2021516959
撹拌子を含む火炎乾燥したシュレンク管に、アルゴン雰囲気下、無水THF（17mL）と、続いてTHF中の臭化エチニルマグネシウム（0.5M、4mL、2mmol）を加えた。次いで、この溶液を-78℃に冷却し、1-クロロ-N,N-ジイソプロピル-1-メトキシホスファンアミン（0.39mL、2mmol）を加え、10分間撹拌した後、35分間で0℃までと、次いで室温まで加温した（次いで、31P-NMRのために0.5mLの反応混合物を採取した）。次いで、反応混合物を火炎乾燥したRBFにアルゴン雰囲気下で移し、溶媒を減圧下で除去して固体を得、フラスコにアルゴンを再充填した。固体を-40℃に冷却し、MeCN中の無水テトラゾール（11mL、5mmol）を加え、無水ベンジルチオール（0.6mL、1.7mmol）を加え、終夜撹拌して、固体懸濁液を得た。この混合物にH2O中70％のtert-ブチルヒドロペルオキシド（1.6mL、12mmol）を加え、30分間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、水で希釈し、DCMで抽出し、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥した。溶媒を減圧下で除去して褐色油状物を得、これをシリカゲルカラム上にロードし、ヘキサン/酢酸エチル（1：0〜1：1）を溶離剤として、純粋な生成物を黄色油状物で得た（82mg、0.362mmol、18％）。
Figure 2021516959
一般手順D：PCl 3 経路によるアルキンホスホノチオレートの合成
丸底フラスコに1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-エチニルホスファンアミン（例えば、0.3mmol）を加え、無水アセトニトリル（3ml）に溶解し、-40℃に冷却した。別に、テトラゾール（MeCN中0.45M、0.6mmol、1.33ml）中のチオール（0.3mmol）の溶液を調製し、撹拌混合物に-40℃で加えた。反応混合物を-40℃で10分間撹拌し、次いで室温まで加温し、さらに30分間撹拌した。この混合物に、tert-ブチルヒドロペルオキシド溶液（H2O中70重量％、0.3mmol、86μl）を室温で加え、10分間撹拌した。次いで、反応混合物をH2O（10ml）で希釈し、DCM（3×30ml）で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
S-ベンジルO-エチルエチニルホスホノチオエート（化合物8）
Figure 2021516959
化合物8を、1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-エチニルホスファンアミン（25mg、0.123mmol）およびメルカプトベンジル（14.4μl、0.123mmol）から出発して、一般手順Cに従って調製した。シリカゲルクロマトグラフィー（100％酢酸エチル）で精製して、所望の化合物を無色油状物で得た（10mg、0.042mmol、34％）。
Figure 2021516959
tert-ブチル(2-((エトキシ(エチニル)ホスホリル)チオ)エチル)カルバメート（化合物9）
Figure 2021516959
化合物9を、1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-エチニルホスファンアミン（93mg、0.465mmol）およびtert-ブチル(2-メルカプトエチル)カルバメート（82mg、0.465mmol）から出発して、一般手順Dに従って調製した。シリカゲルクロマトグラフィー（100％酢酸エチル）で精製して、所望の化合物を無色油状物で得た（50mg、0.17mmol、37％）。
実施例12：アルケンホスホネートの合成のための手順
一般手順E：PCl 3 経路によるアルケンホスホネートの合成
丸底フラスコに1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-ビニルホスファンアミン（例えば、0.3mmol）を加え、無水アセトニトリル（3ml）に溶解し、-40℃に冷却した。別に、テトラゾール（MeCN中0.45M、0.6mmol、1.33ml）中のアルコール（0.3mmol）の溶液を調製し、撹拌混合物に-40℃で加えた。反応混合物を-40℃で10分間撹拌し、次いで室温まで加温し、さらに30分間撹拌した。この混合物に、tert-ブチルヒドロペルオキシド溶液（H2O中70重量％、0.3mmol、86μl）を室温で加え、10分間撹拌した。次いで、反応混合物をH2O（10ml）で希釈し、DCM（3×30ml）で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
ベンジルエチルビニルホスホネート
Figure 2021516959
ベンジルエチルビニルホスホネートを、1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-ビニルホスファンアミン（25mg、0.123mmol）およびベンジルアルコール（12.3μl、0.123mmol）から出発して、一般手順Eに従って調製した。シリカゲルクロマトグラフィー（100％酢酸エチル）で精製して、所望の化合物を無色油状物で得た（2mg、0.0088mmol、7％）。（低収率は精製中の処理段階からの生成物の損失によって説明し得る。）
tert-ブチル(2-((エトキシ(ビニル)ホスホリル)オキシ)エチル)カルバメート
Figure 2021516959
表題化合物を、1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-ビニルホスファンアミン（201mg、1.00mmol）およびtert-ブチル(2-ヒドロキシエチル)カルバメート（161mg、1.00mmol）から出発して、一般手順Eに従って調製した。シリカゲルクロマトグラフィー（100％酢酸エチル）で精製して、所望の化合物を無色油状物で得た（100mg、0.358mmol、36％）。
Figure 2021516959
実施例13：アルキンホスホネートの合成のための手順
一般手順F：PCl 3 経路によるアルキンホスホネートの合成
丸底フラスコに1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-エチニルホスファンアミン（例えば、0.3mmol）を加え、無水アセトニトリル（3ml）に溶解し、-40℃に冷却した。別に、テトラゾール（MeCN中0.45M、0.6mmol、1.33ml）中のアルコール（0.3mmol）の溶液を調製し、撹拌混合物に-40℃で加えた。反応混合物を-40℃で10分間撹拌し、次いで室温まで加温し、さらに30分間撹拌した。この混合物に、tert-ブチルヒドロペルオキシド溶液（H2O中70重量％、0.3mmol、86μl）を室温で加え、10分間撹拌した。次いで、反応混合物をH2O（10ml）で希釈し、DCM（3×30ml）で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
ベンジルエチルエチニルホスホネート
Figure 2021516959
ベンジルエチルエチニルホスホネートを、1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-エチニルホスファンアミン（25mg、0.123mmol）およびベンジルアルコール（12.3μl、0.123mmol）から出発して、一般手順Fに従って調製した。シリカゲルクロマトグラフィー（100％酢酸エチル）で精製して、所望の化合物を無色油状物で得た（27mg、0.120mmol、49％）。
tert-ブチル(2-((エトキシ(エチニル)ホスホリル)オキシ)エチル)カルバメート
Figure 2021516959
表題化合物を、1-エトキシ-N,N-ジイソプロピル-1-エチニルホスファンアミン（201mg、1.00mmol）およびtert-ブチル(2-ヒドロキシエチル)カルバメート（161mg、1.00mmol）から出発して、一般手順Fに従って調製した。シリカゲルクロマトグラフィー（100％酢酸エチル）で精製して、所望の化合物を無色油状物で得た（168mg、0.601mmol、60％）。
Figure 2021516959
実施例14：アルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートならびにアルケンホスホネートおよびアルキンホスホネートへのカルボン酸のカップリングのための手順
一般手順G：アミド結合形成による官能基を付与されたホスホノチオレートおよびホスホネートの調製
Figure 2021516959
アルケンホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレート（X＝S）またはアルケンホスホネートおよびアルキンホスホネート（X＝O）のBoc保護アミン誘導体（前記スキーム参照）（例えば、0.2mmol）をTFA/H2Oの混合物（95：5、xxml）に溶解し、得られた澄明溶液を室温で15分間撹拌した。次いで、溶液に窒素を通気させることにより溶媒を除去した。残渣をH2Oに再度溶解し、凍結乾燥に供して、無色油状物を得た。生成物をそれ以上精製せずに次の段階で用いた。脱保護したアミン（例えば、0.05mmol）に、DMF（250μl）中のHATU（0.055mmol）、カルボン酸（0.055mmol）およびDIPEA（0.15mmol）を加えた。得られた混合物を、エッペンドルフチューブ中、室温で30分間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。残渣をH2O/MeCN（9：1、5ml）に再度溶解し、分取HPLCで精製した。
5-((2-(4-((2-((エトキシ(エチニル)ホスホリル)オキシ)エチル)アミノ)-4-オキソブタンアミド)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸（化合物20）
Figure 2021516959
化合物20を、脱保護アミン（14mg、0.079mmol）から一般手順Gに従って生成した。HPLC（）による精製および凍結乾燥後に純粋な生成物を無色粉末で得た（18mg、0.0342mmol、43％）。
Figure 2021516959
図8は、精製した化合物20のUV-LCの記録を示す。
5-((2-(4-((2-((エトキシ(ビニル)ホスホリル)オキシ)エチル)アミノ)-4-オキソブタンアミド)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸（化合物21）
Figure 2021516959
化合物21を、脱保護アミン（12.9mg、0.072mmol）から一般手順Gに従って生成した。HPLC（）による精製および凍結乾燥後に純粋な生成物を無色粉末で得た（10mg、0.0190mmol、26％）。
Figure 2021516959
図9は、精製した化合物21のUV-LCの記録を示す。
5-((2-(4-((2-((エトキシ(エチニル)ホスホリル)チオ)エチル)アミノ)-4-オキソブタンアミド)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸（化合物22）
Figure 2021516959
化合物22を、脱保護アミン（11.2mg、0.058mmol）から一般手順Gに従って生成した。HPLC（）による精製および凍結乾燥後に純粋な生成物を無色粉末で得た（10mg、0.0185mmol、32％）。
Figure 2021516959
図10は、精製した化合物22のUV-LCの記録を示す。
5-((2-(4-((2-((エトキシ(ビニル)ホスホリル)チオ)エチル)アミノ)-4-オキソブタンアミド)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸（化合物23）
Figure 2021516959
化合物23を、脱保護アミン（9.6mg、0.049mmol）から一般手順Gに従って生成した。HPLC（）による精製および凍結乾燥後に純粋な生成物を無色粉末で得た（11mg、0.0202mmol、41％）。
Figure 2021516959
図11は、精製した化合物23のUV-LCの記録を示す。
O-エチルS-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾル-4-イル)ペンタンアミド)エチル)ビニルホスホノチオエート（化合物13）
Figure 2021516959
化合物13を、脱保護アミン（14.8mg、0.076mmol）から一般手順Gに従って生成した。HPLC（）による精製および凍結乾燥後に純粋な生成物を無色粉末で得た（14mg、0.033mmol、44％）。
O-エチルS-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾル-4-イル)ペンタンアミド)エチル)エチニルホスホノチオエート（化合物28）
Figure 2021516959
表題化合物を、脱保護アミン（20mg、0.104mmol）から一般手順Gに従って生成した。HPLC（）による精製および凍結乾燥後に純粋な生成物を無色粉末で得た（7mg、0.0167mmol、16％）。
実施例15A：グルタチオンによるアルケンホスホノチオレートのヒドロチオール化のための手順
(エチル-S-ベンジル-P-エチル-ホスホノチオレート)-S-グルタチオンコンジュゲート（化合物14）
Figure 2021516959
還元グルタチオン（20.3mg、0.066mmol、2.0当量）を1.32mlの水性緩衝液（1mM EDTA、50mM NH4HCO3、pH8.0）に溶解し、0.33mlのDMF中のS-ベンジルO-エチルアルケン-PT 2（8mg、0.033mmol、1.0当量）の溶液に加え、混合物を室温で90分間撹拌した。反応をUPLC-MS（勾配：5分間で3〜60％MeCN）でモニターし、90分後に完全変換を示した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣を5mlのH2Oに再度溶解し、半分取HPLC（酸性条件、勾配：40分間で20〜60％MeCN、生成物は35％MeCNで溶出、流速16ml/分）で精製した。凍結乾燥後に前述の化合物14を白色粉末で得た（14mg、0.026mmol、77％）。
Figure 2021516959
実施例15B：グルタチオンによるアルケンホスホネートのヒドロチオール化のための手順
(ジエチルホスホネート)-S-グルタチオンコンジュゲート
Figure 2021516959
ジエチルアルケンホスホネート（20mg、0.147mmol、1.0当量）を1mlの緩衝液（50mM NH4HCO3、1mM EDTA、pH8.0）および1mlのDMFに溶解した。これに、9mlの同じ緩衝液（GSH溶解後にpHをpH8.0に調節）中のグルタチオン（90.3mg、0.294mmol、2.0当量）の溶液を加え、混合物を室温で撹拌した。完全な変換（31P-NMRで判断）が達成された時点で、反応混合物を液体窒素中で凍結し、続いて凍結乾燥した。残渣を半分取HPLCで精製して、表題化合物を無色粉末で得た（41.6mg、0.0882mmol、60％）。
Figure 2021516959
実施例16：グルタチオンによるアルキンホスホノチオレートのヒドロチオール化のための手順
(メチル-S-ベンジル-P-エチル-ホスホノチレート)-S-グルタチオンコンジュゲート（化合物15）
Figure 2021516959
水性緩衝液（1mM EDTA、50mM NH4HCO3、pH＝8.5）中のグルタチオン（0.15mmol、23mg）の混合物に、DMF中の化合物7（0.75mL、100mM）を加え、混合物を4分間ボルテックスした。次いで、混合物を凍結乾燥し、残りの残渣をMeCN/H2Oに溶解し、HPLC（50分間で5〜45％MeCN）で精製した。生成物含有分画を凍結乾燥して、表題化合物15を無色粉末で得た（16.4mg、約33％）。
Figure 2021516959
実施例17：安定性試験のためのダブシル-EDANSクエンチャー対の合成のための手順
ダブシル-EDANSクエンチャー対の合成のための一般手順H
Figure 2021516959
ダブシル含有ペプチドを、Rinkアミド樹脂から標準の固相ペプチド合成条件（Fmoc戦略）下で合成した。ダブシル（カルボン酸として）を樹脂上の遊離N末端に、カップリング試薬としてのHATUを用いてカップリングした。このペプチドを樹脂から、TFA/TIS/H2O/DTT＝95/2/2/1混合物を用いて切断した。ペプチドを半分取HPLCで精製した。
精製したダブシルペプチド（例えば、2.35μmol）を水性緩衝液（50mM NH4HCO3、1mM EDTA、pH8.5）に溶解し、エッペンドルフチューブ中でDMF（280μl）に溶解したEDANS化合物20〜23（2.82μmol）と混合した。反応混合物を室温で撹拌し、反応をUV-LC-MSでモニターした。次いで、反応混合物を水（4.7ml）で希釈し、それ以前に半分取HPLC（45分間で10〜50％MeCN、0.1％TFA、流速：16ml/分）で精製し、純粋な生成物含有分画を合わせて凍結乾燥した。
EDANS-ダブシルFRET対（アルキンホスホネート誘導体）（化合物24）
Figure 2021516959
化合物24を、Edans化合物20（1.48mg、2.82μmol）およびダブシルペプチド（2.5mg、2.35μmol）から一般手順Hに従って生成した。半分取HPLC（10〜50％MeCN、0.1％TFA、16ml/分）による精製および凍結乾燥後に生成物を赤色粉末で得た（3mg、2.01μmol、86％）。
図12は、精製した化合物24のUV LCの記録を示す。
EDANS-ダブシルFRET対（アルケンホスホネート誘導体）（化合物25）
Figure 2021516959
化合物25を、Edans化合物21（1.49mg、2.82μmol）およびダブシルペプチド（2.5mg、2.35μmol）から一般手順Hに従って生成した。半分取HPLC（10〜50％MeCN、0.1％TFA、16ml/分）による精製および凍結乾燥後に生成物を赤色粉末で得た（3mg、2.01μmol、86％）。
図13は、精製した化合物25のUV LCの記録を示す。
EDANS-ダブシルFRET対（アルキンホスホノチオレート誘導体）（化合物26）
Figure 2021516959
化合物26を、Edans化合物22（1.53mg、2.82μmol）およびダブシルペプチド（2.5mg、2.35μmol）から一般手順Hに従って生成した。半分取HPLC（10〜50％MeCN、0.1％TFA、16ml/分）による精製および凍結乾燥後に生成物を赤色粉末で得た（3mg、1.87μmol、80％）。
図14は、精製した化合物26のUV LCの記録を示す。
EDANS-ダブシルFRET対（アルケンホスホノチオレート誘導体）（化合物27）
Figure 2021516959
化合物27を、Edans化合物23（1.53mg、2.82μmol）およびダブシルペプチド（2.5mg、2.35μmol）から一般手順Hに従って生成した。半分取HPLC（10〜50％MeCN、0.1％TFA、16ml/分）による精製および凍結乾燥後に生成物を赤色粉末で得た（3mg、1.87μmol、80％）。
図15は、精製した化合物27のUV LCの記録を示す。
実施例18：実施例6の安定性試験のための手順
EDANS-ダブシルコンジュゲート24〜27の0.20mM保存溶液をそれぞれ調製した（PBS pH7.4）。この保存溶液から5μlを、96穴プレート（Corning、N°3615）中、室温（約25℃）で、それぞれの試験用マトリックス（PBS pH7.4、HeLa細胞から新しく調製した溶解物（1mg/ml）、ヒト血清）95μlと混合した。NaOH中での実験のために、化合物（PBS中200μM保存溶液150μL）を、エッペンドルフチューブ中、室温（約25℃）で、1M naOH溶液150μLと混合した。所与の時点で、この溶液3μlを、96穴プレート中、中和のために1M HCl溶液5.6μlおよびPBS 91μlと混合した。蛍光を、Safire/Tecan機器（EDANS：λex＝360nm、λem＝508nm）を用い、3日間にわたってモニターした（NaOHを除く全ての条件について）。蛍光強度を、背景測定（マトリックスのみ）により補正し、3つの独立した実験の平均値および標準偏差を計算した（n＝3）。
実施例19：実施例5の反応速度試験のための手順
Figure 2021516959
DMF中の対応するリン化合物20〜23の20mM溶液2.5μlおよび内部標準としてのDMF/緩衝液（1：1）中のコンジュゲートされていないEDANSの1mM溶液5μlを、コンジュゲーション緩衝液（超純水中50mM NH4HCO3および1mM EDTA、アンモニア水溶液でpH8.5に調節）488μlに加えた。緩衝液中の10mMグルタチオン溶液5μlを加えて、反応を開始させた。反応を室温（約25℃）で実施した。第一の試料（t＝0）を、グルタチオン添加前に採取した。次に続く試料を15、30、60、120、240、および480分後に採取した。試料を20μlの量で採取し、pH3.5の50mM NaOAc緩衝液80μl中にただちに希釈して、反応を停止させた。これらの試料を、各20μlを注入する、蛍光検出器によるHPLC分析に供した。（この試験の結果を図3に示す。）
実施例20A：ホスホノチオレートへのBSAコンジュゲーションのための手順
緩衝液（PBS、1mM EDTA、pH7.4または50mM NH4HCO3、100mM NaCl、1mM EDTA、pH8.5）中のウシ血清アルブミン（BSA）の10μM溶液（100μl）を、100mM（100当量に対応）の1μlまたは化合物2もしくは7の溶液（DMF中50mM）1μlと4℃で混合した。反応混合物を4℃で18時間撹拌した。次いで、過剰の化合物化合物をスピンろ過（7kDa MWCO）で除去し、それにより緩衝液をPBS pH7.4に交換した。PBS中のこのタンパク質溶液（10μM）3μlをメルカプトエタノール含有Laemmli緩衝液27μlと混合し、95℃で10分間加熱し、SDS-ゲル上で泳動させた（12％アクリルアミド、250V、40分間）。次いで、タンパク質をキモトリプシンによるゲル内消化に供し、MS/MSで分析した。（MS/MS分析の結果を表6にまとめている。）
実施例20B：ホスホネートへのBSAコンジュゲーションのための手順
緩衝液（50mM NH4HCO3、100mM NaCl、1mM EDTA、pH8.5）中のウシ血清アルブミン（BSA）の10μM溶液（100μl）を、DMF中のジエチルアルケンホスホネートの100mM溶液1μlと4℃で混合した。反応混合物を4℃で18時間撹拌した。次いで、過剰のホスホネート化合物をスピンろ過（7kDa MWCO）で除去し、それにより緩衝液をPBS pH7.4に交換した。続いて、PBS中のこのタンパク質溶液（10μM）3μlをメルカプトエタノール含有Laemmli緩衝液27μlと混合し、95℃で10分間加熱し、SDS-ゲル上で泳動させた（12％アクリルアミド、250V、40分間）。次いで、タンパク質をキモトリプシンによるゲル内消化に供し、MS/MSで分析した。（MS/MS分析の結果を表1にまとめている。）
実施例20：ホスホノチオレートへの抗体コンジュゲーションのための手順
セツキシマブ抗体の100μM溶液（PBS中）1.25μlを、ホウ酸塩含有PBS（50mMホウ酸塩、pH8.0）10μlおよびDTT溶液（同じホウ塩緩衝液中100mM DTT、pH8.0）1.25μlと混合した。対照試料を、DTT添加なしで同様に調製した。これらの混合物をサーモシェーカー上、37℃で30分間インキュベートした。次いで、過剰のDTTをサイズ排除カラム（Thermo Scientific、Zeba(商標) Micro Spin Desalting Columns、7K MWCO、Product N°89877）を用いて除去した。サイズ排除カラムをまずアルキル化緩衝液（50mM NH4HCO3、1mM EDTA、pH＝8.5/8.0またはPBS、1mM EDTA、pH7.4）で平衡化した（3×50μlを1000gで1分間）。次いで、抗体-DTT混合物（12.5μl）を平衡化したカラムに加え、抗体を遠心分離（2分、1000g）により新しいエッペンドルフチューブ中に回収した。この溶液に、ビオチン-PT（アルケンホスホノチオレートまたはアルキンホスホノチオレート）（DMSO中25mM）の溶液0.25μlをただちに加え、混合物をサーモシェーカー上、4℃で終夜インキュベートした。
この混合物3μlをメルカプトエタノール含有Laemmli緩衝液27μlと混合し、95℃で10分間加熱した。そのうちの10μlを12％アクリルアミドSDS-ゲル上にロードし、250Vで35分間泳動させた。次いで、ビオチン修飾抗体へのハイブリダイゼーションおよび化学発光によるビオチンの間接的検出のために、市販のストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを用いて、ゲルをウェスタンブロットに供した。
実施例21：アルキンホスホノチオレートによるeGFPの修飾
原理実験の証明として、本発明者らは、溶媒に露出する1つのシステインを有するeGFPバリアントを用い、それを低分子蛍光アルキンホスホノチオレートNA1（前記実施例14の化合物22に対応）と生理的pHで反応させた（図16A）。反応をESI-MSで追跡し、14時間後にチェックすると、いかなる検出可能な副生成物も生成せずに、完全な変換が観察された（図16B）。この結果は、アルキンホスホノチオレートが生理的pHで、緩和な条件下でのタンパク質の修飾に適していることを示す。
図16は、アルキンホスホノチオレート-Edans誘導体NA1によるeGFPの修飾を示す。A）合成スキーム、B）所望の生成物へのGFPの完全変換が、ESI-MSにより観察された。ここで示すスペクトルは、いかなる精製もせずに、反応混合物から直接取っている。PT＝ホスホノチオレートNA1。
実施例22：アルキンホスホノチオレートとの抗体薬物コンジュゲート（ADC）の合成
本発明者らは、非常に効率的な抗有糸分裂性のチューブリン結合細胞毒であるモノメチルオーリスタチンE（MMAE）およびCD30に対する抗体ブレンツキシマブからのホスホノチオレート連結抗体薬物コンジュゲート（ADC）の合成も開発した。毒性ペイロードの遊離を促進するために、カテプシンB切断部位（バリン-シトルリンリンカーVC）を有するADCを抗体と毒素との間で調製して、市販のADCであるアドセトリス(登録商標)（ブレンツキシマブベドチン）（M. A. Stephen, Blood 2014, 124, 3197-3200）の直接類縁体を生成した。ホスホノチオレート-VC-PAB-MMAE作成物NA3を、スキーム12に示すとおり、アルキンホスホノチオレートカルボン酸NA2およびVC-PAB-MMAEから、アミドカップリングにより合成した。
Figure 2021516959
スキーム12：ホスホノチオレート連結、カテプシンB切断可能なモノメチルオーリスタチンEコンジュゲートNA3の作製のための合成経路。VC：バリン-シトルリンジペプチド、PAB：p-アミノベンジル。
次に、抗体薬物コンジュゲートを、NA3をブレンツキシマブにコンジュゲートさせることにより合成した。本発明者らは、まず、ホスホノチオレート連結ADCを含むADCの活性を、FDA承認ADCであるアドセトリス(登録商標)と比較し得るように、薬物：抗体の比（DAR）が3〜4のADCを生成するための反応条件を見出すスクリーニングを実施した。アドセトリスの場合、VC-PAB-MMAEはマレイミドを介してブレンツキシマブのシステインにDAR＝4でコンジュゲートする（M. A. Stephen, Blood 2014, 124, 3197-3200）。本発明者らは、まず、遊離スルフヒドリル基を生成するために、ブレンツキシマブの鎖間ジスルフィドをDTTにより還元し、次いで遊離スルフヒドリル基はアルキンホスホノチオレートNA3と反応することができる（図17A参照）。過剰のDTTをZeba(商標) Spin脱塩カラムにより除去した。スクリーニングのために、本発明者らは、ブレンツキシマブ抗体の濃度（1対5mg/ml）、コンジュゲーション中のpH（pH8.5対7.4）およびホスホノチオレート-薬物化合物NA3の当量数（8.8〜100当量）を変動させ、酵素PNGアーゼ-Fによる脱グリコシルおよび還元後に得られたADCをESI-MSで分析した。修飾度が異なる重鎖および軽鎖種の質量分析シグナル強度により、DARを推定した。このスクリーニングの結果を図17Bに示す。抗体濃度が高く、ホスホノチオレートの当量数が多いほど、DARは高かった。アルキンホスホノチオレートとのコンジュゲーションも、生理的pH7.4で効率的にはたらいた。これは、例えば、安定性の理由により、生理的pHでの取り扱いを必要とするタンパク質または抗体のコンジュゲーションのために、アルキンホスホノチオレートの利点であり得る。
図17は、NA3（ホスホノチオレート-VC-PAB-MMAE）とのブレンツキシマブ修飾を示す。A）反応スキーム鎖間ジスルフィドの還元およびアルキル化。B）反応条件のスクリーニング。C）PNGアーゼ-Fによるグリコシル化およびDTTによる還元後の抗体断片の典型的MSスペクトル。デコンボリューションしたスペクトルが示され、挿入図は生データを示す。LC：軽鎖；HC：重鎖；mod：ホスホノチオレート-VC-PAB-MMAE NA3。
本発明者らは、DAR＝3.15を有するADCをサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によりさらに特徴決定した（図21参照）。次いで、このADCを、CD30-過剰発現細胞株Karpas 299を用いる標準のレサズリンアッセイ法で評価した（図18A参照）。ブレンツキシマブ-NA3 ADCは強い成長阻害を示し（青色の曲線）、わずかに低いDAR（アドセトリス(登録商標)の場合、3.15対4.0）で、臨床で用いるADC アドセトリス(登録商標)（赤色の曲線）と同等に強力である。ブレンツキシマブ単独（緑色の曲線）では、成長阻害は示さない。CD30選択性を証明するための対照として、非CD30過剰発現細胞株HL 60を用いた（図18B）。この場合、全ての作成物について細胞増殖の阻害は観察されなかった。まとめると、これらの結果は、アルキンホスホノチオレートは抗原陽性細胞株を選択的に死滅させる活性ADCを生成するのに適したリンカーであることを示している。
図18は、A）MMAE連結ブレンツキシマブADCのCD30-過剰発現細胞株Karpas 299に対する選択的な成長阻害増大を示す。プロットは、抗体濃度に依存しての、処理96時間後の細胞生存率を示す。ブレンツキシマブ単独（緑）、ブレンツキシマブ-NA3(青）およびアドセトリス(登録商標)（赤）。Karpas 299：CD30-過剰発現細胞株。B）対照。ブレンツキシマブ単独（緑）、ブレンツキシマブ-NA3(青）およびアドセトリス(登録商標)（赤）。HL 60：CD30発現レベルが低い細胞株。
ホスホノチオレート-チオールコンジュゲートは、特に過剰の遊離チオール存在下で、マレイミド-チオールコンジュゲートに比べてより安定である。特にチオール交換による毒素の早期遊離が非特異的毒性の増大を引き起こし得るADCについて、これは本明細書に記載の方法および化合物の重要な利点である。
別の利点として、抗体の修飾において、本発明者らは、生理的pHで同じ当量数を用いて、マレイミドに比べてホスホノチオレートでより良いシステイン選択性を観察し、前記の本明細書の実施例7Bも参照されたい。
実施例23：樹脂上でのペプチドへのホスホノチオレートの導入
本発明者らは、本明細書に記載のホスホノチオレートが酸性条件下で非常に安定であることを観察した。したがって、樹脂上での固相ペプチド合成（SPPS）により、ホスホノチオレートをペプチド中に組み込んだ。これは、SPPS中に求電子剤を単純な様式でペプチド中に導入し、続いて酸性条件下で樹脂から切断することを可能にする。
モデルペプチドをカルボン酸NA2に、遊離N末端を介してカップリングした。95％TFAによる2時間の切断後、生成物を半分取HPLCで単離することができた。したがって、この方法は、SPPS中の樹脂上での求電子剤の組み込みを可能にする。利点として、ホスホノチオレートは、樹脂からの切断中の強酸性条件下で加水分解しなかった。したがって、ホスホノチオレートは酸性条件下（例えば、樹脂からの切断中の＞90％トリフルオロ酢酸（TFA））で非常に安定である。
アルキンホスホノチオレート-ペプチドをUV-LC-MSおよび31P-NMRにより分析した。特に、スキーム13に示すとおり、ペプチドはその直鎖形態で存在し、システイン残基を介しての分子内チオール付加によって環化することはなかった。
Figure 2021516959
スキーム13：アルキンホスホノチオレートを用いた固相ペプチド合成
実施例24：アルキンホスホノチオレートNA1によるeGFPの修飾のための手順
この実験のために、eGFP変異体を用いた（eGFP C70MS174C）。タンパク質をプロテアーゼ切断部位を有するHisタグバリアントとして発現させた。切断後、完全配列は、
Figure 2021516959
である。
図19は、eGFP C70MS174CのESI-MSスペクトルを示し、これをNA1とのコンジュゲーションのための出発物質として用いた。
NA1によるeGFPの修飾のための手順：
低結合エッペンドルフチューブ中、PBS pH7.4中のeGFPの溶液（50μl、1mg/ml）に、アルキンホスホノチオレートNA1（DMSO中の25mM保存溶液0.72μl、10当量）を加え、混合物をサーモシェーカー上、14℃および800rpmで14時間維持した。ESI-MSで判断して完全な変換が達成された。
実施例25：アルキンホスホノチオレートとの抗体薬物コンジュゲート（ADC）生成のための手順
4-((2-((エトキシ(エチニル)ホスホリル)チオ)エチル)アミノ)-4-オキソブタン酸（化合物NA2）の合成
Figure 2021516959
*最初の出願からの化合物番号
化合物NA2を、Boc保護前駆体（前記実施例11に記載の化合物番号9）から2段階で生成した。9（94mg、0.321mmol）を丸底フラスコ中、TFA/H2O 95：5（3ml）に溶解し、室温で5分間撹拌した。次いで、反応混合物をH2O（10ml）で希釈し、凍結乾燥した。乾燥粗生成物をDMF（1ml）に溶解し、DMF（1ml）中のコハク酸（38mg、0.321mmol）、HATU（122mg、0.321）およびDIPEA（167ml、0.962mmol）の混合物に加えた。得られた混合物を室温で30分間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣を0.1％TFAを含むMeCN/H2O 1：4の混合物に溶解し、半分取HPLC（60分間で20〜60％MeCN、流速＝10ml/分）で精製した。生成物含有分画の凍結乾燥により、化合物NA2を、1H-NMRに基づく純度約90％の凍結乾燥粉末で得た（34mg、0.116mmol、36％）。化合物をそれ以上精製せずにその後の反応に用いた。
Figure 2021516959
アルキンホスホノチオレート-Val-Cit-Pab-MMAE（化合物NA3）の合成
Figure 2021516959
化合物NA2（1.88mg、6.41mmol）、HATU（2.44mg、6.41mmol）およびDIPEA（4.7ml、26.7mmol）をDMF（100ml）に溶解し、エッペンドルフチューブ中、DMF（150ml）中のH2N-Val-Cit-Pab-MMAE（6mg、5.34mmol）の溶液に加えた。30分後、反応混合物をH2O（4.5ml）で希釈し、ろ過し、半分取HPLC（50分間で30〜99％MeCN、流速＝5ml/分）で精製した。凍結乾燥後、前述の生成物NA3を白色粉末で得た（3mg、2.14mmol、40％）。
Figure 2021516959
図20は、ホスホノチオレート-Val-Cit-Pab-MMAE NA3のUPLC-UV純度を示す。
ブレンツキシマブ生成
ブレンツキシマブの発現および精製を、以前に出版されたとおりに実施し（A. Stengl, D. Horl, H. Leonhardt, J. Helma, SLAS Discov 2017, 22, 309-315.）、GEのSuperdex 200 Increase 10/300（GE life sciences、USA）上でのPBS、流速0.75ml/分でのゲルろ過による最終精製を追加した。
還元/アルキル化プロトコールによるブレンツキシマブの修飾のための手順
Figure 2021516959
PBS（pH＝8.0）中に50mMホウ酸ナトリウムおよび34mM DTTを含む緩衝液中のブレンツキシマブ（c＝5mg/ml、33.4mM）、全量300μlを、低結合エッペンドルフチューブ中、37℃で30分間インキュベートすることにより、ブレンツキシマブ修飾を実施した。その後、過剰のDTT除去および1mM EDTA含有PBS（pH7.4）への緩衝液交換を、7K MWCOの2mL Zeba(商標) Spin Desalting Columns（Thermo Fisher Scientific, Waltham, United States）を用いて行った。次に、DMSO中に36mMホスホノチオレートNA3を含む溶液2.45μlを速やかに加え、混合物を800rpm、14℃で16時間振盪した。過剰のホスホノチオレートをサイズ排除クロマトグラフィー（Akta FPLC、Superose 6 Increase 10/300 GLカラム、PBS、0.8ml/分）により除去した。生成物含有分画を集め、滅菌ろ過した。ADCの分析のために、1mg/ml溶液12μlをRapiGest 1μlと共にサーモシェーカー上、60℃で30分間インキュベートした。次いで、1μlのPNGアーゼFを加え、37℃でさらに2時間インキュベートした。最後に、PBS（pH7.4）中DTTの10mM溶液1μlを加え、混合物を37℃で30分間振盪した。この混合物のうち、10μlを30μlのH2Oで希釈し、ESI-MSに供した（結果は図2C参照）。
ADCのSEC
分析的サイズ排除クロマトグラフィー（A-SEC）を、DAD検出器、Split Sampler FT（4℃）、Column Compartment H（25℃）およびバイナリポンプFを備えたVanquish Flex UHPLC System（Thermo Fisher Scientific、USA）で、MAbPac SEC-1 300Å、4×300mmカラム（Thermo Fisher Scientific、USA）を流速0.15mL/分で用いて行った。異なるADC/mAb集団の分離は、リン酸緩衝液、pH7（移動相として20mM Na2HPO4/NaH2PO4、300mM NaCl、5％v/vイソプロピルアルコールを用いた30分間の均一濃度勾配中に達成されている。8μgのADC/mAbをA-SEC分析のためにカラム上にロードした。UVクロマトグラムを220および280nmで記録した。モノマーおよびHMWSの定量を、220nmのピーク面積の積分後に達成した。
図21は、ブレンツキシマブ-NA3 ADCのサイズ排除クロマトグラムを示す。
細胞による抗増殖アッセイ法
HL60およびKarpas細胞株を、10％FCSおよび0.5％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したRPMI-1640中で培養した。SKBR3およびMDAMB468細胞株を、10％FCSおよび0.5％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したDMEM/F12中で培養した。細胞を、96穴細胞培養マイクロプレート中、細胞5*10^3個/ウェル（SKBR3、HL60およびKarpas）または細胞1*10^3個/ウェル（MDAMB468）の密度で播種した。ADCまたは抗体の1：4連続希釈を、細胞培養培地中、3μg/mL最終濃度で開始して実施し、マイクロプレートの各ウェルに二つ組で移した。プレートを37℃、5％CO2で96時間インキュベートした。続いて、レサズリンを最終濃度50μMまで加えた後、37℃、5％CO2で3〜4時間インキュベートした。レゾルフィンへのレサズリンの代謝変換を、Tecan Infinite M1000マイクロプレートリーダーでレゾルフィンの蛍光シグナル（λEX＝560nmおよびλEM＝590nm）により定量する。二つ組から平均および標準偏差を計算し、未処理対照に対して標準化し、抗体濃度に対してプロットした。データ分析をMatLab R2016ソフトウェアで行った。
実施例26：樹脂上のペプチドへのホスホノチオレートの導入のための手順
Figure 2021516959
配列AYRCAKを有するペプチドを、TentaGel S Rinkアミド樹脂上、0.22g/molのローディングを用いて手動で合成した。カップリングを、DMF中5当量のアミノ酸、5当量のHCTU、5当量のOxymaおよび10当量のDIPEA（濃度：5当量のアミノ酸に基づき0.1M）で1時間実施した。各カップリングの後、残存遊離アミノ基をAc2Oでキャッピングした。Fmoc脱保護をDMF中20％ピペリジンで実施した。
遊離N末端を有する10μM AYRCAKペプチドに対応する量の樹脂を、ホスホノチオレート構築ブロックによるさらなる修飾のために用いた。したがって、ペプチドをペプチド反応器内でDMF（1ml）に2時間膨潤させた後、化合物NA2（DMF中250mM保存溶液120μl、30μmol、3当量）、HATU（11.4mg、30μmol、3当量）およびDIPEA（10.4μl、60μmol、6当量）の混合物を加えた。この混合物を室温で1時間振盪した。樹脂からの切断を、TFA/H2O/TIS（95：2.5：2.5；v：v：v、2ml）を用いて2時間実施した。冷無水エーテル中で沈澱を実施した。粗生成物を分取逆相C18 HPLC（H2O中10〜60％MeCN＋0.1％TFA、流速：10ml/分）で精製した。凍結乾燥後、生成物NA4を白色粉末で得（2.44mg、2.48μmol、25％）、31P-NMR、分析用UPLC（RP-C18カラム上、15分間で0.1％TFAを含むH2O中5〜95％MeCN）およびESI-MSで分析した。
Figure 2021516959
図22は、ホスホノチオレートペプチドNA4のUPLC-UV純度を示す。
結論
本発明者らは本明細書において、不飽和ホスホノチオレートおよびホスホネート（アルケンホスホノチオレートおよびアルキンホスホノチオレートならびにアルケンホスホネートおよびアルキンホスホネート）がシステイン選択的バイオコンジュゲーション反応の適切なハンドルであることを示した。チオール付加は水性条件下で迅速であり、生成したコンジュゲートは生理的に関連する条件下で安定である。本発明者らは、この方法が、例えば、タンパク質（例えば、BSA）および抗体（例えば、セツキシマブ、ブレンツキシマブ）のシステイン選択的修飾を可能にすることを示した。本明細書において提供する結果は、反応がチオールに対してより選択的で、生成したコンジュゲートがより良好な安定性を示すため、ホスホノチオレートまたはホスホネートを用いる本発明の方法は、現行のシステインバイオコンジュゲーション戦略、例えば、マレイミド化学よりもすぐれていることを示すものである。
本明細書において用いられる単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかにそうではないと示さないかぎり、複数の言及を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「試薬」への言及は、1つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「方法」への言及は、本明細書に記載の方法を修飾または代用し得る、当業者には公知の等価の段階または方法への言及を含む。
本開示において引用するすべての出版物および特許は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。参照により組み入れられた材料が本明細書と矛盾する、または一致しない範囲内で、本明細書は任意のそのような材料に取って代わることになる。
特に記載がないかぎり、一連の構成要素に先行する「少なくとも」なる用語は、その中のあらゆる構成要素を指すことが理解されるべきである。当業者であれば、日常的な実験だけを用いて、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの等価物を理解する、または確認し得るであろう。そのような等価物は、本発明に含まれることが意図される。
本明細書および添付の特許請求の範囲の全体を通して、文脈がそれ以外を必要としないかぎり、「含む（comprise）」なる用語、ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprisig）」などの変形は、明記した整数もしくは段階または整数もしくは段階群の包含を意味するが、任意の他の整数もしくは段階または整数もしくは段階群の除外を意味しないことが理解されよう。本明細書において用いられる場合、「含む（comprising）」なる用語は、「含む（containing）」なる用語で、または時に本明細書において用いられる「有する（having）」なる用語で置き換えることができる。
本明細書において用いられる場合、「からなる」は、請求項構成要素に明示されていない任意の構成要素、段階、または成分を除外する。本明細書において用いられる場合、「から本質的になる」は、請求項の基本的および新規特徴に実質的に影響しない材料または段階を除外しない。本明細書におけるそれぞれの場合に、「含む」、「から本質的になる」および「からなる」なる用語はいずれも、他の2つの用語のいずれかで置き換えてもよい。
いくつかの文書を、本明細書の文中で引用する。本明細書において引用する文書（全ての特許、特許出願、科学的出版物、製造者の明細、説明書など）はそれぞれ、前記または下記のいずれであっても、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書のいかなるものも、先行発明によって、そのような開示の日付を早める権利が本発明にはないとの自認であると解釈されるべきではない。

Claims (79)

  1. 以下の段階を含む、ホスホノチオレートまたはホスホネートの調製のための方法：
    式（I）
    Figure 2021516959
    の化合物を、式（II）
    Figure 2021516959
    のチオール含有分子と反応させて、式（III）
    Figure 2021516959
    の化合物を生成させる段階であって、
    式（I）中、
    Figure 2021516959
    は二重結合または三重結合を表し；
    Xは、
    Figure 2021516959
    が三重結合である場合、R3-Cを表し；
    Xは、
    Figure 2021516959
    が二重結合である場合、(R3R4)Cを表し；
    YはSまたはOを表し；
    R1は置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表し；
    R3はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；
    R4はHまたはC1〜C8-アルキルを表し；かつ
    ●は脂肪族または芳香族残基を表し、
    式（II）中、
    Figure 2021516959
    はアミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表し、
    式（III）中、
    Figure 2021516959
    は、式（I）の化合物中の
    Figure 2021516959
    が二重結合を表す場合、結合を表すか；または
    Figure 2021516959
    は、式（I）の化合物中の
    Figure 2021516959
    が三重結合を表す場合、二重結合を表し；かつ
    Figure 2021516959
    、●、R1、X、およびYは前記で定義されたとおりである、
    該段階。
  2. Figure 2021516959
    が二重結合を表し、Xが(R3R4)Cを表し、R3およびR4が独立にHまたはC1〜C8-アルキルを表し、かつ
    Figure 2021516959
    が結合を表す、請求項1に記載の方法。
  3. Figure 2021516959
    が三重結合を表し、XがR3-Cを表し、R3がHまたはC1〜C8-アルキルを表し、かつ
    Figure 2021516959
    が二重結合を表す、請求項1に記載の方法。
  4. YがSである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  5. 式（I）の化合物の調製をさらに含み、
    該調製が、
    式中、R1、X、Y、
    Figure 2021516959
    、および●が前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、式（IV）
    Figure 2021516959
    の化合物を、tert-ブチルヒドロペルオキシド（tBu-OOH）、メタクロロ過安息香酸（mCPBA）、過酸化水素（H2O2）、ヨウ素（I2）、ペルオキシ一硫酸カリウム、または酸素（O2）などの酸化剤と反応させて、式（I）の化合物を生成すること
    を含む、
    前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  6. 式（IV）の化合物の調製をさらに含み、
    該調製が、
    三ハロゲン化リン（X）、好ましくはPCl3を、順番に（i）R1-OH（XI）、（ii）R2が独立にC1〜C8-アルキルを表す、
    Figure 2021516959
    、（iii）Halが、Cl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはBrを表す、
    Figure 2021516959
    、ならびに（iv）
    Figure 2021516959
    と反応させて、式（IV）の化合物を生成すること
    を含み、
    ここで、R1、X、Y、
    Figure 2021516959
    、および●が、前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、
    請求項5に記載の方法。
  7. 式（I）の化合物の調製をさらに含み、
    該調製が、
    式（V）
    Figure 2021516959
    の化合物を式（VIa）または（VIb）
    Figure 2021516959
    の化合物と反応させて、式（I）の化合物を生成すること
    を含み、
    式中、EWGは電子吸引基を表し、該電子吸引基は好ましくは、
    Figure 2021516959
    からなる群より選択され、ここで#はSの位置を示し；Halは、Cl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClを表し、かつ
    ここで、R1、X、
    Figure 2021516959
    、および●は前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、
    請求項4に記載の方法。
  8. Figure 2021516959
    が二重結合であり、かつXが(R3R4)Cを表し、ここでR3およびR4が前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、請求項7に記載の方法。
  9. 以下の段階を含む、ホスホノチオレートまたはホスホネートの調製のための方法：
    式（I*）
    Figure 2021516959
    の化合物を、式（II）
    Figure 2021516959
    のチオール含有分子と反応させて、式（III*）
    Figure 2021516959
    の化合物を生成させる段階であって、
    式（I*）中、
    Vは、C1〜C8-アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し；
    Xは(R3R4)Cを表し；
    ここで●、Y、R1、R3、およびR4は前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりであり、
    式（II）中、
    Figure 2021516959
    は前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりであり、
    式（III*）中、
    Figure 2021516959
    、●、V、R1、X、およびYは前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、
    該段階。
  10. YがSである、請求項9に記載の方法。
  11. 式（I*）の化合物の調製をさらに含み、
    該調製が、
    式中、Xが(R3R4)Cを表しかつY、R1、R3、R4、V、および●が前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、式（IV*）
    Figure 2021516959
    の化合物を、例えば、tert-ブチルヒドロペルオキシド（tBu-OOH）、メタクロロ過安息香酸（mCPBA）、過酸化水素（H2O2）、ヨウ素（I2）、ペルオキシ一硫酸カリウム、または酸素（O2）などの酸化剤と反応させて、式（I*）の化合物を生成すること
    を含む、
    請求項9または10に記載の方法。
  12. 式（IV*）の化合物の調製をさらに含み、
    該調製が、
    三ハロゲン化リン（X）、好ましくはPCl3を、順番に（i）R1-OH（XI）、（ii）R2が独立にC1〜C8-アルキルを表す、
    Figure 2021516959
    、（iii）Halが、Cl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはBrを表し、かつXが(R3R4)Cを表す、
    Figure 2021516959
    、ならびに（iv）
    Figure 2021516959
    と反応させて、式（IV*）の化合物を生成すること
    を含み、
    ここで、R1、R3、R4、V、Y、および●が前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、
    請求項11に記載の方法。
  13. 式（I*）の化合物の調製をさらに含み、
    該調製が、
    式（V*）
    Figure 2021516959
    の化合物を式（VIa）または（VIb）の化合物
    Figure 2021516959
    と反応させて、式（I*）の化合物を生成すること
    を含み、
    式中、EWGは電子吸引基を表し、該電子吸引基は好ましくは、
    Figure 2021516959
    からなる群より選択され、ここで#はSの位置を示し；Halは、Cl、Br、およびIからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClを表し；かつ
    ここで、Xは(R3R4)Cを表し；かつR1、R3、R4、V、および●は前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、
    請求項10に記載の方法。
  14. R1が、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)n、F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1〜C8-アルキル)H、-NH2、-N3、-N(C1〜C8-アルキル)2、=O、C3〜C8-シクロアルキル、-S-S-(C1〜C8-アルキル)、nが1、2、3、4、5、もしくは6であるヒドロキシ-(C1〜C8-アルコキシ)n、C2〜C8-アルケニル、またはC2〜C8-アルキニルのうちの少なくとも1つで置換されていてもよいC1〜C8-アルキルを表すか；または
    R1が、C1〜C8-アルキル、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8-アルキル)H、-NH2、または-N(C1〜C8-アルキル)2のうちの少なくとも1つで独立に置換されていてもよいフェニルを表すか；または
    R1が、ピリジルなどの5もしくは6員ヘテロ芳香族系を表し；
    好ましくは、R1が、C1〜C8-アルキル、-S-S-(C1〜C8-アルキル)で置換されたC1〜C8-アルキル、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)nで置換されたC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニルで置換されたC1〜C8-アルキル、またはフェニルもしくは-NO2で置換されたフェニルを表す、
    前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  15. R1が、メチル、エチル、プロピル、またはブチル、より好ましくはメチルまたはエチルを表す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  16. R1が
    Figure 2021516959
    を表し、ここでR10、R11、R12、およびR13がそれぞれ独立に、水素またはC1〜C8-アルキルを表し；かつ#がOの位置を表す、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
  17. R1が、フェニルで置換されたC1〜C8-アルキルを表し、該フェニルが、
    Figure 2021516959
    でさらに置換されており、ここでZがOまたはNH、好ましくはOであり、かつここで#が該フェニルの位置を表す、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
  18. R1が、フェニルで置換されたC1〜C8-アルキルを表し、該フェニルが、
    Figure 2021516959
    でさらに置換されており、かつここで#が該フェニルの位置を表す、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
  19. R1が、n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10である
    Figure 2021516959
    を表すか；
    Figure 2021516959
    を表すか；またはn＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10である
    Figure 2021516959
    を表し、
    ここで#がOの位置を表す、
    請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
  20. ●が、例えば、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、好ましくはエチル、-CH2-フェニル、
    Figure 2021516959
    などの低分子を表し、ここで#がYの位置を示すか；または
    ●が、置換されていてもよいフェニルを表すか；または
    ●が、放射性もしくは非放射性核種、ビオチン、レポーター酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、CY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、アミノ酸、ペプチド、または置換されていてもよい5もしくは6員ヘテロ芳香族系を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  21. ●がビオチンを表すか；または
    ●がCY5もしくはEDANSを表すか；または
    ●が、フェニルを表し、該フェニルが、C1〜C8-アルキル、C1〜C8-アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1〜C8-アルキル)、-N(C1〜C8-アルキル)2-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル)、-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、-C(O)N-(C1〜C8-アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4、もしくは5つの置換基で置換されていてもよく、好ましくは、C1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよいか；または
    ●がC1〜C8-アルキルを表し、該C1〜C8-アルキルが、C3〜C8-シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8-アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8-アルキル)；-N(C1〜C8-アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8-アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8-アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8-アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、好ましくは、C1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2、フェニル、もしくはヘテロ芳香族系、単糖、多糖、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、アミノ酸、フルオロフォア、タンパク質タグからなる群より選択される少なくとも1つの置換基（置換基第1世代）で置換されていてもよく、ここで置換基第1世代が、C3〜C8-シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8-アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8-アルキル)；-N(C1〜C8-アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8-アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8-アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8-アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、好ましくは、C1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2、フェニル、もしくはヘテロ芳香族系（置換基第2世代）で再度置換されていてもよく、かつここで置換基第2世代が、同じ群から選択される少なくとも1つの置換基で再度置換されていてもよく、かつここでそのような置換が、第3、4、5、6、7、8、9、もしくは10世代までいってもよいか；または
    ●が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含むか；または
    ●が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドを表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  22. ●が、薬物、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、タンパク質、ペプチド、抗体、またはオリゴヌクレオチドを表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  23. ●がリンカーまたはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  24. Figure 2021516959
    が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  25. Figure 2021516959
    が、抗体、好ましくはIgG抗体、より好ましくはセツキシマブまたはトラスツズマブまたはブレンツキシマブ；タンパク質、好ましくはGFPタンパク質またはeGFP-タンパク質、アルブミン、トリペプチド、好ましくは式（VIII）
    Figure 2021516959
    または式（IX）
    Figure 2021516959
    のペプチドを表し、
    ここで#がSの位置を表す、
    前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  26. Figure 2021516959
    が抗体を表し、かつ
    ●が、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  27. Figure 2021516959
    がタンパク質を表し、かつ
    ●が、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、抗体、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  28. Figure 2021516959
    がペプチドを表し、かつ
    ●が、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  29. Figure 2021516959
    がアミノ酸を表し、かつ
    ●が、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  30. Figure 2021516959
    が抗体を表し、かつ
    ●がリンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、
    請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  31. Figure 2021516959
    がヌクレオチドを表し、かつ
    ●が、ペプチド、タンパク質、タンパク質タグ、抗体、オリゴヌクレオチド、CY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  32. Figure 2021516959
    がヌクレオチドを表し、かつ
    ●がリンカーを表す、
    請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  33. Figure 2021516959
    がオリゴヌクレオチドを表し、かつ
    ●が、ペプチド、タンパク質、タンパク質タグ、抗体、オリゴヌクレオチド、CY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  34. Figure 2021516959
    がオリゴヌクレオチドを表し、かつ
    ●がリンカーを表す、
    請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  35. ●が、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し、ここで該アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが、固体支持体に結合されており、ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、請求項1〜22、26〜29、31、および33のいずれか一項に記載の方法。
  36. Figure 2021516959
    が、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し、ここで該アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが、固体支持体に結合されている、請求項1〜25、28、29、31〜34、および35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 以下の段階を含む、式（I）または式（I*）の化合物の調製のための方法：
    （I）式中、Lがアミノ酸への、ペプチドへの、ヌクレオチドへの、またはオリゴヌクレオチドへの結合に適したリンカーを表し；かつ
    Figure 2021516959
    、X、Y、V、およびR1が前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、式（Ia）
    Figure 2021516959
    または式（I*a）
    Figure 2021516959
    の化合物を、固体支持体に結合されているアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドと反応させて、式中、Zが、該固体支持体に結合されている該アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表す、式（Ib）または（I*b）
    Figure 2021516959
    の化合物を生成させる段階；ならびに
    （II）式（Ib）または式（I*b）の化合物を該固体支持体から切断して、式（I）または式（I*）
    Figure 2021516959
    の化合物を得る段階であって、
    式中、●は、リンカーLを通じてYに結合された該アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し、かつ
    Figure 2021516959
    、X、Y、V、およびR1は前記で定義されたとおりである、
    該段階。
  38. 前記リンカーLが
    Figure 2021516959
    であり、ここで#がYの位置を示し、かつmおよびnがそれぞれ独立に、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmが1でありかつnが1である、請求項37に記載の方法。
  39. 式（Ia）または（I*a）の化合物を、固体支持体に結合されたペプチドまたは固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドと、好ましくは固体支持体に結合されたペプチドと反応させる、請求項37または38に記載の方法。
  40. 前記切断を酸性条件下で実施する、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
  41. 式（I）または式（I*）の化合物を、前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである式（II）の化合物と反応させる段階をさらに含む、請求項37〜40のいずれか一項に記載の方法。
  42. Figure 2021516959
    および
    Figure 2021516959
    が、同じ分子内に存在する、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
  43. Figure 2021516959
    および
    Figure 2021516959
    が、同じ分子内に存在する、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
  44. ●、
    Figure 2021516959
    、R1、X、およびYが前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、式（I）
    Figure 2021516959
    の化合物。
  45. Figure 2021516959
    が二重結合を表し、Xが(R3R4)Cを表し、かつR3およびR4が独立にHまたはC1〜C8-アルキルを表す、請求項44に記載の化合物。
  46. Figure 2021516959
    が三重結合を表し、XがR3-Cを表し、かつR3がHまたはC1〜C8-アルキルを表す、請求項44に記載の化合物。
  47. 式（I*）
    Figure 2021516959
    の化合物：
    式中、Xは(R3R4)Cを表し、かつR1、R3、R4、V、Y、および●は前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
  48. 式（III）
    Figure 2021516959
    の化合物：
    式中、
    Figure 2021516959
    は結合を表し、かつXは(R3R4)Cを表し、ここでR3もしくはR4は独立にHまたはC1〜C8-アルキルを表すか；または
    Figure 2021516959
    は二重結合を表し、かつXはR3Cを表し、ここでR3はHもしくはC1〜C8-アルキルを表し；かつ
    Figure 2021516959
    、●、R1、およびYは前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
  49. 式（III*）
    Figure 2021516959
    の化合物：
    式中、Xは(R3R4)Cを表し、かつ
    Figure 2021516959
    、●、V、Y、R1、R3、およびR4は前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
  50. YがSである、請求項44〜49のいずれか一項に記載の化合物。
  51. R1が、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)n、F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1〜C8-アルキル)H、-NH2、-N3、-N(C1〜C8-アルキル)2、=O、C3〜C8-シクロアルキル、-S-S-(C1〜C8-アルキル)、nが1、2、3、4、5、もしくは6であるヒドロキシ-(C1〜C8-アルコキシ)n、C2〜C8-アルケニル、C2〜C8-アルキニルのうちの少なくとも1つで置換されていてもよいC1〜C8-アルキルを表すか；または
    R1が、C1〜C8-アルキル、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8-アルキル)H、-NH2、または-N(C1〜C8-アルキル)2のうちの少なくとも1つで独立に置換されていてもよいフェニルを表すか；または
    R1が、ピリジルなどの5または6員ヘテロ芳香族系を表し；
    好ましくは、R1が、C1〜C8-アルキル、-S-S-(C1〜C8-アルキル)で置換されたC1〜C8-アルキル、nが1、2、3、4、5、もしくは6である(C1〜C8-アルコキシ)nで置換されたC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニルで置換されたC1〜C8-アルキル、またはフェニルもしくは-NO2で置換されたフェニルを表す、
    請求項44〜50のいずれか一項に記載の化合物。
  52. R1が、メチル、エチル、プロピル、またはブチル、より好ましくはメチルまたはエチルを表す、請求項44〜51のいずれか一項に記載の化合物。
  53. R1が
    Figure 2021516959
    を表し、ここでR10、R11、R12、およびR13がそれぞれ独立に、水素またはC1〜C8-アルキルを表し；かつ#がOの位置を表す、請求項44〜50のいずれか一項に記載の化合物。
  54. R1が、フェニルで置換されたC1〜C8-アルキルを表し、該フェニルが、
    Figure 2021516959
    でさらに置換されており、ここでZがOまたはNH、好ましくはOであり、かつここで#が該フェニルの位置を表す、請求項44〜50のいずれか一項に記載の化合物。
  55. R1がフェニルで置換されたC1〜C8-アルキルを表し、該フェニルが、
    Figure 2021516959
    でさらに置換されており、かつここで#が、該フェニルの位置を表す、請求項44〜50のいずれか一項に記載の化合物。
  56. R1が、n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10である
    Figure 2021516959
    を表すか；
    Figure 2021516959
    を表すか；またはn＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10である
    Figure 2021516959
    を表し、
    ここで#がOの位置を表す、
    請求項44〜50のいずれか一項に記載の化合物。
  57. ●が、例えば、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、好ましくはエチル、-CH2-フェニル、
    Figure 2021516959
    などの低分子を表し、ここで#がYの位置を示すか；または
    ●が、置換されていてもよいフェニルを表すか；または
    ●が、放射性もしくは非放射性核種、ビオチン、レポーター酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、CY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、アミノ酸、ペプチド、または置換されていてもよい5もしくは6員ヘテロ芳香族系を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項44〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  58. ●がビオチンを表すか；または
    ●がCY5もしくはEDANSを表すか；または
    ●がフェニルを表し、該フェニルが、C1〜C8-アルキル、C1〜C8-アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1〜C8-アルキル)、-N(C1〜C8-アルキル)2-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル)、-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、-C(O)N-(C1〜C8-アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4、もしくは5つの置換基で置換されていてもよく、好ましくは、C1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよいか；または
    ●が、C1〜C8-アルキルを表し、該C1〜C8-アルキルが、C3〜C8-シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8-アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8-アルキル)；-N(C1〜C8-アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8-アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8-アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8-アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、好ましくは、C1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2、フェニル、もしくはヘテロ芳香族系、単糖、多糖、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、アミノ酸、フルオロフォア、タンパク質タグからなる群より選択される少なくとも1つの置換基（置換基第1世代）で置換されていてもよく、ここで置換基第1世代が、C3〜C8-シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8-アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8-アルキル)；-N(C1〜C8-アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8-アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8-アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8-アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8-アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8-アルキル)、好ましくは、C1〜C8-アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8-アルキル、およびNO2、フェニル、もしくはヘテロ芳香族系（置換基第2世代）で再度置換されていてもよく、かつここで置換基第2世代が、同じ群から選択される少なくとも1つの置換基で再度置換されていてもよく、かつここでそのような置換が、第3、4、5、6、7、8、9、もしくは10世代までいってもよいか；または
    ●が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖、ポリマー、置換されていてもよいC1〜C8-アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい芳香族5もしくは6員複素環系を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含むか；または
    ●が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドを表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項44〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  59. ●が、薬物、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、タンパク質、ペプチド、抗体、またはオリゴヌクレオチドを表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、請求項44〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  60. ●がリンカーまたはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、請求項44〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  61. Figure 2021516959
    が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表す、請求項48〜60のいずれか一項に記載の化合物。
  62. Figure 2021516959
    が、抗体、好ましくはIgG抗体、より好ましくはセツキシマブまたはトラスツズマブまたはブレンツキシマブ；タンパク質、好ましくはGFPタンパク質またはeGFP-タンパク質、アルブミン、トリペプチド、好ましくは式（VIII）
    Figure 2021516959
    または式（IX）
    Figure 2021516959
    のペプチドを表し、
    ここで#がSの位置を表す、
    請求項48〜61のいずれか一項に記載の化合物。
  63. Figure 2021516959
    が抗体を表し、かつ
    ●が、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項48〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  64. Figure 2021516959
    がタンパク質を表し、かつ
    ●が、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、抗体、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項48〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  65. Figure 2021516959
    がペプチドを表し、かつ
    ●が、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、抗体、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項48〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  66. Figure 2021516959
    がアミノ酸を表し、かつ
    ●が、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項48〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  67. Figure 2021516959
    が抗体を表し、かつ
    ●がリンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、
    請求項48〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  68. Figure 2021516959
    がヌクレオチドを表し、かつ
    ●が、ペプチド、タンパク質、タンパク質タグ、抗体、オリゴヌクレオチド、CY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項48〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  69. Figure 2021516959
    がヌクレオチドを表し、かつ
    ●がリンカーを表す、
    請求項48〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  70. Figure 2021516959
    がオリゴヌクレオチドを表し、かつ
    ●が、ペプチド、タンパク質、タンパク質タグ、抗体、オリゴヌクレオチド、CY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、ビオチン、または低分子を表し；ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含む、
    請求項48〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  71. Figure 2021516959
    がオリゴヌクレオチドを表し、かつ
    ●がリンカーを表す、
    請求項48〜56のいずれか一項に記載の化合物。
  72. ●が、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し、ここで該アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが、固体支持体に結合されており、ここで任意で●が、Yに結合されているリンカーをさらに含み、好ましくは前記化合物が式の化合物である、請求項44〜59、61〜66、68、および70のいずれか一項に記載の化合物。
  73. 式（I）または式（I*）の化合物である、請求項72に記載の化合物。
  74. Figure 2021516959
    が、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを表し、ここで該アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合されている、請求項48〜62、65、66、68〜71、および72のいずれか一項に記載の化合物。
  75. 固体支持体と、式（Ia）
    Figure 2021516959
    の化合物および/または式（I*a）
    Figure 2021516959
    の化合物とを含み、
    式中、Lは、アミノ酸への、ペプチドへの、ヌクレオチドへの、またはオリゴヌクレオチドへの結合に適したリンカーであり；かつ
    ここで、
    Figure 2021516959
    、R1、X、Y、およびVは前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである、
    キット。
  76. 前記リンカーLが
    Figure 2021516959
    であり、ここで#がYの位置を示し、かつmおよびnがそれぞれ独立に、0〜20、0〜15、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、または1の整数であり、好ましくはmが1でありかつnが1である、請求項75に記載のキット。
  77. 1つもしくは複数のアミノ酸、1つもしくは複数のペプチド、1つもしくは複数のヌクレオチド、および/または1つもしくは複数のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項75または76に記載のキット。
  78. 式（IIIa）
    Figure 2021516959
    の化合物：
    式中、
    Figure 2021516959
    は結合を表し、かつXは(R3R4)Cを表すか；または
    Figure 2021516959
    は二重結合を表し、かつXはR3-Cを表し；かつ
    Figure 2021516959
    、●、R1、X、およびYは前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
  79. 式（III*a）
    Figure 2021516959
    の化合物：
    式中、Xは(R3R4)Cを表し、かつ
    Figure 2021516959
    、●、V、Y、R1、R3、およびR4は前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
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