JP7217225B2 - アルケンホスホンアミデートまたはアルキンホスホンアミデートとの化学選択的チオールコンジュゲーション - Google Patents
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Description
タンパク質の部位特異的修飾のための強力なツールとして、化学選択的反応および生体直交型反応が明らかになってきた(1、2)。これらの反応により、タンパク質の翻訳後修飾に類似の、フルオロフォアおよび他の分光学的標識、ポリマー、毒素ならびに小分子およびタンパク質のような機能性モジュールを有する、様々なタンパク質コンジュゲートおよび抗体コンジュゲートが入手可能となった。それにより、化学選択的タンパク質修飾技術は、タンパク質の生物学的機能の調査、および新しい画像処理技術の開発から、診断学における有望な新しい薬物的アプローチ、タンパク質ベースの薬剤の設計、および薬物の標的指向性送達におよぶ基礎研究に大いに貢献してきた。
当業者であれば、本出願において用いられる用語「a」または「an」は、状況に応じて、「1つ」「1つもしくは複数」または「少なくとも1つ」を意味し得ることを理解するであろう。
および●は、多くの有機(高)分子による置換を可能にする。これらの分子の構造は、本開示の方法および得られるコンジュゲートに関連がないと言える。したがって、この新しく革新的な概念の原理をいくつかの分子だけに限定するとすれば、それは過度の限定であろう。それにもかかわらず、この用語は、それぞれ有機置換基またはその塩を意味し、これらはそれぞれ、さらなる有機置換基またはその塩でさらに数回置換されていてもよい。そのような複雑な置換基の例が生成され、本出願において示す(例えば、スキーム5、6、7、11、13、15、19、20、21、22、23、および24を参照のこと)。好ましくは、用語:置換されているは、ニトロ、シアノ、Cl、F、Cl、Br、-NH-R、NR2、COOH、-COOR、-OC(O)R -NH2、-OH、-CONH2 CONHR、CON(R)2、-S-R、-SH、-C(O)H、-C(O)R、(C1~C20)-アルキル、(C1~C20)-アルコキシ、(C2~C20)-アリル、3~8員の(複素)環(存在する場合、ヘテロ原子は、N、O、およびSから独立に選択される)、5~12個の環原子を有する(複素)芳香族系(例えば、フェニル、ピリジル、ナフチルなど)から選択される1つまたは複数の置換基で置換されている基を意味し、ここでRは、これらの置換基のうちのいずれかを表すことができ、置換は数回繰り返されることができ、例えば、置換は1、2、3、4、5、6、7、8、9または10回繰り返されることができ;例えば、スキーム11の●置換基:
[式中、#は、N3の位置を表すか、または●がすでに式(VII)の化合物の一部である場合はNの位置を表す]を参照されたい。しかし、当業者であれば、40単位の多糖で置換されているアルキル鎖は、一般的な置換パターンで単純に記載し得ないことに同意するであろう。
;カルモジュリン-タグ、タンパク質カルモジュリンに結合されるペプチド
;ポリグルタミン酸タグ、Mono-Qなどのアニオン交換樹脂に効率的に結合するペプチド(EEEEEE);E-タグ、抗体によって認識されるペプチド
;FLAG-タグ、抗体によって認識されるペプチド(DYKDDDDK);HA-タグ、抗体によって認識されるヘマグルチニン由来ペプチド(YPYDVPDYA);His-タグ、ニッケルまたはコバルトキレートによって結合される5~10個のヒスチジン(HHHHHH);Myc-タグ、抗体によって認識されるc-myc由来ペプチド(EQKLISEEDL);NE-タグ、モノクローナルIgG1抗体によって認識される新規18アミノ酸合成ペプチドであり、ウェスタンブロッティング、ELISA、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫沈降、および組換えタンパク質のアフィニティ精製を含む広範囲の用途において有用である
;S-タグ、リボヌクレアーゼA由来ペプチド
;SBP-タグ、ストレプトアビジンに結合するペプチド
;Softag 1、哺乳動物発現用
;Softag 3、原核生物発現用(TQDPSRVG);Strep-tag、ストレプトアビジン、またはstreptactinと呼ぶ改変ストレプトアビジンに結合するペプチド(Strep-tag II: WSHPQFEK);TCタグ、FlAsHおよびReAsH二ヒ素化合物によって認識されるテトラシステインタグ(CCPGCC);V5タグ、抗体によって認識されるペプチド
;VSV-タグ、抗体によって認識されるペプチド
;Xpressタグ(DLYDDDDK);Isopepタグ、pilin-Cタンパク質に共有結合するペプチド
;SpyTag、SpyCatcherタンパク質に共有結合するペプチド
;SnoopTag、SnoopCatcherタンパク質に共有結合するペプチド
;BCCP(ビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin Carboxyl Carrier Protein))、BirAによってビオチン化されて、ストレプトアビジンによる認識を可能にするタンパク質ドメイン;グルタチオン-S-トランスフェラーゼ-タグ、固定グルタチオンに結合するタンパク質;緑色蛍光タンパク質-タグ、自然蛍光性であり、ナノボディによって結合され得るタンパク質;Halo-タグ、HaloLink(商標) Resin(Promega)に共有結合する変異ヒドロラーゼ;マルトース結合タンパク質-タグ、アミロースアガロースに結合するタンパク質;Nus-タグ;チオレドキシン-タグ;Fc-タグ、免疫グロブリンFcドメインに由来し、二量体化および可溶化を可能にし、Protein-A Sepharoseでの精製に用いることができる;無秩序さを促進するアミノ酸(disorder promoting amino acid)(P、E、S、T、A、Q、G、..)を含有するDesigned Intrinsically Disorderedタグ;アルカリホスファターゼ(AP);西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)グルコースオキシダーゼ(GOX);緑色蛍光タンパク質(GFP);レドックス感受性GFP(RoGFP);Azurite;Emerald;ホタルルシフェラーゼ(EC 1.13.12.7));クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT);β-ガラクトシダーゼ;β-グルクロニダーゼ;チューブリン-チロシンリガーゼ(TTL)。
[本発明1001]
以下の段階を含む、アルケン-ホスホンアミデートまたはアルキン-ホスホンアミデートの調製方法:
(I)式(III)の化合物
[式中、
は二重結合または三重結合を表し;
Xは、
が三重結合である場合にR 3 -Cを表すか;または
Xは、
が二重結合である場合に(R 3 R 4 )Cを表し;
R 1 は独立に、置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基、例えばフェニルを表し;
任意で、R 1 は、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C 1 ~C 8 アルコキシ) n 、F、Cl、Br、I、-NO 2 、-N(C 1 ~C 8 アルキル)H、-NH 2 、-N(C 1 ~C 8 アルキル) 2 、=O、C 3 ~C 8 シクロアルキル、-S-S-(C 1 ~C 8 アルキル)、nが1、2、3、4、5もしくは6であるヒドロキシ-(C 1 ~C 8 アルコキシ) n 、C 2 ~C 8 アルキニル、または置換されていてもよいフェニルのうちの少なくとも1つで置換されていてもよい、C 1 ~C 8 アルキル、例えば
[式中、#は式(III)中のOの位置を表す]を表し、;あるいは
任意で、R 1 は、C 1 ~C 8 アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C 1 ~C 8 アルコキシ) n 、F、Cl、I、Br、-NO 2 、-N(C 1 ~C 8 アルキル)H、-NH 2 、または-N(C 1 ~C 8 アルキル) 2 のうちの少なくとも1つで独立に置換されていてもよい、フェニルを表し;あるいは
任意で、R 1 は、5または6員ヘテロ芳香族系、例えばピリジルを表し;
好ましくは、R 1 は、C 1 ~C 8 アルキル、-S-S-(C 1 ~C 8 アルキル)で置換されたC 1 ~C 8 アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C 1 ~C 8 アルコキシ) n で置換されたC 1 ~C 8 アルキル、置換されていてもよいフェニルで置換されたC 1 ~C 8 アルキル、フェニル、または-NO 2 で置換されたフェニルを表し;
R 3 は、HまたはC 1 ~C 8 アルキルを表し;かつ
R 4 は、HまたはC 1 ~C 8 アルキルを表す]
を、式(IV)のアジド
[式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す]
と反応させて、式(V)の化合物
[式中、●、
、R 1 、およびXは、前記の定義のとおりである]
を調製する段階;
(II)式(V)の化合物を、式(VI)のチオール含有分子
[式中、
は、置換されていてもよいC 1 ~C 8 アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す]
と反応させて、式(VII)の化合物
[式中、
は、式(V)の化合物中の
が二重結合を表す場合に結合を表すか;または
は、式(V)の化合物中の
が三重結合を表す場合に二重結合を表し;かつ
、●、R 1 、およびXは、前記の定義のとおりである]
を生成させる段階。
[本発明1002]
段階(I)の前に段階a)を含む、本発明1001の方法:
a)式(I)の化合物
[式中、R 1 は、前記の定義のとおりであり;
Halは、Cl、Br、Iからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClを表す]
を、アルファ位に二重結合または三重結合を含む式(II)のアルファ不飽和化合物
[式中、
は二重結合または三重結合を表し;
Xは、
が三重結合である場合にR 3 -Cを表すか;または
Xは、
が二重結合である場合に(R 3 R 4 )Cを表し;
R 3 は、HまたはC 1 ~C 8 アルキルを表し;かつ
R 4 は、HまたはC 1 ~C 8 アルキルを表す]
と反応させて、式(III)の化合物
[式中、
、XおよびR 1 は、前記の定義のとおりである]
を形成させる段階;あるいは
式(I')の化合物
[式中、
R 5 は独立に、C 1 ~C 8 アルキルを表し;
Halは、Cl、Br、Iからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClを表す]
を、アルファ位に二重結合または三重結合を含む式(II)のアルファ不飽和化合物
[式中、
は二重結合または三重結合を表し;
Xは、
が三重結合である場合にR 3 -Cを表すか;または
Xは、
が二重結合である場合に(R 3 R 4 )Cを表し;
R 3 は、HまたはC 1 ~C 8 アルキルを表し;かつ
R 4 は、HまたはC 1 ~C 8 アルキルを表す]
と反応させて、式(III')の化合物
を形成させ;かつ
該式(III')の化合物をR 1 -OHと反応させて、
式(III)の化合物
[式中、
およびXは前記の定義のとおりであり、かつR 1 は前記の定義のとおりであるが、個別には選択されない]
を形成させる段階。
[本発明1003]
以下の段階を含む、アルケン-ホスホンアミデートの調製方法:
(I)式(III)の化合物
[式中、
Vは、C 1 ~C 8 アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し;
R 1 は独立に、置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基、例えばフェニルを表し;
任意で、R 1 は、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C 1 ~C 8 アルコキシ) n 、F、Cl、Br、I、-NO 2 、-N(C 1 ~C 8 アルキル)H、-NH 2 、-N(C 1 ~C 8 アルキル) 2 、=O、C 3 ~C 8 シクロアルキル、-S-S-(C 1 ~C 8 アルキル)、nが1、2、3、4、5もしくは6であるヒドロキシ-(C 1 ~C 8 アルコキシ) n 、C 2 ~C 8 アルキニル、または置換されていてもよいフェニルのうちの少なくとも1つで置換されていてもよい、C 1 ~C 8 アルキル、例えば
[式中、#は式(III * )中のOの位置を表す]を表し;あるいは
任意で、R 1 は、C 1 ~C 8 アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C 1 ~C 8 アルコキシ) n 、F、Cl、I、Br、-NO 2 、-N(C 1 ~C 8 アルキル)H、-NH 2 、または-N(C 1 ~C 8 アルキル) 2 のうちの少なくとも1つで独立に置換されていてもよい、フェニルを表し;あるいは
任意で、R 1 は、5または6員ヘテロ芳香族系、例えばピリジルを表し;
好ましくは、R 1 は、C 1 ~C 8 アルキル、-S-S-(C 1 ~C 8 アルキル)で置換されたC 1 ~C 8 アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C 1 ~C 8 アルコキシ) n で置換されたC 1 ~C 8 アルキル、置換されていてもよいフェニルで置換されたC 1 ~C 8 アルキル、フェニル、または-NO 2 で置換されたフェニルを表し;
R 3 は、HまたはC 1 ~C 8 アルキルを表し;かつ
R 4 は、HまたはC 1 ~C 8 アルキルを表す]
を、式(IV)のアジド
[式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す]
と反応させて、式(V * )の化合物
[式中、●、V、およびR 1 は、前記の定義のとおりであり;
Xは、(R 3 R 4 )Cであり;かつ
R 3 およびR 4 は、前記の定義のとおりである]
を調製する段階;
(II)式(V * )の化合物を、式(VI)のチオール含有分子
[式中、
は、置換されていてもよいC 1 ~C 8 アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す]
と反応させて、式(VII * )の化合物
[式中、
、●、V、R 1 、およびXは、前記の定義のとおりである]
を生成させる段階。
[本発明1004]
R 1 が独立に、メチル、エチル、プロピル、またはブチル、より好ましくはメチルまたはエチルを表す、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
R 1 が
[式中、R 10 およびR 11 は独立に、水素またはC 1 ~C 8 アルキルを表し;かつ#はOの位置を表す]を表す、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
R 1 が、フェニルで置換されたC 1 ~C 8 アルキルを表し、該フェニルが
[式中、Zは、OまたはNH、好ましくはOであり、かつ#は該フェニルの位置を表す]でさらに置換されている、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1007]
R 1 が、フェニルで置換されたC 1 ~C 8 アルキルを表し、該フェニルが
[式中、#は該フェニルの位置を表す]でさらに置換されている、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1008]
R 1 が、ヒドロキシエチルまたはホモプロパルギルを表す、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1009]
が二重結合を表し、Xが(R 3 R 4 )Cを表し、R 3 およびR 4 が独立に、HまたはC 1 ~C 8 アルキルを表し、かつ
が結合を表す、本発明1001、1002、1004、1005、1006、1007または1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
が三重結合を表し、XがR 3 -Cを表し、R 3 がHまたはC 1 ~C 8 アルキルを表し、かつ
が二重結合を表す、本発明1001、1002、1004、1005、1006、1007または1008のいずれかの方法。
[本発明1011]
●が、置換されていてもよいC 1 ~C 8 アルキル、好ましくは
;
置換されていてもよいフェニル、好ましくは
;
放射性または非放射性核種、ビオチン、レポーター酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、CY 5 またはEDANSなどのフルオロフォア、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよい5または6員ヘテロ芳香族系を表す、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
●が、
構造(VIII)の環状RGDペプチド(c(RGDfK))
[式中、 * はN 3 基の位置を表す];
ビオチン;
CY 5 またはEDANS;
C 1 ~C 8 アルキル、C 1 ~C 8 アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO 2 、-NH 2 、-N(C 1 ~C 8 アルキル)、-N(C 1 ~C 8 アルキル) 2 -COOH、-COO(C 1 ~C 8 アルキル)、-O-C(O)-(C 1 ~C 8 アルキル)、-C(O)N-(C 1 ~C 8 アルキル)、-N(H)-C(O)-(C 1 ~C 8 アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4または5つの置換基で、好ましくは、C 1 ~C 8 アルコキシ、-COOH、-COO(C 1 ~C 8 アルキル)、およびNO 2 からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよい、フェニル;
C 3 ~C 8 シクロアルキル;ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3つ~8つの環構成員を有するヘテロシクリル;C 1 ~C 8 アルコキシ;ハロゲン;-CN;-NO 2 ;-NH 2 ;-N(C 1 ~C 8 アルキル);-N(C 1 ~C 8 アルキル) 2 ;-COOH;-COO(C 1 ~C 8 アルキル);-O-C(O)-(C 1 ~C 8 アルキル);-CONH 2 ;-C(O)N(C 1 ~C 8 アルキル) 2 ;-C(O)NH-(C 1 ~C 8 アルキル);-N(H)-C(O)-(C 1 ~C 8 アルキル)、好ましくは、C 1 ~C 8 アルコキシ、-COOH、-COO(C 1 ~C 8 アルキル)、およびNO 2 、フェニル、またはヘテロ芳香族系、単糖、多糖、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、アミノ酸、フルオロフォア、タンパク質タグからなる群より選択される少なくとも1つの置換基(置換基第1世代)で置換されていてもよい、C 1 ~C 8 アルキルであって、ここで置換基第1世代は、C 3 ~C 8 シクロアルキル;ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3つ~8つの環構成員を有するヘテロシクリル;C 1 ~C 8 アルコキシ;ハロゲン;-CN;-NO 2 ;-NH 2 ;-N(C 1 ~C 8 アルキル);-N(C 1 ~C 8 アルキル) 2 ;-COOH;-COO(C 1 ~C 8 アルキル);-O-C(O)-(C 1 ~C 8 アルキル);-CONH 2 ;-C(O)N(C 1 ~C 8 アルキル) 2 ;-C(O)NH-(C 1 ~C 8 アルキル);-N(H)-C(O)-(C 1 ~C 8 アルキル)、好ましくは、C 1 ~C 8 アルコキシ、-COOH、-COO(C 1 ~C 8 アルキル)、およびNO 2 、フェニル、またはヘテロ芳香族系(置換基第2世代)でさらに置換されていてもよく、かつここで置換基第2世代は、同じ群から選択される少なくとも1つの置換基でさらに置換されていてもよく、かつここでそのような置換は第3、4、5、6、7、8、9、または10世代まで及んでいてもよい、C 1 ~C 8 アルキル
を表す、本発明1010の方法。
[本発明1013]
●が、置換されていてもよいC 1 ~C 8 アルキル、例えば、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
●が、置換されていてもよいフェニル、例えば、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
が、抗体、好ましくはIgG抗体、より好ましくはセツキシマブまたはトラスツズマブ;ペプチド、好ましくは、GFPタンパク質またはeGFPタンパク質、トリペプチド、より好ましくは、#がSの位置を表す式(IX)のペプチド
;置換されていてもよいC 1 ~C 8 アルキル、好ましくは、#がSの位置を示す置換C 1 ~C 8 アルキル
を表す、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
および
が同じ分子内にある、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
式(V)の化合物
式中、●、
、R1、およびXは、前記本発明のいずれかにおいて定義されたとおりである。
[本発明1018]
式(V * )の化合物
式中、●、V、R 1 、およびXは、前記本発明のいずれかにおいて定義されたとおりである。
[本発明1019]
式(VII)の化合物
式中、
は、式(V)の化合物中の
が二重結合を表す場合に結合を表すか;または
は、式(V)の化合物中の
が三重結合を表す場合に二重結合を表し;かつ
、●、R 1 、およびXは、前記本発明のいずれかにおいて定義されたとおりである。
[本発明1020]
式(VII * )の化合物
式中、
、●、V、R 1 、およびXは、前記本発明のいずれかにおいて定義されたとおりである。
[本発明1021]
が抗体を表し、かつ
●が、タンパク質タグ、またはCY 5 もしくはEDANSなどのフルオロフォア、またはタンパク質を表す、本発明1019または1020の化合物。
[本発明1022]
がタンパク質を表し、かつ
●が、タンパク質タグ、またはCY 5 もしくはEDANSなどのフルオロフォア、抗体、またはタンパク質を表す、本発明1019または1020の化合物。
[本発明1023]
がタンパク質を表し、かつ
●がタンパク質を表す、本発明1019または1020の化合物。
[本発明1024]
が抗体を表し、かつ
●が、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、本発明1019または1020の化合物。
[本発明1025]
式(VIIa)の化合物
式中、
は、式(III)の化合物中の
が二重結合を表す場合に結合を表すか;または
は、式(III)の化合物中の
が三重結合を表す場合に二重結合を表し;かつ
、●、R 1 、およびXは、前記本発明のいずれかにおいて定義されたとおりである。
[本発明1026]
式(VII * a)の化合物
式中、
、●、V、R 1 、およびXは、前記本発明のいずれかにおいて定義されたとおりである。
本発明は、(無保護)ペプチド、タンパク質(例えば、酵素および補酵素(例えば、補酵素A))、抗体、または他のチオール含有化合物におけるCys残基と、アルケン-ホスホンアミデートまたはアルキン-ホスホンアミデートとの、新しい化学選択的反応を提供する。1つの態様において、ペプチド、タンパク質、抗体、または他のチオール含有化合物は保護されていない。別の態様において、アルケン-ホスホンアミデートまたはアルキン-ホスホンアミデートは、電子不足アルケン-ホスホンアミデートまたは電子不足アルキン-ホスホンアミデートである。得られるコンジュゲートは以前に文献で記載されたことがない。
・異なるアルケンホスホニトおよびアルキンホスホニトの合成
・アルケンホスホニトおよびアルキンホスホニトとの(化学選択的)シュタウディンガー反応
・アルケン-ホスホンアミデートまたはアルキン-ホスホンアミデートの、(小分子、ペプチド、タンパク質、および抗体を含む)チオール含有分子とのコンジュゲーション反応
・水性系におけるアルキン-ホスホンアミデートへのチオール付加は、Z-生成物の生成に対して高いジアステレオ選択性を示した
・生理的に適切な条件下でのこれらのコンジュゲートの安定性
・切断可能な基を含むコンジュゲートの合成。
・小分子、ポリマー、タンパク質、および抗体におけるチオールを修飾するための新しい反応、その結果として
・Cys部分における前例のない化学構造
・2つの複雑な分子(例えば、ペプチドおよびタンパク質、またはペプチドおよび抗体)を直接の段階的化学選択的コンジュゲーションにより連結可能
・化学選択的ハンドル(すなわち、好ましくは電子不足アルケン-ホスホンアミデートまたは電子不足アルキン-ホスホンアミデート)の組み込み後、または化学選択的コンジュゲーション後の、最終保護基操作の必要性なし
・多様なリンカー(様々なP-置換基が可能、リン中心の様々なO-置換基、切断可能な基を含むO-置換基)
・通常のマレイミド試薬とは対照的なコンジュゲートの高い安定性;迅速なコンジュゲーション反応
・アルキン-ホスホンアミデートへのチオール付加の高い立体選択性。
(I)式(III)の化合物
[式中、
は二重結合または三重結合を表し;
Xは、
が三重結合である場合にR3-Cを表す
(したがって、構造は
である)か;または
Xは、
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し
(したがって、構造は
である);
R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族もしくは芳香族残基(例えばフェニル);nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1~C8アルコキシ)nで、Fで、Clで、Brで、Iで、-NO2で、-N(C1~C8アルキル)Hで、-NH2で、-N(C1~C8アルキル)2で、=Oで、C3~C8シクロアルキルで、置換されていてもよいフェニルで置換された、C1~C8アルキル、例えば
;または任意で、C1~C8アルキル、(C1~C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1~C8アルキル)H、-NH2、-N(C1~C8アルキル)2で独立に置換された、フェニル;または5もしくは6員ヘテロ芳香族系(例えばピリジル)を表し;好ましくは、C1~C8アルキル、(C1~C8アルコキシ)nで置換されたC1~C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルを表し;
これは、窒素環原子のうちの1つにおいて、ビオチンあるいは任意の他のペプチド、酵素もしくは補酵素(例えば、補酵素A)などのタンパク質、抗体、タンパク質タグ、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、または多糖でさらに置換されていてもよく、かつ式中、#はOの位置を表し;
R3は、HまたはC1~C8アルキルを表し;
R4は、HまたはC1~C8アルキルを表す]
を、式(IV)のアジド
[式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す]
と反応させて、式(V)の化合物
[式中、●、
、R1、およびXは、前記の定義のとおりである]
を調製する段階;
(II)式(V)の化合物を、式(VI)のチオール含有分子
[式中、
は、置換されていてもよいC1~C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す]
と反応させて、式(VII)の化合物
[式中、
は、式(V)の化合物中の
が二重結合を表す場合に結合を表すか;または
は、式(V)の化合物中の
が三重結合を表す場合に二重結合を表し;かつ
、●、R1、およびXは、前記の定義のとおりである]
を生成させる段階。
a)式(I)の化合物
[式中、R1およびHalは、前記の定義のとおりである]
を、アルファ位に二重結合または三重結合を含む式(II)のアルファ不飽和化合物
[式中、
は二重結合または三重結合を表し;
Xは、
が三重結合である場合にR3-Cを表すか;または
Xは、
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し;
R3は、HまたはC1~C8アルキルを表し;かつ
R4は、HまたはC1~C8アルキルを表す]
と反応させて、式(III)の化合物
[式中、
、XおよびR1は、前記の定義のとおりである]
を形成させる段階;
または、式(I')の化合物
[式中、
R5は独立に、C1~C8アルキルを表し;
Halは、Cl、Br、Iからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClを表す]
を、アルファ位に二重結合または三重結合を含む式(II)のアルファ不飽和化合物
[式中、
は二重結合または三重結合を表し;
Xは、
が三重結合である場合にR3-Cを表すか;または
Xは、
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し;
R3は、HまたはC1~C8アルキルを表し;かつ
R4は、HまたはC1~C8アルキルを表す]
と反応させて、式(III')の化合物
を形成させ;
かつ該式(III')の化合物をR1-OHと反応させて、式(III)の化合物
[式中、
およびXは前記の定義のとおりであり、かつR1は前記の定義のとおりであるが、個別には選択されない]
を形成させる段階;
(I)式(III)の化合物を、式(IV)のアジド
[式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す]
と反応させて、式(V)の化合物
[式中、●、
、R1およびXは、前記の定義のとおりである]
を調製する段階;
(II)式(V)の化合物を、式(VI)のチオール含有分子
[式中、
は、置換されていてもよいC1~C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す]
と反応させて、式(VII)の化合物
[式中、
は、式(V)の化合物中の
が二重結合を表す場合に結合を表すか;または
は、式(V)の化合物中の
が三重結合を表す場合に二重結合を表し;かつ
、●、R1、およびXは、前記の定義のとおりである]
を生成させる段階。
が二重結合を表す、式(III)の化合物のP-原子は、(例えば、精製のために)シュタウディンガー反応に先だってBH3により保護することができ、シュタウディンガー反応の前に容易に脱保護することができる:
b)式(III)の化合物
[式中、XおよびR1は、前記の定義のとおりである]
を、BH3と反応させて、式(III')の化合物
[式中、XおよびR1は、前記の定義のとおりである]
を形成させる段階。
[式中、VはC1~C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し;かつR1、R2、およびR3は、前述の化合物(III)についての定義のとおりである]
で実施することもできる。式(III*)の化合物の調製のために、式(II*)の化合物
[式中、V、R3およびR4は本明細書の定義のとおりである]
を用いることができる。
[式中、VはC1~C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し;●およびR1は、化合物(V)についての定義のとおりである]
および式(VII*)の化合物
[式中、VはC1~C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し;●、
およびR1は化合物(VII)についての定義のとおりである]
を生じる。式(V)および(VII)の化合物についての本明細書に記載の方法のすべての段階は、式(V*)および(VII*)の化合物についても同様に実施することができる。
(I)式(III)の化合物
[式中、
Vは、C1~C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し;
R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族もしくは芳香族残基(例えばフェニル);nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1~C8アルコキシ)nで、Fで、Clで、Brで、Iで、-NO2で、-N(C1~C8アルキル)Hで、-NH2で、-N(C1~C8アルキル)2で、=Oで、C3~C8シクロアルキルで、置換されていてもよいフェニルで置換された、C1~C8アルキル、例えば
;または任意で、C1~C8アルキル、(C1~C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1~C8アルキル)H、-NH2、-N(C1~C8アルキル)2で独立に置換された、フェニル;または5もしくは6員ヘテロ芳香族系(例えばピリジル)を表し;好ましくは、C1~C8アルキル、(C1~C8アルコキシ)nで置換されたC1~C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルを表し;
これは、窒素環原子のうちの1つにおいて、ビオチンあるいは任意の他のペプチド、酵素もしくは補酵素(例えば、補酵素A)などのタンパク質、抗体、タンパク質タグ、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、または多糖でさらに置換されていてもよく、かつ式中、#はOの位置を表し;
R3は、HまたはC1~C8アルキルを表し;
R4は、HまたはC1~C8アルキルを表す]
を、式(IV)のアジド
[式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す]
と反応させて、式(V*)の化合物
[式中、●、V、およびR1は、前記の定義のとおりであり;
Xは(R3R4)Cであり;かつ
R3およびR4は、前記の定義のとおりである]
を調製する段階;
(II)式(V*)の化合物を、式(VI)のチオール含有分子
[式中、
は、置換されていてもよいC1~C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す]
と反応させて、式(VII*)の化合物
[式中、
、●、V、R1、およびXは、前記の定義のとおりである]
を生成させる段階。
ここでTFA-はトリフルオロ酢酸であり、Cy5は蛍光色素Cy5であり、HATUは(1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート)であり、DIPEAはN,N-ジイソプロピルエチルアミンであり、かつDMFはN,N-ジメチルホルムアミドである。
を生成し得る。
を表してもよく、式中、「化合物」は、ペプチド、タンパク質、酵素、補酵素(例えば、補酵素A)、抗体、タンパク質タグ、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、多糖、またはビオチンを表してもよく;#はOの位置を表す。
;または任意で、C1~C8アルキル、(C1~C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1~C8アルキル)H、-NH2、-N(C1~C8アルキル)2で独立に置換された、フェニル;または5もしくは6員ヘテロ芳香族系(例えばピリジル)であり;好ましくは、C1~C8アルキル、(C1~C8アルコキシ)nで置換されたC1~C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルである。
[式中、#は、式(III)または式(III*)中のOの位置を表す]
を表してもよい。
を表し、式中、R10およびR11は独立に、水素またはC1~C8アルキルを表し;かつ#はOの位置を表す。より好ましい態様において、R10およびR11は独立に、水素、メチルまたはエチルを表す。さらにより好ましい態様において、R1は
を表し、式中、R10およびR11は独立に、水素、メチルまたはエチルを表し;かつ#はOの位置を表す。これらの態様のうちのいくつかにおいて、R10およびR11はいずれも水素である。これらの態様のうちのいくつかにおいて、R10は水素であり、かつR11はC1~C6アルキルである。これらの態様のうちのいくつかにおいて、R10は水素であり、かつR11はメチルまたはエチルである。好ましくは、これらの態様において、両方のR1は同じである。
でさらに置換されており、式中、ZはOまたはNHであり、かつ#は該フェニルの位置を表す。いくつかの態様において、ZはOである。いくつかの態様において、ZはNHである。
中のC1~C8アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチル;好ましくはメチル、エチル、またはプロピル;より好ましくはメチルまたはエチル;最も好ましくはメチルであってもよい。好ましい態様において、R1は
を表し、式中、C1~C8アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチル;好ましくは、メチル、エチル、またはプロピル;より好ましくは、メチルまたはエチル;最も好ましくはメチルであってもよく;ZはOまたはNHであり、かつ#はOの位置を表す。別の好ましい態様において、R1は
を表し、式中、C1~C8アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチル;好ましくは、メチル、エチル、またはプロピル;より好ましくは、メチルまたはエチル;最も好ましくはメチルであってもよく;ZはOまたはNHであり、かつ#はOの位置を表す。好ましくは、これらの態様において、両方のR1は同じである。
[式中、#は該フェニルの位置を表す]でさらに置換されている。いくつかの態様において、R1は、フェニルで置換されたC1~C8アルキルを表し、該フェニルは
[式中、#は該フェニルの位置を表す]でさらに置換されている。好ましい態様において、R1は
[式中、#はOの位置を表す]を表す。別の好ましい態様において、R1は
[式中、#はOの位置を表す]を表す。好ましくは、これらの態様において、両方のR1は同じである。
は二重結合を表し、Xは(R3R4)Cを表し、R3およびR4は独立に、HまたはC1~C8アルキルを表し、かつ
は結合を表す。別の好ましい態様において、R3およびR4はそれぞれHを表す。
などの置換されていてもよいC1~C8アルキル、または
などの置換されていてもよいフェニル[式中、#は、式(IV)の化合物の-N3基の位置を表す];放射性もしくは非放射性核種、ビオチン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、糖質、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよい5もしくは6員ヘテロ芳香族系、タンパク質タグ、またはフルオロフォア(例えば、CY5もしくはEDANS)を表す。
構造(VIII)の環状RGDペプチド(c(RGDfK))
[式中、*はN3基の位置を表す];
ビオチン;
CY5またはEDANS;
C1~C8アルキル、C1~C8アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1~C8アルキル)、-N(C1~C8アルキル)2 -COOH、-COO(C1~C8アルキル)、-O-C(O)-(C1~C8アルキル)、-C(O)N-(C1~C8アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1~C8アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4または5つの置換基で、好ましくは、C1~C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1~C8アルキル)、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよい、フェニル;
C3~C8シクロアルキル;ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3つ~8つの環構成員を有するヘテロシクリル;C1~C8アルコキシ;ハロゲン;-CN;-NO2;-NH2;-N(C1~C8アルキル);-N(C1~C8アルキル)2;-COOH;-COO(C1~C8アルキル);-O-C(O)-(C1~C8アルキル);-CONH2;-C(O)N(C1~C8アルキル)2;-C(O)NH-(C1~C8アルキル);-N(H)-C(O)-(C1~C8アルキル)、好ましくは、C1~C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1~C8アルキル)、およびNO2、フェニル、またはヘテロ芳香族系、単糖、多糖、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、アミノ酸、フルオロフォア、タンパク質タグからなる群より選択される少なくとも1つの置換基(置換基第1世代)で置換されていてもよい、C1~C8アルキルであって、置換基第1世代は、C3~C8シクロアルキル;ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3つ~8つの環構成員を有するヘテロシクリル;C1~C8アルコキシ;ハロゲン;-CN;-NO2;-NH2;-N(C1~C8アルキル);-N(C1~C8アルキル)2;-COOH;-COO(C1~C8アルキル);-O-C(O)-(C1~C8アルキル);-CONH2;-C(O)N(C1~C8アルキル)2;-C(O)NH-(C1~C8アルキル);-N(H)-C(O)-(C1~C8アルキル)、好ましくは、C1~C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1~C8アルキル)、およびNO2、フェニル、またはヘテロ芳香族系(置換基第2世代)でさらに置換されていてもよく、置換基第2世代は、同じ群から選択される少なくとも1つの置換基でさらに置換されていてもよく、そのような置換は第3、4、5、6、7、8、9、または10世代まで及んでいてもよい、C1~C8アルキル
を表す。
構造(VIII)の環状RGDペプチド(c(RGDfK))
[式中、*はN3基の位置を表す];
ビオチン;
CY5またはEDANS;
C1~C8アルキル、C1~C8アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1~C8アルキル)、-N(C1~C8アルキル)2 -COOH、-COO(C1~C8アルキル)、-O-C(O)-(C1~C8アルキル)、-C(O)N-(C1~C8アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1~C8アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4または5つの置換基で、好ましくは、C1~C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1~C8アルキル)、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよい、フェニル;
1、2、3、4または5つの置換基で置換されていてもよいC1~C8アルキルであって、該置換基が、
C1~C8アルキル、C1~C8アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1~C8アルキル)、-N(C1~C8アルキル)2 -COOH、-COO(C1~C8アルキル)、-O-C(O)-(C1~C8アルキル)、-C(O)N-(C1~C8アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1~C8アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4または5つの置換基で、好ましくは、C1~C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1~C8アルキル)、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよい、フェニル;C1~C8アルコキシ;ハロゲン;-CN;-NO2;-NH2;-N(C1~C8アルキル);-N(C1~C8アルキル)2;-COOH;-COO(C1~C8アルキル);-O-C(O)-(C1~C8アルキル);-C(O)N-(C1~C8アルキル);-N(H)-C(O)-(C1~C8アルキル)、好ましくは、C1~C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1~C8アルキル)、NO2
からなる群より独立に選択される、C1~C8アルキル;
[式中、#はNの位置を表す]
を表す。
は、セツキシマブもしくはトラスツズマブなどの抗体(好ましくはIgG抗体);GFPタンパク質、eGFPタンパク質、トリペプチド(例えば、式(IX)のペプチド
[式中、#はSの位置を表す])などのペプチド;または
[式中、#はSの位置を示す]
などの置換されていてもよいC1~C8アルキルを表す。
(式中、
および
は、●と
とを連結している弧によって示されるとおり、同じ分子内にある)
を本明細書の定義のとおりの式(III)の化合物と反応させて、式(VIIa)の化合物:
[式中、
は、式(III)の化合物中の
が二重結合を表す場合に結合を表すか;または
は、式(III)の化合物中の
が三重結合を表す場合に二重結合を表し;かつ
、●、R1、およびXは本明細書の定義のとおりである]
を得る方法にも関する。
[式中、
および
は、●と
とを連結している弧によって示されるとおり、同じ分子内にある]
を本明細書の定義のとおりの式(III*)の化合物と反応させて、式(VII*a)の化合物:
[式中、
、●、V、R1、およびXは本明細書の定義のとおりである]
を得る方法にも関する。
および
を有する化合物(XX)は、例えば、BCL9ペプチドなどのペプチドである。したがって、この方法によって得られる式(VIIa)または(VII*a)の化合物は、例えば、BCL9ペプチド由来の環状ペプチドなどの、環状ペプチドであってもよい。
などの置換されていてもよいC1~C8アルキル;
などの置換されていてもよいフェニル[式中、#はNの位置を表す];放射性もしくは非放射性核種、ビオチン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、糖質、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい5または6員ヘテロ芳香族系、置換されていてもよいC1~C8アルキル、タンパク質タグ、またはフルオロフォア(例えばCY5)を表す。
[式中、
は結合を表し、かつXは(R3R4)Cを表すか;または
は二重結合を表し、かつXはR3-Cを表し;
R3は、HまたはC1~C8アルキルを表し;
R4は、HまたはC1~C8アルキルを表し;
は、置換されていてもよいC1~C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表し;
●は、脂肪族または芳香族残基を表し;
R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族もしくは芳香族残基(例えばフェニル);nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1~C8アルコキシ)nで、Fで、Clで、Brで、Iで、-NO2で、-N(C1~C8アルキル)Hで、-NH2で、-N(C1~C8アルキル)2で、=Oで、C3~C8シクロアルキルで、置換されていてもよいフェニルで置換された、C1~C8アルキル、例えば
;または任意で、C1~C8アルキル、(C1~C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1~C8アルキル)H、-NH2、-N(C1~C8アルキル)2で独立に置換された、フェニル;または5もしくは6員ヘテロ芳香族系(例えばピリジル)であり;好ましくは、C1~C8アルキル、(C1~C8アルコキシ)nで置換されたC1~C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルである]
にも関する。
[式中、
は、置換されていてもよいC1~C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表し;
●は、脂肪族または芳香族残基を表し;
R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族もしくは芳香族残基(例えばフェニル);nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1~C8アルコキシ)nで、Fで、Clで、Brで、Iで、-NO2で、-N(C1~C8アルキル)Hで、-NH2で、-N(C1~C8アルキル)2で、=Oで、C3~C8シクロアルキルで、置換されていてもよいフェニルで置換された、C1~C8アルキル、例えば
;または任意で、C1~C8アルキル、(C1~C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1~C8アルキル)H、-NH2、-N(C1~C8アルキル)2で独立に置換された、フェニル;または5もしくは6員ヘテロ芳香族系(例えばピリジル)であり;好ましくは、C1~C8アルキル、(C1~C8アルコキシ)nで置換されたC1~C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルであり;
Vは、C1~C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し;
Xは、(R3R4)Cを表し;
R3は、HまたはC1~C8アルキルを表し;かつ
R4は、HまたはC1~C8アルキルを表す]
にも関する。
などの置換されていてもよいC1~C8アルキル;
などの置換されていてもよいフェニル;放射性もしくは非放射性核種、ビオチン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、糖質、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい5もしくは6員ヘテロ芳香族系、置換されていてもよいC1~C8アルキル、タンパク質タグ、またはフルオロフォア(例えば、CY5もしくはEDANS)を表す。
は、抗体、好ましくはIgG抗体、より好ましくはセツキシマブもしくはトラスツズマブ;ペプチド、好ましくはGFPタンパク質もしくはeGFPタンパク質もしくはトリペプチド、より好ましくは式(IX)のペプチドまたはC1~C8アルキルを表す。
[式中、●および
は、●と
とを連結している弧によって示されるとおり、同じ分子内にあり、かつここで●、
、X、およびR1は本明細書の定義のとおりであり、特に化合物(VII)についての定義のとおりである]にも関する。好ましくは、化合物(VIIa)は、例えば、BCL9ペプチド由来の環状ペプチドなどの、環状ペプチドである。
[式中、●および
は、●と
とを連結している弧によって示されるとおり、同じ分子内にあり、かつここで●、
、V、X、およびR1は本明細書の定義のとおりであり、特に化合物(VII*)についての定義のとおりである]にも関する。好ましくは、化合物(VII*a)は、例えば、BCL9ペプチド由来の環状ペプチドなどの、環状ペプチドである。
[式中、左側のタンパク質は、GFPタンパク質、好ましくはeGFPタンパク質である];
;式(X)の蛍光標識したASGP-R指向Cy5コンジュゲート[これは、ビニルホスホンアミデートへのモジュール式付加:
により生成することができる]
も好ましい。
段階a)
シュタウディンガー-ホスホニト反応によるアルケニルまたはアルキニルホスホンアミデート調製のための一般手順は、式(II)の臭化アルケニルまたはアルキニルマグネシウムと式(I)のジアルキルハロゲンクロロホスファイト(ハロゲンクロロ亜リン酸ジエチル)、好ましくはクロロホスホニトとの、-20℃未満、例えば、-100℃~-40℃の間、好ましくは-90℃~-50℃の間(例えば、約87℃)での反応を必要とする。好ましくは、反応はアルゴンなどの不活性ガス雰囲気下で実施する。この場合の「不活性」とは、所与の反応条件下で、この反応の抽出物または生成物のいずれとも反応しないガスを意味する。当然のことながら、反応時間は反応体積および物質の量に依存することになる。しかし、指針として、反応時間は2分~4時間の範囲とすべきである。式(I)および(II)の化合物の量は、2:1~1:2、例えば、約1:1などの、5:1~1:5の範囲とすべきである。
式(III)の化合物と式(IV)のアジドとの反応は、室温、すなわち、約25℃で実施することができる。しかし、反応は0℃~50℃の範囲の温度でも実施することができる。反応時間は反応体積および物質の量に依存する。しかし、指針として、反応は1時間~72時間の時間枠内で実施すべきである。式(III)および(IV)の化合物の量は、2:1~1:2、例えば、約1:1などの、5:1~1:5の範囲とすべきである。
段階(II)
式(V)のホスホンアミデートおよび塩基(および必要な場合は添加剤)をそれぞれの溶媒中に懸濁することができる。次いで、式(VI)のチオールを、例えば、マイクロリットルシリンジで加えることができ、混合物を室温、すなわち、約25℃で反応させる。しかし、反応は0℃~50℃の範囲の温度でも実施することができる。反応時間は反応体積および物質の量に依存する。しかし、指針として、反応は0.1時間~10時間の時間枠内、例えば、0.1時間~3時間の時間枠内または0.1時間~1時間の間の時間枠内で実施すべきである。
火炎乾燥したシュレンク管中、アルゴン雰囲気下で、臭化エチニルマグネシウムの溶液(THF中0.5M、2mL、1mmol)をドライアイス/アセトン浴中で-78℃に冷却した。クロロ亜リン酸ジエチル(157mg、144μL、1mmol)をシリンジから滴加した。溶液を-78℃で30分間撹拌し、次いで室温に戻し、続いてさらに1.5時間撹拌した。その後、3mLの無水THFおよびアジド(1mmol)を加え、溶液を室温で24時間撹拌した。次いで、H2O(5mL)を加え、溶液を空気に開放してさらに24時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した後、粗製混合物を31P NMRで分析した。
三塩化リンからのビニルホスホニト合成のための一般手順A
火炎乾燥したシュレンク管に20mlの無水トルエン中1.50mmol(1.0当量)の三塩化リンを加え、-78℃に冷却した。3.3mmolのピリジン(2.2当量)および5mlのEt2O中3.3mmolのアルコール(2.2当量)を滴加した。得られた懸濁液を室温に戻し、さらに30分間撹拌し、再度-78℃に冷却した。1.65mmol(1.1当量)のビニルグリニャール(THF中1.0M)を加え、反応混合物を室温で2時間撹拌した。最後に、2.25mmol(1.5当量)のボラン(THF中1.0M)を0℃で加え、さらに1時間撹拌した。粗生成物を精製のためにシリカカラムに乾燥充填した。
火炎乾燥したシュレンク管に200μlの無水THFに溶解した1.5mmol(1.0当量)ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンを加え、-78℃に冷却した。1.65mmol(1.1当量)のビニルグリニャール(THF中1.0M)を加え、反応混合物を室温で30分間撹拌した。1mlの無水THFまたはMeCN中3.3mmolの真空乾燥したアルコール(2.2当量)および3.3mmol(2.2当量)のテトラゾール(MeCN中0.45M)の溶液を加えた。得られた懸濁液を室温で終夜撹拌した。最後に、2.25mmol(1.5当量)のボラン(THF中1.0M)を0℃で加え、さらに1時間撹拌した。粗生成物を精製のためにシリカカラムに乾燥充填した。
25-mlシュレンク管に1.71mlの臭化ビニルマグネシウム(THF中0.7M、1.20mmol、1.2当量)をアルゴン雰囲気下で加え、-78℃に冷却し、140μlのクロロ亜リン酸ジエチル(1.00mmol、1.0当量)を滴加した。帯黄色溶液を0℃まで戻し、さらに2時間撹拌し、3.2mlのTHFに溶解した1.00mmolのアジド(1.0当量)を加え、室温で終夜撹拌した。5mlの水を加え、さらに24時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィで精製した。
エチルN-フェニル-P-エチニル-ホスホンアミデートを、「アルケニルまたはアルキニルホスホンアミデート調製のための一般手順」後にフェニルアジド(595mg、5mmol)から5mmolスケールで調製した。粗製混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィにより、ヘキサン/酢酸エチルで溶出して精製した。生成物を無色固体として430mg(2.1mmol、42%)の収率で得た。
エチルN-ベンジル-P-エチニル-ホスホンアミデートを、「アルケニルまたはアルキニルホスホンアミデート調製のための一般手順」後にベンジルアジド(133mg、125μL、1mmol)から調製した。粗製混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィにより、ヘキサン/酢酸エチルで溶出して精製した。生成物を無色固体として37mg(0.17mmol、17%)の収率で得た。
化合物を、一般手順Cに従い、1.15mlのクロロ亜リン酸ジエチル(8mmol)から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ(EtOAc)により精製し、白色固体で得た。(675mg、3.20mmol、40.0%)
化合物を、一般手順Cに従い、288μlのクロロ亜リン酸ジエチル(2mmol)から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ(CH2Cl2/MeOH、9:1~4:1)により精製し、白色固体で得た。(173mg、0.68mmol、34.0%)
化合物を、一般手順Cに従い、290μlのクロロ亜リン酸ジエチル(2mmol)から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ(EtOAc)により精製し、無色油状物で得た。(155mg、0.69mmol、34.3%)
化合物を、一般手順Cに従い、120μlのクロロ亜リン酸ジエチル(0.83mmol)から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ(2%MeOH/CH2Cl2)により精製し、褐色油状物で得た。(125mg、0.46mmol、55.4%)
化合物を、一般手順Cに従い、290μlのクロロ亜リン酸ジエチル(2mmol)から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ(EtOAc)により精製し、無色油状物で得た。(165mg、0.65mmol、32.5%)
化合物を、一般手順Cに従い、140μlのクロロ亜リン酸ジエチル(1mmol)から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ(1.5%MeOH/CH2Cl2)により精製し、無色油状物で得た。(70mg、0.32mmol、32.2%)
ジエチル-アルキニル-ホスホニトの合成および異なるアジドとの反応(段階b)
ジエチル-アルキニル-ホスホニトを、発表されたプロトコル(13)に従って合成し、異なる脂肪族および芳香族アジドと反応させた(スキーム3)。所望のアルキニル-ホスホンアミデートの生成を31P-NMRによってモニターした(異なるアジド基質の変換について表1参照)。
キャップしたバイアルに、エチルN-フェニル-P-エチニル-ホスホンアミデート(10mg、0.05mmol)およびそれぞれの塩基(および必要な場合は添加剤)を加えた。混合物を200μLのそれぞれの溶媒に懸濁した。次いで、エタンチオール(3.1mg、3.6μL、0.05mmol)をマイクロリットルシリンジから加え、混合物を室温で3時間撹拌した。その後、混合物をCH2Cl2(5mL)で希釈し、H2O(5mL)を加えた。抽出後、相を分離し、水層をCH2Cl2(5mL)で3回抽出した。合わせた有機層をH2O(5mL)で2回と食塩水(5mL)で洗浄した。溶媒を除去した後、粗製混合物を1H NMRおよび31P NMRで分析した。アルケンホスホンアミデートの調製は、アルキンホスホンアミデートの調製と類似である。
キャップしたバイアルに、エチルN-フェニル-P-エチニル-ホスホンアミデート(10mg、0.05mmol)および炭酸カリウム(2.8mg、0.02mmol)を加えた。混合物をDMF/H2Oの1:1混合物(200μL)に懸濁した。次いで、エタンチオール(3.1mg、3.6μL、0.05mmol)をマイクロリットルシリンジから加え、混合物を室温で3時間撹拌した。その後、混合物をCH2Cl2(5mL)で希釈し、H2O(5mL)を加えた。抽出後、相を分離し、水層をCH2Cl2(5mL)で3回抽出した。合わせた有機層をH2O(5mL)で2回と食塩水(5mL)で洗浄した。溶媒を減圧下で除去した後、生成物を12mg(0.044mmol、89%)の収率で得た。
キャップしたバイアルに、エチルN-フェニル-P-エチニル-ホスホンアミデート(31mg、0.15mmol)および炭酸カリウム(7mg、0.05mmol)を加えた。混合物をDMF/H2Oの1:1混合物(500μL)に懸濁した。次いで、(2S)-2-アミノ-4-{[(1R)-1-[(カルボキシメチル)カルバモイル]-2-スルファニルエチル]カルバモイル}-ブタン酸(31mg、0.1mmol)を加え、混合物を室温で3時間撹拌した。その後、混合物をH2O(5mL)で希釈し、CH2Cl2(5mL)を加えた。抽出後、相を分離し、有機層をH2O(5mL)で3回抽出した。水層をCH2Cl2(5mL)で3回洗浄した。その後、溶媒を減圧下で除去した。粗製混合物を分取HPLCにより、アセトニトリルおよび酢酸アンモニウム緩衝液で溶出して精製した。生成物を酢酸アンモニウム塩として35.5mg(0.061mmol、61%)の収率で得た。
脂肪族モデル基質としてエタンチオールを選択した。すべての実験を、0.1mmolスケールで、400μLの溶媒を用い、室温で3時間実施した。変換およびジアステレオ選択性を31P-NMRおよび1H-NMRで決定した(スキーム4)。
原理試験の次の証明において、発明者らは、癌細胞において過剰発現されたインテグリンに結合することが公知の、アジド含有環状RGDペプチド(c(RGDfK))を合成した。この環状アジド-ペプチドをビスエトキシアルキン-ホスホニトと反応させて、高度に反応性のホスホンアミデートを、HPLC後に53%の単離収率で生成し、副産物の生成は観察されなかった(スキーム6)。
環状RGDfK-アジドペプチドをNovaSynTGTアルコール樹脂上、0.26mmol/gのローディングで手動により合成した。まず、480.7mgの樹脂を2.5mlのトルエンおよび480μlの塩化アセチル中、60℃で3時間撹拌することにより、樹脂を活性化した。Fmoc-Asp(OAll)-OH(123.56mg、0.3125mmol、2.5当量)の二重カップリングをDCM中、活性化塩基としてDIPEA(212.6μl、1.25mmol、10当量)を用い、それぞれ1時間で実施した。さらなるアミノ酸カップリングを、DMF中でアミノ酸(0.25mmol、2当量)、HATU(0.25mmol、2当量)およびDIPEA(0.5mmol、4当量)を混合し、30分で1回と1時間で1回カップリングさせることにより実施した。Fmoc脱保護をDMF中の20%ピペリジンで行った。最終のアミノ酸カップリング後、樹脂をクロロホルム/酢酸/NMM(体積比37:2:1)中Pd(P(Ph3)4)(433mg、0.375mmol、3当量)により、アルゴン雰囲気下で2時間処理してalloc脱保護を行い、続いてFmoc脱保護と、DMF中HATU(0.25mmol、2当量)およびDIPEA(0.5mmol、4当量)により16時間の環化を実施した。リジン残基上に芳香族アジドを設置可能にするために、Fmoc-Lys(dde)-OHを固相合成において用い、DMF中2%ヒドラジンを3分間×3回用いて樹脂上で直交性に脱保護し、続いて4-アジド安息香酸(81.65mg、0.5mmol、4当量)のカップリングをDMF中HATU(190mg、0.5mmol、4当量)およびDIPEA(1mmol、8当量)で2時間行った。樹脂からの切断をTFA/DCM(体積比75:25)を用いて2.5時間で実施した。冷無水エーテル中で沈澱させた。粗生成物をUPLC-MSで分析し、続くシュタウディンガー反応で粗生成物として用いるか、または分取逆相C18 HPLC(0~5分95/5、水(0.1%TFA)/MeCN(0.1%TFA);5~60分10/90、水(0.1%TFA)/MeCN(0.1%TFA))により精製した。生成物を白色粉末として得(8.0mg、11.0μmol、収率8.5%)、分析UPLC(RP-C18カラム、0.1%TFAを含む5~95%アセトニトリル/水)により分析した。c(RGDfK)-アジドのUPLCクロマトグラムを図7に示す。LRMS: m/z: 749.67 [M+H]+ (calcd. m/z: 749.3485)。
ビスエトキシアルキン-ホスホニト合成
THF中の臭化エチニルマグネシウム(5M、2ml、1mmol、1当量)を、火炎乾燥したシュレンク管中で-78℃に冷却し、クロロ亜リン酸ジエチル(0.143ml、1mmol、1当量)を加えた。溶液を-78℃で10分間撹拌し、室温に戻し、さらに90分間撹拌した。出発原料の完全消費を31P-NMR(生成物126.73ppm;図6参照:粗製ビスエトキシアルキン-ホスホニト合成は図9参照)でチェックし、粗生成物のままで続くアジド-c(RGDfK)とのシュタウディンガー反応に用いた。
粗製ペプチドを用いる場合、それ(66mg、88.2μmol、1当量)をDMSO(4ml、22mM)に溶解し、火炎乾燥したフラスコ中で1時間乾燥した後、ビスエトキシアルキン-ホスホニト(NMRにより決定した生成物のパーセンテージに応じた量、132.3μmol、1.5当量)を加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した後、4mlの水を加え、6時間撹拌し、その後凍結乾燥した。粗生成物を半分取逆相C18 HPLC(0~5分95/5、水(0.1%TFA)/MeCN(0.1%TFA);5~60分10/90、水(0.1%TFA)/MeCN(0.1%TFA))で精製し、生成物を白色粉末で得た(6.2mg、6.64μmol、全収率5.3%)。
グルタチオンとのモデル反応
グルタチオン(1mg、3.25μmol、1当量)およびc(RGDfK)-ホスホンアミデートアルキン(1.24mg、3.25μmol、1当量)を135μlの10mM炭酸水素アンモニウム緩衝液pH9.2および15μlのアセトニトリル中で混合した(c=21.6mM)。10分間振盪した後、LC-UV/MSにより付加生成物への定量的変換が観察された。
次の段階で、発明者らは、Cys含有モデルタンパク質によるシュタウディンガー誘導コンジュゲーション反応を調査した。ここで、発明者らは環状RGD-ホスホンアミデートへのチオールコンジュゲーションのために利用可能なシステインを1つだけ有する変異eGFPを用いた。
GFP C70M S147C(3.13nmol、1当量)を100μlの10mM炭酸水素アンモニウムpH8.4に再緩衝化し、c(RGDfK)-ホスホンアミデートアルキン(0.08mg、93.9nmol、30当量)を加えた。反応混合物を37℃、800rpmで3時間振盪した。最後に、混合物を10kDa MWCOのAmicon Spinフィルターを用いてスピンろ過した。試料を14000rpm、5分間で10回スピンろ過し、新鮮10mM炭酸水素アンモニウム緩衝液を加えた後、MALDI-TOF分析を行い、GFP C70M S147Cの所望の生成物への全変換を検証した。
MALDI TOF: 予想 (in Da): 28605.31 (M+H+), 14303.16 (M+2H+); 実測 (in Da): 28608.46 (M+H+), 14294.46 (M+2H+)
c(RGDfK)-グルタチオンを異なる溶媒(0.1M HCl、pH1;0.1%TFAを含む30%アセトニトリル/水、pH2.3;PBS緩衝液、pH7.4;酢酸アンモニウム緩衝液、pH9.0;0.05M NaOH、pH12)中に2mMの濃度で溶解し、0.5mMのイノシンを内部標準として加えた。次いで、出発原料の安定性を3日間にわたってモニターした。
まず、実験を、ヒト上皮成長因子に対するモノクローナルIgG1抗体、セツキシマブで実施した。抗体をビオチンホスホンアミデートで修飾し、非還元条件下でのSDS-PAGEと、続いて抗ビオチンウェスタンブロッティングにより分析した(スキーム7)。
a)様々なボラン保護ビニルホスホニトの合成
ジエチルビニルホスホニトを、以前に発表されたプロトコルに基づき、クロロ亜リン酸ジエチルの臭化ビニルマグネシウムによるアルキル化と、続くボラン付加により合成した(13)(スキーム8)。所望のホスホニトを37%の収率で単離した。
ジエチルビニルホスホニトボラン
25-mlシュレンク管に2.14mlの臭化ビニルマグネシウム(THF中0.7M、1.50mmol、1.5当量)をアルゴン雰囲気下で加え、-78℃に冷却し、140μlのクロロ亜リン酸ジエチル(1.00mmol、1.0当量)を滴加した。帯黄色溶液を0℃まで戻し、さらに2時間撹拌し、1.00mlのボラン(THF中1.0M、1.00mmol、1.0当量)を加え、0℃でさらに1時間撹拌した。有機溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン/EtOAc、9:1)で精製して、所望の化合物を無色油状物で得た。(60mg、0.37mmol、37.0%)
NMRデータは文献中に報告されたものに一致している。18
化合物を、一般手順Aに従い、PCl3(260μl、3.00mmol)から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン/EtOAc、4:1)により精製し、帯黄色固体で得た。(555mg、1.48mmol、49.2%)
化合物を、一般手順Aに従い、PCl3(130μl、1.50mmol)から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ(CH2Cl2/MeOH、19:1~9:1)により精製し、無色油状物で得た。(34mg、0.11mmol、7.3%)
化合物を、一般手順Aに従い、PCl3(393μl、4.50mmol)から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン/EtOAc、4:1)により精製し、無色油状物で得た。(700mg、2.71mmol、60.3%)
化合物を、一般手順Bに従い、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(71mg、0.27mmol)から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン/CH2Cl2、1:1)により精製し、帯黄色固体で得た。(75mg、0.11mmol、41.9%)
化合物を、一般手順Bに従い、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(513mg、1.92mmol)から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン/CH2Cl2、4:1)により精製し、帯黄色固体で得た。(704mg、1.45mmol、75.6%)
化合物を、一般手順Bに従い、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(266mg、1.00mmol)から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン/CH2Cl2、9:1~4:1)により精製し、無色液体で得た。(87mg、0.32mmol、32.2%)
化合物を、一般手順Bに従い、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(534mg、2.00mmol)およびヒドロキノン(2.20g、10当量)から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン/EtOAc、4:1~1:1)により精製し、無色固体で得た。(280mg、0.96mmol、48.3%)
化合物を、一般手順Bに従い、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(533mg、2.00mmol)から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン/CH2Cl2、9:1~4:1)により精製し、白色固体で得た。(540mg、1.44mmol、71.8%)
5mlマイクロ波チューブに200mgの5-ヒドロキシ-2-ニトロベンジルアルコール(1.18mmol、1.0当量)、245mgのK2CO3(1.77mmol、1.5当量)、132μlの臭化プロパルギル(トルエン中80重量%溶液)および4mlのDMFを加えた。得られた懸濁液を100℃で1時間照射した。室温まで冷却した後、5mlの水を加えた。得られた沈澱をろ過し、水で3回洗浄し、真空乾燥して、179mgの淡褐色固体を得た。(0.87mmol、73.2%)
NMRデータは文献中に報告されたものに一致している。19
火炎乾燥したシュレンク管、400mgの2-ニトロ-5-(オキシプロパルギル)ベンジルアルコール(1.93mmol、1.0当量)を、850mgのヒドロキノン(7.72mmol、4.0当量)および750mgのトリフェニルホスフィン(2.90mmol、1.5当量)と共に10mlの無水THFに溶解した。溶液を0℃に冷却し、1.33mlのアゾジカルボン酸ジエチル(トルエン中40%溶液)(2.90mmol、1.5当量)を滴加し、反応混合物を室温に戻して終夜反応させた。粗生成物を精製のためにシリカカラムに乾燥充填し、ヘキサン/EtOAc(7:3~3:2)で溶出して、505mgの黄色固体を得た。(1.68mmon、87.5%)
まずビニルホスホニトによるシュタウディンガー-ホスホニト反応を、やや単純なジエチル誘導体により調べた。これらを市販のクロロ亜リン酸ジエチルのアルキル化により合成し、異なる脂肪族および芳香族アジドとインサイチューで反応させた。ホスホンイミデートの加水分解の後に、所望のホスホンアミデートをカラムクロマトグラフィで単離した。
最初の試験において、ビニルホスホンアミデートを異なる小分子チオールと、アルキニルホスホンアミデートに対して以前にうまくはたらいた反応条件下で反応させた。炭酸カリウム存在下、1当量のチオールで3時間処理した後に、ホスホンアミデート出発原料の完全変換を観察することができた。
タンパク質レベルでのアルケンホスホンアミデートによる最初の実験を、水溶性エチル-N-(4-カルボキシ-フェニル)-P-ビニル-ホスホンアミデートで行った。以前の試験は、炭酸塩基がチオール付加の促進において非常によくはたらくことを示したため、pH9.0の炭酸水素アンモニウム緩衝液を最初の実験のために選択した。利用可能なシステインを1つだけ有する変異eGFPバリアントを、試験のために選択した。
反応のシステイン残基に対する選択性を、この実験で確認することができた。ホスホンアミデートとインキュベートしたいかなる利用可能なシステインも持たないeGFPバリアント、またはCys含有eGFPへのCy5アジド付加のいずれも、蛍光標識を示さなかった。反応混合物への5%DMSO(ライン1)またはアセトニトリル(ライン3)の添加はいずれも、反応自体に影響をおよぼすことなく色素を可溶化するのに十分であった。
発明者らは以前、CuAACのための追加のアルキンハンドルを有するo-ニトロベンジル置換基を有するホスホンアミデートを合成し得ることに言及した。これらの化合物に対する1つの可能な適用は、タンパク質コンジュゲートを精製するためのアルキンへのビオチンの設置である。発明者らは、ビオチンがストレプトアビジンビーズに結合し、非結合材料を洗浄することができ、純粋なタンパク質を光照射により溶出し得ると考えた。
ビニルホスホンアミデートを、モノクローナル抗体の修飾のためにも適用した。発明者らは、2-ニトロ-ベンジル置換ビニルホスホンアミデートがチオール付加においてより速やかに反応することを見いだしたため、ビオチン修飾したこれらのホスホンアミデートを選択した。
発明者らはさらに、我々のモジュール式コンジュゲーションアプローチを標的指向性の薬物コンジュゲートの合成に適用したいと考えた。Khorev et alは以前に、末端アミノ修飾を有するASGP-R指向三価リガンドの合成を記載した。この経路に基づき、発明者らは末端チオール修飾を有する同じリガンドを合成した(20)。
スキーム25に示すアミノ修飾誘導体N2またはNHS-エステルN1としての一般構築ブロックは、アルキン-ホスホンアミデート部分を機能性分子にアミド結合形成反応によって導入することができる。
分取HPLC
分取HPLCをGilson PLC 2020システム(Gilson Inc, WI, Middleton, USA)でVP 250/32 Macherey-Nagel Nucleodur C18 HTec Spumカラム(Macherey-Nagel GmbH & Co. Kg, Germany)を用いて実施した。本開示のすべての項を通して以下の勾配を用いた:方法C:(A=H2O+0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)、B=MeCN(アセトニトリル)++0.1%TFA、流速30ml/分、5%B 0~5分、5~90%B 5~60分、90%B 60~65分。方法D:(A=H2O+0.1%TFA、B=MeCN++0.1%TFA)、流速30ml/分、5%B 0~5分、5~25%B 5~10分、25%~45%B 10~50分、45~90% 50~60分、90%B 60~65分。
半分取HPLCを、CBM20A通信バスモジュール、FRC-10Aフラクションコレクター、2ポンプLC-20AP、およびSPD-20A UV/VIS検出器を備えたShimadzu prominence HPLCシステム(Shimadzu Corp., Japan)でVP250/21 Macherey-Nagel Nucleodur C18 HTec Spumカラム(Macherey-Nagel GmbH & Co. Kg, Germany)を用いて実施した。本開示のすべての項を通して以下の勾配を用いた:方法E:(A=H2O+0.1%TFA、B=MeCN++0.1%TFA)、流速10ml/分、5%B 0~5分、5~99%B 5~65分、99%B 65~75分。
500-ml丸底フラスコに10mmolの芳香族アミンを加え、15mlの水に懸濁し、0℃に冷却した。5mlの濃HCl水溶液を加え、続いて10mlの水中1.27gの亜硝酸ナトリウム(15.00mmol、1.50当量)溶液を滴加した。混合物を0℃で20分間撹拌し、100mlのEtOAc(酢酸エチル)を加え、5mlの水中0.98gのアジ化ナトリウム(15.00mmol、1.5当量)溶液を滴加した。溶液を室温に戻し、さらに1時間撹拌した。相を分離し、水相をEtOAcで2回抽出し、合わせた有機分画を水で2回洗浄し、乾燥(MgSO4)し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。
25-mlシュレンク管に173μlのクロロ亜リン酸ジエチル(1.20mmol、1.2当量)をアルゴン雰囲気下で加え、-78℃に冷却し、2.40mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、1.20mmol、1.2当量)を滴加した。帯黄色溶液を室温に戻し、3.0mlのTHFまたはDMFに溶解した1.00mmolのアジド(1.0当量)を加え、室温で終夜撹拌した。5mlの水を加え、さらに2時間撹拌した。反応混合物をEtOAcで抽出し、合わせた有機分画を乾燥(MgSO4)し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィまたは分取逆相HPLCにより精製した。
化合物を、一般手順1に従い、2.00gの4-アミノ安息香酸(14.58mmol)から合成し、帯黄色固体で得た。(2.00g、12.26mmol、84.1%)
NMRデータは文献値に一致していた(23)。
50-ml丸底フラスコ中、500mgの4-アジド安息香酸(3.056mmol、1.00当量)、705mgのN-ヒドロキシスクシンイミド(6.112mmol、2.00当量)および20mgの4-ジメチルアミノピリジン(0.164mmol、0.05当量)を10mlの無水CH2Cl2に懸濁した。1.172gのEDC・HCl(1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩、6.112mmol、2.00当量)を0℃でゆっくり加え、反応混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィ(50%EtOAc/ヘキサン)により精製し、白色固体で得た(763mg、2.934mmol、96.0%)
NMRデータは文献値に一致していた(24)。
化合物を、一般手順2に従い、173μlのクロロ亜リン酸ジエチル(1.20mmol、1.20当量)、2.40mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M(テトラヒドロフラン)、1.20mmol、1.20当量)および260mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(1.00mmol、1.00当量)から合成した。粗製ホスホンアミデートをシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(100%EtOAc)により精製し、帯黄色固体で得た。(225mg、0.643mmol、64.3%)
化合物を、一般手順1に従い、1.00gの2-(4-アミノフェニル)-エタノール(7.21mmol)から合成し、褐色油状物で得た(0.50g、3.06mmol、42.5%)。
NMRデータは文献値に一致していた(25)。
50-ml丸底フラスコに455mgの2-(4-アジドフェニル)-エタノール(2.79mmol、1.00当量)を加え、8mlのピリジンに溶解し、0℃に冷却した。787mgの固体塩化トシル(4.18mmol、1.50mmol)を分割して加え、混合物を室温で4時間撹拌し、10mlの飽和NaCl溶液および10mlの水を加え、黄色溶液をEtOAcで3回抽出し、合わせた有機分画を1N HClで2回、飽和NaHCO3溶液で2回および水で1回洗浄した。有機層を乾燥(MgSO4)し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。生成物を黄色油状物で得た(0.72g、2.44mmol、87.4%)。
NMRデータは文献値に一致していた(26)。
50-ml丸底フラスコに4.11gの2-(4-アジドフェニル)-エチル-4-トルエンスルホネート(12.95mmol、1.00当量)を、3.60gのフタルイミドカリウム(19.42mmol、1.50当量)と共に加え、60mlのDMF(N,N-ジメチルホルムアミド)に溶解した。褐色溶液を100℃で終夜撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、50mlの水を加え、EtOAcで3回抽出し、合わせた有機分画を水で2回洗浄し、有機層を乾燥(MgSO4)し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。生成物をそれ以上精製せずに次の段階で用いた。純粋な生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(10%~20%EtOAc/n-ヘキサン)により黄色固体で得た(1.75g、5.99mmol、46.2%)。
100-ml丸底フラスコに722mgの2-(4-アジドフェニル)-エチルフタルイミド(2.47mmol、1.00当量)、144μlのヒドラジン水和物(2.96mmol、1.20当量)を加え、20mlの無水エタノールにアルゴン雰囲気下で溶解し、溶液を4時間還流した。ほとんどの溶媒を減圧下で除去し、50mlの水を加え、懸濁液を1N NaOHで塩基性化した。EtOAcで3回抽出し、合わせた有機分画を水で2回洗浄し、有機層を乾燥(MgSO4)し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。純粋な生成物を、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(10%MeOH(メタノール)/DCM(ジクロロメタン)+0.5%N,N-エチルジメチルアミン)およびHClからの凍結乾燥により、帯黄色固体で得た(224mg、1.14mmol、2段階で46.2%)。
NMRデータは文献値に一致していた(27)。
化合物を、一般手順2に従い、181μlのクロロ亜リン酸ジエチル(1.26mmol、1.20当量)、2.52mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、1.26mmol、1.20当量)および322mgの2-(4-アジドフェニル)エチルアミン塩酸塩(1.05mmol、1.00当量)から合成した。粗製ホスホンアミデートを分取RP-HPLC(前述の方法C)により精製し、褐色油状物で得た。(209mg、0.57mmol、54.5%)
反応をDMF中で実施した。エチル-N-(4-(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ-カルボニル-フェニル)-P-エチニルホスホンアミデートの100mM溶液265μl(0.0265mmol、1.00当量)および5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホネートの50mM溶液1.06ml(0.0530mmol、2.00当量)を795μlのDMFと共にあらかじめ混合し、200mM DIPEA溶液530μl(0.1060mmol、4.00当量)を加えた。混合物を室温で2時間振盪し、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製混合物を分取HPLCにより前述の方法Cを用いて精製し、所望の化合物を凍結乾燥後に白色固体で得た。(9.30mg、0.0186mmol、70.0%)
Cy5-COOHを、発明者らの研究室が以前に発表した手順に従って合成した(28)。5-ml丸底フラスコに33.2mgのCy5-COOH(0.0628mmol、1.00当量)、35.8mgのHATU((1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート)、0.0942mmol、1.5当量)および200μlのDMFを加えた。濃青色溶液を0℃に冷却し、32μlのDIPEA(N,N-ジイソプロピルエチルアミン、0.1884mmol、3.0当量)を加えた。5分後、300μl DMF中の23mgのエチル-N-(4-(2-アミノエチル)フェニル)-P-エチニルホスホンアミデートTFA塩(0.0628mmol、1.00当量)の溶液を滴加した。溶液を室温に戻し、2時間撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(0%~5%MeOH/DCM)で精製して、青色固体で得た。(45mg、0.0590mmol、93.9%)。
本明細書において前述したとおり、発明者らは全長IgG抗体のアルキン-およびアルケン-ホスホンアミデートによる修飾が可能であることを示すことができた。前述の実施例において、発明者らはモデル抗体としてセツキシマブを用い、鎖間ジスルフィドをビオチン化ホスホンアミデート(phorsphonamidate)により、Senterら(29)により以前に記載された還元およびアルキル化プロトコルを介して修飾した。この概念は、非常に強力なチューブリン結合細胞毒のMMAEおよびHer2結合抗体のトラスツズマブのホスホンアミデート仲介性コンジュゲーションによるADC生成のための実行可能なシステムへとさらに展開された。
N-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン
50-mlシュレンク管に1.00gの4-アジド安息香酸(6.13mmol、1.00当量)を加え、8.5mlの無水DCM(ジクロロメタン)に1滴のDMF(N,N-ジメチルホルムアミド)と共に、アルゴン雰囲気下で懸濁した。630μlの塩化オキサリルを0℃で滴加し、反応混合物を室温で2時間、溶液が澄明になるまで撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、対応する固体を4mlのDMFに再溶解した。対応する溶液を、8mlの水中720mgのL-バリン(6.13mmol、1.00当量)および612mgの水酸化ナトリウム(15.33mmol、2.50当量)の溶液に0℃で滴加し、さらに2時間撹拌した。溶液を1N HClで酸性化し、ジエチルエーテルで3回抽出した。有機分画を集め、乾燥(MgSO4)し、溶媒を減圧下で除去した。純粋な生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(30%EtOAc、0.5%ギ酸/n-ヘキサン)により無色ヒュームで得た。(954mg、4.96mmol、80.9%)
100-ml丸底フラスコ中、954mgのN-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン(3.64mmol、1.00当量)、750mgのジシクロヘキシルカルボジイミド(3.64mmol、1.00当量)、418mgのN-ヒドロキシスクシンイミド(3.64mmol、1.00当量)および9mgの4-(ジメチルアミノ)-ピリジン(0.07mmol、0.02当量)を25mlのTHFに溶解し、室温で終夜撹拌した。反応混合物をろ過し、固体をTHFで数回洗浄し、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(20~40%EtOAc/n-ヘキサン)で精製した。化合物を白色粉末として単離した(513mg、1.01mmol、55.7%)
50-ml丸底フラスコ中、380mgのN-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン-無水物(0.75mmol、1.00当量)を2mlの1,2-ジメトキシエタンに溶解し、0℃に冷却した。4mlのH2Oおよび2mlのTHF(テトラヒドロフラン)中の351mgのL-シトルリン(1.50mmol、2.00当量)および144mgの炭酸水素ナトリウム(2.25mmol、3.00当量)の溶液を滴加し、室温で終夜撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(10%MeOH、0.5%ギ酸/CH2Cl2)で精製した。化合物を無色油状物として単離した(312mg、0.74mmol、99.0%)。
50-ml丸底フラスコ中、330mgのN-(4-アジドベンゾイル)-L-バイン(vaine)-L-シトルリン(0.787mmol、1.0当量)および107mgの4-アミノベンジルアルコール(0.866mmol、1.10当量)を8mlのCH2Cl2および4mlのMeOH(メタノール)にアルゴン雰囲気下で溶解し、0℃に冷却した。390mgのN-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン(1.574mmol、2.00当量)を分割して加え、得られた溶液を室温に戻して終夜反応させた。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(10%~15%MeOH/CH2Cl2)により単離して、白色固体で得た(164mg、0.313mmol、39.8%)。鏡像異性的に純粋な化合物を分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法D)により単離し、凍結乾燥後に白色固体で得た。
化合物を、一般手順に従い、230μlのクロロ亜リン酸ジエチル(0.925mmol、5.0当量)、1.85mlの臭化エチニルマグネシウム(THF中0.5M、0.925mmol、5.0当量)および97mgのN-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン-L-シトルリン-4-アミノベンジルアルコール(0.185mmol、1.0当量)から合成した。粗製ホスホンアミデートを分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法C)により単離し、凍結乾燥後に白色固体で得た。(60mg、0.098mmol、52.9%)。
5-ml丸底フラスコに31mgのN-(4-(O-エチル-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)-L-バリン-L-シトルリン-4-アミノベンジルアルコール(0.050mmol、1.00当量)および31mgのビス(4-ニトロフェニル)カーボネート(0.101mmol、2.00当量)を加えた。固体を140μlのDMF(N,N-ジメチルホルムアミド)に溶解し、17.4μlのDIPEA(N,N-ジイソプロピルエチルアミン、0.101mmol、2.00当量)を加えた。黄色溶液を室温で1時間撹拌し、溶液を30mlの氷冷ジエチルエーテルに加えた。沈澱を遠心沈降により回収し、DMFに再溶解し、再度エーテルで沈澱させた。手順を合計3回行い、最後に固体を高真空条件下で乾燥した。化合物を定量的収率および次の段階のために十分な純度で単離した。分析的に純粋な材料を分取HPLCにより、「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法Cを用いて精製した。
15-mLファルコンチューブに14.35mgのN-(4-(O-エチル-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)-L-バリン-L-シトルリン-4-アミノベンジル-4-ニトロフェニルカーボネート(0.0184mmol、1.00当量)、0.50mgの1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(0.0037mmol、0.20当量)および13.15mgのMMAF(モノメチルオーリスタチンF、0.0184mmol、1.00当量)を加えた。固体を250mlの無水DMFおよび25mlのピリジンに溶解し、60℃で終夜加熱した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物を半分取HPLCにより、「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法Eを用いて精製し、所望の化合物を凍結乾燥後に白色固体として得た。(4.84mg、0.0035mmol、19.2%)。HR-MS for C69H104N11O16P2+ [M+2H]2+ calcd:686.8695、found 686.8694。
トラスツズマブ発現および精製を、GEからのSuperdex 200 Increase 10/300上、リン酸緩衝化食塩水(PBS)および流速0.75ml/分でのゲルろ過による最終精製を追加して、以前に発表したとおりに実施した(30)。
トラスツズマブ修飾を、新しく発現した抗体(c=0.55mg/ml)を全体積80μlのPBS中に50mMホウ酸ナトリウムおよび4mM DTTを含む緩衝液(pH8.0)中、37℃で40分間インキュベートすることにより実施した。その後、過剰のDTT除去ならびに50mM NH4HCO3および1mM EDTA含有溶液(pH8.5)への緩衝液交換を、7K MWCOのZeba(商標) Spin Desalting Columns(Thermo Fisher Scientific, Waltham, United States)0.5mLを用いて行った。DMSO中に13mMアミデートを含む溶液1.60μlを急速に加えた。混合物を800rpm、14℃で16時間撹拌した。過剰のアミデートを再度、7K MWCOのZeba(商標) Spin Desalting Columns 0.5mLを用いての滅菌PBSへの緩衝液交換により除去した。
抗増殖検定を、以下のわずかな変更を加え、以前に報告したとおりに実施した(30):
- 100μLの培地を加えた96穴光学細胞培養プレートの各ウェルに、少量の2×103個のMDAMB468細胞を播種した。
- 20×高NA対物レンズを備えたOperetta High-Content Imaging system(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)で画像を取得した。
- 細胞数を二つ組の試験から計算した。
同様の様式で、「抗体薬物コンジュゲート(ADC)生成のためのアルキニルホスホニトによるシュタウディンガー誘導チオール付加」において前述したとおり、蛍光色素Cy5をトラスツズマブにコンジュゲートして、抗体-フルオロフォアコンジュゲートを生成した。Cy5-O-エチル-P-アルキニル-ホスホンアミデートの合成を、「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入」において前述したとおりに実施した。得られたホスホンアミデート-AFCコンジュゲートを、2つの異なるHer2過剰発現細胞株BT474およびSKBR3の免疫染色により評価した。Her2選択性を試験するために、対照としてHer2非過剰発現細胞株MDAMB468を用いた。細胞固定後の十分な膜染色が2つのHer2発現細胞株で観察されたが、Her2非発現細胞株は蛍光増大を示さなかった。
トラスツズマブ-Cy5コンジュゲートを、以下のわずかな変更を加え、「抗体薬物コンジュゲート(ADC)生成のためのアルキニルホスホニトによるシュタウディンガー誘導チオール付加」において前述した、一般手順に従って合成した:アミデートの当量を130に上げ、DMSO(ジメチルスルホキシド)含有量を5%(より正確には、2%から5%)に上げて、Cy5を可溶化した。
BT474、SKBR3およびMDAMB468を滅菌カバーストリップに播種し、細胞接着のために37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。細胞を1×PBSで3回洗浄した後、1×PBS/4%PFA(ホルムアルデヒド)中で10分間固定した。固定を等量の1×PBST(PBS+0.05%トゥイーン20)の添加により停止し、続いてPBSTでさらに2回洗浄した。AFCを最終濃度5μg/mLまで加え、室温で1時間インキュベートした。非結合AFCを、PBSで3回洗浄して除去した。
細胞溶解物または血清のような複雑な系におけるホスホンアミデート結合の安定性を試験するために、ホスホンアミデート結合の切断後に蛍光シグナルを生成する色素-クエンチャーの対を合成した。コンジュゲートは蛍光色素EDANS、クエンチャーDABCYLおよびコンジュゲートの水溶性を確実にするための連結ペプチドからなる(図21)。マレイミド連結コンジュゲートを比較実験のために合成した(図21B)。
DABCYl-Cysペプチド
DABCYl-Cysペプチドを、手動カップリングによる直線的合成で標準的なFmoc化学により合成した。0.1mmolのRinkアミド樹脂(subst:0.4mmol/g)を反応容器に加え、合成を5倍のアミノ酸過剰で実施した。Fmoc脱保護を、DMF中20%ピペリジンで5分間の樹脂処理を2回行うことにより達成した。カップリングをDMF中HOBt/HBTU/DIPEA(5当量/5当量/10当量)を加えて45分間反応させることにより達成した。最終Cysカップリングの後、DMF中で5当量のDABCYL酸を5当量のHATUおよび10当量のDIPEAと45分間カップリングした。ペプチドを樹脂から、TFA/DTT/TIS(95/2.5/2.5、重量比)の添加により3時間以内に切断した。その後、ペプチドを氷冷ジエチルエーテルを加えて沈澱させた。沈澱を遠心沈降により回収し、乾燥し、分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法C)により精製した。ペプチドを赤色固体として35.8%の収率で得た(38.2mg、35.8μmol)。ESI-MS for C48H66N12O14S+ [M+2H]+ calcd: 533.23, found 533.34。
1.5-mlエッペンドルフチューブに50mM NH4HCO3、pH8.5中のDABCYl-Cysペプチド(20mM)の溶液263μlを加えた。158μlの50mM NH4HCO3、pH8.5および105μlのDMF中のEDANSアミデートの溶液(100mM)を加えて、最終濃度を20%DMF/緩衝液中20mMペプチドおよび10mMアミデートとした。チューブを800rpm、室温で3時間振盪した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物を半分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E)により精製した。ペプチドを赤色固体として得た。ESI-MS for C71H90N15O20PS2 + [M+2H]+ calcd:783.78, found 784.47。
1.5-mlエッペンドルフチューブにPBS中のDABCYl-Cysペプチド(20mM)の溶液188μlを加えた。DMF中のEDANSマレイミド(40mM)の溶液188μlを加えて、最終濃度を50%DMF/緩衝液中10mMペプチドおよび20mMマレイミドとした。チューブを800rpm、室温で3時間振盪した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物を半分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E)により精製した。ペプチドを赤色固体として得た。ESI-MS for C66H83N15O20S2 + [M+2H]+ calcd 734.77:, found. 734.79
安定性試験を96穴プレート(Corning 3615、黒色、透明平底)で、少なくとも三つ組で行った。Dabcyl-EDANS付加物の200μM保存溶液5μlおよびそれぞれの試験溶液95μlを各ウェルに加えた。
トラスツズマブ-ビオチンコンジュゲートをPBS中3μMの濃度で、最終濃度0.5mMのBSAと共に37℃でインキュベートした。試料を0、1、2および5日後に採取し、液体窒素中で急速冷凍し、最終的にSDS/Pageおよびウェスタンブロット分析にかけた。
低濃度でのアルキン-ホスホンアミデートへのチオール付加の動力学を試験するために、蛍光EDANS系ホスホンアミデートを、1.1.章に記載の通りに合成した。モデル基質としてのグルタチオンの付加を、蛍光HPLCにより経時的に調べた。ピークの積分および内部標準としてのコンジュゲートされていないEDANSに対する正規化を適用して、反応の二次速度定数をもとめた。測定された二次速度定数は37.32±0.41 l/mol・sであった。
EDANS-ホスホンアミデートへのグルタチオン付加を、pH8.5で1mM EDTAおよび1%DMFを含む50mM NH4HCO3緩衝液中、0.1mMアミデート、0.1mMグルタチオンおよび内部標準としての0.02mM EDANSの最終濃度で実施した。DMF中EDANS-ホスホンアミデートの20mM保存溶液2.5μlを、緩衝液488μlならびにDMFおよび緩衝液1:1混合物中のEDANSの2mM保存溶液5μlとあらかじめ混合した。緩衝液中グルタチオンの10mM溶液5μlを加えることによって反応を開始した。試料10μlを0、15、30、60、120、240および480分の時点で採取し、10mM NaOAc緩衝液(pH5.0)190μlで酸性化し、蛍光HPLC分析にかけた。
さらに、アルキンホスホニトのO-置換基はスキームE2に示すとおり多様で、電子豊富ホスホニトE1~E5を合成した:
ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順
25-mlシュレンク管に267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(1.00mmol、1.00当量)をアルゴン雰囲気下で加え、0℃に冷却し、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量)を滴加した。帯黄色溶液を室温に戻し、さらに30分間撹拌した。5.56mlの1H-テトラゾール溶液(MeCN中0.45M、2.50mmol)に溶解したそれぞれのアルコールを加え、白色懸濁液を室温で終夜撹拌した。反応混合物をシリカゲルフラッシュカラムに直接載せた。
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順」に従い、267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(1.00mmol、1.00当量)、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量)、1.06gの2-(2-ヒドロキシエトキシ)エタン-1-オール(10.00mmol、10.00当量)、5.56mlの1H-テトラゾール溶液(MeCN中0.45M、2.50mmol)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(5%MeOH/CH2Cl2)で精製した。化合物を帯黄色油状物で得た。(112mg、0.421mmol、42.1%)。
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順」に従い、267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(1.00mmol、1.00当量)、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量)、189μlの3-ブチン-1-オール(2.50mmol、2.50当量)、5.56mlの1H-テトラゾール溶液(MeCN中0.45M、2.50mmol)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(10%EtOAc/n-ヘキサン)で精製した。化合物を無色油状物で得た。(152mg、0.774mmol、77.4%)。
電子豊富ホスホニトの非常に安定な性質を、水性溶媒中でアルキン-ホスホニトとのシュタウディンガー-ホスホニト反応を実施することにより、さらに活用した。図24に示すとおり、純粋な水性系においてアルキンホスホニトE1から所望の生成物の生成が観察された。
ペプチドE9
ペプチドE9を、手動カップリングによる直線的合成で標準的なFmoc化学により合成した。0.1mmolのRinkアミド樹脂(subst:0.4mmol/g)を反応容器に加え、合成を5倍のアミノ酸過剰で実施した。Fmoc脱保護を、DMF中20%ピペリジンで5分間の樹脂処理を2回行うことにより達成した。カップリングをDMF中HOBt/HBTU/DIPEA(5当量/5当量/10当量)を加えて45分間反応させることにより達成した。最終Glyカップリングの後、DMF中で5当量の4-アジド安息香酸を5当量のHATUおよび10当量のDIPEAと45分間カップリングした。ペプチドを樹脂から、TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5、重量比)の添加により3時間以内に切断した。その後、ペプチドを氷冷ジエチルエーテルを加えて沈澱させた。沈澱を遠心沈降により回収し、乾燥し、分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法C)により精製した。ESI-MS for C37H50N11O13+ [M+H]+ calcd: 856.36, found 856.36。
100mMトリス-緩衝液(pH9.0)中のペプチドE9の50mM保存溶液10μlを、100mMトリス-緩衝液(pH9.0)80μlに加えた。同じ緩衝液中の500mMホスホニトE1の溶液10μlを加え、800RPM、37℃で2時間振盪した。試料10μlを採取し、90μlのH2O中1%TFAで希釈し、UPLC-MS分析にかけた。
一般手順:5mlのDMF中、1.00mmolの有機アジド(1.00当量)を1.00mmolのアルキニルホスホニト(1.00当量)と共に終夜撹拌した。有機溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカのカラムクロマトグラフィで精製した。この一般手順の後、37mgのジ-(3-ブチニル)エチニルホスホニト(化合物E2)(0.192mmol、1.00当量)および50mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(0.162mmol、1.00当量) を1mlのDMF中で混合し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(70%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物を無色油状物で得た。(55mg、0.147mmol、76.6%)。
O-置換基上の切断可能な基の導入
切断可能なジスルフィドを用いて、還元条件下で特定のペイロードを遊離し得ることが以前に記載されている。例えば、このアプローチは、細胞環境内での抗体薬物コンジュゲート(ADC)からの細胞毒性ペイロードの特異的遊離に適用されている(31)。この状況において、ベータ位に脱離基を有するジスルフィドはジスルフィド切断後にチイランへの環化を起こし、所与のペイロードを遊離することを示すことができよう(32)。
O-置換基上に切断可能な基Rを有する以下の化合物を合成し、切断実験にかけた:
式中、Rは
である。
2-ヒドロキシエチルジスルフィド合成のための一般手順1
250ml丸底フラスコに10mmol(1.00当量)のそれぞれのチオール、10mmolの2-メルカプトエタノール(1.00当量)、0.1mmolのヨウ化ナトリウムおよび20mlのEtOAcを加えた。混合物を急速に撹拌し、10mmolの水中30%H2O2溶液を滴加した。混合物を室温で1時間撹拌し、揮発性物質を減圧下で除去し、ジスルフィドをカラムクロマトグラフィで単離した。
化合物を、前記「2-ヒドロキシエチルジスルフィド合成のための一般手順1」に従い、2.00mlのエタンチオール(27.74mmol、1.00当量)、1.96mlの2-メルカプトエタノール(27.74mmol、1.00当量)、41mgのヨウ化ナトリウム(0.28mmol、0.01当量)および3.14mlの過酸化水素溶液(水性、30%)(27.74mmol、1.00当量)から合成した。ジスルフィドをシリカのカラムクロマトグラフィ(20%EtOAc/ヘキサン)により無色油状物として単離した。収率:2.15g(15.53mmol、56.0%)。
化合物を、前記「2-ヒドロキシエチルジスルフィド合成のための一般手順1」に従い、2.00mlのイソプロピルチオール(21.53mmol、1.00当量)、1.52mlの2-メルカプトエタノール(21.53mmol、1.00当量)、32mgのヨウ化ナトリウム(0.21mmol、0.01当量)および2.44mlの過酸化水素溶液(水性、30%)(21.53mmol、1.00当量)から合成した。ジスルフィドをシリカのカラムクロマトグラフィ(10%EtOAc/ヘキサン)により無色油状物として単離した。収率:1.10g(7.22mmol、33.6%)。
化合物を、前記「2-ヒドロキシエチルジスルフィド合成のための一般手順1」に従い、2.00mlのtert-ブチルチオール(17.74mmol、1.00当量)、1.24mlの2-メルカプトエタノール(17.74mmol、1.00当量)、26mgのヨウ化ナトリウム(0.18mmol、0.01当量)および2.04mlの過酸化水素溶液(水性、30%)(17.74mmol、1.00当量)から合成した。ジスルフィドをシリカのカラムクロマトグラフィ(10%EtOAc/ヘキサン)により無色油状物として単離した。収率:0.90g(5.41mmol、30.5%)。
NMRデータは文献値に一致していた(33)。
500-ml丸底フラスコに2.00mlのチオール酢酸(23.55mmol、1.00当量)および150mlの無水THFを加えた。0℃で、1.60gの水素化アルミニウムリチウム(47.10、2.0当量)を分割して加えた。混合物を室温で1時間撹拌し、再度0℃に冷却し、6N HClで注意深く反応停止した。水相を100mlのEtOAcで2回抽出し、有機分画を集め、乾燥(MgSO4)し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。得られた無色油状物を20mlのEtOHに再溶解し、2.18mlのイソブチルチオール(23.55mmol、1.00当量)、55mgのヨウ化ナトリウム(0.24mmol、0.01当量)および2.70mlの過酸化水素溶液(水性、30%)(23.55mmol、1.00当量)を加えた。帯黄色溶液をさらに1時間撹拌した。揮発性物質を減圧下で除去し、前記ジスルフィドをシリカのカラムクロマトグラフィ(20%EtOAc/ヘキサン)により無色油状物として単離した。収率:1.15g(6. 928mmol、29.4%)。
化合物を以前に発表された手順に従って合成し、橙色固体として単離した(34)。
1H NMR (300 MHz, クロロホルム-d) δ = 8.03 - 7.86 (m, 4H), 7.68 - 7.42 (m, 5H), 4.81 (s, 2H)。NMRデータは文献値に一致していた(34)。
25-mlシュレンク管に267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(1.00mmol、1.00当量)をアルゴン雰囲気下で加え、0℃に冷却し、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量)を滴加した。帯黄色溶液を室温に戻し、さらに30分間撹拌した。5.56mlの1H-テトラゾール溶液(MeCN中0.45M、2.50mmol)に溶解したそれぞれのアルコールを加え、白色懸濁液を室温で終夜撹拌した。反応混合物をシリカゲルフラッシュカラムに直接載せた。
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、116mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(0.44mmol、1.00当量)、0.96mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、0.48mmol、1.10当量)、150mgの2-ヒドロキシエチルエチルジスルフィド(1.10mmol、2.50当量)、2.42mlの1H-テトラゾール溶液(MeCN中0.45M、1.10mmol、2.50当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(10%~20%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物を帯黄色油状物で得た。(112mg、0.34mmol、77.0%)。
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、213mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(0.80mmol、1.00当量)、1.76mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、0.88mmol、1.10当量)、370mgの2-ヒドロキシエチルイソプロピルジスルフィド(2.00mmol、2.50当量)、4.44mlの1H-テトラゾール溶液(MeCN中0.45M、2.00mmol、2.50当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(10%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物を帯黄色油状物で得た。(183mg、0.51mmol、63.9%)。
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、167mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(0.63mmol、1.00当量)、1.38mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、0.69mmol、1.10当量)、260mgの2-ヒドロキシエチルtert-ブチルジスルフィド(1.57mmol、2.50当量)、3.48mlの1H-テトラゾール溶液(MeCN中0.45M、1.57mmol、2.50当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(10%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物を帯黄色油状物で得た。(190mg、0.49mmol、78.5%)。
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(1.00mmol、1.00当量)、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量)、415mgの2-(3-ヒドロキシプロピル)イソプロピルジスルフィド(2.50mmol、2.50当量)、5.55mlの1H-テトラゾール溶液(MeCN中0.45M、2.50mmol、2.50当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(0~10%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物をジアステレオマー混合物として帯黄色油状物で得た。(91mg、0.235mmol、23.5%)。
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(1.00mmol、1.00当量)、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量)、415mgの2-(3-ヒドロキシプロピル)イソプロピルジスルフィド(2.50mmol、2.50当量)、5.55mlの1H-テトラゾール溶液(MeCN中0.45M、2.50mmol、2.50当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(30%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物を無色油状物で得た。(118mg、0.306mmol、30.6%)。
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、98mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(0.37mmol、1.00当量)、0.80mlの臭化エチニルマグネシウム溶液(THF中0.5M、0.4mmol、1.10当量)、195mgの1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-2-フェニルジアゼン(0.93mmol、2.50当量)、2.00mlの1H-テトラゾール溶液(MeCN中0.45M、0.93mmol、2.50当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(0~10%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物を橙色固体で得た。(82mg、0.171mmol、46.3%)。
1.00mmolの有機アジド(1.00当量)を1.00mmolのアルキニルホスホニト(1.00当量)と共に5mlのDMF中で終夜撹拌した。有機溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカのカラムクロマトグラフィで精製した。
化合物を、前記「アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3」に従い、147mgのジ-(2-イソプロピルジスルフィド)エチル)エチニルホスホニト(0.411mmol、1.00当量)および106mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(0.411mmol、1.00当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(60%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物を無色油状物で得た。(80mg、0.175mmol、42.6%)。
化合物を、前記「アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3」に従い、50mgのジ-(2-tert-ブチルジスルフィド)エチル)エチニルホスホニト(0.129mmol、1.00当量)および33mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(0.129mmol、1.00当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(70%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物を無色固体で得た。(29mg、0.0638mmol、47.4%)。
化合物を、前記「アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3」に従い、61mgのジ-((2-イソプロピルジスルフィド)3-プロピル)エチニルホスホニト(0.158mmol、1.00当量)および40mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(0.158mmol、1.00当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(70%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物をジアステレオマーの混合物として無色油状物で得た。(32mg、0.068mmol、43.0%)。
化合物を、前記「アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3」に従い、103mgのジ-(4-アセトキシベンジル)エチニルホスホニト(0.267mmol、1.00当量)および69mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(0.267mmol、1.00当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(70%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物を無色油状物で得た。(36mg、0.077mmol、28.7%)。
化合物を、前記「アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3」に従い、71mgのジ(4-(ジアゾフェニル)-ベンジル)エチニルホスホニト(0.148mmol、1.00当量)および39mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(0.148mmol、1.00当量)から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ(50%EtOAc/ヘキサン)で精製した。化合物を橙色固体で得た。(58mg、0.112mmol、75.8%)。
0.1mmolのNHS-ホスホンアミデート(1.00当量)および0.12mmolの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩(1.20当量)を10mLのDMFに溶解した。0.40mmolのDIPEA(4.0当量)を加え、混合物を室温で3時間撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製混合物を分取HPLCにより、「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法Eを用いて精製した。
化合物を、前記「ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4」に従い、72mgの2-イソプロピル-ジスルフィド-エチル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート(0.157mmol、1.00当量)、54mgの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩(0.188mmol、1.20当量)および109μlのDIPEA(0.628mmol、4.0当量)から合成し、半分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E) により精製した。化合物を白色固体で得た。(62mg、0.102mmol、64.9%)。
化合物を、前記「ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4」に従い、10mgの2-tert-ブチル-ジスルフィド-エチル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート(0.021mmol、1.00当量)、7mgの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩(0.025mmol、1.20当量)および15μlのDIPEA(0.084mmol、4.0当量)から合成し、半分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E) により精製した。化合物を白色固体で得た。(8mg、0.013mmol、62.3%)。
化合物を、前記「ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4」に従い、29mgの2-イソプロピル-ジスルフィド-3-プロピル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート(0.061mmol、1.00当量)、21mgの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩(0.073mmol、1.20当量)および42μlのDIPEA(0.244mmol、4.0当量)から合成し、半分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E) により精製した。化合物をジアステレオマーの混合物として白色固体で得た。(15mg、0.024mmol、39.5%)。
化合物を、前記「ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4」に従い、36mgの4-アセトキシ-ベンジル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート(0.076mmol、1.00当量)、22mgの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩(0.095mmol、1.20当量)および53μlのDIPEA(0.284mmol、4.0当量)から合成し、半分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E) により精製した。化合物を白色固体で得た。(14mg、0.023mmol、30.4%)。
化合物を、前記「ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4」に従い、27mgの4-ジアゾフェニル-ベンジル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート(0.053mmol、1.00当量)、15mgの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩(0.064mmol、1.20当量)および37μlのDIPEA(0.212mmol、4.0当量)から合成し、半分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E) により精製した。化合物を橙色固体で得た。(18mg、0.027mmol、50.9%)。
DMF中のそれぞれのEDANS-ホスホンアミデートの5mM溶液および100mM NH4HCO3-緩衝液(pH8.5)中の前記DABCYL-修飾Cys-ペプチドの5mM溶液の等しい量を新しく調製し、混合して、室温で1時間振盪した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、チオール付加物を半分取HPLC(「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E) により単離した。単離したコンジュゲートを以下の表5および図25に示すとおりHPLC-MSにより分析した。
リン酸緩衝食塩水(PBS)中のそれぞれのペプチド(SM1~3)の1mM保存溶液10μlを、80μlのPBSとあらかじめ混合した。PBS中のトリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン(TCEP)の10mM保存溶液10μlを加え、溶液を37℃で1時間振盪した。その後試料15μlを採取し、水中2%トリフルオロ酢酸(TFA)溶液15μlで希釈し、UPLC-MS分析にかけた。UPLC-MS分析を図26A~Cに示す。赤線はTCEPとのインキュベーション、黒はPBSだけとのインキュベーションを示す。ピークをMSにより同定した。結果は、ジスルフィド含有O-置換基が切断され、EDANS含有部分が出発原料から遊離されることを示している。
PBS中のペプチドSM4の1mM保存溶液10μlを、新しく調製したPBS中のHeLa-溶解物90μlとあらかじめ混合した。溶液を37℃で1時間振盪した。その後試料15μlを採取し、水中2%TFA溶液15μlで希釈し、UPLC-MS分析にかけた。UPLC-MS分析を図27に示す。赤線は細胞溶解物とのインキュベーション、黒はPBSだけとのインキュベーションを示す。ピークをMSにより同定した。結果は、エステル部分を含むリン上のO-置換基が切断され、EDANS含有部分が出発原料から遊離されることを示している。
PBS中のペプチドSM5の1mM保存溶液10μlを、80μlのPBSとあらかじめ混合した。PBS中のTCEPの200mM保存溶液10μlを加え、溶液を37℃で1時間振盪した。その後試料15μlを採取し、水中2%TFA溶液15μlで希釈し、UPLC-MS分析にかけた。UPLC-MS分析を図28に示す。赤線はTCEPとのインキュベーション、黒はPBSだけとのインキュベーションを示す。ピークをMSにより同定した。結果は、ジアゾ部分を含むリン上のO-置換基が切断され、EDANS含有部分が出発原料から遊離されることを示している。
環状細胞透過性ペプチドc(Tat)をeGFPに、ジスルフィド置換ホスホニトとのシュタウディンガー誘導チオール付加によってコンジュゲートした。
c(Tat)-アジドの合成
c(Tat)を0.1mmolスケールでRinkアミド樹脂上、0.78mm/gのローディングで合成した。合成をPTI合成機により、DMF中各アミノ酸の単一カップリング(10当量アミノ酸で40分)で実施した。最終の構築ブロックカップリングの後、まだFmoc保護されたペプチドを4mlの無水DCM中、Pd(PPh3)4(24mg、20μmol、20mol%)およびフェニルシラン(308μl、2.5mmol、2.5当量)で1時間処理して、allocおよびアリル保護基を1段階で切断した。試験切断により完全な脱保護を確認した後、2当量のHATU 4当量のDIPEAによる環化をDMF中で終夜実施した。
精製したc(Tat)-アジドペプチド(5mg、1.9μmol、1当量)を両方のジスルフィド置換ホスホニトと一般プロトコルに従って反応させた。粗製ペプチドを分取逆相C18 HPLCにより精製した。生成物を白色粉末で得、MALDI-TOFにより分析した。
GFP C70M S147Cとの反応
PBS中のeGFP C70M S147C(2.7nmol、1当量)を40μlまで濃縮し、c(Tat)-ホスホンアミデートアルキン(0.05mg、16.2 nmol、6当量)を加えた。反応混合物を37℃、800rpmで終夜振盪した後、MWCOが7kDaのZebaSpinフィルターで精製した。生成物をMALDI-TOFにより分析した。ペプチドE12のコンジュゲーションについて、生成物への約50%の変換が観察されたが、これとは対照的にペプチドE13のコンジュゲーションは完全な変換を示した。
E14のMALDI TOF: 予想生成物 (単位Da): 29919 (M+H+), 14960(M+2H+); 実測 (単位Da): 29933 (M+H+), 14967 (M+2H+)
E15のMALDI TOF: 予想生成物 (単位Da): 29933 (M+H+), 14967 (M+2H+); 実測値 (単位Da): 29940 (M+H+), 14965 (M+2H+)
アジドならびにチオールの複雑な分子、例えば、ペプチドへの組み込みは、以下のスキームに示すとおり、分子内環化を実現し得る分子内シュタウディンガー誘導チオール付加の方法につながる:
BCL9-アジドの合成
BCL9-アジドを0.1mmolスケールでRinkアミド樹脂上、0.78mm/gのローディングで合成した。合成をPTI合成機により、DMF中各アミノ酸の単一カップリング(5当量アミノ酸で40分)で実施した。最後に、ペプチドを樹脂から4mlのTFA:TIS:H2O(95:2.5:2.5)で2時間処理することにより切断し、冷ジエチルエーテル中で沈澱させた。粗製ペプチドを分取逆相C18 HPLC(0~5分:95/5、水(0.1%TFA)/MeCN(0.1%TFA);5~60分:10/90、水(0.1%TFA)/MeCN(0.1%TFA))により精製した。生成物を白色粉末で得(35.0mg、11.5μmol、収率11.5%)、分析UPLC(RP-C18カラム、0.1%TFAを含む5~95%アセトニトリル/水)により分析した。LRMS: m/z: [M+3H]3+ 759.86 (calcd. m/z: 759.6590)。
ペプチド1(20mg、6.55μmol、1当量)を無水DMSO(1.5ml、4.4mM)に溶解した。あらかじめ火炎乾燥したフラスコ中、高真空下で乾燥した後、ビスエトキシアルキン-ホスホニトを反応混合物に加えた(NMRにより決定した生成物のパーセンテージによる量、39.3μmol 、6当量)。反応混合物を50℃に加熱し、24時間撹拌した。水を加えた後、反応混合物を塩基性(10mM酢酸アンモニウム緩衝液pH9.0/MeCN)半分取逆相C18 Nucleodur HPLC(0~5分:95/5、緩衝液/MeCN;5~70分:10/90、緩衝液/MeCN)で精製し、環化生成物を白色粉末で得た(3.82mg、1.22μmol、全収率18.7%)。生成物をエルマン試験でさらに分析し、システインの97%が反応したことが判明した。最終生成物2をLC-UV:室温、5.0分(RP-C18カラムで0~1分:95/5、水(0.1%TFA)/MeCN(0.1%TFA);1~16.5分: 5/95、水(0.1%TFA)/MeCN(0.1%TFA))および質量分析で分析した。LRMS: m/z: [M+3H]3+ 1049.19 (calcd. m/z: 1048.5349)。
BCL9-アジドに対するシュタウディンガー反応
ペプチド3(34mg、11.55μmol、1当量)を無水DMSO(4ml、2.9mM)に溶解した。あらかじめ火炎乾燥したフラスコ中、高真空下で乾燥した後、ビスエトキシビニル-ホスホニトを反応混合物に加えた(NMRにより決定した生成物のパーセンテージによる量、39.3μmol 、6当量)。反応混合物を室温で24時間撹拌した。水を加えた後、反応混合物を分取逆相C18 HPLC(0~5分:95/5、水(0.1%TFA)/MeCN(0.1%TFA);5~60分:10/90、水(0.1%TFA)/MeCN(0.1%TFA))で精製した。生成物を白色粉末で得(14.9mg、4.8μmol、収率41.3%)、分析UPLC(RP-C18カラム、0.1%TFAを含む5~95%アセトニトリル/水)により分析した。LRMS: m/z: [M+4H]4+ 782.89 (calcd. m/z: 782.6660)。生成物4をエルマン試験でさらに分析し、システインの99%が反応したことが判明した。
Claims (23)
- 以下の段階を含む、アルケン-ホスホンアミデートまたはアルキン-ホスホンアミデートの調製方法:
(I)式(III)の化合物
[式中、
は二重結合または三重結合を表し;
Xは、
が三重結合である場合にR3-Cを表すか;または
Xは、
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し;
R1は独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい5員または6員ヘテロ芳香族環を表し;
R3は、HまたはC1~C8アルキルを表し;かつ
R4は、HまたはC1~C8アルキルを表す]
を、式(IV)のアジド
[式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す]
と反応させて、式(V)の化合物
[式中、●、
、R1、およびXは、前記の定義のとおりである]
を調製する段階;
(II)式(V)の化合物を、式(VI)のチオール含有分子
[式中、
は、置換されていてもよいC1~C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す]
と反応させて、式(VII)の化合物
[式中、
は、式(V)の化合物中の
が二重結合を表す場合に結合を表すか;または
は、式(V)の化合物中の
が三重結合を表す場合に二重結合を表し;かつ
、●、R1、およびXは、前記の定義のとおりである]
を生成させる段階。 - 段階(I)の前に段階a)を含む、請求項1記載の方法:
a)式(I)の化合物
[式中、R1は、請求項1の定義のとおりであり;
Halは、Cl、Br、Iからなる群より選択されるハロゲンを表す]
を、アルファ位に二重結合または三重結合を含む式(II)のアルファ不飽和化合物
[式中、
は二重結合または三重結合を表し;
Xは、
が三重結合である場合にR3-Cを表すか;または
Xは、
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し;
R3は、HまたはC1~C8アルキルを表し;かつ
R4は、HまたはC1~C8アルキルを表す]
と反応させて、式(III)の化合物
[式中、
、XおよびR1は、前記の定義のとおりである]
を形成させる段階。 - 段階(I)の前に段階a)を含む、請求項1記載の方法:
式(I')の化合物
[式中、
R5は独立に、C1~C8アルキルを表し;
Halは、Cl、Br、Iからなる群より選択されるハロゲンを表す]
を、アルファ位に二重結合または三重結合を含む式(II)のアルファ不飽和化合物
[式中、
は二重結合または三重結合を表し;
Xは、
が三重結合である場合にR3-Cを表すか;または
Xは、
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し;
R3は、HまたはC1~C8アルキルを表し;かつ
R4は、HまたはC1~C8アルキルを表す]
と反応させて、式(III')の化合物
を形成させ;かつ
該式(III')の化合物をR1-OH
[式中、R1は、請求項1の定義のとおりである]
と反応させて、
式(III)の化合物
[式中、
およびXは前記の定義のとおりであり、かつR1は前記の定義のとおりであるが、個別には選択されない]
を形成させる段階。 - 以下の段階を含む、アルケン-ホスホンアミデートの調製方法:
(I)式(III*)の化合物
[式中、
Vは、C1~C8アルキルを表し;
R1は独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい5員または6員ヘテロ芳香族環を表し;
R3は、HまたはC1~C8アルキルを表し;かつ
R4は、HまたはC1~C8アルキルを表す]
を、式(IV)のアジド
[式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す]
と反応させて、式(V*)の化合物
[式中、●、V、およびR1は、前記の定義のとおりであり;
Xは、(R3R4)Cであり;かつ
R3およびR4は、前記の定義のとおりである]
を調製する段階;
(II)式(V*)の化合物を、式(VI)のチオール含有分子
[式中、
は、置換されていてもよいC1~C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す]
と反応させて、式(VII*)の化合物
[式中、
、●、V、R1、およびXは、前記の定義のとおりである]
を生成させる段階。 - R1が、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1~C8アルコキシ)n、F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1~C8アルキル)H、-NH2、-N(C1~C8アルキル)2、=O、C3~C8シクロアルキル、-S-S-(C1~C8アルキル)、nが1、2、3、4、5もしくは6であるヒドロキシ-(C1~C8アルコキシ)n、C2~C8アルキニル、または置換されていてもよいフェニルのうちの少なくとも1つで置換されていてもよい、C1~C8アルキルを表すか;あるいは
R1が、C1~C8アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1~C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1~C8アルキル)H、-NH2、または-N(C1~C8アルキル)2のうちの少なくとも1つで独立に置換されていてもよい、フェニルを表すか;あるいは
R1が、置換されていてもよい5または6員ヘテロ芳香族環を表す、
請求項1~4のいずれか一項記載の方法。 - R1が独立に、メチル、エチル、プロピル、またはブチルを表す、請求項1~5のいずれか一項記載の方法。
- R1が、ヒドロキシエチルまたはホモプロパルギルを表す、請求項1~5のいずれか一項記載の方法。
- ●が、
置換されていてもよいC1~C8アルキル;
置換されていてもよいフェニル;または
放射性または非放射性核種、ビオチン、レポーター酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、フルオロフォア、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよい5または6員ヘテロ芳香族環を表す、請求項1~12のいずれか一項記載の方法。 - ●が、
構造(VIII)の環状RGDペプチド(c(RGDfK))
[式中、*はN3基の位置を表す];
ビオチン;
CY5またはEDANS;
C1~C8アルキル、C1~C8アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1~C8アルキル)、-N(C1~C8アルキル)2 -COOH、-COO(C1~C8アルキル)、-O-C(O)-(C1~C8アルキル)、-C(O)N-(C1~C8アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1~C8アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4または5つの置換基で置換されていてもよい、フェニル;
C3~C8シクロアルキル;ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3つ~8つの環構成員を有するヘテロシクリル;C1~C8アルコキシ;ハロゲン;-CN;-NO2;-NH2;-N(C1~C8アルキル);-N(C1~C8アルキル)2;-COOH;-COO(C1~C8アルキル);-O-C(O)-(C1~C8アルキル);-CONH2;-C(O)N(C1~C8アルキル)2;-C(O)NH-(C1~C8アルキル);-N(H)-C(O)-(C1~C8アルキル)、フェニル、またはヘテロ芳香族環、単糖、多糖、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、アミノ酸、フルオロフォア、タンパク質タグからなる群より選択される少なくとも1つの置換基(置換基第1世代)で置換されていてもよい、C1~C8アルキルであって、ここで置換基第1世代は、C3~C8シクロアルキル;ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3つ~8つの環構成員を有するヘテロシクリル;C1~C8アルコキシ;ハロゲン;-CN;-NO2;-NH2;-N(C1~C8アルキル);-N(C1~C8アルキル)2;-COOH;-COO(C1~C8アルキル);-O-C(O)-(C1~C8アルキル);-CONH2;-C(O)N(C1~C8アルキル)2;-C(O)NH-(C1~C8アルキル);-N(H)-C(O)-(C1~C8アルキル)、フェニル、またはヘテロ芳香族環(置換基第2世代)でさらに置換されていてもよく、かつここで置換基第2世代は、同じ群から選択される少なくとも1つの置換基でさらに置換されていてもよく、かつここでそのような置換は第3、4、5、6、7、8、9、または10世代まで及んでいてもよい、C1~C8アルキル
を表す、請求項1~12のいずれか一項記載の方法。 - ●が、置換されていてもよいC1~C8アルキルを表すか、または、
●が、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表すか、または、
●が、置換されていてもよいフェニルを表す、
請求項1~12のいずれか一項記載の方法。
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