KR20200138750A - 알켄 또는 알킨-포스포노티올레이트 및 -포스포네이트로의 화학선택적 티올-접합 - Google Patents

알켄 또는 알킨-포스포노티올레이트 및 -포스포네이트로의 화학선택적 티올-접합 Download PDF

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KR20200138750A
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크리스티안 하켄베르거
앨리스 레오니 바우만
마르크-안드레 카스퍼
스티븐 바이른
요나스 헬마-스메츠
하인리히 레온하르트
티나 스토쉑
마르쿠스 거라히
도미니크 슈마커
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포슝스베르분드 베를린 에.베.
루드비히-막시밀리안스-우니버지테트 뮌헨
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Abstract

신규한 접합체 및 그의 제조 방법이 개시된다. 알켄- 또는 알킨-포스포노티올레이트 및 -포스포네이트를 제조하는 방법은 화학식 (I)의 화합물을 화학식 (II)의 티올-함유 분자와 반응시켜 화학식 (III)의 화합물을 생성하는 단계를 포함한다:
Figure pct00657

Figure pct00658

Figure pct00659

상기 식에서,
Figure pct00660
는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타낸다.

Description

알켄 또는 알킨-포스포노티올레이트 및 -포스포네이트로의 화학선택적 티올-접합
화학선택적 및 생물직교 반응은 부위-특이적 변형을 위한 강력한 수단으로 부상하였다 (Hackenberger, C. P. R.; Schwarzer, D. Angew. Chemie - Int. Ed. 2008, 47 (52), 10030; Spicer, C. D.; Davis, B. G. Nat. Commun. 2014, 5, 4740). 이들 반응으로, 형광단 및 다른 분광 라벨, 중합체, 독소 뿐만 아니라 소분자와 같은 기능적 모듈 및 해독후 단백질 변형을 닮은 단백질을 갖는, 다양한 단백질- 및 항체-접합체가 접근 가능하게 되었다. 따라서, 화학선택적 단백질 변형 기술은 단백질의 생물학적 기능 조사 및 새로운 이미징 기술의 개발부터 진단, 단백질-기반 의약물의 설계 및 약물의 표적-전달에서 유망한 새로운 의약 접근법에 이르기까지 기본적인 연구에 상당히 기여했다.
지난 몇년 동안, 연구자들은 단백질 변형을 위한 생물직교 반응의 조작에서 주로 2가지의 상이한 측면에 집중하였다 (Sletten, E. M.; Bertozzi, C. R. Angew. Chemie - Int. Ed. 2009, 48 (38), 6974). 한편으로, 많은 노력은 단백질 측쇄에 존재하는 독특한 기능성을 변형하기 위해 매우 반응적인 출발 물질을 필요로 하는 신속한 반응에 노력을 기울여 왔다 (Patterson, D. M.; Nazarova, L. A.; Prescher, J. A. ACS Chem. Biol. 2014, 9 (3), 592; Lang, K.; Chin, J. W. ACS Chem. Biol. 2014, 9 (1), 16). 이 접근법은 부위-특이적 라벨링을 달성하기 위한 진보한 앰버 억제 기술에 의해 보완되고, 그 결과 다수의 유전자조작으로 코딩된 매우 반응적인 생물직교 리포터는 스트레인-촉진된 알킨-아지드 고리화첨가 또는 역-수요 딜스-알더 반응을 포함한 다양한 유형의 고리화첨가 반응을 겪는다 (Nikic, I.; Plass, T.; Schraidt, O.; Szymaski, J.; Briggs, J. A. G.; Schultz, C.; Lemke, E. A. Angew. Chemie - Int. Ed. 2014, 53 (8), 2245; Agard, N. J.; Prescher, J. A.; Bertozzi, C. R. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126 (46), 15046). 다른 한편으로, 연구자들은, 특히 다량의 기능성 단백질-접합체 및 이상적으로 정량적 전환이 필요한 경우 불가능하지는 않지만 지루한 정제 단계를 피하기 위해 고수율 단백질 변형 반응을 개발 및 적용하는 데 초점을 맞추었다 (1). 이를 달성하기 위해서는, 단백질 발현의 고수율이 특히 중요하다. 앰버 억제는 소량의 발현된 단백질을 초래할 수 있으므로, 표준 및 영양요구성 발현 시스템이 종종 바람직하다. 표준 단백질 발현과 조합하여 부위-특이적 라벨링을 달성하기 위한 일반적인 시나리오는 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 선택된 단백질에 독특한 Cys 잔기를 배치하고 이어 Cys-변형 전략을 따르는 것이다 (Chalker, J. M.; Bernardes, G. J. L.; Lin, Y. A.; Davis, B. G. Chem. - An Asian J. 2009, 4 (5), 630). 대안적으로, 아지드- 또는 알킨-함유 아미노산이 영양요구성 발현 시스템을 사용하여 통합될 수 있으며 (Hoesl, M. G.; Budisa, N. Angew. Chemie - Int. Ed. 2011, 50 (13), 2896), 이는 스타우딩거 (Staudinger) 라이게이션 및 Cu-촉매된 아지드-알킨 고리화첨가 (CuAAC)를 이용하여 변형될 수 있다 (Artner, L. M.; Merkel, L.; Bohlke, N.; Beceren-Braun, F.; Weise, C.; Dernedde, J.; Budisa, N.; Hackenberger, C. P. R. Chem. Commun. 2012, 48 (4), 522; van Kasteren, S. I.; Kramer, H. B.; Jensen, H. H.; Campbell, S. J.; Kirkpatrick, J.; Oldham, N. J.; Anthony, D. C.; Davis, B. G. Nature 2007, 446 (7139), 1105).
이들 측면들 모두는 최근 몇년 동안 상당한 진전을 이뤘지만, 금속이 없는 화학선택적 변형 반응을 위한 매우 반응적이고 복잡한 기능 모듈의 일반적인 모듈식 접근성은 종종 도전적인 상태로 남아 있다. 이는 반응성 빌딩 블럭의 합성에서 추가의 보호기 조작을 필요로 하기 때문이며, 이는 사용된 작용기의 높은 반응성 및 불안정성에 비추어 문제가 될 수 있다. 예컨대, 분자 이미징을 위해 Xe-크립토판을 갖는 매우 반응적인 사이클로옥틴-함유 형광 펩티드의 합성은 정교하지만 낮은 수율의 직교 보호기를 사용해야했다 (Witte, C.; Martos, V.; Rose, H. M.; Reinke, S.; Klippel, S.; Schr
Figure pct00001
der, L.; Hackenberger, C. P. R. Angew. Chemie - Int. Ed. 2015, 54 (9), 2806).
Cys 잔기의 접합을 위한 이전 기술은 주로 말레 이미드 접합에 의존한다. 그러나, 말레이미드 접합체는 종종 불안정하고, 특히 그들은 종종 가수분해되는 경향이 있고, 높은 티올 농도 하에서 티올 교환하는 경향이 있다. Cys-접합 기술에 대한 최근의 포괄적인 개요를 위해 문헌 (Gunnoo, S. B.; Madder, A.; ChemBioChem. 2016, 17, 529-553)을 참조한다. 대안적인 접합 방법으로서, WO 2015/169784는 C2-디술파이드-브릿징된 펩티드 및 단백질의 제조 방법을 개시하며, 여기서 브릿징은 알킨과의 티올-인-반응에 의해 달성된다. US2535174는 에텐포스폰산의 에스테르에 포화된 지방족 메르캅탄의 알칼리 촉매된 첨가를 기재한다. 문헌 (J. Bertran-Vicente et al., Nature Comm. 2016, 7, DOI: 10.1038/ncomms12703)은 보호된 포스파이트가 먼저 친전자성 디술파이드와 반응하여 포스포티올레이트를 생성하고, 탈보호시 (예컨대, UV 광 또는 염기에 의함) 포스포릴화된 시스테인을 생성하는 순서를 기재한다. 이 방법은 자연 발생의 포스포릴화된 시스테인 펩티드의 합성에 적용되었다.
본 발명의 목적은 접합체를 제조하는 추가의 방법을 제공하고 추가의 접합체를 제공하는 것이다.
정의
당업자는 본 출원에 사용된 단수 형태의 용어는 상황에 따라 "하나 (1)", "하나 (1) 이상" 또는 "적어도 하나 (1)"를 의미할 수 있다는 것을 알고 있다.
할로겐, 달리 정의되지 않는 한: 7번째 주요 그룹의 원소, 바람직하게는 불소, 염소, 브롬 및 요오드, 더 바람직하게는 불소, 염소 및 브롬 및 Mg와 조합하여 더욱더 바람직하게는 브롬.
알킬, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한: 바람직하게는 (C1-C8)-, (C1-C6)- 또는 (C1-C4)-탄소 원자를 갖는 포화된 직쇄 또는 분지된 탄화수소 라디칼. 예: 메틸, 에틸, 프로필, 1-메틸에틸, 부틸 등.
알케닐, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한: 이중 결합을 갖는 불포화된 직쇄 또는 분지된 탄화수소 라디칼. 알케닐은 바람직하게는 (C2-C8)-, (C2-C6)- 또는 (C2-C4)-알케닐이다. 예: 에테닐, 1-프로페닐, 3-부테닐 등.
알키닐, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한: 삼중 결합을 갖는 불포화된 직쇄 또는 분지된 탄화수소 라디칼. 알키닐은 바람직하게는 (C2-C8)-, (C2-C6)- 또는 (C2-C4)-알키닐이다. 예: 에티닐, 1-프로피닐 등.
알콕시 (알킬 라디칼 -O-), 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한: 기본 구조에 산소 원자 (-O-)를 통해 부착된 알킬 라디칼. 알콕시는 바람직하게는 (C1-C8)-, (C1-C6)- 또는 (C1-C4)-알콕시이다. 예: 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 1-메틸에톡시 등.
유사하게, 알켄옥시 및 알킨옥시는, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한, 각각 기본 구조에 -O-를 통해 부착된 알케닐 라디칼 및 알키닐 라디칼이다. 알켄옥시는 바람직하게는 (C2-C8)-, (C2-C6)- 또는 (C2-C4)-알켄옥시이다. 알킨옥시는 바람직하게는 (C3-C10)-, (C3-C6)- 또는 (C3-C4)-알킨옥시이다.
알킬카르보닐 (알킬 라디칼 -C(=O)-), 달리 정의되지 않는 한: 알킬카르보닐은 바람직하게는 (C1-C8)-, (C1-C6)- 또는 (C1-C4)-알킬카르보닐이다. 여기서, 탄소 원자수는 알킬카르보닐기의 알킬 라디칼을 언급한다.
유사하게, 알케닐카르보닐 및 알키닐카르보닐은, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한, 각각 기본 구조에 -C(=O)-를 통해 부착된 알케닐 라디칼 및 알키닐 라디칼이다. 알케닐카르보닐은 바람직하게는 (C2-C8)-, (C2-C6)- 또는 (C2-C4)-알케닐카르보닐이다. 알키닐카르보닐은 바람직하게는 (C2-C8)-, (C2-C6)- 또는 (C2-C4)-알키닐카르보닐이다.
알콕시카르보닐 (알킬 라디칼 -O-C(=O)-), 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한: 알콕시카르보닐은 바람직하게는 (C1-C8)-, (C1-C6)- 또는 (C1-C4)-알콕시카르보닐이다. 여기서, 탄소 원자수는 알콕시카르보닐기의 알킬 라디칼을 언급한다.
유사하게, 알켄옥시카르보닐 및 알킨옥시카르보닐은, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한, 각각 기본 구조에 -O-C(=O)-를 통해 부착된 알케닐 라디칼 및 알키닐 라디칼이다. 알켄옥시카르보닐은 바람직하게는 (C2-C8)-, (C2-C6)- 또는 (C2-C4)-알켄옥시카르보닐이다. 알킨옥시카르보닐은 바람직하게는 (C3-C8)-, (C3-C6)- 또는 (C3-C4)-알킨옥시카르보닐이다.
알킬카르보닐옥시 (알킬 라디칼 -C(=O)-O-)은, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한, 기본 구조에 산소에 의해 카르보닐옥시기 (-C(=O)-O-)를 통해 부착된 알킬 라디칼이다. 알킬카르보닐옥시는 바람직하게는 (C1-C8)-, (C1-C6)- 또는 (C1-C4)-알킬카르보닐옥시이다.
유사하게, 알케닐카르보닐옥시 및 알키닐카르보닐옥시는, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한, 각각 기본 구조에 (-C(=O)-O-)를 통해 부착된 알케닐 라디칼 및 알키닐 라디칼이다. 알케닐카르보닐옥시는 바람직하게는 (C2-C8)-, (C2-C6)- 또는 (C2-C4)-알케닐카르보닐옥시이다. 알키닐카르보닐옥시는 바람직하게는 (C2-C8)-, (C2-C6)- 또는 (C2-C4)-알키닐카르보닐옥시이다.
알킬티오, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한: 기본 구조에 -S-를 통해 부착된 알킬 라디칼. 알킬티오는 바람직하게는 (C1-C8)-, (C1-C6)- 또는 (C1-C4)-알킬티오이다.
유사하게, 알케닐티오 및 알키닐티오는, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한, 각각 기본 구조에 -S-를 통해 부착된 알케닐 라디칼 및 알키닐 라디칼이다. 알케닐티오는 바람직하게는 (C2-C8)-, (C2-C6)- 또는 (C2-C4)-알케닐티오이다. 알키닐티오는 바람직하게는 (C3-C8)-, (C3-C6)- 또는 (C3-C4)-알키닐티오이다.
사용된 용어 "치환된" 또는 "임의적으로 치환된" 등은, 다른 곳에서 달리 정의되지 않는 한, 매우 광범위한 치환 패턴을 지칭한다. 본 발명의 개시로부터 알수 있는 바와 같이, 특히 R1,
Figure pct00002
및 ●는 다수의 유기 (마크로)분자로의 치환을 허용한다. 이들 분자의 구조는 현재 개시된 방법 및 생성된 접합체와 관련이 없음이 제안된다. 따라서, 이러한 새롭고 혁신적인 개념을 단지 일부 분자로만 제한하는 것은 과도한 제한을 나타낼 것이다. 그럼에도 불구하고, 용어는 각각 유기 치환체 또는 그의 염을 지칭하며, 이는 다시 추가의 유기 치환체 또는 그의 염으로 수회 치환될 수 있음이 제안된다. 이러한 복잡한 치환체에 대한 예가 본 출원에서 생성되고 제시된다 (예컨대, 도식 7, 8, 도 4 및 합성 실시예를 참조). 바람직하게는, 용어 "치환된"은 니트로, 시아노, Cl, F, Cl, Br, -NH-R, NR2, COOH, -COOR, -OC(O)R -NH2, -OH, -CONH2 CONHR, CON(R)2, -S-R, -SH, -C(O)H, -C(O)R, (C1-C20)-알킬, (C1-C20)-알콕시, (C2-C20)-알릴, 3 내지 8개의 고리-구성원의 (헤테로)사이클릭 고리 (여기서, 존재하는 경우, 헤테로원자 또는 원자들은 N, O 및 S로부터 선택된다), 5 내지 12개의 고리 원자를 갖는 (헤테로)방향족 시스템 (예컨대, 페닐, 피리딜, 나프틸 등)으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 기를 지칭하고, 여기서 R은 다시 이들 치환체 중 임의의 것을 나타낼 수 있고, 치환은 수회 반복될 수 있고, 예컨대 치환은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복될 수 있고; 예컨대, ●가 이미, 예컨대 화학식 (I) 또는 (III)의 화합물의 일부인 경우 하기에서 ● 치환체:
Figure pct00003
를 참조한다 (여기서, #은 Y (본원에 사용된 화합물에서 황 또는 산소)의 위치를 나타낸다). 그러나, 당업자는, 예컨대 40 단위의 다당류로 치환된 알킬-쇄가 일반적 치환 패턴에 의해 간단히 설명될 수 없다는 것에 동의할 것이다.
본원에 사용된 용어 "펩티드"는 펩티드 결합 (아미드 결합)에 의해 공유적으로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 유기 화합물을 지칭한다. 펩티드는 구성 아미노산의 수와 관련하여 지칭될 수 있으며, 즉 디펩티드는 2개의 아미노산 잔기를 함유하고, 트리펩티드는 3개의 아미노산 잔기를 함유한다. 10개 이하의 아미노산을 함유하는 펩티드는 올리고펩티드로 지칭될 수 있고, 10개 초과의 아미노산 잔기, 예컨대 최대 약 30개의 아미노산 잔기를 갖는 것은 폴리펩티드이다. 아미노산은 적어도 하나의 원 또는 분지된 또는 비분지된 쇄 또는 그의 혼합물을 형성할 수 있다. 단백질 및 항체는 펩티드이고, 따라서 이 용어에 의해 포괄되지만 그들의 중요성 때문에 별도로 명명될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아미노산"은 -CH(NH3)-COOH 기를 갖는 유기 화합물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 용어 "아미노산"은 자연 발생 아미노산 아르기닌, 리신, 아스파르트산 글루탐산, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 트립토판, 알라닌, 이소루이신, 루이신, 페닐알라닌, 발린, 프롤린 및 글리신을 지칭한다. 그러, 이 용어는 그의 보다 광범위한 의미에서 또한 비-자연 발생 아미노산을 포괄한다.
본 발명에 따른 아미노산 및 펩티드는 또한 작용기에서 변형될 수 있다. 비제한적 예는 당류, 예컨대 N-아세틸갈락토스아민 (GalNAc), 또는 보호기, 예컨대 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)-변형 또는 에스테르이다.
용어 "단백질"은, 예컨대 30개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 잔기의 하나 이상의 장쇄를 포함하는 펩티드를 지칭한다. 단백질은 대사 반응 촉매, DNA 복제, 자극에 대한 반응, 및 분자 수송, 반응 촉매를 포함하여 생체내 및 시험관내에서 다양한 기능을 수행한다. 단백질을 특정한 3차원 구조로 접힌다. 단백질 내 잔기는 종종, 예컨대 물리적 및 화학적 특성, 접힘성, 안정성, 활성, 및 궁국적으로, 단백질의 기능을 변경시키는, 해독후 변형으로 화학적으로 변형된다. 때때로, 단백질은 보철기 또는 보조인자로 불릴 수 있는 부착된 비-펩티드 그룹을 갖는다. 효소 및 보조효소를 포함하는 단백질은 또한 특정 기능을 달성하도록 함께 작용할 수 있으며, 그들은 종종 안정한 단백질 복합체를 형성하도록 회합한다. 모든 이들 형태가 용어 "단백질"에 의해 포괄된다.
본원에 사용된 용어 "단백질 태그"는 다양한 목적으로 본 발명에 따라 링커를 통해 단백질 또는 다른 티올-포함 화합물에 부착될 수 있는 펩티드 서열을 지칭한다. 단백질 태그의 비제한적 예는 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그 에피토프 태그 및 리포터 효소이다.
친화성 태그는 본 발명에 따른 링커를 통해 단백질 및 다른 티올-포함 화합물에 부가되어, 예컨대 친화성 기술을 이용하여 정제될 수 있다. 이들은, 예컨대 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질 (MBP), 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 또는 폴리(His) 태그를 포함한다.
가용화 태그는 단백질에서 적절한 폴딩을 돕고 침전을 방지하는 데 사용될 수 있다. 이들은 티오레독신 (TRX) 및 폴리(NANP)를 포함한다. 일부 친화성 태그는 가용화제, 예컨대 MBP, 및 GST로서 이중 역할을 한다.
크로마토그래피 태그는 특정한 분리 기술에 걸쳐 상이한 분석을 제공하도록 단백질의 크로마토그래피 특성을 변경하는 데 사용된다. 종종, 이들은 폴리음이온성 아미노산, 예컨대 FLAG-태그로 이루어진다.
에피토프 태그는 높은-친화성 항체가 많은 상이한 종에서 확실하게 생성될 수 있으므로 선택되는 짧은 펩티드이다. 이들은 일반적으로 바이러스 유전자로부터 유래된다. 에피토프 태그는 V5-태그, Myc-태그, HA-태그 및 NE-태그를 포함한다. 이들 태그는 웨스턴 블롯팅, 면역형광 및 면역침전 실험, 및 항체 정제에 특히 유용하다.
본원에 사용된 용어 "리포터 효소"는 생화학적 검출에서 신호의 증가를 가능하게 하는 임의의 공지된 효소를 지칭한다. 비제한적 예는 착색제 형성 효소, 예컨대 알칼리 포스파타제 (AP), 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 또는 글루코스 옥시다제 (GOX); 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), 산화환원 민감성 GFP (RoGFP), 아주라이트 또는 에메랄드; 루시페라제, 즉 생물발광을 생성하는 산화 효소의 일 부류 (예컨대, 반딧불이 루시페라제 (EC 1.13.12.7)); 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT); ß-갈락토시다제; 또는 ß-글루쿠로니다제이다.
단백질 태그의 비제한적 예는 하기이다: 효소 BirA에 의한 비오티닐화를 가능하게 하여 단백질이 스트렙트아비딘에 의해 단리될 수 있는 펩티드인 AviTag (GLNDIFEAQKIEWHE), 단백질 칼모둘린에 의해 결합된 펩티드인 칼모둘린-태그 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), 음이온-교환 수지, 예컨대 Mono-Q에 효율적으로 결합하는 펩티드인 폴리글루타메이트 태그 (EEEEEE), 항체에 의해 인식되는 펩티드인 E-태그 (GAPVPYPDPLEPR), 항체에 의해 인식되는 펩티드인 FLAG-태그 (DYKDDDDK), 항체에 의해 인식되는 헤마글루티닌으로부터의 펩티드인 HA-태그 (YPYDVPDYA)His-태그, 니켈 또는 코발트 킬레이트에 의해 결합된 5-10 히스티딘 (HHHHHH), 항체에 의해 인식되는 c-myc로부터 유래되는 펩티드인 Myc-태그 (EQKLISEEDL), 웨스턴 블롯팅, ELISA, 유동 세포측정, 면역세포화학, 면역침전, 및 재조합 단백질의 친화성 정제를 포함하는 광범위한 적용에 유용한, 모노클로날 IgG1 항체에 의해 인식되는 새로운 18-아미노산 합성 펩티드인 NE-태그 (TKENPRSNQEESYDDNES), 리보뉴클레아제 A로부터 유래되는 펩티드인 S-태그 (KETAAAKFERQHMDS), 스트렙트아비딘에 결합하는 펩티드인 SBP-태그 (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), 포유동물 발현을 위한 Softag 1 (SLAELLNAGLGGS), 원핵생물 발현을 위한 Softag 3 (TQDPSRVG), 스트렙트아비딘 또는 스트렙트액틴으로 불리는 변형된 스트렙트아비딘에 결합하는 Strep-태그 (Strep-태그 II: WSHPQFEK), FlAsH 및 ReAsH 이비소 화합물에 의해 인식되는 테트라시스테인 태그인 TC 태그 (CCPGCC), 항체에 의해 인식되는 펩티드인 V5 태그 (GKPIPNPLLGLDST), 항체에 의해 인식되는 펩티드인 VSV-태그 (YTDIEMNRLGK), Xpress 태그 (DLYDDDDK), pilin-C 단백질에 공유적으로 결합하는 펩티드인 Isopeptag (TDKDMTITFTNKKDAE), SpyCatcher 단백질에 공유적으로 결합하는 펩티드인 SpyTag (AHIVMVDAYKPTK), SnoopCatcher 단백질에 공유적으로 결합하는 펩티드인 SnoopTag (KLGDIEFIKVNK), 스트렙트아비딘에 의한 인식을 가능하게 하는 BirA에 의해 비오티닐화된 단백질 도메인인 BCCP (비오틴 카르복실 캐리어 단백질), 고정된 글루타티온에 결합하는 단백질인 글루타티온-S-트랜스퍼라제-태그, 자발적으로 형광성이고 나노바디에 의해 결합될 수 있는 단백질인 녹색 형광 단백질-태그, HaloLinkTM 수지 (Promega)에 공유적으로 부착하는 돌연변이된 히드롤라제인 Halo-태그, 아밀로스 아가로스에 결합하는 단백질인 말토스 결합 단백질-태그, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그 (면역글로불린 Fc 도메인으로부터 유래되고, 이량체화 및 가용화를 가능하게 함). 단백질-A 세파로스 상에서의 정제를 위해, 장애 촉진 아미노산 (P,E,S,T,A,Q,G,..), 알칼리 포스파타제 (AP), 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 글루코스 옥시다제 (GOX), 녹색 형광 단백질 (GFP), 산화환원 민감성 GFP (RoGFP), 아주라이트, 에메랄드, 반딧불이 루시페라제 (EC 1.13.12.7)), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT), ß-갈락토시다제, ß-글루쿠로니다제, 투불린-티로신 리가제 (TTL)를 함유하는 설계된 내재적 장애 태그가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 바람직하게는 전형적으로 디술파이드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)의 4개의 폴리펩티드 쇄로 구성된 면역글로불린 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은, 예컨대 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (CL)로 구성된다. VH 및 VL 영역은 추가로 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 더욱 보존된 영역으로 간격을 두고 배치된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 과가변성 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로, 예컨대 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배치된 3개의 CDR 및 최대 4개의 FR로 구성된다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" (CDR; 예컨대 CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 이의 존재가 항원 결합에 필수적인 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 카바트에 의해 정의되는 바와 같이 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 (예컨대, 경쇄 가변 도메인에 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 중쇄 가변 도메인에 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 및/또는 "과가변 루프"로부터의 잔기 (예컨대, 경쇄 가변 도메인에 약 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3))를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상보성 결정 영역은 카바트에 따라 정의되는 CDR 영역 및 과가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 온전한 항체는 상이한 "부류"로 할당될 수 있다. 5개의 주요 부류의 온전한 항체가 있으며: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 이들 중 일부는 추가로 "하위부류" (이소형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 나뉠 수 있다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 부류의 면역글로불린은 IgG이다.
상이한 부류의 항체에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 [알파], [델타], [엡신론], [감마], 및 [무]로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3차원 배치는 널리 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 항체는 통상적으로 공지된 항체 및 그의 기능적 단편이다.
본원에서 항체/면역글로불린의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 항원-결합 영역을 보유하는 항체/면역글로불린의 단편 (예컨대, IgG의 가변 영역)으로 정의된다. 항체의 "항원-결합 영역"은 전형적으로 항체의 하나 이상의 과가변 영역(들), 예컨대 CDR1, -2, 및/또는 -3 영역에서 발견되나; 가변 "프레임워크" 영역은 또한, 예컨대 CDR에 대한 스캐폴드를 제공함으로써 항원 결합에서 중요한 역할을 한다. 바람직하게는, "항원-결합 영역"은 가변 경쇄 (VL)의 적어도 아미노산 잔기 4 내지 103 및 가변 중쇄 (VH)의 5 내지 109, 더 바람직하게는 VL의 아미노산 잔기 3 내지 107 및 VH의 4 내지 111을 포함하며, 완전한 VL 및 VH 쇄 (VL의 아미노산 위치 1 내지 109 및 VH의 1 내지 113; WO 97/08320에 따라 번호매김)가 특히 바람직하다.
본 발명의 "기능적 단편", "항원-결합 항체 단편", 또는 "항체 단편"은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 단일 도메인 항체 (DAb), 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이적, 예컨대 이- 및 삼-특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "다-특이적" 또는 "다-기능적" 항체 이외의 항체는 그의 결합 부위 각각이 동일한 것으로 이해된다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1과 CL 도메인 사이에서 발생하는 분자간 디술파이드 상호작용을 최소화하거나 완전히 제거하도록 조작될 수 있다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역의 아미노산 잔기의 번호매김은 EU 인덱스로도 불리는 EU 번호매김 시스템에 따른다.
본 발명에서 고려되는 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 변이체는 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 결합 활성이 유지되는 분자이다.
본 발명에서 고려되는 "결합 단백질"은, 예컨대 항체 모방체, 예컨대 아피바디, 아드넥틴, 안티칼린, DARPin, 아비머, 나노바디이다.
"인간" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에서 키메라가 아니고 (예컨대, "인간화"가 아니고) (전체 또는 부분적으로) 비-인간 종으로부터가 아닌 것으로 정의된다. 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간으로부터 유래될 수 있거나 합성 인간 항체일 수 있다. "합성 인간 항체"는 본원에서 전체 또는 부분적으로 공지된 인간 항체 서열에 기초한 합성 서열로부터 인 실리코 유래되는 서열을 갖는 항체로 정의된다. 인간 항체 서열 또는 그의 단편의 인 실리코 설계는, 예컨대 인간 항체 또는 항체 단편 서열의 데이터베이스를 분석하고 그로부터 수득되는 데이터를 활용하여 폴리펩티드 서열을 고안함으로서 달성될 수 있다. 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 또 다른 예는 인간 기원의 항체 서열의 라이브러리 (예컨대, 인간 천연 공급원으로부터 취해진 항체에 기초하는 라이브러리)로부터 단리된 핵산에 의해 코딩되는 것이다.
"인간화 항체" 또는 그의 인간화 항원-결합 단편은 본원에서 (i) 비-인간 공급원 (예컨대, 이종 면역 시스템을 갖는 트렌스제닉 마우스)로부터 유래되거나 (항체는 인간 배선 서열에 기초함); (ii) 비-인간 항체의 프레임워크 영역의 아미노산이 유전자 조작에 의해 인간 아미노산 서열로 부분적으로 교환되거나; (iii) CDR-이식된 (가변 도메인의 CDR은 비-인간 기원으로부터의 것이고, 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크는 인간 기원이고 불변 도메인 (존재하는 경우)은 인간 기원의 것임) 것으로 정의된다.
"키메라 항체" 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에서 가변 도메인은 비-인간 기원으로부터 유래되고 일부 또는 모든 불변 도메인은 인간 기원으로부터 유래되는 것으로 정의된다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 즉 그 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예컨대 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 용어 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 그들의 특이성 외에, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 것이 이점이다. 용어 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생성을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 용어 "모노클로날 항체"는 구체적으로 키메라, 인간화 및 인간 항체를 포함한다.
"단리된" 항체는 그를 발현하는 세포의 성분으로부터 확인되고 분리된 것이다. 세포의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 사용을 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 항체는 관심 항원, 예컨대 종양-연관된 폴리펩티드 항원 표적에 "특이적으로 결합"하거나, "특이적"이거나, "특이적으로 인식"하고, 항체가 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적하는 데 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 항원에 결합하고, 다른 단백질과 유의하게 교차-반응하지 않거나 상술된 항원 표적의 이종상동체 및 변이체 (예컨대, 돌연변이체 형태, 스플라이스 변이체, 또는 단백질 분해적으로 절두된 형태) 이외의 단백질과 유의하게 교차-반응하지 않는 것이다. 본원에 사용되는 바와 같이 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프를 "특이적으로 인식하는" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"이라는 용어는, 예컨대 항원에 대한 1가 KD가 약 10-4 M 미만, 대안적으로 약 10-5 M 미만, 대안적으로 약 10-6 M 미만, 대안적으로 약 10-7 M 미만, 대안적으로 약 10-8 M 미만, 대안적으로 약 10-9 M 미만, 대안적으로 약 10-10 M 미만, 대안적으로 약 10-11 M 미만, 대안적으로 약 10-12 M 미만, 또는 그 이하인 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 설명될 수 있다. 항체는 이러한 항체가 이러한 항원과 하나 이상의 참조 항원(들) 사이를 구분할 수 있는 경우 항원에 "특이적으로 결합"하거나, "특이적"이거나, "특이적으로 인식"한다. 그의 가장 일반적인 형태에서, "특이적 결합", "특이적으로 결합하는", "특이적인", 또는 "특이적으로 인식하는"은, 예컨대 하기 방법 중 하나에 따라 관심 항원과 비관련된 항원 사이를 구분하는 항체의 능력을 지칭한다. 이러한 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR), 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-테스트 및 펩티드 스캔을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 표준 ELISA 검정이 수행될 수 있다. 스코어링은 표준 발색 (서양고추냉이 퍼옥시다제를 갖는 2차 항체 및 과산화수소와 함께 테트라메틸 벤지딘)에 의해 수행될 수 있다. 특정 웰에서 반응은 광학 밀도, 예컨대 450 nm에서 스코어링된다. 전형적인 배경 (= 음성 반응)은 0.1 OD일 수 있고; 전형적 양성 반응은 1 OD일 수 있다. 이는 양성/음성의 차가 5배, 10배, 50배, 및 바람직하게는 100배 초과임을 의미한다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 참조 항원이 아니라 약 3개 내지 4개의 비관련된 항원, 예컨대 분유, BSA, 트랜스페린 등의 세트를 사용하여 수행된다.
"결합 친화성" 또는 "친화성"은 분자의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 사이의 비-공유적 상호작용의 총합의 세기를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화성"은 결합쌍 (예컨대, 항체 및 항원)의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 해리 상수 "KD"는 일반적으로 분자 (예컨대, 항체)와 그의 결합 파트너 (예컨대, 항원) 사이의 친화성, 즉 리간드가 특정 단백질에 얼마나 단단히 결합하는지를 설명하는 데 사용된다. 리간드-단백질 친화성은 2개의 분자 사이의 비-공유적 분자간 상호작용에 의해 영향을 받는다. 친화성은 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 일반적 방법에 의해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "KD" 또는 "KD 값"은 비아코어 T100, 비아코어 T200, 비아코어 2000, 비아코어 4000, 비아코어 3000 (GE Healthcare Biacore, Inc.)과 같은 비아코어 기기, 또는 ProteOn XPR36 기기 (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 디바이스를 사용하여 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 측정된다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오시드" 및 "뉴클레오시드 모이어티"는 슈가기 및 헤테로사이클릭 염기 뿐만 아니라 이러한 하위-단위의 유사체, 예컨대 변형된 또는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드 또는 그의 임의의 화학적 변형을 포함하는 핵산 하위단위를 지칭한다. 다른기 (예컨대, 보호기)는 뉴클레오시드의 임의의 성분(들)에 부착될 수 있다. 뉴클레오시드의 변형은 2'-, 3'- 및 5'-위치 슈가 변형, 5- 및 6-위치 피리미딘 변형, 2-, 6- 및 8-위치 퓨린 변형, 엑소사이클릭 아민에서의 변형, 5-브로모-우라실의 치환 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오시드는 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 단량체, H-포스포네이트 커플링 또는 포스페이트 트리에스테르 커플링을 이용하는 고체상 자동화된 합성에 의해 당해 분야에 공지된 방법에 의해 올리고뉴클레오티드 합성이 가능하도록 적합하게 보호되고 유도체화된다.
"뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 모이어티"는 포스페이트기, 슈가기 및 헤테로사이클릭 염기를 포함하는 핵산의 하위-단위 뿐만 아니라 이러한 하위-단위의 유사체를 지칭한다. 다른기 (예컨대, 보호기)가 뉴클레오티드의 임의의 성분(들)에 부착될 수 있다. 용어 "뉴클레오티드"는 변형된 또는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드는 일부 경우에 티미딘, 시티딘, 구아노신, 아데닌 및 우리딘을 포함하는 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 공지된 퓨린 및 피리미딘 염기, 예컨대 아데닌 (A), 티민 (T), 시토신 (C), 구아닌 (G), 또는 우라실 (U) 뿐만 아니라 변형된 다른 헤테로사이클릭 염기를 함유하는 모이어티를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 변형은 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 알킬화된 리보스 또는 다른 헤테로사이클을 포함한다. 이러한 변형은, 예컨대 디아미노퓨린 및 그의 유도체, 이노신 및 그의 유도체, 알킬화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 티올화된 퓨린 또는 피리미딘 등, 또는 보호기, 예컨대 아세틸, 디플루오로아세틸, 트리플루오로아세틸, 이소부티릴, 벤조일, 9-플루오레닐메톡시카르보닐, 펜옥시아세틸, 디메틸포름아미딘, 디부틸포름아미딘, 디메틸아세트아미딘, N,N-디페닐 카르바메이트 등의 첨가를 포함한다. 퓨린 또는 피리미딘 염기는 또한 상술한 것의 유사체일 수 있고; 적합한 유사체는 당업자에게 공지될 것이고 관련 텍스트 및 문헌에 기재되어 있다. 일반적인 유사체는 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, N,N-디메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 4-아세틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2,2-디메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 5-에틸우라실, 5-프로필우라실, 5-메톡시우라실, 5-히드록시메틸우라실, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5-(메틸아미노메틸)우라실, 5-(카르복시메틸아미노메틸)-우라실, 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-(2-브로모비닐)우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실, 퀘오신, 이노신, 1-메틸이노신, 히포크산틴, 크산틴, 2-아미노퓨린, 6-히드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 상기 정의된 바와 같은 복수의 연결된 뉴클레오티드 단위로부터 형성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 단위는 각각 포스페이트 연결기를 통해 함께 연결된 뉴클레오시드 단위, 또는 그의 유사체를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 포스페이트 결합 이외의 결합, 예컨대 포스포로티오에이트 결합 또는 스쿠아라미드 결합을 통해 함께 연결된 복수의 뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 단량체 (즉, 올리고리보뉴클레오티드일 수 있음) 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체를 포함할 수 있다. 실례로, 올리고뉴클레오티드는 2 내지 50개 뉴클레오티드 단위, 예컨대 2 내지 40개 뉴클레오티드 단위, 예컨대 5 내지 35개 뉴클레오티드 단위, 예컨대 10 내지 35개 뉴클레오티드 단위, 15 내지 30개 뉴클레오티드 단위를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단당류"는 일반식 Cm(H2O)n의 개방쇄 또는 사이클릭 화합물을 지칭하며, 여기서 m은 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, n은 2, 3, 4, 5 6, 7 또는 8이다. 그러나, 이 용어는 또한 OH 기가 NH2 기 (예컨대, 글루코스아민)로 대체된 이들 염기성 화합물의 유도체, 데스옥시사카라이드를 포괄하며, 여기서 적어도 하나의 OH 기는 H (예컨대, 데스옥시리보스)로 대체된다. 단당류에 대한 바람직한 예는 D-(+)-글리세린알데히드; D-(-)-에리트로스; D-(-)-트레오스; D-(-)-리보스; D-(-)-아라비노스; D-(+)-자일로스; D-(-)-릭소스; D-(+)-알로스; D-(+)-알트로스; D-(+)-글루코스; D-(+)-만노스; D-(-)-굴로스; D-(-)-이도스; D-(+)-갈락토스; D-(+)-탈로스; 디히드록시아세톤; D-에리트룰로스; D-리불로스; D-자일룰로스; D-프시코스; D-프룩토스; D-소르보스; D-테가토스이다. 용어 "단당류"는 또한 1, 2, 3 또는 4개의 히드록실-기가 치환된 단당류를 포괄한다.
용어 "다당류"는 글리코시드 결합을 통해 연결된 적어도 2개 (2), 바람직하게는 적어도 5개 (5), 더 바람직하게는 적어도 10개 (10)의 단당류를 포함하는 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 탄수화물은 단당류 및 다당류 및 그의 유도체를 포괄한다.
본원에 사용된 중합체는 많은 반복된 유기 하위단위로 구성된 마크로분자를 지칭하나, 다당류, 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드는 아니다. 중합체의 예는 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리옥시에틸렌 (PEO) 또는 폴리글리세롤 (예컨대, 폴리글리세롤-폴리리시놀레에이트 (PGPR)이다.
용어 "형광단"은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 광 여기 시 광을 재방출하는 화학적 화합물을 지칭한다. 비제한적 예는 CY5, EDANS, 잔텐 유도체 (예컨대, 플르오레세인, 로다민, 오레곤 그린, 에오신, 텍사스 레드), 시아닌 유도체 (예컨대, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 메로시아닌), 스쿠아라인 유도체 (예컨대, Seta, Se Tau, 스퀘어 염료 (Square dye)), 나프탈렌 유도체 (예컨대, 단실 또는 프로단 유도체), 코우마린 유도체, 옥사디아졸 유도체, 안트라센 유도체 (예컨대, 안트라퀴논, 예컨대 DRAQ5, DRAQ7, CyTRAK 오렌지), 피렌 유도체 (예컨대, 케스케이드 블루), 옥사진 유도체 (예컨대, 나일 레드, 나일 블루, 크레실 바이올렛), 아크리딘 유도체 (예컨대, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우), 아릴메틴 유도체 (예컨대, 아우라민, 크리스탈 바이올렛, 말라카이트 그린), 또는 테트라피롤 유도체 (예컨대, 파르핀, 프탈로시아닌, 빌리루빈)이다.
본원에 사용된 용어 "지방족 또는 방향족 잔기"는 추가의 지방족 및/또는 방향족 치환체에 의해 임의적으로 치환될 수 있는 지방족 치환체, 예컨대 알킬 잔기를 지칭하며, 예컨대 이러한 분자의 코어 구조에 대한 (R1의 경우에, 예컨대 화학식 (I), (I*), (III), 또는 (III*)의 화하물의 각각의 산소에 대한) 직접 연결이 지방족인 한, 지방족 잔기는 핵산, 펩티드, 단백질, 효소, 보조-효소, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 단당류, 다당류, 중합체, 형광단, 임의적으로 치환된 벤젠 등일 수 있다. 펩티드의 코어 구조에 대한 직접 연결이, 예컨대 페닐-잔기를 통한 것인 경우, 방향족 잔기는 코어 구조에 대한 직접 연결이 방향족 시스템, 예컨대 임의적으로 치환된 페닐 또는 피리딜 또는 펩티드의 일부인 치환체이다.
용어 "항체 약물 접합체" 또는 약칭된 ADC는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 본원에 사용된 바와 같이 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약물, 예컨대 화학치료제, 독소, 면역치료제, 이미지화 프로브 등과의 결합을 지칭한다. 본원에 사용된 "링커"는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 공유적으로 약물에 연결하는 임의의 화학적 모이어티이다. 링커는 당업자에게 공지된 임의의 링커일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "링커 약물 접합체"는 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 링커 및 약물을 포함하는 또는 이로 이루어진 분자 또는 화학적 그룹을 지칭한다. 이에 대해, 용어 "링커 약물 접합체"는 일반적으로 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아닌 항체 약물 접합체의 일부를 지칭한다. 일반적으로, 링커 약물 접합체에서, 링커는 약물에 공유적으로 연결된다. 실례로서, 본 발명에 사용된 링커는 효소, 예컨대 카텝신 B에 의해 절단될 수 있는 자가-절단 펩티드를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에 사용된 자가-절단 펩티드를 포함하는 링커는 발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (VC-PAB,
Figure pct00004
), 발린-알라닌-p-아미노벤질옥시카르보닐 (VA-PAB,
Figure pct00005
), 리신-페닐알라닌-p-아미노벤질옥시카르보닐 (KF-PAB,
Figure pct00006
), 또는 발린-리신-p-아미노벤질옥시카르보닐 (VK-PAB,
Figure pct00007
)을 포함할 수 있다. 예컨대, 자가-절단 펩티드를 포함하는 링커는
Figure pct00008
,
Figure pct00009
,
Figure pct00010
, 또는
Figure pct00011
, 바람직하게는
Figure pct00012
일 수 있고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, *는 약물의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 자가-절단 펩티드를 갖는 링커는, 예컨대 문헌 (U.S. 특허 출원 공개 US 2006/0074008, G.M. Dubowchik et al., Bioconjuate Chem. 2002, 13, 855-869, 또는 S.O. Doronina et al., Nature Biotechnology, vol. 21, 778-784 (2003), 이들 문서의 전체 개시가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것이다. 링커-약물 접합체는
Figure pct00013
,
Figure pct00014
,
Figure pct00015
, 또는
Figure pct00016
, 바람직하게는
Figure pct00017
일 수 있고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 실례로서, 본 발명에 사용된 약물은 아우리스타틴, 바람직하게는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 또는 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)일 수 있다. 바람직하게는, 아우리스타틴, 특히 MMAE 또는 MMAF는, 예컨대 VC-PAB, VA-PAB, KF-PAB, 또는 VK-PAB와 같은 자가-절단 펩티드와 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 링커 약물 접합체는 VC-PAB-MMAE, VC-PAB-MMAF, VA-PAB-MMAE, VA-PAB-MMAF, KF-PAB-MMAE, KF-PAB-MMAF, VK-PAB-MMAE 또는 VK-PAB-MMAF를 포함할 수 있다. 특히, 링커 약물 접합체는
Figure pct00018
,
Figure pct00019
,
Figure pct00020
,
Figure pct00021
,
Figure pct00022
,
Figure pct00023
,
Figure pct00024
, 또는
Figure pct00025
, 바람직하게는
Figure pct00026
또는
Figure pct00027
, 더 바람직하게는
Figure pct00028
일 수 있고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편의, 예컨대 Cy5와 같은 형광단과의 결합을 지칭하는 "항체 형광단 접합체" 또는 약칭된 AFC가 또한 본원에 기재된다. 형광단은 링커를 통해 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 연결될 수 있다. 링커는 당업자에게 공지된 임의의 링커일 수 있다. 항체 형광단 접합체는 "링커 형광단 접합체"를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "링커 형광단 접합체"는 본원에서 앞서 정의된 바와 같은 링커, 및 형광단을 포함하는 또는 이로 이루어진 분자 또는 화학적 그룹을 지칭한다. 이에 대해, 용어 "링커 형광단 접합체"는 일반적으로 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아닌 항체 형광단 접합체의 일부를 지칭한다. 일반적으로, 링커 형광단 접합체에서, 링커는 형광단에 공유적으로 연결된다.
본원에 사용된 용어 "소분자"는 적어도 2개의 탄소 원자, 바람직하게는 7, 12, 15 또는 20개 이하의 회전 가능한 탄소 결합, 더 바람빅하게는 7, 12 또는 15개 이하의 회전 가능한 탄소 결합, 더욱더 바람직하게는 7 또는 12개의 회전 가능한 탄소 결합을 포함하고, 100 내지 2000 달톤, 바람직하게는 100 내지 1000 달톤 범위의 분자량을 갖고, 임의적으로 1 또는 2개의 금속 원자를 포함하는 유기 분자를 나타낸다. 소분자 비오틴 및 형광단에 대한 단순 실례로서, EDANS 및 Cy5가 언급될 수 있다.
방법
본 발명은 티올-포함 화합물의 알켄 또는 알킨 포스포노티올레이트 및 포스포네이트와의 새로운 반응을 제공한다. 도식 1은 본 발명에 따른 일반 반응을 설명하고, 실례로서 에테닐 및 에티닐 포스포노티올레이트 및 포스포네이트를 사용한다.
도식 1:
Figure pct00029
본원에 기재된 방법은 위치 R1, ● 및
Figure pct00030
에서 다량의 상이한 유기 잔기를 조합하는 것을 가능하게 한다는 것이 제안된다. 특히, 본 발명에 따른 방법은
Figure pct00031
가 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드인 경우 접합체를 형성하기에 적합하다. 이점으로서, 예컨대 시스테인 잔기의 티올기와 같은 이러한 아미노산, 펩티드, 단백질 또는 항체에 존재하는 티올기, 또는 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 존재하는 티올기는 알켄 또는 알킨 포스포노티올레이트 또는 포스포네이트와 화학선택적으로 반응하여 화학선택적 변형 방법을 제공한다. 이러한 화학선택성으로 인해, 티올 함유 화합물, 특히 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 탈보호될 수 있으며, 이는 보호기가 필요하기 않음을 의미한다. 알켄 또는 알킨 포스포노티올레이트 또는 포스포네이트는 전자-결핍 알켄 또는 알킨 포스포노티올레이트 또는 포스포네이트일 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 방법은 2개의 복합 분자의 접합을 가능하게 한다. 예컨대, 단백질은 항체 또는 또 다른 단백질에 커플링될 수 있다.
본원에서는 하기가 입증된다:
ㆍ 친전자성 알켄- 및 알킨-포스포노티올레이트 및 -포스포네이트의 합성
ㆍ 전자 결핍 알켄- 및 알킨-포스포노티올레이트 및 -포스포네이트의 아미노산, 펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 티올-함유 분자와의 접합 반응
ㆍ 생리적으로 관련된 조건 하에서 이들 접합체의 안정성
ㆍ 접합이, 예컨대 생리학적 pH와 같은 생리적으로 관련된 조건 하에서의 작동한다.
본 발명은 새로운 접합 화학으로 항체 또는 단백질 접합체와 같은 접합체의 접근성을 더욱 용이하게 하는 여러 혁신적인 측면을 특징으로 한다:
ㆍ 다양한 화합물, 예컨대 소분자, 단백질 및 항체에서 티올을 변형시키기 위한 반응.
ㆍ 2개의 복합 분자 (예컨대, 형광단 및 단백질 또는 항체)가 펩티드, 단백질 및 항체의 경우 시스테인-선택적인 직접 접합에 의해 연결될 수 있다.
ㆍ 일반적인 말레이미드 시약과는 대조적으로 접합체의 높은 안정성: 빠른 접합 반응.
ㆍ 펩티드, 단백질 및 항체를 변형 또는 접합시키는 다른 방법과는 대조적으로, 시스테인 선택성으로 인해 알켄 포스포노티올레이트 또는 알킨 포스포노티올레이트 제조 후, 또는 알켄 또는 알킨 포스포네이트 제조 후, 및/또는 화학선택적 접합 후 보호기 조작이 필요하지 않다.
ㆍ 불포화된 포스포노티올레이트는 티올 첨가 시 상응하는 포스포네이트보다 상당히 빠르게 반응하므로 중요한 이점을 나타낸다. 빠른 반응 속도는 생체접합 반응에 매우 요구되며, 이로써 전환 및 또한 수율이 증가될 수 있다. 생성된 티올-포스포노티올레이트-접합체는 생리적으로 관련된 조건 하에서 우수한 안정성 프로필을 나타낸다.
ㆍ 고체상 합성 후 고체 지지체로부터 펩티드의 절단에 전형적으로 이용되는 산성 조건 하에서 포스포노티올레이트의 높은 안정성.
포스포노티올레이트, 및 포스포네이트에 대한 티올 첨가의 몇몇 예가 특허 문헌 (US3904710A, GB917085, GB863434, DE1064512) 및 공개문 (Gao et al., Chemistry Eur. J. 2009, 15(9), 2064-2070; Khusinova et al., Russian Chemical Bulletin, International Edition, 2004, vol. 53, no. 10, pp. 2253-2256, and Acheson et al., Journal of Chemical Research, Synopses, 1986)에 보고되었다. 그러나, 이들 문헌에서 포스포노티올레이트에 대한 티올 첨가는 보고되지 않았다. 또한, 이들 문헌은, 예컨대 펩티드, 단백질, 항체 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 생체분자의 변형과 관련되지 않으며, 그들은 생리적으로 관련된 조거 조건 하에서 반응 속도 및 안정성의 문제에 대한 어떠한 언급도 없다.
일반적으로, 본 발명에 따른 방법은 상이한 화합물, 예컨대 소분자 (예컨대, 임의적으로 치환된 알킬, 페닐 또는 헤테로사이클), 펩티드, 단백질, 항체, 올리고뉴클레오티드 또는 다당류를 태그, 단백질, 올리고뉴클레오티드 등과 접합시키기 위해 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물을 화학식 (II)의 티올-함유 분자와 반응시켜 화학식 (III)의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는, 화학식 (III)의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
상기 식에서,
Figure pct00035
는 이중 결합 또는 삼중 결합을 나타내고;
X는
Figure pct00036
가 삼중 결합인 경우 R3-C를 나타내고;
X는
Figure pct00037
가 이중 결합인 경우 (R3 R4)C를 나타내고;
Y는 S 또는 O를 나타내고;
R1은 임의적으로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
R4는 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
●는 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
Figure pct00038
는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타내고;
Figure pct00039
는 화학식 (I)의 화합물에서
Figure pct00040
이 이중 결합을 나타내는 경우 단일결합을 나타내거나;
Figure pct00041
는 화학식 (I)의 화합물에서
Figure pct00042
이 삼중 결합을 나타내는 경우 이중 결합을 나타낸다.
화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II)의 화합물과 반응하여 화학식 (III)의 화합물을 제공하는 본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서,
Figure pct00043
는 이중 결합을 나타내고, X는 (R3 R4)C를 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고,
Figure pct00044
는 결합을 나타낸다. 바람직하게는, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 H 또는 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 H 또는 C1-C2-알킬을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R3 및 R4는 동일하다. 바람직한 실시양태에서, R3 및 R4는 둘 다 H이다.
대안적으로, 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II)의 화합물과 반응하여 화학식 (III)의 화합물을 제공하는 본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서,
Figure pct00045
는 삼중 결합을 나타내고, X는 R3-C를 나타내고, R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고,
Figure pct00046
는 이중 결합을 나타낸다. 바람직하게는, R3은 H 또는 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 H 또는 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 H 또는 C1-C2-알킬을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R3은 H이다.
화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II)의 화합물과 반응하여 화학식 (III)의 화합물을 제공하는 본 발명의 방법 중 어느 하나에서, Y는 S (황) 또는 O (산소)일 수 있다. Y가 S인 경우, 화합물 (I) 및 (III)는 포스포노티올레이트를 나타낸다. Y가 O인 경우, 화합물 (I) 및 (III)는 포스포네이트를 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, Y는 S이다. 일부 실시양태에서, Y는 O이다. 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II)의 화합물과 반응하여 화학식 (III)의 화합물을 생성하는 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, Y는 S이다. 본 발명자들은 화학식 (II)의 티올을 포스포노티올레이트의 삼중 결합 또는 이중 결합에 첨가하는 것이, 즉 Y가 S인 경우, 상응하는 포스포네이트에 대한 첨가보다, 즉 Y가 O인 경우보다 상당히 빠르다는 것을 발견하였다. 이러한 더 빠른 반응 속도는 이로써 전환 및 수율이 증가하기 때문에 매우 바람직하다.
화학식 (I)의 화합물의 제조는 화학식 (IV)의 화합물을 산화제와 반응시켜 화학식 (I)의 화합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다:
Figure pct00047
상기 식에서, R1, X, Y,
Figure pct00048
및 ●는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다. 산화제는 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 (tBu-OOH), 메타-클로로퍼옥시벤조산 (mCPBA), 과산화수소 (H2O2), 요오드 (I2), 칼륨 퍼옥시모노술페이트, 또는 산소 (O2), 예컨대 공기로부터의 산소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 산화제는 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 (tBu-OOH)이다. 화학식 (IV)의 화합물의 제조는 삼할로겐화인 (X), 바람직하게는 PCl3를 순차적으로 (i) 화학식 (XI)의 화합물, (ii) 화학식 (XII)의 화합물, (iii) 화학식 (XIII)의 화합물, 및 (iv) 화학식 (XIV)의 화합물과 반응시켜 화학식 (IV)의 화합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다:
R1-OH (XI)
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
상기 식에서, R2는 독립적으로 C1-C8-알킬을 나타내고; HaL은 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Br을 나타내고; R1, X, Y,
Figure pct00052
및 ●는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다. 삼할로겐화인은 PCl3, PBr3 또는 PI3일 수 있고, PCl3가 바람직하다.
Figure pct00053
에서 R2는 독립적으로 C1-C8-알킬, 바람직하게는 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 C1-C3-알킬을 나타낸다. 바람직하게는, 두 R2는 동일하다. 더욱더 바람직하게는, 두 R2는 이소프로필이다. 바람직하게는,
Figure pct00054
가 반응되는 단계 (iv)는 테트라졸의 존재 하에 반응된다. 테트라졸은 비치환된 테트라졸 또는 치환된 테트라졸일 수 있다.
대안적으로, Y가 S인 경우, 화학식 (I)의 화합물의 제조는 화학식 (V)의 화합물을 화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물과 반응시켜 화학식 (I)의 화합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다:
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
상기 식에서, EWG는 전자 구인기를 나타내고, 상기 전자 구인기는 바람직하게는
Figure pct00058
,
Figure pct00059
, 및
Figure pct00060
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 #은 S의 위치를 나타내고; HaL은 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Cl을 나타내고, R1, X,
Figure pct00061
및 ●는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다. 바람직하게는, 화학식 (V)의 화합물에서, 두 R1은 동일하다. 더 바람직하게는, 화학식 (VIa)의 화합물이 사용되는 경우, EWG는
Figure pct00062
이다. 화학식 (V)의 화합물은, 예컨대 화학식 (XX)의 화합물을 화학식 (XXI)의 화합물과 반응시켜 화학식 (V)의 화합물을 제공하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
Figure pct00063
Figure pct00064
상기 식에서, R1, X, 및
Figure pct00065
는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같고; Hal1은 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Cl이고; Hal2는 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Br이다. 화학식 (VIa)의 화합물은, 예컨대 화학식 (XXX)의 화합물을 화학식 (XXXI)의 화합물과 반응시켜 화학식 (VIa)의 화합물을 제공함으로써 제조될 수 있다:
Figure pct00066
Figure pct00067
상기 식에서, EWG는 전자-구인기이고, 바람직하게는 전자-구인기는
Figure pct00068
,
Figure pct00069
, 및
Figure pct00070
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는
Figure pct00071
이고, 여기서 #은 S의 위치를 나타내고; 바람직하게는, 화학식 (XXX)의 화합물에서 두 EWG는 동일하고; ●는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다. 화학식(VIb)의 화합물은 문헌에 공지된 절차, 예컨대 티올
Figure pct00072
을 술푸릴 클로라이드(sulfuryl chloride) (예컨대, 문헌 (Allared, F. et al, Synthetic Metals, 120(1-3), 1061-1062; 2001) 참조) 또는 티오닐 클로라이드 (예컨대, 문헌 (Masaki, Yukio et al, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 33(5), 1930-40; 1985) 참조)와 반응시키거나, 티올
Figure pct00073
을 N-클로로숙신이미드 (NCS) (예컨대, 문헌 (Kawamura, Takamasa et al. European Journal of Organic Chemistry, 2015(4), 719-722; 2015) 참조) 또는 염소 (예컨대, 문헌 (E. Schneider, Chemische Berichte　84, 911-916 (1951)) 참조)와 반응시켜 제조될 수 있으며, 여기서 ●는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다.
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (V)의 화합물을 화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물과 반응시켜 제조되는 경우, 화학식 (V)의 화합물에서
Figure pct00074
는 이중 결합이고, X는 (R3 R4)C를 나타내고, 여기서 R3 및 R4는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 화학식 (I*)의 화합물을 화학식 (II)의 티올-함유 분자와 반응시켜 화학식 (III*)의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는 화학식 (III*)의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
상기 식에서,
V는 C1-C8-알킬, 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필, 더 바람직하게는 메틸을 나타내고;
X는 (R3 R4)C를 나타내고;
Y는 S 또는 O를 나타내고;
R1은 임의적으로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
R4는 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
●는 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
Figure pct00078
은 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타낸다.
화학식 (I*)의 화합물이 화학식 (II)의 화합물과 반응하여 화학식 (III*)의 화합물을 제공하는 본 발명의 방법 중 어느 하나에서, Y는 S (황) 또는 O (산소)일 수 있고, 즉 Y가 S인 경우, 화합물 (I*) 및 (III*)는 포스포노티올레이트를 나타내고, Y가 O인 경우, 화합물 (I*) 및 (III*)는 포스포네이트를 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, Y는 S이다. 일부 실시양태에서, Y는 O이다. 화학식 (I*)의 화합물이 화학식 (II)의 화합물과 반응하여 화학식 (III*)의 화합물을 생성하는 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, Y는 S이며, 이는 본 발명자들이 티올을 포스포노티올레이트의 삼중 결합 또는 이중 결합에 첨가하면, 즉 Y가 S인 경우가 상응하는 포스포네이트, 즉 Y가 O인 경우보다 상당히 빠르다는 것을 발견했기 때문이다.
화학식 (I*)의 화합물의 제조는 화학식 (IV*)의 화합물을 산화제와 반응시켜 화학식 (I*)의 화합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다:
Figure pct00079
상기 식에서, X는 (R3 R4)C를 나타내고, Y, R1, R3, R4, V 및 ●는본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다. 산화제는 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 (tBu-OOH), 메타-클로로퍼옥시벤조산 (mCPBA), 과산화수소 (H2O2), 요오드 (I2), 칼륨 퍼옥시모노술페이트, 또는 산소 (O2), 예컨대 공기로부터의 산소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 산화제는 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 (tBu-OOH)이다. 화학식 (IV*)의 화합물의 제조는 삼할로겐화인 (X), 바람직하게는 PCl3를 순차적으로 (i) 화학식 (XI)의 화합물, (ii) 화학식 (XII)의 화합물, (iii) 화학식 (XIII*)의 화합물, 및 (iv) 화학식 (XIV)의 화합물과 반응시켜 화학식 (IV*)의 화합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다:
R1-OH (XI)
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
상기 식에서, R2는 독립적으로 C1-C8-알킬을 나타내고, HaL은 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Br을 나타내고, X는 (R3 R4)C를 나타내고, R1, R3, R4, V, Y 및 ●는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다. 삼할로겐화인은 PCl3, PBr3 또는 PI3일 수 있고, PCl3가 바람직하다.
Figure pct00083
에서 R2는 독립적으로 C1-C8-알킬, 바람직하게는 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 C1-C3-알킬을 나타낸다. 바람직하게는, 두 R2는 동일하다. 더욱더 바람직하게는, 두 R2는 이소프로필이다. 바람직하게는,
Figure pct00084
이 반응되는 단계 (iv)는 테트라졸의 존재 하에서 수행된다. 테트라졸은 비치환된 테트라졸 또는 치환된 테트라졸일 수 있다.
대안적으로, Y가 S인 경우, 화학식 (I*)의 화합물의 제조는 화학식 (V*)의 화합물을 화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물과 반응시켜 화학식 (I*)의 화합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다:
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
상기 식에서, EWG는 전자 구인기를 나타내고, 상기 전자 구인기는 바람직하게는
Figure pct00088
,
Figure pct00089
, 및
Figure pct00090
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 #은 S의 위치를 나타내고; HaL은 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Cl, X는 (R3 R4)C를 나타내고, R1, R3, R4, V 및 ●는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다. 바람직하게는, 화학식 (V*)의 화합물에서, 두 R1은 동일하다. 더 바람직하게는, 화학식 (VIa)의 화합물이 사용되는 경우, EWG는
Figure pct00091
이다. 화학식 (V*)의 화합물은, 예컨대 화학식 (XX)의 화합물을 화학식 (XXI*)와 반응시켜 화학식 (V*)의 화합물을 제공함으로써 제조될 수 있다:
Figure pct00092
Figure pct00093
상기 식에서, X는 (R3 R4)C를 나타내고, R1, R3, R4 및 V는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같고; Hal1은 is Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Cl이고; Hal2는 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Br이다. 화학식 (VIa) 및 (VIb)의 화합물은, 예컨대 본원에서 기 및 하기에서 기재되는 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), F, Cl, Br, I, -NO2, -N(C1-C8-알킬)H, -NH2, -N3, -N(C1-C8-알킬)2, =O, C3-C8-사이클로알킬, -S-S-(C1-C8-알킬), 히드록시-(C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), C2-C8-알케닐 또는 C2-C8-알키닐 중 적어도 하나로 치환된 C1-C8-알킬을 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 치환된 페닐, 예컨대
Figure pct00094
또는
Figure pct00095
을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 C1-C8-알킬, (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), F, Cl, I, Br, -NO2, -N(C1-C8-알킬)H, -NH2 또는 -N(C1-C8-알킬)2 중 적어도 하나로 독립적으로 치환된 페닐을 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 5 또는 6원 헤테로방향족 시스템, 예컨대 피리딜을 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 C1-C8-알킬, -S-S-(C1-C8-알킬)로 치환된 C1-C8-알킬, (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다)로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐로 치환된 C1-C8-알킬; 또는 페닐; 또는 -NO2로 치환된 페닐을 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸, 바람직하게는 메틸 또는 에틸을 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 -S-S-(C1-C8-알킬)로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00096
을 나타내고, 여기서 R10, R11, R12 및 R13은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C8-알킬을 나타내고; #은 O의 위치를 나타낸다. 더 바람직한 실시양태에서, R10,. R11, R12, 및 R13은 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00097
을 나타내고, 여기서 R10 및 R11 독립적으로 수소 또는 C1-C8-알킬을 나타내고; #은 O의 위치를 나타내나. 더 바람직한 실시양태에서, R10 및 R11 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타낸다. 더더욱 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00098
을 나타내고, 여기서 R10 및 R11은 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; #은 O의 위치를 나타낸다. 이들 실시양태의 일부에서, R10 및 R11은 모두 수소이다. 이들 실시양태의 일부에서, R10은 수소이고, R11은 C1-C6-알킬이다. 이들 실시양태의 일부에서, R10은 수소이고, R11은 메틸 또는 에틸이다. 이들 실시양태의 일부에서, R10 및 R11은 동일하다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00099
, 더 바람직하게는
Figure pct00100
을 나타내고, R10 및 R11은 본원에서 상기에서 정의된 바와 같다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00101
을 나타내고, 여기서 R12 및 R13은 독립적으로 수소 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;#은 O의 위치를 나타낸다. 더 바람직한 실시양태에서, R12 및 R13은 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타낸다. 더더욱 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00102
을 나타내고, 여기서 R12 및 R13은 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; #은 O의 위치를 나타낸다. 이들 실시양태의 일부에서, R12 및 R13은 둘 다 수소이다. 이들 실시양태의 일부에서, R12는 수소이고, R13은 C1-C6-알킬이다. 이들 실시양태의 일부에서, R12는 수소이고, R13은 메틸 또는 에틸이다. 이들 실시양태의 일부에서, R12 및 R13은 동일하다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 페닐로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내고, 상기 페닐은
Figure pct00103
로 추가로 치환되고, 여기서 Z는O 또는 NH이고, #은 상기 페닐의 위치를 나타낸다. 일부 실시양태에서, Z는 O이다. 일부 실시양태에서, Z는 NH이다.
Figure pct00104
에서 C1-C8-알킬은, 예컨대메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸; 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필; 더 바람직하게는 메틸 또는 에틸; 가장 바람직하게는 메틸일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00105
을 나타내고, 여기서 C1-C8-알킬은, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸; 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필; 더 바람직하게는 메틸 또는 에틸; 가장 바람직하게는 메틸일 수 있고; Z는 O 또는 NH이고, #은 O의 위치를 나타낸다. 또 다른 바람직한 양태에서, R1은
Figure pct00106
을 나타내고, 여기서 C1-C8-알킬은 예컨데 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸; 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필; 더 바람직하게는 메틸 또는 에틸; 가장 바람직하게는 메틸일 수 있고; Z는 O 또는 NH이고, #은 O의 위치를 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 페닐로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내고, 상기 페닐은
Figure pct00107
로 추가로 치환되고, 여기서 #은 상기 페닐의 위치를 나타낸다. 일부 실시양태에서, R1은 페닐로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내고, 상기 페닐은
Figure pct00108
로 추가로 치환되고, 여기서 #은 상기 페닐의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00109
을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타낸다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00110
을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은
Figure pct00111
을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타내고, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6이고; 더 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3, 4이고; 더욱더 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3이고, 더더욱더 바람직하게는 n은 0, 1, 2이고, 더더더욱더 바람직하게는 n은 0, 1이고; 가장 바람직하게는 n은 1이다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 C2-C8-알키닐로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R1은 호모프로파르길이다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은
Figure pct00112
을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타내고, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6이고; 더 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3, 4이고; 더욱더 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3이고, 더더욱더 바람직하게는 n은 0, 1, 2이고, 더더더욱더 바람직하게는 n은 0, 1이고; 가장 바람직하게는 n은 1이고, 즉 n이 1인 경우, R1은
Figure pct00113
을 나타낸다..
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는, 예컨대 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, -CH2-페닐,
Figure pct00114
Figure pct00115
와 같은 소분자를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 C1-C2-알킬을 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 -CH2-페닐, 즉 벤질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00116
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00117
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00118
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00119
을 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00120
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00121
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00122
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는
Figure pct00123
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는
Figure pct00124
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는
Figure pct00125
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 페닐, 바람직하게는
Figure pct00126
을 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 방사성 또는 비-방사성 핵종, 비오틴, 리포터 효소, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 아미노산, 펩티드, 임의적으로 치환된 5 또는 6원 헤테로방향족 시스템을 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, ●는 방사성 또는 비-방사성 핵종을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 비오틴을 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 리포터 효소를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 아미노산을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 5 또는 6원 헤테로방향족 시스템을 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, "임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다" 등이 임의의 방법 또는 임의의 화합물과 관련하여 지시되는 경우에, ●는 사실상 임의의 링커를 추가로 포함할 수 있고, 링커는 Y에 결합되며, 상기 Y는, 예컨대 화학식 (I), (I*), (III) 또는 (III*)의 화합물과 관련하여 본원에서 제시되는 바와 같이 S (황) 또는 O (산소), 바람직하게는 S이다. 링커는 당업자에게 공지된 임의의 링커, 예컨대 펩티드 링커 또는 직선 또는 분지된 탄화수소-기반 모이어티일 수 있다. 링커는 또한 사이클릭 모이어티를 포함할 수 있다. 펩티드 링커는, 예컨대 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 또는 2, 또는 1개의 아미노산(들)을 포함할 수 있다. 링커가 탄화수소-기반 모이어티인 경우, 링커의 주쇄는 탄소 원자를 포함할 수 있을 뿐만 아니라 헤테로원자, 예컨대 산소 (O), 질소 (N) 또는 황(들) 원자를 또한 함유할 수 있고/있거나 카르보닐기 (C=O)를 함유할 수 있다. 링커는, 예컨대 C1-C20 탄소 원자 쇄 또는 폴리에테르 기반 쇄, 예컨대 -(O-CH2-CH2)- 반복 단위를 갖는 폴리에틸렌 글리콜-기반 쇄일 수 있다. 탄화수소-기반 링커의 전형적 실시양태에서, 연결 모이어티는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19개 주쇄 원자를 포함하여 1 내지 약 150, 1 내지 약 100, 1 내지 약 75, 1 내지 약 50, 또는 1 내지 약 40, 또는 1 내지 약 30, 또는 1 내지 약 20개의 주쇄 원자를 포함한다. 실례로서, 링커는
Figure pct00127
일 수 있고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타내고, *은 ●의 또 다른 부분의 위치를 나타내고, 여기서 상기 또 다른 부분은 비제한적 예로서 아미노산, 펩티드, 항체, 단백질, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자일 수 있고; m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 상술된 예시적인 링커는 또한, 예컨대 본 명세서가 "링커" 자체를 지칭하는 경우, 또는 예컨대 항체 형광단 접합체와 관련하여"링커-약물 접합체"를 지칭하는 경우 사용될 수 있다. 당업자는 적합한 링커를 선택하는 것을 알고 있다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 구조 (VII)의 사이클릭 RGD 펩티드 (c(RDGfK))를 나타낸다:
Figure pct00128
상기 식에서, *는 Y의 위치를 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 임의적으로 C1-C8-알킬, C1-C8-알콕시, 할로겐, -CN, -NO2, -NH2, -N(C1-C8-알킬), -N(C1-C8-알킬)2 -COOH, -COO(C1-C8-알킬), -O-C(O)-(C1-C8-알킬), -C(O)N-(C1-C8-알킬), -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 치환된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환체로 치환된, 바람직하게는 임의적으로 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된, 페닐을 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 C3-C8-사이클로알킬; 3 내지 8개의 고리 구성원을 갖고 헤테로원자(들)이 N, O, S로부터 선택된 헤테로사이클릴; C1-C8-알콕시; 할로겐; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-알킬); -N(C1-C8-알킬)2; -COOH; -COO(C1-C8-알킬); -O-C(O)-(C1-C8-알킬); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-알킬)2; -C(O)NH-(C1-C8-알킬); -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬), 바람직하게는 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2, 페닐 또는 헤테로방향족 시스템, 단당류, 다당류, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 중합체, 아미노산, 형광단, 단백질 태그 (1세대 치환체)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환된, C1-C8-알킬을 나타내고, 여기서 1세대 치환체는 다시 임의적으로 C3-C8-사이클로알킬; 3 내지 8개의 고리 구성원을 갖고 헤테로원자(들)이 N, O, S로부터 선택된 헤테로사이클릴; C1-C8-알콕시; 할로겐; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-알킬); -N(C1-C8-알킬)2; -COOH; -COO(C1-C8-알킬); -O-C(O)-(C1-C8-알킬); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-알킬)2; -C(O)NH-(C1-C8-알킬); -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬), 바람직하게는 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2, 페닐 또는 헤테로방향족 시스템 (2세대 치환체)로 치환될 수 있고, 여기서 2세대 치환체는 다시 동일한 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환될 수 있고, 이러한 치환은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10세대까지 지속될 수 있다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, ●는 아미노산을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 당류를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 다당류를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 중합체를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C2-알킬을 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 페닐을 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, ●는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 더 바람직한 실시양태에서, ●는 펩티드, 단백질, 항체, 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, ●는 아미노산을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, ●는 약물, 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 단백질, 펩티드, 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, ●는 약물을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 링커-약물 접합체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, ●는 링커 또는 링커-약물 접합체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는, 예컨대 VC-PAB, VA-PAB, KF-PAB, 또는 VK-PAB를 포함하는 링커, 바람직하게는 VC-PAB를 포함하는 링커와 같은 링커를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는, 예컨대
Figure pct00129
,
Figure pct00130
,
Figure pct00131
, 또는
Figure pct00132
, 바람직하게는
Figure pct00133
와 같은 링커-약물 접합체를 나타내고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 더 바람직하게는, 링커 약물 접합체는
Figure pct00134
,
Figure pct00135
,
Figure pct00136
,
Figure pct00137
,
Figure pct00138
,
Figure pct00139
,
Figure pct00140
, 또는
Figure pct00141
, 더욱더 바람직하게는
Figure pct00142
또는
Figure pct00143
, 가장 바람직하게는
Figure pct00144
이고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다.
본 발명의 방법 중 어느 하나에 따라,
Figure pct00145
는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타낼 수 있다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00146
은 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 더 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00147
는 펩티드, 단백질, 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00148
는 아미노산을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00149
는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00150
는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00151
는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00152
는 뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00153
는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00154
는 당류를 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00155
는 다당류를 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00156
는 중합체를 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00157
는 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C2-알킬을 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00158
는 임의적으로 치환된 C3-C8-알킬, 바람직하게는 임의적으로 치환된 C3-C6-알킬, 더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C3-C4-알킬을 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00159
는 임의적으로 치환된 C5-C8-알킬, 바람직하게는 임의적으로 치환된 C6-C7-알킬을 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00160
는 임의적으로 치환된 페닐을 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00161
는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00162
는 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 더 바람직하게는 세툭시맙 또는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙; 단백질, 바람직하게는 GFP 단백질 또는 eGFP-단백질, 알부민, 트리펩티드, 바람직하게는 화학식 (VIII)의 펩티드
Figure pct00163
또는 화학식 (IX)의 펩티드
Figure pct00164
를 나타내고, 여기서 #은 S의 위치를 나타낸다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00165
는 항체를 나타낸다. 더 바람직한 실시양태에서, 항체는 IgG 항체, 더욱더 바람직하게는 세툭시맙 또는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙이다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00166
는 단백질, 더 바람직하게는 GFP 단백질 또는 eGFP-단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00167
는 알부민을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00168
는 트리펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00169
는 화학식 (VIII)의 펩티드
Figure pct00170
를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00171
는 화학식 (IX)의 펩티드
Figure pct00172
를 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00173
는 항체 (예컨대, 세툭시맙, 트라스투주맙, 또는 브렌툭시맙)를 나타내고, ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00174
는 항체를 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00175
는 항체를 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00176
는 항체를 나타내고, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00177
는 항체를 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00178
는 항체를 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00179
는 항체를 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00180
는 항체를 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00181
는 단백질 (예컨대, GFP 단백질 또는 eGFP 단백질)을 나타내고, ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고, 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00182
는 단백질을 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00183
는 단백질을 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00184
는 단백질을 나타내고, ●는비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00185
는 단백질을 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00186
는 단백질을 나타내고, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00187
는 단백질을 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00188
는 단백질을 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00189
는 단백질을 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00190
는 펩티드를 나타내고, ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00191
는 펩티드를 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00192
는 펩티드를 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00193
는 펩티드를 나타내고, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00194
는 펩티드를 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00195
는 펩티드를 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00196
는 펩티드를 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00197
는 펩티드를 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00198
는 아미노산을 나타내고, ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00199
는 아미노산을 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00200
는 아미노산을 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00201
는 아미노산을 나타내고, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00202
는 아미노산을 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00203
는 아미노산을 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00204
는 아미노산을 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00205
는 아미노산을 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00206
는 항체 (예컨대, 세툭시맙, 트라스투주맙, 또는 브렌툭시맙)를 나타내고, ●는 링커, 약물, 또는 링커-약물 접합체를 나타낸다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00207
는 항체를 나타내고, ●는, 예컨대 VC-PAB, VA-PAB, KF-PAB, 또는 VK-PAB를 포함하는 링커, 바람직하게는 VC-PAB를 포함하는 링커와 같은 링커를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00208
는 항체를 나타내고, ●는 약물을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00209
는 항체를 나타내고, ●는, 예컨대
Figure pct00210
,
Figure pct00211
,
Figure pct00212
, 또는
Figure pct00213
, 바람직하게는
Figure pct00214
와 같은 링커-약물 접합체를 나타내고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 더 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00215
는 항체를 나타내고, ●는, 예컨대
Figure pct00216
,
Figure pct00217
,
Figure pct00218
,
Figure pct00219
,
Figure pct00220
,
Figure pct00221
,
Figure pct00222
, 또는
Figure pct00223
, 더욱더 바람직하게는
Figure pct00224
또는
Figure pct00225
, 가장 바람직하게는
Figure pct00226
와 같은 링커-약물 접합체를 나타내고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 이들 실시양태 중 어느 하나에서, 항체는 세툭시맙, 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙, 바람직하게는 브렌툭시맙일 수 있다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00227
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 펩티드, 단백질, 단백질 태그, 항체, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00228
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00229
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00230
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00231
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00232
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00233
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00234
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00235
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00236
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 링커를 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00237
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 펩티드, 단백질, 단백질 태그, 항체, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00238
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00239
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00240
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00241
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00242
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00243
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00244
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00245
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00246
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 링커를 나타낸다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, ●는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 여기서 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합된다. 일부 실시양태에서, ●는 고체 지지체에 결합된 아미노산 또는 펩티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 고체 지지체에 결합된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 고체 지지체에 결합된 펩티드를 나타낸다. 이점으로서, 본 발명자들은 본 발명의 포스포노티올레이트가 고체 지지체로부터 펩티드의 절단에 전형적으로 이용되는 산성 조건 하에서, 예컨대 90% 트리플루오로아세트산 (TFA) 하에서 매우 안정하다는 것을 발견하였다. 고체 지지체는 고체상 펩티드 합성에 적합한 당업자에게 공지된 임의의 고체 지지체, 또는 고체상 올리고뉴클레오티드 합성에 적합한 임의의 고체 지지체일 수 있다. 이러한 고체 지지체는 또한 수지로 공지되어 있다. 고체상 펩티드 합성에 적합한 고체 지지체에 대한 실례는 유기 및 무기 지지체, 예컨대 메리필드 (Merrifield) 폴리스티렌 수지 (스티렌 및 1-2% 디비닐벤젠으로부터의 공중합체), 폴리아크릴아미드 수지, 텐타겔 (TentaGel) (폴리틸렌글리콜이 폴리스티렌에 그래프팅된 그래프트 중합체), 왕(Wang) 수지 (전형적으로 메리필드 수지에서와 같이 가교된 폴리스티렌에 기초함), 또는 무기 고체 지지체를 위한 예로서 소정의 세공 크기를 갖는 다공성 유리를 포함한다. 고체상 펩티드 합성을 위한 시판되는 고체 지지체에 대한 실례는 머크 밀리포어 (Merck Millipor)에 의해 공급되는 링크 (Rink) 아미드 수지 또는 NovaSyn®TGR 수지이다. 고체상 올리고뉴클레오티드 합성에 적합한 고체 지지체에 대한 실례는 소정의 세공 크기를 갖는 유리 (제어된 세공 유리, CPG) 및 폴리스티렌, 예컨대 거대다공성 폴리스티렌 (MPPS)을 포함한다. 임의적으로, 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 결합되는 전술한 실시양태에서, ●는 본원에 개시된 화학식, 특히 화합물 (I), (III), (I*) 및 (III*)의 화학식의 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 또한, 링커는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 결합된다. 따라서, ●는 링커-아미노산-고체 지지체, 링커-펩티드-고체 지지체, 링커-뉴클레오티드-고체 지지체, 또는 링커-올리고뉴클레오티드-고체 지지체의 구조를 가질 수 있다. "링커"는 실제로 임의의 링커일 수 있고, 링커는 Y에 결합되고, 상기 Y는, 예컨대 화학식 (I), (I*), (III) 또는 (III*)의 화합물과 관련하여 제시된 바와 같이, S (황) 또는 O (산소), 바람직하게는 S이다. 링커는 당업자에게 공지된 임의의 링커, 예컨대펩티드 링커 또는 직선 또는 분지된 탄화수소-기반 모이어티일 수 있다. 링커는 또한 사이클릭 모이어티를 포함할 수 있다. 펩티드 링커는, 예컨대 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 또는 2, 또는 1개의 아미노산(들)을 포함할 수 있다. 링커가 탄화수소-기반 모이어티인 경우, 링커의 주쇄는 탄소 원자를 포함할 뿐만 아니라 헤테로원자, 예컨대 산소 (O), 질소 (N) 또는 황(들) 원자를 함유할 수 있고/있거나 카르보닐기 (C=O)를 함유할 수 있다. 링커는, 예컨대 C1-C20 탄소 원자 쇄 또는 폴리에테르 기반 쇄, 예컨대 -(O-CH2-CH2)- 반복 단위를 갖는 폴리에틸렌 글리콜-기반 쇄일 수 있다. 탄화수소-기반 링커의 전형적 실시양태에서, 연결 모이어티는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19개의 주쇄 원자를 포함하여 1 내지 약 150, 1 내지 약 100, 1 내지 약 75, 1 내지 약 50, 또는 1 내지 약 40, 또는 1 내지 약 30, 또는 1 내지 약 20개의 주쇄 원자를 포함한다. 당업자는 적합한 링커를 선택하는 것을 알고 있다. 예컨대, 일부 실시양태에서, 링커는
Figure pct00247
일 수 있고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타내고, *는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 N (질소) 원자를 통해 링커에 결합될 수 있다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00248
는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 여기서 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합된다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00249
는 고체 지지체에 결합된 아미노산 또는 펩티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00250
는 고체 지지체에 결합된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00251
는 고체 지지체에 결합된 펩티드를 나타낸다.
본 발명은 또한
(I) 화학식 (Ia) 또는 화학식 (I*a)의 화합물을 고체 지지체에 결합된 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 화학식 (Ib) 또는 화학식 (I*b)의 화합물을 생성하고;
(II) 화학식 (Ib) 또는 화학식 (I*b)의 화합물을 고체 지지체로부터 절단시켜 화학식 (I) 또는 화학식 (I*)의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는, 화학식 (I) 또는 화학식 (I*)의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure pct00252
Figure pct00253
Figure pct00254
Figure pct00255
Figure pct00256
Figure pct00257
상기 식에서,
L은 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 or 올리고뉴클레오티드에 대한 결합에 적합한 링커를 나타내고;
Figure pct00258
, X, Y, V 및 R1은 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같고;
Z는 고체 지지체에 결합된 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고;
●는 링커 L을 통해 Y에 결합된 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 링커 L은
Figure pct00259
이고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 카르복실기를 통해 이러한 링커에 결합된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (Ia) 또는 (I*a)의 화합물은 고체 지지체에 결합된 펩티드 또는 고체 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드와 반응되고, 바람직하게는 화학식 (Ia) 또는 (I*a)의 화합물은 고체 지지체에 결합된 펩티드와 반응된다. 일부 실시양태에서, 단계 (II)의 절단은 산성 조건, 예컨대 수성 트리플루오로아세트산 (예컨대, 90% TFA)을 사용하여 수행된다. 이에 대해, 본 발명자들은 본 발명의 포스포노티올레이트 (Y = S)가, 특히 고체 지지체로부터 펩티드를 절단하는 데 이용되는 산성 조건 하에서 매우 안정하다는 것을 발견하였다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, 방법은 화학식 (I) 또는 화학식 (I*)의 화합물을 상기 및 하기에서 정의된 바와 같이 화학식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 실시양태에서,
Figure pct00260
및
Figure pct00261
는 동일한 분자에 존재한다. 따라서, 본 발명은 또한 화학식 (L)의 화합물이 반응되어 화학식 (IIIa)의 화합물을 생성하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00262
Figure pct00263
상기 식에서,
Figure pct00264
및
Figure pct00265
는 ● 및
Figure pct00266
을 연결하는 아치에 의해 표시된 것과 동일한 분자에 존재하고;
Figure pct00267
는 화학식 (XX)의 화합물에서
Figure pct00268
이 이중 결합을 나타내는 경우 단일 결합을 나타내고, X는 (R3 R4)C를 나타내거나;
Figure pct00269
는 화학식 (XX)의 화합물에서
Figure pct00270
이 삼중 결합을 나타내는 경우 이중 결합을 나타내고, X는 R3-C를 나타내고;
Figure pct00271
, ●, R1, R3, R4 및 Y는본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 화학식 (L*)의 화합물이 반응되어 화학식 (III*a)의 화합물을 생성하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00272
Figure pct00273
상기 식에서,
Figure pct00274
및
Figure pct00275
는 ● 및
Figure pct00276
을 연결하는 아치에 의해 표시된 것과 동일한 분자에 존재하고; X는 (R3 R4)C이고,
Figure pct00277
, ●, V, R1, R3, R4 및 Y는본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 동일한 분자에
Figure pct00278
및
Figure pct00279
를 갖는 화합물 (L)은, 예컨대 BCL9 펩티드와 같은 펩티드이다. 따라서, 이 방법에 의해 수득되는 화학식 (IIIa)의 화합물은, 예컨대 BCL9 펩티드로부터 유도되는 사이클릭 펩티드와 같은 사이클릭 펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일 분자에
Figure pct00280
및
Figure pct00281
을 갖는 화합물 (L*)은, 예컨대 BCL9 펩티드와 같은 펩티드이다. 따라서, 방법에 의해 수득되는 화학식 (III*a)의 화합물은, 예컨대 BCL9 펩티드로부터 유도되는 사이클릭 펩티드와 같은 사이클릭 펩티드일 수 있다.
화학식 (I), (I*), (II), (III) 및 (III*)의 화합물에 대해 본원에서 기재된 모든 방법은 화학식 (L), (L*), (IIIa) 및 (III*a)의 화합물에 대해 유사하게 수행될 수 있다.
화합물
본 발명은 또한 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 수득 가능한 또는 수득되는 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 예컨대 출발 물질 또는 중간체로서 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 사용되는 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 또한 화학식 (I), (I*), (III), (III*), (L), (L*), (IIIa) 및 (III*a)의 화합물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00282
상기 식에서,
Figure pct00283
는 이중 결합 또는 삼중 결합을 나타내고;
X는
Figure pct00284
가 삼중 결합인 경우 R3-C를 나타내고;
X는
Figure pct00285
가 이중 결합인 경우 (R3 R4)C를 나타내고;
Y는 S 또는 O를 나타내고;
R1은 임의적으로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
R4는 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
●는 지방족 또는 방향족 잔기를 나타낸다.
화학식 (I)의 화합물의 일부 실시양태에서,
Figure pct00286
는 이중 결합을 나타내고, X는 (R3 R4)C를 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C8-알킬을 나타낸다. 바람직하게는, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C8-알킬, 더 바람직하게는 H 또는 C1-C6-알킬, 더욱더 바람직하게는 H 또는 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 H 또는 C1-C2-알킬을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R3 및 R4는 동일하다. 바람직한 실시양태에서, R3 및 R4는 둘 다 H이다.
대안적으로, 화학식 (I)의 화합물의 일부 실시양태에서,
Figure pct00287
는 삼중 결합을 나타내고, X는 R3-C를 나타내고, R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타낸다. 바람직하게는, R3은 H 또는 C1-C8-알킬, 더 바람직하게는 H 또는 C1-C6-알킬, 더욱더 바람직하게는 H 또는 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 H 또는 C1-C2-알킬을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R3은 H이다.
본 발명은 화학식 (I*)의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00288
상기 식에서,
V는 C1-C8-알킬, 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필, 더 바람직하게는 메틸을 나타내고;
X는 (R3 R4)C를 나타내고;
Y는 S 또는 O를 나타내고;
R1은 임의적으로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
R4는 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
●는 지방족 또는 방향족 잔기를 나타낸다.
본 발명은 또한 화학식 (III)의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00289
상기 식에서,
Figure pct00290
는 단일 결합을 나타내고, X는 (R3 R4)C를 나타내거나;
Figure pct00291
는 이중 결합을 나타내고, X는 R3-C를 나타내고;
Y는 S 또는 O를 나타내고;
R1은 임의적으로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
R4는 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
●는 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
Figure pct00292
는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타낸다.
화학식 (III)의 화합물의 일부 실시양태에서,
Figure pct00293
는 단일 결합을 나타내고, X는 (R3 R4)C를 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C8-알킬을 나타낸다. 바람직하게는, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 H 또는 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 H 또는 C1-C2-알킬을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R3 및 R4는 동일하다. 바람직한 실시양태에서, R3 및 R4는 둘 다 H이다.
대안적으로, 화학식 (III)의 화합물의 일부 실시양태에서,
Figure pct00294
는 이중 결합을 나타내고, X는 R3-C를 나타내고, R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타낸다. 바람직하게는, R3은 H 또는 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 H 또는 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 H 또는 C1-C2-알킬을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R3은 H이다.
본 발명은 또한 화학식 (III*)의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00295
상기 식에서,
X는 (R3 R4)C를 나타내고;
Y는 S 또는 O를 나타내고;
R1은 임의적으로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
R4는 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
V는 C1-C8-알킬, 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필, 더 바람직하게는 메틸을 나타내고;
●는 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
Figure pct00296
는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타낸다.
화학식 (III*)의 화합물의 일부 실시양태에서, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 또는 C1-C8-알킬을 나타낸다. 바람직하게는, R3 및 R4는 H 또는 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 H 또는 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 H 또는 C1-C2-알킬을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R3 및 R4는 동일하다. 바람직한 실시양태에서, R3 및 R4는 둘 다 H이다.
화학식 (I), (I*), (III) 또는 (III*)의 화합물 중 어느 하나에서, Y는 S (황) 또는 O (산소)일 수 있고, 즉 Y가 S인 경우, 화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*)는 포스포노티올레이트를 나타내고, Y가 O인 경우, 화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*)는 포스포네이트를 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, Y는 S이다. 일부 실시양태에서, Y는 O이다. 이점으로서, 본 발명자들은 포스포노티올레이트 및 포스포네이트 둘 다 생리적으로 관련된 조건 하에서 안정하다는 것을 밝혔다. 화합물 (I), (I*), (III), 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, Y는 S이다. 화학식 (III) 및 (III*)의 포스포노티올레이트 (여기서, Y는 S이다)는 상응하는 포스포네이트보다 빠른 티올 첨가에 의해 접근 가능하다는 것이 밝혀졌다. 이러한 더 빠른 반응 속도는 이로써 포스포노티올레이트의 전환 및 수율이 증가되기 때문에 매우 바람직하다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), F, Cl, Br, I, -NO2, -N(C1-C8-알킬)H, -NH2, -N3, -N(C1-C8-알킬)2, =O, C3-C8-사이클로알킬, -S-S-(C1-C8-알킬), 히드록시-(C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), C2-C8-알케닐 또는 C2-C8-알키닐 중 적어도 하나로 치환된 C1-C8-알킬을 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 치환된 페닐, 예컨대
Figure pct00297
또는
Figure pct00298
을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 C1-C8-알킬, (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), F, Cl, I, Br, -NO2, -N(C1-C8-알킬)H, -NH2 또는 -N(C1-C8-알킬)2 중 적어도 하나로 독립적으로 치환된 페닐을 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 5 또는 6원 헤테로방향족 시스템, 예컨대 피리딜을 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 C1-C8-알킬, -S-S-(C1-C8-알킬)로 치환된 C1-C8-알킬, (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다)로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐로 치환된 C1-C8-알킬; 또는 페닐; 또는 -NO2로 치환된 페닐을 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸, 바람직하게는 메틸 또는 에틸을 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 -S-S-(C1-C8-알킬)로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00299
을 나타내고, 여기서 R10, R11, R12 및 R13은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C8-알킬을 나타내고; #은 O의 위치를 나타낸다. 더 바람직한 실시양태에서, R10,. R11, R12, 및 R13은 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00300
을 나타내고, 여기서 R10 및 R11 독립적으로 수소 또는 C1-C8-알킬을 나타내고; #은 O의 위치를 나타내나. 더 바람직한 실시양태에서, R10 및 R11 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타낸다. 더더욱 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00301
을 나타내고, 여기서 R10 및 R11은 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; #은 O의 위치를 나타낸다. 이들 실시양태의 일부에서, R10 및 R11은 모두 수소이다. 이들 실시양태의 일부에서, R10은 수소이고, R11은 C1-C6-알킬이다. 이들 실시양태의 일부에서, R10은 수소이고, R11은 메틸 또는 에틸이다. 이들 실시양태의 일부에서, R10 및 R11은 동일하다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00302
, 더 바람직하게는
Figure pct00303
을 나타내고, 여기서 R10 및 R11은 본원에서 상기에서 정의된 바와 같다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00304
을 나타내고, 여기서 R12 및 R13은 독립적으로 수소 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;#은 O의 위치를 나타낸다. 더 바람직한 실시양태에서, R12 및 R13은 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타낸다. 더더욱 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00305
을 나타내고, 여기서 R12 및 R13은 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; #은 O의 위치를 나타낸다. 이들 실시양태의 일부에서, R12 및 R13은 둘 다 수소이다. 이들 실시양태의 일부에서, R12는 수소이고, R13은 C1-C6-알킬이다. 이들 실시양태의 일부에서, R12는 수소이고, R13은 메틸 또는 에틸이다. 이들 실시양태의 일부에서, R12 및 R13은 동일하다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 페닐로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내고, 상기 페닐은
Figure pct00306
로 추가로 치환되고, 여기서 Z는O 또는 NH이고, #은 상기 페닐의 위치를 나타낸다. 일부 실시양태에서, Z는 O이다. 일부 실시양태에서, Z는 NH이다.
Figure pct00307
에서 C1-C8-알킬은, 예컨대메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸; 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필; 더 바람직하게는 메틸 또는 에틸; 가장 바람직하게는 메틸일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00308
을 나타내고, 여기서 C1-C8-알킬은, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸; 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필; 더 바람직하게는 메틸 또는 에틸; 가장 바람직하게는 메틸일 수 있고; Z는 O 또는 NH이고, #은 O의 위치를 나타낸다. 또 다른 바람직한 양태에서, R1은
Figure pct00309
을 나타내고, 여기서 C1-C8-알킬은 예컨데 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸; 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필; 더 바람직하게는 메틸 또는 에틸; 가장 바람직하게는 메틸일 수 있고; Z는 O 또는 NH이고, #은 O의 위치를 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 페닐로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내고, 상기 페닐은
Figure pct00310
로 추가로 치환되고, 여기서 #은 상기 페닐의 위치를 나타낸다. 일부 실시양태에서, R1은 페닐로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내고, 상기 페닐은
Figure pct00311
로 추가로 치환되고, 여기서 #은 상기 페닐의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00312
을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타낸다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00313
을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은
Figure pct00314
을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타내고, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6이고; 더 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3, 4이고; 더욱더 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3이고, 더더욱더 바람직하게는 n은 0, 1, 2이고, 더더더욱더 바람직하게는 n은 0, 1이고; 가장 바람직하게는 n은 1이다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은 임의적으로 C2-C8-알키닐로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, R1은 호모프로파르길이다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, R1은
Figure pct00315
을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타내고, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6이고; 더 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3, 4이고; 더욱더 바람직하게는 n은 0, 1, 2, 3이고, 더더욱더 바람직하게는 n은 0, 1, 2이고, 더더더욱더 바람직하게는 n은 0, 1이고; 가장 바람직하게는 n은 1이고, 즉 n이 1인 경우, R1은
Figure pct00316
을 나타낸다..
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는, 예컨대 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, -CH2-페닐,
Figure pct00317
Figure pct00318
와 같은 소분자를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 C1-C2-알킬을 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 -CH2-페닐, 즉 벤질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00319
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00320
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00321
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00322
을 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00323
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00324
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는
Figure pct00325
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는
Figure pct00326
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는
Figure pct00327
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는
Figure pct00328
를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 페닐, 바람직하게는
Figure pct00329
을 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 방사성 또는 비-방사성 핵종, 비오틴, 리포터 효소, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 아미노산, 펩티드, 임의적으로 치환된 5 또는 6원 헤테로방향족 시스템을 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, ●는 방사성 또는 비-방사성 핵종을 나타낸다. 일부 바람직한 실시양태에서, ●는 비오틴을 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 리포터 효소를 나타낸다. 일부 바람직한 실시양태에서, ●는 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 바람직한 실시양태에서, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 바람직한 실시양태에서, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 일부 바람직한 실시양태에서, ●는 아미노산을 나타낸다. 일부 바람직한 실시양태에서, ●는 펩티드를 나타낸다. 일부 바람직한 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 5 또는 6원 헤테로방향족 시스템을 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 구조 (VII)의 사이클릭 RGD 펩티드 (c(RDGfK))를 나타낸다:
Figure pct00330
상기 식에서, *는 Y의 위치를 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 임의적으로 C1-C8-알킬, C1-C8-알콕시, 할로겐, -CN, -NO2, -NH2, -N(C1-C8-알킬), -N(C1-C8-알킬)2 -COOH, -COO(C1-C8-알킬), -O-C(O)-(C1-C8-알킬), -C(O)N-(C1-C8-알킬), -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 치환된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환체로 치환된, 바람직하게는 임의적으로 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된, 페닐을 나타낸다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 C3-C8-사이클로알킬; 3 내지 8개의 고리 구성원을 갖고 헤테로원자(들)이 N, O, S로부터 선택된 헤테로사이클릴; C1-C8-알콕시; 할로겐; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-알킬); -N(C1-C8-알킬)2; -COOH; -COO(C1-C8-알킬); -O-C(O)-(C1-C8-알킬); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-알킬)2; -C(O)NH-(C1-C8-알킬); -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬), 바람직하게는 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2, 페닐 또는 헤테로방향족 시스템, 단당류, 다당류, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 중합체, 아미노산, 형광단, 단백질 태그 (1세대 치환체)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환된, C1-C8-알킬을 나타내고, 여기서 1세대 치환체는 다시 임의적으로 C3-C8-사이클로알킬; 3 내지 8개의 고리 구성원을 갖고 헤테로원자(들)이 N, O, S로부터 선택된 헤테로사이클릴; C1-C8-알콕시; 할로겐; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-알킬); -N(C1-C8-알킬)2; -COOH; -COO(C1-C8-알킬); -O-C(O)-(C1-C8-알킬); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-알킬)2; -C(O)NH-(C1-C8-알킬); -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬), 바람직하게는 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2, 페닐 또는 헤테로방향족 시스템 (2세대 치환체)로 치환될 수 있고, 여기서 2세대 치환체는 다시 동일한 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환될 수 있고, 이러한 치환은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10세대까지 지속될 수 있다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ●는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, ●는 아미노산을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 당류를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 다당류를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 중합체를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C2-알킬을 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 페닐을 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, ●는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 더 바람직한 실시양태에서, ●는 펩티드, 단백질, 항체, 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, ●는 아미노산을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, ●는 약물, 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 단백질, 펩티드, 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, ●는 약물을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 링커-약물 접합체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, ●는 링커 또는 링커-약물 접합체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는, 예컨대 VC-PAB, VA-PAB, KF-PAB, 또는 VK-PAB를 포함하는 링커, 바람직하게는 VC-PAB를 포함하는 링커와 같은 링커를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는, 예컨대
Figure pct00331
,
Figure pct00332
,
Figure pct00333
, 또는
Figure pct00334
, 바람직하게는
Figure pct00335
와 같은 링커-약물 접합체를 나타내고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 더 바람직하게는, 링커 약물 접합체는
Figure pct00336
,
Figure pct00337
,
Figure pct00338
,
Figure pct00339
,
Figure pct00340
,
Figure pct00341
,
Figure pct00342
, 또는
Figure pct00343
, 더욱더 바람직하게는
Figure pct00344
또는
Figure pct00345
, 가장 바람직하게는
Figure pct00346
이고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나에 따라,
Figure pct00347
는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타낼 수 있다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00348
은 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 더 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00349
는 펩티드, 단백질, 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00350
는 아미노산을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00351
는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00352
는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00353
는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00354
는 뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00355
는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00356
는 당류를 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00357
는 다당류를 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00358
는 중합체를 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00359
는 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C6-알킬, 더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C4-알킬, 더욱더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C1-C2-알킬을 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00360
는 임의적으로 치환된 C3-C8-알킬, 바람직하게는 임의적으로 치환된 C3-C6-알킬, 더 바람직하게는 임의적으로 치환된 C3-C4-알킬을 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00361
는 임의적으로 치환된 C5-C8-알킬, 바람직하게는 임의적으로 치환된 C6-C7-알킬을 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00362
는 임의적으로 치환된 페닐을 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00363
는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타낸다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00364
는 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 더 바람직하게는 세툭시맙 또는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙; 단백질, 바람직하게는 GFP 단백질 또는 eGFP-단백질, 알부민, 트리펩티드, 바람직하게는 화학식 (VIII)의 펩티드
Figure pct00365
또는 화학식 (IX)의 펩티드
Figure pct00366
를 나타내고, 여기서 #은 S의 위치를 나타낸다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00367
는 항체를 나타낸다. 더 바람직한 실시양태에서, 항체는 IgG 항체, 더욱더 바람직하게는 세툭시맙 또는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙이다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00368
는 단백질, 더 바람직하게는 GFP 단백질 또는 eGFP-단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00369
는 알부민을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00370
는 트리펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00371
는 화학식 (VIII)의 펩티드
Figure pct00372
를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00373
는 화학식 (IX)의 펩티드
Figure pct00374
를 나타낸다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00375
는 항체 (예컨대, 세툭시맙, 트라스투주맙, 또는 브렌툭시맙)를 나타내고, ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00376
는 항체를 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00377
는 항체를 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00378
는 항체를 나타내고, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00379
는 항체를 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00380
는 항체를 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00381
는 항체를 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00382
는 항체를 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00383
는 단백질 (예컨대, GFP 단백질 또는 eGFP 단백질)을 나타내고, ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고, 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00384
는 단백질을 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00385
는 단백질을 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00386
는 단백질을 나타내고, ●는비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00387
는 단백질을 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00388
는 단백질을 나타내고, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00389
는 단백질을 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00390
는 단백질을 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00391
는 단백질을 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00392
는 펩티드를 나타내고, ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00393
는 펩티드를 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00394
는 펩티드를 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00395
는 펩티드를 나타내고, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00396
는 펩티드를 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00397
는 펩티드를 나타내고, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00398
는 펩티드를 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00399
는 펩티드를 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00400
는 펩티드를 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00401
는 아미노산을 나타내고, ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00402
는 아미노산을 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00403
는 아미노산을 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00404
는 아미노산을 나타내고, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00405
는 아미노산을 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00406
는 아미노산을 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00407
는 아미노산을 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00408
는 아미노산을 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00409
는 항체 (예컨대, 세툭시맙, 트라스투주맙, 또는 브렌툭시맙)를 나타내고, ●는 링커, 약물, 또는 링커-약물 접합체를 나타낸다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00410
는 항체를 나타내고, ●는, 예컨대 VC-PAB, VA-PAB, KF-PAB, 또는 VK-PAB를 포함하는 링커, 바람직하게는 VC-PAB를 포함하는 링커와 같은 링커를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00411
는 항체를 나타내고, ●는 약물을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00412
는 항체를 나타내고, ●는, 예컨대
Figure pct00413
,
Figure pct00414
,
Figure pct00415
, 또는
Figure pct00416
, 바람직하게는
Figure pct00417
와 같은 링커-약물 접합체를 나타내고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 더 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00418
는 항체를 나타내고, ●는, 예컨대
Figure pct00419
,
Figure pct00420
,
Figure pct00421
,
Figure pct00422
,
Figure pct00423
,
Figure pct00424
,
Figure pct00425
, 또는
Figure pct00426
, 더욱더 바람직하게는
Figure pct00427
또는
Figure pct00428
, 가장 바람직하게는
Figure pct00429
와 같은 링커-약물 접합체를 나타내고, 여기서 #은 Y (O (산소) 또는 S (황), 바람직하게는 S)의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 이들 실시양태 중 어느 하나에서, 항체는 세툭시맙, 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙, 바람직하게는 브렌툭시맙일 수 있다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00430
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 펩티드, 단백질, 단백질 태그, 항체, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00431
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00432
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00433
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00434
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00435
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00436
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00437
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00438
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00439
는 뉴클레오티드를 나타내고, ●는 링커를 나타낸다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00440
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 펩티드, 단백질, 단백질 태그, 항체, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00441
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00442
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 단백질을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00443
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 단백질 태그를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00444
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00445
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00446
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 형광단, 예컨대 CY5 또는 EDANS를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00447
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 비오틴을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00448
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 소분자를 나타낸다. 임의적으로, 이들 실시양태 중 어느 하나에서, ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다.
화합물 (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00449
는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ●는 링커를 나타낸다.
화합물 (I), (II), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, ●는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 여기서 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 화학식 (I)의 화합물 또는 화학식 (I*)의 화합물이다. 일부 실시양태에서, ●는 고체 지지체에 결합된 아미노산 또는 펩티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ●는 고체 지지체에 결합된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, ●는 고체 지지체에 결합된 펩티드를 나타낸다. 이점으로서, 본 발명자들은 본 발명의 포스포노티올레이트 (Y = S)가 고체 지지체로부터 펩티드의 절단에 전형적으로 이용되는 산성 조건 하에서, 예컨대 90% 트리플루오로아세트산 (TFA) 하에서 매우 안정하다는 것을 발견하였다. 고체 지지체는 고체상 펩티드 합성에 적합한 당업자에게 공지된 임의의 고체 지지체, 또는 예컨대 방법과 관련하여 본원에서 상기에 기재된 바와 같이 고체상 올리고뉴클레오티드 합성에 적합한 임의의 고체 지지체일 수 있다. 임의적으로, 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 결합되는 전술한 실시양태에서, ●는 본원에 개시된 화학식, 특히 화합물 (I), (III), (I*) 및 (III*)의 화학식의 Y에 결합된 링커를 추가로 포함한다. 또한, 링커는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 결합된다. 따라서, ●는 링커-아미노산-고체 지지체, 링커-펩티드-고체 지지체, 링커-뉴클레오티드-고체 지지체, 또는 링커-올리고뉴클레오티드-고체 지지체의 구조를 가질 수 있다. "링커"는 실제로 임의의 링커일 수 있고, 링커는 Y에 결합되고, 상기 Y는, 예컨대 화학식 (I), (I*), (III) 또는 (III*)의 화합물과 관련하여 제시된 바와 같이, S (황) 또는 O (산소), 바람직하게는 S이다. 링커는 당업자에게 공지된 임의의 링커, 예컨대펩티드 링커 또는 직선 또는 분지된 탄화수소-기반 모이어티일 수 있다. 링커는 또한 사이클릭 모이어티를 포함할 수 있다. 펩티드 링커는, 예컨대 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 또는 2, 또는 1개의 아미노산(들)을 포함할 수 있다. 링커가 탄화수소-기반 모이어티인 경우, 링커의 주쇄는 탄소 원자를 포함할 뿐만 아니라 헤테로원자, 예컨대 산소 (O), 질소 (N) 또는 황(들) 원자를 함유할 수 있고/있거나 카르보닐기 (C=O)를 함유할 수 있다. 링커는, 예컨대 C1-C20 탄소 원자 쇄 또는 폴리에테르 기반 쇄, 예컨대 -(O-CH2-CH2)- 반복 단위를 갖는 폴리에틸렌 글리콜-기반 쇄일 수 있다. 탄화수소-기반 링커의 전형적 실시양태에서, 연결 모이어티는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19개의 주쇄 원자를 포함하여 1 내지 약 150, 1 내지 약 100, 1 내지 약 75, 1 내지 약 50, 또는 1 내지 약 40, 또는 1 내지 약 30, 또는 1 내지 약 20개의 주쇄 원자를 포함한다. 당업자는 적합한 링커를 선택하는 것을 알고 있다. 예컨대, 일부 실시양태에서, 링커는
Figure pct00450
일 수 있고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타내고, *는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로, 예컨대 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 N (질소) 원자를 통해 링커에 결합될 수 있다.
화합물 (I), (I*), (III) 또는 (III*) 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00451
는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 여기서 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합된다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00452
는 고체 지지체에 결합된 아미노산 또는 펩티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00453
는 고체 지지체에 결합된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서,
Figure pct00454
는 고체 지지체에 결합된 펩티드를 나타낸다.
본 발명은 또한 고체 지지체, 및 화학식 (I)의 화합물, 및/또는 화학식 (I*)의 화합물을 포함하는 키트에 관한 것이다:
Figure pct00455
Figure pct00456
상기 식에서, ●는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 결합하기에 적합한 링커이고;
Figure pct00457
, R1, X, Y, 및 V는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다. 이러한 키트는 고체상 펩티드 합성 및/또는 고체상 올리고뉴클레오티드 합성에 적합하다. 바람직하게는, 본 발명자들은 본 발명의 포스포노티올레이트 (Y = S)가 고체 지지체로부터 펩티드의 절단에 전형적으로 이용되는 산성 조건 하에서, 예컨대 90% 트리플루오로아세트산 (TFA) 하에서 매우 안정하다는 것을 발견하였으므로, 키트는 고체상 펩티드 합성에 사용될 수 있다. 고체상 합성 동안, 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합되고, 화학식 (I) 또는 화학식 (I*)의 화합물의 링커는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 결합된다.
키트의 바람직한 실시양태에서, 링커는
Figure pct00458
이고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1이다. 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 카르복실기를 통해 이러한 링커에 결합된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 구조
Figure pct00459
또는
Figure pct00460
을 갖는다.
키트는 고체상 합성에 사용될 수 있는 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 펩티드, 하나 이상의 뉴크레오티드, 및/또는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 특히, 고체상 펩티드 합성이 바람직하므로, 키트는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 (IIIa)의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00461
,
상기 식에서, ● 및
Figure pct00462
는 ● 및
Figure pct00463
을 연결하는 아치에 의해 표시된 것과 동일한 분자에 존재하고, ●,
Figure pct00464
,
Figure pct00465
, X, Y 및 R1은 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같고, 특히 화합물 (III)과 관련하여 정의된 바와 같다. 바람직하게는, 화합물 (IIIa)은, 예컨대 BCL9 펩티드로부터 유도되는 사이클릭 펩티드와 같은 사이클릭 펩티드이다.
본 발명은 또한 화학식 (III*a)의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00466
,
싱기 식에서, ● 및
Figure pct00467
는 ● 및
Figure pct00468
을 연결하는 아치에 의해 표시된 것과 동일한 분자에 존재하고, ●,
Figure pct00469
, V, X, Y 및 R1은 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같고, 특히 화합물 (III*)과 관련하여 정의된 바와 같다. 바람직하게는, 화합물 (III*a)은, 예컨대 BCL9 펩티드로부터 유도되는 사이클릭 펩티드와 같은 사이클릭 펩티드이다.
더우기, 화학식 (I), (I*), (III), (III*), (IIIa) 또는 (III*a)의 화합물에 대해 실시예 섹션에서 예로서 본원에 제공되는 화합물도 바람직하다.
당업자는 본 발명에 따른 실시양태가 자연 법칙에 위배되는 조합이 배제된다는 조건으로 서로 조합될 수 있다는 것을 이해한다.
임의의 방법과 관련하여 본원에 기재된 임의의 실시양태, 특징, 정의 등은 또한 필요한 변경을 가하여 본원에 기재된 임의의 화합물에 적용된다. 동일한 방식으로, 임의의 화합물과 관련하여 본원에 기재된 임의의 실시양태, 특징, 정의 등은 필요한 변경을 가하여 본원에 기재된 임의의 방법에 적용된다.
삼할로겐화인으로부터 출발하는 화학식 (IV), (IV*), (I) 및 (I*)의 화합물의 합성
하기 섹션은 삼할로겐화인으로부터 출발하는 화학식 (IV), (IV*), (I) 및 (I*)의 화합물의 합성의 몇몇 일반적인 특질을 제공한다. 일반적으로, 당업자는 이러한 합성을 수행하기에 적합한 반응 조건을 선택하는 것을 알고 있다. 추가의 세부 사항은 하기 실시예 섹션에서 제공된다.
본원에서 상기 및 하기에 나타낸 바와 같이, 화학식 (IV) 또는 (IV*)의 화합물은 단계 (i) 내지 (iv)를 포함하는 순서를 통해 제조될 수 있다. 따라서, 화학식 (IV) 또는 (IV*)의 화합물은 (i) 삼할로겐화인 (X), 바람직하게는 PCl3를 R1 잔기를 포함하는 알콜 (XI)과 반응시키고, (ii) 단계 (i)에서 수득된 생성물을 아민 (XII)과 반응시키고, (iii) 단계 (ii)에서 수득된 생성물을 알케닐 마그네슘 할라이드 또는 알키닐 마그네슘 할라이드 (XIII)와 또는 알케닐 마그네슘 할라이드 (XIII*)와 반응시키고 , (iv) 단계 (iv)에서 수득된 생성물을 ● 잔기를 포함하는 알콜 또는 티올 (XIV)과 반응시켜 화학식 (IV) 또는 (IV*)의 화합물을 생성함으로써 합성될 수 있다. 화학식 (I) 또는 (I*)의 화합물은 산화에 의해 화학식 (IV) 또는 (IV*)의 화합물로부터 수득될 수 있다.
단계 (i)
단계 (i)은, 예컨대 삼할로겐화인 (X), 바람직하게는 PCl3를 알콜 (XI)과, 예컨대 디에킬 에테르 또는 테트라히드로푸란과 같은 적합한 용매 중에서 -10℃ 미만의 저온에서 반응시킨 후, 반응 혼합물을 가온시켜 수행될 수 있으며; 예컨대, 온도 범위는 -50℃ 내지 +50℃일 수 있고; 더 구체적으로, 반응은 약 -40℃ 또는 -30℃에서 수행된 후, 실온으로 가온될 수 있다. 바람직하게는, 삼할로겐화인의 알콜과의 반응은, 예컨대 트리에틸아민과 같은 아민 염기와 같은 약한 염기의 존재 하에서 수행된다. 알콜 대 삼할로겐화인의 몰비는 5:1 내지 1:5의 범위, 바람직하게는 2:1 내지 1:2의 범위이어야 하며, 더 바람직하게는 몰비는 1:1이다. 약한 염기, 예컨대 트리에틸아민과 같은 아민 염기가 사용되는 경우, 염기 대 삼할로겐화인의 몰비는 5:1 내지 1:5의 범위, 예컨대 2:1 내지 1:2의 범위, 바람직하게는 약 1:1이어야 한다. 물론, 반응 시간은 반응 부피 및 물질의 양에 의존한다. 가이드라인으로서, 가온 전 저온에서의 반응 시간은, 예컨대 약 10분과 같이 2분 내지 2시간일 수 있고, 가온 후 반응 시간은, 예컨대 약 1시간과 같이 15분 내지 6시간일 수 있다. 바람직하게는, 반응은 불활성 기체, 예컨대 아르곤 하에서 수행된다. 이 상황에서 "불활성"은 주어진 반응 조건 하에서 출발 물질 또는 반응 생성물 중 임의의 것과 반응하지 않을 기체를 지칭한다. 단계 (i)의 반응 후 수득된 혼합물은 바람직하게는 생성물을 단리하지 않고 단계 (ii)에 사용된다. 임의적으로, 단계 (i) 후 및 단계 (ii) 전에 혼합물은, 예컨대 셀라이트 여과에 의해 정제될 수 있다.
단계 (ii)
단계 (ii)는, 예컨대 단계 (i)에서 수득된 생성물을 아민 (XII), 바람직하게는 디이소프로필아민과, 예컨대 디에킬 에테르 또는 테트라히드로푸란과 같은 적합한 용매 중에서 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 이에 대해, 용매는 단계 (i)에서와 동일할 수 있다. 단계 (ii)의 반응은 -10℃ 미만의 저온에서 수행된 후, 반응물을 가온시킬 수 있으며; 예컨대, 온도 범위는 -50℃ 내지 +50℃일 수 있고; 더 구체적으로, 반응은 약 -40℃ 또는 -30℃에서 수행된 후, 실온으로 가온될 수 있다. 아민 (XII)의 몰비는 단계 (i)에서 사용된 삼할로겐화인 (X)의 몰량을 기준으로 할 수 있다. 따라서, 아민 (XII) 대 삼할로겐화인 (X)의 몰비는 5:1 내지 1:5의 범위이어야 하고, 바람직하게는 아민 (XII) 대 삼할로겐화인 (X)의 몰비는 약 2:1이어야 한다. 가이드라인으로서, 가온 전 저온에서의 반응 시간은, 예컨대 약 10분과 같이 2분 내지 2시간일 수 있고, 가온 후 반응 시간은, 예컨대 약 1시간과 같이 15분 내지 6시간일 수 있다. 바람직하게는, 반응은 불활성 기체, 예컨대 아르곤 하에서 수행된다. 단계 (ii)의 반응 후 수득된 혼합물은 바람직하게는 생성물을 단리하지 않고 단계 (iii)에 사용된다. 임의적으로, 단계 (ii) 후 및 단계 (iii) 전에 혼합물은, 예컨대 셀라이트 여과에 의해 정제될 수 있다. 단계 (ii)에서, 일반 구조
Figure pct00470
를 갖는 생성물이 수득될 수 있으며, 여기서 Hal은 단계 1에 사용된 삼할로겐화인에 따라 할라이드, 예컨대 Cl, Br 또는 I이고, 예컨대 PCl3가 사용되는 경우 Hal은 Cl이고, R1 및 R2는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다.
단계 (iii)
단계 (iii)은, 예컨대 단계 (ii)에서 수득된 생성물을 알케닐 마그네슘 할라이드 또는 알키닐 마그네슘 할라이드 (XIII), 또는 알케닐 마그네슘 할라이드 (XIII*)와, 예컨대 디에킬 에테르 또는 테트라히드로푸란과 같은 적합한 용매 중에서 반응시켜 수행될 수 있다. 이에 대해, 용매는 단계 (ii)와 동일할 수 있다. 단계 (ii)의 반응은 -50℃ 미만의 저온에서 수행된 후, 반응물을 가온시킬 수 있으며; 예컨대, 온도 범위는 -100℃ 내지 +50℃일 수 있고; 더 구체적으로 반응은 약 -78℃에서 수행된 후, 실온으로 가온될 수 있다. 알케닐 마그네슘 할라이드 또는 알키닐 마그네슘 할라이드 (XIII), 또는 알케닐 마그네슘 할라이드 (XIII*)의 몰비는 단계 (i)에 사용된 삼할로겐화인 (X)의 몰량을 기준으로 할 수 있다. 따라서, 알케닐 마그네슘 할라이드 또는 알키닐 마그네슘 할라이드 (XIII), 또는 알케닐 마그네슘 할라이드 (XIII*) 대 삼할로겐화인 (X)의 비는 5:1 내지 1:5의 범위, 바람직하게는 2:1 내지 1:2의 범위이어야 하고, 더 바람직하게는 알케닐 마그네슘 할라이드 또는 알키닐 마그네슘 할라이드 (XIII) 대 삼할로겐화인 (X)의 몰비는 약 1:1이어야 한다. 가이드라인으로서, 가온 전 저온에서의 반응 시간은, 예컨대 약 10분과 같이 2분 내지 1시간일 수 있고, 가온 후 반응 시간은, 예컨대 약 1시간과 같이 15분 내지 6시간일 수 있다. 바람직하게는, 반응은 불활성 기체, 예컨대 아르곤 하에서 수행될 수 있다. 단계 (iii)의 반응에 의해 수득된 혼합물은 후처리될 수 있고, 생성물은 당업자에게 일반적으로 공지된 방법, 예컨대 실리카겔 크로마토그래피 또는 진공 증류에 의해 단리될 수 있다. 단계 (iii)에서, 알케닐 마그네슘 할라이드 또는 알키닐 마그네슘 할라이드 (XIII)가 사용되는 경우, 일반 구조
Figure pct00471
를 갖는 생성물이 수득될 수 있거나, 알케닐 마그네슘 할라이드 (XIII*)가 사용되는 경우, 일반 구조
Figure pct00472
를 갖는 생성물이 수득될 수 있으며, 여기서, 이들 구조 중 어느 하나에서
Figure pct00473
, R1, R2, X 및 V는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다.
단계 (iv)
단계 (iv)는, 예컨대 단계 (iii)에서 수득된 생성물을 ● 잔기를 포함하는 알콜 또는 티올 (XIV)과, 예컨대 아세토니트릴과 같은 적합한 용매 중에서 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 단계 (ii)의 반응은 -20℃ 미만의 저온에서 수행된 후, 반응물을 가온시킬 수 있으며, 예컨대온도 범위는 -50℃ 내지 +50℃일 수 있고; 더 바람직하게는, 반응은 약 -40℃에서 수행된 후, 실온으로 가온될 수 있다. 바람직하게는, 단계 (iii)에서 수득된 생성물의 알콜 또는 티올 (XIV)과의 반응은 테트라졸의 존재 하에서 수행된다. 테트라졸은 비치환된 테트라졸 또는 치환된 테트라졸일 수 있다. 알콜 또는 티올 (XIV) 대 단계 (iii)에서 수득된 생성물의 몰비는 5:1 내지 1:5의 범위, 바람직하게는 2:1 내지 1:2의 범위이어야 하며, 더 바람직하게는 몰비는 약 1:1이다. 테트라졸이 사용되는 경우, 테트라졸 대 단계 (iii)에서 수득된 생성물의 몰비는 5:1 내지 1:5의 범위일 수 있고, 바람직하게는 테트라졸 대 단계 (iii)에서 수득된 생성물의 몰비는 약 2:1이어야 한다. 가이드라인으로서, 가온 전 저온에서의 반응 시간은, 예컨대 약 10분과 같이 2분 내지 2시간일 수 있고, 가온 후 반응 시간은, 예컨대 약 30분 또는 약 1시간과 같이 15분 내지 6시간일 수 있다. 반응은 불활성 기체, 예컨대 아르곤 하에서 수행될 수 있다.
화학식 (I) 또는 (I*)의 화합물의 합성을 위한 산화
단계 (iv)는 화학식 (IV) 또는 (IV*)의 화합물을 생성한다. 이어서, 화학식 (I) 또는 (I*)의 화합물은 화학식 (IV) 또는 (IV*)의 화합물을 인에서 산화시킴으로써 수득된다. 단계 (iv)의 반응 후 수득된 혼합물은 추가의 후처리 또는 정제 없이 이러한 산화에 사용될 수 있으며, 즉 산화제는 단계 (iv)의 반응 후 수득된 혼합물에 직접적으로 첨가될 수 있다. 예컨대, tert-부틸 히드로퍼옥사이드 (tBu-OOH), 메타-클로로퍼옥시벤조산 (mCPBA), 과산화수소 (H2O2), 요오드 (I2), 칼륨 퍼옥시모노술페이트, 또는 산소 (O2), 예컨대 공기로부터의 산소와 같은 다양한 적합한 산화제가 사용될 수 있다. 당업자는 적합한 산화제를 쉽게 결정할 것이다. 바람직하게는, tert-부틸 히드로퍼옥사이드 (tBu-OOH)가 산화제로서 사용될 수 있다. 반응은 0 내지 60℃의 온도, 예컨대 실온에서 수행될 수 있다. 산화제의 몰비는 단계 (iii)에서 수득된 생성물의 몰량을 기준으로 할 수 있다. 따라서, 산화제 대 단계 (iii)에서 수득된 생성물의 몰비는 2:1 내지 1:2의 범위이어야 하고, 바람직하게는 산화제 대 단계 (iii)에서 수득된 생성물의 몰비는 1:1이어야 한다. 가이드라인으로서, 산화를 위한 반응 시간은, 예컨대 약 10분과 같이 2분 내지 2시간일 수 있다. 반응은 불활성 기체, 예컨대 아르곤 하에서 수행될 수 있다. 산화에 의해 수득된 혼합물은 후처리될 수 있고, 수득된 화학식 (V) 또는 (V*)의 화합물은 당업자에게 일반적으로 공지된 방법, 예컨대 실리카겔 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.
친전자성 디술파이드로부터 출발하는 화학식 (I) 또는 (I*)의 화합물의 합성
하기 섹션은 친전자성 디술파이드로부터 출발하여 Y가 S (황)인 화학식 (I) 및 (I*)의 화합물의 합성의 몇몇 일반적인 특질을 제공한다. 일반적으로, 당업자는 이러한 합성을 수행하기에 적합한 반응 조건을 선택하는 것을 알고 있다. 추가의 세부 사항은 하기 실시예 섹션에서 제공된다.
본원에서 상기 및 하기에 나타낸 바와 같이, Y가 S인 화학식 (I) 또는 (I*)의 화합물은 친전자성 디술파이드 (XXX)를 ● 잔기를 포함하는 티올 (XXXI)과 반응시켜 화학식 (VIa)의 화합물을 생성함으로써 제조될 수 있다. 화학식 (VIb)의 화합물은 문헌 공지된 절차에 따라 제조될 수 있다. 이어서, 화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물은 R1 잔기를 포함하는 화학식 (V) 또는 (V*)의 인 (III) 화합물과 반응되어 화학식 (I) 또는 (I*)의 화합물을 생성한다. 화학식 (V)의 화합물은 화학식 (XX)의 할로게노포스파이트를 화학식 (XXI)의 그리냐드 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있고, 화학식 (V*)의 화합물은 화학식 (XX)의 할로게노포스파이트를 화학식 (XXI*)의 그리냐드 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
화학식 (V) 또는 (V*)의 화합물의 합성
화학식 (V) 또는 화학식 (V*)의 화합물은, 예컨대 화학식 (XXI)의 알케닐 마그네슘 할라이드 또는 알키닐 마그네슘 할라이드 - 바람직하게는 화학식 (XXI)의 알케닐 마그네슘 할라이드 - 또는 화학식 (XXI*)의 알케닐 마그네슘 할라이드를 R1 잔기를 포함하는 화학식 (XX)의 할로게노포파이트와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 바람직하게는, 화학식 (XXI)의 알케닐 마그네슘 할라이드 또는 알키닐 마그네슘 할라이드, 또는 화학식 (XXI*)의 알케닐 마그네슘 할라이드는 알케닐 마그네슘 브로마이드 또는 알키닐 마그네슘 브로마이드이다. 바람직하게는, 화학식 (XX)의 할로게노포파이트는 클로로포스파이트이다. 적합한 용매로서, 예컨대 디에킬 에테르 또는 테트라히드로푸란이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 반응은 -20℃ 미만의 온도, 예컨대 -100℃ 내지 -40℃, 바람직하게는 -90℃ 내지 -50℃ (예컨대, 대략 -78℃)에서 수행된다. 바람직하게는, 반응은 불활성 기체, 예컨대 아르곤 하에서 수행된다. 가이드라인으로서, 반응 시간은, 예컨대 2시간과 같이 2분 내지 4시간의 범위이어야 한다. 화학식 (XXI)의 알케닐 마그네슘 할라이드 또는 알키닐 마그네슘 할라이드, 또는 화학식 (XXI*)의 알케닐 마그네슘 할라이드 대 화학식 (XXI)의 할로게노포스파이트의 비는 5:1 내지 1:5, 예컨대 2:1 내지 1:2의 범위, 예컨대 약 1:1.2의 화학식 (XXI)의 알케닐 마그네슘 할라이드 또는 알키닐 마그네슘 할라이드, 또는 화학식 (XXI*)의 알케닐 마그네슘 할라이드 대 화학식 (XXI)의 할로게노포스파이트의 비율과 같은 대략 1:1이어야 한다. 보다 자세하 사항은, 예컨대 문헌 (M. R. J. Vall-e, Angewandte Chemie Int. Ed., 2013, 52 (36), 9504)에 제공된다.
화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물의 합성
화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물은 화학식 (XXX)의 친전자성 디술파이드를 ● 잔기를 포함하는 티올 (XXXI)과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 반응은, 예컨대 테트라히드로푸란 또는 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)와 같은 적합한 용매 중에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 화학식 (XXX)의 친전자성 디술파이드와 티올 (XXXI)의 반응은, 예컨대 트리에틸아민과 같은 아민 염기와 같은 약한 염기의 존재 하에서 수행된다. 반응은, 예컨대 실온과 같은 0℃ 내지 60℃의 온도에서 수행될 수 있다. 화학식 (XXX)의 친전자성 디술파이드 및 티올 (XXXI)의 몰비는 5:1 내지 1:5의 범위, 바람직하게는 2:1 내지 1:2의 범위, 더 바람직하게는 1.2:1의 화학식 (XXX)의 친전자성 디술파이드 대 티올 (XXXI)의 비율과 같은 대략 1:1이어야 한다. 트리에틸아민과 같은 아민 염기와 같은 약한 염기가 사용되는 경우, 염기 대 화학식 (XXXI)의 티올의 몰비는 5:1 내지 1:5의 범위일 수 있고, 바람직하게는 염기 대 화학식 (XXXI)의 티올의 몰비는 대략 3:1이다. 반응 시간은, 예컨대 약 1시간, 또는 약 20분 또는 약 10분과 같이 2분 내지 6시간일 수 있다. 반응은, 예컨대 박층 크로마토그래피와 같은 적합한 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다. 반응은 불활성 기체, 예컨대 아르곤 하에서 수행될 수 있다. ● 잔기를 포함하는 화학식 (VIa)의 화합물은 당업자에게 일반적으로 공지된 방법, 예컨대 실리카겔 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 화학식(VIb)의 화합물은 문헌 공지된 절차, 예컨대 티올
Figure pct00474
을 술푸릴 클로라이드 (예컨대, 문헌 (Allared, F. et al, Synthetic Metals, 120(1-3), 1061-1062; 2001) 참조) 또는 티오닐 클로라이드 (예컨대, 문헌 (Masaki, Yukio et al, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 33(5), 1930-40; 1985) 참조)과 반응시키거나, 티올
Figure pct00475
을 N-클로로숙신이미드 (NCS) (예컨대, 문헌 (Kawamura, Takamasa et al. European Journal of Organic Chemistry, 2015(4), 719-722; 2015) 참조) 또는 염소 (예컨대, 문헌 (E. Schneider, Chemische Berichte　84, 911-916 (1951) 참조)와 반응시킴으로써 제조될 수 있으며, 여기서 ●는 본원에서 상기 및 하기에서 정의된 바와 같다.
화학식 (I) 또는 (I*)의 화합물의 합성
Y가 S인 화학식 (I) 또는 (I*)의 화합물은 화학식 (V) 또는 (V*)의 화합물을 화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 바람직하게는, 화학식 (V) 또는 (V*)의 화합물은 알켄 포스포나이트이고, 즉 화학식 (V) 또는 (V*)의 화합물에서
Figure pct00476
는 이중 결합이다. 반응은, 예컨대 테트라히드로푸란 또는 N,N-디메틸포름아미드 (DMF), 또는 예컨대 테트라히드로푸란과 톨루엔의 혼합물과 같은 용매 혼합물과 같은 적합한 유기 용매 중에서 수행된다. 반응은 0℃ 내지 60℃의 온도, 예컨대 실온에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 반응은 불활성 기체, 예컨대 아르곤 하에서 수행될 수 있다. 화학식 (V) 또는 (V*)의 화합물 대 화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물의 몰비는 5:1 내지 1:5의 범위, 바람직하게는 2:1 내지 1:1의 범위, 더 바람직하게는, 예컨대 약 1.2:1의 화학식 (V) 또는 (V*)의 화합물 대 화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물의 몰비와 같이 대략 1:1이어야 한다. 가이드라인으로서, 반응 시간은, 예컨대 약 2시간, 약 1시간, 약 30분 또는 약 10분과 같이 2분 내지 6시간일 수 있다. 화학식 (I) 또는 (I*)의 화합물은 당업자에게 일반적으로 공지된 방법, 예컨대 실리카겔 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.
화합물 (I) 또는 (I*)의 화학식 (II)의 화합물로의 히드로티올화
화학식 (I) 또는 (I*)의 포스포노티올레이트 또는 포스포네이트는 화학식 (II)의 티올로 적합한 용매 중에서 히드로티올화 반응될 수 있다. 용매 시스템은 광범위한 용매로부터 선택될 수 있다. 용매는 극성의 비양성자성 용매 시스템, 예컨대 테트라히드로푸란 (THF), 디메틸포름아미드 (DMF), 아세토니트릴 (MeCN), 아세톤, 디메틸 술폭사이드 (DMSO), 에틸 아세테이트 (EtOAc), N-에틸피롤리돈 또는 그의 혼합물, 바람직하게는 THF, DMF, DMSO; 비극성 용매, 예컨대 헥산, 톨루엔, 벤젠, 1,4-디옥산, 클로로포름, 디에킬 에테르 또는 디클로로메탄 (DCM), 바람직하게는 DCM; 극성의 양성자성 용매, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 메탄올, n-부탄올, 바람직하게는 에탄올; 또는 그의 혼합물일 수 있다. 예컨대, 히드로티올화는 DMF 또는 DMF/물 혼합물 중에서 수행될 수 있다. 특히, 히드로티올화는, 예컨대 단백질, 항체, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 생체분자가 반응되는 경우, DMF 또는 DMF/물 혼합물 중에서 수행될 수 있다. 용매는 또한, 예컨대 물 또는, 예컨대 포스페이트-완충 염수 (PBS)와 같은 수성 버퍼, 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스), 비카르보네이트, EDTA/NH4HCO3 버퍼, 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중의 EDTA/NH4HCO3, 또는 보레이트-함유 포스페이트-완충 염수와 같은 수성 매질일 수 있다. 버퍼에서 반응을 수행하는 것은, 예컨대 단백질, 항체, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 생체분자가 히드로티올화 반응에 사용되는 경우 바람직하다. 히드로티올화는 또한 상술된 수성 버퍼 및 DMF 중 어느 하나의 혼합물 중에서 수행될 수 있다. 적합한 용매 및 버퍼는 당업자에 의해 쉽게 선택될 것이다.
바람직하게는, 포스포노티올레이트 또는 포스포네이트의 히드로티올화 반응은 염기성 조건, 특히 약염기성 조건 하에, 예컨대 pH 8 또는 8.5와 같은 pH 7.2 내지 9의 pH에서 수행된다. 이러한 염기성 조건은, 예컨대 상술된 버퍼 중 어느 하나를 사용하는 것과 같은 적합한 버퍼 시스템을 사용하여 확립될 수 있다. 또한 또는 대안적으로, 히드로티올화 반응을 위한 염기성 조건은 약한 염기를 사용하여 확립될 수 있다. 적합한 염기는, 예컨대 카보네이트, 예컨대 (NH4)2CO3, Na2CO3, Rb2CO3, K2CO3 또는 Cs2CO3 또는 그의 상관된 히드로카르보네이트 (예컨대, NaHCO3 등); 및 약한 질소-함유 염기, 예컨대 트리메틸아민 Et3N (pKa 10,76, 25℃에서)이다. 바람직하게는, pKa 7,5 내지 11,5 범위 내의 pKa 값을 갖는 염기가 사용된다. 적합한 염기는 당업자에 의해 쉽게 선택될 것이다.
히드로티올화의 반응 온도는 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 히드로티올화는 0℃ 내지 60℃, 0℃ 내지 50℃, 0℃ 내지 40℃, 0℃ 내지 30℃의 범위의 온도에서, 예컨대 실온, 즉 대략 25℃에서, 예컨대 대략 5℃에서, 또는 예컨대 생리적으로 관련된 조건에서, 대략 37℃에서 수행될 수 있다. 반응 시간은 온도, 반응 부피 및 물질의 양에 의존한다. 가이드라인으로서, 반응은, 예컨대 1분 내지 24시간의 시간 프레임, 예컨대 1분 내지 20시간, 1분 내지 10시간, 1분 내지 3시간의 시간 프레임, 또는 1분 내지 1시간의 시간 프레임 내에서 수행될 수 있었다. 적합한 반응 온도 및 반응 시간은 당업자에 의해 쉽게 결정될 것이다.
히드로티올화 반응에 대한 추가의 세부 사항은 본원에서 하기 실시예 섹션에서 제공된다.
실시예
실시예 1: 알켄-포스포노티올레이트의 합성
본 발명자들은 알켄-포스포노티올레이트에 접근하기 위해 2개의 상이한 합성 경로를 개발하였다: 친전자성 디술파이드로부터의 1-단계 반응 또는 대안적으로 삼할로겐화인, 예컨대 삼염화인 (PCl3)으로부터 출발. 두 경로 뿐만 아니라 단리된 화합물이 본원에 기재되고 (합성 세부 사항 및 특징규명에 대해 본원에서 하기의 실시예 10를 참조) 도식 2에 도시된다. 단순 실례로서, R1이 메틸 또는 에틸, (O-에틸 및 O-메틸 유도체 (R1= 메틸, 에틸); 도식 2 참조)인 유도체의 합성이 입증된다. 그러나, 두 합성 경로는 이 범위에 제한되지 않는다. 실시예 섹션에서 사용되는 바와 같이, "R2" 또는 일부 예에서 단순히 "R", 즉 S에 결합된 잔기는 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 ●에 상응한다.
Figure pct00477
도식 2: 알켄-포스포노티올레이트의 합성
친전자성 디술파이드 경로
알켄-포스포노티올레이트는 친전자성 디술파이드 및 알켄포스포나이트로부터 1-단계 반응으로 수득될 수 있다. 어떠한 이론에도 구애됨이 없이, 포스포나이트의 인 원자의 자유 고립 쌍은 디술파이드의 친전자성 황을 공격하여 매우 반응적인 중간체를 생성하고, 이는 빠르게 포스포노티올레이트로 산화되는 것으로 추정된다.
디에틸 알켄포스포나이트는 공개된 프로토콜 (M. R. J. Vall
Figure pct00478
e, Angewandte Chemie Int. Ed., 2013, 52 (36), 9504)에 따라 합성되고, 상이한 지방족 친전자성 디술파이드와 반응되었다 (도식 3 참조). 친전자성 디술파이드는 각각의 티올의 2,2'-디티올비스(5-니트로피리딘) (PNP)과의 반응으로부터 수득되었다. O-에틸 알켄-포스포노티올레이트는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 단리되었다. 수율은 표 1에 제공된다.
Figure pct00479
도식 3: 디에틸 알켄포스포나이트의 친전자성 디술파이드와의 반응으로부터 O-에틸 알켄-포스포노티올레이트의 합성
Figure pct00480
표 1: 디술파이드 경로를 통해 합성된 O-에틸 알켄-포스포노티올레이트 및 단리 수율
PCl3 경로
대안적으로, PCl3는 여러 치환 반응으로 알켄-포스포노티올레이트로 전환된 후, 산화제, 예컨대 tBuOOH로 산화될 수 있다 (도식 4).
Figure pct00481
도식 4: PCl3로부터 알켄-포스포노티올레이트의 합성
이 경로를 이용하여, 벤질 및 Boc-보호된 아민 유도체가 생성되었으며, 실리카겔 크로마토그래피에 의해 단리되었다 (구조 및 수율에 대해 표 2 참조).
Figure pct00482
표 2: PCl3 경로를 통해 합성된 O-에틸 알켄-포스포노티올레이트 및 단리 수율
실시예 2: 알킨-포스포노티올레이트의 합성
알킨-포스포노티올레이트는 알켄-포스포노티올레이트와 유사하게 PCl3으로부터 출발하여 수득될 수 있다 (상기 실시예 1 및 하기 도식 5 참조).
Figure pct00483
도식 5: PCl3 경로를 통한 알킨-포스포노티올레이트의 합성
PCl3 경로를 이용하여, 본 발명자들은 실리카겔 크로마토그래피에 의해 목적하는 생성물을 단리할 수 있었다 (구조 및 수율에 대해 도식 6 및 표 3 참조).
Figure pct00484
도식 6: 알킨-포스포노티올레이트의 합성
Figure pct00485
표 3: 합성된 O-메틸 알킨-PT 및 단리 수율. *(N,N-디이소프로필메틸 포스폰아미드 클로라이드로부터 출발)
실시예 3: 일반적 포스포노티올레이트 빌딩 블록의 추가 기능화
일반적 카르복실산 또는 아민 포스포노티올레이트 유도체는 기능적 빌딩 블록으로, 예컨대 형광단 EDANS로 또는 비오틴으로, 예컨대 아미드 커플링에 의해 추가로 변형될 수 있다. 2개의 실례가 도식 7에 나타나 있다 (더 많은 화합물 및 또한 알킨 유도체에 대해, 본원에서 하기 실시예 14 참조).
Figure pct00486
도식 7: 일반적 포스포노티올레이트 빌딩 블록의 기능화에 대한 예. A) 카르복실산 유도체는 NHS 에스테르로 활성화되고, 아민, 예컨대 형광단 EDANS과 추가로 반응될 수 있다. B) 대안적으로, 리엑티베이트 (reactivate)는 아민 PT를 카르복실산, 예컨대 비오틴에 커플링함으로써 교환될 수 있다.
실시예 4A: 포스포노티올레이트에 글루타티온의 티올 첨가
불포화된 포스포노티올레이트가 티올과 반응한다는 것을 입증하는 원리의 증거로서, 본 발명자들은 모델 티올 글루타티온과의 접합을 염기성 수성 버퍼 중에서 수행하여 수용성 포스포노티올레이트-접합체를 수득하였다. 반응을 UV LC-MS 및 31P-NMR로 모니터링하였다 (알켄-포스포노티올레이트에 대해 도 1 참조).
도 1: a) 글루타티온-알켄-포스포노티올레이트-접합체 14의 합성. 반응은 b) UV LC-MS 및 c) 31P-NMR로 모니터링되었으며, 단독 생성물의 형성을 나타낸다. P: 생성물 14, SM: 출발 물질 = 알켄-포스포노티올레이트 2, PMe4Br = 테트라메틸포스포늄 브로마이드, 31P-NMR에 대한 내부 표준.
반응은 31P-NMR 및 UPLC-MS로 모니터링되었으며, 단독 생성물 (P)의 형성과 함께 클린 (clean) 반응을 나타낸다.
상기와 마찬가지로, 본 발명자들은 알킨 유도체, 즉 하기 실시예 11로부터의 S-벤질 O-메틸 알킨-PT 7에 대해 글루타티온과의 접합을 수행하였다 (표 3, 엔트리 1) (도 2a 참조). 반응은 알켄-포스포노티올레이트를 사용하는 것보다 상당히 빠르다 (또한 반응속도 연구 비교, 본원에서 하기 실시예 5 참조). 지시된 조건 하에서, 본 발명자들은 약 1분 후 알킨-포스포노티올레이트의 완전 전환을 관찰하였다. 2개의 이중 결합 이성체가 약 3:1의 비율로 형성된다.
도 2: a) 글루타티온-알킨-PT-접합체 15의 합성. 반응은 b) UV LC-MS로 모니터링되었으며, 2개의 이중 이성체가 약 3:1의 비율로 형성됨을 나타낸다. 이노신은 내부 표준으로 사용되었다.
실시예 4B: 알켄 포스포네이트에 글루타티온의 티올 첨가
본 발명자들은 티올 첨가에 의해 디에틸 알켄포스포네이트의 글루타티온과의 접합을 수행하여 수용성 접합체를 수득하였다 (도식 1 참조).
Figure pct00487
도식 1: 글루타티온-포스포네이트 접합체의 합성
반응은 31P-NMR 및 UPLC-MS에 의해 모니터링되었으며, 단독 생성물의 형성과 함께 클린 반응을 나타낸다. 접합체는 반분취용 HPLC (산성 조건)로 60% 수율로 단리될 수 있었다.
실시예 5: 포스포노티올레이트 및 포스포네이트에 대한 티올 첨가의 반응속도 연구
다음 단계에서, 본 발명자들은 반응속도 데이터를 얻기 위해 불포화된 포포노티올레이트에 대한 티올 첨가의 역학을 조사하기 시작하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 실온 (약 25℃)에서 1 당량의 환원된 글루타티온의 존재 하에 알켄- 및 알킨-포스포노티올레이트 둘 다에 대해 형광 EDANS 유도체와의 첨가 반응을 수행하였다 (도식 8). 본 발명자들은 상응하는 포스포네이트 유도체로도 동일한 연구를 수행하였다. 이들 화합물의 제조에 대해 본원에서 하기 실시예 14를 참조한다.
Figure pct00488
도식 8: 형광 알켄- 및 알킨 포스포노티올레이트 및 포스포네이트에 글루타티온의 접합
출발 물질의 붕괴를 형광 검출기를 사용하여 HPLC에 의해 8 h에 걸쳐 모니터링하였다. 이 연구의 결과는 하기 도 3에 도시된다. 2가지의 경향이 분명해진다: 첫째, 알킨 유도체는 알켄 유도체보다 티올 첨가에서 훨씬 더 빠르게 반응한다. 두 번째로, 포스포노티올레이트는 포스포네이트보다 빠르게 반응한다. 이는 사용자가 더 낮은 농도에서 반응을 수행하고 더 짧은 시간에 더 높은 전환을 얻어 결국 반응 수율도 증가시킬 수 있게 할 것이므로 포스포노티올레이트의 중요한 이점이다. 이는 높은 약물 대 항체 비율이 일반적으로 요구되는 항체-약물 접합체의 생성에서 중요하다.
도 3: pH 8.5에서 알켄 및 알킨 포스포노티올레이트 및 포스포네이트에 대한 글루타티온 첨가에 대한 반응속도 연구. 시간에 따른 출발 물질의 붕괴가 표시된다. 내부 표준과 비교하여 남아 있는 출발 물질의 형광 강도는 형광 검출기를 갖는 HPLC를 사용하여 측정되었다. 각각의 반응은 삼중으로 수행되었다. 표준편차를 갖는 평균값이 표시된다. 1.0의 출발 물질 면적은 100% 출발 물질을 지칭한다.
실시예 6: 포스포노티올레이트 접합체의 안정성 연구
불포화된 포스포노티올레이트를 생체접합 핸들로 사용하는 경우 중요한 고려 사항은 생성된 티올-첨가 생성물이 생리적으로 관련된 조건 하에서 안정한 것인지의 여부이다. 이 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 Dabcyl-EDANS ??처 쌍을 사용하고, 각각의 알켄- 및 알킨-포스포노티올레이트 접합체 뿐만 아니라 각각의 알켄- 및 알킨 포스포네이트 접합체를 합성하였다 (도 4). 이들 화합물은 복합 기질, 세포 용해물 또는 혈청에서 접합체의 안정성을 모니터링할 수 있게 한다.
접합체가 온전한 경우, Dabcyl 및 EDANS는 가까이에 있고, EDANS의 형광은 ??칭된다. 접합체의 절단 시, EDANS는 방출되고, 그의 형광이 검출되고 정량화된다.
이들 ??처 쌍 화합물은 P-S 결합의 안정성 뿐만 아니라 티올 접합체의 안정성을 모니터링할 수 있게 한다. 이는 잠재적인 레트로-티올 첨가 또는 다른 티올로의 교환도 검출될 수 있으므로 중요하다.
도 4: 포스포노티올레이트 또는 포스포네이트 접합 화학을 통해 연결된, EDANS-Dabcyl ??처 쌍의 설계. 동그라미 친 모이어티가 절단되면, Dabcyl과의 근접성을 상실하기 때문에 EDANS의 형광은 더 이상 ??칭되지 않을 것이다.
본 발명자들은 하기 조건 하에서 알켄- 및 알킨 포스포노티올레이트 뿐만 아니라 알켄- 및 알킨 포스포네이트의 안정성을 모니터링하였다: PBS (포스페이트-완충 염수) pH= 7.4, Hela 세포 용해물, 인간 혈청. 온도는 실온 (약 25℃)이었다. 형광은 약 3일에 걸쳐 모니터링되었다. 양성 대조군으로, 비접합된 EDANS 및 유리 Dabcyl-펩티드 (1:1)가 동일한 조건 하에서 측정되었다. 결과가 도 5에 나타나 있다. 우측 컬럼은 좌측 컬럼에서와 동일한 데이터 세트의 줌을 나타낸다. 또한, 대조군으로 포스포노티올레이트 및 포스포네이트를 1 M NaOH로 처리하여 포스포노티올레이트 및 포스포네이트의 빠른 절단을 초래하였다. 이는 pH = 7.4에서 PBS를 사용하는 검정에서 HeLa 세포 용해물 또는 인간 혈청 절단은, 존재하는 경우, 단지 매우 낮은 정도로 발생한다는 것을 확인해 준다.
포스페이트 버퍼 (PBS, pH 7.4)에서 모든 유도체는 우수한 안정성을 나타낸다. Hela 세포의 용해물 및 혈청에서도 그들은 우수한 안정성을 나타내므로, 포스포노티올레이트-기반 생체접합체 및 포스포네이트-기반 생체접합체가 생리적으로 관련된 조건 하에서 안정하다는 것을 나타낸다.
도 5: 지시된 조건 하에서 포스포노티올레이트 접합체 및 포스포네이트 접합체의 안정성. 증가된 형광은 접합체의 절단을 의미한다.
실시예 7: 포스포노티올레이트에 대한 단백질 접합
다음으로, 본 발명자들은 모델 단백질 소 혈청 알부민 (BSA) 및 모노클로날 항체 세툭시맙 둘 다에 알켄- 및 알킨-포스포노티올레이트를 접합하였다.
실시예 7A1: 포스포노티올레이트에 대한 소 혈청 알부민의 접합
모델 단백질로서, 본 발명자들은 소 혈청 알부민 (BSA)을 선택하여 알켄- 및 알킨-포스포노티올레이트에 접합시켰다. 이 실험으로, 알켄- 및 알킨-포스포노티올레이트가 단백질 수준의 시스테인-선택적 변형에 적합한 생체접합 핸들이라는 것이 입증된다. BSA는 PT에 의한 알킬화에 접근 가능한 하나의 환원된 시스테인 잔기 (Cys58)를 갖는다. 다른 시스테인은 디술파이드 브릿지에 존재하기 때문에 이론적으로는 포스포노티올레이트에 대해 반응적이지 않다.
변형을 위해, BSA의 용액은 pH= 7.4 - 8.5에서 과량의 PT와 함께 4℃에서 18 h 동안 반응되었다 (s. 도식 9).
Figure pct00489
도식 9: PT로 BSA의 변형
반응 후, 변형된 단백질의 SDS-PAGE를 수행한 후, 겔 내에서 트립신 분해하고, 이어서 수득된 펩티드를 MS/MS 분석하였다.
MS/MS 분석 결과가 표 4에 요약된다. 두 유도체에 대해 BSA의 우수한 서열 커버리지가 수득되었다. 또한, 변형 정도가 높다 (알켄-포스포노티올레이트에 대해 > 50% 및 알킨-포스포노티올레이트에 대해 >90%). 알켄-포스포놀레이트 유도체의 경우, 또한 다른 아미노산 (His, Ser, Thr, Arg)이 약간 변형되었다. 그러나, 더 적은 당량을 사용하고/하거나 pH를 7.4로 낮추면 이들 아미노산과 덜 반응하였다. 알킨-포스포노티올레이트는 알켄-포스포노티올레이트보다 시스테인과 더 선택적으로 반응하는 것으로 관찰되었다.
조건 결과
pH eq. PT
알켄-포스포노티올레이트 2

8.5 100 eq.		 BSA는 분해를 위해 효소 키모트립신을 사용하여 높은 서열 커버리지로 검출될 수 있었다. 여러 C58-함유 펩티드가 확실하게 검출될 수 있었다: 55LQQCPFDEHVKL66, 55LQQCPFDEHVKLVNELTEF73, 56QQCPFDEHVKL66 및 56QQCPFDEHVKLVNELTEF73는 포스포노티올레이트 변형과 함께 및 없이 확실하게 확인될 수 있었다 (스코어 > 20). 변형 정도는 높다 (> 50%).

또한, 포스포노티올레이트에 의해 변형된 다른 펩티드도 검출될 수 있었다. 따라서, 변형은 시스테인에서만 유일하게 발견되는 것이 아니라 히스티딘 및 다른 아미노산에서도 발견되었다. 그러나, 추정된 변형 정도는 이들 펩티드에 대해 상당히 낮다: (H42 약 5-10%, H91/S89/T92 약 10-20%, H169/ R168 1% 미만, H361/R360 약 5-10%, 모든 값은 신호 강도 비율로부터 추정된다).

8.5 & 50 eq.

또는

7.4 & 100 eq.		 BSA는 분해를 위해 키모트립신을 사용하여 높은 서열 커버리지로 검출될 수 있었다. 여러 C-58-함유 펩티드를 확실하게 검출할 수 있었다 (스코어 > 20). 변형 정도는 높다 (> 50%).

또한, 포스포노티올레이트에 의해 변형된 다른 펩티드도 검출될 수 있었다. 따라서, 변형은 시스테인에서만 유일하게 발견되는 것이 아니라 히스티딘 및 다른 아미노산에서도 발견되었다. 그러나, 추정된 변형 정도는 이들 펩티드에 대해 상당히 낮다: (H42 약 2-5%, H91 약 5-10%, H169/ Y171/R168 약 1-5%, H361/R360 약 1-5%, 모든 값은 신호 강도 비율로부터 추정된다).

프로브 pH 8.5 / 50 eq. 및 pH 7.4 / 100 eq.는 변형 정도에서 유의한 차이를 나타내지 않았다.
알킨-포스포노티올레이트 7
pH= 7.4/8.0/8.5 & 100 eq. 모든 pH 값에서, BSA이 단일한 유리 시스테인 (C58)이 명확히 검출되었으며, 알킨-포스포노티올레이트에 의해 약 90% 변형되는 것으로 밝혀졌다. 다른 아미노산에서의 변형은 < 10%으로 추정되었지만, 더 종종 < 1%였다.
표 4: 포스포노티올레이트-변형된 BSA 단백질의 MS/MS 분석.
결론적으로, 결과는 시스테인 선택성을 나타내며, 즉 원하는 대로, BSA의 시스테인이 알켄 또는 알킨 포스포노티올레이트로 선택적으로 변형되었다.
실시예 7A2: 포스포네이트에 대한 소 혈청 알부민의 접합
본 발명자들은 추가로 디에틸 알켄포스포네이트가 접합체의 MS/MS 분석으로 나타나는 바와 같이 시스테인-선택적 방식으로 모델 단백질 소 혈청 알부민 (BSA) (도식 10)에 접합될 수 있다는 것을 입증할 수 있었다 (s. 표 5). BSA는 알킬화에 접근 가능한 하나의 환원된 시스테인 잔기 (Cys58)를 갖는다.
Figure pct00490
도식 10: 디에틸 알켄포스포네이트로 BSA의 변형
조건 결과
pH Eq. 포스포네이트

8.5 100 eq.		 BSA는 분해를 위해 효소 키모트립신을 사용하여 높은 서열 커버리지로 검출될 수 있었다. 여러 C58-함유 펩티드가 확실하게 검출될 수 있었다: 55LQQCPFDEHVKL66, 55LQQCPFDEHVKLVNELTEF73 , 및 56QQCPFDEHVKL66는 포스포네이트 변형과 함께 및 없이 확실하게 확인될 수 있었다 (스코어 > 20). 변형 정도는 높다 (> 50%).

또한, 포스포네이트에 의해 변형된 다른 펩티드도 검출될 수 있었다. 따라서, 변형은 시스테인에서만 유일하게 발견되는 것이 아니라 히스티딘, 리신 및 트레오닌에서도 발견되었다. 그러나, 추정된 변형 정도는 이들 펩티드에 대해 상당히 낮다: (K44 및 H361 1% 미만, T255/K256 및 K297/299 및/또는 C301/302 1-3%, 모든 값은 신호 강도 비율로부터 추정된다).
표 5: 포스포네이트-변형된 BSA 단밸질의 MS/MS 분석 결과.
결론적으로, 또한 이들 결과는 시스테인 선택성을 나타내며, 즉 원하는 대로, BSA의 시스테인이 알켄 또는 알킨 포스포네이트로 선택적으로 변형되었다
실시예 7B: 포스포노티올레이트에 대한 항체 접합
마지막으로, 본 발명자들은 IgG-항체의 접합을 위해 이 새로운 시스테인-선택적 반응 순서를 적용하였다 (도식 11). 변형 전략은 이전에 말레이미드 접합에 적용된 2-단계 환원-알킬화 접근법에 의존한다 (S. O. Doronina, B. E. Toki, M. Y. Torgov, B. A. Mendelsohn, C. G. Cerveny, D. F. Chace, R. L. DeBlanc, R. P. Gearing, T. D. Bovee, C. B. Siegall, J. A. Francisco, A. F. Wahl, D. L. Meyer, P. D. Senter,　Nat Biotech　 2003,　21, 778-784.). 제1 단계에서 항체를 함께 묶는 쇄간 디술파이드 브릿지는 디티오트레이톨 (DTT)로의 처리 시 환원된다. 이어서, 유리 티올은 티올 첨가 반응에서 포스포노티올레이트와 반응할 수 있다. 제1 실험은 인간 표피 성장 인자에 대한 모노클로날 IgG1 항체인 세툭시맙으로 수행되었다.
Figure pct00491
도식 11: 비오틴 변형된 알켄-포스포노티올레이트 4로 시스테인 선택적 항체 변형을 위한 2-단계 환원 및 알킬화 접근법
원리의 입증으로서, 항체를 비오틴 알켄- 유도체 4로 변형시키고, SDS-PAGE로 분석한 후, 항-비오틴 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
항-비오틴 웨스턴 블롯 분석의 결과가 도 6에 나타나 있다. pH=7.4 (레인 3) 및 pH=8.5 (레인 5)에서 항체 단편 (중쇄 및 경쇄)의 비오틴 포스포노티올레이트 유도체 4로의 변형이 확인될 수 있었다. 수율은 더 높은 pH=8.5에 대해 더 높다 (레인 3 및 5 비교). DTT로의 디술파이드 결합의 사전 환원 없이는 어떠한 변형도 검출될 수 없었음이 주목된다 (레인 4 및 6). 비교를 위해, 항체는 또한 동일한 프로토콜을 이용하여 pH=7.4에서 비오틴-말레이미드로 라벨링되었다. 말레이미드의 경우 변형의 정도는 PT와 비교하여 더 높지만 (레인 1 및 3 비교), 비-환원된 항체에 대한 변형도 검출되므로, 반응은 시스테인에 대해 명백하게 화학선택적이지 않다 (레인 2).
도 6: SDS-겔 환원 후 세툭시맙 접합의 웨스턴 블롯 분석. 상단: 블롯팅 후 막의 Ponceau S 염색은 동일한 양의 블롯팅된 항체를 나타낸다. 하단: 비오틴-변형된 항체 단편의 화학발광 검출 (Strep-HRP). 환원된 항체의 비오틴 화합물과의 반응은 pH=7.4 (레인 1-4) 또는 pH=8.5 (레인 5-6)에서 수행하였다. M = 마커 (단백질 사다리).
추가적으로, 본 발명자들은 또한 pH 8.5에서 세툭시맙의 비오틴-포스포노티올레이트 유도체 28 (알킨) 및 13 (알켄)과의 접합 (도 7a) 및 비교로서 pH 7.4, 8.0 및 8.5에서 세툭시맙의 28과의 접합 (도 7b)을 수행하였다. 알킨-포스포노티올레이트가 알켄-포스포노티올레이트보다 항체를 라벨링하는 데 더 효과적이다 (도 7a). 알켄-포스포노티올레이트 4와 유사하게 (도 6), 알킨-포스포노티올레이트 28의 경우에도, pH가 증가함에 따라 알킨-포스포노티올레이트로 더 많은 항체 라벨링이 수득된다.
도 7: SDS-겔 환원 후 세툭시맙 접합의 웨스턴 블롯 분석. a) 화합물 13 및 28로 pH 8.5에서 변형. b) 화합물 28로 pH 7.4-8.5에서 변형.
결론적으로, 이들 결과는 시스테인 선택성을 나타내며, 즉 원하는 대로, 항체의 시스테인이 알켄 또는 알킨 포스포노티올레이트로 선택적으로 변형되었다.
실시예 8: 친전자성 디술파이드의 합성 절차
일반적 절차 A: 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘)으로부터 혼합된 디술파이드의 합성
Figure pct00492
불꽃-건조된 둥근 바닥 플라스크를 10 ml (c = 0.1 M) THF 중의 1.0 mmol (1.0 eq.) 티올로 충전시켰다. 이어서, 3.0 mmol (3.0 eq.) 트리에틸아민 및 1.2 mmol (1.2 eq.) 디술파이드 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응을 TLC로 모니터링하였다. 완전 전환이 달성되었을 때 (대략 10분), 휘발물을 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 실리카겔 상의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
2-(에틸디술파네일)-5-니트로피리딘
Figure pct00493
2-(에틸디술파네일)-5-니트로피리딘을 에탄티올 (103 μl, 1.34 mmol)로부터 일반적 절차 A에 따라 제조하였다. 미정제 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (헥산/EtOAc = 10:1)로 정제하여 표제 화합물을 황색 오일 (228 mg, 1.05 mmol, 78%)로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ = 9.24 (d, J = 2.6, 1H), 8.39 (dd, J = 8.9, 2.6, 1H), 7.92 (d, J = 8.9, 1H), 2.85 (q, J = 7.3, 2H), 1.34 (t, J = 7.3, 3H) ppm.
13C NMR (75 M, 클로로포름-d) δ= 169.42, 145.15, 141.99, 131.67, 119.18, 33.01, 14.36 ppm.
HRMS (ESI): C7H9N2O2S2 [M+H+]에 대한 계산치: 217.0100; 실측치: 217.0106.
2-(벤질디술파네일)-5-니트로피리딘
Figure pct00494
2-(벤질디술파네일)-5-니트로피리딘을 벤질 메르캅탄 (48 μl, 0.41 mmol)으로부터 일반적 절차 A에 따라 제조하였다. 미정제 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (헥산/EtOAc = 10:1)로 정제하여 표제 화합물을 무색 고체 (91 mg, 0.33 mmol, 80%)로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ = 9.18 (d, J = 2.6 , 1H), 8.15 (dd, J = 8.9, 2.6 , 1H), 7.49 (d, J = 8.9 , 1H), 7.30 - 7.24 (m, 2H), 7.24 - 7.17 (m, 3H), 4.04 (s, 2H) ppm.
13C NMR (75 MHz, 클로로포름-d) δ = 168.90, 144.86, 141.81, 136.10, 131.17, 129.50 (2C), 128.83 (2C), 128.04, 119.03, 77.36, 43.86 ppm.
HRMS (ESI): C12H11N2O2S2 [M+H+]에 대한 계산치: 279.0256; 실측치: 279.0271.
3-((5-니트로피리딘 -2-일)디술파네일)프로판산
Figure pct00495
3-((5-니트로피리딘 -2-일)디술파네일)프로판산을 메르캅토프로피온산 (250 μl, 2.85 mmol)으로부터 일반적 절차 A에 따라 제조하였다. 미정제 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (헥산/EtOAc = 1:1 + 0.1% 포름산)로 정제하여 표제 화합물을 황색 오일 (80 mg, 1.54 mmol, 54%)로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ = 9.26 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 8.40 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.09 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 6.8 Hz, 2H) ppm.
13C NMR (75 MHz, 클로로포름-d) δ = 177.25, 168.05, 145.34, 142.35, 131.91, 119.68, 33.69, 33.33.
HRMS: n.d.
2-(비오티닐디술파네일)-5-니트로피리딘
Figure pct00496
2-(비오티닐디술파네일)-5-니트로피리딘을 비오틴티올 (44 mg, 0.179 mmol)로부터 일반적 절차 A에 따라 제조하였다. 미정제 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH= 20:1 내지 10:1)로 정제하여 표제 화합물을 황색 고체 (53 mg, 0.134 mmol, 75%)로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ = 9.27 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 8.42 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.51 (s, 1H), 4.37 - 4.24 (m, 1H), 3.14 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 2.97 - 2.68 (m, 4H), 1.76 - 1.61 (m, 4H), 1.44 (d, J = 3.5 Hz, 4H) ppm.
HRMS (ESI): C15H21N4O3S3 [M+H+]에 대한 계산치: 401.0770; 실측치: 401.0791.
실시예 9: 인 (III) 전구체의 합성 절차
1-에톡시-1-에티닐-N,N-디이소프로필포스판아민
Figure pct00497
불꽃-건조된 둥근 바닥 슐렌크 플라스크를 아르곤 분위기 하에 삼염화인 (12.5 mmol, 1090 μl) 및 무수 에테르 (50 ml)로 충전시키고, 드라이 아이스 조에서 -30℃로 냉각시켰다. 에탄올 (12.5 mmol, 728 μl) 및 트리에틸아민 (12.5 mmol, 1.733 ml)을 첨가하고, 용액을 r.t.로 가온하기 전에 10분 동안 -30℃에서 교반하고, 또 다른 시간 동안 교반하였다. 생성된 백색 현탁액을 셀라이트를 통해 여과하였다. 여과물을 불꽃-건조된 둥근 바닥 슐렌크 플라스크에 수집하고, 다시 아르곤 분위기 하에서 -30℃로 냉각시켰다. 디이소프로필아민 (25 mmol, 3.528 ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 r.t.로 가온하기 전에 10분 동안 -30℃에서 교반하고, 또 다른 시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 다시 셀라이트를 통해 여과하였다. 투명한 여과물을 아르곤 분위기 하에서 -78℃로 냉각시키고, 에티닐마그네슘 브로마이드 (THF 중 0.5 M, 13.75 mmol, 27.5 ml)의 용액을 첨가하고, -78℃에서 10분 동안 교반한 후, 또 다른 시간 동안 r.t.에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 대략 20 ml로 농축시키고, 포화된 수성 NaHCO3 (60 ml)로 희석시키고, EtOAc (3x 120 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 NaSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 생성된 유성 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 1H 및 31P NMR로 판단된 약 80% 순도로 황색 오일 (1.236 g, 6.14 mmol, 49%)로서 수득하였다. 화합물을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
1H-NMR (300 MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δH = 3.84-3.57 (m, 4H), 3.35 (d, J=1.8 Hz, 1H), 1.20 (m, 15 H) ppm.
13C-NMR (75 MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δC = 91.78 (d, J=7.4 Hz), 85.72 (d, J=17.8 Hz), 61.9 (d, J=16.2 Hz), 47.4, 23.5, 16.5 (d, J=16.5) ppm.
31P-NMR (122 MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δP = 92.25 ppm.
HRMS (ESI): NaC10H20NOP [M+Na+]에 대한 계산치: 224.1180; 실측치: 224.1270.
1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-비닐포스판아민
Figure pct00498
불꽃-건조된 둥근 바닥 슐렌크 플라스크를 아르곤 분위기 하에 삼염화인 (12.5 mmol, 1090 μl) 및 무수 에테르 (50 ml)로 충전시키고, 드라이 아이스 조에서 -30℃로 냉각시켰다. 에탄올 (12.5 mmol, 728 μl) 및 트리에틸아민 (12.5 mmol, 1.733 ml)을 첨가하고, 용액을 r.t.로 가온하기 전에 10분 동안 -30℃에서 교반하고, 또 다른 시간 동안 교반하였다. 생성된 백색 현탁액을 셀라이트를 통해 여과하였다. 여과물을 불꽃-건조된 둥근 바닥 슐렌크 플라스크에 수집하고, 다시 아르곤 분위기 하에서 -30℃로 냉각시켰다. 디이소프로필아민 (25 mmol, 3.528 ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 r.t.로 가온하기 전에 10분 동안 -30℃에서 교반하고, 또 다른 시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 다시 셀라이트를 통해 여과하였다. 투명한 여과물을 아르곤 분위기 하에서 -78℃로 냉각시키고, 비닐마그네슘 브로마이드 (THF 중 1.0 M, 13.75 mmol, 13.75 ml)의 용액을 첨가하고, -78℃에서 10분 동안 교반한 후, 또 다른 시간 동안 r.t.에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 대략 20 ml로 농축시키고, 포화된 수성 NaHCO3 (60 ml)로 희석시키고, EtOAc (3x 120 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 NaSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 생성된 유성 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 1H 및 31P NMR로 판단된 > 95% 순도로 무색 오일 (852 mg, 4.19 mmol, 34%)로서 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δH = 6.36-6.14 (m, 1H), 5.77-5.53 (m, 2H), 3.81-3.61 (m, 2H), 3.47 (dt, J=9.8, 6.7 Hz, 2H), 1.23-1.04 (m, 15 H) ppm.
13C-NMR (75 MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δC = 142.30 (d, J=6.9 Hz), 124.41 (d, J= 19.6 Hz), 62.1 (d, J=20.7 Hz), 45.5 (d, J=9.50 Hz), 23.90 (m), 16.66 (d, J=7.7 Hz) ppm.
31P-NMR (122 MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δP = 113.79 ppm.
HRMS (ESI): C10H23NOP [M+H+]에 대한 계산치: 204.1517; 실측치: 204.1596.
실시예 10: 알켄 포스포노티올레이트의 합성 절차
일반적 절차 B: 디술파이드 경로를 통한 알켄-PT의 합성
Figure pct00499
0.5 mmol (1.0 eq.)의 혼합된 디술파이드를 불꽃-건조된 슐렌크 튜브에 넣고, 아르곤 분위기 하에 무수 THF/톨루엔 (2:1, 5 ml)의 혼합물에 용해시켰다. 교반된 혼합물 용액에 디에틸 알켄포스포나이트 (THF 중 약 0.6 M, 0.6 mmol, 0.6 ml, 1.2 eq.)를 실온에서 적가하고, 10분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실리카겔에 무수-패킹하고, 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
O,S-디에틸 알켄-PT (화합물 1 )
Figure pct00500
O,S-디에틸 알켄-PT를 혼합된 디술파이드 2-(에틸디술파네일)-5-니트로피리딘 (100 mg, 0.462 mmol)로부터 일반적 절차 B에 따라 제조하였다. 미정제 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (헥산/EtOAc = 4:1 내지 1:1 구배)로 정제하여 표제 화합물을 무색 오일 (44 mg, 0.244 mmol, 53%)로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ = 6.40 - 5.98 (m, 3H), 4.30 - 4.06 (m, 2H), 2.89-2.72 (m, 2H), 1.41-1.30 (m, 6H) ppm.
13C NMR (75 MHz, 클로로포름-d) δ = 133.92, 131.82, 129.90, 61.83, 24.98, 16.51 ppm.
31P NMR (122 MHz, 클로로포름-d) δ = 42.12 ppm.
HRMS (ESI): C6H14O2PS [M+H+]에 대한 계산치: 181.0447; 실측치: 181.0460.
S-벤질 O-에틸 알켄-PT (화합물 2 )
Figure pct00501
S-벤질 O-에틸 알켄-PT를 혼합된 디술파이드 2-(벤질디술파네일)-5-니트로피리딘 (100 mg, 0.359 mmol)으로부터 일반적 절차 B에 따라 제조하였다. 미정제 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (헥산/EtOAc= 4:1 내지 1:1 구배)로 정제하여 기재된 화합물 2을 황색 오일 (55 mg, 0.227 mmol, 63%)로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ = 7.42 - 7.19 (m, 5H), 6.40 - 5.91 (m, 3H), 4.28-3.39 (m, 4H), 1.31 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ppm.
13C (75 MHz, 클로로포름-d) δ = 162.92, 137.01, 134.54, 130.53, 128.87, 128.59, 128.57, 127.56, 62.23, 34.37, 16.08 ppm.
31P NMR (122 MHz, 클로로포름-d) δ = 42.69 ppm.
HRMS (ESI): C11H15O2PS [M+H+]에 대한 계산치: 242.0525; 실측치: 242.0551.
O-에틸 S-비오틴 알켄-PT (화합물 4 )
Figure pct00502
O-에틸 S-비오틴 알켄-PT을 용매 혼합물 THF/DMF = 5:1 중의 혼합된 디술파이드 2-(비오티닐디술파네일)-5-니트로피리딘 (40 mg, 0.100 mmol)으로부터 일반적 절차 B에 따라 제조하였다. 미정제 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (100% DCM 대 DCM/MeOH = 9:1 구배)로 정제하여 기재된 화합물 4를 황색 고체 (21 mg, 0.0576 mmol, 58%)로서 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ = 6.35 - 6.05 (m, 3H), 5.83 (d, J = 24.7 Hz, 1H), 5.24 (s, 1H), 4.52 (dd, J = 7.8, 4.9 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 7.8, 4.6 Hz, 1H), 4.26 - 4.11 (m, 2H), 3.17 - 3.12 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 1H), 2.87 - 2.72 (m, 3H), 2.15 (s, 2H), 1.75 - 1.60 (m, 4H), 1.49-1.39 (m, 4H), 1.36 (td, J = 7.1, 1.5 Hz, 3H) ppm.
13C NMR (151 MHz, 클로로포름-d) δ = 163.43, 133.85, 130.75 (dd, J = 145.2, 9.9 Hz), 62.10 - 61.69 (m, 2C), 60.17, 55.52, 40.53, 30.59 (t, J = 5.2 Hz), 30.12, 28.51 (d, J = 8.7 Hz), 28.30 (d, J = 25.5 Hz, 2C), 16.32 (d, J = 6.8 Hz) ppm.
31P NMR (122 MHz, 클로로포름-d) δ = 42.57 ppm.
HRMS (ESI): C14H26N2O3PS2 [M+H+]에 대한 계산치: 365.1117; 실측치: 365.1141.
3-((에톡시(알켄)포스포릴)티오)프로판산 (화합물 3 )
Figure pct00503
3-((에톡시(알켄)포스포릴)티오)프로판산을 혼합된 디술파이드 3-((5-니트로피리딘 -2-일)디술파네일)프로판산 (146 mg, 0.561 mmol)으로부터 일반적 절차 B에 따라 제조하였다. 미정제 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (헥산/EtOAc = 산 없이 4:1 내지 EtOAc + 0.1% 포름산)로 정제하여 화합물 3을 무색 오일 (33.7 mg, 0.150 mmol, 27%)로서 수득하였다. 분석적으로 순수한 샘플*을 후속 HPLC 정제 (30분 내에 5-40% MeCN)로 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ = 9.25 (s, 1H), 6.38 - 6.08 (m, 3H), 4.26 - 4.13 (m, 2H), 3.09 - 2.96 (m, 2H), 2.74 (t, J = 7.2 , 2H), 1.35 (t, J = 7.1 , 3H) ppm.
13C NMR (151 MHz, 클로로포름-d) δ = 174.98, 134.92, 130.18 (d, J = 145.9 Hz), 62.52 (d, J= 6.9 Hz), 35.73 (d, J=3.5 Hz), 25.02 (d, J=2.8 Hz), 16.38 (d, J=6.9 Hz) ppm.
31P NMR (122 MHz, 클로로포름-d) δ = 43.17 ppm.
HRMS (ESI): C7H14O4PS 2 [M+H+]에 대한 계산치: 225.0345; 실측치: 225.0358.
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-((에톡시(알켄)포스포릴)티오)프로파노에이트 (화합물 10 )
Figure pct00504
10 mg의 카르복실산 3-((에톡시(알켄)포스포릴)티오)프로판산 3 (0.0446 mmol, 1.0 eq) 및 N-히드록시숙신이미드 (5.1 mg, 0.0446 mg, 1.0 eq.)를 400 μl의 디옥산/EtOAc = 1:1 혼합물에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 9.2 mg의 디사이클로헥실카르보디이미드 (0.0446 mmol, 1.0 eq.)를 교반된 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 1시간 후, 현탁액을 여과하고, 투명한 잔류물을 감압 하에 건조시켜 12 mg의 기재된 생성물 10 (0.0374 mmol, 84%)을 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ = 6.39-6.09 (m, 3H), 4.29-4.13 (m, 2H), 3.19-2.99 (m, 4H), 1.37 (t, J=7.1 Hz, 3H) ppm.
13C NMR (151 MHz, 클로로포름-d) δ = 168.92, 166.85, 134.76, 130.50 (d, J=146.2 Hz), 62.41 (d, J=6.8 Hz), 33.03 (d, J= 3.0 Hz), 25.71, 24.57 (d, J=2.9 Hz), 16.40 (d, J=6.9 Hz) ppm.
31P NMR (122 MHz, 클로로포름-d) δ = 41.44 ppm.
HRMS (ESI): C11H17NO6PS [M+H+]에 대한 계산치: 322.0509; 실측치: 322.0540.
5-((2-(3-((에톡시(알켄)포스포릴)티오)프로판아미도)에틸)아미노)나프탈렌-1- 술폰산 (화합물 11 )
Figure pct00505
30 mg의 NHS 에스테르 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-((에톡시(알켄)포스포릴)티오)프로파노에이트 10 (0.0934 mmol, 1.0 eq.) 및 30 mg의 EDANS (0.103 mmol, 1.1 eq.)를 에펜도르프 튜브에서 470 μl DMF에 용해시켰다. 33 μl (0.189 mmol, 2.0 eq.)의 DIPEA를 첨가하고, 현탁액을 15분 동안 실온에서 교반하였다. 휘발물을 감압 하에 증발시키고, 미정제 생성물을 분취용 HPLC (40분 내에 5-60% MeCN, 유속 16 ml/min)로 정제하여 24 mg의 기재된 화합물 11 (0.0508 mmol, 54%)을 동결건조후 백색 분말로서 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ = 8.32 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.22 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 8.5, 7.1 Hz, 1H), 7.34 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.38 (ddd, J = 28.0, 18.4, 12.4 Hz, 1H), 6.25 - 6.11 (m, 2H), 4.14 - 3.98 (m, 2H), 3.41 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.32 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.93 (ddt, J = 18.0, 12.9, 6.6 Hz, 2H), 1.26 (t, J = 7.0 Hz, 3H) ppm.
13C NMR (151 MHz, DMSO-d 6) δ = 170.42, 144.21, 134.28, 130.60 (d, J = 142 Hz), 130.09, 125.92, 124.59, 124.07, 123.23, 122.62, 61.37 (d, J=6.7 Hz), 44.79, 37.23, 36.23 (d, J=4.0 Hz), 25.42 (d, J= 2.8 Hz), 16.10 (d, J=6.5 Hz) ppm.
31P NMR (243 MHz, DMSO-d 6) δ = 41.29 ppm.
HRMS (ESI): C19H26N2O6PS2 [M+H+]에 대한 계산치: 473.0964; 실측치: 473.0984.
일반적 절차 C: PCl 3 경로를 통한 알켄-PT의 합성
둥근 바닥 플라스크를 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-비닐포스판아민 (예컨대, 0.3 mmol)로 충전시키고, 무수 아세토니트릴 (3 ml)에 용해시키고, -40℃로 냉각시켰다. 별도로, 테트라졸 (MeCN 중 0.45 M, 0.6 mmol, 1.33 ml) 중의 티올 (0.3 mmol)의 용액을 제조하고, -40℃에서 교반된 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 -40℃에서 교반한 후, r.t.로 가온시키고, 또 다른 30분 동안 교반하였다. 이 혼합물에 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 용액 (H2O 중 70 wt.%, 0.3 mmol, 86 μl)을 r.t.에서 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 H2O (10 ml)로 희석시키고, DCM (3x 30 ml)으로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다.
tert-부틸 (2-((에톡시(비닐)포스포릴)티오)에틸)카르바메이트 (화합물 6 )
Figure pct00506
화합물 6을 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-비닐포스판아민 (93 mg, 0.465 mmol) 및 tert-부틸 (2-메르캅토에틸)카르바메이트 (82 mg, 0.465 mmol)로부터 일반적 절차 C에 따라 제조하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (100% 에틸아세테이트)에 의한 정제로 목적하는 화합물을 무색 오일 (30 mg, 0.10 mmol, 22%)로 수득하였다.
실시예 11: 알킨 포스포노티올레이트의 합성 절차
S-벤질 O-메틸 에티닐-PT (화합물 7 )
Figure pct00507
아르곤 분위기 하에서 교반 막대가 장착된 불꽃 건조된 슐렌크 튜브에 무수 THF (17 mL)를 첨가한 후, THF 중의 에티닐마그네슘 브로마이드 (0.5 M, 4 mL, 2 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 이 용액을 -78℃로 냉각시키고, 1-클로로-N,N-디이소프로필-1-메톡시포스판아민 (0.39 mL, 2 mmol)을 충전시키고, 35분 동안 0℃로 가온하고 이어서 r.t.로 가온하기 전에 10분 동안 교반하였다 (이어서, 0.5 mL의 반응 혼합물을 31P-NMR을 위해 취하였다). 이어서, 반응 혼합물을 아르곤 하에서 불꽃 건조된 RBF로 옮기고, 용매를 진공 하에 제거하여 고체를 남기고, 플라스크를 다시 아르곤으로 충전시켰다. 고체를 -40℃로 냉각시키고, MeCN 중의 무수 테트라졸 (11 mL, 5 mmol)을 첨가하고, 무수 벤질 티올 (0.6 mL, 1.7 mmol)로 충전시키고, 밤새 교반하여 고체 현탁액을 수득하였다. 이 혼합물에 H2O 중의 70% tert-부틸 히드로퍼옥사이드를 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 진공 하에 제거하고, 물로 희석시키고, DCM로 추출하고, 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에 제거하여 갈색 오일을 수득하고, 용출제로서 헥산/에틸 아세테이트 (1:0 내지 1:1)를 사용하면서 실리카겔 컬럼에 로딩하여 순수한 생성물을 황색 오일 (82 mg, 0.362 mmol, 18%)로 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δH = 7.40 - 7.28 (5H, m, 5 x 방향족 C(sp2)-H), 4.17 (1H, d, 3 J HP = 3.2 Hz, S-CHa), 4.11 (1H, d, 3 J HP = 1.8 Hz, S-CHb), 3.71 (3H, d, 3 J HP = 14.0 Hz, O-CH3), 3.20 (1H, d, 3 J HP = 12.6 Hz, CCH) ppm.
13C-NMR (76 MHz, CDCl3) δC = 135.39 (d, 3 J CP = 6.1 Hz, IPSO 방향족 C(sp2)), 129.07 (s, 메타 방향족 C(sp2)), 128.76 (s, 오르토 방향족 C(sp2)), 127.88 (s, 파라 방향족 C(sp2), 89.76 (d, 2 J CP = 43.2 Hz, C(sp)-H), 76.66 (d, 1 J CP = 239.2 Hz, C(sp)), 52.93 (d, 2 J CP = 6.2 Hz, O-CH3), 34.96 (d, 2 J CP = 3.5 Hz).
31P- NMR (122 MHz, CDCl3) δP = 17.59 (m) ppm.
HRMS (ESI): C10H11O2PS [M+H+]에 대한 계산치: 227.0290; 실측치: 227.0293.
일반적 절차 D: PCl 3 경로를 통한 알킨-포스포노티올레이트의 합성
둥근 바닥 플라스크를 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-에티닐포스판아민 (예컨대, 0.3 mmol)으로 충전시키고, 무수 아세토니트릴 (3 ml)에 용해시키고, -40℃로 냉각시켰다. 별도로, 테트라졸 (MeCN 중 0.45 M, 0.6 mmol, 1.33 ml) 중의 티올 (0.3 mmol)의 용액을 제조하고, -40℃에서 교반된 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 -40℃에서 교반한 후, r.t.로 가온하고, 또 다른 30분 동안 교반하였다. 이 혼합물에 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 용액 (H2O 중 70 wt.%, 0.3 mmol, 86 μl)을 r.t.에서 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 H2O (10 ml)로 희석시키고, DCM (3x 30 ml)으로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다.
S-벤질 O-에틸 에티닐포스포노티오에이트 (화합물 8 )
Figure pct00508
화합물 8을 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-에티닐포스판아민 (25 mg, 0.123 mmol) 및 메르캅토벤질 (14.4 μl, 0.123 mmol)로부터 일반적 절차 C에 따라 제조하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (100% 에틸아세테이트)로 정제하여 목적하는 화합물을 무색 오일 (10 mg, 0.042 mmol, 34%)로서 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δH = 7.45-7.25 (m, 5H), 4.28-4.02 (m, 4H), 3.12 (d, J=12.5 Hz, 1H), 1.35 (t, J=7.1 Hz, 3H) ppm.
13C-NMR (76 MHz, CDCl3) δC = 136.47 (d, J=6.4 Hz), 129.09, 128.91, 127.84, 88.90 (d, J= 43.0 Hz), 63.50 (d, J= 3.3 Hz), 35.04 (d, J= 3.3 Hz), 28.27, 16.05 (d, J=7.7 Hz) ppm.
31P- NMR (122 MHz, CDCl3) δP = 15.36 ppm.
HRMS: n.d.
tert-부틸 (2-((에톡시(에티닐)포스포릴)티오)에틸)카르바메이트 (화합물 9 )
Figure pct00509
화합물 9를 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-에티닐포스판아민 (93 mg, 0.465 mmol) 및 tert-부틸 (2-메르캅토에틸)카르바메이트 (82 mg, 0.465 mmol)로부터 일반적 절차 C에 따라 제조하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (100% 에틸아세테이트)로 정제하여 목적하는 화합물을 무색 오일 (50 mg, 0.17 mmol, 37%)로서 수득하였다.
실시예 12: 알켄-포스포네이트의 합성 절차
일반적 절차 E: PCl 3 경로를 통한 알켄-포스포네이트의 합성
둥근 바닥 플라스크를 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-비닐포스판아민 (예컨대, 0.3 mmol)으로 충전시키고, 무수 아세토니트릴 (3 ml)에 용해시키고, -40℃로 냉각시켰다. 별도로, 테트라졸 (MeCN 중 0.45 M, 0.6 mmol, 1.33 ml) 중의 알콜 (0.3 mmol)의 용액을 제조하고, -40℃에서 교반된 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 -40℃에서 교반한 후, r.t.로 가온하고, 또 다른 30분 동안 교반하였다. 이 혼합물에 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 용액 (H2O 중 70 wt.%, 0.3 mmol, 86 μl)을 r.t.에서 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 H2O (10 ml)로 희석시키고, DCM (3x 30 ml)으로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다.
벤질 에틸 비닐포스포네이트
Figure pct00510
벤질 에틸 비닐포스포네이트를 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-비닐포스판아민 (25 mg, 0.123 mmol) 및 벤질알콜 (12.3 μl, 0.123 mmol)로부터 일반적 절차 E에 따라 제조하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (100% 에틸아세테이트)로 정제하여 목적하는 화합물을 무색 오일 (2 mg, 0.0088 mmol, 7%)로서 수득하였다. (낮은 수율은 정제 동안 핸들링 단계로부터 생성물의 손실에 의해 설명될 수 있다.)
tert-부틸 (2-((에톡시(비닐)포스포릴)옥시)에틸)카르바메이트
Figure pct00511
표제 화합물을 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-비닐포스판아민 (201 mg, 1.00 mmol) 및 tert-부틸 (2-히드록시에틸)카르바메이트 (161 mg, 1.00 mmol)로부터 일반적 절차 E에 따라 제조하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (100% 에틸아세테이트)로 정제하여 목적하는 화합물을 무색 오일 (100 mg, 0.358 mmol, 36%)로서 수득하였다.
HRMS (ESI): NaC11H22NO5P [M+Na+]에 대한 계산치: 302.1133; 실측치: 302.1120.
실시예 13: 알킨-포스포네이트의 합성 절차
일반적 절차 F: PCl 3 경로를 통한 알킨-포스포네이트의 합성
둥근 바닥 플라스크를 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-에티닐포스판아민 (예컨대, 0.3 mmol)으로 충전시키고, 무수 아세토니트릴 (3 ml)에 용해시키고, -40℃로 냉각시켰다. 별도로, 테트라졸 (MeCN 중 0.45 M, 0.6 mmol, 1.33 ml) 중의 알콜 (0.3 mmol)의 용액을 제조하고, -40℃에서 교반된 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 -40℃에서 교반한 후, r.t.로 가온하고, 또 다른 30분 동안 교반하였다. 이 혼합물에 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 용액 (H2O 중 70 wt.%, 0.3 mmol, 86 μl)을 r.t.에서 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 H2O (10 ml)로 희석시키고, DCM (3x 30 ml)으로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다.
벤질 에틸 에티닐포스포네이트
Figure pct00512
벤질 에틸 에티닐포스포네이트를 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-에티닐포스판아민 (25 mg, 0.123 mmol) 및 벤질알콜 (12.3 μl, 0.123 mmol)로부터 일반적 절차 F에 따라 제조하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (100% 에틸아세테이트)로 정제하여 목적하는 화합물을 무색 오일 (27 mg, 0.120 mmol, 49%)로서 수득하였다.
tert-부틸 (2-((에톡시(에티닐)포스포릴)옥시)에틸)카르바메이트
Figure pct00513
표제 화합물을 1-에톡시-N,N-디이소프로필-1-에티닐포스판아민 (201 mg, 1.00 mmol) 및 tert-부틸 (2-히드록시에틸)카르바메이트 (161 mg, 1.00 mmol)로부터 일반적 절차 F에 따라 제조하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (100% 에틸아세테이트)로 정제하여 목적하는 화합물을 무색 오일 (168 mg, 0.601 mmol, 60%)로서 수득하였다.
HRMS (ESI): C11H21NO5P [M+H+]에 대한 계산치: 278.1157; 실측치: 278.1149.
실시예 14: 알켄- 및 알킨 포스포노티올레이트 및 포스포네이트에 대한 카르복실산의 커플링 절차
일반적 절차 G: 아미드 결합 형성을 통한 기능화된 포스포노티올레이트 및 포스포네이트의 제조
Figure pct00514
알켄- 및 알킨 포스포노티올레이트 (X=S) 또는 포스포네이트 (X=O)의 Boc-보호된 아민 유도체 (s. 상기 도식) (예컨대, 0.2 mmol)를 TFA/H2O (95:5, xx ml)의 혼합물에 용해시키고, 생성된 투명한 용액을 15분 동안 r.t.에서 교반하였다. 이어서, 용매를 용액을 통해 질소를 버블링시켜 제거하였다. 잔류물을 H2O에 재용해시키고, 동결건조시켜 무색 오일을 수득하였다. 생성물을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 탈보호된 아민 (예컨대, 0.05 mmol)에 DMF (250 μl) 중의 HATU (0.055 mmol), 카르복실산 (0.055 mmol) 및 DIPEA (0.15 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 에펜도르프 튜브에서 30분 동안 r.t.에서 교반한 후, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 H2O/MeCN (9:1, 5 ml)에 재용해시키고, 분취용 HPLC로 정제하였다.
5-((2-(4-((2-((에톡시(에티닐)포스포릴)옥시)에틸)아미노)-4-옥소부탄아미도)에틸)아미노) 나프탈렌-1-술폰산 (화합물 20 )
Figure pct00515
화합물 20은 탈보호된 아민 (14 mg, 0.079 mmol)으로부터 일반적 프로토콜 G에 따라 생성되었다. HPLC ()로 정제하고 동결건조한 후 순수한 생성물을 무색 분말 (18 mg, 0.0342 mmol, 43%)로서 수득하였다.
HRMS (ESI): C22H29N3O8PS [M+H+]에 대한 계산치: 526.1413; 실측치: 526.1387.
도 8은 정제된 화합물 20의 UV-LC 트레이스를 나타낸다.
5-((2-(4-((2-((에톡시(비닐)포스포릴)옥시)에틸)아미노)-4-옥소부탄아미도)에틸)아미노)나프탈렌-1-술폰산 (화합물 21 )
Figure pct00516
화합물 21은 탈보호된 아민 (12.9 mg, 0.072 mmol)으로부터 일반적 프로토콜 G에 따라 생성되었다. HPLC ()로 정제하고 동결건조한 후 순수한 생성물을 무색 분말 (10 mg, 0.0190 mmol, 26%)로서 수득하였다.
HRMS (ESI): C22H31N3O8PS [M+H+]에 대한 계산치: 528.1570; 실측치: 528.1543.
도 9는 정제된 화합물 21의 UV-LC 트레이스를 나타낸다.
5-((2-(4-((2-((에톡시(에티닐)포스포릴)티오)에틸)아미노)-4-옥소부탄아미도)에틸)아미노)나프탈렌-1-술폰산 (화합물 22 )
Figure pct00517
화합물 22는 탈보호된 아민 (11.2 mg, 0.058 mmol)으로부터 일반적 프로토콜 G에 따라 생성되었다. HPLC ()로 정제하고 동결건조한 후 순수한 생성물을 무색 분말 (10 mg, 0.0185 mmol, 32%)로서 수득하였다.
HRMS (ESI): C22H29N3O7PS2 [M+H+]에 대한 계산치: 542.1184; 실측치: 542.1156.
도 10은 정제된 화합물 22의 UV-LC 트레이스를 나타낸다.
5-((2-(4-((2-((에톡시(비닐)포스포릴)티오)에틸)아미노)-4-옥소부탄아미도)에틸)아미노)나프탈렌-1-술폰산 (화합물 23 )
Figure pct00518
화합물 23은 탈보호된 아민 (9.6 mg, 0.049 mmol)으로부터 일반적 프로토콜 G에 따라 생성되었다. HPLC ()로 정제하고 동결건조한 후 순수한 생성물을 무색 분말 (11 mg, 0.0202 mmol, 41%)로서 수득하였다.
HRMS (ESI): C22H31N3O7PS2 [M+H+]에 대한 계산치: 544.1341; 실측치: 544.1316.
도 11은 정제된 화합물 23의 UV-LC 트레이스를 나타낸다.
O-에틸 S-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)에틸) 비닐포스포노티오에이트 (화합물 13 )
Figure pct00519
화합물 (13)은 탈보호된 아민 (14.8 mg, 0.076 mmol)으로부터 일반적 프로토콜 G에 따라 생성되었다. HPLC ()로 정제하고 동결건조한 후 순수한 생성물을 무색 분말 (14 mg, 0.033 mmol, 44%)로서 수득하였다.
O-에틸 S-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)에틸) 에티닐포스포노티오에이트 (화합물 28 )
Figure pct00520
표제 화합물은 탈보호된 아민 (20 mg, 0.104 mmol)으로부터 일반적 프로토콜 G에 따라 생성되었다. HPLC ()로 정제하고 동결건조한 후 순수한 생성물을 무색 분말 (7 mg, 0.0167 mmol, 16%)로서 수득하였다.
실시예 15A: 글루타티온으로 알켄-포스포노티올레이트의 히드로티올화 절차
(에틸-S-벤질-P-에틸-포스포노티올레이트)-S-글루타티온 접합체 (화합물 14 )
Figure pct00521
환원된 글루타티온 (20.3 mg, 0.066 mmol, 2.0 eq.)을 1.32 ml 수성 버퍼 (1 mM EDTA, 50 mM NH4HCO3, pH 8.0)에 용해시키고, 0.33 ml DMF 중의 S-벤질 O-에틸 알켄-PT 2 (8 mg, 0.033 mmol, 1.0 eq.)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 r.t.에서 교반하였다. 반응을 UPLC-MS (구배: 5분 내에 3-60% MeCN)로 모니터링하였으며, 90분 후 완전 전환을 나타내었다. 이어서, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 5 ml H2O에 재용해시키고, 반분취용 HPLC (산성 조건, 구배: 40분 내에 20-60% MeCN, 생성물은 35% MeCN에서 용출됨, 유속: 16 ml/min)를 통해 정제하였다. 동결건조 후, 기재된 화합물 14를 백색 분말 (14 mg, 0.026 mmol, 77%)로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, 산화중수소) δ = 7.46 - 7.28 (m, 5H), 4.50 (dd, J = 8.4, 5.3 Hz, 1H), 4.19 - 3.93 (m, 7H), 2.90 (dd, J = 14.1, 5.3 Hz, 1H), 2.76 (ddd, J = 14.1, 8.4, 1.9 Hz, 1H), 2.69 - 2.47 (m, 4H), 2.25 - 2.01 (m, 4H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ppm.
13C NMR (75 MHz, 산화중수소) δ = 174.29, 172.82, 172.51, 172.08, 137.34, 128.95, 128.84, 127.95, 63.30, 63.20, 52.79, 52.60, 41.06, 33.90, 32.66, 31.37, 30.93, 25.58, 23.95, 15.38 (d, J = 6.5 Hz) ppm.
　31P NMR (122 MHz, 산화중수소) δ 60.51 (d, J = 1.9 Hz) ppm.
HRMS (ESI): C21H33N3O8PS [M+H+]에 대한 계산치: 550.1441; 실측치: 550.1451.
실시예 15B: 글루타티온으로 알켄-포스포네이트의 히드로티올화 절차
(디에틸-포스포네이트)-S-글루타티온 접합체
Figure pct00522
디에틸 알켄포스포네이트 (20 mg, 0.147 mmol, 1.0 eq.)를 1 ml 버퍼 (50 mM NH4HCO3, 1 mM EDTA, pH 8.0) 및 1 ml DMF에 용해시켰다. 이에, 9 ml의 동일한 버퍼 (GSH를 용해시킨 후 pH 8.0으로 조정된 pH) 중의 글루타티온 (90.3 mg, 0.294 mmol, 2.0 eq.)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 r.t.에서 교반하였다. 완전 전환이 달성되면 (31P-NMR로 판단됨), 반응 혼합물을 액체 질소에 동결시킨 후, 동결건조시켰다. 잔류물을 반분취용 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 무색 분말 (41.6 mg, 0.0882 mmol, 60%)로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ = 8.48 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.38 - 8.25 (m, 4H), 4.49 (td, J = 8.9, 4.8 Hz, 1H), 4.07 - 3.90 (m, 5H), 3.76 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 2.91 (dd, J = 13.8, 4.8 Hz, 1H), 2.71 - 2.55 (m, 3H), 2.45 - 2.23 (m, 2H), 2.12 - 1.89 (m, 4H), 1.23 (t, J = 7.0 Hz, 6H) ppm.
13C NMR (75 MHz, DMSO-d 6) δ = 171.45, 171.39, 171.27, 171.01, 61.70, 61.62, 52.27, 52.07, 34.13, 31.09, 26.95, 26.50, 25.17, 24.82, 16.76, 16.69 ppm.
31P NMR (122 MHz, DMSO-d 6 ) δ= 28.58 ppm.
HRMS: ESI-MS (양성 모드) m/z 472.1496 [(M+H)+; C16H31N3O9PS+에 대한 계산치: 472.1513].
실시예 16: 글루타티온으로 알킨-포스포노티올레이트의 히드로티올화 절차
(메틸-S-벤질-P-에틸-포스포노티올레이트)-S-글루타티온 접합체 (화합물 15 )
Figure pct00523
완충된 수용액 (1 mM EDTA, 50 mM NH4HCO3, pH = 8.5) 중의 글루타티온 (0.15 mmol, 23 mg)의 혼합물에 DMF 중의 화합물 7 (0.75 mL, 100 mM)을 첨가하고, 4분 동안 볼텍싱하였다. 이어서, 혼합물을 동결건조시키고, 남아 있는 잔류물을 MeCN/H2O에 용해시키고, HPLC (50분 내에 5-45% MeCN)를 통해 정제하였다. 생성물-함유 분획을 동결건조시켜 표제 화합물 15를 무색 분말 (16.4 mg, 약 33%)로서 수득하였다.
1H- NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ = 8.47 - 8.45 (1H, m), 8.39 - 8.37 (1H, m), 7.62 - 7.51 (1H, ddd, J = 49.9 Hz, J = 12.3 Hz, J = 4.8 Hz), 7.37 - 7.25 (5H, m), 5.83 - 5.78 (1H, ddd, J = 21.3 Hz, J = 12.2 Hz, J = 6.4 Hz), 4.56 - 4.54 (1H, m), 4.01 - 3.91 (3H, m), 3.78 - 3.77 (2H, m), 3.77 - 3.53 (3H, m), 3.22 - 3.19 (1H, m), 2.96 - 2.92 (1H, m), 2.38 - 2.31 (2H, m), 2.07 - 1.98 (2H, m) ppm.
13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ = 171.07, 170.87, 170.75, 170.02, 137.80, 137.76, 128.87, 128.50, 127.32, 118.07, 116.09, 113.62, 112.63, 52.89, 51.63, 51.20, 51.17, 51.13, 40.77, 36.81, 33.37, 30.66, 30.62, 25.88 ppm.
31P-NMR (122 MHz, DMSO-d6) δ = 41.6 ppm.
실시예 17: 안정성 연구를 위한 Dabcyl-EDANS ??처 쌍의 합성 절차
Dabcyl-EDANS ??처 쌍의 합성을 위한 일반적 절차 H
Figure pct00524
DABCYL-함유 펩티드를 표준 고체상 펩티드 합성 조건 (Fmoc 전략) 하에서 링크-아미드 수지로부터 합성하였다. Dabcyl (카르복실산으로서)을 커플링 시약으로 HATU를 사용하면서 수지 상의 유리 N-말단에 커플링시켰다. 이 펩티드를 TFA/TIS/H2O/DTT = 95/2/2/1 혼합물을 사용하여 수지로부터 절단시켰다. 펩티드를 반분취용 HPLC를 통해 정제하였다.
정제된 Dabcyl 펩티드 (예컨대, 2.35 μmol)를 수성 버퍼 (50 mM NH4HCO3, 1 mM EDTA, pH 8.5)에 용해시키고, EDANS 화합물 20-23 (2.82 μmol)과 혼합하고, 에펜도르프 튜브에서 DMF (280 μl)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 r.t.에서 교반하고, 반응을 UV-LC-MS로 모니터링하였다. 이어서, 반응 혼합물을 물 (4.7 ml)로 희석시키고, 반분취용 HPLC (45분에 걸쳐 10-50% MeCN, 0.1% TFA, 유속: 16 ml/min)를 통해 정제하고, 순수한 생성물-함유 분획을 합하고, 동결건조시켰다.
EDANS-Dabcyl FRET 쌍 (알킨 포스포네이트 유도체) (화합물 24 )
Figure pct00525
화합물 24는 Edans 화합물 20 (1.48 mg, 2.82 μmol) 및 Dabcyl 펩티드 (2.5 mg, 2.35 μmol)로부터 일반적 프로토콜 H에 따라 생성되었다. 반분취용 HPLC (10-50% MeCN, 0.1% TFA, 16 ml/min)로 정제하고 동결건조한 후 생성물을 적색 분말 (3 mg, 2.01 μmol, 86%)로서 수득하였다.
도 12는 정제된 화합물 24의 UV-LC 트레이스를 나타낸다.
EDANS-Dabcyl FRET 쌍 (알켄 포스포네이트 유도체) (화합물 25 )
Figure pct00526
화합물 25는 Edans 화합물 21 (1.49 mg, 2.82 μmol) 및 Dabcyl 펩티드 (2.5 mg, 2.35 μmol)로부터 일반적 프로토콜 H에 따라 생성되었다. 반분취용 HPLC (10-50% MeCN, 0.1% TFA, 16 ml/min)로 정제하고 동결건조한 후 생성물을 적색 분말 (3 mg, 2.01 μmol, 86%)로서 수득하였다.
도 13은 정제된 화합물 25의 UV-LC 트레이스를 나타낸다.
EDANS-Dabcyl FRET 쌍 (알킨 포스포노티올레이트 유도체) (화합물 26 )
Figure pct00527
화합물 26은 Edans 화합물 22 (1.53 mg, 2.82 μmol) 및 Dabcyl 펩티드 (2.5 mg, 2.35 μmol)로부터 일반적 프로토콜 H에 따라 생성되었다. 반분취용 HPLC (10-50% MeCN, 0.1% TFA, 16 ml/min)로 정제하고 동결건조한 후 생성물을 적색 분말 (3 mg, 1.87 μmol, 80%)로서 수득하였다.
도 14는 정제된 화합물 26의 UV-LC 트레이스를 나타낸다.
EDANS-Dabcyl FRET 쌍 (알켄 포스포노티올레이트 유도체) (화합물 27 )
Figure pct00528
화합물 27은 Edans 화합물 23 (1.53 mg, 2.82 μmol) 및 Dabcyl 펩티드 (2.5 mg, 2.35 μmol)로부터 일반적 프로토콜 H에 따라 생성되었다. 반분취용 HPLC (10-50% MeCN, 0.1% TFA, 16 ml/min)로 정제하고 동결건조한 후 생성물을 적색 분말 (3 mg, 1.87 μmol, 80%)로서 수득하였다.
도 15는 정제된 화합물 27의 UV-LC 트레이스를 나타낸다.
실시예 18: 실시예 6의 안정성 연구를 위한 절차
EDANS-DABCYL 접합체 24-27의 0.20 mM 스톡 용액을 각각 제조하였다 (PBS pH 7.4). 이 스톡 용액으로부터 5 μl를 실온 (약 25℃)에서 96-웰 플레이트 (Corning, N° 3615)에서 시험될 95 μl의 각각의 매트릭스 (PBS pH 7.4, HeLa 세포로부터 새로이 제조된 용해물 (1 mg/ml), 인간 혈청)와 혼합하였다. NaOH에서의 실험을 위해, 화합물 (PBS 중의 150μL의 200 μM 스톡 용액)을 실온 (약 25℃)에서 에펜도르프 튜브에서 150 μL의 1 M NaOH 용액과 혼합하였다. 주어진 시점에서, 3 μl의 이 용액을 96 웰 플레이트에서 중화를 위해 5.6 μl의 1 M HCl 용액 및 91 μl PBS와 혼합하였다. 형광을 Safire/Tecan 기기 (EDANS: λex = 360 nm, λem = 508 nm)를 사용하여 3일에 걸쳐 (NaOH를 제외한 모든 조건에 대해) 모니터링하였다. 형광 강도를 배경 측정 (매트릭스 단독)에 의해 보정하고, 3개의 독립적인 실험의 평균 값 및 표준편차를 계산하였다 (n=3).
실시예 19: 실시예 5의 반응속도 연구를 위한 절차
Figure pct00529
DMF 중의 상응하는 인 화합물 20-23의 20 mM 용액 2.5　μl 및 내부 표준으로서 DMF/버퍼 (1:1) 중의 비접합된 EDANS의 1 mM 용액 5　μl를 488 μl 접합 버퍼 (수성 암모니아 용액으로 pH 8.5로 조정된, 초순수 물 중의 50　mM NH4HCO3 및 1　mM EDTA)에 첨가하였다. 버퍼 중의 10　mM 글루타티온 용액 5　μl를 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응을 실온 (약 25℃)에서 수행하였다. 제1 샘플 (t=0)은 글루타티온을 첨가하기 전에 취하였다. 15, 30, 60, 120, 240 및 480분 후 다음 샘플을 취하였다. 샘플을 20 μl의 부피로 취하고, 즉시 pH 3.5에서 80 μl의 50　mM NaOAc 버퍼로 희석시켜 반응을 정지시켰다. 이들 샘플을 각각 20　μl를 주입하면서 형광 검출기로 HPLC 분석하였다. (이 연구의 결과는 도 3에 나타나 있다).
실시예 20A: 포스포노티올레이트에 대한 BSA 접합을 위한 절차
버퍼 (PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4 또는 50 mM NH4HCO3, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.5) 중의 소 혈청 알부민 (BSA)의 10 μM 용액 (100 μl)을 4℃에서 1 μl의 100 mM (100 eq.에 상응) 또는 1 μl의 화합물 2 또는 7의 용액 (DMF 중 50 mM)과 혼합하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 18 h 동안 교반하였다. 이어서, 과량의 화합물을 스핀 여과 (7 kDa MWCO)를 통해 제거하여 버퍼를 PBS pH 7.4로 변경하였다. PBS 중의 이 단백질 용액 (10 μM) 3 μl를 27 μl의 메르캅토에탄올-함유 라엠리 (Laemmli) 버퍼와 혼합하고, 10분 동안 95℃에서 가열하고, SDS-겔 (12% 아크릴아미드, 250 V, 40분)에서 진행하였다. 이어서, 단백질을 키모트립신으로 겔 내에서 분해시키고, MS/MS로 분석하였다. (MS/MS 분석 결과는 표 6에 요약되어 있다.)
실시예 20B: 포스포네이트에 대한 BSA 접합을 위한 절차
버퍼 (50 mM NH4HCO3, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.5) 중의 소 혈청 알부민 (BSA)의 10 μM 용액 (100 μl)을 4℃에서 DMF 중의 디에틸 알켄 포스포네이트의 100 mM 용액 1 μl와 혼합하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 18 h 동안 교반하였다. 이어서, 과량의 포스포네이트 화합물을 스핀 여과 (7 kDa MWCO)를 통해 제거하여 버퍼를 PBS pH 7.4로 변경하였다. PBS 중의 이 단백질 용액 (10 μM) 3 μl를 27 μl의 메르캅토에탄올-함유 라엠리 버퍼와 혼합하고, 10분 동안 95℃에서 가열하고, SDS-겔 (12% 아크릴아미드, 250 V, 40분)에서 진행하였다. 이어서, 단백질을 키모트립신으로 겔 내에서 분해시키고, MS/MS로 분석하였다. (MS/MS 분석 결과는 표 1에 요약되어 있다.)
실시예 20: 포스포노티올레이트에 대한 항체 접합을 위한 절차
세툭시맙 항체 (PBS 중)의 100 μM 용액 1.25 μl를 10 μl 보레이트 함유 PBS (50 mM 보레이트, pH 8.0) 및 1.25 μl의 DTT 용액 (동일한 보레이트 버퍼 중 100 mM DTT, pH 8.0)과 혼합하였다. 대조군 샘플을 DTT를 첨가하지 않으면서 유사하게 제조하였다. 이들 혼합물을 37℃에서 30분 동안 써모-쉐이커 상에서 인큐베이션하였다. 이어서, 과량의 DTT를 크기 배제 컬럼 (Thermo Scientific, ZebaTM 마이크로 스핀 탈염 컬럼, 7 K MWCO, 생성물 N° 89877)을 사용하여 제거하였다. 크기 배제 컬럼을 먼저 알킬화 버퍼 (50 mM NH4HCO3, 1 mM EDTA, pH = 8.5/8.0 또는 PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4)로 평형화시켰다 (3 x 50 μl, 1000 g에서 1분 동안). 이어서, 항체-DTT 혼합물 (12.5 μl)을 평형화된 컬럼에 적용하고, 항체를 새로운 에펜도르프 튜브로 원심분리 (2분, 1000 g)로 수집하였다. 이 용액에, 비오틴-PT (알켄 또는 알킨 포스포노티올레이트) (DMSO 중 25 mM)의 용액 0.25 μl를 즉시 첨가하고, 혼합물을 써모쉐이커 상에서 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다.
3 μl의 이 혼합물을 27 μl의 메르캅토에탄올-함유 라엠리 버퍼와 혼합하고, 10분 동안 95℃에서 가열하였다. 그 중, 10 μl를 12% 아크릴아미드 SDS-겔에 로딩하고, 35분 동안 250 V에서 진행하였다. 이어서, 겔을 비오틴-변형된 항체에 대한 하이브리드화 및 화학발광을 통한 비오틴의 간접적 검출을 위해 시판되는 스트렙트아비딘-HRP 접합체를 사용하면서 웨스턴-블롯팅하였다.
실시예 21: 알킨포스포노티올레이트로 eGFP의 변형
원리 증명 실험에서, 본 발명자들은 하나의 용매-접근 가능한 시스테인을 갖는 eGFP 변이체를 사용하였으며, 이를 생리적 pH에서 소분자 형광 알킨 포스포노티올레이트 NA1 (상기 실시예 14의 화합물 22에 상응) (도 16a)과 반응시켰다. 반응에 이어 ESI-MS가 뒤따르고, 14 h 후 점검하였을 때, 임의의 검출 가능한 부산물 형성 없이 완전 전환이 관찰되었다 (도 16b). 이 결과는 알킨포스포노티올레이트가 생리적 pH에서 온화한 조건 하에서 단백질의 변형에 적합하다는 것을 입증한다.
도 16: 알킨포스포노티올레이트-Edans 유도체 NA1으로 eGFP의 변형 a) 합성 도식, b) GFP의 원하는 생성물로의 완전 전환이 ESI-MS로 관찰되었다. 여기에 나타낸 스펙트럼은 임의의 정제 없이 반응 혼합물로부터 직접적으로 취한 것이다. PT= 포스포노티올레이트 NA1.
실시예 22: 알킨-포스포노티올레이트로 항체 약물 접합체 (ADC)의 합성
본 발명자들은 또한 매우 효율적인 항유사분열제인 투불린 결합 세포독소 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 CD30-어드레싱 항체 브렌툭시맙로부터 포스포노티올레이트-연결된 항체 약물 접합체 (ADC)의 합성을 개발하였다. 독성 페이로드의 방출을 촉진하기 위해, 카텝신 B 절단면 (발린-시트룰린 링커 VC)를 갖는 ADC를 항체와 독소 사이에 제조하여 시판되는 ADC Adcetris® (브렌툭시맙 베도틴)에 대한 직접적인 유사체를 생성하였다 (M. A. Stephen, Blood 2014, 124, 3197-3200.). 포스포노티올레이트-VC-PAB-MMAE 구축물 NA3를 도식 12에 나타낸 바와 같이 아미드 커플링을 통해 알킨 포스포노티올레이트 카르복실산 NA2 및 VC-PAB-MMAE로부터 합성하였다.
Figure pct00530
도식 12: 포스포노티올레이트 연결되고 카텝신 B 절단 가능한 모노메틸 아우리스타틴 E 접합체 NA3의 구축을 위한 합성 경로. VC: 발린-시트룰린 디펩티드, PAB: p-아미노벤질.
다음으로, NA3를 브렌툭시맙에 접합시켜 항체 약물 접합체를 합성하였다. 본 발명자들은 먼저 포스포노티올레이트 연결된 ADC를 포함하는 ADC의 활성과 FDA-승인된 ADC Adcetris®를 비교할 수 있도록 하기 위해 3-4의 약물 대 항체 비율 (DAR)을 갖는 ADC를 생성하는 반응 조건을 찾는 스크리닝을 수행하였다. 아드세트리스의 경우, VC-PAB-MMAE가 말레이미드를 통해 DAR=4로 브렌툭시맙의 시스테인에 접합되었다 (M. A. Stephen, Blood 2014, 124, 3197-3200.). 본 발명자들은 먼저 알킨포스포노티올레이트 NA3와 반응할 수 있는 유리 술프히드릴기를 생성하기 위해 브렌툭시맙의 쇄간-디술파이드 결합을 DTT로 환원시켰다 (도 17a 참조). 과량의 DTT를 ZebaTM 스핀 탈염 컬럼으로 제거하였다. 스크리닝을 위해, 본 발명자들은 브렌툭시맙 항체의 농도 (1 vs. 5 ng/mg), 접합의 pH (pH 8.5 vs. 7.4) 및 포스포노티올레이트-약물 화합물 NA3의 당량수 (8.8-100 eq.)를 변화시키고, 효소 PNGase-F로 탈글리코실화 및 환원 후 ESI-MS로 생성된 ADC를 분석하였다. DAR은 상이한 정도의 변형을 갖는 중쇄 및 경쇄 종의 매쓰 신호 강도로 추정되었다. 이 스크린의 결과가 도 17b에 나타나 있다. 더 높은 항체 농도 및 더 많은 당량의 포스포노티올레이트는 더 높은 DAR을 제공하였다. 알킨포스포노티올레이트로의 접합은 또한 생리적 pH에서 효율적으로 작동하였다. 이는, 예컨대 안정성 이유로 생리적 pH에서의 취급을 필요로 하는 단백질 또는 항체의 접합을 위한 알킨포스포노티올레이트의 이점일 수 있다.
도 17: NA3 (포스포노티올레이트-VC-PAB-MMAE)로 브렌툭시맙 변형. a) 반응 도식: 쇄간 디술파이드의 환원 및 알킬화. b) 반응 조건의 스크린. c) PNGase-F로 탈글리코실화 및 DTT로 환원 후 항체 단편의 전형적인 MS 스펙트럼. 디컨볼루션 스펙트럼을 나타내며, 삽입물은 미가공 데이터를 나타낸다. LC: 경쇄; HC: 중쇄; mod: 포스포노티올레이트-VC-PAB-MMAE NA3.
본 발명자들 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 DAR=3.15를 갖는 ADC를 더욱 특징규명하였다 (도 21 참조). 이어서, 이 ADC는 CD30-과발현 세포주 Karpas 299를 사용하는 표준 레사주린 검정으로 평가되었다 (도 18a 참조). 브렌툭시맙-NA3 ADC (청색 곡선)는 강력한 성장 억제를 나타내었으며, 약간 낮은 DAR로 임상적으로 사용된 ADC Adcetris® (적색 곡선)와 같이 강력하다 (Adcetris®에 대해 3.15 vs. 4.0). 브렌툭시맙 단독 (녹색 곡선)은 성장 억제를 나타내지 않는다. CD30 선택성을 입증하기 위한 대조군으로, 비-CD30-과발현 세포주 HL 60을 사용하였다 (도 18b). 이 경우 모든 구축물에 대해 세포 증식의 억제가 관팔되지 않았다. 종합하면, 이들 결과는 알킨포스포노티올레이트가 항원-양성 세포주를 선택적으로 사멸시키는 활성 ADC를 생성하는 데 적합하다는 것을 입증한다.
도 18: a) CD30-과발현 세포주 Karpas 299에서 선택적으로 MMAE 연결된 브렌툭시맙 ADC의 증가된 성장 억제. 플롯은 항체 농도에 따라 96시간 처리 후 세포 생존력을 나타낸다. 브렌툭시맙 단독 (녹색), 브렌툭시맙-NA3 (청색) 및 Adcetris® (적색). Karpas 299: CD30-과발현 세포주. b) 대조군. 브렌툭시맙 단독 (녹색), 브렌툭시맙-NA3 (청색) 및 Adcetris® (적색). HL 60: 낮은 CD30 발현 수준을 갖는 세포주.
포스포노티올레이트-티올 접합체는 말레이미드-티올 접합체와 비교하여, 특히 과량의 유리 티올의 존재 하에서 더 안정하다. 특히, 티올 교환으로 인한 독소의 조기 방출이 증가된 오프-타겟 독성을 초래할 수 있는 ADC에 대해, 이는 본원에 기재된 방법 및 화합물의 중요한 이점이다.
항체의 변형에서, 또 다른 이점으로, 본 발명자들은 생리적 pH에서 동일한 수의 등가물을 사용하여 말레이미드에 비해 포스포노티올레이트에 대해 더 우수한 시스테인-선택성을 관찰하였다.
실시예 23: 수지 상의 펩티드에 대한 포스포노티올레이트의 도입
본 발명자들은 본원에 기재된 포스포노티올레이트가 산성 조건 하에서 매우 안정하다는 것을 관찰하였다. 따라서, 포스포노티올레이트는 수지 상에서 고체상 펩티드 합성 (SPPS)을 통해 펩티드로 통합되었다. 이는 SPPS 동안 펩티드로 직접적인 방식으로 친전자체를 도입하고, 산성 조건 하에서 수지로부터 후속 절단하는 것을 가능하게 한다.
모델 펩티드를 유리 N-말단을 통해 카르복실산 NA2에 커플링하였다. 2시간 동안 95% TFA로 절단 후, 생성물을 반분취용 HPLC로 단리할 수 있었다. 따라서, 이 방법은 SPPS 동안 수지 상에 친전자체의 통합을 가능하게 한다. 이점으로, 포스포노티올레이트는 수지로부터의 절단 동안 강한 산성 조건 하에서 가수분해하지 않았다. 따라서, 포스포노티올레이트는 산성 조건 하에 (예컨대, 수지로부터의 절단 동안 > 90% 트리플루오로아세트산 (TFA)에서) 매우 안정하다.
알킨포스포노티올레이트-펩티드를 UV-LC-MS 및 31P-NMR로 분석하였다. 특히, 펩티드는 도식 13에 나타난 바와 같이 그의 성형 형태로 존재하며, 시스테인 잔기를 통한 분자내 티올 첨가에 의해 고리화되지 않았다.
Figure pct00531
도식 13: 알킨 포스포노티올레이트를 사용하는 고체상 펩티드 합성
실시예 24: 알킨포스포노티올레이트 NA1으로 eGFP의 변형을 위한 절차
이 실험을 위해 eGFP 돌연변이체를 사용하였다 (eGFP C70MS174C). 단백질은 프로테아제 절단 부위를 갖는 His-태그부착된 변이체로 발현되었다. 절단 후, 전체 서열은 하기이다:
Figure pct00532
도 19는 NA1과의 접합을 위한 출발 물질로서 사용되었던 eGFP C70MS174C의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸다.
NA1으로 eGFP의 변형을 위한 절차:
낮은-결합 에펜도르프 튜브에서 PBS pH 7.4 중의 eGFP (50 μl, 1 mg/ml)의 용액에 알킨포스포노티올레이트 NA1 (DMSO 중 0.72 μl의 25 mM 스톡 용액, 10 eq.)을 첨가하고, 혼합물을 14 h 동안 14℃ 및 800 rpm에서 써모쉐이커 상에 유지하였다. ESI-MS로 판단하여 완전 전환이 달성되었다.
실시예 25: 알킨-포스포노티올레이트로 항체 약물 접합체 (ADC)의 생성을 위한 절차
4-((2-((에톡시(에티닐)포스포릴)티오)에틸)아미노)-4-옥소부탄산 (화합물 NA2 )의 합성
Figure pct00533
화합물 NA2를 Boc-보호된 전구체 (상기 실시예 11에서 기재된 화합물 번호 9)로부터 2 단계로 생성하였다. 9 (94 mg, 0.321 mmol)를 둥근 바닥 플라스크에서 TFA/H2O 95:5 (3 ml)에 용해시키고, 5분 동안 r.t.에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 H2O (10 ml)로 희석시키고, 동결-건조시켰다. 무수 미정제 생성물을 DMF (1 ml)에 용해시키고, DMF (1 ml) 중의 숙신산 (38 mg, 0.321 mmol), HATU (122 mg, 0.321) 및 DIPEA (167 ml, 0.962 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 30분 동안 r.t.에서 교반하였다. 이어서, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 0.1% TFA를 함유하는 MeCN/H2O 1:4의 혼합물에 용해시키고, 반분취용 HPLC (60분 내에 20-60% MeCN, 유속 = 10 ml/min)로 정제하였다. 생성물-함유 분획 화합물을 냉동-건조시켜 NA2를 1H-NMR을 기반으로 하여 대략 90% 순도의 동결건조된 분말 (34 mg, 0.116 mmol, 36%)을 수득하였다. 화합물을 추가의 정제 없이 후속 반응에 사용하였다.
HR-MS: C10H17NO5PS1+ [M+1H]1+ 에 대한 계산치: 294.0560, 실측치 294.0614.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δH = 7.22 - 7.13 (m, 1H), 4.25 (dq, J=9.8, 7.1 Hz, 2H), 3.76-3.74 (m, 2H), 3.29 (d, J= 12.6 Hz, 1H), 3.25-2.98 (m, 2H), 2.72-2.51 (m, 4H), 1.50-1.36 (m, 3H) ppm.
31P-NMR (122 MHz, CDCl3) δP= 17.1 ppm.
알킨-포스포노티올레이트-Val-Cit-Pab-MMAE (화합물 NA3 )의 합성
Figure pct00534
화합물 NA2 (1.88 mg, 6.41 mmol), HATU (2.44 mg, 6.41 mmol) 및 DIPEA (4.7 ml, 26.7 mmol)를 DMF (100 ml)에 용해시키고, 에펜도르프 튜브에서 DMF (150 ml) 중의 H2N-Val-Cit-Pab-MMAE (6 mg, 5.34 mmol)의 용액에 첨가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 H2O (4.5 ml)로 희석시키고, 여과하고, 반분취용 HPLC (50분 내에 30-99% MeCN, 유속 = 5 ml/min)로 정제하였다. 동결건조 후, 기재된 생성물 NA3를 백색 분말 (3 mg, 2.14 mmol, 40%)로서 수득하였다.
HR-MS: C68H109N11O16PS1+ [M+1H]1+에 대한 계산치: 1398.7507, 실측치: 1398.7201.
도 20은 포스포노티올레이트-Val-Cit-Pab-MMAE NA3의 UPLC-UV 순도를 나타낸다.
브렌툭시맙 생성
브렌툭시맙 발현 및 정제는, PBS 및 0.75　ml/min의 유속으로 GE (GE life sciences, USA)로부터의 슈퍼덱스 200 인크리즈 10/300 (Superdex 200 Increase 10/300) 상에서 겔 여과에 의한 추가의 최종 정제와 함께, 이전에 공개된 바와 같이 수행하였다 (A. Stengl, D. H
Figure pct00535
rl, H. Leonhardt, J. Helma, SLAS Discov 2017, 22, 309-315.).
환원/알킬화 프로토콜을 통한 브렌툭시맙의 변형을 위한 절차
Figure pct00536
브렌툭시맙 변형은 브렌툭시맙 (c　=　5　mg/ml, 33.4 mM)을 낮은-결합 에펜도르프 튜브에서 30분 동안 37℃에서 총 300　μl의 부피로 50　mM 붕산나트륨를 함유하는 버퍼 중의 브렌툭시맙 (c　=　5　mg/ml, 33.4 mM) 및 PBS (pH=8.0) 중의 34　mM DTT를 인큐베이션함으로써 수행되었다. 과량의 DTT 제거 및 1 mM EDTA를 함유하는 PBS (pH 7.4)로의 버퍼 교환은 7K MWCO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, United States)를 갖는 2 mL ZebaTM 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 이후에 수행되었다. 이어서, DMSO 중의 36　mM 포스포노티올레이트 NA3를 함유하는 용액 2.45 μl를 신속히 첨가하고, 혼합물을 16시간 동안 800 rpm 및 14℃에서 진탕하였다. 과량의 포스포노티올레이트를 크기 배제 크로마토그래피 (
Figure pct00537
kta FPLC, Superose 6 Increase 10/300 GL 컬럼, PBS를 가짐, 0.8 ml/min)로 제거하였다. 생성물 함유 분획을 모으고, 멸균 여과하였다. ADC의 분석을 위해, 12 μl의 1 mg/ml 용액을 써모쉐이커 상에서 60℃에서 30분 동안 1 μl RapiGest와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 1 μl의 PNGaseF를 첨가하고, 또 다른 2 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, PBS (pH 7.4) 중의 DTT의 10 mM 용액 1 μl를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 37℃에서 진탕하였다. 이 혼합물 중 10 μl를 30 μl H2O 로 희석시키고, ESI-MS를 수행하였다 (결과는 도 2c를 참조).
ADC의 SEC
분석적 크기-배제 크로마토그래피 (A-SEC)는 DAD 검출기, 스플릿 샘플러 FT (4℃), 컬럼 컴파트먼트 H (25℃) 및 이원 펌프 F (Thermo Fisher Scientific, USA)를 갖는 반퀴쉬 플렉스 UHPLC 시스템 (Vanquish Flex UHPLC System) 상에서 MAbPac SEC-1 300 Å, 4 x 300 mm 컬럼 (Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 0.15 mL/min의 유속으로 수행되었다. 상이한 ADC/mAb 집단의 분리는 이동상으로 pH 7의 포스페이트 버퍼 (20 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300　mM NaCl, 5% v/v 이소프로필 알콜을 사용하여 30분 등용매 구배 동안 달성되었다. 8 μg ADC/mAb가 A-SEC 분석을 위한 컬럼에 로딩되었다. UV 크로마토그램은 220 및 280 nm에서 기록되었다. 단량체 및 HMWS의 정량화는 220 nm에서 피크 면적의 통합 후 달성되었다.
도 21은 브렌툭시맙-NA3 ADC의 크기-배제 크로마토그램을 나타낸다.
세포 기반 항증식 검정
HL60 및 Karpas 세포주는 10% FCS 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640에서 배양되었다. SKBR3 및 MDAMB468 세포주는 10% FCS 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 DMEM/F12에서 배양되었다. 세포는 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트에 5*103개 세포/웰 (SKBR3, HL60 및 Karpas) 또는 1*103개 세포/웰 (MDAMB468)의 밀도로 시딩되었다. ADC 또는 항체의 1:4 연속 희석을 3 μg/mL 최종 농도에서 출발하여 세포 배양 배지에서 수행하고, 마이크로플레이트 상의 각각의 웰에 이중으로 옮겼다. 플레이트를 96 h 동안 37℃ 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 이어서, 레사주린을 50 μM의 최종 농도로 첨가한 후, 3 - 4 h 동안 7℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 레사주린의 레소루핀으로의 대사 전환은 테칸 인피니트 M1000 (Tecan Infinite M1000) 마이크로플레이트 판독기 상에서 레소루핀의 형광 신호 (λEX = 560 nm 및 λEM = 590　nm)로 정량화된다. 평균 및 표준편차는 이중으로 계사되었으며, 비처리 대조군에 대해 정규화되고, 항체 농도에 대해 플로팅되었다. 데이터 분석은 MatLab R2016 소프트웨어로 수행되었다.
실시예 26: 수지 상의 펩티드에 포스포노티올레이트의 도입을 위한 절차
Figure pct00538
서열 AYRCAK를 갖는 펩티드는 0.22 g/mol의 로딩으로 텐타겔 S 링크 아미드 수지 상에서 수동으로 합성되었다. 커플링은 5 eq. 아미노산, 5 eq. HCTU, 5 eq. Oxyma 및 10 eq. DIPEA로 1 h 동안 DMF (농도: 5 eq. 아미노산 기준으로 0.1 M)에서 수행되었다. 각각의 커플링 후, 잔류 유리 아민기는 Ac2O로 캡핑되었다. Fmoc-탈보호는 DMF 중의 20% 피페리딘으로 달성되었다.
유리 N-말단을 갖는 10 μM AYRCAK 펩티드에 상응하는 수지의 양이 포스포노티올레이트 빌딩 블록으로 추가로 변형하는 데 사용되었다. 따라서, 펩티드는 화합물 NA2 (120 μl의 250 mM 스톡 용액 DMF, 30 μmol, 3 eq.), HATU (11.4 mg, 30 μmol, 3 eq.) 및 DIPEA (10.4 μl, 60 μmol, 6 eq.)의 혼합물을 첨가하기 전에 2시간 동안 펩티드 반응기에서 DMF (1 ml)에서 팽윤되었다. 이 혼합물을 1 h 동안 r.t.에서 진탕하였다. 수지로부터의 절단은 2 h 동안 TFA/H2O/TIS (95:2.5:2.5; v:v:v, 2 ml)를 사용하여 수행되었다. 침전은 냉각된 무수 에테르에서 수행되었다. 미정제물을 분취용 역상 C18 HPLC (H2O + 0.1% TFA 중 10-60% MeCN, 유속: 10 ml/min)로 정제하였다. 동결건조 후, 생성물 NA4를 백색 분말 (2.44 mg, 2.48 μmol, 25%)로서 수득하고, 31P-NMR, 분석용 UPLC (RP-C18 컬럼 상에서 15분 내에 0.1% TFA를 함유하는 H2O 중 5 내지 95% MeCN) 및 ESI-MS로 분석하였다.
HR-MS: C40H66N12O11PS2 1+ [M+1H]1+에 대한 계산치: 985.4148, 실측치: 985.4152.
31P-NMR (243 MHz, DMSO-d6) δP= 14.6 (d, J=6.5 Hz) ppm.
도 22는 포스포노티올레이트 펩티드 NA4의 UPLC-UV 순도를 나타낸다.
결론
본 발명자들은 불포화된 포스포노티올레이트 및 포스포네이트 (알켄- 및 알킨-포스포노티올레이트 뿐만 아니라 알켄- 및 알킨-포스포네이트)가 시스테인-선택적 생체접합 반응에 적합한 핸들임을 입증하였다. 티올 첨가는 수성 조건에서 빠르고, 형성된 접합체는 생리적으로 관련된 조건 하에서 안정하다. 본 발명자들은 이 방법이, 예컨대 단백질 (예컨대, BSA) 및 항체 (예컨대, 세툭시맙, 브렌툭시맙)의 시스테인-선택적 변형을 가능하게 한다는 것을 입증하였다. 본원에 제공된 결과는 반응이 티올에 대해 더 선택적이고 형성된 접합체가 더 우수한 안정성을 나타내기 때문에 포스포노티올레이트 또는 포스포네이트를 사용하는 본 발명에 따른 방법이, 예컨대 말레이미드 화학과 같은 현재의 시스테인 생체접합 전략에 비해 뛰어나다는 것을 입증한다.
본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 나타내지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 점에 주목해야 한다. 따라서, 예컨대, "시약"에 대한 언급은 하나 이상의 이러한 상이한 시약을 포함하고 "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 방법 대신 변형되거나 대체될 수 있는 당업자에게 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
본 개시에 인용된 모든 공개문 및 특허는 그 전체가 참조로 포함된다. 참조로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 한, 본 명세서는 임의의 이러한 자료를 대체할 것이다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞에 있는 용어 "적어도"는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포괄되는 것으로 의도된다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 하기 청구범위 전반에 걸쳐, 표현 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제시키지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는", 또는 때때로 본원에 사용된 용어 "갖는"으로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 "로 이루어진"은 청구된 요소에 명시되지 않은 효소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본원에 사용된 "로 본질적으로 이루어진"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원에서 각각의 경우에, 용어 "포함하는", "로 본질적으로 이루어진" 및 "로 이루어진" 중 어느 하나의 용어는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.
본 명세서의 텍스트 전체에 걸쳐 여러 문서가 인용된다. 본원에 인용된 각각의 문서 (모든 특허, 특허 출원, 과학 공개문, 제조업체의 설명서, 지침 등을 포함)는 위 또는 아래에 관계 없이 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 개시를 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> Forschungsverbund Berlin e.V. <120> Chemoselective Thiol-Conjugation with Alkene or Alkyne-Phosphonothiolates and -Phosphonates <130> FMP16264PCT <150> EP 18160384.6 <151> 2018-03-07 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AviTag <400> 1 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Calmodulin-tag <400> 2 Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu 20 25 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> polyglutamate tag <400> 3 Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> E-tag <400> 4 Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FLAG-tag <400> 5 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HA-tag <400> 6 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> His-tag <400> 7 His His His His His His 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Myc-tag <400> 8 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NE-tag <400> 9 Thr Lys Glu Asn Pro Arg Ser Asn Gln Glu Glu Ser Tyr Asp Asp Asn 1 5 10 15 Glu Ser <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> S-tag <400> 10 Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser 1 5 10 15 <210> 11 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SBP-tag <400> 11 Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro 20 25 30 Gln Gly Gln Arg Glu Pro 35 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Softag 1 <400> 12 Ser Leu Ala Glu Leu Leu Asn Ala Gly Leu Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Softag 3 <400> 13 Thr Gln Asp Pro Ser Arg Val Gly 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Strep-tag II <400> 14 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TC tag <400> 15 Cys Cys Pro Gly Cys Cys 1 5 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> V5 tag <400> 16 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VSV-tag <400> 17 Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys 1 5 10 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Xpress tag <400> 18 Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Isopeptag <400> 19 Thr Asp Lys Asp Met Thr Ile Thr Phe Thr Asn Lys Lys Asp Ala Glu 1 5 10 15 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SpyTag <400> 20 Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SnoopTag <400> 21 Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C58-containing peptide <400> 22 Leu Gln Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val Lys Leu 1 5 10 <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C58-containing peptide <400> 23 Leu Gln Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val Lys Leu Val Asn Glu Leu 1 5 10 15 Thr Glu Phe <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C58-containing peptide <400> 24 Gln Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val Lys Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C58-containing peptide <400> 25 Gln Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val Lys Leu Val Asn Glu Leu Thr 1 5 10 15 Glu Phe <210> 26 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> eGFP mutant C70MS174C <400> 26 Arg Gly Ser His Met Gly Ser Ile Gln Met Val Ser Lys Gly Glu Glu 1 5 10 15 Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val 20 25 30 Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr 35 40 45 Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro 50 55 60 Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Met 65 70 75 80 Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser 85 90 95 Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp 100 105 110 Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr 115 120 125 Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly 130 135 140 Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Cys His Asn Val 145 150 155 160 Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys 165 170 175 Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr 180 185 190 Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn 195 200 205 His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys 210 215 220 Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr 225 230 235 240 Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 245

Claims (79)

  1. 화학식 (I)의 화합물을 화학식 (II)의 티올-함유 분자와 반응시켜 화학식 (III)의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는, 포스포노티올레이트 또는 포스포네이트의 제조 방법:
    Figure pct00539

    Figure pct00540

    Figure pct00541

    상기 식에서,
    Figure pct00542
    는 이중 결합 또는 삼중 결합을 나타내고;
    X는
    Figure pct00543
    가 삼중 결합인 경우 R3-C를 나타내고;
    X는
    Figure pct00544
    가 이중 결합인 경우 (R3 R4)C를 나타내고;
    Y는 S 또는 O를 나타내고;
    R1은 임의적으로 치환된 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
    R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
    R4는 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
    ●는 지방족 또는 방향족 잔기를 나타내고;
    Figure pct00545
    는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타내고;
    Figure pct00546
    는 화학식 (I)의 화합물에서
    Figure pct00547
    이 이중 결합을 나타내는 경우 단일 결합을 나타내거나;
    Figure pct00548
    는 화학식 (I)의 화합물에서
    Figure pct00549
    이 삼중 결합을 나타내는 경우 이중 결합을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    Figure pct00550
    는 이중 결합을 나타내고, X는 (R3 R4)C를 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고,
    Figure pct00551
    는 단일 결합을 나타내는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    Figure pct00552
    는 삼중 결합을 나타내고, X는 R3-C를 나타내고, R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고,
    Figure pct00553
    는 이중 결합을 나타내는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 S인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (IV)의 화합물을, 예컨대 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 (tBu-OOH), 메타-클로로퍼옥시벤조산 (mCPBA), 과산화수소 (H2O2), 요오드 (I2), 칼륨 퍼옥시모노술페이트, 또는 산소 (O2)와 같은 산화제와 반응시켜 화학식 (I)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 화학식 (I)의 화합물의 제조를 추가로 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00554

    상기 식에서, R1, X, Y,
    Figure pct00555
    및 ●는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  6. 제5항에 있어서, 삼할로겐화인 (X), 바람직하게는 PCl3를 순차적으로 (i) 화학식 (XI)의 화합물, (ii) 화학식 (XII)의 화합물, (iii) 화학식 (XIII)의 화합물, 및 (iv) 화학식 (XIV)의 화합물과 반응시켜 화학식 (IV)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 화학식 (IV)의 화합물의 제조를 추가로 포함하는 것인 방법:
    R1-OH (XI)
    Figure pct00556

    Figure pct00557

    Figure pct00558

    상기 식에서, R2는 독립적으로 C1-C8-알킬을 나타내고; Hal은 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Br을 나타내고; R1, X, Y,
    Figure pct00559
    및 ●는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  7. 제4항에 있어서, 화학식 (V)의 화합물을 화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물과 반응시켜 화학식 (I)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 화학식 (I)의 화합물의 제조를 추가로 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00560

    Figure pct00561

    Figure pct00562

    상기 식에서, EWG는 전자 구인기를 나타내고, 상기 전자 구인기는 바람직하게는
    Figure pct00563
    ,
    Figure pct00564
    , 및
    Figure pct00565
    로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 #은 S의 위치를 나타내고; Hal은 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Cl을 나타내고; R1, X,
    Figure pct00566
    및 ●는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  8. 제7항에 있어서,
    Figure pct00567
    는 이중 결합이고, X는 (R3 R4)C를 나타내고, 여기서 R3 및 R4는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.
  9. 화학식 (I*)의 화합물을 화학식 (II)의 티올-함유 분자와 반응시켜 화학식 (III*)의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는, 포스포노티올레이트 또는 포스포네이트의 제조 방법:
    Figure pct00568

    Figure pct00569

    Figure pct00570

    상기 식에서,
    ●,
    Figure pct00571
    , Y, R1, R3 및 R4는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같고;
    상기 화학식 (I*)에서,
    V는 C1-C8-알킬, 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필, 더 바람직하게는 메틸을 나타내고;
    X는 (R3 R4)C를 나타내고;
    상기 화학식 (III*)에서,
    V 및 X는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  10. 제9항에 있어서, Y가 S인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 화학식 (IV*)의 화합물을, 예컨대 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 (tBu-OOH), 메타-클로로퍼옥시벤조산 (mCPBA), 과산화수소 (H2O2), 요오드 (I2), 칼륨 퍼옥시모노술페이트, 또는 산소 (O2)와 같은 산화제와 반응시켜 화학식 (I*)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는, 화학식 (I*)의 화합물의 제조를 추가로 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00572

    상기 식에서, X는 (R3 R4)C를 나타내고; Y, R1, R3, R4, V 및 ●는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  12. 제11항에 있어서, 삼할로겐화인 (X), 바람직하게는 PCl3를 순차적으로 (i) 화학식 (XI)의 화합물, (ii) 화학식 (XII)의 화합물, (iii) 화학식 (XIII*)의 화합물, 및 (iv) 화학식 (XIV)의 화합물과 반응시켜 화학식 (IV*)의 화합물의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는, 화학식 (IV*)의 화합물의 제조를 추가로 포함하는 것인 방법:
    R1-OH (XI)
    Figure pct00573

    Figure pct00574

    Figure pct00575

    상기 식에서, R2는 독립적으로 C1-C8-알킬을 나타내고; Hal은 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Br을 나타내고; X는 (R3 R4)C를 나타내고; R1, R3, R4, V, Y 및 ●는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  13. 제10항에 있어서, 화학식 (V*)의 화합물을 화학식 (VIa) 또는 (VIb)의 화합물과 반응시켜 화학식 (I*)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는, 화학식 (I*)의 화합물의 제조를 추가로 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00576

    Figure pct00577

    Figure pct00578

    상기 식에서, EWG는 전자 구인기를 나타내고, 상기 전자 구인기는 바람직하게는
    Figure pct00579
    ,
    Figure pct00580
    , 및
    Figure pct00581
    로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 #은 S의 위치를 나타내고; Hal은 Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐, 바람직하게는 Cl을 나타내고; X는 (R3 R4)C를 나타내고; R1, R3, R4, V 및 ●는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 임의적으로 (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), F, Cl, Br, I, -NO2, -N(C1-C8-알킬)H, -NH2, -N3, -N(C1-C8-알킬)2, =O, C3-C8-사이클로알킬, -S-S-(C1-C8-알킬), 히드록시-(C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), C2-C8-알케닐, C2-C8-알키닐 중 적어도 하나로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내거나;
    R1은 임의적으로 C1-C8-알킬, (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), F, Cl, I, Br, -NO2, -N(C1-C8-알킬)H, -NH2 또는 -N(C1-C8-알킬)2 중 적어도 하나로 독립적으로 치환된 페닐을 나타내거나;
    R1은 피리딜과 같은 5 또는 6원 헤테로방향족 시스템을 나타내고;
    바람직하게는, R1은 C1-C8-알킬, -S-S-(C1-C8-알킬)로 치환된 C1-C8-알킬, (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다)로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐로 치환된 C1-C8-알킬; 또는 페닐; 또는 -NO2로 치환된 페닐을 나타내는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸, 더 바람직하게는 메틸 또는 에틸을 나타내는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R1은
    Figure pct00582

    을 나타내고, 여기서 R10, R11, R12 및 R13은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C8-알킬을 나타내고; #은 O의 위치를 나타내는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 페닐로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내고, 상기 페닐은
    Figure pct00583
    로 추가로 치환되고, 여기서 Z는 O 또는 NH, 바람직하게는 O이고, #은 상기 페닐의 위치를 나타내는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 페닐로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내고, 상기 페닐은
    Figure pct00584
    로 추가로 치환되고, 여기서 #은 상기 페닐의 위치를 나타내는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R1은
    Figure pct00585
    (n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10);
    Figure pct00586
    ; 또는
    Figure pct00587
    (n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)을 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타내는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, ●는 예컨대 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 바람직하게는 에틸, -CH2-페닐,
    Figure pct00588
    과 같은 소분자를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타내거나;
    ●는 임의적으로 치환된 페닐을 나타내거나;
    ●는 방사성 또는 비-방사성 핵종, 비오틴, 리포터 효소, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 아미노산, 펩티드, 또는 임의적으로 치환된 5 또는 6원 헤테로방향족 시스템을 나타내고;
    여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    ●는 비오틴을 나타내거나;
    ●는 CY5 또는 EDANS를 나타내거나;
    ●는 임의적으로 C1-C8-알킬, C1-C8-알콕시, 할로겐, -CN, -NO2, -NH2, -N(C1-C8-알킬), -N(C1-C8-알킬)2 -COOH, -COO(C1-C8-알킬), -O-C(O)-(C1-C8-알킬), -C(O)N-(C1-C8-알킬), -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환체로 치환된, 바람직하게는 임의적으로 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된, 페닐을 나타내거나;
    ●는 임의적으로 C3-C8-사이클로알킬; 3 내지 8개의 고리 구성원을 갖고 헤테로원자(들)이 N, O, S로부터 선택된 헤테로사이클릴; C1-C8-알콕시; 할로겐; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-알킬); -N(C1-C8-알킬)2; -COOH; -COO(C1-C8-알킬); -O-C(O)-(C1-C8-알킬); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-알킬)2; -C(O)NH-(C1-C8-알킬); -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬), 바람직하게는 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2, 페닐 또는 헤테로방향족 시스템, 단당류, 다당류, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 중합체, 아미노산, 형광단, 단백질 태그 (1세대 치환체)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환된, C1-C8-알킬을 나타내고, 여기서 1세대 치환체는 다시 임의적으로 C3-C8-사이클로알킬; 3 내지 8개의 고리 구성원을 갖고 헤테로원자(들)이 N, O, S로부터 선택된 헤테로사이클릴; C1-C8-알콕시; 할로겐; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-알킬); -N(C1-C8-알킬)2; -COOH; -COO(C1-C8-알킬); -O-C(O)-(C1-C8-알킬); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-알킬)2; -C(O)NH-(C1-C8-알킬); -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬), 바람직하게는 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2, 페닐 또는 헤테로방향족 시스템 (2세대 치환체)으로 치환될 수 있고, 2세대 치환체는 다시 동일한 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환될 수 있고, 이러한 치환은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10세대까지 지속될 수 있거나;
    ●는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하거나;
    ●는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, ●는 약물, 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 단백질, 펩티드, 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, ●는 링커 또는 링커-약물 접합체를 나타내는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00589
    는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00590
    는 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 더 바람직하게는 세툭시맙 또는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙; 단백질, 바람직하게는 GFP 단백질 또는 eGFP-단백질, 알부민, 트리펩티드, 바람직하게는 화학식 (VIII)의 펩티드
    Figure pct00591
    ,
    또는 화학식 (IX)의 펩티드
    Figure pct00592

    를 나타내고, 여기서 #은 S의 위치를 나타내는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00593
    는 항체를 나타내고,
    ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00594
    는 단백질을 나타내고,
    ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00595
    는 펩티드를 나타내고,
    ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00596
    는 아미노산을 나타내고,
    ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00597
    는 항체를 나타내고,
    ●는 링커, 약물, 또는 링커-약물 접합체를 나타내는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00598
    는 뉴클레오티드를 나타내고,
    ●는 펩티드, 단백질, 단백질 태그, 항체, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00599
    는 뉴클레오티드를 나타내고,
    ●는 링커를 나타내는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00600
    는 올리고뉴클레오티드를 나타내고,
    ●는 펩티드, 단백질, 단백질 태그, 항체, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00601
    는 올리고뉴클레오티드를 나타내고,
    ●는 링커를 나타내는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제22항, 제26항 내지 제29항, 제31항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ●는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 여기서 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합되고, 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제25항, 제28항, 제29항 및 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00602
    는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 여기서 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합되는 것인 방법.
  37. (I) 화학식 (Ia) 또는 화학식 (I*a)의 화합물을 고체 지지체에 결합된 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 화학식 (Ib) 또는 화학식 (I*b)의 화합물을 생성하고;
    (II) 화학식 (Ib) 또는 화학식 (I*b)의 화합물을 고체 지지체로부터 절단시켜 화학식 (I) 또는 화학식 (I*)의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는, 화학식 (I) 또는 화학식 (I*)의 화합물의 제조 방법:
    Figure pct00603

    Figure pct00604

    Figure pct00605

    Figure pct00606

    Figure pct00607

    Figure pct00608

    상기 식에서,
    L은 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 결합하기에 적합한 링커를 나타내고;
    Figure pct00609
    , X, Y, V 및 R1은 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같고;
    Z는 고체 지지체에 결합된 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고;
    ●는 링커 L을 통해 Y에 결합된 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
  38. 제37항에 있어서, 링커 L은
    Figure pct00610
    이고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1인 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 화학식 (Ia) 또는 (I*a)의 화합물은 고체 지지체에 결합된 펩티드 또는 고체 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 고체 지지체에 결합된 펩티드와 반응되는 것인 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 절단이 산성 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I) 또는 화학식 (I*)의 화합물을 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같이 화학식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00611
    및
    Figure pct00612
    이 동일한 분자에 있는 것인 방법.
  43. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00613
    및
    Figure pct00614
    이 동일한 분자에 있는 것인 방법.
  44. 화학식 (I)의 화합물:
    Figure pct00615

    상기 식에서, ●,
    Figure pct00616
    , R1, X 및 Y는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  45. 제44항에 있어서,
    Figure pct00617
    은 이중 결합을 나타내고, X는 (R3 R4)C를 나타내고, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내는 것인 화합물.
  46. 제44항에 있어서,
    Figure pct00618
    은 삼중 결합을 나타내고, X는 R3-C를 나타내고, R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내는 것인 화합물.
  47. 화학식 (I*)의 화합물:
    Figure pct00619

    상기 식에서, X는 (R3 R4)C를 나타내고, R1, R3, R4, V, Y 및 ●는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  48. 화학식 (III)의 화합물:
    Figure pct00620

    상기 식에서,
    Figure pct00621
    는 단일 결합을 나타내고, X는 (R3 R4)C를 나타내고, 여기서 R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내거나;
    Figure pct00622
    는 이중 결합을 나타내고, X는 R3C을 나타내고, 여기서 R3은 H 또는 C1-C8-알킬을 나타내고;
    Figure pct00623
    , ●, R1, 및 Y는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  49. 화학식 (III*)의 화합물:
    Figure pct00624

    상기 식에서, X는 (R3 R4)C를 나타내고,
    Figure pct00625
    , ●,V, Y, R1, R3 및 R4는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 S인 화합물.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 임의적으로 (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), F, Cl, Br, I, -NO2, -N(C1-C8-알킬)H, -NH2, -N3, -N(C1-C8-알킬)2, =O, C3-C8-사이클로알킬, -S-S-(C1-C8-알킬), 히드록시-(C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), C2-C8-알케닐, C2-C8-알키닐 중 적어도 하나로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내거나;
    R1은 임의적으로 C1-C8-알킬, (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다), F, Cl, I, Br, -NO2, -N(C1-C8-알킬)H, -NH2 또는 -N(C1-C8-알킬)2 중 적어도 하나로 독립적으로 치환된 페닐을 나타내거나;
    R1은 피리딜과 같은 5 또는 6원 헤테로방향족을 나타내고;
    바람직하게는, R1은 C1-C8-알킬, -S-S-(C1-C8-알킬)로 치환된 C1-C8-알킬, (C1-C8-알콕시)n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다)로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐로 치환된 C1-C8-알킬; 또는 페닐; 또는 -NO2로 치환된 페닐을 나타내는 것인 화합물.
  52. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸, 더 바람직하게는 메틸 또는 에틸을 나타내는 것인 화합물.
  53. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, R1은
    Figure pct00626
    을 나타내고, 여기서 R10, R11, R12 및 R13은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C8-알킬을 나타내고; #은 O의 위치를 나타내는 것인 화합물.
  54. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 페닐로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내고, 상기 페닐은
    Figure pct00627
    로 추가로 치환되고, 여기서 Z는 O 또는 NH, 바람직하게는 O이고, #은 상기 페닐의 위치를 나타내는 것인 화합물.
  55. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 페닐로 치환된 C1-C8-알킬을 나타내고, 상기 페닐은
    Figure pct00628
    로 추가로 치환되고, 여기서 #은 상기 페닐의 위치를 나타내는 것인 화합물.
  56. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, R1은
    Figure pct00629
    (n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10);
    Figure pct00630
    ; 또는
    Figure pct00631
    (n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)를 나타내고, 여기서 #은 O의 위치를 나타내는 것인 화합물.
  57. 제44항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    ●는 예컨대 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 바람직하게는 에틸, -CH2-페닐,
    Figure pct00632
    과 같은 소분자를 나타내고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타내거나;
    ●는 임의적으로 치환된 페닐을 나타내거나;
    ●는 방사성 또는 비-방사성 핵종, 비오틴, 리포터 효소, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 아미노산, 펩티드, 또는 임의적으로 치환된 5 또는 6원 헤테로방향족 시스템을 나타내고;
    여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  58. 제44항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    ●는 비오틴을 나타내거나;
    ●는 CY5 또는 EDANS를 나타내거나;
    ●는 임의적으로 C1-C8-알킬, C1-C8-알콕시, 할로겐, -CN, -NO2, -NH2, -N(C1-C8-알킬), -N(C1-C8-알킬)2 -COOH, -COO(C1-C8-알킬), -O-C(O)-(C1-C8-알킬), -C(O)N-(C1-C8-알킬), -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환체로 치환된, 바람직하게는 임의적으로 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된, 페닐을 나타내거나;
    ●는 임의적으로 C3-C8-사이클로알킬; 3 내지 8개의 고리 구성원을 갖고 헤테로원자(들)이 N, O, S로부터 선택된 헤테로사이클릴; C1-C8-알콕시; 할로겐; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-알킬); -N(C1-C8-알킬)2; -COOH; -COO(C1-C8-알킬); -O-C(O)-(C1-C8-알킬); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-알킬)2; -C(O)NH-(C1-C8-알킬); -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬), 바람직하게는 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2, 페닐 또는 헤테로방향족 시스템, 단당류, 다당류, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 중합체, 아미노산, 형광단, 단백질 태그 (1세대 치환체)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환된, C1-C8-알킬을 나타내고, 여기서 1세대 치환체는 다시 임의적으로 C3-C8-사이클로알킬; 3 내지 8개의 고리 구성원을 갖고 헤테로원자(들)이 N, O, S로부터 선택된 헤테로사이클릴; C1-C8-알콕시; 할로겐; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-알킬); -N(C1-C8-알킬)2; -COOH; -COO(C1-C8-알킬); -O-C(O)-(C1-C8-알킬); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-알킬)2; -C(O)NH-(C1-C8-알킬); -N(H)-C(O)-(C1-C8-알킬), 바람직하게는 C1-C8-알콕시, -COOH, -COO(C1-C8-알킬 및 NO2, 페닐 또는 헤테로방향족 시스템 (2세대 치환체)으로 치환될 수 있고, 2세대 치환체는 다시 동일한 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환될 수 있고, 이러한 치환은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10세대까지 지속될 수 있거나;
    ●는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 당류, 다당류, 중합체, 임의적으로 치환된 C1-C8-알킬, 임의적으로 치환된 페닐, 또는 임의적으로 치환된 방향족의 5 또는 6원 헤테로사이클릭 시스템을 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하거나;
    ●는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  59. 제44항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, ●는 약물, 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 단백질, 펩티드, 항체 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  60. 제44항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, ●는 링커 또는 링커-약물 접합체를 나타내는 것인 화합물.
  61. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00633
    는 아미노산, 펩티드, 단백질, 항체, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내는 것인 화합물.
  62. 제48항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00634
    는 항체, 바람직하게는 lgG-항체, 더 바람직하게는 세툭시맙 또는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙; 단백질, 바람직하게는 GFP 단백질 또는 eGFP-단백질, 알부민, 트리펩티드, 바람직하게는 화학식 (VIII)의 펩티드
    Figure pct00635
    ,
    또는 화학식 (IX)의 펩티드
    Figure pct00636

    를 나타내고, 여기서 #은 S의 위치를 나타내는 것인 화합물.
  63. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00637
    는 항체를 나타내고,
    ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  64. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00638
    는 단백질을 나타내고,
    ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  65. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00639
    는 펩티드를 나타내고,
    ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  66. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00640
    는 아미노산을 나타내고,
    ●는 단백질 태그, 또는 CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  67. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00641
    는 항체를 나타내고,
    ●는 링커, 약물, 또는 링커-약물 접합체를 나타내는 것인 화합물.
  68. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00642
    는 뉴클레오티드를 나타내고,
    ●는 펩티드, 단백질, 단백질 태그, 항체, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  69. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00643
    는 뉴클레오티드를 나타내고,
    ●는 링커를 나타내는 것인 화합물.
  70. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00644
    는 올리고뉴클레오티드를 나타내고,
    ●는 펩티드, 단백질, 단백질 태그, 항체, 올리고뉴클레오티드, CY5 또는 EDANS와 같은 형광단, 비오틴, 또는 소분자를 나타내고; 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하는 것인 화합물.
  71. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00645
    는 올리고뉴클레오티드를 나타내고,
    ●는 링커를 나타내는 것인 화합물.
  72. 제44항 내지 제59항, 제61항 내지 제66항, 제68항 및 제70항 중 어느 한 항에 있어서, ●는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 여기서 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합되고, 여기서 임의적으로 ●는 Y에 결합된 링커를 추가로 포함하고, 바람직하게는 화합물은 화학식의 화합물인 화합물.
  73. 제72항에 있어서, 화합물은 화학식 (I) 또는 화학식 (I*)의 화합물인 화합물.
  74. 제48항 내지 제62항, 제65항, 제66항, 제68항 내지 제71항 및 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00646
    는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 여기서 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합되는 것인 화합물.
  75. 고체 지지체, 및 화학식 (Ia)의 화합물, 및/또는 화학식 (I*a)의 화합물을 포함하는 키트:
    Figure pct00647

    Figure pct00648

    상기 식에서,
    L은 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 결합하기에 적합한 링커이고;
    Figure pct00649
    , R1, X, Y, 및 V는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  76. 제75항에 있어서, 링커 L은
    Figure pct00650
    이고, 여기서 #은 Y의 위치를 나타내고, m 및 n은 각각 독립적으로 0 내지 20, 0 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1의 정수이고, 바람직하게는 m은 1이고 n은 1인 화합물.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 펩티드, 하나 이상의 뉴크레오티드, 및/또는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 키트.
  78. 화학식 (IIIa)의 화합물:
    Figure pct00651

    상기 식에서,
    Figure pct00652
    는 단일 결합을 나타내고, X는 (R3 R4)C을 나타내거나;
    Figure pct00653
    는 이중 결합을 나타내고, X는 R3-C를 나타내고;
    Figure pct00654
    , ●, R1, X 및 Y는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  79. 화학식 (III*a)의 화합물:
    Figure pct00655

    상기 식에서, X는 (R3 R4)C를 나타내고,
    Figure pct00656
    , ●, V, Y, R1, R3, 및 R4는 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
KR1020207028795A 2018-03-07 2019-03-06 알켄 또는 알킨-포스포노티올레이트 및 -포스포네이트로의 화학선택적 티올-접합 KR20200138750A (ko)

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