CN117903297A - 化学选择性的巯基与烯基或炔基磷酰胺的偶联 - Google Patents

化学选择性的巯基与烯基或炔基磷酰胺的偶联 Download PDF

Info

Publication number
CN117903297A
CN117903297A CN202311230447.3A CN202311230447A CN117903297A CN 117903297 A CN117903297 A CN 117903297A CN 202311230447 A CN202311230447 A CN 202311230447A CN 117903297 A CN117903297 A CN 117903297A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alkyl
formula
compound
phenyl
optionally substituted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311230447.3A
Other languages
English (en)
Inventor
H·克里斯蒂安
M·A·卡斯帕
M·格兰仕
T·索尔
D·舒马赫
J·赫尔马-斯梅茨
H·莱昂哈特
A·斯滕格尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungsverbund Berlin FVB eV
Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Original Assignee
Forschungsverbund Berlin FVB eV
Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungsverbund Berlin FVB eV, Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU filed Critical Forschungsverbund Berlin FVB eV
Publication of CN117903297A publication Critical patent/CN117903297A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids RP(=O)(OH)2; Thiophosphonic acids, i.e. RP(=X)(XH)2 (X = S, Se)
    • C07F9/44—Amides thereof
    • C07F9/4461—Amides thereof the amide moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids RP(=O)(OH)2; Thiophosphonic acids, i.e. RP(=X)(XH)2 (X = S, Se)
    • C07F9/44—Amides thereof
    • C07F9/4461—Amides thereof the amide moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/4473—Amides thereof the amide moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of cycloaliphatic amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids RP(=O)(OH)2; Thiophosphonic acids, i.e. RP(=X)(XH)2 (X = S, Se)
    • C07F9/44—Amides thereof
    • C07F9/4461—Amides thereof the amide moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/448—Amides thereof the amide moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of aralkylamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes

Abstract

本发明公开了新颖的偶联物及其制备方法。制备烯基‑或炔基‑磷酰胺的方法，包括如下步骤：(I)式(III)的化合物和式(IV)的叠氮化合物反应以制备式(V)的化合物(II)式(V)的化合物与式(VI)的含巯基分子反应得到式(VII)的化合物

Description

化学选择性的巯基与烯基或炔基磷酰胺的偶联
背景技术
化学选择性反应和生物正交反应已经成为蛋白质位点特异性修饰的有力工具(1,2)。通过这些反应，可以得到各种蛋白质-和抗体-偶联物，它们携带功能性模块，如类似翻译后蛋白修饰的荧光基团和其它光谱标签、聚合物、毒素以及小分子和蛋白质。因此，从蛋白质生物学功能研究和发展新的成像技术，到前景光明的新诊断医学手段、基于蛋白质的药物设计和药物的靶向递送，化学选择的蛋白质修饰技术极大地促进了基础研究。
近年来，研究人员主要关注修饰蛋白质的生物正交反应工程中的两个不同方面(3)。一方面，很多研究致力于快速反应，其要求高活性反应原料以在蛋白质侧链呈现独特的功能(4,5)。伴随着这种方法出现的还有实现位点特异性标记的高级琥珀抑制技术，，从而产生了许多基因编码的、高反应性的生物正交反应器来完成各种类型的环加成反应，包括应变促进的炔-叠氮化物环加成或反需求的狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应(6,7)。另一方面，研究人员已经专注于开发和应用高产率的蛋白修饰反应，特别是如果大量功能性蛋白偶联物和理想的定量转化被要求用来避免繁琐的如果不是不可能的纯化步骤(1)。为了实现这一目标，高产率的蛋白质表达尤为重要。由于琥珀抑制可导致低含量表达的蛋白质，标准和营养缺陷表达系统往往是优选的。结合标准蛋白表达实现位点特异性标记的常用方案是将独特的半胱氨酸(Cys)残基通过位点定向诱变放置在选择的蛋白质中，随后进行半胱氨酸(Cys)修饰(8)。或者，可以利用营养缺陷表达系统插入含叠氮或炔基的氨基酸(9)，这些氨基酸可以使用施陶丁格(Staudinger)连接和铜催化叠氮-炔环加成(CuAAC)进行修饰(10,11)。
虽然这两个方面近年来都已经取得了显著进展，但是对于无金属化学选择性修饰反应，高反应性和复杂功能性模块的通用和模块化可得性仍然是具有挑战性的。这是由于合成反应性生物正交构建模块时需要额外的基团保护操作，由于所用的生物正交功能的高反应性和不稳定性，该操作可能会出现问题。例如，合成一种用于分子成像的携带Xe-隐黄素的高活性含环辛烷的荧光肽，需要利用正交保护基团，操作繁琐但产率低(12)。
2013年，通过将铜催化叠氮-炔环加成反应(CuAAC)与施陶丁格亚磷酸酯反应(Staudinger-phosphonite reaction，SPhR)结合，开发了一种模块化化学选择性方法来分步地将两个叠氮化物构建模块偶联起来(13)。通过硼烷保护的双乙氧基亚烷基-亚磷酸酯，引入SPhR对含水体系中含叠氮肽和蛋白质进行化学选择性标记进而形成蛋白质-磷酸酯偶联物(14)是已知的。
以往的Cys残基偶联技术主要依赖马来酰亚胺偶联，在高浓度硫醇下，马来酰亚胺偶联往往容易水解并发生巯基交换。关于Cys偶联技术的最新综合性综述(22)。WO 2015/169784公开了一种制备C2-二硫化桥联肽和蛋白质的方法，其中桥联是通过与炔烃的巯基-炔-反应来得到的。
US2535174描述了饱和脂肪族硫醇和乙烯基磷酸的碱催化加成反应。然而，现有技术既没有报道过也不曾预测出本文所公开的炔基和烯基磷酰胺的巯基偶联。
定义
本领域技术人员知晓，在本申请中使用的术语“一个(a)”或“一个(an)”可根据具体情况指“一个(1)”“一个(1)或多个”或“至少一个(1)”。
卤素，除非另有规定：指第7主族元素，优选氟、氯、溴和碘，更优选氟、氯和溴，并且与镁(Mg)结合时甚至更优选溴。
烷基，除非另有规定：指具有优选(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-碳原子的饱和直链或支链烃基。例如：甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基，等。
烯基，除非另有定义：指具有双键的不饱和直链或支链烃基。烯基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯基。例如：乙烯基、1-丙烯基、3-丁烯基，等。
炔基，除非另有规定：指具有三键的不饱和直链或支链烃基。炔基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-炔基。例如：乙炔、1-丙炔，等。
烷氧基(烷基自由基-O-)，除非另有规定：指通过氧原子(-O-)连接到基本结构上的烷基自由基。烷氧基优选(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-烷氧基。例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基，等。
类似地，除非另有规定，烯氧基和炔氧基分别是通过-O-连接到基本结构上的烯基自由基和炔基自由基。烯氧基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯氧基。炔氧基优选(C3-C10)-、(C3-C6)-或(C3-C4)-炔氧基。
烷基羰基(烷基自由基-C(＝O)-)，除非另有规定：烷基羰基优选(C1-C8)-、(C1-C6)-烷基羰基。此处，碳原子的数目是指烷基羰基中的烷基自由基。
类似地，除非另有规定，烯基羰基和炔基羰基分别是：通过-C(＝O)-连接到基本结构上的烯基和炔基自由基。烯基羰基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯基羰基。炔基羰基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-炔基羰基。
烷氧基羰基(烷基自由基-O-C(＝O)-)，除非另有规定：烷氧基羰基优选(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-烷氧基羰基。此处，碳原子的数目是指烷氧基羰基中的烷基自由基。
类似地，除非另有规定，烯氧羰基和炔氧羰基分别是：通过-O-C(＝O)-连接到基本结构上的烯基自由基和炔基自由基。烯氧羰基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯氧羰基。炔氧基羰基优选(C3-C8)-、(C3-C6)-或(C3-C4)-炔氧基羰基。
烷基羰基氧基(烷基自由基-C(＝O)-O-)，除非另有规定：指通过羰基氧基(-C(＝O)-O-)经氧原子与基本结构相连的烷基自由基。烷基羰基氧基优选(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-烷基羰基氧基。
类似地，除非另有定义，否则烯基羰基氧基和炔基羰基氧基分别是：通过(-C(＝O)-O-)连接到基本结构上的烯基自由基和炔基自由基。烯基羰基氧基优选为(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯基羰基氧基。炔基羰基氧基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-炔基羰基氧基。
烷基硫基，除非另有规定：指通过-S-连接到基本结构上的烷基自由基。烷基硫基优选(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-烷基硫基。
类似地，除非另有规定，否则烯基硫基和炔基硫基分别是：通过-S-连接到基本结构上的烯基自由基和炔基自由基。烯基硫基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯基硫基。炔基硫基优选(C3-C8)-、(C3-C6)-或(C3-C4)-炔基硫基。
除非另有规定，本文所用术语“取代”指的是非常广泛的取代方式。从本发明的公开中可以看出，尤其是位置R1、和●允许多种有机(大)分子取代。本发明认为，这些分子的结构与本发明的方法和由此产生的偶联物无关。因此，将这一新颖的有创造性的概念的原理仅限定在某些分子上则代表不适当的限制。然而，本发明认为该术语分别是指有机取代基或其盐，其可分别被其它有机取代基或其盐多次取代。本申请中已制备并呈现这些复杂取代基的实例(参见，例如方案5、6、7、11、13、15、19、20、21、22、23及24)。优选地，术语被取代是指被一个或多个取代基取代的基团，所述取代基选自硝基、氰基、Cl、F、Cl、Br、-NH-R、NR2、COOH、-COOR、-OC(O)R-NH2、-OH、-CONH2CONHR、CON(R)2、-S-R、-SH、-C(O)H、-C(O)R、(C1-C20)-烷基、(C1-C20)-烷氧基、(C2-C20)-烯丙基、3-8元的(杂)环(其中，如果出现，所述杂原子或原子独立地选自N、O和S)，具有5到12个环原子的(杂)芳香族系统(例如，苯基、吡啶基、萘基等)，其中R可以再次代表这些取代基中的任何一个，并且所述取代可以重复多次，例如，取代可以重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；参见，例如方案11中的取代基●：其中#表示N3或N的位置，如果●已经是式(VII)的化合物的一部分。然而，本领域技术人员将赞同，被具有40个单元的多糖取代的烷基链不能仅用一般取代模式来描述。
本文所用术语“肽”是指包含两个或两个以上通过肽键(酰胺键)共价连接的氨基酸的有机化合物。肽可根据组成氨基酸的数量命名，即二肽含有两个氨基酸残基，三肽含有三个氨基酸残基，等。含有十个或十个以下氨基酸的肽可称为寡肽，而含有十个以上氨基酸残基的肽为多肽。所述氨基酸可以形成至少一个环或带分支的或未带分支的链或它们的混合物。蛋白质和抗体是肽，因此虽然涵盖在本术语范围内，但由于其重要性可单独命名。
本文所用术语“氨基酸”是指具有-CH(NH3)-COOH基团的有机化合物。在一个实施方案中，术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸：精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸(leicine)、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甘氨酸。然而，该术语广义上也包括非天然存在的氨基酸。
根据本发明的氨基酸和肽也可以用官能团进行修饰。非限制性实例是糖基，例如，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))、或保护基团，例如，芴基甲氧基羰基(Fmoc)-修饰或酯。
术语“蛋白质”是指包含一条或多条氨基酸残基长链的肽。蛋白质在体内和体外发挥着广泛的功能，包括催化代谢反应、DNA复制、对刺激的应答，以及转运分子、催化反应。蛋白质被折叠成特定的三维结构。蛋白质中的残基经常被化学修饰，例如通过翻译后修饰，从而改变蛋白质的物理和化学性质、折叠、稳定性、活性以及最终影响蛋白质的功能。有时蛋白质会附着非肽基团，称为辅基或辅因子。多种蛋白质，包括酶和辅酶，也可以协同工作以发挥一个特定的功能，且它们往往联合形成稳定的蛋白质复合物。所有这些形式都包含在所述术语“蛋白质”中。
本文所用术语“蛋白质标签”系指用于各种目的根据本发明通过连接子连接到蛋白质或其它包含巯基的化合物上的肽序列。蛋白质标签的非限制性示例包括亲和标签、增溶标签、色谱标签表位标签和报告酶。
亲和力标签根据本发明通过连接子附加到蛋白质和其它包含巯基的化合物上，以便它们可以，例如利用亲和力技术被纯化。这些标签包括例如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或聚(组氨酸)标签。
增溶标签可以帮助蛋白质正确折叠，防止沉淀。这些标签包括硫氧化还原蛋白(TRX)和聚(NANP)。一些亲和力标签作为增溶剂具有双重作用，如MBP(麦芽糖结合蛋白)和GST(谷胱甘肽-S-转移酶)。
色谱标签用于改变蛋白质的色谱性质，以在特定的分离技术中提供不同的分辨率。通常，这些标签由聚阴离子氨基酸组成，如FLAG标签。
表位标签是短肽序列，选择它们是因为可以稳定地在许多不同的种群中产生高亲和力抗体。这些标签通常来源于病毒基因。表位标签包括V5标签、Myc标签、HA标签和NE标签。这些标签对于免疫印迹、免疫荧光和免疫沉淀实验以及抗体纯化特别有用。
本文所用术语“报告酶”是指使生化检测中的信号增强的任何已知的酶。非限制性实例是，着色剂形成酶，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或葡萄糖氧化酶(GOX)；荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、氧化还原敏感性GFP(RoGFP)、蓝色荧光蛋白(Azurite)或祖母绿荧光蛋白(Emerald)；荧光素酶，即产生生物发光的一类氧化酶(例如萤火虫荧光素酶(EC 1.13.12.7))；氯霉素乙酰转移酶(CAT)；β-半乳糖苷酶；或β-葡萄糖醛酸酶。
蛋白质标签的非限制性示例有：Avi标签，一种使蛋白质被BirA酶生物素化因而可以通过链霉亲和素分离所述蛋白质的肽(GLNDIFEAQKIEWHE)；钙调蛋白标签，一种被钙调素蛋白结合的肽(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)；聚谷氨酸标签，一种能有效结合到阴离子交换树脂(如Mono-Q)的肽(EEEEEE)；E标签，一种被抗体识别的肽(GAPVPYPDPLEPR)；FLAG标签，一种被抗体识别的肽(DYKDDDDK)；HA标签，一种被抗体识别的、来源于血凝素的肽(YPYDVPDYA)His标签，通过镍或钴螯合物结合的5-10个组氨酸(HHHHHH)；Myc标签，一种被抗体识别的、源于c-myc的肽(EQKLISEEDL)；NE标签，一种被单克隆IgG1抗体识别的、新颖的18氨基酸合成肽(TKENPRSNQEESYDDNES)，其可应用于包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附、流式细胞术、免疫细胞化学、免疫沉淀和重组蛋白亲和纯化在内的广泛范围内；S标签是一种来源于核糖核酸酶A的肽(KETAAAKFERQHMDS)；SBP标签，一种与链霉亲和素结合的肽(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)；Sof标签1，用于哺乳动物表达(SLAELLNAGLGGS)；Sof标签3，用于原核表达(TQDPSRVG)；Strep标签，一种与链霉亲和素或被称为链球菌素(streptactin)的改良链霉亲和素结合的肽(Strep标签II:WSHPQFEK)；TC标签，一种被FIAsH和ReAsH双砷化合物识别的四环素标签(CCPGCC)；V5标签，一种由抗体识别的肽(GKPIPNPLLGLDST)；VSV标签，一种由抗体识别的肽(YTDIEMNRLGK)；Xpress标签(DLYDDDDK)；异pep标签(isopeptag)，一种共价结合至pilin-C蛋白的肽(TDKDMTITFTNKKDAE)；Spy标签，一种共价结合至SpyCatcher蛋白的肽(AHIVMVDAYKPTK)；Snoop标签，一种共价结合至Snoopcatcher蛋白的肽(KLGDIEFIKVNK)；BCCP(生物素羧基载体蛋白)，一种被BirA生物化从而能够被链霉亲和素识别的蛋白结构域；谷胱甘肽-S-转移酶标签，一种结合至固定化谷胱甘肽的蛋白；绿色荧光蛋白标签，一种自发荧光的且可被纳米体结合的蛋白质；Halo标签，一种共价结合至HaloLinkTM树脂(Promega)的突变水解酶；麦芽糖结合蛋白标签，一种结合至直链淀粉琼脂糖的蛋白质；Nus标签，硫氧化还原蛋白标签，Fc标签，源自免疫球蛋白Fc结构域，使蛋白质二聚化和增溶。可用于在蛋白质A琼脂糖凝胶上的纯化，人工设计的固有无序标签含有促进无序的氨基酸(P、E、S、T、A、Q、G、……)，碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)葡萄糖氧化酶(GOX)，绿色荧光蛋白(GFP)，氧化还原敏感性GFP(RoGFP)，蓝色荧光蛋白(Azurite)，祖母绿荧光蛋白(Emerald)，萤火虫荧光素酶(EC 1.13.12.7))，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖醛酸酶，微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL)。
如本文所用，术语“抗体”意在指免疫球蛋白分子，优选由四条多肽链组成，其中两条重(H)链和两条轻(L)链，它们通常由二硫键相互连接。每条重链由重链可变区(本文简称VH)和重链恒定区组成。重链恒定区域可以包括例如三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链由一个轻链可变区(本文简称VL)和一个轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，与更保守的区域(称为框架区(FR))穿插。每个VH和VL通常由三个CDR和最多四个FR组成，它们例如按以下顺序从氨基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所用，术语“互补决定区”(CDRs；例如，CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在对于抗原结合是至关重要的。每个可变结构域通常有三个CDR区，分别标识为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可包含来自Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(例如，轻链可变区中的大约位于24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位的残基，重链可变区中的大约位于31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位的残基；和/或来自“高度可变环”的那些残基(例如，轻链可变区中的大约位于26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位的残基以及重链可变区中大约位于26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位的残基)。在某些情况下，互补决定区可以同时包括来自Kabat所定义的CDR区和高度可变环的氨基酸。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可以被分为不同的“类”。完整抗体分为五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步分为“亚类”(异型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在本发明中使用的免疫球蛋白的优选类别是IgG。
对应于不同类抗体的重链恒定区分别称为[α]、[δ]、[ε]、[γ]和[μ]。不同种类免疫球蛋白的亚单位结构和三维结构是众所周知的。本文所用的抗体为本领域已知的抗体及其功能性片段。
抗体/免疫球蛋白的“功能性片段”或“抗原结合抗体片段”在本文定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如，IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常位于抗体的一个或多个高度可变区中，例如，CDR1、-2和/或-3区；然而，可变“框架”区也可以在抗原结合中起重要作用，例如通过为CDRs提供支架。优选地，“抗原结合区”至少包含可变轻(VL)链的4到103个氨基酸残基和可变重(VH)链的5到109个氨基酸残基，更优选包含VL的3到107个氨基酸残基和VH的4到111个氨基酸残基，尤其优选包含完整的VL和VH链(VL的1到109个氨基酸位点和VH的1到113个氨基酸位点；氨基酸根据WO 97/08320编号)。
本发明的“功能性片段”、“抗原结合抗体片段”或“抗体片段”包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2及Fv片段；双体；单域抗体(DAbs)、线性抗体；单链抗体分子(scFv)；及由抗体片段构成的多特异性例如双特异性及三特异性抗体。显而易见地，除“多特异性”或“多功能性”抗体外，抗体的每个结合位点相同。F(ab’)2或Fab可以通过工程化来减小或完全去除CH1和CL结构域之间的分子间二硫的相互作用。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，该区域至少包含恒定区的一部分。该术语包括原生序列Fc区域和变异Fc区域。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区域从Cys226或Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区域的C末端赖氨酸(Lys447)可能存在，也可能不存在。除非本文另有规定，否则Fc区或恒定区氨基酸残基依据欧盟编号系统，也称为欧盟指数编号。
本发明所涵盖的抗体变体或抗原结合抗体片段变体是指保持了抗体或抗原结合抗体片段结合活性的分子。
本发明中所涵盖的“结合蛋白”是例如类抗体，例如亲和体(Affibodies))、Adnectins、抗运载蛋白(Anticalins)、预设计锚蛋白重复蛋白(DARPins)、高亲和性多聚体(Avimers)和纳米体(Nanobodies)。
“人”抗体或其抗原结合片段被定义为非嵌合的(例如，非“人源化的”)且非(全部或部分)源于非人类物种。人抗体或其抗原结合片段可以源自人类或可以为合成的人抗体。本文将“合成人抗体”定义为一种抗体，其具有的序列全部或部分源自基于已知人类抗体序列分析的计算机模拟的合成序列。例如通过分析人抗体或抗体片段序列的数据库并利用从中获得的数据设计多肽序列，从而实现计算机模拟设计人抗体序列或其片段。人抗体或其抗原结合片段的另一实例是由提取自人源抗体序列库(例如，该库基于取自人的天然来源的抗体)的核酸编码的人抗体或其抗原结合片段。
“人源化抗体”或其人源化抗原结合片段在本文中被定义为一种抗体(i)源自非人类来源的(例如，具有异源免疫系统的转基因小鼠)，该抗体基于人种系序列；(ii)其中非人抗体的框架区的氨基酸通过基因工程部分替换为人的氨基酸序列的或(iii)CDR移植的，其中可变区的CDR来自非人源，而可变区的一个或多个框架为人源的，且恒定区(如果有的话)为人源的。
本文将“嵌合抗体”或其抗原结合片段在本文中被定义为一种抗体，其中可变结构域源自非人源，而部分或所有恒定结构域源自人源。
本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体群中获得的抗体，即，除可能少量存在的可能的突变例如自然发生的突变外，组成该群的单个抗体都是相同的。因此，术语“单克隆的”表明抗体的特征为非离散抗体的混合物。与通常包括针对不同决定因子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每一个单克隆抗体针对抗原上的单个决定因子。除其特异性外，单克隆抗体制剂的优势在于它们通常不被其他免疫球蛋白污染。术语“单克隆的”不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。术语单克隆抗体具体包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
一种“分离的”抗体是一种已经被识别出来并从表达它的细胞成分中分离出来的抗体。细胞的污染物成分是会干扰抗体诊断或治疗用途的物质，可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶解物。
如本文所用，抗体“特异性地结合至”是指“特异性结合至/针对”或“特异性地识别”目标抗原，例如肿瘤相关多肽抗原靶点，是一种以足够亲和力结合抗原的抗体，使得抗体可用作靶向表达所述抗原的细胞或组织的治疗剂，且不与其他蛋白质发生明显的交叉反应或者也不与除上述抗原靶点的直系同源物和变体(例如突变型、剪接变体或蛋白水解截短型)以外的蛋白质发生显著的交叉反应。本文所用的术语“特异性识别”或“特异性地结合至”或“特异性结合至/针对”特定多肽或特定多肽靶点上的表位例如可以通过抗体或其抗原结合片段来表现，所述抗体或抗原结合片段对抗原的单价KD小于约10-4M，或者小于约10- 5M，或小于约10-6M，或小于约10-7M，或小于约10-8M，或小于约10-9M，或小于约10-10M，或小于约10-11M，或小于约10-12M，或更小。如果抗体能够将抗原和一个或多个参考抗原区分开，则该抗体“特异性地结合至”、“特异性结合至/针对”或“特异性识别”该抗原。在其最常见的形式中，“特异性地结合至”、“特异性结合至/针对”或“特异性识别”是指抗体区分目标抗原和不相关抗原的能力，例如，根据以下方法之一确定。这些方法包括但不限于表面等离子体共振(SPR)、蛋白质印迹、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫印迹试验(ECL)、免疫放射分析(IRMA)和肽扫描。例如，可以进行标准的酶联免疫吸附测定。可以通过标准显色法进行评分(如辣根过氧化物酶二级抗体和双氧水四甲基联苯胺)。某些孔中的反应例如由450nm处的光密度来评分的。典型的背景(＝阴性反应)可以是0.1OD；典型的阳性反应可以是1OD。这意味着正/负差异大于5倍、10倍、50倍，优选大于100倍。通常，不使用单一参考抗原进行结合特异性的测定，而是使用一组大约三到五个不相关的抗原，如奶粉、牛血清白蛋白、转铁蛋白等。
“结合亲和力”或“亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合伴侣之间总的非共价相互作用的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。离解常数“KD”通常用于描述分子(如抗体)与其结合伴侣(如抗原)之间的亲和力，即配体与特定蛋白质结合的紧密程度。配体蛋白亲和力受两个分子间非共价相互作用的影响。亲和力可藉由本领域已知的常用方法，包括本文所述方法来测定。在一个实施方案中，根据本发明的“KD”或“KD值”通过使用合适的设备(包括但不限于Biacore T100、Biacore T200、Biacore 2000、Biacore 4000、Biacore 3000(通用电气医疗Biacore有限公司)或ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories有限公司)利用表面等离子体共振分析来测定的。
本文所用术语“核苷”和“核苷部分”是指一类包含糖基和杂环碱基的核酸亚单位，以及该亚单位的类似物，例如经修饰或自然产生的脱氧核糖核苷或核糖核苷或其任何化学修饰。其他基团(例如，保护基团)可以附加到核苷的任何组分上。核苷的修饰包括但不限于2′-、3′-和5′-位的糖修饰，5-位和6-位的嘧啶修饰，2-位、6-位和8-位的嘌呤修饰，环外胺修饰，5-溴尿嘧啶取代，等等。核苷可以被适当地保护和衍生，从而能够用本领域已知的方法合成寡核苷酸，如使用核苷磷酰胺单体的固相自动合成法、H-磷酸耦合或磷酸三酯耦合。
“核苷酸”或“核苷酸部分”指的是一类包含磷酸基、糖基和杂环碱基的核酸亚单位，以及该亚单位的类似物。其他基团(例如，保护基团)可以附加到核苷酸的任何组分上。术语“核苷酸”可以指经修饰或自然产生的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在一些情况中，核苷酸包含嘌呤类和嘧啶类，包括胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶。术语“核苷酸”意在包括那些部分，其不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、或尿嘧啶(U)，而且也含有其他经修饰的杂环碱基。这样的修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶，酰基化嘌呤或嘧啶酰化，烷基化核糖或其它杂环化合物。这样的修饰包括，例如，二氨基嘌呤及其衍生物、肌苷及其衍生物、烷基化嘌呤或嘧啶、酰基化嘌呤或嘧啶巯基化嘌呤或嘧啶，等等，或加保护基，如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、9-芴甲氧羰基、苯氧乙酰基、二甲基甲酰胺、二丁基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N，N-二苯基氨基甲酸酯，等等。嘌呤或嘧啶基也可以是前述基团的类似物；适合的类似物是本领域技术人员已知的，且记载在有关的教科书和文献中。常见的类似物包括但不限于：1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊基腺嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)尿嘧啶、5-(羧基甲基氨基甲基)-尿嘧啶、2-巯基尿嘧啶、5-甲基-2-巯基尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、肌苷、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-巯基嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指一类由多个如上文所定义的连接的核苷酸单元形成的多核苷酸。所述核苷酸单元各自包括通过磷酸连接基团或其类似物连接在一起的核苷单元。术语寡核苷酸还指通过除磷酸连接基团以外的连接基团(例如硫代磷酸酯连接基团或方酰胺连接基团)连接在一起的多个核苷酸。所述寡核苷酸可以是自然产生的，也可以是非自然产生的。在某些情况下，所述寡核苷酸可能包含核糖核苷酸单体(即，可以是核糖核苷酸)和/或脱氧核糖核苷酸单体。
本文所用术语“单糖”系指具有通式Cm(H2O)n的开链或环状化合物，其中m是3、4、5、6、7或8且n是2、3、4、5、6、7或8。然而，该术语还包括这些基本化合物的衍生物，其中一个羟基(OH)被一个氨基(NH2)取代(例如氨基葡萄糖)，脱氧糖，其中至少一个羟基(OH)被氢原子(H)取代(例如脱氧核糖)。单糖的优选实例为D-(+)-甘油醛；D-(-)-赤藓糖；D-(-)-苏糖；D-(-)-核糖；D-(-)-阿拉伯糖；D-(+)-木糖；D-(-)-来苏糖；D-(+)-阿洛糖；D-(+)-阿卓糖；D-(+)-葡萄糖；D-(+)-甘露糖；D-(-)-葡萄糖；D-(-)-艾杜糖；D-(+)-半乳糖；D-(+)-塔罗糖；二羟基丙酮；
D-赤鲜酮糖；D-核酮糖；D-木酮糖；D-阿洛酮糖；D-果糖；D-山梨糖；D-塔格糖。所述术语单糖还包括1个、2个、3个或4个羟基被取代的单糖。
术语“多糖”是指包含至少二个(2)，优选至少五个(5)，更优选至少十个(10)个单糖的分子，这些单糖通过糖苷键连接。
本文所用的碳水化合物包含单糖和多糖及其衍生物。
本文所用的聚合物是指由许多重复的有机亚单位组成的大分子，但这些亚单位不是多糖、寡核苷酸或肽。聚合物的实例是聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PEO)或聚甘油(例如聚甘油-聚蓖麻酸酯(PGPR)。
术语“荧光团”为本领域技术人员所熟知，是指在受到光激发时重新发光的化合物。非限制性实例为CY5、5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸(EDANS)、黄嘌呤衍生物(例如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、伊红、德克萨斯红)、菁衍生物(例如吲哚碳菁、草酸碳菁、份菁)、方酰胺衍生物(例如Seta染料、Se Tau染料、方形染料)、萘衍生物(例如丹磺酰或prodan衍生物)、香豆素衍生物、恶二唑衍生物、蒽衍生物(例如，蒽醌类如DRAQ5、DRAQ7、CyTRAK橙)、芘衍生物(例如，级联蓝)、恶嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫)、吖啶衍生物(例如，二氨基吖啶、吖啶橙、吖啶黄)、芳基甲基衍生物(例如，金胺、结晶紫、孔雀绿)、或四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁、胆红素)。
本文所用术语“脂肪族或芳香族残基”是指脂肪族取代基，例如烷基残基，然而该烷基残基可进一步被脂肪族和/或芳香族取代基取代，例如脂肪族残基可以是核酸、肽、蛋白质、酶、同工酶、抗体、核苷酸、寡核苷酸、单糖、多糖、聚合物、荧光团、任意取代的苯等，只要该分子与核心结构的直接连接(对R1而言，例如与式(III)或(V)化合物的相应氧的连接)是脂肪族的。芳族残基是指与核心结构的直接连接是芳族系统的一部分的取代基，例如被任意取代的苯基或吡啶基或肽，如果肽与核心结构的直接连接例如是经由苯基残基。
术语“抗体药物偶联物”或缩写ADC为本领域技术人员所熟知，并且，如本文所用，是指抗体或其抗原结合片段与药物(例如化疗药剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针，等)的连接。如本文所用，“连接子”是将抗体或其抗原结合片段共价连接到药物的任何化学部分。如本文所用，术语“连接子药物偶联物”是指包含或包括如前文所定义的连接子以及药物的分子或化学基团。在这点上，术语“连接子药物偶联物”一般是指抗体药物偶联物的一部分，其不是抗体或其抗原结合片段。通常，在连接子药物偶联物中，所述连接子与所述药物共价连接。
本文亦描述“抗体荧光团偶联物”或简称AFC，其是指抗体或其抗原结合片段与荧光团(例如Cy5)的连接。荧光团可通过连接子(例如上文的抗体药物偶联物中所述的连接子)连接到抗体或其抗原结合片段。所述抗体荧光团偶联物可以包含“连接子荧光团偶联物”。如本文所用，术语“连接子荧光团偶联物”是指包含或包括如前文所定义的连接子的分子或化学基团以及荧光团。在这点上，术语“连接子荧光团偶联物”一般是指抗体药物偶联物的一部分，其不是抗体或其抗原结合片段。通常，在连接子荧光团偶联物中，连接子与荧光团共价连接。
附图简要说明
图1：显示在酸性条件下谷胱甘肽-磷酰胺偶联物的水解衰减；
图2：显示pH8.5处反应中与谷胱甘肽反应的N-苯基炔基磷酰胺乙酯的消耗量；
图3：显示施陶丁格诱导的环叠氮-RGD-肽与GSH的巯基加成反应；
图4：显示c(RGDfK)-谷胱甘肽的pH稳定性；
图5：施陶丁格诱导的含有巯基的eGFP的硫醇加成反应；
图6：双乙氧基炔基-亚磷酸酯粗品的合成；
图7：显示c(RGDfK)-叠氮化物的UPLC色谱图；
图8：显示c(RGDfK)-炔基的色谱图；
图9：显示c(RGDfK)-谷胱甘肽的色谱图；
图10：方案7中的蛋白质印迹分析图；
图11：随着时间的推移乙基-N-苯基-P-乙烯基磷酰胺在不同pH下的稳定性；
图12：随着时间的推移谷胱甘肽磷酰胺加成物在不同pH下的稳定性；
图13：pH8.5下，在与谷胱甘肽的反应中，各种N-苯基乙烯基磷酰胺的消耗量；
图14：方案23的蛋白质印记分析图；
图15：显示整个说明书中提到的序列；
图16：显示A：用三种不同的Cys反应性生物素衍生物对曲妥珠单抗进行修饰；B：蛋白质印迹分析；通道1和5：未经处理的抗体；通道2-4：DTT预处理的反应；通道6-8：未经DTT预处理的对照反应；
图17：示出用磷酸酰胺修饰的、组织蛋白酶可裂解的MMAF(磷酰胺-VC-PAB-MMAF)修饰曲妥珠单抗；A：链间二硫键的还原和烷基化反应方案；B：反应的SDS-PAGE分析；C：PNGase F去甲酰化和DTT还原后的抗体片段的质谱图的反卷积；LC：轻链；HC：重链；mod：磷酸酰胺-VC-PAB-MMAF；
图18：示出在两种不同的Her2过表达细胞系(BT474和SKBR3)和一种对照细胞系(MDAMB468)上，MMAF-连接的曲妥珠单抗的抑制增殖能力增强；
图19：示出UPLC-UV检测的磷酰胺-Val-Cit-Pab-MMAF的纯度；
图20：示出细胞表面受体Her2过度表达的细胞(BT474和SKBR3)或Her2低表达的细胞(MDAMB468)固定后的免疫染色；比例尺代表10μm；
图21：A：磷酰胺连接的FRET偶联物的结构；B：马来酰亚胺连接的FRET偶联物的结构；C：基于荧光淬灭的读出原理；D：随着时间的推移检测到的荧光增强；E：在暴露于PBS中1000eq.谷胱甘肽期间，磷酰胺连接的和马来酰亚胺连接的染料猝灭剂对的比较；
图22：示出抗体修饰向血清蛋白的转移；A：在37℃下，浓度3μM的曲妥珠单抗生物素偶联物在PBS中用500μMBSA孵化；B：通过蛋白质印记分析监测生物素向白蛋白的转移；通道1：未经处理的马来酰亚胺偶联物；通道2-5：暴露于BSA 0、1、2和5天后的马来酰亚胺加合物的分析；通道6：未处理的酰胺偶联物。通道6-10：暴露于BSA 0、1、2和5天后的酰胺加合物的分析；
图23：示出巯基加成反应的二级速率常数的测定；A：EDANS磷酰胺与谷胱甘肽的反应；B：反应时间30分钟后荧光HPLC示踪；C：监测磷酰胺随时间的减少；D：反向浓度与反应时间的关系图；误差条代表三次重复的平均值(n＝3)；
图24：示出叠氮修饰肽与水溶性亚磷酸酯E1在Tris缓冲液中的反应；
图25：表5的偶联物的HPLC-MS分析；
图26：用TCEP裂解具二硫键的酰胺加成物的UPLC-MS分析结果；
图27：用细胞裂解液裂解包含酯的酰胺加成物的UPLC-MS分析结果；
图28：用连二亚硫酸钠裂解包含二氮的酰胺加成物的UPLC-MS分析结果；
图29：示出炔基-c(Tat)和eGFPC70M S147C的巯基加成反应。
发明详述
本发明提供一种在(未保护的)肽、蛋白质例如酶和辅酶(例如辅酶A)、抗体或其他含巯基化合物中的Cys残基与烯基或炔基磷酰胺的新的化学选择性反应。在一个实施方案中，所述肽、蛋白质、抗体或其他含巯基化合物是未保护的。在另一个实施方案中，所述烯基或炔基磷酰胺是缺电子的烯基或炔基磷酰胺。所产生的偶联物没有被以前的文献报道过。
方案1以乙烯基或乙炔基亚磷酸酯为例描述了根据本发明的合成的一般策略。R1代表任选取代的脂肪族或芳香族残基：
方案1
方案2显示了本领域已知的方法(例如，15)和本发明的方法之间的区别A)利用炔基亚磷酸酯的顺序叠氮-叠氮偶合；B)施陶丁格诱导的巯基加成(所述巯基加成也可以表示为“迈克尔加成”，例如在方案2B中)用于根据本发明的Cys残基修饰。采用乙烯基和乙炔基(二乙基)亚磷酸酯仅作为示例目的：
方案2
递交的本文所述的方法允许在R1 和●位置处合并大量不同的有机化合物。
此外，本发明涉及两个复杂分子的生物偶联方法：化学选择性反应，其诱导偶联到蛋白质的第二化学选择性反应。该概念基于叠氮构建模块通过施陶丁格亚磷酸酯反应(SPhR)与未保护的炔基或烯基亚磷酸酯产生优选缺电子双键或三键(方案1和方案2B)的独特反应性。由此产生的亲电系统随后可用于与含巯基的蛋白质和抗体或其它含巯基化合物反应，得到功能性偶联物如抗体或蛋白质偶联物。
所附结果表明：
·不同的烯基和炔基亚磷酸酯的合成
·(化学选择性的)与烯基和炔基亚磷酸酯的施陶丁格反应
·烯基或炔基磷酰胺与含有巯基的分子(包括小分子、肽、蛋白质和抗体)的偶联反应
·炔基磷酰胺在含水体系中的巯基加成反应显示出对Z-产物的形成具有很高的非对映选择性
·在生理相关条件下这些偶联物的稳定性
·包含可裂解基团的偶联物的合成
本发明的特征在于以下几个创新方面，这进一步使偶联物，如抗体或蛋白质偶联物，特别是具有复杂有效载荷和包含多个功能性基团的标签的抗体或蛋白质偶联物，具有新的偶联物化学的抗体或蛋白质偶联物的获得变得容易：
·一种修饰小分子、聚合物、蛋白质和抗体中的巯基的新反应
·Cys部分前所未见的化学结构
·两个复杂分子(例如肽和蛋白质或肽和抗体)能够通过直接的分步化学选择性偶联结合在一起
·在安装化学选择性手柄(即，优选缺电子的烯基或炔基磷酰胺)或化学选择性偶联后，无需进行最终保护基团操作
·具有高度可变性的连接子(P-取代基能够改变，磷中心的各种O-取代基，包含可裂解基团的O-取代基)
·与常见的马来酰亚胺试剂相反，偶联物具有高稳定性；快速的偶联反应
·巯基加成至炔基磷酰胺的立体选择性高
一般而言，根据本发明的所述方法可用于将不同的化合物，例如小分子(例如任意取代的烷基、苯基或杂环)、蛋白质、抗体、寡核苷酸或多糖与标签、蛋白质寡核苷酸等偶联。为实现该偶联，本发明在第一方面涉及一种制备式(VII)的偶联物的方法，所述方法包括如下步骤：
(I)式(III)的化合物
其中
代表双键或三键；
当是三键时，X代表R3-C
(这样，所述结构为)；或
当是双键时，X代表(R3 R4)C
(这样，所述结构为)；/>
R1独立地代表任意取代的脂肪族或芳香族残基，例如苯基；被(C1-C8-烷氧基)n，其中n是1、2、3、4、5或6，被F，被Cl，被Br，被I，被-NO2，被-N(C1-C8-烷基)H，被＝O，被C3-C8-环烷基，被任意取代的苯基取代的C1-C8-烷基取代，如，
或任意独立地被C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2、取代苯基取代；或5-或6-元杂芳香系统例如吡啶基；优选C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基、苯基或-NO2取代的苯基；
或
其在氮环原子中的一个可以再次被生物素或任何其它肽、蛋白如酶或辅酶(例如辅酶A)、抗体、蛋白标签、荧光团、寡核苷酸或多糖取代，且其中#代表O的位置；
R3代表H或C1-C8-烷基；
R4代表H或C1-C8-烷基；
与式(IV)的叠氮化合物反应
其中
●代表脂肪族或芳香族残基；
以制备式(V)的化合物
/>
其中●、R1和X如前所定义。
(II)式(V)的化合物与式(VI)的含巯基分子反应
其中代表任意取代的C1-C8-烷基、任意取代的苯基、任意取代的芳香5-或6-元杂环系统、氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖基、多糖、核苷酸、寡核苷酸或聚合物；
形成式(VII)的化合物
其中
如果在式(V)的化合物中代表双键，那么/>代表化学键；
或
如果在式(V)的化合物中代表三键，那么/>代表双键；
并且
●、R1和X如前所定义。
本发明还涉及一种方法，该方法包括在上述方法的步骤(I)之前的步骤(a)。因而，该方法包括如下步骤：
a)式(I)的化合物
其中R1和Hal如前所定义；
与在α位置上包含双键或三键的式(II)的α-不饱和化合物反应
其中
代表双键或三键；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X代表(R3 R4)C；
R3代表H或C1-C8-烷基；和
R4代表H或C1-C8-烷基；
以形成式(III)的化合物
其中
X和R1如前所定义；
或者，式(I’)的化合物
其中
R5独立地代表C1-C8-烷基；
Hal代表卤素，选自Cl、Br和I，优选Cl；
与在α位置上包含双键或三键的式(II)的α-不饱和化合物反应
其中
代表双键或三键；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X代表(R3 R4)C；
R3代表H或C1-C8-烷基；且
R4代表H或C1-C8-烷基；
以形成式(III’)的化合物
并且式(III’)的所述化合物与R1-OH反应以形成式(III)的化合物
其中
和X如前所定义，R1如前所定义但不作特定选择；
(I)式(III)的化合物与式(IV)的叠氮化合物反应
其中
●代表脂肪族或芳香族残基；
以制备式(V)的化合物
其中
●、R1和X如前所定义；
(II)式(V)的化合物与式(VI)的含巯基分子反应
其中代表任意取代的C1-C8-烷基、任意取代的苯基、任意取代的芳香5-或6-元杂环系统、氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖基、多糖、核苷酸、寡核苷酸或聚合物；
形成式(VII)的化合物
其中
如果在式(V)的化合物中代表双键，那么/>代表化学键；或
如果在式(V)的化合物中代表三键，那么/>代表双键；并且/>●、R1和X如前所定义。
优选地，在该方法中代表三键。
在一个实施方案中，式(III)的化合物的P原子，优选地其中代表双键，在施陶丁格反应之前能够被BH3保护(例如为了纯化的目的)，且在施陶丁格反应前能够容易地脱保护：
b)式(III)的化合物
其中X和R1如前所定义；
与BH3反应形成式(III’)的化合物
其中X和R1如前所定义。
通过加入弱碱例如DABCO(1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷＝三乙基二胺(TEDA))可以很容易地实现式(III’)化合物的硼烷保护的亚磷酸酯的脱保护以形成反应性P(III)物质。
式(III)的化合物也可以从PCl3起始来合成：
其中R1如本文中的定义。
本文所述的方法也可以采用式(III*)的化合物替代式(III)的化合物来进行
其中V代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基或丙基，更优选甲基；R1、R2和R3如前述式(III)化合物中所定义。可以利用式(II*)的化合物来制备式(III*)的化合物
其中V、R3和R4如本文中所定义。
一种根据本发明的以式(III*)的化合物和式(VII*)的化合物形成式(V*)的化合物的方法
其中V代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基或丙基，更优选甲基；●和R1如式(V)化合物中所定义；
其中V代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基或丙基，更优选甲基；●、和R1如式(VII)化合物中所定义。本文所述方法的用于制备式(V)和(VII)的化合物的所有步骤可以类似地用于制备式(V*)和(VII*)的化合物。
因此，本发明还涉及制备烯基磷酰胺的方法，所述方法包括如下步骤：
(I)式(III)的化合物
其中
V代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基或丙基，更优选甲基；
R1独立地代表任意取代的脂肪族或芳香族残基，例如苯基；被(C1-C8-烷氧基)n，其中n是1、2、3、4、5或6，被F，被Cl，被Br，被I，被-NO2，被-N(C1-C8-烷基)H，被
＝O，被C3-C8-环烷基，被任意取代的苯基取代的C1-C8-烷基，如，
或任意独立地被C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2、取代苯基取代；或5-或6-元杂芳香系统例如吡啶基；优选C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基、苯基或–NO2取代的苯基；或
其在含氮环上原子中的一个可以再次被生物素或任何其它肽、蛋白如酶或辅酶(例如辅酶A)、抗体、蛋白标签、荧光团、寡核苷酸、或多糖取代，且其中#代表O的位置；R3代表H或C1-C8-烷基；
R4代表H或C1-C8-烷基；
与式(IV)的叠氮化合物反应
其中
●代表脂肪族或芳香族残基；
以制备式(V*)的化合物
其中●、V、和R1如前所定义；
X是(R3 R4)C；且
R3和R4如前所定义；
(II)式(V*)的化合物与式(VI)的含巯基分子反应
其中代表任意取代的C1-C8-烷基、任意取代的苯基、任意取代的芳香5-或6-元杂环系统、氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖基、多糖、核苷酸、寡核苷酸或聚合物；
形成式(VII*)的化合物；
其中
●、V、R1和X如前所定义。/>
本发明的一个实施方案还涉及式(V*)和式(VII*)的化合物。
在本文所述的本发明方法中，不要求步骤(I)中获得的用于在步骤(II)中与式(VI)的含巯基的分子反应的化合物(V)或(V*)与化合物(V)或(V*)具有完全相同的结构。从这点上说，在步骤(II)中化合物(V)或(V*)用于式(VI)的含巯基的分子反应之前，可以对化合物(V)或(V*)的●、R1和/或X部分进行修饰。只要修饰后的●、R1和/或X部分仍涵盖在本文如前所公开的定义中，则可进行所述修饰。仅作为一个说明性示例，如下面的反应方案所示，可以将步骤(I)中得到的式(V)的化合物A的●部分进行修饰，得到式(V)的化合物B，然后用于步骤(II)中与式(VI)的含巯基的分子反应：
其中TFA-是三氟乙酸根；Cy5是荧光染料Cy5,HATU是(1-双[(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化六氟磷酸盐)。DIPEA是N,N-二异丙基乙胺，DMF是N,N-二甲基甲酰胺。
在根据本发明的方法的一个优选的实施方案中，R1独立地代表甲基、乙基、丙基、丁基、苯基、硝基取代的苯基、(C1-C2-烷氧基)n其中n是1、2、3、4、5或6，更优选2-(2-甲氧基乙氧基)乙基、苯基、苄基或硝基取代的苄基、甲基或乙基，甚至更优选甲基或乙基。在一个更优选的实施方案中R1为相同的取代基。
在另一个优选的实施方案中，R1甚至可以在巯基加成步骤(II)后再进行修饰，例如R1的取代基可以包括在以下中的三键
其可以与任何希望的有机的化合物-N3反应(例如肽-N3，蛋白质-N3，诸如酶-N3或辅酶-N3(例如辅酶A-N3)，抗体-N3、蛋白标签-N3，荧光团-N3，寡核苷酸-N3，或多糖-N3如生物素-N3)以形成三唑桥联复合物，如
因此，R1可以代表其中“化合物”可以代表肽、蛋白、酶、辅酶(例如辅酶A)、抗体、蛋白标签、荧光团、寡核苷酸、多糖、或生物素；其中#代表O的位置。
在另一个优选的实施方案中，R1是任意取代的脂肪族或芳香族残基，例如苯基；被(C1-C8烷氧基)n，其中n是1、2、3、4、5或6，被F，被Cl，被Br，被I，被-NO2，被-N(C1-C8烷基)H，被NH2，被-N(C1-C8烷基)2、被＝O，被C3-C8-环烷基，被任意取代的苯基取代的C1-C8-烷基取代，如，
/>
或任意独立地被C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2、取代苯基取代；或5-或6-元杂芳香系统例如吡啶基；优选C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基、苯基或–NO2取代的苯基。
因此，R1可以独立地代表任意取代的脂肪族或芳香族残基，如苯基。“任意取代的”在“任意取代的脂肪族或芳香族残基”中是指独立地被任何可能的残基取代的脂肪族或芳香族残基的任意取代。
R1可以代表被选自(C1-C8-烷氧基)n(其中n是1、2、3、4、5或6)、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、–S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n(其中n是1、2、3、4、5或6)、C2-C8-炔基或任意取代的苯基中的至少一个任意取代的C1-C8-烷基，如
其中#代表式(III)或式(III*)中的O的位置。
R1可以代表被选自C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n(其中n是1、2、3、4、5或6)、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2或-N(C1-C8-烷基)2中的至少一个任意独立地取代的苯基。
R1可以代表5-或6-元杂芳香系统例如吡啶基。
R1可以代表C1-C8-烷基、被S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基、被(C1-C8-烷氧基)n(其中n是1、2、3、4、5或6)取代的C1-C8-烷基、被任意取代的苯基取代的C1-C8-烷基、苯基或被-NO2取代的苯基。
在一些实施方案中R1代表被–S-S-(C1-C8-烷基)任意取代的脂肪族或芳香族残基。在一个优选的实施方案中，R1代表其中R10和R11独立地代表氢原子或C1-C8-烷基；且#代表O的位置。在一个更优选的实施方案中R10和R11独立地代表氢原子、甲基或乙基。在另一个更优选的实施方案中，R1代表/>其中R10和R11独立地代表氢原子、甲基或乙基；且#代表O的位置在部分。在这些实施方案的一些中，R10和R11都是氢原子。在这些实施方案的一些中，R10是氢原子而R11是C1-C6-烷基。在这些实施方案的一些中，R10是氢原子而R11是甲基或乙基。优选地，在这些实施方案中两个R1都是相同的。
在一些实施方案中，R1代表苯基取代的C1-C8-烷基，所述苯基进一步被代，其中Z是O或NH，且其中#代表所述苯基的位置。在一些实施方案中Z是O。在一些实施方案中Z是NH。在/>中的C1-C8-烷基可以是，例如甲基、乙基、丙基或丁基；优选甲基、乙基或丙基；更优选甲基或乙基；最优选甲基。在一个优选的实施方案中，R1代表/>其中所述C1-C8-烷基可以是，例如甲基、乙基、丙基或丁基；优选甲基、乙基或丙基；更优选甲基或乙基；最优选甲基；其中Z是O或NH，且其中#代表O的位置。在另一个优选的实施方案中，R1代表述C1-C8-烷基可以是例如甲基、乙基、丙基或丁基；优选甲基、乙基或丙基；更优选甲基或乙基；最优选甲基；其中Z是O或NH，且其中#代表O的位置。优选地，在这些实施方案中两个R1都是相同的。
在一些实施方案中，R1代表苯基取代的C1-C8-烷基，所述苯基进一步被取代，其中#代表所述苯基的位置。在一些实施方案中，R1代表苯基取代的C1-C8-烷基，所述苯基进一步被/>取代，其中#代表所述苯基的位置。在一个优选的实施方案中，R1代表/>其中#代表O的位置。在另一个优选的实施方案中，R1代表/>其中#代表O的位置。优选地，在这些实施方案中两个R1都是相同的。
在一些实施方案中，R1代表被羟基-(C1-C8-烷氧基)n其中n是1、2、3、4、5或6任意取代的脂肪族或芳香族残基。在一个优选的实施方案中，R1是羟基乙氧基乙基，更优选为-(CH2)2-O-(CH2)2-OH。
在一些实施方案中，R1代表被C2-C8-炔基任意取代的脂肪族或芳香族残基。在一个优选的实施方案中R1是高炔丙基。
在根据本发明的方法的另一个优选的实施方案中，代表双键，X代表(R3 R4)C，R3和R4独立地代表H或C1-C8-烷基，且/>代表化学键。在另一个优选的实施方案中，R3和R4每一个都代表H。
在根据本发明的方法的另一个优选的实施方案中，代表三键，X代表R3-C，R3代表H或或C1-C8-烷基，更优选为H，且/>代表双键。
在根据本发明的方法的另一个优选的实施方案中，●代表任意取代的C1-C8-烷基，如
或任意取代的苯基如
其中#代表式(IV)的化合物的–N3基团的位置、放射性或非放射性核素、生物素、核苷酸、寡核苷酸、聚合物、碳水化合物、氨基酸、肽、任意取代的5-或6-元杂芳香系统、蛋白标签、或荧光团如CY5或EDANS。
在根据本发明的方法的另一个优选的实施方案中●代表
结构式(VIII)的环状RGD肽(c(RGDfK)
/>
其中
*代表N3基团的位置；
生物素；
CY5或EDANS；
苯基，被独立选自下列中的一个、两个、三个、四个或五个取代基任意取代：C1-C8-烷基、C1-C8-烷氧基、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1-C8-烷基)、-N(C1-C8-烷基)2-COOH、-COO(C1-C8-烷基)、-O-C(O)-(C1-C8-烷基)、-C(O)N-(C1-C8-烷基)、-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)优选被选自下列中的一个取代基任意取代：C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基和NO2。
被选自下列中的至少一个取代基任意取代的C1-C8-烷基：C3-C8-环烷基；具有3到8个环的杂环基其中所述杂原子选自N、O、S；C1-C8-烷氧基；卤素；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1-C8-烷基)；-N(C1-C8-烷基)2；-COOH；-COO(C1-C8-烷基)；-O-C(O)-(C1-C8-烷基)；-CONH2；-C(O)N(C1-C8-烷基)2；-C(O)NH-(C1-C8-烷基)；-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)，优选C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基和NO2，苯基或杂芳香系统、单糖、多糖、肽、核苷酸、寡核苷酸、聚合物、氨基酸、荧光团、蛋白标签(取代基1代)，其中取代基1代可以再次被C3-C8-环烷基；具有3到8个环的杂环基其中所述杂原子选自N、O、S；C1-C8-烷氧基；卤素；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1-C8-烷基)；-N(C1-C8-烷基)2；-COOH；-COO(C1-C8-烷基)；-O-C(O)-(C1-C8-烷基)；-CONH2；-C(O)N(C1-C8-烷基)2；-C(O)NH-(C1-C8-烷基)；-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)，优选C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基和NO2、苯基或杂芳香系统(取代基2代)，且其中取代基2代可以再次被选自同样组的至少一个基团取代，且其中这样的取代可以持续到3、4、5、6、7、8、9或10代。
在另一个根据本发明的方法的优选的实施方案中●代表
结构式(VIII)的环状RGD肽(c(RGDfK)
其中
*代表N3基团的位置；
生物素；
CY5或EDANS；
苯基，被独立选自下列中的一个、两个、三个、四个或五个取代基任意取代：C1-C8-烷基、C1-C8-烷氧基、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1-C8-烷基)、-N(C1-C8-烷基)2-COOH、-COO(C1-C8-烷基)、-O-C(O)-(C1-C8-烷基)、-C(O)N-(C1-C8-烷基)、-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)优选被选自下列中的一个取代基任意取代：C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基和NO2。
被独立选自下列中的一个、两个、三个、四个或五个取代基任意取代的C1-C8-烷基：被独立选自下列中的一个、两个、三个、四个或五个取代基任意取代的苯基：C1-C8-烷基、C1-C8-烷氧基、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1-C8-烷基)、-N(C1-C8-烷基)2-COOH、-COO(C1-C8-烷基)、-O-C(O)-(C1-C8-烷基)、-C(O)N-(C1-C8-烷基)、-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)，优选被选自下列中的一个取代基任意取代：C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基和NO2；C1-C8-烷氧基；卤素；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1-C8-烷基)；-N(C1-C8-烷基)2；-COOH；-COO(C1-C8-烷基)；-O-C(O)-(C1-C8-烷基)；-C(O)N-(C1-C8-烷基)；-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)，优选C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基、-NO2；
其中#代表N的位置。
在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，●代表任意取代的苯基，如
其中#代表–N3基团的位置。TFA–是三氟乙酸根。
在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，●代表任意取代的C1-C8-烷基，如连接子、药物、或连接子-药物偶联物。
在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，●代表任意取代的苯基，如连接子、药物、或连接子-药物偶联物。
在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，代表抗体，优选lgG抗体，如西妥昔单抗或曲妥珠单抗；肽，如GFP蛋白、eGFP蛋白，三肽，例如式(IX)的肽
其中#代表S的位置；或
任意取代的C1-C8-烷基如
其中#标示出了S的位置。
在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，代表其中#代表S的位置。
在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述和所述/>存在于相同的分子中。
因此，本发明还涉及一种方法，其中式(XX)的化合物
其中，如通过弧将所述●和所述连接所显示的，所述/>和所述存在于相同的分子中，
与本文所定义的式(III)的化合物反应得到式(VIIa)的化合物：
其中如果在式(III)的化合物中代表双键，那么/>代表化学键；
或
如果在式(III)的化合物中代表三键，那么/>代表双键；且/>●、R1和X如本文中所定义。
因此，本发明还涉及一种方法，其中式(XX)的化合物
其中如通过弧将所述●和所述连接所显示的，所述/>和所述/>存在于相同的分子中，
与本文所定义的式(III*)的化合物反应以得到式(VII*a)的化合物：
/>
其中●、V、R1和X如本文中所定义。
在一些实施方案中，在相同的分子中具有和/>的化合物(XX)是肽，诸如例如BCL9肽。因此，通过所述方法得到的式(VIIa)或式(VII*a)的化合物可以是环肽，诸如例如衍生自BCL9肽的环肽。
本文所描述的用于式(V)、(V*)、(VII)和(VII*)的方法的所有步骤能够类似地用于式(VIIa)和(VII*a)的化合物。
叠氮和巯基同时并入相同的分子提供了分子内施陶丁格诱导的巯基加成反应，其能够实现如以下方案示例性示出的分子内环化：
在不希望受任何理论约束的情况下，假定首先叠氮化物与富电子炔基/烯基亚磷酸酯反应，形成磷酰胺和缺电子的炔基/烯基磷酰胺，这会与SH部分经历快速的分子内巯基加成反应。
本发明的一个实施方案还涉及式(VIIa)和(VII*a)的化合物。
化合物
本发明还涉及式(V)的化合物
其中R1和X和●如前所定义。
本发明还涉及式(V*)的化合物
其中●、V、R1和X如前所定义。
优选地，在式(V)或(V*)化合物中，●代表任意取代的C1-C8-烷基，如
任意取代的苯基，如
其中#代表N的位置；放射性或非放射性核素、生物素、核苷酸、寡核苷酸、聚合物、碳水化合物、氨基酸、肽、任意取代的苯基、任意取代的5-或6-元杂芳香系统、任意取代的C1-C8-烷基、蛋白标签或荧光团如CY5。
优选地，在式(V)或(V*)化合物中，●代表任意取代的苯基，如 其中#代表N的位置。TFA–是三氟乙酸根。
优选地，在式(V)或(V*)化合物中，●代表任意取代的C1-C8-烷基，如连接子、药物、或连接子-药物偶联物。
优选地，在式(V)或(V*)化合物中，●代表代表任意取代的苯基，如连接子、药物、或连接子-药物偶联物。
本发明还涉及式(VII)的化合物
其中
代表化学键且X代表(R3R4)C；或
代表双键且X代表R3-C；
R3代表H或C1-C8-烷基；
R4代表H或C1-C8-烷基；
代表任意取代的C1-C8-烷基、任意取代的苯基、任意取代的芳香5-或6-元杂环系统、氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖基、多糖、核苷酸、寡核苷酸或聚合物；
●代表脂肪族或芳香族残基；
R1独立地代表任意取代的脂肪族或芳香族残基，例如苯基；被(C1-C8-烷氧基)n，其中n是1、2、3、4、5或6，被F，被Cl，被Br，被I，被-NO2，被-N(C1-C8-烷基)H，被＝O，被C3-C8-环烷基，被任意取代的苯基取代的C1-C8-烷基取代，如
或任意独立地被C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2、取代苯基取代；或5-或6-元杂芳香系统例如吡啶基；优选C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基、苯基或-NO2取代的苯基；
本发明还涉及式(VII*)的化合物
其中
代表任意取代的C1-C8-烷基、任意取代的苯基、任意取代的芳香5-或6-元杂环系统、氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖基、多糖、核苷酸、寡核苷酸或聚合物；
●代表脂肪族或芳香族残基；
R1独立地代表任意取代的脂肪族或芳香族残基，例如苯基；被(C1-C8烷氧基)n，其中n是1、2、3、4、5或6，被F，被Cl，被Br，被I，被-NO2，被-N(C1-C8烷基)H，被-NH2，被-N(C1-C8-烷基)2，被＝O，被C3-C8环烷基，被任意取代的苯基取代的C1-C8烷基取代，如
或任意独立地被C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2、取代苯基取代；或5-或6-元杂芳香系统例如吡啶基；优选C1-C8烷基、(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基、苯基或-NO2取代的苯基；
V代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基或丙基，更优选甲基；
X代表(R3 R4)C
R3代表H或C1-C8-烷基；且
R4代表H或C1-C8-烷基。
优选地，在式(VII)或(VII*)的化合物中，●代表任意取代的C1-C8-烷基，如
任意取代的苯基，如
放射性或非放射性核素、生物素、核苷酸、寡核苷酸、聚合物、碳水化合物、氨基酸、肽、任意取代的苯基、任意取代的5-或6-元杂芳香系统、任意取代的C1-C8-烷基、蛋白标签或荧光团如CY5或EDANS。
优选地，在式(VII)或(VII*)的化合物中，●代表任意取代的苯基，如
其中#代表N的位置。TFA–是三氟乙酸根。
优选地，在式(VII)或(VII*)的化合物中，●代表任意取代的C1-C8-烷基，如连接子、药物、或连接子-药物偶联物。
优选地，在式(VII)或(VII*)的化合物中，●代表代表任意取代的苯基，如连接子、药物、或连接子-药物偶联物。
优选地，在式(VII)或(VII*)的化合物中，代表抗体，优选lgG抗体，更优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗；肽，优选GFP蛋白或eGFP蛋白或三肽，更优选式(IX)的肽或C1-C8-烷基。/>
优选地，在式(VII)或(VII*)的化合物中，代表其中#代表S的位置。
优选的式(VII)或式(VII*)的偶联物是下述的偶联物，其中
代表抗体且
●代表蛋白标签或荧光团如CY5或EDANS，或蛋白。
进一步优选的式(VII)或式(VII*)的偶联物是下述的偶联物，其中代表蛋白质且
●代表蛋白标签或或荧光团如CY5或EDANS，抗体或蛋白质。
一个优选的实施方案为式(VII)的偶联物，其中代表蛋白质且
●代表蛋白质。
进一步地，优选的式(VII)或式(VII*)偶联物是下述的偶联物，其中代表抗体且
●代表连接子、药物、或连接子-药物偶联物。
本发明还涉及式(VIIa)的化合物
其中，如通过连接●和所显示的，●和/>在相同的分子中，且其中●、X和R1如本文中所定义，特别如式(VII)所定义。优选地，所述化合物(VIIa)是环肽，诸如例如衍生自BCL9肽的环肽。
本发明还涉及式(VII*a)的化合物
其中，如通过连接●和所显示的，●和/>在相同的分子中，且其中●、/>V、X和R1如本文前所定义，特别如式(VII*)的化合物所定义的。优选地，化合物(VII*a)是环肽，诸如例如衍生自BCL9肽的环肽。
下列式(VII)的化合物也是优选的：
其中左侧的蛋白质是GFP蛋白，优选eGFP蛋白；
一种式(X)所示的荧光标记ASGP-R寻址的Cy5偶联物(fluorescently labeledASGP-R addressing Cy5 conjugate)，其可经由模块加成至乙烯基磷酰胺来生产：
/>
下列式(VII)的化合物也是优选的：
其中LD代表具有如下结构的连接子药物偶联物
且#代表N的位置；和
此外，本文中在实施例部分作为式(VII)化合物的示例提供的化合物也是优选的。
本领域技术人员理解，根据本发明的实施例可以相互结合，但前提是排除了可能违反任何自然法则的组合。
式(V)的磷酰胺的合成
步骤a)
通过施陶丁格亚磷酸酯反应制备烯基或炔基磷酰胺的一般操作方法要求式(II)的烯基或炔基溴化镁与式(I)的卤代氯亚磷酸二烷基酯(优选氯亚磷酸酯)在-20℃以下，例如-100℃到-40℃之间，优选-90℃到-50℃之间(例如约87℃)反应。优选地，所述反应在惰性气体如氩气的保护下进行。在这种情况下，“惰性”是指在给定的反应条件下不会和该反应的任何组分或产物发生反应的气体。当然，反应时间取决于反应体积和物料的量。但是，作为指导原则，反应时间应在2分钟到4小时范围内。式(I)和(II)的化合物的量应在5:1到1:5的范围之间，例如2:1到1:2，例如1:1左右。
步骤(I)
式(III)的化合物与式(IV)的叠氮化物的反应可在室温下(即约25℃)进行。然而，该反应也可以在0℃至50℃的温度范围内进行。反应时间视反应体积及物料的量而定。但是，作为指导原则，反应应该在1小时至72小时的范围内完成。式(III)和(IV)的化合物的量应在5:1至1:5的范围内，例如2:1至1:2，例如1:1左右。
优选地，本文所述步骤(I)在极性非质子溶剂系统中进行，例如四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(MeCN)、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯(EtOAc)、N-甲基吡咯烷酮或它们的混合物，优选THF、DMF、MeCN、THF/DMF、THF/MeCN；或极性非质子溶剂和非极性溶剂(如己烷、甲苯、苯、1,4-二氧六环、氯仿、二乙醚或二氯甲烷(DCM))的混合物，优选THF/甲苯。步骤(I)也可在含水介质中进行，例如在水中或水缓冲液中，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)或碳酸氢盐。
碱介导的缺电子的磷酰胺炔的巯基化操作方法
步骤(II)
式(V)的磷酰胺和碱(以及必要时的添加剂)可以悬浮在相应的溶剂中。然后，可以例如通过微升注射器加入式(VI)的硫醇，然后允许混合物在室温(即约25℃)下反应。但是，该反应也可以在0℃到50℃的温度范围内进行。反应时间取决于反应体积和物料的量。然而，作为指导原则，反应应在0.1h(小时)至10h的时间范围内进行，例如，在0.1h至3h的时间范围内，甚至在0.1h至1h的时间范围内进行。
在一个优选的实施方案中，本文所述步骤(II)在弱碱存在下进行。优选的弱碱是碳酸盐，例如铵(NH4)2CO3、Na2CO3、Rb2CO3、K2CO3、或Cs2CO3或其相关的碳酸氢盐(例如NaHCO3等)；和含氮弱碱，例如三乙胺ET3N(pKa 10.76，25℃下)。优选地，采用pKa值在7.5到11.5范围内的碱。
溶剂(系统)可从多种溶剂中选择。所述溶剂可以是极性非质子溶剂系统，例如四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(MeCN)、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯(EtOAc)、N-甲基吡咯烷酮或其混合物，优选THF、DMF、DMSO；非极性溶剂，例如己烷、甲苯、苯、1,4-二氧六环、氯仿、二乙醚或二氯甲烷(DCM)，优选DCM；极性质子溶剂，例如水、乙醇、异丙醇、甲醇、正丁醇、优选二乙醇；或它们的混合物，例如DMF/水。溶剂也可以是含水介质，例如水或含水缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)或碳酸氢盐。
实施例
制备炔基磷酰胺的通用操作方法
在火焰干燥舒伦克瓶中，在氩气保护下，在干冰/丙酮浴中将乙炔基溴化镁溶液(0.5M的THF溶液，2ml，1mmol)冷却至-78℃。通过注射器滴加氯亚磷酸二乙酯(157mg，144μl，1mmol)。溶液在-78℃搅拌30分钟，然后升温到室温，接着再搅拌1.5小时。然后加入3ml干燥的THF和叠氮化物(1mmol)，并在室温下将溶液搅拌24小时。然后加入H2O(5ml)，将溶液在空气中再搅拌24小时。减压除去溶剂后，通过31P核磁共振分析粗混合物。
乙烯基亚磷酸酯的合成。
由三氯化磷合成乙烯基亚磷酸酯的通用操作方法A.
向火焰干燥的舒伦克瓶中加入溶于20ml干燥甲苯的1.50mmol的三氯化磷(1.0eq.)，冷却至-78℃。滴加3.3mmol吡啶(2.2eq.)和溶于5mlEt2O的3.3mmol的醇(2.2eq.)溶液。将所得悬浮液升温至室温，再搅拌30分钟并再次冷却至-78℃。加入1.65mmol(1.1eq.)乙烯基格氏试剂(1.0M的THF溶液)，在室温下搅拌反应2小时。最后在0℃加入2.25mmol(1.5eq.)硼烷(1.0M的THF溶液)并再搅拌一小时。粗品在硅胶柱上干法上样进行纯化。
由双(二异丙氨基)氯膦合成乙烯基亚磷酸酯的通用操作方法B
向火焰干燥的舒伦克瓶中加入1.5mmol(1.0eq.)双(二异丙基氨基)氯膦，溶解于200μl干燥的THF中并冷却至-78℃。加入1.65mmol(1.1eq.)乙烯基格氏试剂(1.0M的THF溶液)，在室温下搅拌反应30分钟。加入溶于1ml干燥THF或MeCN的3.3mmol真空干燥酒精(2.2eq.)溶液和3.3mmol(2.2eq.)四唑(0.45M的MeCN溶液)。将所得悬浮液在室温下搅拌过夜。最后在0℃加入2.25mmol(1.5eq.)硼烷(1.0M的THF溶液)并再搅拌一小时。粗品在硅胶柱上干法上样进行纯化。
由氯亚磷酸二乙酯、乙烯基格氏试剂和不同叠氮化物合成乙烯基磷酰胺的通用操作方法C
在氩气保护下，向25m l舒伦克瓶中加入1.71ml乙烯基溴化镁(0.7M的THF溶液，1.20mmol，1.2eq.)，冷却至-78℃，滴加140μl氯亚磷酸二乙酯(1.00mmol，1.0eq.)。将淡黄色溶液升温至0℃，再搅拌2小时，然后加入溶解于3.2ml THF中的叠氮化物1.00mmol(1.0eq.)，室温下搅拌过夜。加入5ml水，再搅拌24小时。减压除去溶剂，粗品用快速硅胶柱层析纯化。
N-苯基-P-乙炔基-磷酰胺乙酯
“制备烯基或炔基磷酰胺的通用操作方法”之后，以5mmol规模，由叠氮苯(595mg，5mmol)制备N-苯基-P-乙炔基磷酰胺乙酯。粗产物通过硅胶柱层析纯化，以己烷/乙酸乙酯洗脱。得到的目标产物为无色固体，产量为430mg(2.1mmol，42％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d):δ＝7.28(t,J＝7.7Hz,2H,ArH),7.11(d,J＝8.0Hz,2H,ArH),7.02(t,J＝7.3Hz,1H,ArH),6.74(d,J＝7.6Hz,1H,NH),4.55–3.93(m,2H,CH2),2.89(d,J＝12.8Hz,1H,CH),1.39(t,J＝7.0Hz,3H,CH3)ppm。13C NMR(75MHz,氯仿-d):δ＝138.99,129.39,122.42,118.23,118.13,88.10,87.45,76.34(d,J＝273.3Hz),62.26(d,J＝5.2Hz),16.23(d,J＝7.4Hz)ppm。31P NMR(122MHz,氯仿-d):δ＝-9.17ppm.HRMS ESI-TOF m/z[M+H]+＝210.0678(计算)；210.0687(测定)。N-苄基-P-乙炔基-磷酰胺乙酯
“制备烯基或炔基磷酰胺的通用操作方法”之后，由苄基叠氮(133mg,125μL,1mmol)制备N-苄基-P-乙炔基-磷酰胺乙酯。粗产物经硅胶柱层析纯化，以己烷/乙酸乙酯洗脱。得到的目标产物为无色固体，产量为37mg(0.17mmol，17％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d):δ＝7.51–7.18(m,5H,ArH),4.26–4.04(m,4H,2x CH2),3.34(s,1H,CH),2.91(d,J＝12.7Hz,1H,NH),1.34(t,J＝7.1Hz,3H,CH3)ppm。13C NMR(75MHz,氯仿-d):δ＝138.99,138.90,128.71,127.62,127.54,87.77,87.16,76.83(d,J＝260.0Hz),62.03(d,J＝5.1Hz),44.86,16.25(d,J＝7.3Hz)ppm。31P NMR(122MHz,氯仿-d):δ＝-2.76ppm.HRMS ESI-TOF m/z[M+H]+＝224.0835(计算)；224.0835(测定).
N-苯基-P-乙烯基-磷酰胺乙酯
按照所述通用操作方法C，由1.15ml氯亚磷酸二乙酯(8mmol)合成所述化合物。所述磷酰胺经快速柱层析(EtOAc)纯化，得到白色固体。(675mg，3.20mmol，40.0％)
1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ＝7.24(dd,J＝8.5,7.3,2H),7.05–7.01(m,2H),6.99(d,J＝5.8,1H),6.94(tt,J＝7.3,1.1,1H),6.33–6.23(m,2H),6.10(ddd,J＝50.3,9.6,5.1,1H),4.29–4.04(m,2H),1.35(t,J＝7.1,3H)。13C NMR(151MHz,氯仿-d)δ＝140.43,134.44,129.28,127.51(d,J＝172.7),121.26,117.31(d,J＝6.6),60.44(d,J＝6.2),16.22(d,J＝7.0)。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝15.68。C10H15NO2P+[M+H]+的HRMS计算：212.0835,测定：212.0839。N-(4-羧基-苯基)-P-乙烯基-磷酰胺乙酯
按照所述通用操作方法C由288μl氯亚磷酸二乙酯(2mmol)合成所述化合物。所述纯的磷酰胺经快速柱层析(CH2Cl2/MeOH，9:1到4:1)纯化，得到白色固体。(173mg,0.68mmol,34.0％)
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝8.37(d,J＝7.9,1H),7.80(d,J＝8.7,2H),7.12(d,J＝8.7,2H),6.42–6.04(m,3H),4.11–3.94(m,2H),1.26(t,J＝7.0,3H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ＝167.56,146.36,135.00,131.21,129.04(d,J＝165.8),123.06,117.00(d,J＝6.9),60.84(d,J＝5.7),16.61(d,J＝6.3)。31P NMR(122MHz,DMSO-d6)δ＝14.36。C11H15NO4P+[M+H]+的HRMS，计算：256.0733，测定：256.0723。
N-苄基-P-乙烯基-磷酰胺乙酯
按照所述通用操作方法C由290μl氯亚磷酸二乙酯(2mmol)合成所述化合物。所述纯的磷酰胺经快速柱层析(EtOAc)纯化，得到无色油状物。(155mg，0.69mmol，34.3％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝7.36–7.21(m,5H),6.33–5.88(m,3H),4.16–3.90(m,4H),3.21(d,J＝8.5,1H),1.28(t,J＝7.1,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝139.65(d,J＝5.9),133.21(d,J＝1.5),129.45,128.46,127.20,127.17,60.11(d,J＝5.7),44.58,16.27(d,J＝6.7)。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝20.52。C11H17NO2P+的HRMS，计算：226.0991，测定：226.1003N-(2-硝基-苄基)-P-乙烯基-磷酰胺乙酯
按照所述通用操作方法C由120μl氯亚磷酸二乙酯(0.83mmol)合成所述化合物。所述纯的磷酰胺经快速柱层析(2％甲醇的二氯甲烷溶液)纯化，得到棕色油状物。(125mg，0.46mmol，55.4％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.03(d,J＝8.1,1H),7.73–7.57(m,2H),7.45(t,J＝7.6,1H),6.31–5.83(m,3H),4.39(dd,J＝11.2,7.7,2H),4.12–3.85(m,2H),3.65(q,J＝8.6,1H),1.26(t,J＝7.1,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝148.09,135.45(d,J＝4.2),133.83,133.52(d,J＝1.6),131.10,128.41,128.26(d,J＝169.7),124.95,60.35(d,J＝5.7),42.42(d,J＝1.3),16.22(d,J＝6.7)。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝20.63。C11H16N2O4P+的HRMS，计算：271.0842，测定：271.0851。
N-(3-苯基-丙基)-P-乙烯基-磷酰胺乙酯
按照所述通用操作方法C由290μl氯亚磷酸二乙酯(2mmol)合成所述化合物。所述纯的磷酰胺经快速柱层析(EtOAc)纯化，得到无色油状物。(165mg，0.65mmol，32.5％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝7.28(dd,J＝8.1,6.2,2H),7.23–7.11(m,3H),6.28–5.89(m,3H),4.04(qt,J＝10.2,7.2,2H),2.92(dq,J＝9.1,7.0,2H),2.84–2.70(m,1H),2.70–2.60(m,2H),1.82(p,J＝7.3,2H),1.31(t,J＝7.1,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝141.28,132.98(d,J＝1.5),128.42(d,J＝169.0),128.34,128.24,125.88,59.95(d,J＝5.7),40.23,33.53(d,J＝5.6),32.86,16.32(d,J＝6.7)。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝20.82。C11H16N2O4P+的HRMS：计算：271.0842，测定：271.0851。C13H21NO2P+的HRMS，计算：254.1304，测定：254.1312。
N-环己基-P-乙烯基-磷酰胺乙酯
按照所述通用操作方法C由140μl氯亚磷酸二乙酯(1mmol)合成所述化合物。所述纯的磷酰胺经快速柱层析(1.5％甲醇的二氯甲烷溶液)纯化，得到无色油状物。(70mg，0.32mmol，32.2％)
1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ＝6.25–5.93(m,3H),4.14–3.97(m,2H),2.96(dqd,J＝13.8,9.6,8.1,4.2,1H),2.51(t,J＝9.6,2H),1.97–1.84(m,2H),1.74–1.65(m,1H),1.57(dt,J＝13.0,3.9,1H),1.32(t,J＝7.1,3H),1.30–1.09(m,5H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝132.56(d,J＝1.8),129.30(d,J＝168.8),59.80(d,J＝5.9),49.71,36.03,25.24,24.96,16.32(d,J＝6.8)。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝19.34。C10H21NO2P+的HRMS，计算：218.1304，测定：218.1302。
施陶丁格诱导的炔基-亚磷酸酯的巯基加成反应：
炔基-亚磷酸二乙酯的合成及与不同叠氮化物的反应(步骤b)
按照已公开的方案(13)合成炔基-亚磷酸二乙酯，并与不同的脂肪族或芳香族叠氮化物反应(方案3)。通过31P-NMR监控期望的炔基-磷酰胺的形成(不同叠氮化物底物的转化率参见表1)。
方案3:炔基亚磷酸二乙酯和R-N3的施陶丁格-亚磷酸酯反应(R参见表1)
表1:炔基-亚磷酸二乙酯的施陶丁格亚磷酸酯反应的底物范围(数值为百分比％)n.d.＝未测定；由31P-NMR测定。
N-苯基-和N-苄基-磷酰胺经柱层析分离，产率分别为41％和17％。在THF中得到最高转化率(表2)。
表2:溶剂对炔基-亚磷酸二乙酯和叠氮苯之间的施陶丁格亚磷酸酯反应的影响。
碱介导的磷酰胺炔或烯的巯基化的通用操作方法
向带帽小瓶中加入N-苯基-P-乙炔基-磷酰胺乙酯(10mg，0.05mmol)和相应的碱(和必要时的添加剂)。将混合物悬浮于200μL相应的溶剂中。然后通过微升注射器加入乙硫醇(3.1mg，3.6μL，0.05mmol)，在室温下搅拌混合物3小时。然后混合物用CH2Cl2(5mL)稀释，并加入H2O(5mL)。萃取后，进行相分离，水层用CH2Cl2(5mL)萃取三次。合并的有机层用H2O(5mL)和盐水(5mL)洗涤两次。去除溶剂后，用1H NMR和31P NMR对粗混合物进行分析。烯基磷酰胺的制备方法与炔基磷酰胺的制备方法类似。N-苯基-P-(2-乙硫烷基)-乙烯基-磷酰胺乙酯
向带帽小瓶中加入N-苯基-P-乙炔基-磷酰胺乙酯(10mg，0.05mmol)和碳酸钾(2.8mg，0.02mmol)。将混合物悬浮于1比1的DMF/H2O混合物中(200μL)。然后通过微升注射器加入乙硫醇(3.1mg，3.6μL，0.05mmol)，在室温下搅拌混合物3小时。然后混合物用CH2Cl2(5mL)稀释，并加入H2O(5mL)。萃取后，进行相分离，水层用CH2Cl2(5mL)萃取三次。合并的有机层用H2O(5mL)和盐水(5mL)洗涤两次。减压去除溶剂后，得到12mg目标产物(0.044mmol，89％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d):δ＝7.45(dd,J＝21.7,16.7Hz,1H,P-CH,E),7.30–7.17(m,3H,ArH),7.06(d,J＝12.5Hz,1H,S-CH,Z),7.01–6.90(m,2H,ArH),5.75(dd,J＝16.7,12.5Hz,1H,P-CH,Z),4.35–4.00(m,2H,OCH2),2.75(q,J＝7.5Hz,2H,SCH2),1.36(t,J＝7.0Hz,3H,OCH2CH3),1.28(t,J＝7.5Hz,3H,SCH2CH3)ppm。13C NMR(75MHz,氯仿-d):δ＝150.40,140.11,129.31,121.50,117.47(d,J＝6.4Hz),60.61(d,J＝6.0Hz),29.59,25.90,16.42(d,J＝6.9Hz),15.53,13.75ppm。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ15.13,14.35ppm。HRMSESI-TOF m/z[M+H]+＝272.0869(计算)；272.0855(测定)。
(乙基-N-苯基-P-乙烯基-磷酰胺)-S-谷胱甘肽偶联物
向带帽小瓶中加入N-苯基-P-乙炔基-磷酰胺乙酯(31mg，0.15mmol)和碳酸钾(7mg，0.05mmol)。将混合物悬浮于1比1的DMF/H2O混合溶剂中(500μL)。然后加入(2S)-2-氨基-4-{[(1R)-1-[(羧基甲基)氨甲酰基]-2-硫乙基]氨甲酰基}-丁酸(31mg，0.1mmol)，在室温下搅拌混合物3小时。然后，混合物用H2O(5mL)稀释，并加入CH2Cl2(5mL)。萃取后，进行相分离，有机层用H2O(5mL)萃取三次，水层用CH2Cl2(5mL)萃取三次。然后，减压去除溶剂。粗混合物用制备型HPLC纯化，以乙腈和乙酸铵缓冲液洗脱。得到乙酸铵盐产物35.5mg(0.061mmol，61％)。1H NMR(300MHz,重水):δ＝7.37(d,J＝12.6Hz,1H,S-CH,Z),7.21(t,J＝7.9Hz,2H,ArH),6.94(dd,J＝7.8,5.3Hz,3H,ArH),5.77(dd,J＝17.5,12.2Hz,1H,PCH,Z),4.45(ddd,J＝12.8,8.3,5.2Hz,1H),4.01(q,J＝7.4Hz,2H,CH2),3.84–3.52(m,2H,CH2),3.21(dd,J＝14.7,5.1Hz,1H,CH),3.02(dd,J＝14.6,8.5Hz,1H,CH),2.45–2.20(m,2H,CH2),1.96(q,J＝7.2Hz,2H,CH2),1.19(t,J＝7.1Hz,3H,CH3)ppm。13C NMR:(75MHz,重水)δ＝174.66,174.45,173.59,171.25,171.19,151.73,139.17,129.38,122.06,117.75(d,J＝6.8Hz),86.89,86.83,86.72,62.14,53.76(d,J＝12.1Hz),42.35,35.94,31.18,25.92,15.41ppm。31P NMR:(122MHz,重水)δ＝18.96,18.11(d,J＝4.2Hz)ppm。HRMS ESI-TOF m/z[M+H]+＝517.1516(计算)；517.1526(测定)。
乙硫醇和谷胱甘肽巯基加成至炔基-磷酰胺的选择乙硫醇作为脂肪族模型底物。所有实验均在室温下用400μL溶剂以0.1mmol的规模进行3小时。用31P-NMR和1H-NMR测定转化率和非对映选择性(方案4)。
方案4:筛选反应条件的模型反应
首先，实验证实了E-和Z-构象异构体的形成。在非对映体混合物的核磁共振氢谱中，主要非对映体与次要非对映体的相邻H-H耦合常数分别为12.5Hz和21.7Hz，表明Z-异构体是所有反应条件下的主要产物(参见表3)。
表3：碱介导的缺电子炔基磷酰胺的巯基化反应的溶剂筛选。
然后进一步研究了溶剂对巯基加成的影响，揭示了每种被测溶剂中定量形成的巯基加成物。在所有测试溶剂中都实现了完全转化。DMSO显示了最低的非对映选择性(12％的E产物)。因此，进一步研究了在DMSO和DMF/H2O(1:1)中碱的影响(表4)。
表4:DMSO和DMF/H2O(1:1)中缺电子炔基磷酰胺硫基化反应碱的筛选。
结果表明，DMSO中反应的非对映选择性取决于所用的碱。与此相反，含水体系中的反应总是以Z-烯烃为主要产物。
总之，可以对所述模型反应的反应条件进行优化。该反应可在含水溶剂体系中进行，并可在室温下使用温和的碳酸盐碱反应3小时后能够实现定量转化。未观察到副反应。
在接下来的步骤中，这些优化的反应条件用于合成水溶性的谷胱甘肽磷酰胺偶联物(方案5)。
方案5:谷胱甘肽-磷酰胺偶联物的合成
在碱性条件下，所述偶联物可以用半制备型HPLC分离为非对映异构体混合物，产率为61％。因为手头有适量该水溶性磷酰胺偶联物，因此可以进行研究以确定磷-氮键的水解性质。为进行这些研究，制备了3μM的偶联物溶液和标准四甲基溴化磷鎓(1.2μM)的水性缓冲液，并通过31P NMR监测24小时内偶联物相对于标准品的衰减来表征磷酰胺的水解。结果如图1所示，图1显示了在酸性条件下谷胱甘肽-磷酰胺偶联物的水解衰减。
在强酸性条件下(1MHCL，pH0.36)，磷酰胺呈现快速分解，以下降的曲线(圆点)表示。在略微酸性条件下(150mM NH4OAc缓冲液，pH＝4.76)，如蓝色曲线所示，化合物在测量期间保持稳定(方块)。
反应速率用HPLC测定。将谷胱甘肽加入到N-苯基炔基磷酰胺乙酯的弱碱性水缓冲溶液中。在几个时间点后通过加入酸性缓冲液来终止反应，并通过HPLC-UV进行分析，以肌苷为内标物。图2为pH8.5处反应中与谷胱甘肽反应的N-苯基炔基磷酰胺乙酯的消耗量。在不同的时间点进行了HPLC-UV检测。实验重复进行三次。
如图2所示，在pH8.5下15分钟后，我们实现了起始原料炔基磷酰胺超过95％的快速转化。
施陶丁格诱导的RGD肽和GFP的巯基加成反应
在下一个原理验证研究中，我们合成了一种含叠氮基的环状RGD肽(c(RGDfK))，已知它与癌细胞中过度表达的整合素结合。该环状叠氮肽与炔基亚磷酸二乙酯反应生成高活性磷酰胺，经HPLC分离后收率53％，无副产物形成(方案6)。
方案6:施陶丁格诱导的环叠氮-RGD肽和谷胱甘肽的巯基加成反应。
c(RGDfK)-叠氮的合成
在负载为0.26mmol/g的NovaSynTGT醇类树脂上人工合成环状RGDfK-叠氮肽。首先，在60℃，将480.7mg树脂在2.5ml甲苯和480μl乙酰氯中通过搅拌活化该树脂3小时。在DCM中使用DIPEA(212.6μl，1.25mmol，10eq.)为活化碱，对Fmoc-Asp(OAll)-OH(123.56mg，0.3125mmol，2.5eq)进行双偶联，每次1小时。通过将氨基酸(0.25mmol，2eq.)、HATU(0.25mmol,2eq.)和DIPEA(0.5mmol,4eq.)在DMF中混合进一步执行氨基酸偶联，且一次偶联30分钟，一次偶联1小时。用20％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护。在最后的氨基酸偶联完成后，在氩气氛围中用氯仿/乙酸/NMM(37:2:1；v:v:v)中的Pd(P(Ph3)4)(433mg，0.375mmol，3eq.)处理树脂2小时以实现烯丙氧羰基脱(alloc)保护，然后用HATU(0.25mmol，2eq.)和DIPEA(0.5mmol，4eq.)的DMF溶液进行16小时的Fmoc脱保护和环化。为了能够将芳香族叠氮化物安装在赖氨酸残基上，将Fmoc-Lys(dde)-OH用于固相合成中，并使用2％肼的DMF溶液在树脂上正交脱保护三次3分钟，随后将4-叠氮苯甲酸(81.65mg，0.5mmol，4eq)与DMF中的HATU(190mg，0.5mmol，4eq.)和DIPEA(1mmol，8eq.)偶联2小时。用TFA/DCM(75:25；v:v)进行2.5小时的树脂切割。在低温干燥的乙醚中进行沉淀。粗品通过UPLC-MS进行分析，或者作为原料用于后面的施陶丁格反应，或者通过制备型反相C18HPLC纯化(0-5min 95/5，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)；5-60min 10/90，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA))。得到的产物为白色粉末(8.0mg，11.0μmol，产率8.5％)，并通过分析型UPLC上进行分析(RP-C18柱，含0.1％TFA的5％到95％乙腈的水溶液)。图7显示了c(RGDfK)-叠氮化物的UPLC色谱图。LRMS:m/z:749.67[M+H]+(计算m/z:749.3485)。
c(RGDfK)-磷酰胺炔烃的合成
双乙氧基炔基-亚磷酸酯的合成
将乙炔基溴化镁(5M，2ml，1mmol，1eq.)的THF溶液在火焰干燥的舒伦克瓶中冷却至-78℃，加入氯亚磷酸二乙酯(0.143ml，1mmol，1eq.)。溶液在-78℃下搅拌10分钟，然后升温至室温，再搅拌90分钟。用31P-NMR检查起始原料的总消耗量(126.73ppm处的产物；见图6：双乙氧基炔基-亚磷酸酯粗品的合成，至图9)，以粗产物用于下面的与叠氮基-c(RGDfK)的施陶丁格反应。
c(RGDfK)-叠氮的施陶丁格反应
当使用粗品肽时，将其(66mg，88.2μmol,1eq.)溶解于DMSO(4ml，22mM)中并在火焰干燥烧瓶中干燥1小时，然后加入双乙氧基炔基-亚磷酸酯(体积根据NMR测定的产物百分比确定，132.3μmol,1.5eq.)。在室温下，反应混合物搅拌过夜，在冻干前加入4ml水并搅拌6小时。粗品用半制备型反相C18HPLC纯化(0-5min 95/5，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)；5-60min 10/90，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA))，得到白色粉末状产物(6.2mg，6.64μmol，总收率5.3％)。
取纯化的c(RGDfK)-叠氮肽(6.9mg，9.14μmol,1eq.)，将其溶解于DMSO(1.5ml，6mM)中，并在火焰干燥烧瓶中干燥1小时，然后加入双乙氧基炔基-亚磷酸酯(体积根据NMR测定的产物百分比，36.56μmol,4eq.)。在室温下将反应混合物搅拌过夜后，在冻干前，加入1.5ml水并再次搅拌6小时。粗品用半制备型反相C18HPLC纯化(0-5min 95/5，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)；5-60min 10/90，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA))纯化，得到白色粉末产物(4.1mg，4.89μmol，产率53.5％)。
终产物用LC-UV(保留时间，5.0min(0-1min 95/5,水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)；1-16.5min 5/95,水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)，RP-C18柱))和分子量分析。c(RGDfK)-炔基的色谱图见图8。HRMS:m/z:839.3636[M+H]+(计算m/z:839.3606)。
缺电子c(RGDfK)-磷酰胺酯炔的巯基化反应
与谷胱甘肽的模型反应
谷胱甘肽(1mg,3.25μmol,1eq.)和c(RGDfK)-磷酰胺炔(1.24mg,3.25μmol,1eq.)在135μl pH9.2的10mM碳酸氢铵缓冲溶液和15μl乙腈中混合(c＝21.6mM)。振摇10分钟后，用LC-UV/MS测定向加成产物的定量转化。
终产物通过LC-UV分析：保留时间4.3/4.4min(0-1min 95/5,水(0.1％TFA)/MeCN(0.1％TFA)；1-16.5min 5/95,水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)，RP-C18柱)
HRMS:m/z:1146.4451[M+H]+(计算m/z:1146.4444),573.7321[M+2H]2+(计算m/z:573.7262)
作为与硫醇反应的第一个测试底物，我们使用谷胱甘肽(GSH)，在室温下，pH8.8的略微碱性条件下，10分钟后，我们发现硫醇以几乎定量转化的方式快速、高产率地加成至磷酰胺炔(图3：施陶丁格诱导的环叠氮-RGD-肽与GSH的巯基加成反应)。
对于该模型加成产物，我们在不同的pH下以及在中性和碱性pH下添加诸如MesNa和DTT的硫醇下进行了稳定性研究。已经可以显示，形成的产物在从pH2.3到pH9.0的宽pH范围内都是稳定的(图4：c(RGDfK)-谷胱甘肽的pH稳定性)。
同时，该产品在生理的pH(PBS缓冲液；pH7.4)条件下对高浓度(0.2M，100eq.)的DTT和MesNa稳定。在pH9.0下，Mesna缓慢加成至形成的双键(4天后形成10％的加成产物)。与此相反，DTT快速形成加成产物(30小时后为42％)，随后随着时间的推移降解。
施陶丁格诱导的GFP蛋白的巯基加成
在下一步中，我们探讨了与含Cys的模型蛋白的施陶丁格诱导的偶联反应。此处，我们采用了只含有一个可寻址的半胱氨酸的突变的eGFP来与环状RGD磷酰胺进行硫醇偶联。
与GFP C70M S147C反应
将GFP C70M S147C(3.13nmol,1eq)重新缓冲至pH8.4的100μl 10mM碳酸氢铵中，并加入c(RGDfK)-磷酰胺炔(0.08mg，93.9nmol，30eq)。将反应混合物在37℃和800rpm下振摇3小时。最后，使用带有10kDa MWCO的Amicon旋转过滤器对混合物进行旋转过滤。将样品在14000rpm下进行10次旋转过滤5分钟，并添加新鲜的10mM碳酸氢铵缓冲液后，进行MALDI-TOF分析，测定生成目标产品GFP C70M S147C的总转化率。
MALDI TOF:期望值(单位：Da)：28605.31(M+H+),14303.16(M+2H+)；测定值(单位：Da)：28608.46(M+H+),14294,46(M+2H+)
使用这种方法，我们可以验证浓度为31μM的蛋白质水平上发生这种反应的可行性，通过对消化后的蛋白偶联物的MALDI-MS分析和MS/MS分析证实了，该反应中所述偶联物同样以几乎定量转化的方式形成，(图5：施陶丁格诱导的含有巯基的eGFP的硫醇加成反应)
c(RGDfK)-谷胱甘肽稳定性研究
将c(RGDfK)-谷胱甘肽以浓度为2mM溶解在不同溶剂中(pH1的0.1MHCl；pH 2.3的含0.1％TFA的30％乙腈水溶液；pH 7.4的PBS缓冲液；pH9.0的醋酸铵缓冲液；pH 12的0.05MNaOH)，并加入0.5mM肌苷作为内标物。然后在三天内监测起始原料的稳定性。
在竞争性硫醇存在下进行稳定性研究，c(RGDfK)-谷胱甘肽以浓度为2mM溶解于PBS或1M Tris HCl pH 9.0中，加入10eq.的DTT或MesNa。对混合物进行了连续几天的监测。
抗体与炔基磷酰胺的偶联
首先采用西妥昔单抗进行实验，其是抗人表皮生长因子单克隆IgG1抗体。用生物素磷酰胺修饰该抗体，并在非还原条件下通过SDS-PAGE分析，随后进行抗生物素蛋白质印迹分析(方案7)。
方案7:生物素修饰的炔基磷酰胺修饰半胱氨酸选择性抗体的两步还原和烷基化法。
在37℃下，完整的抗体通过以含有PBS(pH8.0)的50mM硼酸中的DTT孵化而被还原。反应后，通过尺寸排除柱去除多余的DTT，经还原的抗体片段以50mM碳酸氢铵缓冲液(pH8.5)中的生物素磷酰胺(每硫醇1.1当量)孵化。将EDTA(1mM)加入到反应混合物中以复合促进二硫化物形成的重金属离子。
即使完整的抗体不会由剩下的半胱氨酸的再氧化而恢复，但是蛋白质印迹分析证实了抗体片段的修饰。这可以用高度修饰来解释。如果不预先还原二硫键，则检测不到任何修饰。从而进一步证实了这些化合物对游离半胱氨酸残基的高选择性。进一步的实验将包括测定修饰程度和证明修饰抗体功能性的实验(参见图10：非还原性SDS-PAGE后的蛋白质印迹分析。SM：西妥昔单抗原料。以生物素修饰的磷酰胺孵化1:5分钟，2:1小时，3:2小时，4:20小时。预先还原二硫化物的反应(左)和未预先还原二硫化物的反应(右))。
通过西妥昔单抗-磷酰胺偶联物的胰蛋白酶消化进一步确认了半胱氨酸选择性修饰，接着进行MS/MS分析。为了简化MS/MS光谱，在先前描述的条件下用结构简单的N-苯基炔基磷酰胺乙酯进行了修饰。重链的Cys 263和轻链的Cys 214的修饰可以通过MS/MS(HCD碎片)来确认，而在二硫键未预先还原的情况下没有检测到修饰。
施陶丁格诱导的乙烯基亚磷酸酯的巯基加成:
a)多种硼烷保护的乙烯基亚磷酸酯的合成
基于已经发表的方案，以乙烯基溴化镁对氯亚磷酸二乙酯烷基化和随后的硼烷加成合成了乙烯基亚磷酸二乙酯(13)(方案8)。分离出目标亚磷酸酯，产率37％。
方案8:硼烷保护的乙烯基亚磷酸二乙酯的合成
以三氯化磷为原料，在吡啶存在下，用相应的醇取代两个氯，合成了具有不同O取代基的乙烯基亚磷酸酯。形成的单氯亚磷酸酯与乙烯基格氏试剂反应，并用硼烷保护。所有这些步骤都是一锅法完成的。
方案9:示出分离产率的由PCl3合成不同的硼烷保护的乙烯基亚磷酸二乙酯路线
由于某些醇与随后加成的格氏试剂不相容，我们以双(二异丙基氨基)氯膦为起始物，采用了一种替代路线来合成由这些醇衍生的亚磷酸酯。第一步双(二异丙氨基)乙烯基膦的烷基化，使第二步四唑介导的醇加成更够在更极性的溶剂(如乙腈)中完成。用硼烷原位处理所有亚磷酸酯，并用快速色谱法分离。
方案10:示出分离产率的由双(二异丙基氨基)氯膦合成不同的硼烷保护的乙烯基亚磷酸酯。
IIa)的实验部分
乙烯基亚磷酸二乙酯硼烷
在氩气保护下，向25ml舒伦克瓶中装入2.14ml乙烯基溴化镁(0.7M的THF溶液，1.50mmol，1.5eq.)，冷却至-78℃，并滴加140μl氯亚磷酸二乙酯(1.00mmol，1.0eq.)。允许淡黄色溶液升温至0℃，再搅拌2小时，加入1.00ml硼烷(1M的THF溶液，1.00mmol，1.0eq.)，在0℃继续搅拌1小时。减压除去有机溶剂，在硅胶上通过快速柱层析色谱法(己烷/EtOAc，9:1)纯化粗产物，以得到无色油状的目标化合物。(60mg，0.37mmol，37.0％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝6.36–6.03(m,3H),4.19–3.96(m,4H),1.33(t,J＝7.1,6H),0.55(ddd,J＝190.3,94.1,16.6,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝134.62(d,J＝8.7),130.12(d,J＝75.0),63.16(d,J＝4.8),16.59(d,J＝5.6)。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝129.58(dd,J＝167.1,82.6)。
NMR数据与文献报道18的一致。
乙烯基亚磷酸二(2-硝基苄基)酯硼烷
根据通用操作方法A，由PCl3(260μl,，3.00mmol)合成所述化合物。纯的硼烷保护的亚磷酸酯通过快速柱层析色谱(己烷/EtOAc，4:1)纯化，得到淡黄色固体。(555mg，1.48mmol，49.2％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.10(d,J＝8.2,2H),7.77–7.63(m,4H),7.57–7.44(m,2H),6.51–6.18(m,3H),5.45(qd,J＝14.8,7.5,4H),1.42–-0.02(m,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝146.80,136.84(d,J＝10.2),132.52(d,J＝6.8),129.10,129.05,128.67,128.61(d,J＝74.3),125.09,65.56(d,J＝3.6)。31PNMR(122MHz,氯仿-d)δ＝136.23(dd,J＝151.3,56.0)。C16H18BN2NaO6P+的HRMS，[M+Na]+计算：399.0888,实测399.0885
乙烯基亚磷酸二(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)酯硼烷
根据通用操作方法A，由PCl3(130μl,，1.50mmol)合成所述化合物。纯的硼烷保护的亚磷酸酯通过快速柱层析色谱(CH2Cl2/MeOH，19:1到9:1)纯化，得到无色油状物。(34mg,0.11mmol,7.3％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝6.37–6.00(m,3H),4.16(dq,J＝7.6,4.9,4H),3.70(t,J＝4.8,4H),3.64(dd,J＝5.8,3.3,4H),3.54(dd,J＝5.9,3.3,4H),3.38(s,6H),1.14–-0.12(m,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝135.00(d,J＝8.9),129.51(d,J＝75.7),71.79,70.47,70.21(d,J＝6.0),65.92(d,J＝5.2),58.95。31PNMR(122MHz,氯仿-d)δ＝133.77–130.56(m)。
乙烯基亚磷酸二苯酯硼烷
根据通用操作方法A，由PCl3(393μl,，4.50mmol)合成所述化合物。纯的硼烷保护的亚磷酸酯通过快速柱层析色谱(己烷/EtOAc，4:1)纯化，得到无色油状物。(700mg,2.71mmol,60.3％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝7.39(td,J＝7.7,5.5,4H),7.30–7.17(m,6H),6.67–6.18(m,3H),1.48–0.01(m,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝151.27(d,J＝8.7),137.01(d,J＝12.5),129.70(d,J＝1.0),129.05(d,J＝71.1),125.35(d,J＝1.3),120.90(d,J＝4.2)。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝134.08–130.87(m)。C14H16BNaO2P+的HRMS[M+Na]+，计算：281.0873,实测：281.0873。
双(4-(2-硝基-5-(氧基丙炔基)苄基氧基)苯基)乙烯基亚磷酸酯硼烷
根据通用操作方法B，由双(二异丙基氨基)氯膦(71mg，0.27mmol)合成所述化合物。所述纯的硼烷保护的亚磷酸酯通过快速柱层析色谱(己烷/CH2Cl2，1:1)纯化，得到淡黄色固体。(75mg，0.11mmol，41.9％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.25(d,J＝9.1,2H),7.47(d,J＝2.8,2H),7.17–6.87(m,10H),6.62–6.14(m,3H),5.48(s,4H),4.78(d,J＝2.4,4H),2.55(t,J＝2.4,2H),1.51–-0.24(m,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝161.89,155.27(d,J＝1.3),145.34(d,J＝8.4),140.04,137.08(d,J＝12.6),136.97,129.06(d,J＝71.3),127.77,121.93(d,J＝4.0),115.74(d,J＝1.1),113.85,113.79,76.89,76.89,67.37,56.24。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝136.36–131.69(m)。C34H30BN2NaO10P+的HRMS，[M+Na]+计算：691.1623,实测：691.1629。
双(2-硝基-5-(氧基丙炔基)苄基)乙烯基亚磷酸酯硼烷
根据通用操作方法B，由双(二异丙基氨基)氯膦(513mg，1.92mmol)合成所述化合物。所述纯的硼烷保护的亚磷酸酯通过快速柱层析色谱(己烷/CH2Cl2，4:1)纯化，得到淡黄色固体。(704mg，1.45mmol。75.6％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.19(d,J＝9.1,2H),7.31(d,J＝2.8,2H),7.00(dd,J＝9.2,2.8,2H),6.58–6.22(m,3H),5.49(qd,J＝15.5,7.4,4H),4.81(d,J＝2.4,4H),2.62(t,J＝2.4,2H),1.31–0.12(m,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝161.86,139.86,136.92(d,J＝10.4),135.78(d,J＝6.8),128.43(d,J＝73.2),127.79,114.10,113.92,76.95,76.89,65.54(d,J＝3.6),56.31。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝136.32(d,J＝107.0)。C22H22BN2NaO8P+的HRMS，计算：507.1099,实测：507.1111。
乙烯基亚磷酸双(2,2,2-三氟乙基)酯硼烷
根据通用操作方法B，由双(二异丙基氨基)氯膦(266mg，1.00mmol)合成所述化合物。所述纯的硼烷保护的亚磷酸酯通过快速柱层析色谱(己烷/CH2Cl2，9:1到4:1)纯化，得到无色液体。(87mg，0.32mmol，32.2％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝6.52–6.11(m,3H),4.36(p,J＝8.1,4H),0.62(ddd,J＝203.0,103.5,15.0,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝137.57,127.48(d,J＝79.1),122.37(qd,J＝276.0,7.5),63.60(qd,J＝37.7,2.5)。19F NMR(282MHz,氯仿-d)δ＝2.13。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝145.49(dd,J＝135.6,65.1)。
乙烯基亚磷酸双-(4-羟基苯基)酯硼烷
根据通用操作方法B，由双(二异丙基氨基)氯膦(534mg，2.00mmol)和氢醌(2.20g，10eq.)合成所述化合物。所述纯的硼烷保护的亚磷酸酯通过快速柱层析色谱(己烷/EtOAc，4:1到1:1)纯化，得到无色固体。(280mg，0.96mmol，48.3％)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ＝9.49(s,2H),6.96(d,J＝8.5,4H),6.74(d,J＝8.9,4H),6.63–6.22(m,3H),1.20–-0.12(m,3H)。31P NMR(122MHz,DMSO-d6)δ＝131.80。C14H16BNaO4P+的HRMS，计算：313.0771,实测：313.0774。
乙烯基亚磷酸二(4-硝基苄基)酯硼烷
根据通用操作方法B，由双(二异丙基氨基)氯膦(533mg，2.00mmol)合成所述化合物。所述纯的硼烷保护的亚磷酸酯通过快速柱层析色谱(己烷/CH2Cl2，9:1到4:1)纯化，得到白色固体。(540mg，1.44mmol，71.8％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.17(d,J＝8.6,4H),7.49(d,J＝8.5,4H),6.47–6.16(m,3H),5.12(qd,J＝13.2,8.3,4H),1.40–-0.00(m,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝147.66,143.09(d,J＝6.1),136.50(d,J＝10.2),128.80(d,J＝76.0),127.78,123.73,67.30(d,J＝3.8)。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝137.95(d,J＝95.6)。
2-硝基-5-(氧基丙炔基)苯甲醇
将200mg 5-羟基-2-硝基苯甲醇(1.18mmol，1.0eq.)、245mg K2CO3(1.77mmol，1.5eq.)、132μl炔丙基溴(80wt.％甲苯溶液)和4ml DMF装入5ml微波管中。将所得悬浮液在100℃辐照1h。冷却至室温后，加入5ml水。过滤所得沉淀，用水洗涤三次，真空干燥，得到179mg浅棕色固体。(0.87mmol，73.2％)
NMR数据和文献报道一致19。
4-(2硝基-5-(氧基丙炔基)苄基氧基)苯酚
在经火焰干燥的舒伦克管中，400mg 2-硝基-5-(氧基丙炔基)苯甲醇(1.93mmol，1.0eq.)、850mg氢醌(7.72mmol，4.0eq.)和750mg三苯基膦(2.90mmol，1.5eq.)溶解于10ml干燥的THF中。将溶液冷却至0℃并加滴1.33ml二乙基偶氮二甲酸酯(40％甲苯溶液)(2.90mmol，1.5eq.)，允许反应升温至室温，过夜。将粗产物在硅胶柱上干法上样进行纯化，己烷/EtOAc(7:3到3:2)洗脱，得到505mg黄色固体。(1.68mmon，87.5％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.26(d,J＝9.1,1H),7.51(d,J＝2.8,1H),7.00(dd,J＝9.2,2.9,1H),6.89(d,J＝9.0,2H),6.80(d,J＝9.0,2H),5.46(s,2H),4.79(d,J＝2.4,2H),2.54(t,J＝2.4,1H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝161.86,152.11,150.03,140.10,137.71,127.69,116.11,116.03,113.88,113.69,76.95,76.68,67.66,56.20。C16H14NO5 +的HRMS[M+H]+计算：300.0866,实测：300.0871。
小分子研究:未保护的烯基亚磷酸酯与不同叠氮化物的反应
乙烯基亚磷酸酯的施陶丁格亚磷酸酯反应首先研究了较简单的二乙基衍生物。这些化合物是由市售的氯亚磷酸二乙酯烷基化并与不同的脂肪族和芳香族叠氮化物原位反应而制备得到。在磷酰亚胺水解后，通过柱色谱分离出期望的磷酰胺。
方案11:示出分离产率的乙烯基亚磷酸二乙酯和不同的叠氮化物的施陶丁格亚磷酸酯反应。
改变磷酰胺的O-取代基便于精确调节巯基加成的反应性以及给系统增加第三功能。通过相应的亚磷酸酯的施陶丁格亚磷酸酯反应，合成了具有除乙基以外的取代基的磷酰胺。分离得到的硼烷保护亚磷酸酯用DABCO处理，以形成反应性P(III)化合物，并与叠氮化物原位反应，得到磷酰亚胺。随后通过水加成水解得到期望的磷酰胺，产率适中。
方案12:DABCO介导的乙烯基亚磷酸酯硼烷加成物脱保护后原位施陶丁格亚磷酸酯反应。
2-硝基-苄基是已知的光不稳定取代基，并已经显示在UV照射下会释放附着的分子20。根据我们在磷酰胺化学方面的专业知识，我们知道一旦磷酰胺酯裂解，磷酰胺的P-N键就非常不稳定。因此，我们想要合成2-硝基-苄基取代的磷酰胺，其能够使光介导的巯基加成偶联物的氨基酸释放变得可控。
方案13:乙烯基亚磷酸2-硝基-苄基酯和不同叠氮化物间的施陶丁格亚磷酸酯反应的分离产率。
可以合成几种2-硝基-苄基取代的磷酰胺，包括光可裂解生物素、Cy5染料和DABCYL淬灭剂变体。在2-硝基-苄基上另外的炔基给系统铜线催化点击化学增加第三功能，其可以通过光辐照再次被裂解。
方案14:两个不同炔基修饰的乙烯基亚磷酸2-硝基-苄基酯和叠氮苯间的施陶丁格亚磷酸酯反应的分离产率。
通过改变磷酰胺的电子性质可以实现后续巯基加成反应性的精确调节。因此，合成了不同的苯基以及三氟乙基衍生物。
方案15:多种乙烯基亚磷酸酯和不同的叠氮化物间的施陶丁格亚磷酸酯反应的分离产率。
一些带硼烷保护基的亚磷酸酯无法被分离出来，因为它们对应的醇与硼烷加成物不相容。我们能够证明，如方案16中所述，这些亚磷酸酯可与叠氮化物原位加成而无需分离所述的亚磷酸酯。
方案16:一锅法合成亚磷酸吡啶酯及后续与叠氮苯的施陶丁格亚磷酸酯反应。
通过31P-NMR证明了磷酰胺室温下在含水缓冲液中对不同pH的稳定性。在第一个实验中，选择乙基-N-苯基-P-乙烯基磷酰胺来测定稳定性。结果表明，该化合物在宽的pH范围内都是稳定的。P-N键在强酸性条件下发生断裂(图11：随着时间的推移乙基-N-苯基-P-乙烯基磷酰胺在不同pH下的稳定性)。
小分子硫醇和谷胱甘肽对乙烯基磷酰胺的巯基加成
在第一项研究中，在先前对炔基磷酰胺有效的反应条件下，将乙烯基磷酰胺与不同的小分子硫醇进行反应。在碳酸钾存在下，用1当量硫醇处理3h后，可观察到磷酰胺起始原料完全转化。
方案17:不同小分子硫醇对乙烯基磷酰胺乙酯的巯基加成。
在下一步中，这些反应条件现在被应用于合成水溶性谷胱甘肽磷酰胺偶联物。对水溶性4-羧基苯基-磷酰胺，在不添加任何有机溶剂的情况下进行反应。用半制备型HPLC以略微碱性的梯度分离高极性产物。
方案18:示出产率的谷胱甘肽和乙烯基磷酰胺乙酯的加成反应(半制备型HPLC)。
通过31P-NMR证明了巯基加成物室温下在含水缓冲液中对不同pH的稳定性。所述偶联物显示了在宽的pH范围内极佳的稳定性。P-N键在强酸性条件下发生断裂。没有观察到被称为反巯基加成的巯基去除(图12：随着时间的推移谷胱甘肽磷酰胺加成物在不同pH下的稳定性)。
通过向pH8.5的各种N-苯基炔基磷酰胺的碳酸氢铵缓冲溶液中加入谷胱甘肽，考察了O-取代基对反应速率的影响。不同磷酰胺随时间的转化率如图11所示。
我们发现乙烯基磷酰胺与硫醇的反应比相应的炔基衍生物慢得多。我们假设，将磷酰胺的供电子乙基替换为吸电子作用更强的取代基上会进一步提高亲电性，从而提高巯基加成的反应速率。将乙基替换为苯基已经将反应中起始原料的半衰期t1/2从10小时减少到1小时。三氟乙烯基取代进一步将T1/2降低到30分钟，而2-硝基苄基在两小时内才反应了50％(图13：pH8.5下，在与谷胱甘肽的反应中，各种N-苯基乙烯基磷酰胺的消耗量。在各时间点进行了HPLC-UV检测。实验重复三次)。
蛋白水平上乙烯基磷酰胺的巯基加成反应。
烯基磷酰胺蛋白水平的实验首先在水溶性的N–(4-羧基-苯基)-P-乙烯基-磷酰胺乙酯上开展。由于以往的研究表明，碳酸盐在促进巯基加成方面起到了很好的作用，因此首次实验选择了pH9.0的碳酸氢铵缓冲液。本研究选择了只携带一个可寻址半胱氨酸的突变的eGFP变异体。
方案19:水溶性乙烯基磷酰胺与具一个可寻址半胱氨酸的eGFP的加成反应。
在37℃下蛋白质和50当量的磷酰胺孵化。尽管16小时后对反应混合物的MALDI/MS分析显示仍有未反应的蛋白质，但我们很高兴观察到目标蛋白质偶联物的形成。
用荧光Cy5磷酰胺开展了进一步的eGFP偶联实验，并通过Cy5通道的胶内荧光测定进行观察。
方案20:具一个可寻址半胱氨酸的eGFP的Cy5磷酰胺标记。SDS Page之后读出胶内荧光值以确认选择性Cy5标记。
本实验证实了该反应对半胱氨酸残基的选择性。无论是不带可寻址半胱氨酸的eGFP变体与磷酰胺孵化，还是Cy5叠氮化物与含半胱氨酸的eGFP加成，都没有显示荧光标记。向反应混合物中加入5％DMSO(条1)或乙腈(条3)均足以溶解染料而不影响反应本身。
光可裂解的三重偶联
我们早先承认，我们能够合成含有对CuAAC有附加炔基手柄(additional alkynehandle)的邻-硝基苄基取代基的磷酰胺。这些化合物的一个可能应用是在炔基上连接生物素来纯化蛋白偶联物。我们设想生物素与链霉亲和素珠结合，未结合的物质可以被冲走，纯蛋白可以经光照洗脱。
在蛋白质水平的第一个实验中，在先前优化的条件下，首先将一个简单的带有O-取代的光可裂解炔基的N-苯基磷酰胺和我们的含有单半胱氨酸的eGFP反应。该步骤完成后，将叠氮修饰的生物素通过CuACC连接到所述构建物上，并用抗生物素蛋白质印迹法分析该偶联物。
方案21:含有一个可寻址半胱氨酸的eGFP的光可裂解炔基标记及其后经CuACC的生物素标记和蛋白质印记分析。
蛋白质印记分析证实生物素和所述eGFP构建物成功偶联。当未附着磷酰胺的eGFP用于CuACC反应中时，没有检测到生物素。在缺乏铜的情况下也是如此。
利用磷酰胺对链霉亲和素珠进行进一步的固定化实验，该磷酰胺由含叠氮的肽和含单个半胱氨酸的泛素合成。肽的高分子量诱导SDS凝胶中蛋白质的移位，从而可以估计偶联产率。
方案22:含有一个可寻址半胱氨酸的泛素的光可裂解炔基标记及其后经CuACC的生物素标记。链霉亲和素珠固定后进行蛋白质印迹分析。1：泛素起始原料，2：CuACC后的反应混合物，3：反应混合物与链霉亲和素琼脂糖孵化后的上清液，4：链霉亲和素琼脂糖洗涤后流出液，5：煮沸珠，6：辐照珠
肽与蛋白质的偶联产率估计可达60％。最后的构建物成功地固定在链霉亲和素珠上。所述构建物可以通过在SDS缓冲液中煮沸珠子(该方法可以释放完整的蛋白-肽偶联物)或通过UV光照射珠子来释放。后一种方法裂解磷酰胺酯，会导致P-N键不稳定，因此释放未偶联蛋白。进一步的实验将采用在光照下形成完整酯的磷酰胺开展，以在光照下释放偶联构建物。
b)抗体与乙烯基磷酰胺的偶联
乙烯基磷酰胺也用于单克隆抗体的修饰。因为我们发现2-硝基-苄基取代的乙烯基磷酰胺在巯基加成中反应更快，我们选择了这些磷酰胺化合物来修饰生物素。
方案23:抗体二硫键的还原及随后的生物素乙烯基磷酰胺修饰。
除巯基加成的反应条件为4℃外，我们选择了与前面描述的还原-烷基化操作方法相同的反应条件，因为我们发现较低的温度减缓了二硫化物的形成，因而使偶联产率更高。
蛋白质印迹分析证实了抗体的半胱氨酸选择性修饰。在没有事先还原二硫键的情况下，通过抗生物素蛋白印迹中信号的消失可以观察对游离半胱氨酸残基的高选择性。与使用炔基磷酰胺进行的标记实验相反，这次可以观察到抗体片段的再形成(图14：非还原SDS-PAGE后的蛋白质印记分析。SM：西妥昔单抗原料。与生物素修饰的磷酰胺孵化1：5分钟，2：1小时，3：2小时，4：4小时，5：20小时。预先还原二硫化物的反应(左)和未预先还原二硫化物的反应(右)。
通过对西妥昔单抗磷酰胺偶联物的胰蛋白酶消化而后行MS/MS分析进一步确认了半胱氨酸选择性修饰。为了简化MS/MS光谱，在之前描述过的条件下用结构简单的苯基-N-苯基炔基磷酰胺进行修饰。重链的Cys264和Cys146的修饰可以通过MS/MS(HCD碎裂)来确认，而在没有预先还原二硫键的情况下没有检测到任何修饰。
烯基亚磷酸酯用于合成ASGP-R寻址的药物偶联物
我们还准备将我们的模块偶联方法应用于靶向药物偶联物的合成。Khorev等人先前描述了一种末端氨基修饰的ASGP-R寻址的三价配体的合成。基于这一路线，我们合成了具有末端巯基修饰的同一配体(20)。
方案24:通过乙烯基磷酰胺的模块加成合成荧光标记的ASGP-R寻址的Cy5偶联物。
已经制备了巯基修饰的、完全脱保护的配体，我们成功地将该构建物与我们的荧光Cy5-磷酰胺偶联。利用这种偶联物，我们现在可以通过FACS分析和荧光显微镜监测充分摄入肝细胞。
图15显示了整个说明书中提到的序列。
经酰胺键采用通用的构建模块引入炔基-磷酰胺部分
如方案25所示的作为氨基修饰衍生物N2或NHS酯N1的通用构建模块，可以通过酰胺键形成反应将炔基-磷酰胺部分引入到功能分子中。
方案25:用于Cys残基化学选择性修饰的炔基-磷酰胺。通过通用构建模块N1和N2的化学选择性施陶丁格-亚磷酸酯反应或酰胺偶联引入。
这种方法的优越性在于技术人员不必处理不稳定的P(III)化合物。此外，已经显示，通过使用这些通用的构建模块能够实现高的产率，这对于昂贵的起始原料特别有意义。
方案26:通过酰胺键将炔基-磷酰胺部分高产率地连接到功能性荧光染料的两个实例。
经酰胺键通过通用的构建模块引入炔基-磷酰胺的操作方法制备型HPLC
制备型HPLC采用Gilson PLC 2020高效液相系统(Gilson股份有限公司，威斯康星州，米德尔顿，美国)，色谱柱采用VP 250/32Macherey-Nagel Nucleodur C18 HTec Spum柱(Macherey-Nagel股份有限公司，Kg，德国)。本说明书所有部分均采用如下梯度洗脱：方法C：(A＝水+0.1％TFA(三氟乙酸)，B＝MeCN(乙腈)++0.1％TFA，流速30ml/min，5％ B 0-5min,5-90％B 5-60min,90％ B 60-65min。方法D：(A＝水+0.1％TFA，B＝MeCN++0.1％TFA)，流速30ml/min,5％ B 0-5min,5-25％ B 5-10min,25％-45％ B 10-50min,45-90％50-60min,90％ B 60-65min.
半制备型HPLC
半制备型HPLC采用Shimadzu prominence HPLC系统(Shimadzu公司，日本)，带通信总线模块、FRC-10A流分收集器、2泵LC-20AP和SPD-20AUV/VIS检测器，色谱柱采用VP250/21Macherey-Nagel Nucleodur C18 HTec Spum柱(Macherey-Nagel股份有限公司，Kg，德国)。本说明书所有部分均采用如下梯度洗脱：方法E：(A＝水+0.1％TFA，B＝MeCN++0.1％TFA)，流速10ml/min，5％ B 0-5min,5-99％ B 5-65min,99％ B 65-75min。
合成芳香族叠氮化物的通用操作方法1
向500ml圆底烧瓶中加入10mmol芳香胺，悬浮于15ml水中并冷却至0℃。加入5ml浓盐酸水溶液，然后滴加10ml含1.27g亚硝酸钠(15.00mmol，1.50eq.)的水溶液。将混合物在0℃搅拌20分钟，加入100ml EtoAc(乙酸乙酯)，并滴加5ml含0.98g叠氮化钠(15.00mmol，1.5eq.)的水溶液。将溶液升温至室温，再搅拌一小时。进行相分离，用EtOAc萃取水相两次，合并的有机相用水洗涤两次，干燥(MgSO4)，减压去除所有挥发物。
由氯亚磷酸二乙酯合成O-乙基-炔基磷酰胺的通用操作方法2
在氩气保护下向25ml舒伦克瓶中加入173μl氯亚磷酸二乙酯(1.20mmol，1.2eq.)，冷却至-78℃，滴加2.40ml乙炔基溴化镁溶液(0.5M的THF溶液，1.20mmol，1.2eq.)。将淡黄色溶液升温至室温，加入溶解于3.0ml THF或DMF中的叠氮化物1.00mmol(1.0eq.)，并在室温下搅拌过夜。加入5ml水并继续搅拌2h。用EtOAc萃取反应混合物，干燥合并的有机相(MgSO4)，减压除去溶剂。粗品经硅胶柱层析或制备型反相HPLC纯化。
4-叠氮苯甲酸
由2.00g 4-氨基苯甲酸(14.58mmol)根据所述通用操作方法1合成所述化合物，得到淡黄色固体。(2.00g,12.26mmol,84.1％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.11(d,J＝8.4,2H),7.11(d,J＝8.4,2H)。NMR数据和文献值一致(23)。
4-叠氮苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯
在50ml圆底烧瓶中，将500mg 4-叠氮苯甲酸(3.056mmol，1.00eq.)、705mg N-羟基琥珀酰亚胺(6.112mmol，2.00eq.)和20mg 4-二甲基氨基吡啶(0.164mmol，0.05eq.)悬浮于10ml干燥CH2Cl2中。在0℃下缓慢加入1.172g EDC*HCl(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，6.112mmol，2.00eq.)，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。减压去除溶剂，粗产物在硅胶上通过柱层析纯化(50％EtOAc的己烷溶液)，得到白色固体(763mg，2.934mmol，96.0％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.14(d,J＝8.6,2H),7.15(d,J＝8.6,2H),2.92(s,4H)。13C NMR(75MHz,CDCl3)δ＝169.15,160.97,146.85,132.42,121.19,119.21,25.59。NMR数据和文献酯一致(24)。
N-(4-(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基-羰基-苯基)-P-乙炔基磷酰胺乙酯
根据所述通用操作方法2，由173μl氯亚磷酸二乙酯(1.20mmol,1.20eq.)、2.40ml乙炔基溴化镁(0.5M的THF(四氢呋喃)溶液，1.20mmol,1.20eq.)和260mg 4-叠氮苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺(1.00mmol,1.00eq.)合成所述化合物。磷酰胺粗品在硅胶上通过快速柱层析纯化(100％EtOAc)，得到淡黄色固体。(225mg,0.643mmol,64.3％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.05(d,J＝8.6,2H),7.37(d,J＝7.4,1H),7.16(d,J＝8.6,2H),4.38–4.13(m,2H),2.96(d,J＝13.2,1H),2.90(s,4H),1.40(t,J＝7.1,3H)。13CNMR(75MHz,氯仿-d)δ＝169.59,161.51,145.64,132.55,118.38,117.59(d,J＝8.0),88.69(d,J＝50.2),62.93(d,J＝5.2),25.82,16.24(d,J＝7.3)。31P NMR(122MHz,氯仿-d)δ＝-10.65。C15H16N2O6P+的HR-MS，[M+H]+计算：351.0740,实测：351.0749。
2-(4-叠氮苯基)-乙醇
根据通用操作方法1，由1.00g的2-(4-氨基苯基)-乙醇(7.21mmol)合成所述化合物，得到棕色油状物(0.50g，3.06mmol，42.5％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝7.21(d,J＝8.3,2H),6.97(d,J＝8.3,2H),3.83(t,J＝6.5,2H),2.84(t,J＝6.5,2H),1.81(s,1H)。13C NMR(75MHz,CDCl3)δ＝138.26,135.41,130.42,119.18,63.55,38.50。NMR数据与文献值一致(25)。
2-(4-叠氮苯基)-乙基-4-甲苯磺酸酯
向50ml圆底烧瓶中加入455mg的2-(4-叠氮苯基)-乙醇(2.79mmol，1.00eq.)，溶解于8ml吡啶中并冷却至0℃。分批加入787mg固体对甲苯酰氯(4.18mmol，1.50mmol)，混合物在室温下搅拌4h，加入10ml饱和氯化钠溶液和10ml水，然后黄色溶液用EtoAc萃取三次，合并的有机相用1N HCl洗涤2次，饱和NaHCO3溶液洗涤2次，用水洗涤1次。干燥有机层(MgSO4)，减压去除所有挥发物。得到黄色油状产物(0.72g,2.44mmol,87.4％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝7.69(d,J＝8.2,2H),7.30(d,J＝8.2,2H),7.10(d,J＝8.3,2H),6.91(d,J＝8.3,2H),4.21(t,J＝6.8,2H),2.94(t,J＝6.8,2H),2.45(s,3H)。13CNMR(75MHz,CDCl3)δ＝144.66,138.60,132.96,132.76,130.19,129.69,127.72,119.05,70.34,34.60,21.55。NMR数据和文献一致(26)。
2-(4-叠氮苯基)-乙基邻苯二甲酰亚胺
向50ml圆底烧瓶中加入4.11g的2-(4-叠氮苯基)-乙基-4-甲苯磺酸酯(12.95mmol，1.00eq.)，以及3.60g的邻苯二甲酰亚胺钾(19.42mmol，1.50eq.)，并溶解于60mlDMF(N，N-二甲基甲酰胺)。将棕色溶液在100℃下搅拌过夜。减压去除所有挥发物，加入50ml水用EtOAc萃取3次，合并的有机相用水洗涤2次，干燥有机层(MgSO4)，减压去除所有挥发物。该产品不经进一步纯化用于下一步反应。在硅胶上通过快速柱层析得到纯的黄色固体产物(10％到20％EtOAc的正己烷溶液)(1.75g,5.99mmol,46.2％)。
1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ＝7.85(dd,J＝5.4,3.1,2H),7.73(dd,J＝5.4,3.1,2H),7.25(d,J＝8.4,2H),6.96(d,J＝8.4,2H),3.93(dd,J＝8.3,6.8,2H),3.00(dd,J＝8.3,6.8,2H)。13C NMR(151MHz,CDCl3)δ＝168.12,138.43,134.76,133.96,132.00,130.22,123.26,119.17,39.14,33.92。
2-(4-叠氮苯基)-乙基铵盐酸盐
100ml圆底烧瓶中加入722mg的2-(4-叠氮苯基)-乙基邻苯二甲酰亚胺(2.47mmol，1.00eq.)、144μl水合肼(2.96mmol，1.20eq.)，氩气保护下溶解于20ml干燥乙醇中，溶液回流4h。减压去除大部分溶剂，加入50ml水并用1N氢氧化钠碱化悬浮液。用EtOAc萃取三次，合并的有机相用水洗涤两次，干燥有机层(MgSO4)，减压去除所有挥发物。在硅胶上通过快速柱层析法(10％甲醇的DCM(二氯甲烷)溶液+0.5％N,N-乙基二甲胺)和HCl冷冻干燥得到淡黄色固体的纯产物(224mg，1.14mmol，两步总产率46.2％)。
1H NMR(600MHz,重水)δ＝7.29(d,J＝7.6,2H),7.05(d,J＝7.6,2H),3.22(t,J＝7.2,2H),2.94(t,J＝7.2,2H)。13C NMR(151MHz,D2O)δ＝138.81,133.24,130.32,119.40,40.51,32.13。NMR数据和文献值一致(27)。
N-(4-(2-氨基乙基)苯基)-P-乙炔基磷酰胺乙酯三氟乙酸盐
根据通用操作方法2，由181μl二乙基亚磷酰氯(1.26mmol,1.20eq.)、2.52ml乙基溴化镁溶液(0.5M的THF溶液，1.26mmol，1.20eq.)和322mg2-(4-叠氮苯基)乙基铵盐酸盐(1.05mmol,1.00eq.)合成所述化合物。粗品经RP-HPLC(前述的方法C)纯化，得到棕色油状物。(209mg,0.57mmol,54.5％)
1H NMR(300MHz,乙腈-d3)δ＝7.58(s,3H),7.20–7.01(m,4H),6.96(d,J＝8.5,1H),4.26–4.05(m,2H),3.42(d,J＝12.8,1H),3.08(d,J＝7.8,2H),2.88(dd,J＝9.0,6.4,2H),1.31(t,J＝7.1,3H)。13C NMR(75MHz,乙腈-d3)δ＝161.38(q,J＝34.7),139.20(d,J＝1.3),131.75,130.66,119.63(d,J＝7.3),90.09(d,J＝47.2),77.02(d,J＝265.0),63.54(d,J＝5.3),41.92,33.19,16.41(d,J＝7.3)。31PNMR(122MHz,乙腈-d3)δ＝-9.71。C12H18N2O2P+的HR-MS，[M+H]+计算：253.1100,实测：253.1095。
5-((2-(O-乙基-P-乙炔基-磷酰胺基-N-苯甲酰)乙基)氨基)萘-1-磺酸
反应在DMF中进行。将265μl 100mM的N-(4-(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧-羰基-苯基)-P-乙炔基磷酰胺乙酯(0.0265mmol，1.00eq.)溶液和1.06ml50mM的5-(2-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸酯(0.0530mmol，2.00eq.)溶液与795μlDMF一起预混，并加入530μl 200mM的DIPEA(0.1060mmol，4.00eq.)溶液。混合物在室温下振摇2小时，减压去除所有挥发物，使用上述方法C，通过制备型高效液相色谱纯化粗混合物，冻干后获得白色固体的目标化合物。(9,30mg,0.0186mmol,70.0％)
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝8.78(d,J＝8.5,1H),8.57(t,J＝5.7,1H),8.36(d,J＝8.6,1H),8.11(d,J＝8.4,1H),7.99(d,J＝7.0,1H),7.80(d,J＝8.7,2H),7.43(dd,J＝8.5,7.1,1H),7.38(t,J＝8.1,1H),7.14(d,J＝8.7,2H),6.92(d,J＝7.5,1H),4.43(d,J＝12.7,1H),4.21–4.05(m,2H),3.62(q,J＝6.3,2H),3.46(t,J＝6.6,2H),1.31(t,J＝7.0,3H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ＝167.03,144.64,143.48,141.01,130.59,128.98,127.65,126.47,125.13,124.62,123.86,123.13,119.62,117.34(d,J＝7.8),107.91,91.69(d,J＝45.5),77.26(d,J＝260.8),62.31(d,J＝5.0),45.51,38.15,16.42(d,J＝6.9)。31P NMR(243MHz,DMSO)δ＝-10.35。C23H25N3O6PS+的HR-MS[M+H]+，计算：502.1196,实测：502.1195。
Cy5-O-P-乙炔基-磷酰胺乙酯
所述Cy5-COOH根据我们实验室之前发表的方法制备(28)。5ml圆底烧瓶中加入33.2mg Cy5-COOH(0.0628mmol,1.00eq.)、35.8mg HATU((1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸酯),0.0942mmol,1.5eq.)和200μl DMF。深蓝色溶液冷却至0℃，加入32μlDIPEA(N,N-二异丙基乙胺，0.1884mmol,3.0eq.)5分钟后，滴加300μlDMF中23mgN-(4-(2-氨基乙基)苯基)-P-乙炔基磷酰胺乙酯TFA盐(0.0628mmol,1.00eq.)。所述溶液升温至室温并搅拌2小时。减压去除所有的挥发物，粗产物在硅胶上通过快速柱层析纯化(0％到5％甲醇的DCM溶液)，得到蓝色固体。(45mg,0.0590mmol,93.9％)。
1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ＝7.88(td,J＝13.0,4.9,2H),7.43–7.33(m,4H),7.23(t,J＝7.4,2H),7.15–7.07(m,4H),7.01(d,J＝8.4,2H),6.72(t,J＝12.5,1H),6.46(bs,1H),6.18(dd,J＝13.6,8.5,2H),6.11(q,J＝7.6,1H),4.27–4.09(m,2H),3.98(t,J＝7.6,2H),3.56(s,3H),3.43(q,J＝6.9,2H),2.97(d,J＝12.8,1H),2.75(t,J＝7.5,2H),2.25(t,J＝7.3,2H),1.81(p,J＝8.0,2H),1.73–1.67(m,2H),1.70(s,6H),1.69(s,6H),1.55–1.42(m,2H),1.35(t,J＝7.1,3H)。13C NMR(151MHz,CDCl3)δ＝173.64,173.19,173.11,153.34,152.99,142.72,141.90,141.17,140.89,136.88,133.32,129.69,128.78,128.66,126.32,126.22,125.34,125.15,122.21,122.13,118.60,118.53,110.83,110.36,103.77,103.64,88.54,88.23,75.27,62.46,49.40,49.17,44.22,41.03,35.94,34.78,27.96,27.90,27.84,27.09,26.32,25.24,16.17,16.11,16.04。31P NMR(243MHz,CDCl3)δ＝-9.08。
施陶丁格诱导的炔基磷酰胺巯基加成来制备抗体药物偶联物(ADCs)。
如上所述，我们能够证明用炔基-和烯基-磷酰胺修饰全长IgG抗体是可能的。在上述实施例中，我们采用西妥昔单抗作为示例性抗体，如Senter和同事已经描述的那样，通过还原和烷基化方法将链间二硫化物用生物素化的磷酰胺修饰(29)。这一概念被进一步发展为一个产生ADCs的可行体系，通过磷酰胺介导偶联高效微管蛋白结合的细胞毒素MMAE和Her2结合抗体曲妥珠单抗。
与上述对西妥昔单抗的研究类似，我们还原了曲妥珠单抗与二硫苏糖醇(DTT)的链间二硫键，并进行了Cys与不同的亲电生物素衍生物(包括马来酰亚胺、碘乙酰胺和炔基-磷酰胺(磷酰胺标记))的偶联反应，以直接与现有技术进行比较。后者采用施陶丁格亚磷酸酯反应方法合成，总收率72％。在二硫键事先还原和未事先还原的情况下进行抗体标记反应，以探究Cys偶联反应的化学选择性(图16)。蛋白质印记分析显示，使用还原曲妥珠单抗对所有测试生物素衍生物进行了充分标记。最引人注目的是，我们观察到马来酰亚胺与非还原曲妥珠单抗的高反应性，其进一步被胰蛋白酶消化和MS/MS分析证实。相比之下，磷酰胺标记显示了对Cys残基的突出的选择性(图16)。
图16示出：A：用三种不同的Cys反应性生物素衍生物对曲妥珠单抗进行修饰。用溶于50mM含PBS的硼酸盐缓冲液的中1000eq.DTT在37℃下进行30分钟的二硫键还原。通过尺寸排除色谱法去除多余的DTT。在含有50mM NH4HCO3和1mM EDTA的缓冲液中，最终二甲基亚砜含量为1％，使用35eq.生物素衍生物进行标记，酰胺盐和含有1mM EDTA的PBS的pH值为8.5，其他两种化合物的pH值为7.4。B：蛋白质印迹分析。通道1和5：未经处理的抗体。通道2-4：DTT预处理的反应。通道6-8：未经DTT预处理的对照反应。
由强效抗有丝分裂毒素MMAF和FDA批准的靶向Her2抗增殖抗体曲妥珠单抗制备了磷酰胺连接的ADCs(图17)。为了研究毒性有效载荷的释放，在所述抗体和所述毒素之间制备了具有组织蛋白酶B裂解侧(缬氨酸-瓜氨酸连接子VC)的ADC。磷酸酰胺-VC-PAB-MMAF构建体根据之前描述的操作方法，如方案27所述合成。
方案27：磷酸酰胺连接的，组织蛋白酶B可裂解的单甲基澳瑞他汀(auristatin)F(MMAF)偶联物的合成路线。VC：缬氨酸-瓜氨酸二肽，PAB：对氨基苄基，PNP：对硝基苯基碳酸盐。
在用DTT还原链间二硫键并通过ZebaTM旋转脱盐柱去除过量还原剂后，在pH8.5的50mM碳酸氢铵缓冲液中，14℃下反应16小时进行曲妥珠单抗的偶联。
图17示出：用磷酸酰胺修饰的、组织蛋白酶可裂解的MMAF(磷酰胺-VC-PAB-MMAF)修饰曲妥珠单抗。A：链间二硫键的还原和烷基化反应方案。B：反应的SDS-PAGE分析。C：PNGase F去甲酰化和DTT还原后的抗体片段的质谱图的反卷积。LC：轻链；HC：重链；mod：磷酸酰胺-VC-PAB-MMAF。
在去糖基化和还原后通过ESI-MS确定每个抗体平均负载4.6个药物分子。我们用不同程度修饰的重链和轻链质谱信号强度来估算药物-抗体比(DAR)。
在已经建立的基于Her2的增殖试验中，用两种不同的Her2过表达的细胞株BT474和SKBR3来评估制备的磷酰胺-ADC偶联物(30)。Her2非过表达细胞株MDAMB468用作对照，以证明Her2的选择性。将磷酰胺连接的偶联物与马来酰亚胺连接的组织蛋白酶B可裂解的曲妥珠单抗MMAF偶联物进行比较。这些实验清楚地证明了磷酰胺标记的MMAF-ADCs能够大量地选择性地杀死Her2过表达细胞。测得的IC50值至少与马来酰亚胺对照组相当(图18)。值得注意的是，令人意想不到的是，与马来酰亚胺化合物相比，磷酰胺标记的偶联物显示出对体外杀灭细胞作用有积极影响的优点。
图18示出：在两种不同的Her2过表达细胞系(BT474和SKBR3)和一种对照细胞系(MDAMB468)上，MMAF-连接的曲妥珠单抗的抑制增殖能力增强。图中示出了抗体处理4后抗体浓度依赖的增殖的细胞数量。仅曲妥珠单抗(粉红色)、曲妥珠单抗-磷酰胺-MMAF(蓝色)和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-MMAF(绿色)。
制备抗体药物偶联物(ADCs)的施陶丁格诱导的炔基亚磷酸酯巯基加成的操作方 法
N-(4-叠氮苯甲酰)-L-缬氨酸
氩气保护下，向50ml舒伦克瓶中加入1.00g 4-叠氮苯甲酸(6.13mmol，1.00eq.)，和一滴DMF(N，N-二甲基甲酰胺)一起悬浮于8.5ml干燥DCM(二氯甲烷)中。在0℃下添加630μl的草酰氯，并在室温下将反应混合物搅拌2h，直到溶液变得澄清。减压除去所有挥发物，剩余的固体在4ml DMF中重新溶解。在0℃将相应溶液滴加到含720mg L-缬氨酸(6.13mmol，1.00eq.)和612mg氢氧化钠(15.33mmol，2.50eq.)的8ml水溶液中并搅拌2小时以上。溶液用1N盐酸酸化，再用乙醚萃取三次。合并有机相，干燥(MgSO4)，减压去除溶剂。在硅胶上通过快速柱层析(30％乙醇和0.5％甲酸的正己烷溶液)得到无色烟气的纯产物。(954mg，4.96mmol，80.9％)
1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ＝10.12(s,1H),7.79(d,J＝8.6,2H),7.05(d,J＝8.6,2H),6.79(d,J＝8.5,1H),4.76(dd,J＝8.5,4.9,1H),2.33(pd,J＝6.9,4.9,1H),1.03(d,J＝6.9,3H),1.01(d,J＝6.9,3H)。13C NMR(151MHz,CDCl3)δ＝175.82,167.28,144.03,130.17,129.13,119.20,77.16,57.79,31.40,19.16,17.99。C12H15N4O3+的HR-MS，[M+H]+计算：263.1139,实测：263.1151。
N-(4-叠氮苯甲酰)-L-缬氨酸-酐
在100ml圆底烧瓶中，将954mg N–(4-叠氮苯甲酰)-L-缬氨酸(3.64mmol，1.00eq.)、750mg二环己基碳二亚胺(3.64mmol，1.00eq.)、418mg N-羟基琥珀酰亚胺(3.64mmol，1.00eq.)和9mg 4-(二甲氨基)-吡啶(0.07mmol，0.02eq.)溶解于25ml THF中，并在室温下搅拌过夜。过滤反应混合物，用THF洗涤固体数次，减压去除溶剂，粗产物在硅胶上通过快速柱层析(20到40％EtOAc的正己烷溶液)纯化。分离得到的化合物为白色粉末(513mg，1.01mmol，55.7％)。
1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ＝8.01(d,J＝8.7,2H),7.13(d,J＝8.7,2H),4.29(d,J＝4.6,1H),2.39(heptd,J＝6.9,4.6,1H),1.16(d,J＝6.9,3H),1.03(d,J＝6.9,3H)。13CNMR(151MHz,CDCl3)δ＝177.52,160.90,144.51,129.60,122.43,119.30,70.68,31.28,18.76,17.57。
N-(4-叠氮苯甲酰基)-L-缬氨酸-L-瓜氨酸
在50ml圆底烧瓶中，将380mg N-(4-叠氮苯甲酰)-L-缬氨酸-酐(0.75mmol，1.00eq.)溶解于2ml的1,2-二甲氧基乙烷中，并冷却至0℃。滴加入溶解于4ml H2O和2mlTHF(四氢呋喃)中的351mg L-瓜氨酸(1.50mmol，2.00eq.)和144mg碳酸氢钠(2.25mmol，3.00eq.)的溶液，并室温下搅拌过夜。减压除去所有挥发物，粗产物在硅胶上通过快速柱层析(10％甲醇和0.5％甲酸的CH2Cl2溶液)。分离得到无色油状物的目标产物(312mg，0.74mmol，99.0％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝8.31(d,J＝8.8,1H),8.27–8.21(m,1H),7.96(d,J＝8.6,2H),7.20(d,J＝8.6,2H),6.05(t,J＝5.5,1H),5.47(s,2H),4.37(t,J＝8.3,1H),4.18(td,J＝8.1,5.1,1H),2.98(q,J＝6.4,2H),2.15(dq,J＝13.6,6.8,1H),1.78–1.68(m,1H),1.68–1.56(m,1H),1.51–1.35(m,2H),0.96(d,J＝6.8,3H),0.94(d,J＝6.8,3H)。13C NMR(151MHz,DMSO)δ＝174.09,171.54,165.99,159.40,142.77,131.36,129.93,119.23,59.31,52.57,49.07,30.77,29.01,27.07,19.75,19.28。C18H26N7O5+的HR-MS，[M+H]+计算：420.1990,实测：420.1990。
N-(4-叠氮苯甲酰基)-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-4-氨基苄基醇
50ml圆底瓶内，氩气保护下，330mgN-(叠氮苯甲酰基)-L-缬氨酸-L-瓜氨酸(1.0mmol，1.0eq.)和107mg4-氨基苄基醇(0.866mmol，1.10eq.)溶解于8ml CH2Cl2和4mlMeOH(甲醇)中，并冷却至0℃。分批加入390mgN-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(1.574mmol，2.00eq.)，得到的溶液升温至室温并放置过夜。减压下除去全部的挥发物，粗产物在硅胶上通过快速柱层析分离(10％到15％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到白色固体(164mg，0.313mmol，39.8％)。经制备型HPLC分离得到纯对映异构体(前述“经酰胺键通过通 用的构建模块引入炔基-磷酰胺的操作方法”项下的方法D)，冷冻干燥后得到白色固体。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝9.93(s,1H),8.32(d,J＝8.4,1H),8.21(d,J＝7.6,1H),7.96(d,J＝8.6,2H),7.55(d,J＝8.6,2H),7.24(d,J＝8.6,2H),7.21(d,J＝8.6,2H),6.12(bs,2H),4.44(s,2H),4.46–4.40(m,1H),4.36(t,J＝8.1,1H),3.09–2.93(m,2H),2.24–2.04(m,J＝6.7,1H),1.84–1.58(m,2H),1.55–1.34(m,2H),0.95(d,J＝6.7,3H),0.94(d,J＝6.7,3H)。13C NMR(151MHz,DMSO)δ＝171.62,170.79,166.15,159.46,142.83,137.95,137.91,131.29,129.96,127.38,119.34,119.26,63.07,59.56,53.64,39.20,30.61,29.88,27.16,19.79,19.37。C25H33N8O5 +的HR-MS，[M+H]+计算：525.2568,实测：525.2563。(c＝0.81；甲醇)
N-(4-(O-乙基-P-乙炔基-磷酰胺-N-苯甲酰基)-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-4-氨基苄基醇
所述化合物由230μl氯亚磷酸二乙酯(0.925mmol，5.0eq.)、1.85ml乙炔溴化镁(0.5M THF溶液,0.925mmol，5.0eq.)和97mg N-(4-叠氮苯甲酰基)-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-4-氨基苄基醇(0.185mmol，1.0eq.)按照常规方法合成。粗磷酰胺经制备型HPLC纯化(前述“经 酰胺键通过通用的构建模块引入炔基-磷酰胺的操作方法”项下的方法C)，冷冻干燥后得到白色固体。(60mg，0.098mmol，52.9％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝9.96(s,1H),8.80(d,J＝8.5,1H),8.22(d,J＝7.7,1H),8.11(dd,J＝8.6,1.9,1H),7.82(d,J＝8.7,2H),7.56(d,J＝8.4,2H),7.24(d,J＝8.4,2H),7.14(d,J＝8.7,2H),4.39–4.46(m,4H),4.33(t,J＝8.1,1H),4.20–4.03(m,2H),3.02(ddt,J＝38.3,13.4,6.8,2H),2.20–2.09(m,J＝6.9,1H),1.79–1.57(m,2H),1.53–1.35(m,2H),1.31(t,J＝7.1,3H),0.95(d,J＝6.9,3H),0.93(d,J＝6.9,3H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ＝171.74,170.81,166.59,159.53,143.51,137.93(d,J＝9.0),129.31,127.57,127.38,119.34,117.24(d,J＝7.7),91.68(d,J＝45.5),77.25(d,J＝261.1),63.06,62.29(d,J＝5.0),59.45,53.61,39.27,30.70,29.82,27.03,19.82,19.32,16.42(d,J＝6.9)。31PNMR(243MHz,DMSO-d6)δ＝-13.28,-13.32.C29H40N6O7P+的HR-MS[M+H]+，计算：615.2691,实测：615.2716。
N-(4-(O-乙基-P-乙炔基-磷酰胺-N-苯甲酰基)-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-4-氨基苄基-4-硝基苯基碳酸酯
5ml圆底烧瓶内加入31mgN-(4-(O-乙基-P-乙炔基-磷酰胺-N-苯甲酰基)-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-4-氨基苄基醇(0.050mmol，1.00eq.)和31mg二(4-硝基苯基)碳酸酯(0.101mmol，2.00eq.)。所述固体溶解于140μlDMF(N,N-二甲基甲酰胺)，然后加入17.4μlDIPEA(N,N-二异丙基乙胺，0.101mmol，2.00eq.)室温下搅拌得到的黄色溶液1h，然后加入30ml冰乙醚。经离心过滤收集沉淀，重新溶解于DMF中，乙醚再次沉淀。该操作重复共三次，最后，固体在高真空条件下干燥。分离得到定量产率和纯度足够的目标化合物，以用于下步反应。经制备型HPLC，采用前述“经酰胺键通过通用的构建模块引入炔基-磷酰胺的操作方 法”项下的方法C纯化得到分析纯的化合物。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝10.10(s,1H),8.79(d,J＝8.5,1H),8.32(d,J＝9.1,1H),8.23(d,J＝7.4,1H),8.07(dd,J＝8.5,2.2,1H),7.81(d,J＝8.7,2H),7.66(d,J＝8.5,2H),7.57(d,J＝9.1,1H),7.42(d,J＝8.5,2H),7.13(d,J＝8.7,2H),5.25(s,2H),4.47–4.40(m,2H),4.34(t,J＝8.0,1H),4.20–4.05(m,2H),3.01(ddt,J＝47.1,13.4,6.8,2H),2.20–2.09(m,J＝6.8,1H),1.80–1.59(m,2H),1.55–1.35(m,2H),1.30(t,J＝7.0,3H),0.95(d,J＝6.7,3H),0.93(d,J＝6.7,3H)。13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ＝171.79,171.17,166.58,159.44,155.75,152.42,145.63,143.50,139.83,129.95,129.77,129.30,127.59,125.86,123.08,119.51,117.24(d,J＝7.8),91.67(d,J＝45.6),77.26(d,J＝261.0),70.71,62.26(d,J＝5.0),59.31,53.68,39.14,30.71,29.76,27.19,19.80,19.30,16.41(d,J＝6.9)。31PNMR(243MHz,DMSO)δ＝-10.39,-10.44。C36H43N7O11P+的HR-MS，[M+H]+计算：780.2753,实测：780.2744.
酰胺化-Val-Cit-Pab-MMAF
15ml猎鹰管(falcon-tube)中加入14.35mg N-(4-(O-乙基-P-乙炔基-磷酰胺-N-苯甲酰基)-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-4-氨基苄基-4-硝基苯基碳酸酯(0.0184mmol，1.00eq.)、0.50mg1-羟基苯并三唑(0.0037mmol，0.20eq.)和13.15mgMMAF(单甲基澳瑞他汀F，0.0184mmol，1.00eq.)。所述固体溶解于250ml干燥的DMF和25ml吡啶中，加热至60℃并放置过夜。减压除去所有挥发物，粗产物经半制备HPLC纯化，采用“经酰胺键通过通用的构建模 块引入炔基-磷酰胺的操作方法”项下的方法E，冷冻干燥后得到白色固体的目标产物。(4.84mg，0.0035mmol，19.2％)。(C69H104N11O16P2+的HR-MS，[M+2H]2+计算：686.8695,实测：686.8694。
图19示出了UPLC-UV检测的磷酰胺-Val-Cit-Pab-MMAF的纯度。
曲妥珠单抗的生产
按照已公开的方法进行曲妥珠单抗的表达和纯化，在GE公司的Superdex200Increase 10/300上凝胶过滤进行附加的最终纯化，以磷酸盐缓冲盐水(PBS)流率0.75ml/min洗脱(30)。
经还原/烷基化方法修饰曲妥珠单抗的通用操作方法。
通过在37℃下，在总体积80μl的含有50mM硼酸钠和4mM DTT的PBS(pH8.0)缓冲液中孵化新表达的抗体(c＝0.55mg/ml)40分钟进行曲妥珠单抗修饰。随后，采用0.5mL具有7KMWCO的ZebaTM旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国)去除过量的DTT并将缓冲液替换为含有50mM NH4HCO3和1mM EDTA(pH8.5)的溶液。快速加入1.60μl含有13mM酰胺化合物的DMSO溶液。14℃下，将混合物以800rpm振摇16小时。再次采用0.5mL具有7K MWCO的ZebaTM旋转脱盐柱通过将缓冲液置换为无菌PBS来除去过量的酰胺化合物。
基于细胞的抗增殖试验
按照已公开的方法进行抗增殖试验(30)，细微的不同之处动在于：
-对于MDAMB468细胞，96孔透光细胞培养板每孔接种细胞量减少至2*103个细胞，悬浮在100μL培养基中。
-图像由装备有20倍高数值孔径物镜的Operetta高内涵成像系统(PerkinElmer,沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)采集。
-细胞计数通过平行操作的计算得到。
制备抗体荧光团偶联物(AFCs)的施陶丁格诱导的炔基亚磷酸酯巯基加成。通过前述“制备抗体药物偶联物(ADCs)的施陶丁格诱导的炔基磷酰胺巯基加成”项下类似的方法，荧光染料Cy5与曲妥珠单抗偶联，从而得到一种抗体-荧光团偶联物。按照前述“经酰胺键通过通用的构建模块引入炔基-磷酰胺部分”项下的方法开展了Cy5-O-乙基-P-炔基-磷酰胺的合成。通过对两种不同的Her2过表达的细胞株BT474和SKBR3进行免疫染色来评价获得的磷酰胺-AFC偶联物。Her2非过表达细胞株MDAMB 468被用作对照，以证明Her2的选择性。在细胞固定后，所述两个Her2表达的细胞株观察到足够强的膜染色，而Her2非表达的细胞株没有显示荧光增强。
图20：示出了细胞表面受体Her2过度表达的细胞(BT474和SKBR3)或Her2低表达的细胞(MDAMB468)固定后的免疫染色。AFC(曲妥珠单抗-酰胺-Cy5)显示出对Her2+细胞株清晰的质膜定位，而对Her2-细胞无染色。合并后的图像以蓝色显示DAPI信号和红色显示曲妥珠单抗-磷酰胺-Cy5的信号。比例尺代表10μm。
制备抗体荧光团偶联物(AFCs)的陶丁格诱导的炔基亚磷酸酯巯基加成的操作方 法
根据上述“制备抗体药物偶联物(ADCs)的施陶丁格诱导的炔基亚磷酸酯巯基加成”项下的通用操作方法合成了曲妥珠单抗-Cy5偶联物，但有以下细微的不同：将酰胺当量提高到130，DMSO(二甲基亚砜)含量为提高到5％(更准确地说，从2％提高到5％)以使Cy5溶解。
AFC成像操作方法：
将BT474、SKBR3和MDAMB468接种在无菌盖玻片上，并在37℃、5％CO2条件下孵化以使细胞附着。细胞在1xPBS/4％PFA(甲醛)中固定10分钟，在此之前用1xPBS清洗细胞三次。加入等体积的1xPBST(PBS+0.05％吐温20)来终止固定，然后再用PBST冲洗两次。加入AFCs使终浓度为5μg/mL，并在室温下孵化1h。用PBS清洗三次去除未结合的AFC。
在配备63x1.40浸油物镜的徕卡SP5共聚焦显微镜系统上采集图像。采用405nm和594nm激光结合标准DAPI和Cy5过滤设置。采用Fiji处理包扩展的ImageJ 1.5.1h软件进行图像处理。
磷酰胺连接的稳定性研究
为了研究磷酰胺键在如细胞裂解液或血清等复杂体系中的稳定性，合成了一对染料淬灭剂，其在磷酰胺键断裂后产生荧光信号。偶联物由荧光染料EDANS、淬灭剂DABCYL和连接的肽组成，以确保偶联物的水溶性(图21)。合成了马来酰亚胺连接的偶联物用于对照实验(图21B)。
图21示出了：A：磷酰胺连接的FRET偶联物的结构。B：马来酰亚胺连接的FRET偶联物的结构C：基于荧光淬灭的读出原理。在室温下以10μM的浓度培养偶联物。在96孔板中至少重复三次进行测量。D：随着时间的推移检测到的荧光增强。HCl样品在测量前被中和。裂解液由Hela细胞新鲜制备，在PBS中裂解。血清来源于人的血液。E：在暴露于PBS中1000eq.谷胱甘肽期间，磷酰胺连接的和马来酰亚胺连接的染料猝灭剂对的比较。
如图21所示，磷酰胺加合物在PBS、Hela细胞裂解液和人血清中表现出高稳定性，只有强酸性条件(1N HCl)才导致磷酰胺键断裂。同时，FRET偶联物也暴露于大量的谷胱甘肽中。在生理pH下，以1000eq.谷胱甘肽孵化2天后，15％的马来酰亚胺连接键断裂，而99％的磷酰胺加合物仍然保持完整(图21C)。
在下一个实验中，我们探讨了在硫醇存在的情况下，磷酰胺标记的或马来酰亚胺标记的ADCs的修饰元素是否转移到血清蛋白中，因为在血液循环中ADCs能够维持数天的稳定性是至关重要的。用不同生物素衍生物修饰的曲妥珠单抗(图22)暴露于浓度0.5mM的血清样白蛋白中，37℃下孵化，并通过蛋白质印记监测修饰从抗体到血清蛋白的转移(图22B)。在血清浓度下，马来酰亚胺连接的偶联物观察到生物素显著转移至BSA(牛血清白蛋白)上，而在试验条件下，磷酰胺连接的偶联物却是稳定的。综上所述，这些稳定性实验清楚表明，与马来酰亚胺标记的ADCs相比，磷酰胺标记的ADCs具有更高的稳定性，那么与传统的马来酰亚胺连接的偶联物相比，可能降低脱靶毒性。
图22示出：抗体修饰向血清蛋白的转移。A：在37℃下，浓度3μM的曲妥珠单抗生物素偶联物在PBS中用500μMBSA孵化。B：通过蛋白质印记分析监测生物素向白蛋白的转移。通道1：未经处理的马来酰亚胺偶联物。通道2-5：暴露于BSA 0、1、2和5天后的马来酰亚胺加合物的分析。通道6：未处理的酰胺偶联物。通道6-10：暴露于BSA 0、1、2和5天后的酰胺加合物的分析。
磷酰胺连接稳定性研究的操作方法
DABCYl-Cys肽
采用标准的基于Fmoc的化学方法，通过人工偶合的线性合成法合成了DABCYl-Cys肽。将0.1mmol的Rink酰胺树脂(底物：0.4mmol/g)添加到反应容器中，并在过量5倍氨基酸的情况下进行合成。通过用20％哌啶的DMF溶液处理树脂两次5分钟从而去除Fmoc。通过加入HOBt/HBTU/DIPEA(5eq./5eq./10eq)的DMF溶液反应45分钟完成偶联。在最后的Cys偶联之后，5eq.的DABCYL酸与5eq.的HATU和10eq.的DIPEA在DMF中偶联45分钟。通过在3小时内加入TFA/DTT/TIS(95/2.5/2.5,w,w,w)，将肽从树脂上剪切下来。随后，加入冰乙醚来沉淀肽。离心收集沉淀，干燥并通过制备型HPLC纯化(前述“经酰胺键通过通用的构建模块引入 炔基-磷酰胺的操作方法”项下所述的方法C)。得到红色固体的目标肽，产率35.8％(38.2mg,35.8μmol)。ESI-MSfor C48H66N12O14S+[M+2H]+计算：533.23,实测：533.34。
DABCYl-Cys肽磷酰胺EDANS加合物
在1.5-ml Eppendorf管中加入溶解于pH8.5的50mM NH4HCO3中的DABCYl-Cys肽(20mM)溶液263μl，并加入溶解于DMF中的EDANS酰胺化物(100mM)溶液105μl，使肽和酰胺化物在20％DMF/缓冲液中的终浓度分别为20mM和10mM。在室温下以800rpm的速度振摇3h。减压去除所有挥发物，粗产物通过半制备型HPLC纯化(前述“经酰胺键通过通用的构建模块引 入炔基-磷酰胺的操作方法”项下所述的方法E)。得到的目标肽为红色固体C71H90N15O20PS2 +的ESI-MS，[M+2H]+计算：783.78,实测：784.47。
DABCYl-Cys肽马来酰胺EDANS加合物
在1.5-ml Eppendorf管中加入DABCYl-Cys肽(20mM)的PBS溶液188μl。加入EDAN马来酰亚胺(40mM)的DMF溶液188μl，以使所述肽和马来酰亚胺化物在50％DMF/缓冲液中的终浓度分别为10mM和20mM。在室温下以800rpm的速度振摇试管3h。减压除去所有挥发物，粗产物用半制备型HPLC纯化(前述“经酰胺键通过通用的构建模块引入炔基-磷酰胺的操作方 法”项下所述的方法E)。得到的目标肽为红色固体。C66H83N15O20S2 +的ESI-MS，[M+2H]+计算：734,.77:,实测.734,.79
所述Dabcyl-EDANS加合物的稳定性研究
稳定性研究至少在96孔板(Corning3615，黑底透明平底)上重复进行三次。在每个孔中加入5μl 200μM的Dabcyl-EDANS加合物储备溶液和95μl相应的试验溶液。
由大约1*107个细胞在400μl PBS中经超声裂解产生HeLa细胞裂解液。在75cm2细胞培养板上培养细胞，PBS洗涤两次，用细胞刮刀收获细胞。人血清购自Sigma Aldrich公司。谷胱甘肽以浓度10mM溶解于PBS，调pH至7.4。在200μM下进行1NHCl的研究，荧光测定前中和至pH7并稀释至10μM。
在Tecan Safire平板读数器上测量荧光。激发：336nm，发射：490nm，带宽：5nm，20℃。
用BSA孵化曲妥珠单抗-生物素偶联物
37℃下，在PBS中浓度为3μM的曲妥珠单抗-生物素偶联物与最终浓度为0.5mM的BSA进行孵化。0、1、2和5天后提取样品，在液氮中深度冷冻，最后进行SDS/PAGE和蛋白质印记分析。
巯基加成反应的进一步动力学研究
为了研究在低浓度下炔烃磷酰胺的巯基加成反应的动力学，如1.1章所述，合成了一种基于荧光EDAN的磷酰胺。用荧光高效液相色谱法研究了谷胱甘肽作为模型底物随时间的加成反应。以未结合EDAN的峰积分和归一化为内标，测定了反应的二级速率常数。测定的二级速率常数为37,32±0,41l/mol*s。
图23示出：巯基加成反应的二级速率常数的测定。A：EDANS磷酰胺与谷胱甘肽的反应。B：反应时间30分钟后荧光HPLC示踪。C：监测磷酰胺随时间的减少。D：反向浓度与反应时间的关系图。误差条代表三次重复的平均值(n＝3)。
巯基加成反应进一步动力学研究的操作方法
1％DMF存在下，在pH8.5含有1mM EDTA的50mM NH4HCO3缓冲液中，以最终浓度分别为0.1mM酰胺化物、0.1mM谷胱甘肽和0.02mM EDANS(作为内标物)进行谷胱甘肽和EDANS-磷酰胺酯的加成反应。将2.5μl溶于DMF中浓度为20mM的EDANS-磷酰胺酯储备溶液与488μl缓冲液以及5μl溶于1:1的DMF和缓冲液的混合溶液中浓度为2mM的EDANS储备溶液预混。通过加入5μl溶于缓冲液浓度为10mM的谷胱甘肽溶液而开始反应。在0、15、30、60、120、240和480分钟时提取10μl样品，并用190μl 10mM NaOAc缓冲液(pH 5.0)酸化，然后进行荧光高效液相色谱分析。
进一步亚磷酸酯的合成
此外，如方案E2所示，改变了炔基亚磷酸酯上的O-取代基，合成了富电子的亚磷酸酯E1到E5：
方案28：由双(二异丙基)-氨基氯膦合成亚磷酸酯。图中所示为E1-E5的各个亚磷酸酯的产率。
进一步亚磷酸酯E1到E5的合成操作方法
由双(二异丙基)-氨基氯膦合成O-取代的炔基磷酰胺的通用操作方法
氩气保护下，25ml舒伦克瓶中加入267mg双(二异丙基氨基)氯膦(1.00mmol,1.00eq.)，冷却到0℃，滴加2.20ml乙炔溴化镁溶液(0.5M的THF溶液，1.10mmol，1.10eq.)。得到的黄色溶液升温至室温，搅拌30分钟。加入溶解于5.56ml的1H-四唑(1H-tetrazol)溶液(0.45M乙腈溶液，2.50mmol)中的相应的醇，室温下白色混悬液搅拌过夜。反应混合物在硅胶快速柱上直接上样。
乙炔亚磷酸二-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)酯(化合物E1)
按照上述“由双(二异丙基)-氨基氯膦合成O-取代的炔基磷酰胺的通用操作方法”，由267mg双(二异丙基)-氨基氯膦(1.00mmol,1.00eq.)、2.20ml乙炔溴化镁溶液(0.5M的THF溶液，1.10mmol,1.10eq.)、1.06g2-(2-羟基乙氧基)乙烯-1-醇(10.00mmol,10.00eq.)和5.56ml1H-四唑溶液(0.45M的乙腈溶液，2.50mmol)合成目标化合物，在硅胶上通过快速柱层析纯化(5％甲醇的二氯甲烷溶液)。得到淡黄色油状的目标化合物。(112mg，0.421mmol，42.1％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝4.14–3.98(m,4H),3.65–3.59(m,4H),3.58–3.49(m,8H),3.15(d,J＝2.4,1H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝92.52,92.50,84.61,83.98,72.60,70.72(d,J＝4.0),67.20(d,J＝6.0),61.44。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝92.51(d,J＝1.4),84.30(d,J＝46.8),72.60,70.72(d,J＝4.0),67.20(d,J＝6.0),61.44。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝131.97。
乙炔基亚磷酸二-(3-丁炔基)酯(化合物E2)
按照上述“由双(二异丙基)-氨基氯膦合成O-取代的炔基磷酰胺的通用工艺”，由267mg双(二异丙基)-氨基氯膦(1.00mmol,1.00eq.)、2.20ml乙炔溴化镁溶液(0.5M的THF溶液，1.10mmol,1.10eq.)、189μl 3-丁炔基-1-醇(2.50mmol,2.50eq.)和5.56ml1H-四唑溶液(0.45M的乙腈溶液，2.50mmol)合成目标化合物，在硅胶上通过快速柱层析纯化(10％乙酸乙酯的正己烷溶液)。得到无色油状的目标化合物。(152mg,0.774mmol,77.4％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝4.07(dtd,J＝8.1,7.0,1.5,4H),3.14(d,J＝2.3,1H),2.56(tdd,J＝7.0,2.7,0.6,4H),2.03(t,J＝2.7,2H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝92.42(d,J＝1.3),83.92(d,J＝47.1),80.24,70.02,65.81(d,J＝6.5),21.28(d,J＝4.7)。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝130.15。
化合物E3、E4和E5的合成工艺在下文的“O-取代基上具有可裂解基团的化合物的合成操作方法”项下提供。
亚磷酸酯E1和E2的施陶丁格亚磷酸酯反应
通过在水溶液中进行炔基亚磷酸酯的施陶丁格亚磷酸酯反应，进一步探究了富电子亚磷酸酯的高稳定性。如图24所示，在纯水系统中观察到由炔基亚磷酸酯E1形成目标产物。
图24示出：叠氮修饰肽与水溶性亚磷酸酯E1在Tris缓冲液中的反应。A：反应方案。B：HPLC示踪；橙色：起始物质；蓝色：反应2h后。
亚磷酸酯E1和E2的施陶丁格反应亚磷酸酯的操作方法
肽E9
采用标准的基于Fmoc的化学方法，通过人工偶合的线性合成法合成了E9肽。将0.1mmol的Rink酰胺树脂(底物：0.4mmol/g)添加到反应容器中，并在过量5倍氨基酸的情况下进行合成。通过用20％哌啶的DMF溶液处理树脂两次5分钟而去除Fmoc。通过加入HOBt/HBTU/DIPEA(5eq./5eq./10eq)的DMF溶液反应45分钟完成偶联。在最后的Gly偶联之后，5eq.的4-叠氮苯甲酸与5eq.的HATU和10eq.的DIPEA在DMF中偶联45分钟。通过在3小时内加入TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5,w,w,w)，将肽从树脂上剪切下来。随后，加入冰乙醚来沉淀肽。离心收集沉淀，干燥并通过制备型HPLC纯化(前述“经酰胺键通过通用的构建模块引入炔 基-磷酰胺的操作方法”项下所述的方法C)。C37H50N11O13+的ESI-MS，[M+H]+计算：856.36,实测856.36。
碱性tris缓冲液中肽E9和磷酰胺化合物E1的施陶丁格亚磷酸酯反应
10μl的溶于100mM Tris缓冲液浓度为50mM的肽E9储备液加入80μl的100mM Tris缓冲液(pH 9.0)中。加入10μl的溶于同样的缓冲液的浓度为500mM的亚磷酸酯E1溶液，37℃下800RPM振摇2小时。取样10μl，用溶于H2O的1％ TFA稀释，进行UPLC-MS分析。
E6的合成
通用操作方法：将1.00mmol有机叠氮化物(1.00eq.)和1.00mmol炔基亚磷酸酯(1.00eq.)在5ml DMF中搅拌过夜。减压去除有机溶剂，残余物在硅胶上通过柱层析纯化。在此通用操作后，将37mg乙炔基亚磷酸二-(3-丁炔基)酯(化合物E2)(0.192mmol，1.00eq.)和50mg 4-叠氮苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.162mmol，1.00eq.)在1ml DMF中混合，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(70％乙酸乙酯的己烷溶液)。得到无色油状的目标化合物。(55mg,0.147mmol,76.6％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.33–7.93(m,3H),7.21(d,J＝8.8,2H),4.47–3.94(m,2H),3.06(d,J＝13.2,1H),2.89(s,4H),2.65(td,J＝6.7,2.7,2H),2.07(t,J＝2.7,1H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ169.61,161.42,145.52,132.30,118.19,117.72(d,J＝8.1Hz),89.38(d,J＝50.0Hz),79.09,70.94,63.92(d,J＝5.0Hz),31.48,25.69,20.57(d,J＝8.2Hz)。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝-9.74。
在O-取代基上具有可裂解基团的化合物的合成及裂解实验。
在O-取代基上引入可裂解基团
前面已经叙述过，可裂解的二硫化物可用于在还原条件下释放特定的有效载荷。例如，该方法已应用于细胞环境中从抗体药物偶联物(ADC)特定释放细胞毒性的有效载荷(31)。在本文中，可以显示在β位携带离去基团的二硫化物在二硫键断裂后进行环化形成环硫乙烷，并释放特定的有效载荷(32)。
为了本发明的目的，如方案29所示，设想合成具有包含O-取代基的可裂解二硫键的偶联物。
方案29：通过施陶丁格亚磷酸酯反应合成具有包含可裂解二硫键的O-取代基的偶联物。
合成了下列在O-取代基具有可裂解基团R的化合物，并进行裂解实验：
其中R是
合成在O-取代基上具有可裂解基团的化合物的操作方法
合成2-羟乙基二硫化物的通用操作方法1
250ml圆底烧瓶中加入10mmol(1.00eq.)相应的硫醇、10mmol2-巯基乙醇、0.1mmol碘化钠和20ml EtOAc。混合物快速搅拌并滴加10mmol30％H2O2的水溶液。所得的混合物在室温下搅拌1h，减压除去挥发物，经柱层析分离所述二硫化物。
2-羟乙基乙基二硫醚
按照上述“合成2-羟乙基二硫化物的通用操作方法1”，由2.00ml乙硫醇(27.74mmol,1.00eq.)、1.96ml2-巯基乙醇(27.74mmol,1.00eq.)、41mg碘化钠(0.28mmol,0.01eq.)和3.14ml过氧化氢溶液(水溶液，30％)(27.74mmol,1.00eq.)合成所述化合物。所述二硫化物在硅胶上通过柱层析分离(20％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到无色油状物2.15g(15.53mmol,56.0％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝3.91(dd,J＝5.7,2H),2.87(t,J＝5.7,2H),2.74(q,J＝7.3,2H),2.08(s,1H),1.35(t,J＝7.3,3H)。
2-羟乙基异丙二硫醚
按照上述“合成2-羟乙基二硫化物的通用操作方法1”，由2.00ml异丙硫醇(21.53mmol,1.00eq.)、1.52ml2-巯基乙醇(21.53mmol,1.00eq.)、32mg碘化钠(0.21mmol,0.01eq.)和2.44ml过氧化氢溶液(水溶液，30％)(21.53mmol,1.00eq.)合成所述化合物。所述二硫化物在硅胶上通过柱层析分离(10％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到无色油状物1.10g(7.22mmol,33.6％)
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝3.88(m,2H),3.02(hept,J＝6.7,1H),2.85(t,J＝5.9,2H),2.37(m,1H),1.32(d,J＝6.7,6H)。13C NMR(75MHz,CDCl3)δ＝60.48,41.94,41.14,22.54。
2-羟乙基叔丁基二硫醚
按照上述“合成2-羟乙基二硫化物的通用操作方法1”，由2.00ml叔丁硫醇(17.74mmol,1.00eq.)、1.24ml2-巯基乙醇(17.74mmol,1.00eq.)、26mg碘化钠(0.18mmol,0.01eq.)和2.04ml过氧化氢溶液(水溶液，30％)(17.74mmol,1.00eq.)合成所述化合物。所述二硫化物在硅胶上通过柱层析分离(10％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到无色油状物0.90g(5.41mmol,30.5％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝3.87(t,J＝5.9,2H),2.86(t,J＝5.9,2H),2.33(bs,1H),1.35(s,9H)。NMR数据与文献值一致(33)。
2-(3-羟丙基)异丙基二硫醚
500ml圆底烧瓶中装入2.00ml硫代乳酸(23.55mmol,1.00eq.)和150ml干燥的THF。0℃下分批加入1.60g氢化锂铝(47.10,2.0eq.)。混合物室温下搅拌1h，然后再次冷却到0℃，小心地用6N HCl淬灭反应。水相用100ml EtOAc萃取两次，合并有机相，干燥(MgSO4)，减压除去所有的挥发物。剩余的无色油状物重新溶解于20ml EtOH和2.18ml异丁基硫醇(23.55mmol,1.00eq.)中，加入55mg碘化钠(0.24mmol,0.01eq.)和2.70ml过氧化氢溶液(水溶液，30％)(23.55mmol,1.00eq.)。黄色溶液继续搅拌1小时。减压除去所有的挥发物，在硅胶上通过柱层析纯化分离无色油状的上述二硫化物(20％ EtOAc的己烷溶液)。产量：1.15g(6.928mmol,29.4％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝3.69(dd,J＝5.8,3.2,2H),3.08–2.83(m,2H),1.37–1.25(m,9H)。13C NMR(75MHz,CDCl3)δ＝65.49,48.70,41.66,22.60,22.51,16.89。
1-(4-(羟甲基)苯基)-2-苯基二氮烯
所述化合物根据已公开的方法合成，分离得到橙色的固体(34)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.03–7.86(m,4H),7.68–7.42(m,5H),4.81(s,2H)。NMR数据与文献值一致(34)。
由双(二异丙基氨基)氯膦合成O-取代的炔基亚磷酸酯的通用操作方法2
氩气保护下，25ml舒伦克瓶加入267mg双(二异丙基氨基)氯膦(1.00mmol，1.00eq.)，冷却至0℃，滴加2.20ml乙炔溴化镁溶液(0.5M的THF溶液，1.10mmol，1.10eq.)。淡黄色溶液升温至室温，继续搅拌30分钟。加入溶解于5.56ml1H-四唑(1H-tetrazol)溶液(0.45M的乙腈溶液，2.50mmol)的相应的醇，室温下将白色混悬液搅拌过夜。将反应混合物直接上样于硅胶快速柱。
乙炔亚磷酸二-(乙基二硫)乙基)酯
根据上述“由双(二异丙基氨基)氯膦合成O-取代的炔基亚磷酸酯的通用操作方法2”，由116mg双(二异丙基氨基)氯膦(0.44mmol，1.00eq.)、0.96ml乙炔溴化镁(0.5M的THF溶液，0.48mmol，1.10eq.)、150mg2-羟乙基乙基二硫醚(1.10mmol，2.50eq.)和2.42ml1H-四唑溶液(0.45M的乙腈溶液，1.10mmol，2.50eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(10％到20％ EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为淡黄色油状物。(112mg,0.34mmol,77.0％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝4.22(dt,J＝7.6,6.8,4H),3.15(d,J＝2.3,1H),2.95(t,J＝6.8,4H),2.75(q,J＝7.3,4H),1.35(t,J＝7.3,6H)。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝130.46。
乙炔亚磷酸二-(2-异丙基二硫)乙基)酯
根据上述“由双(二异丙基氨基)氯膦合成O-取代的炔基亚磷酸酯的通用操作方法2”，由213mg双(二异丙基氨基)氯膦(0.80mmol，1.00eq.)、1.76ml乙炔溴化镁(0.5M的THF溶液，0.88mmol，1.10eq.)、370mg2-羟乙基异丙基二硫醚(2.00mmol，2.50eq.)和4.44ml1H–四唑溶液(0.45M的乙腈溶液，2.00mmol，2.50eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(10％EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为淡黄色油状物。(183mg,0.51mmol,63.9％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝4.21(dt,J＝8.0,6.8,4H),3.15(d,J＝2.3,1H),3.04(p,J＝6.7,2H),2.94(t,J＝6.8,4H),1.33(d,J＝6.7,12H)。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝130.40。
乙炔亚磷酸二-(2-叔丁基二硫)乙基)酯
根据上述“由双(二异丙基氨基)氯膦合成O-取代的炔基亚磷酸酯的通用操作方法2”，由167mg双(二异丙基氨基)氯膦(0.63mmol，1.00eq.)、1.38ml乙炔溴化镁(0.5M的THF溶液，0.69mmol，1.10eq.)、260mg2-羟乙基叔丁基二硫醚(1.57mmol，2.50eq.)和3.48ml1H–四唑溶液(0.45M的乙腈溶液，1.57mmol，2.50eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(10％EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为淡黄色油状物。(190mg,0.49mmol,78.5％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝4.20(dt,J＝7.9,6.9,4H),3.14(d,J＝2.2,1H),2.95(t,J＝6.9,4H),1.36(s,18H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝92.35(d,J＝1.0),84.21(d,J＝47.8),66.37(d,J＝6.1),47.98,40.77(d,J＝4.3),29.89。31PNMR(122MHz,CDCl3)δ＝130.28。
乙炔亚磷酸二-((2-异丙基二硫)-3-丙基)酯
根据上述“由双(二异丙基氨基)氯膦合成O-取代的炔基亚磷酸酯的通用操作方法2”，由267mg双(二异丙基氨基)氯膦(1.00mmol，1.00eq.)、2.20ml乙炔溴化镁(0.5M的THF溶液，1.10mmol，1.10eq.)、415mg2-(3-羟丙基)异丙基二硫醚(2.50mmol，2.50eq.)和5.55ml1H–四唑溶液(0.45M的乙腈溶液，2.50mmol，2.50eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(0％到10％ EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为非对映异构体混合物，淡黄色油状物。(91mg,0.235mmol,23.5％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝4.28–4.06(m,2H),3.99–3.81(m,2H),3.21–3.10(m,1H),3.07-2.95(m,4H),1.37–1.28(m,18H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝92.39(d,J＝3.6),84.32(d,J＝49.3),71.18(d,J＝4.9),48.18–44.79(m),41.65,22.55(d,J＝6.5),17.12。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝130.56,130.32,130.10。
乙炔亚磷酸二-(4-乙酰氧基苯基)酯
根据上述“由双(二异丙基氨基)氯膦合成O-取代的炔基亚磷酸酯的通用操作方法2”，由267mg双(二异丙基氨基)氯膦(1.00mmol，1.00eq.)、2.20ml乙炔溴化镁(0.5M的THF溶液，1.10mmol，1.10eq.)、415mg2-(3-羟丙基)异丙基二硫醚(2.50mmol，2.50eq.)和5.55ml1H–四唑溶液(0.45M的乙腈溶液，2.50mmol，2.50eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(30％ EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为无色油状物。(118mg,0.306mmol,30.6％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝7.34(d,J＝8.5,4H),7.08(d,J＝8.5,4H),4.95(dd,J＝8.4,1.7,4H),3.20(d,J＝2.3,1H),2.32(s,6H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ＝169.44,150.37,135.31(d,J＝4.3),128.89,121.68,92.68,84.40(d,J＝47.6),69.35(d,J＝6.8),21.16。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝131.09。乙炔亚磷酸二(4-(二氮苯基)-苄基)酯
根据上述“由双(二异丙基氨基)氯膦合成O-取代的炔基亚磷酸酯的通用操作方法2”，由98mg双(二异丙基氨基)氯膦(0.37mmol，1.00eq.)、0.80ml乙炔溴化镁(0.5M的THF溶液，0.4mmol，1.10eq.)、195mg1-(4-羟甲基)苯基)-2-苯基二氮烯(0.93mmol，2.50eq.)和2.00ml1H–四唑溶液(0.45M的乙腈溶液，0.93mmol，2.50eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(0％-10％ EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为橙色固体。(82mg,0.171mmol,46.3％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝7.98–7.86(m,8H),7.59–7.44(m,10H),5.08(d,J＝8.5,4H),3.24(d,J＝2.3,1H)。13C NMR(75MHz,Chloroform-d)δ＝152.60,152.27,140.55(d,J＝4.3),131.07,129.09,128.24,123.03,122.90,92.89,84.35(d,J＝47.2),69.54(d,J＝6.9)。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝131.77。由炔基亚磷酸酯和叠氮化物合成O-取代炔基磷酰胺的通用操作方法3
1.00mmol的有机叠氮化物(1.00eq.)和1.00mmol的炔基亚磷酸酯(1.00eq.)在5mlDMF中搅拌过夜。减压除去有机溶剂，剩余物在硅胶上通过柱层析纯化。
2-异丙基-二硫-乙基-N-(4-苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯)-P-乙炔磷酰胺
根据上述“由炔基亚磷酸酯和叠氮化物合成O-取代炔基磷酰胺的通用操作方法3”，由147mg乙炔亚磷酸二(2-异丙基二硫)乙基)酯(0.411mmol，1.00eq.)和106mg4-叠氮苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(0.411mmol，1.00eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(60％ EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为无色油状物。(80mg,0.175mmol,42.6％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.08(d,J＝8.7,2H),7.20(d,J＝8.8,2H),7.13(d,J＝7.5,1H),4.63–4.18(m,2H),3.23–2.76(m,8H),1.31(dd,J＝6.7,1.0,6H)。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝-10.16。
2-叔丁基-二硫-乙基-N-(4-苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯)-P-乙炔磷酰胺
根据上述“由炔基亚磷酸酯和叠氮化物合成O-取代炔基磷酰胺的通用操作方法3”，由50mg乙炔亚磷酸二(2-叔丁基二硫)乙基)酯(0.129mmol，1.00eq.)和33mg4-叠氮苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(0.129mmol，1.00eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(70％ EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为无色油状物。(29mg,0.0638mmol,47.4％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.06(d,J＝8.7,2H),7.49(d,J＝7.5,1H),7.21(d,J＝8.7,2H),4.58–4.26(m,2H),3.09–2.81(m,7H),1.33(s,9H)。31PNMR(122MHz,CDCl3)δ＝-9.98。
2-异丙基二硫-3-丙基-N-(4-苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯)-P-乙炔磷酰胺
根据上述“由炔基亚磷酸酯和叠氮化物合成O-取代炔基磷酰胺的通用操作方法3”，由61mg乙炔亚磷酸二(2-异丙基二硫)-3-丙基)酯(0.158mmol，1.00eq.)和40mg4-叠氮苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(0.158mmol，1.00eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(70％ EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为无色油状物。(32mg,0.068mmol,43.0％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝8.05(d,J＝8.7,2H),7.84–7.74(m,1H),7.21(d,J＝8.8,2H),4.57–4.27(m,2H),3.20–2.66(m,7H),1.46–1.21(m,9H)。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝-9.87。
4-乙酰氧基-苄基-N-(4-苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯)-P-乙炔磷酰胺
根据上述“由炔基亚磷酸酯和叠氮化物合成O-取代炔基磷酰胺的通用操作方法3”，由103mg乙炔亚磷酸二(4-乙酰氧基苄基)酯(0.267mmol，1.00eq.)和69mg4-叠氮苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(0.267mmol，1.00eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(70％ EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为无色油状物。(36mg,0.077mmol,28.7％)。
1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ＝7.53–7.34(m,2H),7.20–6.99(m,7H),5.14(d,J＝8.8,2H),3.01(d,J＝13.3,1H),2.91(s,4H),2.32(s,3H)。31P NMR(122MHz,CDCl3)δ＝-10.33。
4-二氮苯基-苄基-N-(4-苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯)-P-乙炔磷酰胺
根据上述“由炔基亚磷酸酯和叠氮化物合成O-取代炔基磷酰胺的通用操作方法3”，由71mg乙炔亚磷酸二(4-(二氮苯基)-苄基)酯(0.148mmol，1.00eq.)和39mg4-叠氮苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(0.148mmol，1.00eq.)合成所述化合物，并在硅胶上通过快速柱层析纯化(50％ EtOAc的己烷溶液)。得到的目标化合物为橙色固体。(58mg,0.112mmol,75.8％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝9.44(d,J＝8.6,1H),8.02(d,J＝8.8,2H),7.96–7.89(m,4H),7.67(d,J＝8.5,2H),7.64–7.57(m,3H),7.33(d,J＝8.8,2H),5.28(ddd,J＝45.1,12.5,8.7,2H),4.61(d,J＝13.0,1H),2.88(s,4H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ＝170.90,161.75,152.36,152.23,147.36,139.31(d,J＝7.6),132.33,132.17,129.97,129.41,123.14,123.08,118.17(d,J＝8.1),117.25,93.06(d,J＝46.9),76.49(d,J＝265.4),66.88,25.98。31P NMR(243MHz,DMSO)δ＝-10.42。
磷酰胺-NHS酯和EDANS间形成酰胺键的通用操作方法4
0.1mmolNHS磷酰胺(1.00eq.)和0.12mmol 5-((2-氨乙基)氨基萘-1-磺酸钠盐(1.20eq.)溶解于10mLDMF中。加入0.40mmol的DIPEA(4.0eq.)，混合物室温下搅拌3小时。减压除去所有的挥发物，粗混合物采用前述“经酰胺键通过通用的构建模块引入炔基-磷酰胺 的操作方法”项下所述的方法E，经制备型HPLC纯化。
5-((2-(O-(2-异丙基-二硫-乙基)-P-乙炔-磷酰胺-N-苄氧基)乙基)氨基)萘-1-磺酸
根据上述“磷酰胺-NHS酯和EDANS间形成酰胺键的通用操作方法4”，由72mg2-异丙基-二硫-乙基-N-(4-苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯)-P-乙炔磷酰胺(0.157mmol，1.00eq.)、54mg5-((2-氨乙基)氨基萘-1-磺酸钠盐(0.188mmol，1.20eq.)和109μl DIPEA(0.628mmol，4.0eq.)合成所述化合物，并经半制备型HPLC纯化(前述“经酰胺键通过通用的构建模块引 入炔基-磷酰胺的操作方法”项下所述的方法E)。得到的化合物为白色固体。(62mg，0.102mmol，64.9％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝8.90(d,J＝8.8,1H),8.61(t,J＝5.6,1H),8.56(d,J＝8.6,1H),8.13(d,J＝8.3,1H),8.04(dd,J＝7.2,1.1,1H),7.82(d,J＝8.7,2H),7.60–7.31(m,2H),7.17(d,J＝8.8,2H),4.51(d,J＝12.8,1H),4.37–4.17(m,2H),3.65(q,J＝6.3,2H),3.52(t,J＝6.5,2H),3.07(p,J＝6.7,1H),3.03(t,J＝6.3,2H),1.24(dd,J＝6.7,2.8,6H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ＝167.03,144.53,143.31,130.53,129.02,127.63,126.33,125.44,125.15,124.70,123.21,117.55,117.50,92.38(d,J＝45.7),76.79(d,J＝262.5),63.85(d,J＝4.7),46.85,40.77,39.01(d,J＝7.7),37.65,22.72。31P NMR(243MHz,DMSO)δ＝-9.84。
5-((2-(O-(2-叔丁基-二硫-乙基)-P-乙炔-磷酰胺-N-苄氧基)乙基)氨基)萘-1-磺酸
根据上述“磷酰胺-NHS和EDANS间形成酰胺键的通用操作方法4”，由10mg2-叔丁基-二硫-乙基-N-(4-苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯)-P-乙炔磷酰胺(0.021mmol，1.00eq.)、7mg5-((2-氨乙基)氨基萘-1-磺酸钠盐(0.025mmol，1.20eq.)和15μl DIPEA(0.084mmol，4.0eq.)合成所述化合物，并经半制备型HPLC纯化(前述“经酰胺键通过通用的构建模块引 入炔基-磷酰胺的操作方法”项下所述的方法E)。得到的化合物为白色固体。(8mg，0.013mmol，62,3％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝8.87(d,J＝8.7,1H),8.57(t,J＝5.8,1H),8.21(d,J＝8.6,1H),8.10(d,J＝8.5,1H),7.94(dd,J＝7.1,1.2,1H),7.80(d,J＝8.7,2H),7.36(dd,J＝8.5,7.1,1H),7.31(dd,J＝8.7,7.5,1H),7.14(d,J＝8.8,2H),6.74(d,J＝7.6,1H),4.49(d,J＝12.8,1H),4.37–4.11(m,2H),3.60(q,J＝6.4,2H),3.40(t,J＝6.5,2H),3.03(t,J＝6.5,2H),1.29(s,9H)。31P NMR(243MHz,DMSO)δ＝-9.87。
5-((2-(O-(2-异丙基-二硫-3-丙基)-P-乙炔-磷酰胺-N-苄氧基)乙基)氨基)萘-1-磺酸
根据上述“磷酰胺-NHS和EDANS间形成酰胺键的通用操作方法4”，由29mg2-异丙基-二硫-3-丙基-N-(4-苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯)-P-乙炔磷酰胺(0.081mmol，1.00eq.)、21mg5-((2-氨乙基)氨基萘-1-磺酸钠盐(0.073mmol，1.20eq.)和42μl DIPEA(0.244mmol，4.0eq.)合成所述化合物，并经半制备型HPLC纯化(前述“经酰胺键通过通用的 构建模块引入炔基-磷酰胺的操作方法”项下所述的方法E)。得到的化合物为非对映异构体混合物，白色固体。(15mg，0.024mmol，39.5％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝8.88(d,J＝8.8,1H),8.58(t,J＝5.7,1H),8.35(d,J＝8.6,1H),8.10(dt,J＝8.6,1.1,1H),7.98(dd,J＝7.1,1.1,1H),7.81(d,J＝8.7,2H),7.39(ddd,J＝31.3,8.6,7.3,2H),7.15(d,J＝8.8,2H),6.91(d,J＝7.5,1H),4.51(dd,J＝12.9,1.8,1H),4.25–4.13(m,1H),4.13–3.98(m,1H),3.61(q,J＝6.4,2H),3.45(t,J＝6.6,2H),3.18(dtd,J＝10.6,6.8,5.2,1H),3.03(h,J＝6.7,1H),1.30–1.19(m,9H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ＝166.92,144.74,143.21,130.61,128.96,127.79,126.43,125.10,124.61,123.82,123.09,117.50(d,J＝7.5),92.58(d,J＝9.5),92.28(d,J＝9.4),76.76(d,J＝262.3),68.10(d,J＝4.9),45.48,41.32(d,J＝8.6),38.15,22.74,17.14(d,J＝4.1)。31P NMR(243MHz,DMSO)δ＝-9.76,-9.79。
5-((2-(O-(4-乙酰氧基苄基)-P-乙炔-磷酰胺-N-苄氧基)乙基)氨基)萘-1-磺酸
根据上述“磷酰胺-NHS和EDANS间形成酰胺键的通用操作方法4”，由36mg4-乙酰氧基-苄基-N-(4-苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯)-P-乙炔磷酰胺(0.076mmol，1.00eq.)、22mg5-((2-氨乙基)氨基萘-1-磺酸钠盐(0.095mmol，1.20eq.)和53μl DIPEA(0.284mmol，4.0eq.)合成所述化合物，并经半制备型HPLC纯化(前述“经酰胺键通过通用的构建模块引 入炔基-磷酰胺的操作方法”项下所述的方法E)。得到的化合物为白色固体。(14mg，0.023mmol，30.4％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝8.92(d,J＝8.6,1H),8.56(t,J＝5.7,1H),8.32(d,J＝8.7,1H),8.10(d,J＝8.5,1H),8.03–7.92(m,1H),7.80(d,J＝8.6,2H),7.47(d,J＝8.5,2H),7.41(dd,J＝8.5,7.2,1H),7.36(t,J＝8.1,1H),7.17(d,J＝6.7,2H),7.15(d,J＝6.7,2H),6.88(d,J＝7.5,1H),5.25–5.05(m,2H),4.49(d,J＝12.8,1H),3.61(q,J＝6.3,2H),3.44(t,J＝6.6,2H),2.28(s,3H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ＝169.61,166.95,150.96,144.73,143.29,133.66(d,J＝7.7),130.61,129.81,128.99,127.82,126.47,125.06,124.53,123.68,123.10,122.42,117.44(d,J＝7.9),92.28(d,J＝45.6),77.01(d,J＝261.8),66.59(d,J＝4.4),45.26,38.24,21.31。31P NMR(243MHz,DMSO)δ＝-9.87。
5-((2-(O-(4-二氮苯基-苄基)-P-乙炔-磷酰胺-N-苄氧基)乙基)氨基)萘-1-磺酸
根据上述“磷酰胺-NHS和EDANS间形成酰胺键的通用工艺4”，由27mg4-二氮苯基-苄基-N-(4-苯甲酸-N-羟基丁二酰亚胺酯)-P-乙炔磷酸酯(0.053mmol，1.00eq.)、15mg5-((2-氨乙基)氨基萘-1-磺酸钠盐(0.064mmol，1.20eq.)和37μl DIPEA(0.212mmol，4.0eq.)合成所述化合物，并经半制备型HPLC纯化(前述“经酰胺键通过通用的构建模块引入炔基- 磷酰胺的步骤”项下所述的方法E)。得到的化合物为橙色固体。(18mg，0.027mmol，50.9％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ＝8.98(d,J＝8.7,1H),8.57(t,J＝5.7,1H),8.36(d,J＝8.6,1H),8.11(d,J＝8.5,1H),7.98(d,J＝7.1,1H),7.97–7.88(m,4H),7.81(d,J＝8.8,2H),7.66(d,J＝8.5,2H),7.64–7.52(m,4H),7.42(dd,J＝8.5,7.1,1H),7.37(t,J＝8.1,1H),7.18(d,J＝8.7,2H),6.92(d,J＝7.5,1H),5.37–5.04(m,2H),4.53(d,J＝12.8,1H),3.61(q,J＝6.4,2H),3.45(t,J＝6.6,2H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ＝166.95,152.36,152.18,144.75,143.27,139.56,139.51,132.15,130.61,129.97,129.32,129.01,127.84,126.44,125.11,124.62,123.83,123.13,123.07,117.49(d,J＝8.0),92.47(d,J＝45.9),76.95(d,J＝262.7),66.56(d,J＝4.4),45.47,38.15。31P NMR(243MHz,DMSO)δ＝-9.68。
Cys-模型肽和不同O-取代的EDANS磷酰胺加成反应的通用操作方法5。
新鲜制备等体积的5mM相应的EDANS-磷酸酯的DMF溶液和前述DABCYL修饰的Cys肽溶于100mM NH4HCO3-缓冲溶液(pH8.5)的浓度为5mM的溶液，混合，室温下振摇1h。减压除去所有的挥发物，经半制备HPLC分离所述巯基加成物(前述“经酰胺键通过通用的构建模块引 入炔基-磷酰胺的步骤”项下所述的方法E)。分离得到的偶联物进行HPLC-MS分析，结果如下面的表5和图25所示：
表5
用TCEP裂解具二硫键的酰胺加成物的操作方法
磷酸缓冲溶液(PBS)中各个肽(SM1-3)的浓度1mM的储备液10μl与80μl的PBS预混。加入10μl的溶于PBS的浓度10mM的三-(2-羧基乙基)-膦的储备液，得到的溶液在37℃下振摇1小时。随后取样15μl，用15μl的2％三氟乙酸(TFA)的水溶液稀释，行UPLC-MS分析。UPLC-MS分析结果如图26A-C所示。红线示出了与TCEP共孵化的分析结果，黑线代表仅有PBS的分析结果。吸收峰通过质谱进行鉴别。结果显示包含二硫键的O-取代基被裂解，包含EDANS的部分从起始原料中被释放出来。
用细胞裂解液裂解包含酯的酰胺加成物的操作方法
PBS中肽SM4的浓度1mM的储备液10μl与90μl新鲜制备的PBS中的Hela-裂解液预混。得到的溶液在37℃下振摇1小时。随后取样15μl，用15μl的2％三氟乙酸(TFA)的水溶液稀释，行UPLC-MS分析。UPLC-MS分析结果如图27所示。红线示出了与细胞裂解液共孵化的分析结果，黑线代表仅有PBS的分析结果。吸收峰通过质谱进行鉴别。结果显示磷原子上包含酯部分的O-取代基被裂解，包含EDANS的部分从起始原料中被释放出来。
用连二亚硫酸钠裂解包含二氮的酰胺加成物的操作方法
PBS中肽SM5的浓度1mM的储备液10μl与80μlPBS预混。加入PBS中的浓度200mM的TCEP的储备液10μl，得到的溶液在37℃下振摇1小时。随后取样15μl，用15μl的2％ TFA的水溶液稀释，行UPLC-MS分析。UPLC-MS分析结果如图28所示。红线示出了与TCEP孵化的分析结果，黑线代表仅有PBS的分析结果。吸收峰通过质谱进行鉴别。结果显示磷原子上包含二氮部分的O-取代基被裂解，包含EDANS的部分从起始原料中被释放出来。
因此，上述结果证明，含有不同可裂解基团的酰胺类化合是可以被裂解的，所述可裂解基团作为磷原子上的O取代基。
在不希望受任何理论约束的情况下，对于磷原子上的含二硫键的基团，其裂解的机理认为是这样的：如方案31中所示，即通过二硫键的还原性裂解，环化为环硫乙烷，生成游离的氨基磷酸，其经过P-N-水解从而以游离胺的形式释放出有效载荷。
方案30：还原性裂解和释放机理。
用于与蛋白偶联的二硫取代的亚磷酸酯
环状细胞穿透肽c(TAT)通过施陶丁格诱导的巯基加成反应与二硫键取代亚磷酸酯偶联至eGFP。
首先，我们通过固相肽合成法(SPPS)合成了环状Tat肽(见方案32)。通过用4-叠氮苯甲酸对N端封端，我们得到具有叠氮部分的化合物E11。经制备型高效液相色谱纯化后，在DMF中E11与含二硫键的炔基亚磷酸酯进行施陶丁格亚磷酸酯反应，得到化合物E12和E13，并再次用制备型高效液相色谱纯化。
方案31：炔基功能化环状Tat的SPPS。
使用手头的炔基功能化肽，我们进一步尝试进行含有半胱氨酸的eGFP的巯基加成反应，如图29所示。eGFP C70M S147C是一个突变体，其仅显示两个半胱氨酸，其中只有一个是可寻址的。
对于叔丁基二硫取代物(E13)，在37℃下，蛋白质浓度63μM，将eGFP和6当量的亚磷酸酯在PBS中孵化16小时后，其巯基加成反应完成。当相同的反应条件应用于异丙基二硫取代物(E12)时，根据MALDI分析，如图29所示，产物的转化率大约为50％。
图29示出：炔基-c(Tat)和eGFP C70M S147C的巯基加成反应。
二硫键取代的亚磷酸酯用于蛋白质偶联的操作方法
c(Tat)-叠氮的合成
在负载为0.78mm/g Rink酰胺树脂上以0.1mmol的规模合成了c(Tat)。在PTI合成器上，通过在DMF中对每个氨基酸进行单偶联(10eq.氨基酸偶联40分钟)来进行所述合成。在最后的构建模块偶联后，此时仍受Fmoc保护的肽在4ml干燥DCM中用Pd(PPh3)4(24mg，20μmol，20mol％)和苯基硅烷(308μl，2.5mmol，2.5eq.)处理1小时，以便一步脱除烯丙氧羰基和烯丙基保护基。在通过测试裂解确认完全脱保护后，在DMF中用2eq.HATU 4eq.DIPEA环化过夜。
然后用溶于DMF的20％哌啶对肽进行Fmoc脱保护，在HATU(190.1mg，0.5mmol，5eq.)和DIPEA(170μl，1.0mmol，10eq.)存在下，反应1小时，将4-叠氮苯甲酸(81.6mg，0.5mmol，5eq.)偶联到N端。最后，用4ml的TFA:TIS:H2O(95:2.5:2.5)处理3小时，将肽从树脂中切割下来，并在冷乙醚中沉淀。通过制备型反相C18高效液相色谱纯化粗肽(0-5min95/5，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)；5-60min 10/90，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA))。得到白色粉末的目标产物(30.0mg，11.4μmol，产率11.4％)，并在分析型UPLC上进行分析(反相-C18柱，5％至95％乙腈水溶液，所述水含0.1％TFA)。
LRMS:m/z:648.49[M+3H]3+(计算m/z:648.0569).
c(Tat)-磷酸酯炔的合成：c(Tat)-叠氮的施陶丁格反应
根据通用操作方法，将纯化的c(Tat)-叠氮肽(5mg，1.9μmol，1eq.)和两个二硫键取代的亚磷酸酯反应。粗肽用制备型反相C18HPLC纯化。得到白色粉末的目标产物，进行MALDI-TOF分析。
缺电子c(Tat)-磷酰胺炔的巯基化反应：和GFP C70M S147C的反应
eGFP C70M S147C(2.7nmol,1eq)的PBS溶液浓缩至40μl，加入c(Tat)-磷酰胺炔烃(0.05mg，16.2nmol，6eq.)。反应混合物在37℃下以800rpm振摇过夜后，该混合物用7kDaMWCO的Zeba旋转过滤器纯化。所述产物进行MALDI-TOF分析。对于肽E12的偶联反应，大约50％转化为目标产物，与之相对的，肽E13的偶联实现了完全转化。
E14的MALDI TOF分析：期望产物(单位：道尔顿)：29919(M+H+),14960(M+2H+)；实测(单位：道尔顿)：29933(M+H+),14967(M+2H+)
E15的MALDI TOF分析：期望产物(单位：道尔顿)：29933(M+H+),14967(M+2H+)；实测(单位：道尔顿)：29940(M+H+),14965(M+2H+)用于肽环化的分子内施陶丁格诱导的巯基加成反应
将叠氮化物和硫醇并入复合分子(例如肽)促成了分子内施陶丁格诱导的巯基加成反应，该加成反应可实现分子内环化，如下图所示：
在不希望受任何理论约束的情况下，假定首先叠氮化物与富电子炔基/烯基亚磷酸酯反应从而形成磷酰胺，并且形成缺电子炔基/烯基磷酰胺，其与肽结构中的半胱氨酸进行快速分子内巯基加成。
首先，我们合成了从BCL-9蛋白序列中提取的肽，并通过标准固相肽合成法将相隔三个氨基酸的叠氮丙氨酸和半胱氨酸插入到所述肽中。固相切割下来并经制备型高效液相色谱纯化后得到所述肽。有了该肽，我们就可以通过施陶丁格诱导的巯基加成反应来探索分子内环化。
我们将溶解于干燥DMSO中的肽和乙炔亚磷酸二乙酯或乙烯基亚磷酸二乙酯反应24小时。经制备型HPLC纯化，得到经Ellman法测试确认的所述环化的肽。
用于肽环化的分子内施陶丁格诱导的巯基加成反应的操作方法
BCL9-叠氮的合成
在负载为0.78mm/g的Rink酰胺树脂上以0.1mmol的规模合成了BCL9-叠氮。在PTI合成器上，通过在DMF中对每个氨基酸进行单偶联(5eq.氨基酸偶联40分钟)进行所述合成。最后，用4ml的TFA:TIS:H2O(95:2.5:2.5)处理2小时，将肽从树脂中切割下来，并在冷乙醚中沉淀。粗肽用制备型反相C18高效液相色谱纯化(0-5min 95/5，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)；5-60min 10/90，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA))。得到白色粉末的目标产物(35.0mg，11.5μmol，产率11.5％)，并在分析型UPLC上进行分析(反相-C18柱，5％至95％乙腈水溶液，所述水含0.1％TFA)。LRMS:m/z:[M+3H]3+759.86(计算m/z:759.6590)。
分子内施陶丁格诱导的巯基加成反应
炔烃-磷酰胺
BCL9-叠氮的施陶丁格反应
将所述肽1(20mg,6.55μmol,1eq.)溶解于干燥DMSO(1.5ml,4.4mM)中。双乙氧基炔基亚磷酸酯在事先火焰干燥的烧瓶中经高真空干燥后，加入到反应混合物中(体积取决于NMR测定的产物的百分含量，39.3μmol，6eq.)。反应混合物加热至50℃并搅拌24小时。加入水后，所述反应混合物经碱性(乙酸铵缓冲液pH9.0/乙腈)半制备型反相C18 Nucleodur高效液相色谱纯化(0-5min 95/5,缓冲液/乙腈；5-70min 10/90,缓冲液/乙腈)，得到白色粉末的环化产物(3.82mg，1.22μmol，总产率18.7％)。所述产物进一步经Ellman法测试分析，结果显示97％半胱氨酸已经反应。最终的产物2经LC-UV分析：保留时间5.0min(反相C18柱，0-1min 95/5，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)；1-16.5min 5/95，水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA))，以及质谱分析。LRMS:m/z:[M+3H]3+1049.19(计算m/z:1048.5349)。
烯烃-磷酰胺
BCL9-叠氮的施陶丁格反应
将所述肽3(34mg,11.55μmol,1eq.)溶解于干燥DMSO(4ml,2.9mM)中。双乙氧基乙烯基亚磷酸酯在事先火焰干燥的烧瓶中经高真空干燥后，加入到反应混合物中(体积取决于NMR测定的产物的百分含量，39.3μmol，6eq.)。反应混合物在室温下搅拌24小时。加入水后，所述反应混合物经制备型反相C18高效液相色谱纯化(0-5min 95/5,水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)；5-60min 10/90,水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA))。得到白色粉末的产物(14.9mg，4.8μmol，产率41.3％)，并用分析型UPLC分析(反相C18柱，5到95％乙腈水溶液，所述水含有0.1％TFA)。LRMS:m/z:[M+4H]4+782.89(计算m/z:782.6660)。所述产物4进一步经Ellman法测试，结果显示99％的半胱氨酸已经反应。
参考文献:
(1)Hackenberger,C.P.R.；Schwarzer,D.Angew.Chemie-Int.Ed.2008,47(52),10030。
(2)Spicer,C.D.；Davis,B.G.Nat.Commun.2014,5,4740。
(3)Sletten,E.M.；Bertozzi,C.R.Angew.Chemie-Int.Ed.2009,48(38),6974。
(4)Patterson,D.M.；Nazarova,L.A.；Prescher,J.A.ACS Chem.Biol.2014,9(3),592。
(5)Lang,K.；Chin,J.W.ACS Chem.Biol.2014,9(1),16。
(6)Nikic,I.；Plass,T.；Schraidt,O.；Szymaski,J.；Briggs,J.A.G.；Schultz,C.；Lemke,E.A.Angew.Chemie-Int.Ed.2014,53(8),2245。
(7)Agard,N.J.；Prescher,J.A.；Bertozzi,C.R.J.Am.Chem.Soc.2004,126(46),15046。
(8)Chalker,J.M.；Bernardes,G.J.L.；Lin,Y.A.；Davis,B.G.Chem.-AnAsianJ.2009,4(5),630。
(9)Hoesl,M.G.；Budisa,N.Angew.Chemie-Int.Ed.2011,50(13),2896。
(10)Artner,L.M.；Merkel,L.；Bohlke,N.；Beceren-Braun,F.；Weise,C.；Dernedde,J.；Budisa,N.；Hackenberger,C.P.R.Chem.Commun.2012,48(4),522。
(11)van Kasteren,S.I.；Kramer,H.B.；Jensen,H.H.；Campbell,S.J.；Kirkpatrick,J.；Oldham,N.J.；Anthony,D.C.；Davis,B.G.Nature2007,446(7139),1105。
(12)Witte,C.；Martos,V.；Rose,H.M.；Reinke,S.；Klippel,S.；L.；Hackenberger,C.P.R.Angew.Chemie-Int.Ed.2015,54(9),2806。/>
(13)Vallée,M.R.J.；Artner,L.M.；Dernedde,J.；Hackenberger,C.P.R.Angew.Chemie-Int.Ed.2013,52(36),9504。
(14)Vallée,M.R.J.；Majkut,P.；Wilkening,I.；Weise,C.；Müller,G.；Hackenberger,C.P.R.Org.Lett.2011,13(20),5440。
(15)Vallée,M.R.J.；Majkut,P.；Krause,D.；Gerrits,M.；Hackenberger,C.P.R.Chemistry2015,21(3),970。
(16)Pfaff,M.；Tangemann,K.；Müller,B.；Gurrath,M.；Müller,G.；Kessler,H.；Timpl,R.；Engel,J.J.Biol.Chem.1994,269(32),20233。
(17)Doronina,S.O.；Toki,B.E.；Torgov,M.Y.；Mendelsohn,B.a；Cerveny,C.G.；Chace,D.F.；DeBlanc,R.L.；Gearing,R.P.；Bovee,T.D.；Siegall,C.B.；Francisco,J.a；Wahl,A.F.；Meyer,D.L.；Senter,P.D.Nat.Biotech.2003,21(7),778。
(18)Ortial,S.；Montchamp,J.L.Org.Lett.2011,13(12),3134。
(19)Park,C.；Lee,K.；Kim,C.Angew.Chemie-Int.Ed.2009,48(7),1275。
(20)Barltrop,J.A.；Plant,P.J.；Schofield,P.Chem.Commun.(London)1966,822。
(21)Khorev,O.；Stokmaier,D.；Schwardt,O.；Cutting,B.；Ernst,B.BioorganicMed.Chem.2008,16(9),5216
(22)Gunnoo,S.B.；Madder,A.；ChemBioChem.2016,17,529-553
(23)T.K.Claus,S.Telitel,A.Welle,M.Bastmeyer,A.P.Vogt,G.Delaittre,C.Barner-Kowollik,Chem.Commun.(Cambridge,U.K.)2017,53,1599-1602。
(24)M.M.Dcona,D.Mitra,R.W.Goehe,D.A.Gewirtz,D.A.Lebman,M.C.T.Hartman,Chem.Commun.(Cambridge,U.K.)2012,48,4755-4757。
(25)Y.Chen,A.S.Kamlet,J.B.Steinman,D.R.Liu,Nat Chem 2011,3,146-153。
(26)J.I.Degraw,J.S.Engstrom,Journal of Labelled Compounds 1975,11,233-239。
(27)A.J.Pérez,F.Wesche,H.Adihou,H.B.Bode,Chemistry–A EuropeanJournal2016,22,639-645。
(28)H.D.Herce,D.Schumacher,A.F.L.Schneider,A.K.Ludwig,F.A.Mann,M.Fillies,M.-A.Kasper,S.Reinke,E.Krause,H.Leonhardt,M.C.Cardoso,C.P.R.Hackenberger,Nat Chem 2017,advance online publication。
(29)S.O.Doronina,B.E.Toki,M.Y.Torgov,B.A.Mendelsohn,C.G.Cerveny,D.F.Chace,R.L.DeBlanc,R.P.Gearing,T.D.Bovee,C.B.Siegall,J.A.Francisco,A.F.Wahl,D.L.Meyer,P.D.Senter,Nat Biotech 2003,21,778-784。
(30)A.Stengl,D.H.Leonhardt,J.Helma,Slas Discovery 2017,22,309-315。
(31)a)T.H.Pillow,J.D.Sadowsky,D.Zhang,S.-F.Yu,G.Del Rosario,K.Xu,J.He,S.Bhakta,R.Ohri,K.R.Kozak,E.Ha,J.R.Junutula,J.A.Flygare,Chemical Science2017,8,366-370；b)L.R.Staben,S.G.Koenig,S.M.Lehar,R.Vandlen,D.Zhang,J.Chuh,S.-F.Yu,C.Ng,J.Guo,Y.Liu,A.Fourie-O'Donohue,M.Go,X.Linghu,N.L.Segraves,T.Wang,J.Chen,B.Wei,G.D.L.Phillips,K.Xu,K.R.Kozak,S.Mariathasan,J.A.Flygare,T.H.Pillow,Nat Chem 2016,8,1112-1119。
(32)a)A.Satyam,Bioorg.Med.Chem.Lett.2008,18,3196-3199；b)L.W.C.Miles,L.N.Owen,Journal of the Chemical Society(Resumed)1952,817-826。
(33)G.-M.Fang,J.-X.Wang,L.Liu,Angew.Chem.,Int.Ed.2012,51,10347-10350。
(34)P.Fatás,E.Longo,F.Rastrelli,M.Crisma,C.Toniolo,A.I.Jiménez,C.Cativiela,A.Moretto,Chemistry–A European Journal 2011,17,12606-12611。

Claims (26)

1.制备烯基-或炔基-磷酰胺的方法，包括如下步骤：
(I)式(III)的化合物
其中
代表双键或三键；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X代表(R3R4)C；
R1独立地代表任意取代的脂肪族或芳香族残基，例如苯基；
任选地，R1代表被(C1-C8-烷氧基)n其中n是1、2、3、4、5或6，F，Cl，Br，I，-NO2，-N(C1-C8-烷基)H，-NH2，-N(C1-C8-烷基)2，＝O，C3-C8-环烷基，–S-S-(C1-C8-烷基)，羟基-(C1-C8-烷氧基)n其中n是1、2、3、4、5或6，C2-C8-炔基或任意取代的苯基中的至少一个任意取代的C1-C8-烷基，如
其中#代表式(III)中O的位置；或
任选地，R1代表被C1-C8-烷基，(C1-C8-烷氧基)n其中n是1、2、3、4、5或6，F，Cl，I，Br，-NO2，-N(C1-C8-烷基)H，-NH2或-N(C1-C8-烷基)2中的至少一个任意独立取代的苯基；或
任选地，R1代表5-或6-元杂芳香系统例如吡啶基；
优选地，R1代表C1-C8-烷基，–S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基，(C1-C8-烷氧基)n其中n是1、2、3、4、5或6取代的C1-C8-烷基，任意取代的苯基取代的C1-C8-烷基，苯基或–NO2取代的苯基；
R3代表H或C1-C8-烷基；且
R4代表H或C1-C8-烷基；
与式(IV)的叠氮化合物反应
●-N3
(IV)
其中
●代表脂肪族或芳香族残基；
以制备式(V)的化合物
其中●、R1和X如前所定义；
(II)式(V)的化合物与式(VI)的含巯基分子反应
其中代表任意取代的C1-C8烷基、任意取代的苯基、任意取代的芳香5-或6-元杂环系统、氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖基、多糖、核苷酸、寡核苷酸或聚合物；
形成式(VII)的化合物
其中
如果在式(V)的化合物中代表双键，那么/>代表化学键；或
如果在式(V)的化合物中代表三键，那么/>代表双键；并且
●、R1和X如前所定义。
2.根据权利要求1所述的方法，包括步骤(I)之前的步骤a)
a)式(I)的化合物
其中R1如前所定义；
Hal代表卤素，选自Cl、Br、I，优选为Cl，
与在α位置上包含双键或三键的式(II)的α-不饱和化合物反应
其中
代表双键或三键；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X代表(R3R4)C；
R3代表H或C1-C8-烷基；和
R4代表H或C1-C8-烷基；
以形成式(III)的化合物
其中
X和R1如前所定义；
或者，式(I’)的化合物
其中
R5独立地代表C1-C8-烷基；
Hal代表卤素，选自Cl、Br和I，优选Cl；
与在α位置上包含双键或三键的式(II)的α-不饱和化合物反应
其中
代表双键或三键；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X代表(R3R4)C；
R3代表H或C1-C8-烷基；且
R4代表H或C1-C8-烷基；
以形成式(III’)的化合物
并且式(III’)的所述化合物与R1-OH反应
以形成式(III)的化合物
其中
和X如前所定义，R1如前所定义但不作特定选择。
3.制备烯基-磷酰胺的方法，包括如下步骤：
(I)式(III)的化合物
其中
V代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基或丙基，更优选甲基；
R1独立地代表任意取代的脂肪族或芳香族残基，例如苯基；
任选地，R1代表被(C1-C8-烷氧基)n其中n是1、2、3、4、5或6，F，Cl，Br，I，-NO2，-N(C1-C8-烷基)H，-NH2，-N(C1-C8-烷基)2，＝O，C3-C8-环烷基，–S-S-(C1-C8-烷基)，羟基-(C1-C8-烷氧基)n其中n是1、2、3、4、5或6，C2-C8-炔基或任意取代的苯基中的至少一个任意取代的C1-C8-烷基，如
其中#代表式(III*)中O的位置；或
任选地，R1代表被C1-C8-烷基，(C1-C8-烷氧基)n其中n是1、2、3、4、5或6，F，Cl，I，Br，-NO2，-N(C1-C8-烷基)H，-NH2或-N(C1-C8-烷基)2中的至少一个任意独立取代的苯基；或
任选地，R1代表5-或6-元杂芳香系统例如吡啶基；
优选地，R1代表C1-C8-烷基，–S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基，(C1-C8-烷氧基)n其中n是1、2、3、4、5或6取代的C1-C8-烷基，任意取代的苯基取代的C1-C8-烷基，苯基或–NO2取代的苯基；
R3代表H或C1-C8-烷基；且
R4代表H或C1-C8-烷基；
与式(IV)的叠氮化合物反应
●-N3
(IV)
其中
●代表脂肪族或芳香族残基；
以制备式(V*)的化合物
其中●、V、和R1如前所定义；
X是(R3 R4)C；且
R3和R4如前所定义；
(II)式(V*)的化合物与式(VI)的含巯基分子反应
其中代表任意取代的C1-C8烷基、任意取代的苯基、任意取代的芳香5-或6-元杂环系统、氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖基、多糖、核苷酸、寡核苷酸或聚合物；
形成式(VII*)的化合物
其中●、V、R1和X如前所定义。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中R1独立地代表甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中R1代表
其中R10和R11独立地代表氢原子或C1-C8-烷基；
且#代表O的位置。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中R1代表苯基取代的C1-C8-烷基，所述苯基进一步被取代，其中Z是O或NH，优选O，且其中#代表所述苯基的位置。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中R1代表苯基取代的C1-C8-烷基，所述苯基进一步被取代，其中#代表所述苯基的位置。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中R1代表羟基乙基或高炔丙基。
9.根据权利要求1、2、4、5、6、7或8中任一项所述的方法，其中代表双键，X代表(R3R4)C，R3和R4独立地代表H或C1-C8-烷基，且/>代表化学键。
10.根据权利要求1、2、4、5、6、7或8中任一项所述的方法，其中代表三键，X代表R3-C，R3代表H或或C1-C8-烷基且/>代表双键。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中●代表任意取代的C1-C8-烷基，优选
任意取代的苯基，优选
放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、核苷酸、寡核苷酸、荧光团如CY5或EDANS、氨基酸、肽、任意取代的5-或6-元杂芳香系统。
12.根据权利要求10所述的方法，其中●代表结构式(VIII)的环状RGD肽(c(RGDfK)
其中*代表所述N3基团的位置；
生物素；
CY5或EDANS；
苯基，任选被独立选自下列的一个、两个、三个、四个或五个取代基取代：C1-C8-烷基、C1-C8-烷氧基、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1-C8-烷基)、-N(C1-C8-烷基)2-COOH、-COO(C1-C8-烷基)、-O-C(O)-(C1-C8-烷基)、-C(O)N-(C1-C8-烷基)、-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)，优选地，任选被选自下列的一个取代基取代：C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基和NO2；
任选被选自下列的至少一个取代基取代的C1-C8-烷基：C3-C8-环氧烷基；具有3到8个环的杂环基其中所述杂原子选自N、O、S；C1-C8-烷氧基；卤素；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1-C8-烷基)；-N(C1-C8-烷基)2；-COOH；-COO(C1-C8-烷基)；-O-C(O)-(C1-C8-烷基)；-CONH2；-C(O)N(C1-C8-烷基)2；-C(O)NH-(C1-C8-烷基)；-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)，优选C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基和NO2，苯基或杂芳香系统、单糖、多糖、肽、核苷酸、寡核苷酸、聚合物、氨基酸、荧光团、蛋白标签(取代基1代)，其中取代基1代可以再次任选被C3-C8-环烷基；具有3到8个环的杂环基其中所述杂原子选自N、O、S；C1-C8-烷氧基；卤素；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1-C8-烷基)；-N(C1-C8-烷基)2；-COOH；-COO(C1-C8-烷基)；-O-C(O)-(C1-C8-烷基)；-CONH2；-C(O)N(C1-C8-烷基)2；-C(O)NH-(C1-C8-烷基)；-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)，优选C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基和NO2、苯基或杂芳香系统(取代基2代)，且其中取代基2代可以再次被选自同样组的至少一个基团取代，且其中这样的取代可以持续到3、4、5、6、7、8、9或10代。
13.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中●代表任意取代的C1-C8-烷基，如连接子、药物、或连接子-药物偶联物。
14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中●代表任意取代的苯基，如连接子、药物、或连接子-药物偶联物。
15.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中代表抗体，优选lgG抗体，更优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗；肽，优选GFP蛋白或eGFP蛋白，三肽，更优选式(IX)的肽
其中
#代表S的位置；
任意取代的C1-C8-烷基，优选下述取代的C1-C8-烷基
其中#标示出了S的位置。
16.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述●-N3和所述存在于相同分子中。
17.式(V)的化合物
其中●、R1和X如前述任一项权利要求中所定义。
18.式(V*)的化合物
其中●、V、R1和X如前述任一项权利要求中所定义。
19.式(VII)的化合物
其中
如果在式(V)的化合物中代表双键，那么/>代表化学键；或
如果在式(V)的化合物中代表三键，那么/>代表双键；且
●、R1和X如前述任一项权利要求中所定义。
20.式(VII*)的化合物
其中●、V、R1和X如前述任一项权利要求中所定义。
21.根据权利要求19或20所述的化合物，其中
代表抗体且
●代表蛋白标签或荧光团如CY5或EDANS，或蛋白质。
22.根据权利要求19或20所述的化合物，其中
代表蛋白质且
●代表蛋白标签或荧光团如CY5或EDANS，抗体或蛋白质。
23.根据权利要求19或20所述的化合物，其中
代表蛋白质且
●代表蛋白质。
24.根据权利要求19或20所述的化合物，其中
代表抗体且
●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。
25.式(VIIa)的化合物
其中
如果在式(III)的化合物中代表双键，那么/>代表化学键；或
如果在式(III)的化合物中代表三键，那么/>代表双键；且
●、R1和X如前述任一项权利要求中所定义。
26.式(VII*a)的化合物
其中●、V、R1和X如前述任一项权利要求中所定义。/>
CN202311230447.3A 2016-09-01 2017-09-01 化学选择性的巯基与烯基或炔基磷酰胺的偶联 Pending CN117903297A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16001917 2016-09-01
EP16001917.0 2016-09-01
CN201780053946.6A CN109689112B (zh) 2016-09-01 2017-09-01 化学选择性的巯基与烯基或炔基磷酰胺的偶联
PCT/EP2017/071937 WO2018041985A1 (en) 2016-09-01 2017-09-01 Chemoselective thiol-conjugation with alkene or alkyne-phosphonamidates

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780053946.6A Division CN109689112B (zh) 2016-09-01 2017-09-01 化学选择性的巯基与烯基或炔基磷酰胺的偶联

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117903297A true CN117903297A (zh) 2024-04-19

Family

ID=56888890

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780053946.6A Active CN109689112B (zh) 2016-09-01 2017-09-01 化学选择性的巯基与烯基或炔基磷酰胺的偶联
CN202311230447.3A Pending CN117903297A (zh) 2016-09-01 2017-09-01 化学选择性的巯基与烯基或炔基磷酰胺的偶联

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780053946.6A Active CN109689112B (zh) 2016-09-01 2017-09-01 化学选择性的巯基与烯基或炔基磷酰胺的偶联

Country Status (7)

Country Link
US (3) US11161873B2 (zh)
EP (1) EP3506949A1 (zh)
JP (2) JP7217225B2 (zh)
CN (2) CN109689112B (zh)
AU (1) AU2017320913A1 (zh)
CA (1) CA3032251A1 (zh)
WO (1) WO2018041985A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7429191B2 (ja) * 2018-03-07 2024-02-07 フォルシュングスフェアバント ベルリン エー．ベー． アルケンホスホノチオレートまたはアルキンホスホノチオレートおよびアルケンホスホネートまたはアルキンホスホネートとの化学選択的チオールコンジュゲーション
CN109666044B (zh) * 2018-07-04 2021-03-05 浙江大学 基于[2.2]对环芳烷骨架的有机磷化合物及其中间体和制备方法与用途
US20230052528A1 (en) * 2019-11-22 2023-02-16 The Regents Of The University Of California Taspase1 inhibitors and uses thereof
JP7454418B2 (ja) 2020-03-23 2024-03-22 鹿島建設株式会社 光ファイバ組込シート、光ファイバの設置方法、および貼付装置
WO2021263087A2 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Yale University Compositions and methods for selective detection and/or inhibition of bacterial pathogens in microbial communities
EP4297794A2 (en) 2021-02-26 2024-01-03 Forschungsverbund Berlin E.V. Cellular uptake of large biomolecules enabled by cell-surface-reactive cell-penetrating peptide additives
CN117545511A (zh) 2021-04-23 2024-02-09 柏林合作研究学会 与不饱和磷(v)化合物的硫醇偶联
WO2023083919A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Tubulis Gmbh Conjugates comprising a phosphorus (v) and a camptothecin moiety
WO2023083900A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Tubulis Gmbh Conjugates comprising a phosphorus (v) and a drug moiety
WO2023105087A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Tubulis Gmbh Novel flt3 antibodies and antibody-drug-conjugates based thereon, therapeutic methods and uses thereof in combination with tyrosine kinase inhibitors
WO2024003002A1 (en) 2022-06-27 2024-01-04 Diaccurate N-substituted indole derivatives and conjugates for the treatment of cancer
WO2024083926A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Tubulis Gmbh Novel antibody drug conjugates with novel napi2b antibodies, therapeutic methods and uses thereof
WO2024083953A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Tubulis Gmbh Novel anti-tpbg antibody and antibody-drug-conjugates based thereon, therapeutic methods and uses thereof
WO2024083925A2 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Tubulis Gmbh Novel anti-napi2b antibodies and antibody-drug-conjugates based thereon, therapeutic methods and uses thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2535174A (en) 1949-04-07 1950-12-26 Us Rubber Co Mercaptoethanephosphonates
DE2024250A1 (de) 1970-05-19 1971-12-02 Farbwerke Hoechst AG, vorm. Meister Lucius & Brüning, 6000 Frankfurt Antimikrobielle grenzflächenaktive Mittel
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
WO2010056847A2 (en) 2008-11-13 2010-05-20 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Lyophilization formulation
CN102058547A (zh) * 2009-11-12 2011-05-18 太景生物科技股份有限公司 冻干制剂
US10036010B2 (en) * 2012-11-09 2018-07-31 Innate Pharma Recognition tags for TGase-mediated conjugation
EP2935608A1 (en) * 2013-10-14 2015-10-28 SynAffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
CA2948082A1 (en) 2014-05-09 2015-11-12 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Method for targeted conjugation of peptides and proteins by paired c2 bridging of cysteine amino acids

Also Published As

Publication number Publication date
US11746124B2 (en) 2023-09-05
WO2018041985A1 (en) 2018-03-08
US20190330264A1 (en) 2019-10-31
CN109689112B (zh) 2023-10-13
CA3032251A1 (en) 2018-03-08
CN109689112A (zh) 2019-04-26
EP3506949A1 (en) 2019-07-10
US20220106356A1 (en) 2022-04-07
US20230348529A1 (en) 2023-11-02
US11161873B2 (en) 2021-11-02
AU2017320913A1 (en) 2019-02-07
JP2023055766A (ja) 2023-04-18
JP7217225B2 (ja) 2023-02-02
JP2019532041A (ja) 2019-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109689112B (zh) 化学选择性的巯基与烯基或炔基磷酰胺的偶联
US11161884B2 (en) Modified biotin, streptavidin mutant, and usage of them
JP7429191B2 (ja) アルケンホスホノチオレートまたはアルキンホスホノチオレートおよびアルケンホスホネートまたはアルキンホスホネートとの化学選択的チオールコンジュゲーション
JP6876002B2 (ja) 機能的要素を共有結合により係留させるための細胞透過性、細胞適合性、かつ開裂可能であるリンカー
US20220088212A1 (en) C-terminal lysine conjugated immunoglobulins
US11293060B2 (en) Method for labeling of aldehyde containing target molecules
Dirin et al. Fragment-based solid-phase assembly of oligonucleotide conjugates with peptide and polyethylene glycol ligands
EP3166645B1 (en) Site selective conjugation of an oligonucleotide conjugate to a metal binding protein
Obeng et al. Sortase A transpeptidation produces seamless, unbranched biotinylated nanobodies for multivalent and multifunctional applications
CN117545511A (zh) 与不饱和磷(v)化合物的硫醇偶联
Kugler Investigation of Peptidic Templates for Bioorthogonal Ligations
WO2024030954A1 (en) Chemical modification of antibodies and functional fragments thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination