BR112020018093A2 - Conjugação quimiosseletiva de tiol com fosfonotiolatos e fosfonatos de alqueno ou alquino - Google Patents

Conjugação quimiosseletiva de tiol com fosfonotiolatos e fosfonatos de alqueno ou alquino Download PDF

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Christian Hackenberger
Alice Leonie BAUMANN
Marc-André KASPER
Stephen Byrne
Jonas Helma-Smets
Heinrich Leonhardt
Tina STOSCHECK
Marcus GERLACH
Dominik Schumacher
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Abstract

a presente invenção se refere a novos conjugados e processos para a preparação dos mesmos. um processo para a preparação de fosfonotiolatos e fosfonatos de alqueno ou alquino compreende a etapa de: reagir um composto de fórmula (i) com uma molécula contendo tiol de fórmula (ii) em que representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma c1-c8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída ou um sistema heterocíclico de 5 ou de 6 membros aromático opcionalmente substituído; resultando em um composto de fórmula (iii).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGAÇÃO QUIMIOSSELETIVA DE TIOL COM
FOSFONOTIOLATOS E FOSFONATOS DE ALQUENO OU ALQUINO". ANTECEDENTES
[001] As reações quimiosseletivas e bio-ortogonais surgiram como ferramentas poderosas para a modificação específica de sítio de proteínas (Hackenberger, C.P.R.; Schwarzer, D. Angew. Chemie - Int. Ed. 2008, 47 (52), 10030; Spicer, C.D.; Davis, B.G. Nat. Commun. 2014, 5, 4740). Com essas reações, vários conjugados de proteínas e anticorpos tornaram-se acessíveis, os quais carregavam módulos funcionais como fluoróforos e outros marcadores espectroscópicos, polímeros, toxinas, bem como pequenas moléculas e proteínas que se assemelham a modificações de proteínas pós-tradução. Desse modo, as técnicas de modificação quimiosseletiva de proteínas têm contribuído enormemente para estudos fundamentais, que vão desde a investigação das funções biológicas das proteínas e o desenvolvimento de novas técnicas de imagem até novas abordagens medicinais promissoras em diagnósticos, o projeto de produtos farmacêuticos à base de proteínas e a entrega direcionada de drogas.
[002] Nos últimos anos, pesquisadores têm se concentrado principalmente em dois aspectos diferentes na engenharia genética de reações bio-ortogonais para a modificação de proteínas (Sletten, por exemplo, M.; Bertozzi, C. R. Angew. Chemie - Int. Ed. 2009, 48 (38), 6974). Por um lado, muitos esforços têm sido dedicados a reações rápidas que requerem materiais de partida altamente reativos para a transformação de funcionalidades únicas presentes nas cadeias laterais de proteínas (Patterson, D.M.; Nazarova, L.A.; Prescher, J.A. ACS Chem. Biol. 2014, 9 (3), 592; Lang, K.; Chin, J.W. ACS Chem. Biol. 2014,
9 (1), 16). Esta abordagem é complementada por técnicas avançadas de supressão de âmbar para atingir uma marcação específica de sítio, o que resultou em uma série de repórteres bio-ortogonais geneticamente codificados e altamente reativos para sofrer vários tipos de reações de cicloadição, incluindo cicloadição alquino-azida promovida por cepa ou Reações de Diels-Alder de demanda inversa (Nikic, I.; Plass, T.; Schraidt, O.; Szymaski, J.; Briggs, J.A.G.; Schultz, C.; Lemke, E.A.
Angew.
Chemie - Int.
Ed. 2014, 53 (8), 2245; Agard, N.J.; Prescher, J.A.; Bertozzi, C.R.J.
Am.
Chem.
Soc. 2004, 126 (46), 15046). Por outro lado, pesquisadores se concentraram no desenvolvimento e aplicação de reações de modificação de proteínas de alto rendimento, especialmente se grandes quantidades de conjugados de proteínas funcionais e conversões quantitativas idealmente forem desejadas para evitar etapas de purificação tediosas, senão impossíveis (1). Para conseguir isso, altos rendimentos na expressão de proteínas são de particular importância.
Uma vez que a supressão de âmbar pode resultar em baixas quantidades de proteína expressa, sistemas de expressão padrão e auxotróficos são frequentemente preferidos.
Um cenário comum para alcançar a marcação específica de sítio em combinação com a expressão de proteína padrão é a colocação de um resíduo Cys exclusivo em uma proteína de escolha por mutagênese dirigida a sítio, seguido por estratégias de modificação de Cys (Chalker, J.M.; Bernardes, G.J.L.; Lin, Y.A.; Davis, B.G.
Chem. - An Asian J. 2009, 4 (5), 630). Alternativamente, aminoácidos contendo azida ou alquino podem ser incorporados usando sistemas de expressão auxotróficos (Hoesl, M.G.; Budisa, N.
Angew.
Chemie - Int.
Ed. 2011, 50 (13), 2896), que podem ser modificados usando ligações Staudinger e cicloadição de azida- alquino catalisada por Cu (CuAAC) (Artner, L.M.; Merkel, L.; Bohlke, N.;
Beceren-Braun, F.; Weise, C.; Dernedde, J.; Budisa, N.; Hackenberger, C.P.R. Chem. Commun. 2012, 48 (4), 522; van Kasteren, S.I.; Kramer, H.B.; Jensen, H.H.; Campbell, S.J.; Kirkpatrick, J.; Oldham, N.J.; Anthony, D.C.; Davis, B.G. Nature 2007, 446 (7139), 1105).
[003] Embora esses dois aspectos tenham visto avanços significativos nos últimos anos, uma acessibilidade geral e modular de módulos funcionais altamente reativos e complexos para uma reação de modificação quimiosseletiva sem metal permanece frequentemente um desafio. Isso se deve à necessidade de manipulações adicionais de grupos de proteção na síntese de blocos de construção reativos, o que pode ser problemático à luz da alta reatividade e labilidade dos grupos funcionais empregados. Por exemplo, a síntese de um peptídeo fluorescente contendo ciclo-octina altamente reativo carregando um Xe- criptofano para imagiologia molecular, exigiu um uso sofisticado, mas de baixo rendimento, de grupos de proteção ortogonais (Witte, C.; Martos, V.; Rose, H.M.; Reinke, S.; Klippel, S.; Schröder, L.; Hackenberger, C.P.R. Angew. Chemie - Int. Ed. 2015, 54 (9), 2806).
[004] Técnicas anteriores para a conjugação de resíduos Cys baseiam-se principalmente na conjugação de maleimida. No entanto, os conjugados de maleimida são frequentemente instáveis, em particular, eles frequentemente tendem a hidrolisar e são propensos a troca de tiol em altas concentrações de tiol. Para uma visão geral abrangente recente das técnicas de conjugação de Cys, vide Gunnoo, S. B.; Madder, A.; ChemBioChem. 2016, 17, 529-553. Como método de conjugação alternativo, WO 2015/169784 divulga um processo para a preparação de peptídeos e proteínas em ponte C2-dissulfeto, em que a ponte é alcançada por uma reação de tiol-in com alquinos. US2535174 descreve a adição alcalina catalisada de mercaptanos alifáticos saturados a ésteres de ácidos etenofosfônicos. J. Bertran-Vicente et al., Nature Comm. 2016, 7, DOI: 10.1038/ncomms12703, descreve uma sequência, em que um fosfito protegido reage primeiro com um dissulfeto eletrofílico para gerar um éster fosfotiolato, que após a desproteção (por exemplo, por luz UV ou base) produz uma cisteína fosforilada. Este método foi aplicado à síntese de peptídeos de cisteína fosforilados de ocorrência natural.
[005] É um objetivo da presente invenção fornecer outros processos de preparação de conjugados e fornecer outros conjugados.
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[006] O versado na técnica está ciente de que os termos "um/uma" ou "o/a", conforme usados no presente pedido, podem, dependendo da situação, significar "um (1)" "um (1) ou mais" ou "pelo menos um (1)".
[007] Halogênio, a menos que definido de outra forma: elementos do 7º grupo principal, preferivelmente flúor, cloro, bromo e iodo, mais preferivelmente flúor, cloro e bromo e, em combinação com Mg ainda mais preferivelmente bromo.
[008] Alquila, a menos que definido de outra forma: radicais de hidrocarbonetos saturados de cadeia linear ou ramificada tendo preferivelmente átomos de carbono (C1-C8), (C1-C6) ou (C1-C4). Exemplos: metila, etila, propila, 1-metiletila, butila, etc.
[009] Alquenila, a menos que definido de outra forma: radicais de hidrocarbonetos insaturados de cadeia linear ou ramificada tendo uma ligação dupla. Alquenila é preferivelmente (C2-C8), (C2-C6) ou (C2-C4)- alquenila. Exemplos: etenila, 1-propenila, 3-butenila, etc.
[010] Alquinila, a menos que definido de outra forma: radicais de hidrocarbonetos insaturados de cadeia linear ou ramificada tendo uma ligação tripla. Alquinila é preferivelmente (C2-C8), (C2-C6) ou (C2-C4)- alquinila. Exemplos: etinila, 1-propinila, etc.
[011] Alcóxi (radical alquila -O-), a menos que definido de outra forma em outro lugar: um radical alquila que está ligado por meio de um átomo de oxigênio (-O-) à estrutura básica. Alcóxi é preferivelmente (C1- C8), (C1-C6) ou (C1-C4)-alcóxi. Exemplos: metóxi, etóxi, propóxi, 1- metiletóxi, etc.
[012] Analogamente, alquenóxi e alquinóxi, a menos que definido de outra forma em outro lugar, são radicais alquenila e radicais alquinila, respectivamente, que estão ligados por meio de -O- à estrutura básica. Alquenóxi é preferivelmente (C2-C8), (C2-C6) ou (C2-C4)-alquenóxi. Alquinóxi é preferivelmente (C3-C10), (C3-C6) ou (C3-C4)-alquinóxi.
[013] Alquilcarbonila (radical alquila -C(=O)-), a menos que definido de outra forma: alquilcarbonila é preferivelmente (C1-C8), (C1- C6) ou (C1-C4)-alquilcarbonila. Aqui, o número de átomos de carbono se refere ao radical alquila no grupo alquilcarbonila.
[014] Analogamente, alquenilcarbonila e alquinilcarbonila são, a menos que definido de outra forma: radicais alquenila e radicais alquinila, respectivamente, que estão ligados via -C(=O)- à estrutura básica. Alquenilcarbonila é preferivelmente (C2-C8), (C2-C6) ou (C2-C4)- alquenilcarbonila. Alquinilcarbonila é preferivelmente (C2-C8), (C2-C6) ou (C2-C4)-alquinilcarbonila.
[015] Alcoxicarbonila (radical alquila -O-C(=O)-), a menos que definido de outra forma: alcoxicarbonila é preferivelmente (C1-C8), (C1- C6) ou (C1-C4)-alcoxicarbonila. Aqui, o número de átomos de carbono se refere ao radical alquila no grupo alcoxicarbonila.
[016] Analogamente, alquenoxicarbonila e alquinoxicarbonila, a menos que definido de outra forma em outro lugar, são: radicais alquenila e radicais alquinila, respectivamente, que estão ligados via - O-C(=O)- à estrutura básica. Alquenoxicarbonila é preferivelmente (C2- C8), (C2-C6) ou (C2-C4)-alquenoxicarbonila. Alquinoxicarbonila é preferivelmente (C3-C8), (C3-C6) ou (C3-C4)-alquinoxicarbonila.
[017] Alquilcarbonilóxi (radical alquila -C(=O)-O-), a menos que definido de outra forma em outro lugar: um radical alquila que está ligado por meio de um grupo carbonilóxi (-C(=O)-O-) pelo oxigênio à estrutura básica. alquilcarbonilóxi é preferivelmente (C1-C8), (C1-C6) ou (C1-C4)- alquilcarbonilóxi.
[018] Analogamente, alquenilcarbonilóxi e alquinilcarbonilóxi, a menos que definido de outra forma, são: radicais alquenila e radicais alquinila, respectivamente, que estão ligados por meio de (-C(=O)-O-) à estrutura básica. Alquenilcarbonilóxi é preferivelmente (C2-C8), (C2-C6) ou (C2-C4)-alquenilcarbonilóxi. Alquinilcarbonilóxi é preferivelmente (C2- C8), (C2-C6) ou (C2-C4)-alquinilcarbonilóxi.
[019] Alquiltio, a menos que definido de outra forma em outro lugar: um radical alquila que está ligado por meio de -S- à estrutura básica. alquiltio é preferivelmente (C1-C8), (C1-C6) ou (C1-C4)-alquiltio.
[020] Analogamente, alqueniltio e alquiniltio, a menos que definido de outra forma em outro lugar, são: radicais alquenila e radicais alquinila, respectivamente, que estão ligados por meio de -S- à estrutura básica. Alqueniltio é preferivelmente (C2-C8), (C2-C6) ou (C2-C4)- alqueniltio. Alquiniltio é preferivelmente (C3-C8), (C3-C6) ou (C3-C4)- alquiniltio.
[021] O termo "substituído" ou "opcionalmente substituído", ou semelhante, conforme usado, a menos que definido de outra forma em outro lugar, se refere a um padrão de substituição muito amplo. Como pode ser visto na divulgação da presente invenção, especialmente a posição R1, e permitem a substituição por numerosas moléculas orgânicas (macro). É afirmado que a estrutura dessas moléculas não é relevante para o processo presentemente divulgado e os conjugados resultantes. Assim, seria uma limitação indevida limitar o princípio deste novo e inovador conceito a apenas algumas moléculas. No entanto, é afirmado que o termo se refere a substituintes orgânicos ou sais dos mesmos, respectivamente, que podem ser novamente substituídos várias vezes por outros substituintes orgânicos ou sais dos mesmos,
respectivamente. Exemplos de tais substituintes complexos foram produzidos e são apresentados neste pedido (vide, por exemplo, Esquemas 7, 8, Figura 4 e os exemplos sintéticos). De preferência, o termo substituído se refere a grupos que são substituídos por um ou mais substituintes selecionados a partir de nitro, ciano, Cl, F, Cl, Br, - NH-R, NR2, COOH, -COOR, -OC(O)R -NH2, -OH, -CONH2 CONHR, CON(R)2, -SR, -SH, -C(O)H, -C(O)R, (C1-C20)-alquila, (C1-C20)-alcóxi, (C2-C20)-alila, anéis (hetero)cíclicos de 3 a 8 membros do anel em que, se presentes, o heteroátomo ou átomos são independentemente selecionados a partir de N, O e S, sistemas (hetero)aromáticos com 5 a 12 átomos no anel (por exemplo, fenila, piridila, naftila, etc.), em que R novamente pode representar qualquer um desses substituintes e a substituição pode ser repetida várias vezes, por exemplo, a substituição pode ser repetida por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes; vide, por exemplo, o substituinte no seguinte:
[022] em que # representa a posição de Y (enxofre ou oxigênio nos compostos usados neste documento) se já faz parte de um composto de por exemplo, fórmula (I) ou (III). No entanto, o especialista irá concordar que uma cadeia alquila que é substituída, por exemplo, com um polissacarídeo de 40 unidades não pode ser simplesmente descrita pelo padrão geral de substituição.
[023] Os termos "peptídeo", tal como aqui utilizados, referem-se a um composto orgânico que compreende dois ou mais aminoácidos covalentemente unidos por ligações peptídicas (ligação amida). Os peptídeos podem ser referidos em relação ao número de aminoácidos constituintes, ou seja, um dipeptídeo contém dois resíduos de aminoácidos, um tripeptídeo contém três, etc. Os peptídeos contendo dez ou menos aminoácidos podem ser referidos como oligopeptídeos, enquanto aqueles com mais de dez resíduos de aminoácidos, por exemplo, com até cerca de 30 resíduos de aminoácidos, são polipeptídeos. Os aminoácidos podem formar pelo menos um círculo ou uma cadeia ramificada ou não ramificada ou suas misturas. Proteínas e anticorpos são peptídeos e, portanto, englobados pelo termo, mas podem ser nomeados separadamente, devido à sua importância.
[024] O termo "aminoácido", tal como aqui utilizado, se refere a um composto orgânico tendo um grupo -CH(NH3)-COOH. Em uma modalidade, o termo "aminoácido" se refere a um aminoácido natural arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, asparagina, histidina, serina, treonina, tirosina, cisteína, metionina, triptofano, alanina, isoleucina, leicina, fenilalanina, valina, prolina e glicina. No entanto, o termo em seu significado mais amplo também abrange aminoácidos de ocorrência não natural.
[025] Os aminoácidos e peptídeos de acordo com a invenção também podem ser modificados em grupos funcionais. Exemplos não limitativos são sacarídeos, por exemplo, N-Acetilgalactosamina (GalNAc), ou grupos de proteção, por exemplo, modificações ou ésteres de fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc).
[026] O termo "proteína" se refere a peptídeos que compreendem uma ou mais cadeias longas de resíduos de aminoácidos, por exemplo, com mais de cerca de 30 resíduos de aminoácidos. As proteínas desempenham uma vasta gama de funções in vivo e in vitro, incluindo catalisar reações metabólicas, replicação de DNA, responder a estímulos e transportar moléculas e catalisar reações. As proteínas são desdobradas em uma estrutura tridimensional específica. Os resíduos em uma proteína são frequentemente modificados quimicamente, por exemplo, por modificação pós-tradução, que altera as propriedades físicas e químicas, desdobramento, estabilidade, atividade e, em última análise, a função das proteínas. Às vezes, as proteínas têm grupos não peptídicos anexados, que podem ser chamados de grupos protéticos ou cofatores. As proteínas, incluindo enzimas e coenzimas, também podem trabalhar juntas para atingir uma função específica e frequentemente se associam para formar complexos de proteínas estáveis. Todas essas formas são abrangidas pelo termo "proteína".
[027] O termo "marcadores de proteína", tal como aqui utilizado, se refere a sequências peptídicas que podem ser anexadas a proteínas ou outros compostos compreendendo tiol através do ligante de acordo com a presente invenção para vários fins. Exemplos não limitativos para marcadores de proteína são marcadores de afinidade, marcadores de solubilização, marcadores de cromatografia, marcadores de epitopo e enzimas repórter.
[028] Os marcadores de afinidade são anexados a proteínas e outros compostos compreendendo tiol através do ligante de acordo com a presente invenção de modo que possam ser, por exemplo, purificados usando uma técnica de afinidade. Estes incluem, por exemplo, proteína de ligação à quitina (CBP), proteína de ligação à maltose (MBP) e glutationa-S-transferase (GST) ou a marcador poli(His).
[029] Marcadores de solubilização podem ser usados para auxiliar no desdobramento adequado das proteínas e evitar que elas precipitem. Estes incluem tioredoxina (TRX) e poli(NANP). Alguns marcadores de afinidade têm um papel duplo como agente de solubilização, como MBP e GST.
[030] Os marcadores de cromatografia são usados para alterar as propriedades cromatográficas da proteína para permitir uma resolução diferente em uma técnica de separação particular. Frequentemente, estes consistem em aminoácidos polianiônicos, como marcador FLAG.
[031] Marcadores de epitopo são sequências peptídicas curtas que são escolhidas porque os anticorpos de alta afinidade podem ser produzidos de forma confiável em muitas espécies diferentes. Geralmente são derivados de genes virais. As marcas de epitopo incluem V5-marcador, marcador Myc, marcador HA e marcador NE.
Estes marcadores são particularmente úteis para experimentos de Western blotting, imunofluorescência e imunoprecipitação e purificação de anticorpos.
[032] O termo "enzimas repórter", tal como aqui utilizado, se refere a qualquer enzima conhecida que permite um aumento de um sinal em uma detecção bioquímica. Exemplos não limitativos são, enzimas formadoras de corantes, tais como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano silvestre (HRP) ou glicose oxidase (GOX); proteínas fluorescentes, tais como a proteína fluorescente verde (GFP), GFP sensível a redox (RoGFP), Azurita ou Emeralda; luciferase, isto é, uma classe de enzimas oxidativas que produzem bioluminescência (por exemplo, luciferase de pirilampo (EC 1.13.12.7)); cloranfenicol acetiltransferase (CAT); β-galactosidase; ou β-glucuronidase.
[033] Exemplos não limitativos de marcadores de proteína são: AviTag, um peptídeo que permite a biotinilação pela enzima BirA e, portanto, a proteína pode ser isolada por estreptavidina (GLNDIFEAQKIEWHE), marcador calmodulina, um peptídeo ligado pela proteína calmodulina (marcador KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), poliglamato, um peptídeo que se liga de forma eficiente a uma resina de troca aniônica, como Mono- Q (EEEEEE), E-marcador, um peptídeo reconhecido por um anticorpo (GAPVPYPDPLEPR), marcador FLAG, um peptídeo reconhecido por um anticorpo (DYKDDDDK), marcador HA, um peptídeo de hemaglutinina reconhecido por um anticorpo (YPYDVPDYA) marcador His, 5-10 histidinas ligadas por um quelato de níquel ou cobalto (HHHHHH), marcador Myc, um peptídeo derivado de c-myc reconhecido por um anticorpo (EQKLISEEDL), marcador NE, um novo peptídeo sintético de 18 aminoácidos (TKENPRSNQEESYDDNES) reconhecido por um anticorpo IgG1 monoclonal, que é útil em um amplo espectro de aplicações, incluindo Western blotting, ELISA, citometria de fluxo, imunocitoquímica, imunoprecipitação e purificação de afinidade de proteínas recombinantes, S-marcador, um peptídeo derivado de Ribonuclease A (KETAAAKFERQHMDS), marcador SBP, um peptídeo que se liga a estreptavidina (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQG QREP), Softag 1, para expressão de mamífero (SLAELLGQREP), Softag 3, para expressão procariótica (TQDPSRVG), marcador Strep, um peptídeo que se liga à estreptavidina ou à estreptavidina modificada chamada estreptactina (marcador Strep-II: WSHPQFEK), TC marcador, um marcador de tetracisteína que é reconhecido por compostos biarsênicos FlAsH e ReAsH (CCPGCC), marcador V5, um peptídeo reconhecido por um anticorpo (GKPIPNPLLGLDST), marcador VSV, um peptídeo reconhecido por um anticorpo (YTDIEMNRLGK), marcador Xpress (DLYDDDDK), Isopeptag, um peptídeo que se liga covalentemente à proteína pilina-C (TDKDMTITFTNKKDAE), que se liga covalentemente a um peptídeo SpyTag, SpyTag, à proteína SpyCatcher (AHIVMVDAYKPTK), SnoopTag, um peptídeo que se liga covalentemente à proteína SnoopCatcher (KLGDIEFIKVNK), BCCP (Proteína Transportadora de Carboxil Biotina), um domínio de proteína biotinilado por BirA permitindo o reconhecimento por estreptavidina, marcador Glutationa-S-transferase, uma proteína que se liga à glutationa imobilizada, marcador de proteína fluorescente verde, uma proteína que é espontaneamente fluorescente e pode ser ligada por nanocorpos, marcador Halo, uma hidrolase mutada que se liga covalentemente à Resina HaloLink™ (Promega), marcador de proteína de ligação de maltose, uma proteína que se liga a agarose de amilose, marcador Nus, marcador de tiorredoxina, marcador Fc, derivada do domínio Fc de imunoglobulina, permite a dimerização e solubilização.
Pode ser usado para purificação em Proteína-A Sefarose, marcadores desordenados intrinsecamente projetados contendo aminoácidos promotores de desordens (P, E, S, T, A, Q, G,..), fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano silvestre (HRP) glicose oxidase (GOX), proteína fluorescente verde (GFP), GFP sensível a redox (RoGFP), Azurita, Esmeralda, luciferase de pirilampo (EC 1.13.12.7)), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), β-galactosidase, β-glucuronidase, tubulina- tirosina ligase (TTL).
[034] O termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, pretende referir- se a moléculas de imunoglobulina, preferivelmente compreendidas por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) que são tipicamente interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada pode compreender, por exemplo, três domínios CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é composta por um domínio (CL). As regiões VH e VL podem ser subdivididas adicionalmente em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é tipicamente composta por três CDRs e até quatro FRs arranjadas do terminal amino ao terminal carbóxi, por exemplo, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
[035] Tal como aqui utilizado, o termo "Regiões Determinantes de Complementaridade" (CDRs; por exemplo, CDR1, CDR2 e CDR3) se refere aos resíduos de aminoácidos de um domínio variável de anticorpo, cuja presença é necessária para a ligação a antígeno. Cada domínio variável normalmente tem três Regiões CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Cada região determinante de complementaridade pode compreender resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" como definido por Kabat (por exemplo, cerca dos resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95- 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada); e/ou os resíduos de um "loop hipervariável" (por exemplo, sobre os resíduos 26-32 (L1), 50- 52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada). Em alguns casos, uma região determinante de complementaridade pode incluir aminoácidos de uma região CDR definida de acordo com Kabat e um loop hipervariável.
[036] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser atribuídos a diferentes "classes". Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários destes podem ainda ser divididos em "subclasses" (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Uma classe preferida de imunoglobulinas para uso na presente invenção é IgG.
[037] Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamados de [alfa], [delta], [épsilon], [gama] e [mu], respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Tal como aqui utilizado, os anticorpos são anticorpos convencionalmente conhecidos e seus fragmentos funcionais.
[038] Um "fragmento funcional" ou "fragmento de anticorpo de ligação a antígeno" de um anticorpo/imunoglobulina é definido como um fragmento de um anticorpo/imunoglobulina (por exemplo, uma região variável de uma IgG) que retém a região de ligação a antígeno. Uma "região de ligação a antígeno" de um anticorpo normalmente é encontrada em uma ou mais regiões hipervariáveis de um anticorpo, por exemplo, as regiões CDR1, -2 e/ou -3; no entanto, as regiões variáveis de "estrutura" também podem desempenhar um papel importante na ligação a antígeno, como fornecendo uma estrutura para as CDRs. De preferência, a "região de ligação a antígeno" compreende pelo menos resíduos de aminoácidos 4 a 103 da cadeia leve variável (VL) e 5 a 109 da cadeia pesada variável (VH), mais preferivelmente resíduos de aminoácidos 3 a 107 de VL e 4 a 111 de VH, e particularmente preferidas são as cadeias VL e VH completas (posições de aminoácidos 1 a 109 de VL e 1 a 113 de VH; numeração de acordo com WO 97/08320).
[039] "Fragmentos funcionais", "fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno" ou "fragmentos de anticorpo" da invenção incluem, mas não estão limitados a fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos de domínio único (DAbs), anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (scFv); e multiespecíficos, tais como bi e tri-específicos, anticorpos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Um anticorpo diferente de um anticorpo "multiespecífico" ou "multifuncional" é entendido como tendo cada um dos seus sítios de ligação idênticos. O F(ab')2 ou Fab pode ser projetado para minimizar ou remover completamente as interações dissulfeto intermoleculares que ocorrem entre os domínios CH1 e CL.
[040] O termo "região Fc" aqui é usado para definir uma região C- terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma modalidade, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana se estende de Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma aqui, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado de índice EU.
[041] As variantes dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno contemplados na invenção são moléculas nas quais a atividade de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação a antígeno é mantida.
[042] "Proteínas de ligação" contempladas na invenção são, por exemplo, miméticos de anticorpos, tais como Aficorpos, Adnectinas, Anticalinas, DARPins, Avímeros, Nanocorpos.
[043] Um anticorpo "humano" ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é definido como aquele que não é quimérico (por exemplo, não "humanizado") e não de (no todo ou em parte) uma espécie não humana. Um anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode ser derivado de um humano ou pode ser um anticorpo humano sintético. Um "anticorpo humano sintético" é definido neste documento como um anticorpo tendo uma sequência derivada, no todo ou em parte, in silico de sequências sintéticas que são baseadas na análise de sequências de anticorpos humanos conhecidas. O projeto in silico de uma sequência de anticorpo humano ou seu fragmento pode ser alcançado, por exemplo, analisando uma base de dados de sequências de anticorpo humano ou fragmento de anticorpo e criando uma sequência de polipeptídeo utilizando os dados obtidos a partir dela. Outro exemplo de um anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é aquele que é codificado por um ácido nucleico isolado de uma biblioteca de sequências de anticorpos de origem humana (por exemplo, tal biblioteca sendo baseada em anticorpos obtidos de uma fonte natural humana).
[044] Um "anticorpo humanizado" ou fragmento de ligação a antígeno humanizado do mesmo é definido aqui como aquele que é (i) derivado de uma fonte não humana (por exemplo, um camundongo transgênico que carrega um sistema imunológico heterólogo), cujo anticorpo é baseado em uma sequência de linhagem germinativa humana; (ii) onde os aminoácidos das regiões estruturais de um anticorpo não humano são parcialmente trocados por sequências de aminoácidos humanos por engenharia genética ou (iii) CDR enxertado, em que as CDRs do domínio variável são de origem não humana, enquanto uma ou mais estruturas do domínio variável são de origem humana e o domínio constante (se houver) é de origem humana.
[045] Um "anticorpo quimérico" ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é definido aqui como um, em que os domínios variáveis são derivados de uma origem não humana e alguns ou todos os domínios constantes são derivados de uma origem humana.
[046] O termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado, se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto para possíveis mutações, por exemplo, mutações de ocorrência natural, que podem estar presentes em quantidades menores. Assim, o termo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpos monoclonais são vantajosas por serem tipicamente não contaminadas por outras imunoglobulinas. O termo "monoclonal" não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. O termo anticorpo monoclonal inclui especificamente anticorpos quiméricos, humanizados e humanos.
[047] Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado de um componente da célula que o expressou. Os componentes contaminantes da célula são materiais que interferem no uso diagnóstico ou terapêutico do anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos.
[048] Tal como aqui utilizado, um anticorpo "liga-se especificamente a", é "específico para/para" ou "reconhece especificamente" um antígeno de interesse, por exemplo, um alvo de antígeno polipeptídico associado a tumor, é aquele que se liga ao antígeno com afinidade suficiente de modo que o anticorpo seja útil como um agente terapêutico no direcionamento de uma célula ou tecido que expressa o antígeno e não apresenta reação cruzada significativa com outras proteínas ou não reage significativamente de forma cruzada com proteínas diferentes de ortólogos e variantes (por exemplo, formas mutantes, variantes de emendas ou formas truncadas proteoliticamente) do antígeno alvo acima mencionado. O termo "reconhece especificamente" ou "liga-se especificamente a" ou é "específico para" um polipeptídeo específico ou um epitopo em um polipeptídeo alvo particular, tal como aqui utilizado, pode ser exibido, por exemplo, por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tendo um KD monovalente para o antígeno inferior a cerca de 10-4 M, alternativamente inferior a cerca de 10-5 M, alternativamente inferior a cerca de 10-6 M, alternativamente inferior a cerca de 10-7 M, alternativamente inferior a cerca de 10-8 M, alternativamente inferior a cerca de 10-9 M, alternativamente inferior a cerca de 10-10 M, alternativamente inferior a cerca de 10-11 M, alternativamente inferior a cerca de 10-12 M, ou menos. Um anticorpo "liga-se especificamente a", é "específico para/para" ou "reconhece especificamente" um antígeno se tal anticorpo for capaz de discriminar entre tal antígeno e um ou mais antígeno (s) de referência. Em sua forma mais geral, "ligação específica", "liga-se especificamente a", é "específico para/para" ou "reconhece especificamente" se refere à capacidade do anticorpo de discriminar entre o antígeno de interesse e um antígeno não relacionado, como determinado, por exemplo, de acordo com um dos seguintes métodos. Tais métodos compreendem, mas não estão limitados a ressonância plasmônica de superfície (SPR), Western blots, testes de ELISA, RIA, ECL, IRMA e varreduras de peptídeo. Por exemplo, pode ser realizado um ensaio ELISA padrão. A pontuação pode ser realizada por desenvolvimento de cor padrão (por exemplo, anticorpo secundário com peroxidase de rábano silvestre e tetrametilbenzidina com peróxido de hidrogênio). A reação em certos poços é classificada pela densidade óptica, por exemplo, a 450 nm. O fundo típico (= reação negativa) pode ser 0,1 OD; a reação positiva típica pode ser 1 OD. Isso significa que a diferença positivo/negativo é mais de 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes e, de preferência, mais de 100 vezes. Normalmente, a determinação da especificidade de ligação é realizada usando não um único antígeno de referência, mas um conjunto de cerca de três a cinco antígenos não relacionados, como leite em pó, BSA, transferrina ou semelhantes.
[049] "Afinidade de ligação" ou "afinidade" se refere à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula e seu parceiro de ligação. A menos que indicado de outra forma, como aqui utilizado, "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, um anticorpo e um antígeno). A constante de dissociação "KD" é comumente usada para descrever a afinidade entre uma molécula (como um anticorpo) e seu parceiro de ligação (como um antígeno), ou seja, quão firmemente um ligante se liga a uma proteína particular. As afinidades ligante-proteína são influenciadas por interações intermoleculares não covalentes entre as duas moléculas. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos. Em uma modalidade, o "KD" ou "valor KD" de acordo com esta invenção é medido usando ensaios de ressonância plasmônica de superfície usando dispositivos adequados incluindo, mas não se limitando a instrumentos Biacore como Biacore T100, Biacore T200, Biacore 2000, Biacore 4000, um Biacore 3000 (GE Healthcare Biacore, Inc.) ou um instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.).
[050] Os termos "nucleosídeo" e "porção de nucleosídeo", conforme aqui utilizados, referem-se a uma subunidade de ácido nucleico incluindo um grupo de açúcar e uma base heterocíclica, bem como análogos de tais subunidades, como um desoxirribonucleosídeo ou ribonucleosídeo modificado ou de ocorrência natural ou qualquer produto químico modificações dos mesmos. Outros grupos (por exemplo, grupos de proteção) podem ser anexados a qualquer componente (s) de um nucleosídeo. As modificações dos nucleosídeos incluem, mas não estão limitadas a, modificações de açúcar nas posições 2′, 3′ e 5′, modificações nas posições 5 e 6 da pirimidina, modificações nas posições 2, 6 e 8 de purina, modificações na aminas exocíclicas, substituição de 5-bromo-uracila e semelhantes. Os nucleosídeos podem ser adequadamente protegidos e derivatizados para permitir a síntese de oligonucleotídeos por métodos conhecidos no campo, tais como síntese automatizada de fase sólida usando monômeros de fosforamidito de nucleosídeo, acoplamento de H- fosfonato ou acoplamento de triéster de fosfato.
[051] Um "nucleotídeo" ou "porção de nucleotídeo" se refere a uma subunidade de um ácido nucleico que inclui um grupo fosfato, um grupo de açúcar e uma base heterocíclica, bem como análogos de tais subunidades. Outros grupos (por exemplo, grupos de proteção) podem ser ligados a qualquer componente (s) de um nucleotídeo. O termo "nucleotídeo" pode se referir a um desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo modificado ou de ocorrência natural. Os nucleotídeos em alguns casos incluem purinas e pirimidinas, que incluem timidina,
citidina, guanosina, adenina e uridina.
O termo "nucleotídeo" se destina a incluir aquelas porções que contêm não apenas as bases de purina e pirimidina conhecidas, por exemplo, adenina (A), timina (T), citosina (C), guanina (G) ou uracila (U), mas também outras bases heterocíclicas que foram modificadas.
Essas modificações incluem purinas metiladas ou pirimidinas, purinas aciladas ou pirimidinas, riboses alquiladas ou outros heterociclos.
Tais modificações incluem, por exemplo, diaminopurina e seus derivados, inosina e seus derivados, purinas alquiladas ou pirimidinas, purinas aciladas ou pirimidinas purinas tioladas ou pirimidinas e semelhantes, ou a adição de um grupo protetor, como acetila, difluoroacetila, trifluoroacetila, isobutirila, benzoila, 9- fluorenilmetoxicarbonila, fenoxiacetila, dimetilformamidina, dibutilformamidina, dimetilacetamidina, N,N-difenil carbamato ou semelhantes.
A base de purina ou pirimidina também pode ser um análogo do anterior; análogos adequados serão conhecidos dos especialistas na técnica e são descritos nos textos e literatura pertinentes.
Análogos comuns incluem, mas não estão limitados a, 1- metiladenina, 2-metiladenina, N6-metiladenina, N6-isopentiladenina, 2- metiltio-N6-isopentiladenina, N,N-dimetiladenina, 8-bromoadenina, 2- tiocitosina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, 5-etilcitosina, 4- acetilcitosina, 1-metilguanina, 2-metilguanina, 7-metilguanina, 2,2- dimetilguanina, 8-bromoguanina, 8-cloroguanina, 8-aminoguanina, 8- metilguanina, 8-tioguanina, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5- clorouracila, 5-iodouracila, 5-etiluracila, 5-propiluracila, 5-metoxiuracila, 5-hidroximetiluracila, 5-(carboxihidroximetil)uracila, 5-(metilaminometil)- uracila, 5-(carboximetilaminometil)-uracila, 2-tiouracila, 5-metil-2- tiouracila, 5-(2-bromovinil)uracila, ácido uracil-5-oxiacético, metil éster de ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracila, 1-metilpseudouracila, queosina, inosina, 1-metilinosina, hipoxantina, xantina, 2-aminopurina, 6-hidroxiaminopurina, 6-tiopurina e 2,6-diaminopurina.
[052] O termo "oligonucleotídeo", tal como aqui utilizado, se refere a um polinucleotídeo formado a partir de uma pluralidade de unidades de nucleotídeo ligadas como definido acima. Cada unidade de nucleotídeo inclui uma unidade de nucleosídeo ligada entre si por meio de um grupo de ligação de fosfato, ou um análogo do mesmo. O termo oligonucleotídeo também se refere a uma pluralidade de nucleotídeos que estão ligados entre si por meio de ligações diferentes de ligações de fosfato, como ligações de fosforotioato ou ligações de esquaramida. O oligonucleotídeo pode ser de ocorrência natural ou não natural. Em alguns casos, os oligonucleotídeos podem incluir monômeros de ribonucleotídeos (ou seja, podem ser oligoribonucleotídeos) e/ou monômeros de desoxirribonucleotídeos. Como exemplos ilustrativos, os oligonucleotídeos podem compreender de 2 a 50 unidades de nucleotídeos, por exemplo, de 2 a 40 unidades de nucleotídeos, por exemplo, de 5 a 35 unidades de nucleotídeos, por exemplo, de 10 a 35 unidades de nucleotídeos, por exemplo, de 15 a 30 unidades de nucleotídeos.
[053] O termo "monossacarídeo", conforme usado neste documento, se refere a um composto de cadeia aberta ou cíclico de fórmula geral Cm(H2O)n em que m é 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 e n é 2, 3, 4, 5 6, 7 ou
8. No entanto, o termo também abrange derivados destes compostos básicos em que um grupo OH é substituído por um grupo NH2 (tal como glucosamina), desoxissacarídeos, em que pelo menos um grupo OH é substituído por H (por exemplo, desoxirribose). Os exemplos preferidos de monossacáridos são D-(+)-Glicerinaldeído; D-(-)- Eritrose; D-(-)-treose; D- (-)- Ribose; D-(-)-Arabinose; D-(+)-xilose; D-(-)-Lixose; D-(+)-Alose; D-(+)- Altrose; D-(+)-Glicose; D-(+)-Manose; D-(-)-Gulose; D-(-)-Idose; D-(+)- Galactose; D-(+)-Talose; Di-idroxiacetona; D-Eritrulose; D-Ribulose; D- xilulose; D-Psicose; D-Frutose; D-Sorbose; D-marcadoratose. O termo monossacarídeo também abrange monossacarídeos em que um, dois, três ou quatro grupos hidroxila são substituídos.
[054] O termo "polissacarídeos" se refere a moléculas compreendendo pelo menos 2 (dois), de preferência pelo menos 5 (cinco), mais preferivelmente pelo menos 10 (dez) monossacarídeos que estão conectados por meio de uma ligação glicosídica.
[055] Um carboidrato, conforme usado aqui, abrange um monossacarídeo e um polissacarídeo e seus derivados.
[056] Um polímero, tal como aqui utilizado, se refere a macromoléculas compostas por muitas subunidades orgânicas repetidas, no entanto, que não são polissacarídeos, oligonucleotídeos ou peptídeos. Exemplos de polímeros são polietilenoglicol (PEG), polioxietileno (PEO) ou poliglicerol (por exemplo, poliglicerol- poliricinoleato (PGPR).
[057] O termo "fluoróforo" é bem conhecido do versado na técnica e se refere a compostos químicos que reemitem luz após excitação de luz. Exemplos não limitativos são CY5, EDANS, derivados de xanteno (por exemplo, fluoresceína, Rodamina, verde de Oregon, eosina, vermelho do Texas), derivados de cianina (por exemplo, indocarbocianina, oxacarbocianina, merocianina), derivados de Sraína (por exemplo, Seta, Se Tau, corantes quadrados), Derivados de naftaleno (por exemplo, derivados de dansila ou prodano), derivados de cumarina, derivados de oxadiazol, derivados de antraceno (por exemplo, antracinonas, como DRAQ5, DRAQ7, CyTRAK Orange), derivados de pireno (por exemplo, azul em cascata), derivados de oxazina (por exemplo, vermelho do Nilo, Azul do Nilo, violeta de Cresila), derivados de Acridina (por exemplo, proflavina, laranja de acridina, amarelo de acridina), derivados de Arilmetina (por exemplo, Auramina, Violeta de cristal, Verde malaquita) ou derivados de tetrapirrol (por exemplo, Parfina, Ftal ocianina, Bilirrubina).
[058] O termo "resíduo alifático ou aromático", tal como aqui utilizado, se refere a um substituinte alifático, por exemplo, um resíduo alquila que, no entanto, pode ser opcionalmente substituído por outros substituintes alifáticos e/ou aromáticos, por exemplo, um resíduo alifático pode ser um ácido nucleico, um peptídeo, uma proteína, uma enzima, uma coenzima, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um monossacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, um fluoróforo, benzeno opcionalmente substituído, etc. desde que a ligação direta de tal molécula à estrutura central (no caso de R1, por exemplo, para o respectivo oxigênio de um composto de, por exemplo, fórmula (I), (I*), (III) ou (III*)) é alifático. Um resíduo aromático é um substituto, em que a ligação direta à estrutura central é parte de um sistema aromático, por exemplo, uma fenila ou piridila ou peptídeo opcionalmente substituído, se a ligação direta do peptídeo à estrutura central for, por exemplo, através de um resíduo de fenila.
[059] O termo "conjugado anticorpo-droga" ou ADC abreviado é bem conhecido por um versado na técnica e, conforme usado neste documento, se refere à ligação de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo com uma droga, tal como um agente quimioterápico, uma toxina, um agente imunoterapêutico, uma sonda de imagem e semelhantes. Tal como aqui utilizado, um "ligante" é qualquer porção química que liga um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno covalentemente à droga. O ligante pode ser qualquer ligante conhecido por um especialista na técnica. Tal como aqui utilizado, o termo "conjugado droga ligante" se refere a uma molécula ou grupo químico compreendendo ou consistindo em um ligante como definido anteriormente e uma droga. A este respeito, o termo "conjugado droga ligante" em geral se refere à parte de um conjugado anticorpo droga que não é o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em geral, em um conjugado ligante droga, o ligante está covalentemente ligado à droga. Como um exemplo ilustrativo, o ligante usado na invenção pode compreender um peptídeo autoclivável, que pode ser clivado por uma enzima, por exemplo, catepsina B.
Em particular, o ligante compreendendo um peptídeo de autoclavagem utilizado na invenção pode compreender valina-citrulina-p-
aminobenziloxicarbonil (VC-PAB, ), valina-
alanina-p-aminobenziloxicarbonila (VA-PAB, ), lisina-fenilalanina-p-aminobenziloxicarbonila (KF-PAB,
) ou valina-lisina-p-aminobenziloxicarbonila
(VK-PAB, ). Por exemplo, o ligante compreendendo um peptídeo de autoclivagem pode ser,
, ,
, ou ,
preferivelmente , em que # indica a posição do Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e * indica a posição da droga, e m e n são, cada um, independentemente, um número inteiro de, por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. Ligantes com um peptídeo de clivagem são, por exemplo, divulgados na publicação do pedido de patente US 2006/0074008, GM Dubowchik et al., Bioconjuate Chem. 2002, 13, 855-869 ou S.O.
Doronina et al., Nature Biotechnology, vol. 21, 778-784 (2003), toda a divulgação destes documentos é aqui incorporada por referência.
O conjugado ligante-droga pode ser,
em que # indica a posição de Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e m e n são, cada um, independentemente, um número inteiro de por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. Como um exemplo ilustrativo, uma droga utilizada na invenção pode ser uma auristatina, preferivelmente monometil auristatina E (MMAE) ou monometil auristatina F (MMAF). De preferência, a auristatina, em particular MMAE ou MMAF, pode ser utilizada em combinação com um peptídeo autoclivável, tal como, por exemplo, VC-PAB, VA-PAB, KF-PAB ou VK- PAB.
Por conseguinte, um conjugado droga ligante usado aqui pode compreender VC-PAB-MMAE, VC-PAB-MMAF, VA-PAB-MMAE, VA- PAB-MMAF, KF-PAB-MMAE, KF-PAB-MMAF, VK-PAB- MMAE ou VK- PAB-MMAF.
Em particular, o conjugado droga ligante pode ser
, ,
, ,
, , ou , preferivelmente ou , mais preferivelmente , em que # indica a posição de Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e m e n são, cada um, independentemente, um número inteiro de, por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1.
[060] Também são descritos aqui "conjugados anticorpo fluoróforo" ou abreviado AFC, que se refere à ligação de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo com um fluoróforo, tal como, por exemplo, CY5. O fluoróforo pode ser ligado ao anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo através de um ligante. O ligante pode ser qualquer ligante conhecido por um versado na técnica. O conjugado de anticorpo fluoróforo pode compreender um "conjugado ligante fluoróforo". Tal como aqui utilizado, o termo "conjugado ligante fluoróforo" se refere a uma molécula ou grupo químico compreendendo ou consistindo em um ligante como aqui definido antes, e um fluoróforo. A este respeito, o termo "conjugado ligante fluoróforo" em geral se refere à parte de um conjugado de fluoróforo de anticorpo que não é o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em geral, em um conjugado ligante fluoróforo, o ligante está covalentemente ligado ao fluoróforo.
[061] O termo "molécula pequena", tal como aqui utilizado, denota uma molécula orgânica compreendendo pelo menos dois átomos de carbono, mas preferivelmente não mais do que 7, 12, 15 ou 20 ligações de carbono rotativas, mais preferivelmente não mais do que 7, 12 ou 15 ligações de carbono rotativas, ainda mais preferivelmente não mais do que 7 ou 12 ligações de carbono rotativas, tendo um peso molecular na faixa entre 100 e 2000 Dalton, preferivelmente entre 100 e 1000 Dalton, e opcionalmente incluindo um ou dois átomos de metal. Como exemplos meramente ilustrativos para pequenas moléculas de biotina e os fluoróforos EDANS e CY5 podem ser mencionados. Processos
[062] A presente invenção fornece uma nova reação de compostos compreendendo tiol com alqueno ou fosfonotiolatos de alquino e fosfonatos. O Esquema 1 descreve a reação geral de acordo com a presente invenção e utiliza a título de exemplos ilustrativos fosfonotiolatos e fosfonatos de etenila e etinila. Esquema 1: = resíduo alifático ou aromático: por exemplo, biotina, fluoróforo, moléculas pequenas, aminoácidos, peptídeo, proteína, anticorpo, nucleotídeo, oligonucleotídeo = molécula contendo tiol: por exemplo, aminoácido, peptídeo, proteína, anticorpo, nucleotídeo, oligonucleotídeo
R1 = resíduo alifático ou aromático Y = S (enxofre), O (oxigênio)
[063] Afirma-se que os processos aqui descritos permitem combinar uma grande quantidade de diferentes resíduos orgânicos nas posições R1, e . Em particular, os processos de acordo com a invenção são adequados para formar conjugados quando é um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo. Como uma vantagem, os grupos tiol presentes em tal aminoácido, peptídeo, proteína ou anticorpo, tais como, por exemplo, um grupo tiol de um resíduo de cisteína, ou grupos tiol presentes em um nucleotídeo ou oligonucleotídeo, reagem quimiosseletivamente com o fosfonotiolato ou fosfonato de alqueno ou alquino, proporcionando assim um método de modificação quimiosseletivo. Devido a tal quimioseletividade, o composto contendo tiol, em particular o aminoácido, peptídeo, proteína, anticorpo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo, pode estar desprotegido, o que significa que os grupos de proteção não são necessários. Os fosponotiolatos ou fosfonatos de alqueno ou alquino podem ser fosfonotiolatos ou fosfonatos de alqueno ou alquino deficiente em elétrons.
[064] Além disso, os processos de acordo com a invenção permitem a conjunção de duas moléculas complexas. Por exemplo, uma proteína pode ser acoplada a um anticorpo ou à outra proteína. É demonstrado aqui:  Síntese de fosfonotiolatos e fosfonatos de alqueno e alquino eletrofílicos;  Reações de conjugação de fosfonotiolatos e fosfonatos de alqueno e alquino deficientes em elétrons com moléculas contendo tiol, incluindo aminoácidos, peptídeos, proteínas e anticorpos;  Estabilidade desses conjugados sob condições fisiologicamente relevantes;
 A conjugação funciona sob condições fisiologicamente relevantes, como, por exemplo, pH fisiológico.
[065] A presente invenção apresenta vários aspectos inovadores, que facilitam ainda mais a acessibilidade de conjugados, como conjugados de anticorpos ou proteínas, com uma nova química de conjugação:  Uma reação para modificar tióis em uma variedade de compostos, por exemplo, em pequenas moléculas, proteínas e anticorpos;  Duas moléculas complexas (por exemplo, um fluoróforo e uma proteína ou um anticorpo) podem ser conectadas por uma conjugação direta, que é seletiva para a cisteína no caso de peptídeos, proteínas e anticorpos;  Alta estabilidade de conjugados em oposição aos reagentes de maleimida usuais; reações de conjugação rápidas;  Em contraste com outros métodos de modificação ou conjugação de peptídeos, proteínas e anticorpos, devido à seletividade da cisteína, não há necessidade de manipulações de grupos de proteção após a preparação do fosfonotiolato de fosfonotiolato de alqueno ou alquino, ou após a preparação de fosfonato de alqueno ou de alquino, e/ou após a conjugação quimiosseletiva;  Fosfonotiolatos insaturados exibem uma vantagem importante, porque reagem consideravelmente mais rápido na adição de tiol do que os fosfonatos correspondentes. Taxas de reação rápidas são altamente desejadas para reações de bioconjugação, visto que, assim, a conversão e também o rendimento podem ser aumentados. Os conjugados de tiol-fosfonotiolato resultantes mostram bons perfis de estabilidade sob condições fisiologicamente relevantes;  Alta estabilidade de fosfonotiolatos em condições ácidas tipicamente usadas para clivagem de peptídeo de suporte sólido após síntese em fase sólida.
[066] Poucos exemplos de fosfonotiolatos e adições de tiol a fosfonatos foram relatados, vide, por exemplo, documentos de patentes US3904710A, GB917085, GB863434, DE1064512 e as publicações de Gao et al., Chemistry Eur. J. 2009, 15 (9), 2064-2070; Khusinova et al., Russian Chemical Bulletin, Edição Internacional, 2004, vol. 53, No. 10, pp. 2253-2256, e Acheson et al., Journal of Chemical Research, Synopses, 1986. No entanto, nenhuma adição de tiol a fosfonotiolatos foi relatada nestes documentos. Além disso, estes documentos não se referem à modificação de biomoléculas, tais como, por exemplo, peptídeos, proteínas, anticorpos ou oligonucleotídeos, e eles não fazem qualquer referência às questões de taxa de reação e estabilidade em condições fisiologicamente relevantes.
[067] Geralmente, o processo de acordo com a presente invenção pode ser realizado para conjugar diferentes compostos, tais como moléculas pequenas (por exemplo, alquila opcionalmente substituída, fenila ou heterociclos), peptídeos, proteínas, anticorpos, oligonucleotídeos ou polissacarídeos com marcadores, proteínas, oligonucleotídeos etc. a presente invenção se refere a um processo para a preparação de um composto de fórmula (III), o referido processo compreendendo as etapas de: reagir um composto de fórmula (I) (I) em que representa uma ligação dupla ou ligação tripla; X representa R3-C quando é uma ligação tripla; X representa (R3R4)C quando é uma ligação dupla; Y representa S ou O;
R1 representa um resíduo alifático ou aromático opcionalmente substituído; R3 representa H ou C1-C8-alquila; R4 representa H ou C1-C8-alquila; e representa um resíduo alifático ou aromático; com uma molécula contendo tiol de fórmula (II) (II) em que representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída ou um sistema heterocíclico de 5 ou de 6 membros aromático opcionalmente substituído; resultando em um composto de fórmula (III) (III) em que representa uma ligação se em um composto de fórmula (I) representa uma ligação dupla; ou representa uma ligação dupla se em um composto de fórmula (I) representa uma ligação tripla; e , , R1, X e Y são como definidos para os compostos de fórmula (I) e (II).
[068] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção onde um composto de fórmula (I) é reagido com um composto de fórmula (II) para dar um composto de fórmula (III), representa uma ligação dupla, X representa (R3 R4)C, R3 e R4 representam, independentemente, H ou C1-C8-alquila e representa uma ligação. De preferência, R3 e R4 representam independentemente H ou C1-C6- alquila, mais preferivelmente H ou C1-C4-alquila, ainda mais preferivelmente H ou C1-C2-alquila. Em modalidades preferidas, R3 e R4 são iguais. Em modalidades preferidas, R3 e R4 são ambos H.
[069] Alternativamente, em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, onde um composto de fórmula (I) é reagido com um composto de fórmula (II) para dar um composto de fórmula (III), representa uma ligação tripla, X representa R3-C, R3 representa H ou C1-C8-alquila e representa uma ligação dupla. Preferivelmente, R3 representa H ou C1-C6-alquila, mais preferivelmente H ou C1-C4- alquila, ainda mais preferivelmente H ou C1-C2-alquila. Em modalidades preferidas, R3 é H.
[070] Em qualquer um dos processos da invenção onde um composto de fórmula (I) é reagido com um composto de fórmula (II) para dar um composto de fórmula (III), Y pode ser S (enxofre) ou O (oxigênio). Quando Y é S, os compostos (I) e (III) representam fosfonotiolatos. Quando Y é O, os compostos (I) e (III) representam fosfonatos. Consequentemente, em algumas modalidades Y é S. Em algumas modalidades Y é O. Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos em que um composto de fórmula (I) é reagido com um composto de fórmula (II) para dar um composto de fórmula (III) Y é S. Os presentes inventores descobriram que a adição de tióis de fórmula (II) à ligação tripla ou ligação dupla de um fosfonotiolato, ou seja, quando Y é S, é consideravelmente mais rápida do que a adição aos fosfonatos correspondentes, ou seja, quando Y é O. Essa taxa de reação mais rápida é altamente desejada, uma vez que assim a conversão e o rendimento são aumentados.
[071] Uma preparação de um composto de fórmula (I) pode compreender: reagir um composto de fórmula (IV)
(IV) em que R1, X, Y e são como definidos acima e abaixo; com um oxidante para formar o composto de fórmula (I). O oxidante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em hidroperóxido de terc-butila (tBu-OOH), ácido meta-cloroperoxibenzoico (mCPBA), peróxido de hidrogênio (H2O2), iodo (I2), peroximonossulfato de potássio ou oxigênio (O2), por exemplo, oxigênio do ar.
De preferência, o oxidante é hidroperóxido de terc-butila (tBu-OOH). Uma preparação de um composto de fórmula (IV) pode compreender: reagir, em ordem sequencial, um tri-haleto de fósforo (X), de preferência PCl3, com
(i) R1-OH (XI), (ii) (XII), em que R2 representa independentemente C1-C8-alquila, (iii) (XIII), em que Hal representa um halogênio selecionado a partir do grupo que consiste em
Cl, Br e I, preferivelmente Br, e (IV) (XIV) para formar o composto de fórmula (IV);
em que R1, X, Y, e são como definidos acima e abaixo.
O tri-haleto de fósforo pode ser PCl3, PBR3 ou PI3, com PCl3 sendo preferido.
R2 em (XII) representa independentemente C1- C8-alquila, preferivelmente C1-C6-alquila, mais preferivelmente C1-C4- alquila, ainda mais preferivelmente C1-C3-alquila.
De preferência, ambos os R2 são iguais.
Ainda mais preferivelmente, ambos os R2 são isopropila. De preferência, a etapa (iv), onde (XIV) é reagido, é realizada na presença de um tetrazol. O tetrazol pode ser tetrazol não substituído ou um tetrazol substituído.
[072] Alternativamente, quando Y é S, uma preparação de um composto de fórmula (I) pode compreender: reagir um composto de fórmula (V) (V) com um composto de fórmula (VIa) ou (VIb) ou (VIa) (VIb) para formar um composto de fórmula (I); em que EWG representa um grupo de remoção de elétrons, o referido grupo de remoção de elétrons sendo de preferência selecionado a partir do grupo que consiste em, , ,e , em que # indica a posição de S; Hal representa um halogênio selecionado a partir do grupo que consiste em Cl, Br e I, de preferência Cl, e em que R1, X, e são como definidos acima e abaixo. De preferência, no composto de fórmula (V) ambos os R1 são iguais. Mais preferivelmente, quando um composto de fórmula (VIa) é usado, EWG é . Os compostos de fórmula (V) podem ser preparados, por exemplo, por um processo que compreende: reagir (XX) com (XXI) para dar um composto de fórmula (V), em que R1, X, e são como aqui definidos acima e abaixo; e Hal1 é um halogênio selecionado a partir do grupo que consiste em Cl, Br e I, de preferência Cl; e Hal2 é um halogênio selecionado a partir do grupo que consiste em Cl, Br e I, de preferência Br. Os compostos de fórmula (VIa) podem ser preparados, por exemplo, reagindo um composto (XXX) com (XXXI) para dar um composto de fórmula (VIa), em que EWG é um grupo de remoção de elétrons, de preferência um grupo de remoção de elétrons selecionado a partir do grupo que consiste em , , e , em que # indica a posição de S, mais preferivelmente ; de preferência, no composto de fórmula (XXX) ambos os EWG são iguais; e em que é como definido acima e abaixo. Os compostos de fórmula VIb podem ser preparados de acordo com procedimentos conhecidos da literatura, por exemplo, reagindo um tiol (XXXI) com cloreto de sulfurila (vide, por exemplo, Allared, F. et al., Synthetic Metals, 120 (1-3), 1061-1062; 2001) ou cloreto de tionila (vide, por exemplo, Masaki, Yukio et al, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 33 (5), 1930-40; 1985), ou reagindo um tiol (XXXI) com N-clorossuccinimida (NCS) (vide, por exemplo, Kawamura, Takamasa et al. European Journal of Organic Chemistry, 2015 (4), 719-722; 2015) ou cloro (vide, por exemplo, por exemplo, Schneider, Chemische Berichte 84, 911-916 (1951), em que é como definido acima e abaixo.
[073] De preferência, quando um composto de fórmula (I) é preparado pela reação de um composto de fórmula (V) com um composto de fórmula (VIa) ou (VIb), no composto de fórmula (V) é uma ligação dupla e X representa (R3 R4) C, em que R3 e R4 são como definidos acima e abaixo.
[074] A presente invenção também se refere a um processo para a preparação de um composto de fórmula (III*) compreendendo a etapa de: reagir um composto de fórmula (I*) (I*) em que V representa C1-C8-alquila, preferivelmente metila, etila ou propila, mais preferivelmente metila; X representa (R3 R4)C; Y representa S ou O; R1 representa um resíduo alifático ou aromático opcionalmente substituído; R3 representa H ou C1-C8-alquila; R4 representa H ou C1-C8-alquila; e representa um resíduo alifático ou aromático; com uma molécula contendo tiol de fórmula (II) (II) em que representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída ou um sistema heterocíclico de 5 ou de 6 membros aromático opcionalmente substituído; resultando em um composto de fórmula (III*)
(III*) em que , V, R1, X e Y são como definidos para os compostos de fórmula (I*) e (II).
[075] Em qualquer um dos processos da invenção em que um composto de fórmula (I*) é reagido com um composto de fórmula (II) para dar um composto de fórmula (III*), Y pode ser S (enxofre) ou O (oxigênio), isto é, quando Y é S, os compostos (I*) e (III*) representam fosfonotiolatos, e quando Y é O, os compostos (I*) e (III*) representam fosfonatos. Por conseguinte, em algumas modalidades Y é S. Em algumas modalidades Y é O. Em modalidades preferidas de qualquer um dos métodos em que um composto de fórmula (I*) é reagido com um composto de fórmula (II) para dar um composto de fórmula (III*) Y é S, uma vez que os inventores descobriram que a adição de tióis à ligação tripla ou ligação dupla de um fofonotiolato, ou seja, quando Y é S, é consideravelmente mais rápida do que a adição aos fosfonatos correspondentes, ou seja, quando Y é O.
[076] Uma preparação de um composto de fórmula (I*) pode compreender: reagir um composto de fórmula (IV*) (IV*) em que X representa (R3 R4)C e Y, R1, R3, R4, V e são como aqui definidos acima e abaixo; com um oxidante para formar o composto de fórmula (I*). O oxidante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em hidroperóxido de terc-butila (tBu-OOH), ácido meta-cloroperoxibenzoico (mCPBA), peróxido de hidrogênio (H2O2), iodo (I2), peroximonossulfato de potássio ou oxigênio (O2), por exemplo, oxigênio do ar. De preferência, o oxidante é hidroperóxido de terc-butila (tBu-OOH). Uma preparação de um composto de fórmula (IV*) pode compreender: reagir, em ordem sequencial, um tri-haleto de fósforo (X), de preferência PCl3, com (i) R1-OH (XI), (ii) (XII), em que R2 representa independentemente C1-C8-alquila, (iii) (XIII*), em que Hal representa um halogênio selecionado a partir do grupo que consiste em Cl, Br e I, preferivelmente Br, e X representa (R3 R4)C, e (iv) (XIV) para formar o composto de fórmula (IV*); em que R1, R3, R4, V, Y e são como definidos acima e abaixo. O tri-haleto de fósforo pode ser PCl3, PBR3 ou PI3, com PCl3 sendo preferido. R2 em (XII) representa independentemente C1- C8-alquila, preferivelmente C1-C6-alquila, mais preferivelmente C1-C4- alquila, ainda mais preferivelmente C1-C3-alquila. De preferência, ambos os R2 são iguais. Ainda mais preferivelmente, ambos os R2 são isopropila. De preferência, a etapa (iv), onde (XIV) é reagido, é realizada na presença de um tetrazol. O tetrazol pode ser tetrazol não substituído ou um tetrazol substituído.
[077] Alternativamente, quando Y é S, uma preparação de um composto de fórmula (I*) pode compreender: reagir um composto de fórmula (V*) (V*)
com um composto de fórmula (VIa) ou (VIb) ou (VI (VIb) para formar um composto de fórmula (I*); em que EWG representa um grupo de remoção de elétrons, o referido grupo de remoção de elétrons sendo preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em , , e ,, em que # indica a posição de S; Hal representa um halogênio selecionado a partir do grupo que consiste em Cl, Br e I, de preferência Cl, e em que X representa (R3 R4)C e R1, R3, R4, V e são como definidos acima e abaixo. De preferência, no composto de fórmula (V*) ambos os R1 são iguais. Mais preferivelmente, quando um composto de fórmula (VIa) é usado, EWG é . Os compostos de fórmula (V*) podem ser preparados, por exemplo, por um processo que compreende: reagir (XX) com (XXI*) para dar um composto de fórmula (V*), em que X representa (R3 R4)C e R1, R3, R4 e V são como aqui definidos acima e abaixo; e Hal1 é um halogênio selecionado a partir do grupo que consiste em Cl, Br e I, de preferência Cl; e Hal2 é um halogênio selecionado a partir do grupo que consiste em Cl, Br e I, de preferência Br. Os compostos de fórmula (VIa) e (VIb) podem ser preparados, por exemplo, conforme descrito acima e abaixo.
[078] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa C1-C8-alquila opcionalmente substituída por pelo menos um de (C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, F, Cl, Br, I, -NO2, -N(C1-C8-alquila)H, -NH2, -N3, -N(C1-C8-alquila)2, =O, C3-C8- cicloalquila, –S-S-(C1-C8-alquila), hidróxi-(C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, C2-C8-alquenila ou C2-C8-alquinila.
[079] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa fenila opcionalmente substituída, tal como em que # representa a posição de O.
[080] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa fenila opcional e independentemente substituída por pelo menos um de C1-C8-alquila, (C1-C8-alcóxi)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, F, Cl, I, Br, -NO2, -N(C1-C8-alquila)H, -NH2 ou -N(C1- C8-alquila)2.
[081] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa um sistema heteroaromático de 5 ou 6 membros, como piridila.
[082] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa C1-C8-alquila, C1-C8-alquila substituída por –S- S-(C1-C8-alquila), C1-C8-alquila substituída por (C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, C1-C8-alquila substituída por fenila opcionalmente substituída; ou fenila; ou fenila substituída por –NO2.
[083] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa metila, etila, propila ou butila, de preferência metila ou etila.
[084] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa um resíduo alifático ou aromático que é opcionalmente substituído por –S-S-(C1-C8-alquila). Em uma modalidade preferida, R1 representa , em que R10, R11, R12 e R13 representam, cada um, independentemente, hidrogênio ou C1-C8-alquila; e # representa a posição de O.
Em uma modalidade mais preferida, R10, R11, R12 e R13 representam, cada um, independentemente, hidrogênio, metila ou etila.
Em uma modalidade preferida, R1 representa , em que R10 e R11 representam independentemente hidrogênio ou C1-C8-alquila; e # representa a posição de O.
Em uma modalidade mais preferida, R10 e R11 representam independentemente hidrogênio, metila ou etila.
Em uma modalidade ainda mais preferida, R1 representa
, em que R10 e R11 representam independentemente hidrogênio, metila ou etila; e # representa a posição de O.
Em algumas dessas modalidades, R10 e R11 são ambos hidrogênio.
Em algumas dessas modalidades, R10 é hidrogênio e R11 é C1-C6-alquila.
Em algumas dessas modalidades, R10 é hidrogênio e R11 é metila ou etila.
Em algumas dessas modalidades, R10 e R11 são iguais.
Em uma modalidade preferida, R1 representa
, mais preferivelmente
, em que R10 e R11 são como aqui definidos antes. Em outra modalidade preferida, R1 representa , em que R12 e R13 representam, independentemente, hidrogênio ou C1-C8-alquila; e # representa a posição de O. Em uma modalidade mais preferida, R12 e R13 representam independentemente hidrogênio, metila ou etila. Em uma modalidade ainda mais preferida, R1 representa , em que R12 e R13 representam independentemente hidrogênio, metila ou etila; e # representa a posição de O. Em algumas dessas modalidades, R12 e R13 são ambos hidrogênio. Em algumas dessas modalidades, R12 é hidrogênio e R13 é C1-C6-alquila. Em algumas dessas modalidades, R12 é hidrogênio e R13 é metila ou etila. Em algumas dessas modalidades, R12 e R13 são iguais.
[085] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa C1-C8-alquila substituída por fenila, a referida fenila sendo adicionalmente substituída por, , em que Z é O ou NH, e em que # representa a posição da referida fenila. Em algumas modalidades, Z é O. Em algumas modalidades Z é NH. A C1-C8-alquila no pode ser, por exemplo, metila, etila, propila ou butila; preferivelmente metila, etila ou propila; mais preferivelmente metila ou etila; mais preferivelmente metila. Em uma modalidade preferida, R1 representa , em que a C1-C8-alquila pode ser, por exemplo, metila, etila, propila ou butila; preferivelmente metila, etila ou propila; mais preferivelmente metila ou etila; mais preferivelmente metila; em que Z é O ou NH, e em que # representa a posição de O. Em outra modalidade preferida R1 representa , em que C1-C8-alquila pode ser, por exemplo, metila, etila, propila ou butila; preferivelmente metila, etila ou propila; mais preferivelmente metila ou etila; mais preferivelmente metila; em que Z é O ou NH, e em que # representa a posição de O.
[086] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa C1-C8-alquila substituída por fenila, sendo a referida fenila ainda substituída por , e em que # representa a posição da referida fenila. Em algumas modalidades, R1 representa C1-C8- alquila substituída por fenila, a referida fenila sendo adicionalmente substituída por , em que # representa a posição da referida fenila. Em uma modalidade preferida, R1 representa , em que # representa a posição de O. Em uma outra modalidade preferida, R1 representa , em que # representa a posição de O.
[087] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa , onde # representa a posição de O, e com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de preferência com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6; mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, 3, 4; ainda mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, 3, ainda mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, ainda mais preferivelmente com n = 0, 1; e mais preferivelmente com n = 1.
[088] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa um resíduo alifático ou aromático que é opcionalmente substituído por C2-C8-alquinila. Em uma modalidade preferida, R1 é homopropargila.
[089] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, R1 representa , em que # representa a posição de O, com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de preferência com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6; mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, 3, 4; ainda mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, 3, ainda mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, ainda mais preferivelmente com n = 0, 1; e mais preferivelmente com n = 1, isto é, quando n é 1, R1 representa .
[090] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, representa uma pequena molécula; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[091] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, representa uma pequena molécula, como, por exemplo,
uma C1-C8-alquila, -CH2-fenila, , ,
, , ,
, , ,
ou , em que # indica a posição de Y.
Em modalidades preferidas, representa uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, preferivelmente uma C1-C6- alquila opcionalmente substituída, mais preferivelmente uma C1-C4- alquila opcionalmente substituída, ainda mais preferivelmente C1-C2- alquila.
Em algumas modalidades, representa -CH2-fenila, isto é,
benzila.
Em modalidades preferidas, representa , em que # indica a posição de Y.
Em modalidades preferidas, representa
, em que # indica a posição de Y.
Em modalidades preferidas, representa , em que # indica a posição de Y.
Em modalidades preferidas, representa , em que # indica a posição de Y.
Em modalidades preferidas, representa
, em que # indica a posição de Y.
Em modalidades preferidas, representa , em que # indica a posição de Y.
Em modalidades preferidas, representa
, em que # indica a posição de Y.
Em alguns as modalidades, representam , em que # indica a posição de Y.
Em algumas modalidades, representa
, em que # indica a posição de Y.
Em algumas modalidades, representa , em que # indica a posição de Y.
[092] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, representa uma fenila opcionalmente substituída, de preferência , em que # indica a posição de Y.
[093] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, representa um nuclídeo radioativo ou não radioativo, biotina, uma enzima repórter, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo como CY5 ou EDANS, um aminoácido, um peptídeo, um sistema heteroaromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído; em que, opcionalmente o , adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Por conseguinte, em algumas modalidades representa um nuclídeo radioativo ou não radioativo. Em modalidades preferidas representa biotina. Em algumas modalidades, representa uma enzima repórter. Em modalidades preferidas representa um nucleotídeo. Em modalidades preferidas representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um fluoróforo como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas representa um aminoácido. Em modalidades preferidas representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um sistema heteroaromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[094] Ao longo desta especificação, sempre que for indicado em relação a qualquer processo ou qualquer composto que "opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y", ou semelhante, o pode adicionalmente compreender virtualmente qualquer ligante, e o ligante é ligado ao Y, o referido Y sendo, por exemplo, conforme estabelecido neste documento em relação a um composto de fórmula (I), (I*), (III) ou (III*), S (enxofre) ou O (oxigênio), de preferência S. O ligante pode ser qualquer ligante conhecido por um versado na técnica, por exemplo, um ligante peptídico ou uma porção à base de hidrocarboneto linear ou ramificado. O ligante também pode compreender porções cíclicas. Um ligante peptídico pode compreender, por exemplo, 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3 ou 2, ou 1 aminoácido (s). Se o ligante for uma porção à base de hidrocarboneto, a cadeia principal do ligante pode compreender apenas átomos de carbono, mas também pode conter heteroátomos, tais como átomos de oxigênio (O), nitrogênio (N) ou enxofre (S) e/ou pode conter grupos carbonila (C=O). O ligante pode ser, por exemplo, uma cadeia de átomos de carbono C1-C20 ou uma cadeia à base de poliéter, como uma cadeia à base de polietilenoglicol com -(O–CH2–CH2)- unidades de repetição. Em modalidades típicas de ligantes à base de hidrocarbonetos, a porção de ligação compreende entre 1 a cerca de 150, 1 a cerca de 100, 1 a cerca de 75, 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 30, ou 1 a cerca de 20, incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19 átomos da cadeia principal.
Como um exemplo ilustrativo, o ligante pode ser , em que # indica a posição de Y, e * indica a posição de outra parte de , em que a referida outra parte pode ser, como exemplos não limitativos, aminoácido, peptídeo, anticorpo, proteína, nucleotídeo, oligonucleotídeo ou molécula pequena; e m e n são cada um, independentemente, um número inteiro de, por exemplo, 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é
1. Os ligantes exemplares mencionados acima podem também ser usados, por exemplo, quando a presente especificação se referir a um "ligante" como tal, ou a um "conjugado ligante-droga", por exemplo, no contexto de um conjugado anticorpo-droga ou a um "conjugado ligante- fluoróforo", por exemplo, no contexto de um conjugado de anticorpo fluoróforo. Um especialista na técnica sabe como selecionar ligantes adequados.
[095] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, representa um peptídeo RGD cíclico de estrutura (VII) (c(RDGfK)) (VII) em que * representa a posição de Y.
[096] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, representa fenila, opcionalmente substituída por um, dois, três, quatro ou cinco substituintes selecionados independentemente do grupo que consiste em C1-C8-alquila, C1-C8-alcóxi, halogênio, -CN, - NO2, -NH2, -N(C1-C8-alquila), -N(C1-C8-alquil)2-COOH, -COO(C1-C8- alquila), -O-C(O)-(C1-C8-alquila), -C(O)N-(C1-C8-alquila), -N(H)-C(O)- (C1-C8-alquila) de preferência opcionalmente substituídos por um substituinte selecionado a partir do grupo que consiste de C1-C8-alcóxi, -COOH, -COO(C1-C8-alquila) e NO2.
[097] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, representa C1-C8-alquila, opcionalmente substituída por pelo menos um substituinte selecionado a partir do grupo que consiste em C3-C8-cicloalquila; heterociclila com 3 a 8 membros no anel em que o (s) heteroátomo (s) é selecionado (s) de N, O, S; C1-C8-alcóxi; halogênio; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-alquila); -N(C1-C8-alquila)2; -COOH; -COO(C1-C8-alquila); -O-C(O)-(C1-C8-alquila); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-alquila)2; -C(O)NH-(C1-C8-alquila); -N(H)-C(O)-(C1-C8- alquila), de preferência C1-C8-alcóxi, -COOH, -COO(C1-C8-alquila) e NO2, fenila ou um sistema heteroaromático, um monossacarídeo, um polissacarídeo, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um polímero, um aminoácido, um fluoróforo, um marcador de proteína (substituinte de 1ª geração), em que um substituinte de 1ª geração pode novamente ser opcionalmente substituído por C3-C8-cicloalquila; heterociclila com 3 a 8 membros do anel em que o (s) heteroátomo (s) é selecionado (s) a partir de N, O, S; C1-C8-alcóxi; halogênio; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-alquila); -N(C1-C8- alquila)2; -COOH; -COO(C1-C8-alquila); -O-C(O)-(C1-C8-alquila); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-alquila)2; -C(O)NH-(C1-C8-alquila); -N(H)-C(O)- (C1-C8-alquila), de preferência C1-C8-alcóxi, - COOH, -COO(C1-C8- alquila) e NO2, fenila ou um sistema heteroaromático (substituintes de 2ª geração) e em que um substituinte de 2ª geração pode ser substituído novamente por pelo menos um substituinte selecionado a partir do mesmo grupo e em que tal substituição pode ir até geração 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
[098] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos da invenção, representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída ou um sistema heterocíclico aromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas representa um aminoácido. Em modalidades preferidas representa um peptídeo. Em modalidades preferidas representa uma proteína. Em modalidades preferidas representa um anticorpo. Em modalidades preferidas representa um nucleotídeo. Em modalidades preferidas representa um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, representa um sacarídeo. Em algumas modalidades, representa um polissacarídeo. Em algumas modalidades, representa um polímero. Em algumas modalidades representa uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, de preferência uma C1-C6- alquila opcionalmente substituída, mais preferivelmente uma C1-C4- alquila opcionalmente substituída, ainda mais preferivelmente uma C1- C2-alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades representa uma fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, representa um sistema heterocíclico aromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[099] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Em modalidades mais preferidas representa um peptídeo, uma proteína, um anticorpo ou um oligonucleotídeo; em que, opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido. Em modalidades preferidas representa um peptídeo. Em modalidades preferidas representa uma proteína. Em modalidades preferidas representa um anticorpo. Em modalidades preferidas representa um nucleotídeo. Em modalidades preferidas representa um oligonucleotídeo. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[100] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa uma droga, um marcador de proteína ou um fluoróforo, tal como CY5 ou EDANS, biotina, uma proteína, um peptídeo, um anticorpo ou um oligonucleotídeo; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas representa uma droga. Em modalidades preferidas, representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um conjugado ligante-droga. Em modalidades preferidas, representa um fluoróforo como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas representa biotina. Em modalidades preferidas representa uma proteína. Em modalidades preferidas representa um peptídeo. Em modalidades preferidas representa um anticorpo. Em modalidades preferidas representa um oligonucleotídeo. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[101] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção representa um ligante ou um conjugado ligante-droga. Em modalidades preferidas representa um ligante, tal como, por exemplo, um ligante compreendendo VC-PAB, VA-PAB, KF-PAB ou VK-PAB, de preferência um ligante compreendendo VC-PAB. Em modalidades preferidas representa um conjugado ligante-droga, tal como, por exemplo, ,
,
ou , preferivelmente,
, em que # indica a posição de Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e m e n são cada um, independentemente, um número inteiro de, por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. Mais preferivelmente, o ligante conjugado de droga é,
, ,
, ,
, ,
, ou
, ainda mais preferivelmente ou
, o mais preferivelmente
, em que # indica a posição de Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e m e n são cada um, independentemente, um número inteiro de, por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1.
[102] De acordo com qualquer um dos processos da invenção, pode representar um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída ou um sistema heterocíclico aromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo. Em modalidades mais preferidas, representa um peptídeo, uma proteína, um anticorpo ou um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas representa um aminoácido. Em modalidades preferidas representa um peptídeo. Em modalidades preferidas representa uma proteína. Em modalidades preferidas representa um anticorpo. Em modalidades preferidas representa um nucleotídeo. Em modalidades preferidas representa um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, representa um sacarídeo. Em algumas modalidades, representa um polissacarídeo. Em algumas modalidades, representa um polímero. Em algumas modalidades representa uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, de preferência uma C1-C6-alquila opcionalmente substituída, mais preferivelmente uma C1-C4-alquila opcionalmente substituída, ainda mais preferivelmente uma C1-C2- alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades representa uma C3-C8-alquila opcionalmente substituída, de preferência uma C3-C6-alquila opcionalmente substituída, mais preferivelmente uma C3-C4-alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades representa uma C5-C8-alquila opcionalmente substituída, de preferência uma C6-C7-alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, representa uma fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, representa um sistema heterocíclico aromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído.
[103] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um anticorpo, preferivelmente um anticorpo IgG, mais preferivelmente um Cetuximab ou um Trastuzumab ou um Brentuximab; uma proteína, de preferência uma proteína GFP ou proteína eGFP, uma albumina, um tripeptídeo, de preferência um peptídeo de fórmula (VIII) (VIII), ou da fórmula (IX) (IX) em que # representa a posição de S. Consequentemente, em modalidades preferidas representa um anticorpo. Em modalidades mais preferidas, o anticorpo é um anticorpo IgG, ainda mais preferivelmente um Cetuximab ou um Trastuzumab ou um Brentuximab. Em modalidades preferidas representa uma proteína, mais preferivelmente uma proteína GFP ou proteína eGFP. Em modalidades preferidas representa uma albumina. Em modalidades preferidas, representa um tripeptídeo. Em modalidades preferidas,
representa um peptídeo de fórmula (VIII) (VIII). Em modalidades preferidas, representa um peptídeo de fórmula (VIII) (VIII). Em modalidades preferidas representa um peptídeo de fórmula (IX) (IX).
[104] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um anticorpo (por exemplo, um Cetuximab, Trastuzumab ou Brentuximab) e representa um marcador de proteína ou um fluoróforo, como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo ou uma pequena molécula; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa uma proteína. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[105] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa uma proteína (por exemplo, uma proteína GFP ou proteína eGFP) e representa um marcador de proteína ou um fluoróforo, como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, um anticorpo, uma proteína, um oligonucleotídeo ou uma pequena molécula; em que opcionalmente o adicional compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa um anticorpo. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa uma proteína. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[106] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um peptídeo e representa um marcador de proteína ou um fluoróforo como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo ou uma molécula pequena; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa uma proteína. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[107] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um aminoácido e representa um marcador de proteína ou um fluoróforo, como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo ou uma molécula pequena; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa uma proteína. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[108] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um anticorpo (por exemplo, um
Cetuximab, um Trastuzumab ou um Brentuximab) e representa um ligante, uma droga ou um conjugado ligante-droga.
Consequentemente, em modalidades preferidas representa um anticorpo e representa um ligante, tal como, por exemplo, um ligante compreendendo VC-PAB, VA-PAB, KF-PAB ou VK-PAB, de preferência um ligante compreendendo VC-PAB.
Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa uma droga.
Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa um conjugado ligante-droga, tal como, ,
,
, ou
, preferivelmente
, em que # indica a posição de Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e m e n são cada um, independentemente, um número inteiro de, por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. Em modalidades mais preferidas representa um anticorpo e representa um conjugado ligante-droga, como por exemplo,
, , , , , , , ou , ainda mais preferivelmente ou , o mais preferivelmente , em que # indica a posição do Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e m e n são cada um, independentemente, um inteiro de por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. Em qualquer uma destas modalidades, o anticorpo pode ser um Cetuximab, um Trastuzumab ou um Brentuximab, de preferência um Brentuximab.
[109] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um nucleotídeo e representa um peptídeo, uma proteína, um marcador de proteína, um anticorpo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo, tal como CY5 ou EDANS, biotina ou uma pequena molécula; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa uma proteína. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa um anticorpo. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[110] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um nucleotídeo e representa um ligante.
[111] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um oligonucleotídeo e representa um peptídeo, uma proteína, um marcador de proteína, um anticorpo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo, tal como CY5 ou EDANS, biotina ou uma pequena molécula; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa uma proteína. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa um anticorpo. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[112] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um oligonucleotídeo e representa um ligante.
[113] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, em que o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo está ligado a um suporte sólido. Em algumas modalidades, representa um aminoácido ou um peptídeo ligado a um suporte sólido. Em algumas modalidades, representa um nucleotídeo ou oligonucleotídeo ligado a um suporte sólido. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo ligado a um suporte sólido. Como uma vantagem, os inventores descobriram que os fosfonotiolatos da presente invenção são altamente estáveis sob condições ácidas que são tipicamente usadas para clivagem do peptídeo do suporte sólido, por exemplo, 90% de ácido trifluoroacético (TFA). O suporte sólido pode ser qualquer suporte sólido conhecido por um especialista na técnica que seja adequado para a síntese de peptídeos em fase sólida, ou qualquer suporte sólido que seja adequado para a síntese de oligonucleotídeos em fase sólida. Esses suportes sólidos também são conhecidos como resinas. Exemplos ilustrativos para um suporte sólido adequado para a síntese de peptídeos em fase sólida incluem suportes orgânicos e inorgânicos, como uma resina de poliestireno Merrifield (copolímero de estireno e 1-2% de divinil benzeno), resinas de poliacrilamida, TentaGel (um polímero de enxerto em que o polietilenoglicol é enxertado em poliestireno), resina Wang (tipicamente com base em poliestireno reticulado, como em uma resina Merrifield), ou vidro poroso tendo tamanho de poro definido como um exemplo para um suporte sólido inorgânico.
Os exemplos ilustrativos de suportes sólidos comercialmente disponíveis para a síntese de peptídeos em fase sólida são resinas de amida de Rink ou resinas NovaSyn®TGR fornecidas pela Merck Millipore.
Exemplos ilustrativos para um suporte sólido adequado para a síntese de oligonucleotídeos em fase sólida incluem vidro com tamanho de poro definido (vidro de poro controlado, CPG) e poliestireno, tal como poliestireno macroporoso (MPPS). Opcionalmente, nas modalidades anteriores, em que o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo está ligado a um suporte sólido, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y das fórmulas aqui divulgadas, em particular dos compostos (I), (III), (I*) e (III*). Além disso, o ligante está ligado ao aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo.
Consequentemente, o pode ter uma estrutura de Ligante-Aminoácido-Suporte Sólido, Ligante- Peptídeo-Suporte Sólido, Ligante-Nucleotídeo-Suporte Sólido ou Ligante-Oligonucleotídeo-Suporte Sólido.
O "ligante" pode ser virtualmente qualquer ligante, e o ligante é ligado ao Y, sendo o referido Y, por exemplo, conforme estabelecido neste documento em relação a um composto de fórmula (I), (I*), (III) ou (III*), S (enxofre) ou O (oxigênio), de preferência S.
O ligante pode ser qualquer ligante conhecido por um versado na técnica, por exemplo, um ligante peptídico ou uma porção à base de hidrocarboneto linear ou ramificado.
O ligante também pode compreender porções cíclicas.
Um ligante peptídico pode compreender, por exemplo, 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 10, 1 a 5,
1 a 3 ou 2, ou 1 aminoácido (s). Se o ligante for uma fração à base de hidrocarboneto, a cadeia principal do ligante pode compreender apenas átomos de carbono, mas também pode conter heteroátomos, tais como átomos de oxigênio (O), nitrogênio (N) ou enxofre (S) e/ou conter grupos carbonila (C=O). O ligante pode ser, por exemplo, uma cadeia de átomos de carbono C1-C20 ou uma cadeia à base de poliéter, como uma cadeia à base de polietilenoglicol com -(O–CH2–CH2)- unidades de repetição. Em modalidades típicas de ligantes à base de hidrocarbonetos, a porção de ligação compreende entre 1 a cerca de 150, 1 a cerca de 100, 1 a cerca de 75, 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 30, ou 1 a cerca de 20, incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19 átomos da cadeia principal. Um especialista na técnica sabe como selecionar ligantes adequados. Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante pode ser , em que # indica a posição do Y, e * indica a posição do aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo, e m e n são, cada um, independentemente, um número inteiro de, por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. O aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo pode ser ligado ao ligante através de um átomo de N (nitrogênio).
[114] Em modalidades preferidas de qualquer um dos processos da invenção, representa um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, em que o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo está ligado a um suporte sólido. Em algumas modalidades, representa um aminoácido ou um peptídeo ligado a um suporte sólido. Em algumas modalidades, representa um nucleotídeo ou oligonucleotídeo ligado a um suporte sólido. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo ligado a um suporte sólido.
[115] A presente invenção também se refere a um processo para a preparação de um composto de fórmula (I) ou fórmula (I*), o referido método compreendendo: (I) reagir um composto de fórmula (Ia)
(Ia); ou de fórmula (I*a)
(I*a), em que L representa um ligante adequado para ligação a um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo; e
, X, Y, V e R1 são como definidos acima e abaixo, com um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, em que o aminoácido, o peptídeo, o nucleotídeo ou o oligonucleotídeo está ligado a um suporte sólido, resultando em um composto de fórmula (Ib) ou (I*b),
(Ib); ou
(I*b), em que Z representa o aminoácido, o peptídeo, o nucleotídeo ou o oligonucleotídeo, em que o aminoácido, o peptídeo, o nucleotídeo ou o oligonucleotídeo está ligado ao suporte sólido; e (II) clivar o composto de fórmula (Ib) ou fórmula (I*b) do suporte sólido para dar o composto de fórmula (I) ou fórmula (I*):
(I); ou
(I*), em que representa o aminoácido, o peptídeo, o nucleotídeo ou o oligonucleotídeo ligado ao Y através do ligante L, e
, X, Y, V e R1 são como definidos acima na etapa (I). Em algumas modalidades, o ligante L é , em que # indica a posição de Y, e m e n são, cada um, independentemente, um número inteiro de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. O aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo é ligado a tal ligante através do grupo carboxila.
Em algumas modalidades, o composto de fórmula (Ia) ou (I*a) é reagido com um peptídeo ligado a um suporte sólido ou um oligonucleotídeo ligado a um suporte sólido, de preferência o composto de fórmula (Ia) ou (I*a) é reagido com um peptídeo ligado a um suporte sólido.
Em algumas modalidades, a clivagem da etapa (II) é realizada em condições ácidas, por exemplo, usando ácido trifluoroacético aquoso (por exemplo, 90% de TFA). A este respeito, os inventores descobriram que os fosfonotiolatos (Y = S) da presente invenção são altamente estáveis em condições ácidas, que são em particular utilizadas para a clivagem de um peptídeo de um suporte sólido.
Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o processo pode adicionalmente compreender a reação do composto de fórmula (I) ou fórmula (I*) com um composto de fórmula (II) como definido aqui acima e abaixo.
[116] Em uma modalidade de um processo de acordo com a invenção, o e o estão na mesma molécula. Consequentemente, a presente invenção também se refere a um processo em que um composto de fórmula (L) (L), em que o e o estão na mesma molécula indicada pelo arco que conecta o eo , é reagido para dar um composto de fórmula (IIIa): (IIIa); em que representa uma ligação se em um composto de fórmula (XX) representa uma ligação dupla, e X representa (R3 R4)C; ou representa uma ligação dupla se em um composto de fórmula (XX) representa uma ligação tripla, e X representa R3-C; e , , R1, R3, R4 e Y são como definidos acima e abaixo.
[117] A presente invenção também se refere a um processo em que um composto de fórmula (L *) (XX*), em que o e o estão na mesma molécula como indicado pelo arco que conecta o eo , é reagido para dar um composto de fórmula (III*a): (III*a); em que X é (R3 R4)C, e , , V, R1, R3, R4 e Y são como aqui definidos acima e abaixo.
[118] Em algumas modalidades, o composto (L) tendo o eo na mesma molécula é um peptídeo, como por exemplo, o peptídeo BCL9. Consequentemente, o composto de fórmula (IIIa) obtido pelo processo pode ser um peptídeo cíclico, tal como por exemplo, um peptídeo cíclico derivado do peptídeo BCL9. Em algumas modalidades, o composto (L*) tendo o e o na mesma molécula é um peptídeo, como por exemplo, o peptídeo BCL9. Consequentemente, o composto de fórmula (III*a) obtido pelo processo pode ser um peptídeo cíclico, tal como, por exemplo, um peptídeo cíclico derivado do peptídeo BCL9.
[119] Todos os processos aqui descritos para compostos de fórmula (I), (I*), (II), (III) e (III*) podem ser realizados analogamente para compostos de fórmula (L), (L*), (IIIa) e (III*a). Compostos
[120] A presente invenção também se refere a compostos que podem ser obtidos ou obteníveis por qualquer um dos processos aqui descritos. Além disso, a presente invenção se refere a compostos que são usados em qualquer um dos processos aqui descritos, por exemplo, como materiais de partida ou intermediários. Em particular, a presente invenção também se refere a compostos de fórmula (I), (I*), (III), (III*), (L), (L*), (IIIa) e (III*a).
[121] Consequentemente, a presente invenção também se refere a um composto de fórmula (I) (I) em que representa uma ligação dupla ou ligação tripla; X representa R3-C quando é uma ligação tripla; X representa (R3 R4)C quando é uma ligação dupla; Y representa S ou O;
R1 representa um resíduo alifático ou aromático opcionalmente substituído; R3 representa H ou C1-C8-alquila; R4 representa H ou C1-C8-alquila; e representa um resíduo alifático ou aromático;
[122] Em algumas modalidades do composto de fórmula (I) representa uma ligação dupla, X representa (R3 R4)C, e R3 e R4 representam independentemente H ou C1-C8-alquila. De preferência, R3 e R4 representam independentemente H ou C1-C8-alquila, mais preferivelmente H ou C1-C6-alquila, ainda mais preferivelmente H ou C1- C4-alquila, e ainda mais preferivelmente H ou C1-C2-alquila. Em modalidades preferidas, R3 e R4 são iguais. Em modalidades preferidas, R3 e R4 são ambos H.
[123] Alternativamente, em algumas modalidades do composto de fórmula (I) representa uma ligação tripla, X representa R3-C e R3 representa H ou C1-C8-alquila. Preferivelmente, R3 representa H ou C1- C8-alquila, mais preferivelmente H ou C1-C6-alquila, ainda mais preferivelmente H ou C1-C4-alquila, e ainda mais preferivelmente H ou C1-C2-alquila. Em modalidades preferidas, R3 é H.
[124] A presente invenção também se refere a um composto de fórmula (I*) (I*), em que V representa C1-C8-alquila, preferivelmente metila, etila ou propila, mais preferivelmente metila; X representa (R3 R4)C;
Y representa S ou O; R1 representa um resíduo alifático ou aromático opcionalmente substituído; R3 representa H ou C1-C8-alquila; R4 representa H ou C1-C8-alquila; e representa um resíduo alifático ou aromático.
[125] A presente invenção também se refere a um composto de fórmula (III) (III), em que representa uma ligação e X representa (R3 R4)C; ou representa uma ligação dupla e X representa R3-C; Y representa S ou O; R1 representa um resíduo alifático ou aromático opcionalmente substituído; R3 representa H ou C1-C8-alquila; R4 representa H ou C1-C8-alquila; e representa um resíduo alifático ou aromático; representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída ou um 5- aromático opcionalmente substituído ou sistema heterocíclico de 6 membros.
[126] Em algumas modalidades do composto de fórmula (III),
representa uma ligação, X representa (R3 R4)C, e R3 e R4 representam independentemente H ou C1-C8-alquila. De preferência, R3 e R4 representam independentemente H ou C1-C6-alquila, mais preferivelmente H ou C1-C4-alquila, ainda mais preferivelmente H ou C1- C2-alquila. Em modalidades preferidas, R3 e R4 são iguais. Em modalidades preferidas, R3 e R4 são ambos H.
[127] Alternativamente, em algumas modalidades do composto de fórmula (III), representa uma ligação dupla, X representa R3-C e R3 representa H ou C1-C8-alquila. Preferivelmente, R3 representa H ou C1-C6-alquila, mais preferivelmente H ou C1-C4-alquila, ainda mais preferivelmente H ou C1-C2-alquila. Em modalidades preferidas, R3 é H.
[128] A presente invenção também se refere a um composto de fórmula (III*) (III*). em que X representa (R3 R4) C Y representa S ou O; R1 representa um resíduo alifático ou aromático opcionalmente substituído; R3 representa H ou C1-C8-alquila; R4 representa H ou C1-C8-alquila; V representa C1-C8-alquila, preferivelmente metila, etila ou propila, mais preferivelmente metila; representa um resíduo alifático ou aromático; e representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína,
um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída ou um sistema heterocíclico de 5- ou de 6 membros aromático opcionalmente substituído.
[129] Em algumas modalidades do composto de fórmula (III*), R3 e R4 representam, independentemente, H ou C1-C8-alquila. De preferência, R3 e R4 representam independentemente H ou C1-C6- alquila, mais preferivelmente H ou C1-C4-alquila, ainda mais preferivelmente H ou C1-C2-alquila. Em modalidades preferidas, R3 e R4 são iguais. Em modalidades preferidas, R3 e R4 são ambos H.
[130] Em qualquer um de um composto de fórmula (I), (I*), (III) ou (III*) Y pode ser S (enxofre) ou O (oxigênio), ou seja, quando Y é S, os compostos (I), (I*), (III) ou (III*) representam fosfonotiolatos, e quando Y é O, os compostos (I), (I*), (III) ou (III*) representam fosfonatos. Consequentemente, em algumas modalidades Y é S. Em algumas modalidades Y é O. Como vantagem, os inventores mostraram que ambos os fosfonotiolatos e fosfonatos são estáveis sob condições fisiologicamente relevantes. Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*) Y é S. Verificou-se que os fosfonotiolatos de fórmula (III) e (III*), em que Y é S, são acessíveis por uma adição de tiol mais rápida do que os fosfonatos correspondentes. Essa taxa de reação mais rápida é altamente desejada, visto que assim a conversão e o rendimento do fosfonotiolato são aumentados.
[131] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa C1-C8-alquila opcionalmente substituída por pelo menos um de (C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, F, Cl, Br, I, -NO2, -N(C1-C8-alquila) H, -NH2, -N3, -N(C1-C8-alquila)2, = O, C3-C8-cicloalquila, –S-S-(C1-C8-alquila), hidróxi-(C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, C2-C8 -alquenila ou C2-C8-alquinila.
[132] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa fenila opcionalmente substituída, tal como ou, em que # representa a posição de O.
[133] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa fenila opcional e independentemente substituída por pelo menos um dentre C1-C8-alquila, (C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, F, Cl, I, Br, -NO2, -N(C1-C8-alquila) H, -NH2 ou -N(C1-C8-alquila)2.
[134] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa um sistema heteroaromático de 5 ou 6 membros, como piridila.
[135] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa C1-C8-alquila, C1-C8-alquila substituída por –S-S-(C1-C8-alquila), C1-C8-alquila substituída por (C1-C8-alcóxi)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, C1-C8-alquila substituída por fenila opcionalmente substituída, ou fenila, ou fenila substituída com –NO2.
[136] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa metila, etila, propila ou butila, de preferência metila ou etila.
[137] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa um resíduo alifático ou aromático que é opcionalmente substituído por –S-S-(C1-C8-alquila). Em uma modalidade preferida, R1 representa , em que R10, R11, R12 e R13 representam, cada um, independentemente, hidrogênio ou C1-C8-alquila; e # representa a posição de O.
Em uma modalidade mais preferida, R10, R11, R12 e R13 representam, cada um, independentemente, hidrogênio, metila ou etila.
Em uma modalidade preferida, R1 representa , em que R10 e R11 representam, independentemente, hidrogênio ou C1-C8-alquila; e # representa a posição de O.
Em uma modalidade mais preferida, R10 e R11 representam independentemente hidrogênio, metila ou etila.
Em uma modalidade ainda mais preferida, R1 representa
, em que R10 e R11 representam independentemente hidrogênio, metila ou etila; e # representa a posição de O.
Em algumas dessas modalidades, R10 e R11 são ambos hidrogênio.
Em algumas dessas modalidades, R10 é hidrogênio e R11 é C1-C6-alquila.
Em algumas dessas modalidades, R10 é hidrogênio e R11 é metila ou etila.
Em algumas dessas modalidades, R10 e R11 são iguais.
Em uma modalidade preferida, R1 representa
, mais preferivelmente
, em que R10 e R11 são como aqui definidos antes. Em uma modalidade preferida, R1 representa , em que R12 e R13 representam, independentemente, hidrogênio ou C1-C8-alquila; e # representa a posição de O. Em uma modalidade mais preferida, R12 e R13 representam independentemente hidrogênio, metila ou etila. Em uma modalidade ainda mais preferida, R1 representa , em que R12 e R13 representam independentemente hidrogênio, metila ou etila; e # representa a posição de O. Em algumas dessas modalidades, R12 e R13 são ambos hidrogênio. Em algumas dessas modalidades, R12 é hidrogênio e R13 é C1-C6-alquila. Em algumas dessas modalidades, R12 é hidrogênio e R13 é metila ou etila. Em algumas dessas modalidades, R12 e R13 são iguais.
[138] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa C1-C8-alquila substituída por fenila, a referida fenila sendo adicionalmente substituída por , em que Z é O ou NH, e em que # representa a posição da referida fenila. Em algumas modalidades, Z é O. Em algumas modalidades Z é NH. A C1-C8-alquila no pode ser, por exemplo, metila, etila, propila ou butila; preferivelmente metila, etila ou propila; mais preferivelmente metila ou etila; mais preferivelmente metila. Em uma modalidade preferida, R1 representa , em que o C1-C8-alquila pode ser, por exemplo, metila, etila, propila ou butila; preferivelmente metila, etila ou propila; mais preferivelmente metila ou etila; mais preferivelmente metila; em que Z é O ou NH, e em que # representa a posição de O. Em outra modalidade preferida R1 representa , em que C1-C8-alquila pode ser, por exemplo, metila, etila, propila ou butila; preferivelmente metila, etila ou propila; mais preferivelmente metila ou etila; mais preferivelmente metila; em que Z é O ou NH, e em que # representa a posição de O.
[139] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa C1-C8-alquila substituída por fenila, a referida fenila sendo adicionalmente substituída por , e em que # representa a posição da referida fenila. Em algumas modalidades, R1 representa C1-C8- alquila substituída por fenila, a referida fenila sendo adicionalmente substituída por , em que # representa a posição da referida fenila. Em uma modalidade preferida, R1 representa , em que # representa a posição de O. Em uma outra modalidade preferida, R1 representa , em que # representa a posição de O.
[140] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I),
(I*), (III) ou (III*), R1 representa , onde # representa a posição de O, com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de preferência com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6; mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, 3, 4; ainda mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, 3, ainda mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, ainda mais preferivelmente com n = 0, 1; e mais preferivelmente com n = 1.
[141] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa um resíduo alifático ou aromático que é opcionalmente substituído por C2-C8-alquinila. Em uma modalidade preferida, R1 é homopropargila.
[142] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), R1 representa , em que # representa a posição de O, com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de preferência com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6; mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, 3, 4; ainda mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, 3, ainda mais preferivelmente com n = 0, 1, 2, ainda mais preferivelmente com n = 0, 1; e mais preferivelmente com n = 1, isto é, quando n é 1, R1 representa .
[143] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa uma pequena molécula; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[144] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa uma pequena molécula, como, por exemplo, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, -CH2-fenila, , , , ,
, , , , ou em que # indica a posição de Y. Em modalidades preferidas representa uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, de preferência uma C1-C6-alquila opcionalmente substituída, mais preferivelmente uma C1-C4-alquila opcionalmente substituído, ainda mais preferivelmente C1-C2-alquila. Em algumas modalidades representa -CH2-fenila, isto é, benzila. Em modalidades preferidas representa , em que # indica a posição de Y.
Em modalidades preferidas representa , em que # indica a posição de Y. Em modalidades preferidas representa , em que # indica a posição de Y. Em modalidades preferidas representam , em que # indica a posição de Y. Em modalidades preferidas representa , em que # indica a posição de Y. Em modalidades preferidas representa , em que # indica a posição de Y. Em modalidades preferidas representa , em que # indica o posição de Y. Em algumas modalidades representa , em que # indica a posição de Y. Em algumas modalidades representa , em que # indica a posição de Y. Em algumas modalidades representa , em que # indica a posição de Y.
[145] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa uma fenila opcionalmente substituída,
de preferência, , em que # indica a posição de Y.
[146] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa um nuclídeo radioativo ou não radioativo, biotina, uma enzima repórter, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, um aminoácido, um peptídeo, um sistema heteroaromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Por conseguinte, em algumas modalidades representa um nuclídeo radioativo ou não radioativo. Em algumas modalidades preferidas representa biotina. Em algumas modalidades, representa uma enzima repórter. Em algumas modalidades preferidas, representa um nucleotídeo. Em algumas modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades preferidas, representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em algumas modalidades preferidas, representa um aminoácido. Em algumas modalidades preferidas, representa um peptídeo. Em algumas modalidades preferidas, representa um sistema heteroaromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[147] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa um peptídeo RGD cíclico de estrutura (VII) (c(RDGfK))
(VII) em que * representa a posição de Y.
[148] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa fenila, opcionalmente substituída por um, dois, três, quatro ou cinco substituintes independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8-alquila, C1-C8-alcóxi, halogênio, -CN, -NO2, -NH2, -N(C1-C8-alquila), -N(C1-C8-alquila)2- COOH, -COO (C1- C8-alquila), -O-C(O)-(C1-C8-alquila), -C(O)N-(C1-C8- alquila), -N(H)-C(O)-(C1-C8-alquila) de preferência opcionalmente substituída por um substituinte selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C8-alcóxi, -COOH, -COO(C1-C8-alquila e NO2.
[149] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa C1-C8-alquila, opcionalmente substituída por pelo menos um substituinte selecionado a partir do grupo que consiste em C3-C8-cicloalquila; heterociclila com 3 a 8 membros no anel em que o (s) heteroátomo (s) é selecionado (s) de N, O, S; alcóxi C1-C8; halogênio; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-alquila); -N(C1-C8-alquila)2; -COOH; -COO(C1-C8-alquila); -O-C(O)-(C1-C8-alquila); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-alquila)2; -C(O)NH-(C1-C8-alquila); -N(H)-C(O)-(C1-C8- alquila), de preferência C1-C8-alcóxi, -COOH, -COO(C1-C8-alquila e NO2, fenila ou um sistema heteroaromático, um monossacarídeo, um polissacarídeo, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um polímero, um aminoácido, um fluoróforo, um marcador de proteína (substituinte de 1ª geração), em que um substituinte de 1ª geração pode novamente ser opcionalmente substituído por C3-C8-cicloalquila; heterociclila com 3 a 8 membros do anel em que o (s) heteroátomo (s) é selecionado (s) a partir de N, O, S; C1-C8-alcóxi; halogênio; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-alquila); -N(C1-C8- alquila)2; -COOH; -COO(C1-C8-alquila); -O-C(O)-(C1-C8-alquila); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-alquila)2; -C(O)NH-(C1-C8-alquila); -N(H)-C(O)- (C1-C8-alquila), de preferência C1-C8-alcóxi, - COOH, -COO(C1-C8- alquila e NO2, fenila ou um sistema heteroaromático (substituintes de 2ª geração) e em que um substituinte de 2ª geração pode ser substituído novamente por pelo menos um substituinte selecionado a partir do mesmo grupo e em que tal substituição pode ir até geração 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
[150] Em algumas modalidades de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída ou um sistema heterocíclico aromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído; em que opcionalmente o adicional compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas representa um aminoácido. Em modalidades preferidas representa um peptídeo. Em modalidades preferidas representa uma proteína. Em modalidades preferidas representa um anticorpo. Em modalidades preferidas representa um nucleotídeo. Em modalidades preferidas representa um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, representa um sacarídeo. Em algumas modalidades, representa um polissacarídeo. Em algumas modalidades,
representa um polímero. Em algumas modalidades representa uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, de preferência uma C1-C6- alquila opcionalmente substituída, mais preferivelmente uma C1-C4- alquila opcionalmente substituída, ainda mais preferivelmente uma C1- C2-alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, representa uma fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, representa um sistema heterocíclico aromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[151] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Em modalidades mais preferidas representa um peptídeo, uma proteína, um anticorpo ou um oligonucleotídeo; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido. Em modalidades preferidas representa um peptídeo. Em modalidades preferidas representa uma proteína. Em modalidades preferidas representa um anticorpo. Em modalidades preferidas representa um nucleotídeo. Em modalidades preferidas representa um oligonucleotídeo. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[152] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa uma droga, um marcador de proteína ou um fluoróforo, como CY5 ou EDANS, biotina, uma proteína, um peptídeo, um anticorpo ou um oligonucleotídeo; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas representa uma droga. Em modalidades preferidas, representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um conjugado ligante-droga. Em modalidades preferidas, representa um fluoróforo como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas representa biotina. Em modalidades preferidas representa uma proteína. Em modalidades preferidas representa um peptídeo. Em modalidades preferidas representa um anticorpo. Em modalidades preferidas representa um oligonucleotídeo. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[153] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa um ligante ou um conjugado ligante- droga. Em modalidades preferidas representa um ligante, tal como, por exemplo, um ligante compreendendo VC-PAB, VA-PAB, KF-PAB ou VK-PAB, de preferência um ligante compreendendo VC-PAB. Em modalidades preferidas representa um conjugado ligante-droga, tal como, por exemplo, , , , ou
, preferivelmente
, em que # indica a posição de Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e m e n são cada um, independentemente, um número inteiro de por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. Mais preferivelmente, o ligante conjugado de droga é
, ,
, ,
, ,
, ou
, ainda mais preferivelmente ou
, o mais preferivelmente
, em que # indica a posição de Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e m e n são cada um, independentemente, um número inteiro de, por exemplo, de 0 a 20, 0 a
15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1.
[154] De acordo com qualquer um dos compostos (III) ou (III*), pode representar um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída ou um sistema heterocíclico aromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo. Em modalidades mais preferidas, representa um peptídeo, uma proteína, um anticorpo ou um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas representa um aminoácido. Em modalidades preferidas representa um peptídeo. Em modalidades preferidas representa uma proteína. Em modalidades preferidas representa um anticorpo. Em modalidades preferidas representa um nucleotídeo. Em modalidades preferidas representa um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, representa um sacarídeo. Em algumas modalidades, representa um polissacarídeo. Em algumas modalidades, representa um polímero. Em algumas modalidades representa uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, de preferência uma C1-C6-alquila opcionalmente substituída, mais preferivelmente uma C1-C4-alquila opcionalmente substituída, ainda mais preferivelmente um C1-C2-alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades representa um C3-C8-alquila opcionalmente substituída, de preferência um C3-C6- alquila opcionalmente substituída, mais preferivelmente uma C3-C4- alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades representa uma C5-C8-alquila opcionalmente substituída, de preferência uma C6-C7-alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, representa uma fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, representa um sistema heterocíclico aromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído.
[155] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (III) ou (III*), representa um anticorpo, preferivelmente um anticorpo IgG, mais preferivelmente um Cetuximab ou um Trastuzumab ou um Brentuximab; uma proteína, de preferência uma proteína GFP ou proteína eGFP, uma albumina, um tripeptídeo, de preferência um peptídeo de fórmula (VIII) (VIII), ou de fórmula (IX) (IX) em que # representa a posição de S. Consequentemente, em modalidades preferidas representa um anticorpo. Em modalidades mais preferidas, o anticorpo é um anticorpo IgG, ainda mais preferivelmente um Cetuximab ou um Trastuzumab ou um Brentuximab. Em modalidades preferidas representa uma proteína, mais preferivelmente uma proteína GFP ou proteína eGFP. Em modalidades preferidas representa uma albumina. Em modalidades preferidas, representa um tripeptídeo. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo de fórmula (VIII) (VIII). Em modalidades preferidas, representa um peptídeo de fórmula (VIII). Em modalidades preferidas representa um peptídeo de fórmula (IX) (IX).
[156] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (III) ou (III*), representa um anticorpo (por exemplo, um Cetuximab, um Trastuzumab ou um Brentuximab) e representa um marcador de proteína ou um fluoróforo, como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo ou uma pequena molécula; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa uma proteína. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[157] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (III) ou (III*), representa uma proteína (por exemplo, uma proteína
GFP ou proteína eGFP) e representa um marcador de proteína ou um fluoróforo, como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, um anticorpo, uma proteína, um oligonucleotídeo ou uma pequena molécula; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa um anticorpo. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa uma proteína. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa uma proteína e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[158] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (III) ou (III*), representa um peptídeo e representa um marcador de proteína ou um fluoróforo, como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, um anticorpo, uma proteína, um oligonucleotídeo ou uma pequena molécula; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa um anticorpo. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa uma proteína. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[159] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (III) ou (III*), representa um aminoácido e representa um marcador de proteína, ou um fluoróforo, como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo ou um pequeno molécula; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa uma proteína. Em modalidades preferidas representa um aminoácido e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um aminoácido e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[160] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (III) ou (III*), representa um anticorpo (por exemplo, um Cetuximab, um Trastuzumab ou um Brentuximab) e representa um ligante, uma droga ou um conjugado ligante-droga.
Consequentemente, em modalidades preferidas representa um anticorpo e representa um ligante, tal como, por exemplo, um ligante compreendendo VC-PAB, VA-PAB, KF-PAB ou VK-PAB, de preferência um ligante compreendendo VC-PAB.
Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa uma droga.
Em modalidades preferidas, representa um anticorpo e representa um conjugado ligante-
droga, tal como, por exemplo, ,
,
, ou
, preferivelmente
, em que # indica a posição de Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e m e n são cada um, independentemente, um número inteiro de por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. Em modalidades mais preferidas representa um anticorpo e representa um conjugado ligante-droga, como por exemplo,
, ,
, , , , , ou , ainda mais preferivelmente ou , o mais preferivelmente , em que # indica a posição do Y (O (oxigênio) ou S (enxofre), preferivelmente S), e m e n são cada um, independentemente, um inteiro de por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. Em qualquer um destes modalidades, o anticorpo pode ser um Cetuximab, um Trastuzumab ou um Brentuximab, de preferência um Brentuximab.
[161] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (III) ou (III*), representa um nucleotídeo e representa um peptídeo, uma proteína, um marcador de proteína, um anticorpo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo, tal como CY5 ou EDANS, biotina ou uma molécula pequena; em que, opcionalmente, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa uma proteína. Em modalidades preferidas,
representa um nucleotídeo e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa um anticorpo. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa um nucleotídeo e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[162] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (III) ou (III*) representa um nucleotídeo e representa um ligante.
[163] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (III) ou (III*), representa um oligonucleotídeo e representa um peptídeo, uma proteína, um marcador de proteína, um anticorpo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo, como CY5 ou EDANS, biotina, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y. Consequentemente, em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa um peptídeo. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa uma proteína. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa um marcador de proteína. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa um anticorpo. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa um oligonucleotídeo. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa um fluoróforo, como CY5 ou EDANS. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa biotina. Em modalidades preferidas, representa um oligonucleotídeo e representa uma pequena molécula. Opcionalmente, em qualquer uma dessas modalidades, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y.
[164] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (III) ou (III*), representa um oligonucleotídeo e representa um ligante.
[165] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, em que o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo está ligado a um suporte sólido. Em algumas modalidades, o composto é um composto de fórmula (I) ou um composto de fórmula (I*). Em algumas modalidades, representa um aminoácido ou um peptídeo ligado a um suporte sólido. Em algumas modalidades, representa um nucleotídeo ou oligonucleotídeo ligado a um suporte sólido. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo ligado a um suporte sólido. Como vantagem, os inventores descobriram que os fosfonotiolatos (Y = S) da presente invenção são altamente estáveis sob condições ácidas que são tipicamente utilizados para a clivagem do peptídeo do suporte sólido, por exemplo, 90% de ácido trifluoroacético (TFA). O suporte sólido pode ser qualquer suporte sólido conhecido por um especialista na técnica que seja adequado para a síntese de peptídeos em fase sólida, ou qualquer suporte sólido que seja adequado para a síntese de oligonucleotídeos em fase sólida, como por exemplo, descrito acima no contexto do processo. Opcionalmente, nas modalidades anteriores, em que o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo está ligado a um suporte sólido, o adicionalmente compreende um ligante que está ligado ao Y das fórmulas aqui divulgadas, em particular dos compostos (I), (III), (I*) e (III*). Além disso, o ligante está ligado ao aminoácido, peptídeo,
nucleotídeo ou oligonucleotídeo.
Consequentemente, o pode ter uma estrutura de Ligante-Aminoácido-Suporte Sólido, Ligante-Peptídeo- Suporte Sólido, Ligante-Nucleotídeo-Suporte Sólido ou Ligante- Oligonucleotídeo-Suporte Sólido.
O "ligante" pode ser virtualmente qualquer ligante, e o ligante é ligado ao Y, sendo que Y é, por exemplo, conforme estabelecido neste documento em relação a um composto de fórmula (I), (I*), (III) ou (III*), S (enxofre) ou O (oxigênio), de preferência S.
O ligante pode ser qualquer ligante conhecido por um versado na técnica, por exemplo, um ligante peptídico ou uma porção à base de hidrocarboneto linear ou ramificado.
O ligante também pode compreender porções cíclicas.
Um ligante peptídico pode compreender, por exemplo, 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3 ou 2, ou 1 aminoácido (s). Se o ligante é uma porção à base de hidrocarboneto, a cadeia principal do ligante pode compreender apenas átomos de carbono, mas também pode conter heteroátomos, como átomos de oxigênio (O), nitrogênio (N) ou enxofre (S) e/ou conter grupos carbonil (C = O). O ligante pode ser, por exemplo, uma cadeia de átomos de carbono C1-C20 ou uma cadeia à base de poliéter, como uma cadeia à base de polietilenoglicol com -(O–CH2–CH2)-unidades de repetição.
Em modalidades típicas de ligantes à base de hidrocarbonetos, a fração de ligação compreende entre 1 a cerca de 150, 1 a cerca de 100, 1 a cerca de 75, 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 30, ou 1 a cerca de 20, incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19 átomos da cadeia principal.
Um especialista na técnica sabe como selecionar ligantes adequados.
Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante pode ser , em que # indica a posição de Y, e * indica a posição do aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo, e m e n são cada um, independentemente, um número inteiro de, por exemplo, de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6,
1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. O aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo pode ser ligado ao ligante através de um átomo de N (nitrogênio).
[166] Em modalidades preferidas de qualquer um dos compostos (I), (I*), (III) ou (III*), representa um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, em que o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo está ligado a um suporte sólido. Em algumas modalidades, representa um aminoácido ou um peptídeo ligado a um suporte sólido. Em algumas modalidades, representa um nucleotídeo ou oligonucleotídeo ligado a um suporte sólido. Em modalidades preferidas, representa um peptídeo ligado a um suporte sólido.
[167] A presente invenção também se refere a um kit que compreende um suporte sólido, e um composto de fórmula (I) (I), e/ou um composto de fórmula (I*) (I*) em que é um ligante adequado para ligação a um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo; e
[168] em que , R1, X, Y e V são como definidos acima e abaixo. Esse kit é adequado para a síntese de peptídeos em fase sólida e/ou a síntese de oligonucleotídeos em fase sólida. De preferência, o kit pode ser utilizado para a síntese de peptídeos em fase sólida, uma vez que os inventores descobriram que os fosfonotiolatos (Y = S) da presente invenção são altamente estáveis em condições ácidas que são tipicamente utilizadas para clivagem do peptídeo do suporte sólido, por exemplo, 90% de ácido trifluoroacético (TFA). Durante a síntese em fase sólida, o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo é ligado ao suporte sólido, e o ligante do composto de fórmula (I) ou fórmula (I*) é ligado ao aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo.
[169] Em modalidades preferidas do kit, o ligante é , em que # indica a posição de Y, e m e n são, cada um, independentemente, um número inteiro de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2 ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1. O aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo está ligado a esse ligante através do grupo carboxila. Em algumas modalidades, o composto de fórmula (I) tem a estrutura ou .
[170] O kit pode adicionalmente compreender um ou mais de um aminoácido, um ou mais de um peptídeo, um ou mais de um nucleotídeo e/ou um ou mais de um oligonucleotídeo, que podem ser usados na síntese de fase sólida. Em particular, como a síntese de peptídeos em fase sólida é preferida, o kit pode compreender um ou mais de um aminoácido.
[171] A invenção também se refere a compostos de fórmula (IIIa) (IIIa),
em que e estão na mesma molécula como indicado pelo arco conectando o eo , e em que , , , X, Y e R1 são como aqui definidos acima e abaixo, em particular como definido em relação ao composto (III). De preferência, o composto (IIIa) é um peptídeo cíclico, como por exemplo, um peptídeo cíclico derivado do peptídeo BCL9.
[172] A invenção também se refere a compostos de fórmula (III*a) (III*a), em que e estão na mesma molécula como indicado pelo arco conectando o eo , e em que , , V, X, Y e R1 são como definidos aqui acima e abaixo, em particular como definido em relação ao composto (III*). De preferência, o composto (III*a) é um peptídeo cíclico, como por exemplo, um peptídeo cíclico derivado do peptídeo BCL9.
[173] Além disso, também os compostos fornecidos aqui como exemplos na seção de exemplo para compostos de fórmula (I), (I*), (III), (III*), (IIIa) ou (III*a) são preferidos.
[174] O especialista entende que as modalidades de acordo com a invenção podem ser combinadas umas com as outras com a condição de que uma combinação que violaria qualquer lei natural seja excluída.
[175] Qualquer modalidade, característica, definição ou semelhante aqui descrito com referência a qualquer processo também se aplica a qualquer composto aqui descrito mutatis mutandis. Da mesma maneira, qualquer modalidade, recurso, definição ou semelhante aqui descrito com referência a qualquer composto se aplica a qualquer processo aqui descrito mutatis mutandis.
Síntese de compostos de fórmulas (IV), (IV*), (I) e (I*) a partir de tri- haletos de fósforo
[176] A seção a seguir fornece algumas características gerais da síntese de compostos de fórmulas (IV), (IV*), (I) e (I*) a partir de tri- haletos de fósforo. Em geral, um especialista na técnica sabe selecionar as condições de reação adequadas para realizar tal síntese. Mais detalhes são fornecidos na seção Exemplo abaixo.
[177] Conforme indicado acima e abaixo, os compostos de fórmula (IV) ou (IV*) podem ser preparados por meio de uma sequência que compreende as etapas (i) a (iv). Por conseguinte, os compostos de fórmula (IV) ou (IV*) podem ser sintetizados (i) reagindo um tri-haleto de fósforo (X), de preferência PCl3, com um álcool (XI) compreendendo o resíduo R1, (ii) reagindo o produto obtido em etapa (i) com uma amina (XII), (iii) reagindo o produto obtido na etapa (ii) com um haleto de alquenil magnésio ou um haleto de alquinil magnésio (XIII), ou com um haleto de alquenila magnésio (XIII*), e (iv) reagindo o produto obtido na etapa (iv) com um álcool ou um tiol (XIV) compreendendo o resíduo para fornecer os compostos de fórmula (IV) ou (IV*). Os compostos de fórmula (I) ou (I*) podem ser obtidos a partir de compostos de fórmula (IV) ou (IV*) por oxidação. Etapa (i)
[178] A etapa (i), por exemplo, pode ser realizado reagindo o tri- haleto de fósforo (X), de preferência PCl3, com o ácido clorídrico (XI) em um solvente adequado, tal como, por exemplo, dietil éter ou tetrahidrofurano, em baixa temperatura abaixo de –10°C e, em seguida, aquecendo a mistura de reação; por exemplo, a faixa de temperatura pode estar entre –50°C e + 50°C; mais especificamente, a reação pode ser realizada a cerca de -40°C ou -30°C e, em seguida, aquecendo até a temperatura ambiente. De preferência, a reação do tri-haleto de fósforo com o álcool é realizada na presença de uma base fraca, tal como, por exemplo, uma base de amina como trietilamina. A razão molar do álcool para o tri-haleto de fósforo deve estar na faixa de 5:1 a 1:5, de preferência na faixa de 2:1 a 1:2, mais preferivelmente a razão molar é 1:1. Quando uma base fraca, como uma base de amina como trietilamina é usada, a razão molar da base para o tri-haleto de fósforo pode estar em uma faixa de 5:1 a 1:5, por exemplo, em uma faixa de 2:1 a 1:2, de preferência cerca de 1:1. Obviamente, o tempo de reação depende do volume da reação e da quantidade de substância. Como orientação, o tempo de reação à baixa temperatura antes do aquecimento pode ser de 2 minutos a duas horas, tal como, por exemplo, cerca de 10 minutos, e o tempo de reação após o aquecimento pode ser de 15 minutos a 6 horas, tal como, por exemplo, cerca de uma hora. De preferência, a reação é realizada sob um gás inerte, como argônio. "Inerte", neste contexto, se refere a um gás que não reagirá com qualquer um dos materiais de partida ou produtos da reação sob as condições de reação dadas. A mistura obtida após a reação da etapa (i) é preferivelmente usada na etapa (ii) sem isolar o produto. Opcionalmente, após a etapa (i) e antes da etapa (ii), a mistura pode ser purificada, por exemplo, por filtração de celite. Etapa (ii)
[179] A etapa (ii), por exemplo, pode ser realizada reagindo o produto obtido na etapa (i) com amina (XII), de preferência di- isopropilamina, em um solvente adequado, tal como, por exemplo, dietil éter ou tetrahidrofurano. A este respeito, o solvente pode ser o mesmo que na etapa (i). A reação da etapa (ii) pode ser realizada a uma temperatura baixa abaixo de -10°C e, em seguida, aquecendo a reação; por exemplo, a faixa de temperatura pode estar entre –50°C e + 50°C; mais especificamente, a reação pode ser realizada a cerca de -40°C ou -30°C e, em seguida, aquecendo até a temperatura ambiente. A razão molar da amina (XII) pode ser baseada na quantidade molar do tri-haleto de fósforo (X) empregado na etapa (i). Assim, a razão molar da amina (XII) para o tri-haleto de fósforo (X) deve estar em uma faixa de 5:1 a 1:5, de preferência a razão molar da amina (XII) para o tri-haleto de fósforo (X) deve ser cerca de 2:1. Como orientação, o tempo de reação à baixa temperatura antes do aquecimento pode ser de 2 minutos a duas horas, tal como, por exemplo, cerca de 10 minutos, e o tempo de reação após o aquecimento pode ser de 15 minutos a 6 horas, tal como, por exemplo, cerca de uma hora. De preferência, a reação é realizada sob um gás inerte, como argônio. A mistura obtida após a reação da etapa (ii) é preferivelmente usada na etapa (iii) sem isolar o produto. Opcionalmente, após a etapa (ii) e antes da etapa (iii), a mistura pode ser purificada, por exemplo, por filtração de celite. Na etapa (ii) pode ser obtido um produto tendo a estrutura geral , em que Hal é um halogeneto como Cl, Br ou I, dependendo do tri-haleto de fósforo utilizado na etapa 1, por exemplo, Hal é Cl quando PCl3 é usado; e em que R1 e R2 são como definidos acima e abaixo. Etapa (iii)
[180] A etapa (iii), por exemplo, pode ser realizada reagindo o produto obtido na etapa (ii) com um haleto de alquenil magnésio ou um haleto de alquinil magnésio (XIII), ou um haleto de alquenil magnésio (XIII*) em um solvente adequado, como por exemplo, dietil éter ou tetrahidrofurano. A este respeito, o solvente pode ser o mesmo que na etapa (ii). A reação da etapa (ii) pode ser realizada a uma temperatura baixa abaixo de -50°C e, em seguida, aquecendo a reação; por exemplo, a faixa de temperatura pode estar entre –100°C e + 50°C; mais especificamente, a reação pode ser realizada a cerca de -78°C e, em seguida, aquecendo até a temperatura ambiente. A razão molar do haleto de alquenil magnésio ou haleto de alquinil magnésio (XIII), ou o haleto de alquenil magnésio (XIII*) pode ser baseada na quantidade molar do tri-haleto de fósforo (X) empregado na etapa (i). Assim, a razão do haleto de alquenil magnésio ou haleto de alquinil magnésio (XIII), ou o haleto de alquenil magnésio (XIII*) para o tri-haleto de fósforo (X) deve estar em uma faixa de 5:1 a 1:5, de preferência em uma razão de 2:1 a 1:2, mais preferivelmente a razão molar do haleto de alquenil magnésio ou haleto de alquinil magnésio (XIII) para o tri-haleto de fósforo (X) deve ser de cerca de 1:1. Como diretriz, o tempo de reação a baixa temperatura antes do aquecimento pode ser de 2 minutos a uma hora, tal como, por exemplo, cerca de 10 minutos, e o tempo de reação após o aquecimento pode ser de 15 minutos a 6 horas, tal como, por exemplo, cerca de uma hora. De preferência, a reação é realizada sob um gás inerte, como argônio. A mistura obtida pela reação da etapa (iii) pode ser processada e o produto pode ser isolado por métodos geralmente conhecidos por um especialista na técnica, por exemplo, cromatografia em sílica-gel ou destilação a vácuo. Na etapa (iii) um produto tendo a estrutura geral pode ser obtido quando um haleto de alquenil magnésio ou haleto de alquinil magnésio (XIII) é usado, ou um produto tendo a estrutura geral pode ser obtido quando um haleto de alquenil magnésio (XIII*) é usado, em que em qualquer uma dessas estruturas , R1, R2, X e V são como definidos acima e abaixo. Etapa (iv)
[181] A etapa (iv), por exemplo, pode ser realizado reagindo o produto obtido na etapa (iii) com um álcool ou tiol (XIV) compreendendo o resíduo em um solvente adequado, tal como, por exemplo,
acetonitrila. A reação da etapa (ii) pode ser realizada a uma temperatura baixa abaixo de -20°C e, em seguida, aquecendo a reação; por exemplo, a faixa de temperatura pode estar entre –50°C e + 50°C; mais especificamente, a reação pode ser realizada a cerca de -40°C e, em seguida, aquecendo até a temperatura ambiente. De preferência, a reação do produto obtido na etapa (iii) com um álcool ou tiol (XIV) é realizada na presença de um tetrazol. O tetrazol pode ser tetrazol não substituído ou um tetrazol substituído. A razão molar do álcool ou tiol (XIV) para o produto obtido na etapa (iii) deve estar em uma faixa de 5:1 a 1:5, de preferência em uma razão de 2:1 a 1:2, mais de preferência, a razão molar é de cerca de 1:1. Quando um tetrazol é usado, a razão molar do tetrazol para o produto obtido na etapa (iii) pode estar em uma faixa de 5:1 a 1:5, de preferência a razão molar do tetrazol para o produto obtido na etapa (iii) deve ser cerca de 2:1. Como orientação, o tempo de reação a baixa temperatura antes do aquecimento pode ser de 2 minutos a duas horas, tal como, por exemplo, cerca de 10 minutos, e o tempo de reação após o aquecimento pode ser de 15 minutos a 6 horas, tal como, por exemplo, cerca de 30 minutos ou cerca de uma hora. A reação pode ser realizada sob um gás inerte, como argônio. Oxidação para a síntese de compostos de fórmula (I) ou (I*)
[182] A etapa (iv) resulta em um composto de fórmula (IV) ou (IV*). Um composto de fórmula (I) ou (I*) é então obtido por oxidação do composto de fórmula (IV) ou (IV*) no fósforo. A mistura obtida após a reação da etapa (iv) pode ser usada em tal oxidação sem processamento ou purificação adicional, isto é, O oxidante pode ser adicionado diretamente à mistura obtida após a reação da etapa (iv). Vários oxidantes adequados podem ser usados, tais como, por exemplo, hidroperóxido de terc-butila (tBu-OOH), ácido meta- cloroperoxibenzoico (mCPBA), peróxido de hidrogênio (H2O2), iodo (I2), peroximonossulfato de potássio ou oxigênio (O2), por exemplo, oxigênio do ar. O especialista determinará prontamente um oxidante adequado. De preferência, pode-se utilizar hidroperóxido de terc-butila (tBu-OOH) como oxidante. A reação pode ser realizada a uma temperatura entre 0 e 60°C, por exemplo, à temperatura ambiente. A razão molar do oxidante pode ser baseada na quantidade molar do produto obtido na etapa (iii). Assim, a razão molar do oxidante para o produto obtido na etapa (iii) deve estar na faixa de 2:1 a 1:2, de preferência a razão molar do oxidante para o produto obtido na etapa (iii) deve ser 1:1. Como orientação, o tempo de reação para a oxidação pode ser de 2 minutos a duas horas, tal como, por exemplo, cerca de 10 minutos. A reação pode ser realizada sob um gás inerte, como argônio. A mistura obtida pela oxidação pode ser processada e o composto de fórmula (V) ou (V*) obtido pode ser isolado por métodos geralmente conhecidos de um especialista na técnica, por exemplo, por cromatografia em sílica-gel. Síntese de compostos de fórmula (I) ou (I*) a partir de dissulfetos eletrofílicos
[183] A seção a seguir fornece algumas características gerais da síntese de compostos de fórmulas (I) e (I*), em que Y é S (enxofre), partindo de dissulfetos eletrofílicos. Em geral, um especialista na técnica sabe selecionar as condições de reação adequadas para realizar tal síntese. Mais detalhes são fornecidos na seção Exemplo abaixo.
[184] Como indicado aqui acima e abaixo, os compostos de fórmulas (I) ou (I*), em que Y é S, podem ser preparados pela reação de um dissulfeto eletrofílico (XXX) com um tiol (XXXI) compreendendo o resíduo para dar um composto de fórmula (Através da). Os compostos de fórmula (VIb) podem ser preparados de acordo com procedimentos conhecidos na literatura. Em seguida, o composto de fórmula (VIa) ou (VIb) é reagido com um composto de fósforo (III) de fórmula (V) ou (V*) compreendendo o resíduo R1 para dar um composto de fórmula (I) ou (I*). Os compostos de fórmula (V) podem ser preparados pela reação de um halogenofosfito de fórmula (XX) transportando o resíduo R1 com um composto de Grignard de fórmula (XXI), e compostos de fórmula (V*) podem ser preparados por reação de um halogenofosfito de fórmula (XX) com um composto de Grignard de fórmula (XXI*). Síntese de compostos de fórmula (V) ou (V*)
[185] Os compostos de fórmula (V) ou fórmula (V*) podem ser preparados, por exemplo, pela reação de um haleto de alquenil magnésio ou haleto de alquinil magnésio de fórmula (XXI) - de preferência um haleto de alquenil magnésio de fórmula (XXI) ou um alquenil halogeneto de magnésio de fórmula (XXI*) com um halogenofosfito de fórmula (XX) compreendendo o resíduo R1. De preferência, o haleto de alquenil magnésio ou haleto de alquinil magnésio de fórmula (XXI), ou o haleto de alquenil magnésio de fórmula (XXI*), é um brometo de alquenil magnésio ou um brometo de alquinil magnésio. De preferência, o halogenofosfito de fórmula (XX) é um clorofosfito. Como um solvente adequado, por exemplo, dietil éter ou tetrahidrofurano pode ser usado. De preferência, a reação é realizada a uma temperatura abaixo de -20°C, por exemplo, entre –100°C e –40°C, de preferência entre –90°C e –50°C (por exemplo, cerca de –78°C). De preferência, a reação é realizada sob gás inerte, como argônio. Como diretriz, o tempo de reação deve estar na faixa de 2 minutos a 4 horas, como, por exemplo, duas horas. A razão do haleto de alquenil magnésio ou haleto de alquinil magnésio de fórmula (XXI), ou o haleto de alquenil magnésio de fórmula (XXI*) para o halogenofosfito de fórmula (XXI) deve estar em uma faixa de 5:1 a 1:5, por exemplo, de 2:1 a 1:2, por exemplo, em torno de 1:1, como por exemplo, uma razão do haleto de alquenil magnésio ou halogeneto de alquinil magnésio de fórmula (XXI), ou o haleto de alquenil magnésio de fórmula (XXI*) para o halogenofosfito de fórmula (XXI) de cerca de 1:1,2. Mais detalhes são fornecidos, por exemplo, em M. R. J. Vallée, Angewandte Chemie Int. Ed., 2013, 52 (36), 9504. Síntese de compostos de fórmula (VIa) ou (VIb)
[186] Os compostos de fórmula (VIa) ou (VIb) podem ser preparados, por exemplo, por reação de um dissulfeto eletrofílico de fórmula (XXX) com tiol (XXXI) compreendendo o resíduo . A reação pode ser realizada num solvente adequado, como, por exemplo, tetrahidrofurano ou N,N-dimetilformamida (DMF). Preferivelmente, a reação do dissulfeto eletrofílico de fórmula (XXX) com tiol (XXXI) é realizada na presença de uma base fraca, tal como, por exemplo, uma base de amina como trietilamina. A reação pode ser realizada a uma temperatura entre 0°C e 60°C, como por exemplo, à temperatura ambiente. A razão molar do dissulfeto eletrofílico de fórmula (XXX) e tiol (XXXI) deve estar em uma faixa de 5:1 a 1:5, de preferência em uma faixa de 2:1 a 1:2, mais preferivelmente em torno de 1:1, como por exemplo, uma razão do dissulfeto eletrofílico de fórmula (XXX) a tiol (XXXI) de 1,2:1. Quando uma base fraca, tal como uma base de amina como trietilamina é usada, a razão molar da base para o tiol de fórmula (XXXI) pode estar em uma faixa de 5:1 a 1:5, de preferência a razão molar da base para o tiol de fórmula (XXXI) é cerca de 3:1. O tempo de reação pode ser, por exemplo, entre 2 minutos e 6 horas, tal como, por exemplo, cerca de uma hora ou cerca de 20 minutos ou cerca de 10 minutos. A reação pode ser monitorada usando um método apropriado, tal como, por exemplo, cromatografia em camada fina. A reação pode ser realizada sob um gás inerte, como argônio. O composto de fórmula (VIa) que compreende o resíduo pode ser isolado por métodos geralmente conhecidos por um especialista na técnica, por exemplo, por cromatografia em sílica-gel. Os compostos de fórmula VIb podem ser preparados de acordo com procedimentos conhecidos da literatura, por exemplo, reagindo um tiol (XXXI) com cloreto de sulfurila (vide,
por exemplo, Allared, F. et al., Synthetic Metals, 120 (1-3), 1061-1062; 2001) ou cloreto de tionila (vide, por exemplo, Masaki, Yukio et al, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 33 (5), 1930-40; 1985), ou por reação de um tiol (XXXI) com N-clorossuccinimida (NCS) (vide, por exemplo, Kawamura, Takamasa et al. European Journal of Organic Chemistry, 2015 (4), 719-722; 2015) ou cloro (vide, por exemplo, por exemplo, Schneider, Chemische Berichte 84, 911-916 (1951), em que é como definido acima e abaixo. Síntese de compostos de fórmula (I) ou (I*)
[187] Um composto de fórmula (I) ou (I*), em que Y é S, pode ser preparado reagindo um composto de fórmula (V) ou (V*) com um composto de fórmula (VIa) ou (VIb). De preferência, o composto de fórmula (V) ou (V*) é um fosfonito de alqueno, isto é, o em um composto de fórmula (V) ou (V*) é uma ligação dupla. A reação é realizada num solvente orgânico adequado, tal como, por exemplo, em tetrahidrofurano ou em N,N-dimetilformamida (DMF), ou numa mistura de solventes, tal como, por exemplo, numa mistura de tetrahidrofurano e tolueno. A reação pode ser realizada a uma temperatura entre 0°C e 60°C, por exemplo, à temperatura ambiente. De preferência, a reação pode ser realizada sob um gás inerte, como argônio. A razão molar do composto de fórmula (V) ou (V*) para o composto de fórmula (VIa) ou (VIb) deve estar em uma faixa de 5:1 a 1:5, de preferência em uma faixa de 2:1 a 1:1, mais preferivelmente em torno de 1:1, como por exemplo, uma razão molar dos compostos de fórmula (V) ou (V*) para o composto de fórmula (VIa) ou (VIb) é de 1,2:1. Como uma orientação, o tempo de reação pode ser, por exemplo, entre 2 minutos e 6 horas, tal como, por exemplo, cerca de duas horas, cerca de uma hora, cerca de 30 minutos ou cerca de 10 minutos. O composto de fórmula (I) ou (I*) pode ser isolado por métodos geralmente conhecidos por um especialista na técnica, por exemplo, por cromatografia em sílica-gel.
Hidrotiolações de compostos (I) ou (I*) com compostos de fórmula (II)
[188] Os fosfonotiolatos ou fosfonatos de fórmula (I) ou (I*) podem ser submetidos a uma reação de hidrotiolação com um tiol de fórmula (II) em um solvente adequado. O sistema de solventes pode ser escolhido a partir de uma ampla variedade de solventes. O solvente pode ser um sistema de solvente polar aprótico, como tetrahidrofurano (THF), dimetilformamida (DMF), acetonitrila (MeCN), acetona, dimetilsulfóxido (DMSO), acetato de etila (EtOAc), N-etilpirrolidona ou suas misturas, de preferência THF, DMF, DMSO; solventes não polares, tais como hexano, tolueno, benzeno, 1,4-dioxano, clorofórmio, dietil éter ou diclorometano (DCM), preferivelmente DCM; solventes próticos polares, tais como água, etanol, isopropanol, metanol, n-butanol, de preferência etanol; ou suas misturas. Por exemplo, a hidrotiolação pode ser realizada em DMF ou uma mistura de DMF/água. Em particular, a hidrotiolação pode ser realizada em DMF ou uma mistura de DMF/água quando uma biomolécula, tal como, por exemplo, uma proteína, um anticorpo, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, é reagido. O solvente pode ser também um meio aquoso, tal como, por exemplo, água ou um tampão aquoso, tal como, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS), tris(hidroximetil)-aminometano (TRIS), bicarbonato, tampão EDTA/NH4HCO3, EDTA/NH4HCO3 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina tamponada com fosfato contendo borato. A realização da reação em um tampão é preferida no caso de uma biomolécula, tal como, por exemplo, uma proteína, um anticorpo, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, é empregado na reação de hidrotiolação. A hidrotiolação também pode ser realizada em uma mistura de qualquer um dos tampões aquosos acima mencionados e DMF. Os solventes e tampões adequados serão facilmente selecionados por um especialista na técnica.
[189] De preferência, a reação de hidrotiolação de um fosfonotiolato ou fosfonato é efetuada em condições básicas, em particular em condições ligeiramente básicas, por exemplo, a um pH de por exemplo, entre 7,2 e 9, como por exemplo, a um pH de 8 ou 8,5. Tais condições básicas podem ser estabelecidas usando um sistema tampão adequado, tal como, por exemplo, usando qualquer um dos buffers mencionados acima. Além ou alternativamente, as condições básicas para a hidrotiolação da reação de íons pode ser estabelecida usando uma base fraca. As bases adequadas são, por exemplo, carbonatos, tais como (NH4)2CO3, Na2CO3, Rb2CO3, K2CO3 ou Cs2CO3 ou seus hidrogenocarbonatos correlacionados (por exemplo, NaHCO3, etc.); e bases contendo nitrogênio fracas, tais como trimetilamina Et 3N (pKa 10,76 a 25°C). De preferência, é usada uma base com um valor de pKa na faixa de 7,5 a 11,5. As bases adequadas serão prontamente selecionadas por um especialista na técnica.
[190] A temperatura de reação da hidrotiolação não é particularmente limitada. Por exemplo, a hidrotiolação pode ser realizada em temperaturas na faixa de 0°C a 60°C, de 0°C a 50°C, de 0°C a 40°C, de 0°C a 30°C, por exemplo, à temperatura ambiente, isto é, cerca de 25°C, por exemplo, a cerca de 5°C, ou por exemplo, em condições fisiologicamente relevantes a cerca de 37°C. O tempo de reação depende da temperatura, do volume da reação e da quantidade de substância. Como orientação, a reação pode ser, por exemplo, realizado num intervalo de tempo de 1 minuto a 24 horas, por exemplo, num intervalo de tempo de 1 minuto a 20 horas, de 1 minuto a 10 horas, de 1 minuto a 3 horas, ou mesmo num intervalo de tempo entre 1 minuto e uma hora. As temperaturas de reação e os tempos de reação adequados serão facilmente determinados por um especialista na técnica.
[191] Mais detalhes sobre a reação de hidrotiolação são fornecidos na seção de Exemplos abaixo.
EXEMPLOS Exemplo 1: Síntese de Fosfonotiolatos de alqueno
[192] Os inventores desenvolveram duas rotas de síntese diferentes para acessar fosfonotiolatos de alqueno: ou em uma reação de uma etapa de dissulfetos eletrofílicos ou alternativamente a partir de tri-haletos de fósforo, como tricloreto de fósforo (PCl3). Ambas as rotas, bem como os compostos isolados, são aqui descritos (vide o Exemplo 10 aqui abaixo para detalhes de síntese e caracterização) e representados no Esquema 2. Como exemplos meramente ilustrativos, a síntese de derivados é demonstrada em que R1 é metila ou etila, (Derivados de O-etila e O-metila (R1 = metila, etila); vide o Esquema 2). No entanto, ambas as rotas de síntese não se limitam a este escopo. Conforme usado na seção de Exemplos, "R2" ou, em alguns casos, simplesmente "R", ou seja, o resíduo ligado ao S, corresponde ao usado ao longo desta especificação.
Esquema 2: Síntese de Fosfonotiolatos de alqueno. Rota de dissulfeto eletrofílico
[193] Os fosfonotiolatos de alqueno podem ser obtidos em uma reação de uma etapa a partir de um dissulfeto eletrofílico e um alquenofosfonita. Sem querer se limitar a qualquer teoria, presume-se que o par solitário livre do átomo de fósforo do fosfonito ataca o enxofre eletrofílico do dissulfeto, gerando assim um intermediário altamente reativo, que se oxida rapidamente em fosfonotiolato.
[194] A dietilalquenofosfonita foi sintetizada de acordo com protocolos publicados (MRJ Vallée, Angewandte Chemie Int. Ed., 2013,
52 (36), 9504) e reagiu com diferentes dissulfetos eletrofílicos alifáticos, vide Esquema 3. Os dissulfetos eletrofílicos foram obtidos a partir da reação de o respectivo tiol com 2,2'-ditiobis (5-nitropiridina) (PNP). Fosfonotiolatos de alqueno de O-etila foram isolados por cromatografia em coluna de sílica-gel. Os rendimentos são fornecidos na Tabela 1.
Esquema 3: Síntese de Fosfonotiolatos de alqueno de O- etila a partir da reação de dietil alquenofosfonita com dissulfetos eletrofílicos.
Rendimento Entrada Composto isolado(%) R= 1 1 53 2 2 63 3 3 27 4 4 58 Tabela 1: fosfonotiolatos de alqueno de O-etila com rendimentos isolados sintetizados pela via de dissulfureto.
Rota PCl3
[195] Alternativamente, PCl3 pode ser convertido em fosfonotiolatos de alqueno em várias reações de substituição, seguidas por oxidação com um oxidante, por exemplo, tBuOOH (Esquema 4).
Esquema 4: Síntese de fosfonotiolatos de alqueno de PCl3.
[196] Usando esta rota, uma benzila e um derivado de amina protegido por Boc foram gerados e isolados por cromatografia em sílica- gel (vide Tabela 2 para estruturas e rendimentos).
Rendimento Entrada Composto isolado(%) R= 1 5 37 2 6 36 Tabela 2: Fosfonotiolatos de alqueno de O-etila e rendimentos isolados sintetizados através da rota PCl3. Exemplo 2: Síntese de Fosfonotiolatos de alquino
[197] Os fosfonotiolatos de alquino podem ser obtidos a partir de PCl3 analogamente aos fosfonotiolatos de alqueno (vide Exemplo 1 acima e Esquema 5 abaixo).
Esquema 5: Síntese de fosfonotiolatos de alquino por meio da rota PCl3.
[198] Usando a rota PCl3, os inventores poderiam isolar os produtos desejados por cromatografia em sílica-gel (vide Esquema 6 e Tabela 3 para estruturas e rendimentos).
Esquema 6: Síntese de fosfonotiolatos de alquino Rendimento Entrada Composto isolado (%) 1 R1= Metila, R2=Benzila 7 18* 2 R1= Etila, R2=Benzila 8 34 3 R1= Etila, R2= 9 32 Tabela 3: O-metil alquino-PT sintetizado com rendimentos isolados. * (iniciando de Cloreto fosfonamídico de N,N-di- isopropilmetila) Exemplo 3: Funcionalização Adicional de Blocos de Construção de Fosfonotiolato Genérico
[199] Os derivados de ácido carbocíclico genérico ou fosfonotiolato de amina podem ser posteriormente modificados com blocos de construções funcionais, por exemplo, com o fluoróforo EDANS ou com biotina, por exemplo, por meio de um acoplamento de amida. Dois exemplos ilustrativos são mostrados no esquema 7 (para mais compostos e também derivados de alquino vide Exemplo 14 abaixo).
Esquema 7: Exemplos para a funcionalização de blocos de construção fosfonotiolato genéricos. A) Os derivados do ácido carboxílico podem ser ativados no éster NHS e posteriormente reagir com uma amina, por exemplo, o fluoróforo EDANS. B) Alternativamente, os reativos podem ser trocados por acoplamento de PTs de amina a ácidos carboxílicos, por exemplo, biotina. Exemplo 4A: Adição de Tiol de Glutationa a Fosfonotiolatos
[200] Como prova de princípio para demonstrar que fosfonotiolatos insaturados reagem com tióis, os inventores realizaram uma conjugação com o modelo tiol glutationa em tampão aquoso básico para dar um conjugado de fosfonotiolato solúvel em água. A reação foi monitorada 31 por UV LC-MS e P-RMN (vide Figura 1 para fosfonotiolatos de alqueno).
[201] Figura 1 mostra: A) Síntese do conjugado glutationa- fosfonotiolato de alqueno 14. A reação foi monitorada por B) UV LC-MS 31 e C) P-RMN, indicando a formação de um único produto. P: produto 14, SM: material de partida = fosfonotiolato de alqueno 2, PMe4Br = brometo de tetrametilfosfônio, padrão interno para 31P-RMN.
[202] A reação foi monitorada por 31P-RMN e UPLC-MS, indicando uma reação limpa com um único produto (P) formado.
[203] Da mesma forma como acima, os inventores realizaram uma conjugação com glutationa a um derivado de alquino, nomeadamente a
S-benzil O-metil alquino-PT 7 abaixo do Exemplo 11 (Tabela 3, entrada 1) (vide Figura 2A). A reação é consideravelmente mais rápida do que com fosfonotiolatos de alqueno (compare também estudos cinéticos, vide Exemplo 5 aqui abaixo). Sob as condições indicadas, os inventores observaram a conversão total do fosfonotiolato de alquino após ca. 1 minuto. Dois isômeros de ligação dupla são formados em uma razão de cerca de 3:1.
[204] Figura 2 mostra: A) Síntese do conjugado glutationa- alquino-PT-15. A reação foi monitorada por B) UV LC-MS, indicando a formação de dois isômeros duplos em uma razão de ca. 3:1. A inosina foi usada como padrão interno. Exemplo 4B: Adição de Tiol de Glutationa a Fosfonatos de Alqueno
[205] Os inventores realizaram uma conjugação de alquenofosfonato de dietila com glutationa por meio de uma adição de tiol, para dar um conjugado solúvel em água (vide esquema 1).
Esquema 1: Síntese do conjugado glutationa-fosfonato.
[206] A reação foi monitorada por 31P-RMN e UPLC-MS, indicando uma reação limpa com um único produto formado. O conjugado pode ser isolado por HPLC semipreparativa (condições ácidas) com 60% de rendimento. Exemplo 5: Estudo Cinético de Adição de Tiol a Fosfonotiolatos e Fosfonatos
[207] Em uma próxima etapa, os inventores começaram a investigar a cinética da adição de tiol a fosfonotiolatos insaturados a fim de obter dados cinéticos. Para isso, os inventores realizaram a reação de adição com derivados de EDANS fluorescentes para fosfonotiolatos de alqueno e alquino na presença de 1 equivalente de glutationa reduzida à temperatura ambiente (cerca de 25°C) (Esquema 8). Os inventores realizaram o mesmo estudo também com os derivados fosfonato correspondentes. Para a preparação destes compostos, vide o Exemplo 14 abaixo.
Esquema 8: Conjugação de glutationa a fosfonotiolatos e fosfonatos de alqueno e alquino fluorescentes.
[208] Os decaimentos dos materiais de partida foram monitorados ao longo de 8 h por meio de HPLC usando um detector fluorescente. Os resultados deste estudo são apresentados na figura 3 abaixo. Duas tendências se tornam claras: primeiro, os derivados de alquino reagem muito mais rápido na adição de tiol do que os derivados de alqueno. Em segundo lugar, os fosfonotiolatos reagem mais rapidamente do que os fosfonatos. Esta é uma vantagem importante dos fosfonotiolatos, pois permitirá ao usuário realizar a reação em menor concentração e obter maior conversão em menor tempo, eventualmente aumentando também o rendimento da reação. Isso é crucial, por exemplo, na geração de conjugados de anticorpo-droga, onde uma alta razão de droga para anticorpo é geralmente desejada.
[209] Figura 3 mostra: Estudo cinético para a adição de glutationa a fosfonotiolatos e fosfonatos de alqueno e alquino em pH 8,5. São mostrados os decaimentos dos materiais iniciais ao longo do tempo. A intensidade fluorescente do material de partida restante em relação a um padrão interno foi medida usando um HPLC com um detector fluorescente. Cada reação foi realizada em triplicado. São mostrados os valores médios com desvio padrão. A área do material de partida de 1,0 se refere a 100% do material de partida. Exemplo 6: Estudo de Estabilidade de Conjugados Fosfonotiolato
[210] Uma consideração importante ao usar fosfonotiolatos insaturados como manipulações de bioconjugação é se os produtos de adição de tiol resultantes são estáveis sob condições fisiologicamente relevantes. A fim de abordar esta questão, os inventores usaram o par de inibidor de Dabcyl-EDANS e sintetizaram os respectivos conjugados de alqueno e fosfonotiolato de alquino bem como os respectivos conjugados de alqueno e alquino fosfonato (figura 4). Esses compostos nos permitem monitorar a estabilidade dos conjugados em matrizes complexas, como lisado celular ou soro.
[211] Quando o conjugado está intacto, Dabcyl e EDANS estão em estreita proximidade e a fluorescência de EDANS é apagada. Após a clivagem do conjugado, o EDANS é liberado e sua fluorescência pode ser detectada e quantificada.
[212] Estes compostos de par arrefecedores não só permitem monitorar a estabilidade da ligação P-S, mas também para a estabilidade do conjugado tiol. Isso é importante porque a adição potencial de retro-tiol ou troca com outros tióis também poderia ser detectada.
[213] Figura 4 mostra: Projeto de pares arrefecedores de EDANS- Dabcyl, que são conectados por meio da química de conjugação de fosfonotiolato ou fosfonato. Se a porção circundada for clivada, a fluorescência de EDANS não será mais arrefecida, uma vez que perde sua proximidade com Dabcyl.
[214] Os inventores monitoraram a estabilidade dos fosfonotiolatos de alqueno e alquino, bem como dos fosfonatos de alqueno e alquino nas seguintes condições: PBS (solução salina tamponada com fosfato) pH = 7,4, lisado de células Hela, soro humano. A temperatura era a temperatura ambiente (cerca de 25°C). A fluorescência foi monitorada ao longo de ca. 3 dias. Como um controle positivo, EDANS não conjugado e Dabcyl-peptídeo livre (1:1) foram medidos nas mesmas condições. Os resultados são mostrados na figura
5. A coluna da direita mostra um zoom do mesmo conjunto de dados da coluna da esquerda. Além disso, como controle, os fosfonotiolatos e fosfonatos foram tratados com 1M de NaOH, o que resultou em uma rápida clivagem dos fosfonotiolatos e fosfonatos. Isso confirma que nos ensaios usando PBS a pH = 7,4, o lisado de células HeLa ou a clivagem do soro humano ocorre apenas em uma extensão muito baixa, se houver.
[215] Em tampão fosfato (PBS, pH 7,4) todos os derivados apresentam boa estabilidade. No lisado de células Hela e no soro, elas também mostram boa estabilidade, indicando assim que os bioconjugados à base de fosfonotiolato e os bioconjugados à base de fosfonato são estáveis sob condições fisiologicamente relevantes.
[216] Figura 5 mostra: Estabilidade de conjugados de fosfonotiolato e conjugados de fosfonato nas condições indicadas. O aumento da fluorescência implica a clivagem do conjugado. Exemplo 7: Conjugação de proteínas a fosfonotiolatos
[217] Em seguida, os inventores conjugaram fosfonotiolatos de alqueno e alquino com a proteína modelo albumina sérica bovina (BSA) e o anticorpo monoclonal Cetuximab. Exemplo 7A1: Conjugação de Albumina Sérica Bovina a Fosfonotiolatos
[218] Como proteína modelo, os inventores escolheram albumina sérica bovina (BSA) para conjugar com fosfonotiolatos de alqueno e alquino. Com este experimento, é demonstrado que fosfonotiolatos de alqueno e alquino são manipulações de bioconjugatoína adequadas para a modificação seletiva de cisteína do nível de proteína. BSA tem um resíduo de cisteína reduzido (Cys58), que é acessível para alquilação por PTs. As demais cisteínas teoricamente não são reativas aos fosfonotiolatos, pois estão presentes em pontes dissulfeto.
[219] Para a modificação, uma solução de BSA foi reagida por 18 h a 4°C com um excesso de PTs em pH = 7,4- 8,5 (s. Esquema 9).
Esquema 9: Modificação de BSA com PTs.
[220] Após a reação, um SDS-PAGE da proteína modificada foi executado, seguido por uma digestão tríptica em gel, e os peptídeos obtidos foram subsequentemente submetidos à análise de MS/MS.
[221] Os resultados da análise de MS/MS estão resumidos na tabela 4. Uma boa cobertura de sequência de BSA foi obtida para ambos os derivados. Além disso, o grau de modificação é alto (> 50% para fosfonotiolatos de alqueno e > 90% para fosfonotiolatos de alquino). Para o derivado de alqueno-fosfonolato, também outros aminoácidos (His, Ser, Thr, Arg) foram modificados em alguma extensão. No entanto, o uso de menos equivalentes e/ou a redução do pH para 7,4 levou a menos reação com esses aminoácidos. Foi observado que os fosfonotiolatos de alquino reagem mais seletivamente com as cisteínas do que os fosfonotiolatos de alqueno.
Condições Resultado pH eq. PT Fosfonotiolato de alqueno 2 O BSA pode ser detectado com alta cobertura de sequência usando a enzima quimotripsina para digestão. Vários peptídeos contendo C58 podem ser detectados de
8.5 100 eq. forma confiável: 55LQQCPFDEHVKL66, 55LQQCPFDEHVKLVNELTEF73, 56QQCPFDEHVKL66 e 56QQCPFDEHVKLVNELTEF73 poderiam ser identificados com segurança (pontuação > 20) com e sem a modificação do fosfonotiolato. O grau de modificação é alto (> 50%).
Também outros peptídeos podem ser detectados, os quais são modificados pelo fosfonotiolato. A modificação não foi encontrada apenas nas cisteínas, mas também nas histidinas e outros aminoácidos. No entanto, o grau de modificação estimado é significativamente menor para estes peptídeos: (H42 ca. 5-10%, H91/S89/T92 ca. 10- 20%, H169/ R168 menor que 1%, H361/R360 ca. 5- 10%, todos os valores são estimados a partir das taxas de intensidade do sinal.) O BSA pode ser detectado com alta cobertura de sequência usando uma quimiotripsina para digestão. Vários peptídeos contendo C58 puderam ser detectados com segurança
8.5 & 50 eq. (pontuação > 20). O grau de modificação é alto (> 50%).
ou Também outros peptídeos podem ser detectados, os quais são modificados pelo fosfonotiolato. A modificação não foi encontrada apenas nas cisteínas, mas também
7.4 & 100 eq. nas histidinas e outros aminoácidos. No entanto, o grau de modificação estimado é muito menor para estes peptídeos: (H42 ca. 2-5%, H91 ca. 5-10%, H169/ Y171/ R168 ca. 1-5%, H361/ R360 ca. 1-5%, todos os valores são estimados a partir de razões de intensidade de sinal).
As sondas pH 8,5/50 eq. e pH 7,4/100 eq. não mostrou diferenças significativas nos graus de modificações.
Fosfonotiolato de alquino 7 pH= 7.4/8.0/8.5 & 100 eq. Em todos os valores de pH, a única cisteína livre (C58) de BSA foi claramente detectada e descobriu-se que era ca. 90% modificado pelo fosfonotiolato de alquino. As modificações em outros aminoácidos foram estimadas em < 10%, mas mais frequentemente < 1%.
Tabela 4: Resultados da análise de MS/MS da proteína BSA modificada com fosfonotiolato.
[222] Em conclusão, os resultados mostram uma seletividade de cisteína, isto é, conforme desejado, a cisteína de BSA foi modificada seletivamente com um fosfonotiolato de alqueno ou alquino. Exemplo 7A2: Conjugação de albumina sérica bovina para fosfonatos
[223] Os inventores puderam demonstrar ainda que o alquenofosfonato de dietila pode ser conjugado à proteína modelo de albumina sérica bovina (BSA) (esquema 10) de uma forma seletiva para cisteína, conforme indicado pela análise de MS/MS do conjugado (tabela 5). BSA tem um resíduo de cisteína reduzido (Cys58), que é acessível para alquilação.
Esquema 10: Modificação de BSA com alquenofosfonato de dietila.
Condições Resultados pH Eq. fosfonato O BSA pode ser detectado com alta cobertura de
8.5 100 eq. sequência usando a enzima quimotripsina para digestão. Vários peptídeos contendo C58 podem ser detectados: 55 LQQCPFDEHVKL66, 55LQQCPFDEHVKLVNELTEF73, e 56 QQCPFDEHVKL66 pode ser identificado de forma confiável (pontuação > 20) com e sem a modificação de fosfonato. O grau de modificação é alto (> 50%).
Também podem ser detectados outros peptídeos, que são modificados pelo fosfonato. A modificação não foi encontrada apenas nas cisteínas, mas também nas histidinas, lisina e treonina. No entanto, o grau estimado de modificação é significativamente menor para estes peptídeos: (K44 e H361 kess 1%, T255/K256 e K297/299 e ou C301/302 1-3%, todos os valores são estimados a partir de razões de intensidade de sinal). Tabela 5: Resultados da análise de MS/MS da proteína BSA modificada com fosfonato.
[224] Em conclusão, também estes resultados mostram uma seletividade de cisteína, ou seja, conforme desejado, a cisteína de BSA foi modificada seletivamente com um fosfonato de alqueno ou alquino. Exemplo 7B: Conjugação de Anticorpo a Fosfonotiolatos
[225] Finalmente, os inventores aplicaram esta nova sequência de reação seletiva de cisteína para a conjugação de anticorpos IgG (esquema 11). A estratégia de modificação baseia-se em uma abordagem de redução-alquilação em duas etapas, anteriormente aplicada à conjugação de maleimida (S. O. Doronina, B. E. Toki, M. Y. Torgov, B. A. Mendelsohn, C. G. Cerveny, D. F. Chace, R. L. DeBlanc, R. P. Gearing, T. D. Bovee, C. B. Siegall, J. A. Francisco, A. F. Wahl, D. L. Meyer, P. D. Senter, Nat Biotech 2003, 21, 778-784). Na primeira etapa, as pontes dissulfureto intercadeia que mantêm o anticorpo unido são reduzidas após tratamento com ditiotreitol (DTT). Os tióis livres podem então reagir com os fosfonotiolatos em uma reação de adição de tiol. Os primeiros experimentos foram realizados com Cetuximab, um anticorpo IgG1 monocolonal contra o fator de crescimento epidérmico humano.
Esquema 11: Redução em duas etapas e abordagem de alquilação para modificação seletiva de anticorpos para cisteína com um fosfonotiolato de alqueno modificado por biotina 4.
[226] Como prova de princípio, o anticorpo foi modificado com derivado de biotina alqueno 4 e analisado por SDS-PAGE, seguido por um western blotting antibiotina.
[227] Os resultados da análise de Western blot antibiotina são mostrados na figura 6. A modificação dos fragmentos de anticorpo (cadeia pesada e leve) com derivado de fosfonotiolato de biotina 4 a pH = 7,4 (faixa 3) e pH = 8,5 (faixa 5) poderia ser confirmada. O rendimento é maior para pH mais alto = 8,5 (compare as faixas 3 e 5). Observe que nenhuma modificação pode ser detectada sem redução prévia das ligações dissulfeto com DTT (faixas 4 e 6). Para comparação, o anticorpo também foi marcado com biotina-maleimida em pH = 7,4 usando o mesmo protocolo. Embora o grau de modificação no caso da maleimida seja maior em comparação com o PT (comparar as faixas 1 e 3), a reação aparentemente não é quimiosseletiva para a cisteína, uma vez que também há modificação detectada para o anticorpo não reduzido (faixa 2).
[228] Figura 6 mostra: análise de Western blot de conjugação de Cetuximab após redução do gel de SDS. Em cima: A coloração de Ponceau S da membrana após o blotting mostra quantidades iguais de anticorpo manchados. Abaixo: Detecção de quimioluminescência (Strep-HRP) de fragmentos de anticorpo modificado com biotina. A reação do anticorpo reduzido com os compostos de biotina foi realizada a pH = 7,4 (faixas 1-4) ou a pH = 8,5 (faixas 5-6). M = marcador (escada de proteína).
[229] Além disso, os inventores também realizaram a conjugação de Cetuximab com os derivados de biotina-fosfonotiolato 28 (alquino) e 13 (alqueno) em pH 8,5 (Figura 7A) e a conjugação de Cetuximab com 28 em pH 7,4, 8,0 e 8,5 como comparação (Figura 7B). Os fosfonotiolatos de alquino são mais eficazes na marcação do anticorpo do que os fosfonotiolatos de alqueno (Figura 7A). Da mesma forma que para o fosfonotiolato de alqueno 4 (Figura 6), também para o fosfonotiolato de alquino 28, mais marcação do anticorpo é obtida com o fosfonotiolato de alquino com pH crescente.
[230] Figura 7 mostra: análise de Western blot de conjugação de Cetuximab após redução do gel de SDS. A) Modificação em pH 8,5 com os compostos 13 e 28. B) Modificação em pH 7,4-8,5 com o composto
28.
[231] Em conclusão, os resultados mostram uma seletividade de cisteína, isto é, conforme desejado, as cisteínas do anticorpo foram modificadas seletivamente com um fosfonotiolato de alqueno ou alquino. Exemplo 8: Procedimentos para a Síntese de Dissulfetos Eletrofílicos Procedimento geral A: Síntese de dissulfetos mistos de 2,2′-Ditiobis(5- nitropiridina)
[232] Um frasco de fundo redondo seco à chama foi carregado com 1,0 mmol (1,0 eq.) de tiol em 10 ml (c = 0,1 M) THF. 3,0 mmol (3,0 eq.) de trietilamina e 1,2 mmol (1,2 eq.) de dissulfeto de 2,2'-Ditiobis(5- nitropiridina) foram subsequentemente adicionados e a mistura de reação foi agitada durante 10 min à temperatura ambiente. A reação foi monitorada por meio de TLC. Quando a conversão total foi alcançada (aproximadamente 10 min), os voláteis foram evaporados sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash em sílica-gel. 2-(etildisulfanil)-5-nitropiridina
[233] 2-(etildissulfanoil)-5-nitropiridina foi preparada de acordo com o procedimento geral A a partir de etanotiol (103 µl, 1,34 mmol). O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (hexanos/EtOAc = 10:1) para produzir o composto do título como um óleo amarelo (228 mg, 1,05 mmol, 78%). 1 H RMN (300 MHz, clorofórmio-d) δ = 9,24 (d, J = 2,6, 1H), 8,39 (dd, J = 8,9, 2,6, 1H), 7,92 (d, J = 8,9, 1H), 2,85 (q, J = 7,3, 2H), 1,34 (t, J = 7,3, 3H) ppm. 13 C RMN (75 M, clorofórmio-d) δ = 169,42, 145,15, 141,99, 131,67, 119,18, 33,01, 14,36 ppm. HRMS (ESI): calcd para C7H9N2O2S2 [M+H+]: 217,0100; encontrado: 217,0106. 2-(benzildisulfanoil)-5-nitropiridina
[234] 2-(benzildisulfanoil)-5-nitropiridina foi preparada de acordo com o procedimento geral A a partir de mercaptano de benzila (48 µl, 0,41 mmol). O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (hexanos/EtOAc = 10:1) para produzir o composto do título como um sólido incolor (91 mg, 0,33 mmol, 80%). 1 H RMN (300 MHz, clorofórmio-d) δ = 9,18 (d, J = 2,6, 1H), 8,15 (dd, J = 8,9, 2,6, 1H), 7,49 (d, J = 8,9, 1H), 7,30 - 7,24 (m, 2H), 7,24- 7,17 (m, 3H), 4,04 (s, 2H) ppm. 13 C RMN (75 MHz, clorofórmio-d) δ = 168,90, 144,86, 141,81, 136,10, 131,17, 129,50 (2C), 128,83 (2C), 128,04, 119,03, 77,36, 43,86 ppm. HRMS (ESI): calcd para C12H11N2O2S2 [M+H+]: 279,0256; encontrado: 279,0271. Ácido 3-((5-nitropiridin-2-il)dissulfanoil)propanoico
[235] Ácido 3-((5-nitropiridin-2-il)dissulfanoil)propanoico foi preparado de acordo com o procedimento geral A a partir de ácido mercaptopropiônico (250 µl, 2,85 mmol). O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (hexanos/EtOAc = 1:1 + 0,1% de ácido fórmico) para render o composto do título como um óleo amarelo (80 mg, 1,54 mmol, 54%). 1 H RMN (300 MHz, clorofórmio-d) δ = 9,26 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 8,40 (dd, J = 8,8, 2,7 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,09 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,82 (t, J = 6,8 Hz, 2H) ppm. 13 C RMN (75 MHz, clorofórmio-d) δ = 177,25, 168,05, 145,34, 142,35, 131,91, 119,68, 33,69, 33,33. HRMS: n.d. 2-(biotinildissulfanoil)-5-nitropiridina
[236] 2-(biotinildisulfanoil)-5-nitropiridina foi preparada de acordo com o procedimento geral A a partir de biotintiol (44 mg, 0,179 mmol). O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (DCM/MeOH = 20: 1 a 10: 1) para produzir o composto do título como um sólido amarelo (53 mg, 0,134 mmol, 75%). 1 H RMN (300 MHz, clorofórmio-d) δ = 9,27 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 8,42 (dd, J = 8,9, 2,6 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 4,51 (s, 1H), 4,37 - 4,24 (m, 1H), 3,14 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 2,97 - 2,68 (m, 4H), 1,76 - 1,61 (m, 4H), 1,44 (d, J = 3,5 Hz, 4H) ppm. HRMS (ESI): calcd para C15H21N4O3S3 [M+H+]: 401,0770; encontrado: 401,0791. Exemplo 9: Procedimentos para a Síntese de Precursores de Fósforo (III) 1-etóxi-1-etinil-N,N-di-isopropilfosfanamina
[237] Um frasco Schlenk de fundo redondo seco à chama foi carregado com tricloreto de fósforo (12,5 mmols, 1090 µl) e éter seco (50 mL) sob uma atmosfera de argônio e resfriado a -30°C em um banho de gelo seco. Etanol (12,5 mmols, 728 µl) e trietilamina (12,5 mmols, 1,733 ml) foram adicionados e a solução foi agitada a -30°C durante 10 min antes de aquecer à r.t. e agitada por mais uma hora. A suspensão branca resultante foi filtrada sobre celite. O filtrado foi recolhido em um frasco Schlenk de fundo redondo seco à chama e arrefecido novamente a -30°C sob uma atmosfera de argônio. Di-isopropilamina (25 mmol, 3,528 ml) foi adicionada e a mistura de reação foi agitada a -30°C durante 10 min antes de aquecer até à r.t. e agitada por mais uma hora. A suspensão resultante foi filtrada sobre celite novamente. O filtrado límpido foi arrefecido a -78°C sob uma atmosfera de argônio e foi adicionada uma solução de brometo de etinilmagnésio (0,5 M em THF, 13,75 mmols, 27,5 ml), agitada durante 10 min a -78°C e depois à r.t.
por mais uma hora. A mistura de reação foi então concentrada até cerca de 20 ml sob pressão reduzida, diluída com NaHCO 3 aquoso saturado (60 ml) e extraída com EtOAc (3x 120 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre NaSO4, filtradas e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. O resíduo oleoso resultante foi purificado por cromatografia em sílica-gel para produzir o composto do título como um óleo amarelo (1,236 g, 6,14 mmol, 49%) em ca. de 80% de pureza avaliada por 1H e 31 P RMN. O composto foi usado nas próximas etapas sem purificação adicional. 1 H-RMN (300 MHz, acetonitrila-d3) δH = 3,84-3,57 (m, 4H), 3,35 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 1,20 (m, 15 H) ppm. 13 C-RMN (75 MHz, acetonitrila-d3) δC = 91,78 (d, J = 7,4 Hz), 85,72 (d, J = 17,8 Hz), 61,9 (d, J = 16,2 Hz), 47,4, 23,5, 16,5 (d, J = 16,5) ppm. 31 P-RMN (122 MHz, acetonitrila-d3) δP = 92,25 ppm. HRMS (ESI): calculado para NaC10H20NOP [M+Na+]: 224,1180; encontrado: 224,1270. 1-etóxi-N,N-di-isopropil-1-vinilfosfanamina
[238] Um frasco Schlenk de fundo redondo seco à chama foi carregado com tricloreto de fósforo (12,5 mmols, 1090 µl) e éter seco (50 ml) sob uma atmosfera de argônio e resfriado a -30°C em um banho de gelo seco. Etanol (12,5 mmols, 728 µl) e trietilamina (12,5 mmols, 1,733 ml) foram adicionados e a solução foi agitada a -30°C durante 10 min antes de aquecer à r.t. e agitada por mais uma hora. A suspensão branca resultante foi filtrada sobre celite. O filtrado foi recolhido em um frasco Schlenk de fundo redondo seco à chama e arrefecido novamente a -30°C sob uma atmosfera de argônio. Di-isopropilamina (25 mmols,
3,528 ml) foi adicionada e a mistura de reação foi agitada a -30°C durante 10 min antes de aquecer até à r.t. e agitada por mais uma hora. A suspensão resultante foi filtrada sobre celite novamente. O filtrado límpido foi arrefecido a -78°C sob uma atmosfera de argônio e foi adicionada uma solução de brometo de vinilmagnésio (1,0 M em THF, 13,75 mmols, 13,75 ml), agitada durante 10 min a -78°C e depois à r.t. por mais uma hora. A mistura de reação foi então concentrada até cerca de 20 ml sob pressão reduzida, diluída com NaHCO 3 aquoso saturado (60 ml) e extraída com EtOAc (3x 120 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre NaSO4, filtradas e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. O resíduo oleoso resultante foi purificado por cromatografia em sílica-gel para produzir o composto do título como um óleo incolor (852 mg, 4,19 mmols, 34%) em> 95% de pureza avaliada por 1H e 31P RMN. 1 H-RMN (300 MHz, acetonitrila-d3) δH = 6,36-6,14 (m, 1H), 5,77-5,53 (m, 2H), 3,81-3,61 (m, 2H), 3,47 (dt, J = 9,8, 6,7 Hz, 2H), 1,23- 1,04 (m, 15 H) ppm. 13 C-RMN (75 MHz, acetonitrila-d3) δC = 142,30 (d, J = 6,9 Hz), 124,41 (d, J = 19,6 Hz), 62,1 (d, J = 20,7 Hz), 45,5 (d, J = 9,50 Hz), 23,90 (m), 16,66 (d, J = 7,7 Hz) ppm. 31 P-RMN (122 MHz, acetonitrila-d3) δP = 113,79 ppm. HRMS (ESI): calc para C10H23NOP [M+H+]: 204,1517; encontrado: 204,1596. Exemplo 10: Procedimentos para a Síntese de Fosfonotiolatos de Alqueno Procedimento geral B: Síntese de alqueno-PTs por meio da rota de dissulfeto
[239] 0,5 mmol (1,0 eq.) de dissulfeto misto foi colocado em um tubo Schlenk seco à chama e dissolvido em uma mistura de THF/tolueno seco (2:1, 5 mL) sob uma atmosfera de argônio. À mistura agitada foi adicionada uma solução de alquenofosfonito de dietila (ca. 0,6 M em THF, 0,6 mmol, 0,6 mL, 1,2 eq.) gota a gota à temperatura ambiente e agitada durante 10 min. A mistura de reação foi então empacotada a seco em sílica-gel e purificada por cromatgrafia em coluna flash. O, S-dietil alqueno-PT (composto 1)
[240] O,S-dietil alqueno-PT foi preparado de acordo com o procedimento geral B a partir de dissulfureto misto 2-(etildisulfanoil)-5- nitropiridina (100 mg, 0,462 mmol). O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (hexanos/EtOAc = gradiente 4:1 a 1:1) para produzir o composto do título como um óleo incolor (44 mg, 0,244 mmol, 53%). 1 H RMN (300 MHz, clorofórmio-d) δ = 6,40 - 5,98 (m, 3H), 4,30 - 4,06 (m, 2H), 2,89-2,72 (m, 2H), 1,41-1,30 (m, 6H) ppm. 13 C RMN (75 MHz, clorofórmio-d) δ = 133,92, 131,82, 129,90, 61,83, 24,98, 16,51 ppm. 31 P RMN (122 MHz, clorofórmio-d) δ = 42,12 ppm. HRMS (ESI): calculado para C6H14O2PS [M+H+]: 181,0447; encontrado: 181,0460. S-benzil O-etil alqueno-PT (composto 2)
[241] S-benzil O-etil alqueno-PT foi preparado de acordo com o procedimento geral B a partir de dissulfeto misto 2-(benzildisulfanoil)-5- nitropiridina (100 mg, 0,359 mmol). O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (hexanos/EtOAc = gradiente 4: 1 a 1: 1) para produzir o composto descrito 2 como um o amarelo il (55 mg, 0,227 mmol, 63%). 1 H RMN (300 MHz, clorofórmio-d) δ = 7,42- 7,19 (m, 5H), 6,40 - 5,91 (m, 3H), 4,28-3,39 (m, 4H), 1,31 (t, J = 7,1 Hz, 3H) ppm. 13 C (75 MHz, clorofórmio-d) δ = 162,92, 137,01, 134,54, 130,53, 128,87, 128,59, 128,57, 127,56, 62,23, 34,37, 16,08 ppm. 31 P RMN (122 MHz, clorofórmio-d) δ = 42,69 ppm. HRMS (ESI): calc para C11H15O2PS [M+H+]: 242,0525; encontrado: 242,0551. O-etil S-biotina alqueno-PT (composto 4)
[242] O-etil S-biotina alqueno-PT foi preparado de acordo com o procedimento geral B a partir de dissulfeto misto 2-(biotinildisulfanoil)-5- nitropiridina (40 mg, 0,100 mmol) em uma mistura de solvente THF/DMF = 5:1. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (100% DCM para DCM/MeOH = gradiente 9:1) para produzir o composto descrito 4 como um sólido amarelo (21 mg, 0,0576 mmol, 58%). 1 H RMN (600 MHz, clorofórmio-d) δ = 6,35- 6,05 (m, 3H), 5,83 (d, J = 24,7 Hz, 1H), 5,24 (s, 1H), 4,52 (dd, J = 7,8, 4,9 Hz, 1H), 4,32 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, 1H), 4,26 - 4,11 (m, 2H), 3,17 - 3,12 (m, 1H), 2,92 (dd, J = 12,8, 5,0 Hz, 1H), 2,87 - 2,72 (m, 3H), 2,15 (s, 2H), 1,75- 1,60 (m, 4H), 1,49-1,39 (m, 4H), 1,36 (td, J = 7,1, 1,5 Hz, 3H) ppm. 13 C RMN (151 MHz, clorofórmio-d) δ = 163,43, 133,85, 130,75 (dd, J = 145,2, 9,9 Hz), 62,10 - 61,69 (m, 2C), 60,17, 55,52,
40,53, 30,59 (t, J = 5,2 Hz), 30,12, 28,51 (d, J = 8,7 Hz), 28,30 (d, J = 25,5 Hz, 2C), 16,32 (d, J = 6,8 Hz) ppm. 31 P RMN (122 MHz, clorofórmio-d) δ = 42,57 ppm. HRMS (ESI): calcd para C14H26N2O3PS2 [M+H+]: 365,1117; encontrado: 365,1141. Ácido 3-((etóxi(alqueno)fosforil)tio)propanoico (composto 3)
[243] O ácido 3-((etóxi(alqueno)fosforil)tio)propanoico foi preparado de acordo com o procedimento geral B a partir de ácido dissulfeto 3-((5-nitropiridin-2-il)dissulfanoil)propanoico misto (146 mg, 0,561 mmol). O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (hexanos/EtOAc = 4:1 sem ácido para EtOAc + ácido fórmico 0,1%) para se obter o composto 3 como um óleo incolor (33,7 mg, 0,150 mmol, 27%). Uma amostra* analiticamente pura foi obtida por purificação por HPLC subsequente (5-40% MeCN em 30 min). 1 H RMN (600 MHz, clorofórmio-d) δ = 9,25 (s, 1H), 6,38 - 6,08 (m, 3H), 4,26 - 4,13 (m, 2H), 3,09 - 2,96 (m, 2H), 2,74 (t, J = 7,2, 2H), 1,35 (t, J = 7,1, 3H) ppm. 13 C RMN (151 MHz, clorofórmio-d) δ = 174,98, 134,92, 130,18 (d, J = 145,9 Hz), 62,52 (d, J = 6,9 Hz), 35,73 (d, J = 3,5 Hz), 25,02 (d, J = 2,8 Hz), 16,38 (d, J = 6,9 Hz) ppm. 31 P RMN (122 MHz, clorofórmio-d) δ = 43,17 ppm. HRMS (ESI): calc para C7H14O4PS2 [M+H+]: 225,0345; encontrado: 225,0358.
3-((etóxi(alqueno)fosforil)tio)propanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (composto 10)
[244] 10 mg de ácido carboxílico, ácido 3- ((etóxi(alqueno)fosforil)tio)propanoico 3 (0,0446 mmol, 1,0 eq) e N- hidroxissuccinimida (5,1 mg, 0,0446 mg, 1,0 eq.) foram dissolvidos em 400 μL de um dioxano/EtOAc = mistura 1:1 e arrefecida a 0°C. 9,2 mg de diciclohexilcarbodi-imida (0,0446 mmol, 1,0 eq.) foram adicionados à solução agitada e a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente. Após uma hora, a suspensão foi filtrada e o resíduo límpido foi seco sob pressão reduzida para produzir 12 mg do produto 10 descrito (0,0374 mmol, 84%). 1 H RMN (600 MHz, clorofórmio-d) δ = 6,39-6,09 (m, 3H), 4,29-4,13 (m, 2H), 3,19-2,99 (m, 4H), 1,37 (t, J = 7,1 Hz, 3H) ppm. 13 C RMN (151 MHz, clorofórmio-d) δ = 168,92, 166,85, 134,76, 130,50 (d, J = 146,2 Hz), 62,41 (d, J = 6,8 Hz), 33,03 (d, J = 3,0 Hz), 25,71, 24,57 (d, J = 2,9 Hz), 16,40 (d, J = 6,9 Hz) ppm. 31 P RMN (122 MHz, clorofórmio-d) δ = 41,44 ppm. HRMS (ESI): calculado para C11H17NO6PS [M+H+]: 322,0509; encontrado: 322,0540. Ácido 5-((2-(3-((etóxi(alqueno)fosforil)tio)propanamido)etil) amino)naftaleno-1-sulfônico (composto 11)
[245] 30 mg de 3-((etóxi(alqueno)fosforil)tio)propanoato 2,5- dioxopirrolidin-1-ila de éster NHS 10 (0,0934 mmol, 1,0 eq.) e 30 mg de EDANS (0,103 mmol, 1,1 eq.) foram dissolvidos em 470 μL de DMF em um tubo Eppendorf. 33 μL (0,189 mmol, 2,0 eq.) de DIPEA foram adicionados e a suspensão foi agitada em temperatura ambiente por 15 minutos. Os voláteis foram evaporados sob pressão reduzida e o produto em bruto foi purificado por HPLC preparativa (5-60% de MeCN em 40 min, fluxo de 16 ml/min) para render 24 mg do composto descrito 11 (0,0508 mmol, 54%) como um branco pó após a liofilização. 1 H RMN (600 MHz, DMSO-d6) δ = 8,32 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,22 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,96 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,40 (dd, J = 8,5, 7,1 Hz, 1H), 7,34 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 6,38 (ddd, J = 28,0, 18,4, 12,4 Hz, 1H), 6,25- 6,11 (m, 2H), 4,14- 3,98 (m, 2H), 3,41 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,32 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,93 (ddt, J = 18,0, 12,9, 6,6 Hz, 2H), 1,26 (t, J = 7,0 Hz, 3H) ppm. 13 C RMN (151 MHz, DMSO-d6) δ = 170,42, 144,21, 134,28, 130,60 (d, J = 142 Hz), 130,09, 125,92, 124,59, 124,07, 123,23, 122,62, 61,37 (d, J = 6,7 Hz), 44,79, 37,23, 36,23 (d, J = 4,0 Hz), 25,42 (d, J = 2,8 Hz), 16,10 (d, J = 6,5 Hz) ppm. 31 P RMN (243 MHz, DMSO-d6) δ = 41,29 ppm. HRMS (ESI): calcd para C19H26N2O6PS2 [M+H+]: 473,0964; encontrado: 473,0984. Procedimento Geral C: Síntese de alqueno-PTs através da rota PCl3
[246] Um frasco de fundo redondo foi carregado com 1-etóxi-N,N- di-isopropil-1-vinilfosfanamina (por exemplo, 0,3 mmol), dissolvido em acetonitrila seca (3 ml) e resfriado a -40°C. Separadamente, uma solução do tiol (0,3 mmol) em tetrazol (0,45 M em MeCN, 0,6 mmol, 1,33 mL) foi preparada e adicionada à mistura agitada a -40°C. A mistura de reação foi agitada a -40°C durante 10 min e depois aquecida à r.t. e agitada por mais 30 min. A esta mistura foi adicionada uma solução de hidroperóxido de terc-butila (70% em peso em H2O, 0,3 mmol, 86 μL) à r.t. e agitada durante 10 min. A mistura de reação foi então diluída com H2O (10 mL) e extraída com DCM (3x 30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4, filtradas e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em sílica-gel. (2-((etóxi(vinil)fosforil)tio)etil)carbamato de terc-butila (composto 6)
[247] O composto 6 foi preparado de acordo com o procedimento geral C partindo de 1-etóxi-N,N-di-isopropil-1-vinilfosfanamina (93 mg, 0,465 mmol) e (2-mercaptoetil)carbamato de terc-butila (82 mg, 0,465 mmol). A purificação por cromatografia em sílica-gel (100% acetato de etila) deu o composto desejado como um óleo incolor (30 mg, 0,10 mmol, 22%). Exemplo 11: Procedimentos para a Síntese de Fosfonotiolatos de Alquino S-benzil O-metila etinil-PT (composto 7)
[248] A um tubo de Schlenk seco à chama equipado com uma barra de agitação sob uma atmosfera de argônio, THF seco (17 mL) foi adicionado, seguido por brometo de etinilmagnésio em THF (0,5 M, 4 mL, 2 mmols). Esta solução foi então resfriada a -78°C, carregada com 1-cloro-N,N-di-isopropil-1-metoxifosfanamina (0,39 mL, 2 mmols) e agitada por 10 min, antes de aquecer a 0°C por 35 min, e em seguida 31 r.t. (0,5 mL da mistura de reação foi então levada para P-RMN). A mistura de reação foi então transferida para um RBF seco à chama sob argônio, o solvente removido in vacuo para deixar um sólido e o frasco novamente preenchido com argônio. O sólido foi resfriado a -40°C, tetrazol seco em MeCN (11 mL, 5 mmols) adicionado, carregado com benziltiol seco (0,6 mL, 1,7 mmol) e agitado durante a noite para dar uma suspensão sólida. A esta mistura 70% de hidroperóxido de terc- butila em H2O (1,6 mL, 12 mmols) foi adicionado, e agitada por 30 min. O solvente foi então removido in vacuo, diluído com água, extraído com DCM, lavado com salmoura e seco sobre MgSO4. O solvente foi removido in vacuo para dar um óleo marrom, que foi carregado em uma coluna de sílica-gel com hexano/acetato de etila (1:0 a 1:1) como eluente para dar o produto puro como um óleo amarelo (82 mg, 0,362 mmol, 18%). 1 H-RMN (300 MHz, CDCl3) δH = 7,40 - 7,28 (5H, m, 5 x C(sp2)-H) aromático, 4,17 (1H, d, 3JHP = 3,2 Hz, S-CHa), 4,11 (1H, d, 3 JHP = 1,8 Hz, S-CHb), 3,71 (3H, d, 3JHP = 14,0 Hz, O-CH3), 3,20 (1H, d, 3JHP = 12,6 Hz, CCH) ppm. 13 C-RMN (76 MHz, CDCl3) δC = 135,39 (d, 3JCP = 6,1 Hz, IPSO aromático C(sp2)), 129,07 (s, meta aromático C(sp2)), 128,76 (s, orto aromático C(sp2)), 127,88 (s, para aromático C(sp2), 89,76 (d, 2JCP = 43,2 Hz, C(sp)-H), 76,66 (d, 1JCP = 239,2 Hz, C(sp)), 52,93 (d, 2JCP = 6,2 Hz, O-CH3), 34,96 (d, 2JCP = 3,5 Hz). 31 P-RMN (122 MHz, CDCl3) δP = 17,59 (m) ppm. HRMS (ESI): calculado para C10H11O2PS [M+H+]: 227,0290; encontrado: 227,0293. Procedimento Geral D: Síntese de Fosfonotiolatos de Alquino através da rota PCl3
[249] Um frasco de fundo redondo foi carregado com 1-etóxi-N,N- di-isopropil-1-etinilfosfanamina (por exemplo, 0,3 mmol), dissolvido em acetonitrila seca (3 ml) e resfriado a -40°C. Separadamente, uma solução do tiol (0,3 mmol) em tetrazol (0,45 M em MeCN, 0,6 mmol, 1,33 mL) foi preparada e adicionada à mistura agitada a -40°C. A mistura de reação foi agitada a -40°C durante 10 min e depois aquecida à r.t. e agitada por mais 30 min. A esta mistura foi adicionada uma solução de hidroperóxido de terc-butila (70% em peso em H2O, 0,3 mmol, 86 μL) à r.t. e agitada durante 10 min. A mistura de reação foi então diluída com H2O (10 mL) e extraída com DCM (3x 30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4, filtradas e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em sílica-gel. S-benzil O-etila etinilfosfonotioato (composto 8)
[250] O composto 8 foi preparado de acordo com o procedimento geral C a partir de 1-etóxi-N,N-di-isopropil-1-etinilfosfanamina (25 mg, 0,123 mmol) e mercaptobenzil (14,4 μL, 0,123 mmol). A purificação por cromatografia em sílica-gel (100% acetato de etila) deu o composto desejado como um óleo incolor (10 mg, 0,042 mmol, 34%). 1 H-RMN (300 MHz, CDCl3) δH = 7,45-7,25 (m, 5H), 4,28-4,02 (m, 4H), 3,12 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 1,35 (t, J = 7,1 Hz, 3H) ppm. 13 C-RMN (76 MHz, CDCl3) δC = 136,47 (d, J = 6,4 Hz), 129,09, 128,91, 127,84, 88,90 (d, J = 43,0 Hz), 63,50 (d, J = 3,3 Hz), 35,04 (d, J = 3,3 Hz), 28,27, 16,05 (d, J = 7,7 Hz) ppm. 31 P-RMN (122 MHz, CDCl3) δP = 15,36 ppm. HRMS: n.d. (2-((etóxi(etinil)fosforil)tio)etil)carbamato de terc-butila (composto 9)
[251] O Composto 9 foi preparado de acordo com o procedimento geral e D partindo de 1-etóxi-N,N-di-isopropil-1-etinilfosfanamina (93 mg, 0,465 mmol) e (2-mercaptoetil)carbamato de terc-butila (82 mg, 0,465 mmol). A purificação por cromatografia em sílica-gel (100% acetato de etila) deu o composto desejado como um óleo incolor (50 mg, 0,17 mmol, 37%).
Exemplo 12: Procedimentos para a Síntese de Fosfonatos de alqueno Procedimento geral E: Síntese de fosfonatos de alqueno através da rota PCl3
[252] Um frasco de fundo redondo foi carregado com 1-etóxi-N,N- di-isopropil-1-vinilfosfanamina (por exemplo, 0,3 mmol), dissolvido em acetonitrila seca (3 ml) e resfriado a -40°C. Separadamente, uma solução do álcool (0,3 mmol) em tetrazol (0,45 M em MeCN, 0,6 mmol, 1,33 mL) foi preparada e adicionada à mistura agitada a -40°C. A mistura de reação foi agitada a -40°C durante 10 min e depois aquecida à r.t. e agitada por mais 30 min. A esta mistura foi adicionada uma solução de hidroperóxido de terc-butila (70% em peso em H2O, 0,3 mmol, 86 μL) à r.t. e agitada durante 10 min. A mistura de reação foi então diluída com H2O (10 mL) e extraída com DCM (3x 30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4, filtradas e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em sílica-gel. Vinilfosfonato de benzil etila
[253] O vinilfosfonato de benzil etila foi preparado de acordo com o procedimento geral E a partir de 1-etóxi-N,N-di-isopropil-1- vinilfosfanamina (25 mg, 0,123 mmol) e álcool benzílico (12,3 μL, 0,123 mmol). A purificação por cromatografia em sílica-gel (acetato de etila 100%) deu o composto desejado como um óleo incolor (2 mg, 0,0088 mmol, 7%). (O baixo rendimento pode ser explicado pela perda do produto de uma etapa de manuseio durante a purificação.)
(2-((etóxi(vinil)fosforil)óxi)etil)carbamato de terc-butila
[254] O composto do título foi preparado de acordo com o procedimento geral E a partir de 1-etóxi-N,N-di-isopropil-1- vinilfosfanamina (201 mg, 1,00 mmol) e (2-hidroxietil)carbamato de terc- butila (161 mg, 1,00 mmol). A purificação por cromatografia em sílica- gel (100% acetato de etila) deu o composto desejado como um óleo incolor (100 mg, 0,358 mmol, 36%). HRMS (ESI): calculado para NaC11H22NO5P [M+Na+]: 302,1133; encontrado: 302,1120. Exemplo 13: Procedimentos para a Síntese de fosfonatos de alquino Procedimento Geral F: Síntese de fosfonatos de alquino através da rota PCl3
[255] Um frasco de fundo redondo foi carregado com 1-etóxi-N,N- di-isopropil-1-etinilfosfanamina (por exemplo, 0,3 mmol), dissolvido em acetonitrila seca (3 ml) e resfriado a -40°C. Separadamente, uma solução do álcool (0,3 mmol) em tetrazol (0,45 M em MeCN, 0,6 mmol, 1,33 mL) foi preparada e adicionada à mistura agitada a -40°C. A mistura de reação foi agitada a -40°C durante 10 min e depois aquecida à r.t. e agitada por mais 30 min. A esta mistura foi adicionada uma solução de hidroperóxido de terc-butila (70% em peso em H2O, 0,3 mmol, 86 μL) à r.t. e agitada durante 10 min. A mistura de reação foi então diluída com H2O (10 mL) e extraída com DCM (3 x 30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4, filtradas e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em sílica-gel.
Etinilfosfonato de benzil etila
[256] Etinilfosfonato de benzil etila foi preparado de acordo com o procedimento geral F a partir de 1-etóxi-N,N-di-isopropil-1- etinilfosfanamina (25 mg, 0,123 mmol) e álcool benzílico (12,3 μL, 0,123 mmol). A purificação por cromatografia em sílica-gel (100% acetato de etila) deu o composto desejado como um óleo incolor (27 mg, 0,120 mmol, 49%). (2-((etóxi(etinil)fosforil)óxi)etil)carbamato de terc-butila
[257] O composto do título foi preparado de acordo com o procedimento geral F a partir de 1-etóxi-N,N-di-isopropil-1- etinilfosfanamina (201 mg, 1,00 mmol) e (2-hidroxietil)carbamato de terc-butila (161 mg, 1,00 mmol). A purificação por cromatografia em sílica-gel (100% acetato de etila) deu o composto desejado como um óleo incolor (168 mg, 0,601 mmol, 60%). HRMS (ESI): calculado para C11H21NO5P [M+H+]: 278,1157; encontrado: 278,1149.
Exemplo 14: Procedimentos para o Acoplamento de Ácidos Carboxílicos a Fosfonotiolatos e Fosfonatos de Alqueno e Alquino Procedimento Geral G: Preparação de fosfonotiolatos e fosfonatos funcionalizados via formação de ligação amida
[258] Derivados de amina protegidos com Boc de alquenofosfonotiolatos (X = S) ou fosfonatos (X = O) (esquema acima) (por exemplo, 0,2 mmol) foram dissolvidos em uma mistura de TFA/H2O (95:5, xx ml) e a solução clara resultante agitada à temperatura ambiente por 15 min. Os solventes foram então removidos borbulhando nitrogênio através da solução. O resíduo foi redissolvido em H2O e submetido à liofilização, rendendo um óleo incolor. Os produtos foram usados para a próxima etapa sem purificação adicional. À amina desprotegida (por exemplo, 0,05 mmol) foi adicionada uma solução de HATU (0,055 mmol), ácido carboxílico (0,055 mmol) e DIPEA (0,15 mmol) em DMF (250 μL). A mistura resultante foi agitada durante 30 min à r.t. em um tubo Eppendorf e depois concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi redissolvido em H2O/MeCN (9:1, 5 mL) e purificado por HPLC preparativa. Ácido 5-((2-(4-((2-((etóxi(etinil)fosforil)óxi)etil)amino)-4- oxobutanamido)etil)amino)naftaleno-1-sulfônico (composto 20)
[259] O composto 20 foi gerado de acordo com o protocolo geral G a partir de amina desprotegida (14 mg, 0,079 mmol). O produto puro foi obtido após purificação por HPLC () e liofilização como um pó incolor (18 mg, 0,0342 mmol, 43%). HRMS (ESI): calcd para C22H29N3O8PS [M+H+]: 526,1413; encontrado: 526,1387. Figura 8 mostra um traço UV-LC do composto 20 purificado. Ácido 5-((2-(4-((2-((etóxi(vinil)fosforil)óxi)etil)amino)-4- oxobutanamido)etil)amino)naftaleno-1-sulfônico (composto 21)
[260] O composto 21 foi gerado de acordo com o protocolo geral G a partir de amina desprotegida (12,9 mg, 0,072 mmol). O produto puro foi obtido após purificação por HPLC () e liofilização como um pó incolor (10 mg, 0,0190 mmol, 26%). HRMS (ESI): calc para C22H31N3O8PS [M+H+]: 528,1570; encontrado: 528,1543. Figura 9 mostra um traço UV-LC do composto 21 purificado Ácido 5-((2-(4-((2-((etóxi(etinil)fosforil)tio)etil)amino)-4- oxobutanamido)etil)amino)naftaleno-1-sulfônico (composto 22)
[261] O composto 22 foi gerado de acordo com o protocolo geral G a partir de amina desprotegida (11,2 mg, 0,058 mmol). O produto puro foi obtido após purificação por HPLC () e liofilização como um pó incolor (10 mg, 0,0185 mmol, 32%). HRMS (ESI): calcd para C22H29N3O7PS2 [M+H+]: 542,1184; encontrado: 542,1156. Figura 10 mostra um traço UV-LC do composto 22 purificado
Ácido 5-((2-(4-((2-((etóxi(vinil)fosforil)tio)etil)amino)-4- oxobutanamido)etil)amino)naftaleno-1-sulfônico (composto 23)
[262] O composto 23 foi gerado de acordo com o protocolo geral G a partir de amina desprotegida (9,6 mg, 0,049 mmol). O produto puro foi obtido após purificação por HPLC () e liofilização como um pó incolor (11 mg, 0,0202 mmol, 41%). HRMS (ESI): calcd para C22H31N3O7PS2 [M+H+]: 544,1341; encontrado: 544,1316. Figura 11 mostra um traço UV-LC do composto 23 purificado S-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexa-hidro-1H-tieno[3,4-dimidazol-4- il)pentanamido)etil)vinilfosfonotioato de O-etila (composto 13)
[263] O composto 13 foi gerado de acordo com o protocolo geral G a partir de amina desprotegida (14,8 mg, 0,076 mmol). O produto puro foi obtido após purificação por HPLC () e liofilização como um pó incolor (14 mg, 0,033 mmol, 44%). S-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexa-hidro-1H-tieno[3,4-dimidazol-4- il)pentanamido)etil)etinilfosfonotioato de O-etila (composto 28)
[264] O composto do título foi gerado de acordo com o protocolo geral G a partir de amina desprotegida (20 mg, 0,104 mmol). O produto puro foi obtido após purificação por HPLC () e liofilização como um pó incolor (7 mg, 0,0167 mmol, 16%).
Exemplo 15A: Procedimento para a hidrotiolação de fosfonotiolato de alqueno com glutationa Conjugado de (Etil-S-benzil-P-etil-fosfonotiolato)-S-glutationa (composto 14)
[265] Glutationa reduzida (20,3 mg, 0,066 mmol, 2,0 eq.) foi dissolvida em 1,32 ml de tampão aquoso (1 mM de EDTA, 50 mM de NH4HCO3, pH 8,0) e adicionada a uma solução de S-benzil O-etil alqueno-PT 2 (8 mg, 0,033 mmol, 1,0 eq.) em 0,33 ml de DMF e a mistura foi agitada à r.t. por 90 min. A reação foi monitorada por UPLC- MS (gradiente: 3-60% MeCN em 5 min), indicando conversão completa após 90 min. Os solventes foram então removidos sob pressão reduzida e o resíduo foi redissolvido em 5 ml de H2O e purificado via HPLC semipreparativa (condições ácidas, gradiente: 20-60% de MeCN em 40 min, produto elui a 35% de MeCN, fluxo: 16 ml/min). Após a liofilização, o composto 14 descrito foi obtido como um pó branco (14 mg, 0,026 mmol, 77%). 1 H RMN (300 MHz, Óxido de Deutério) δ = 7,46 - 7,28 (m, 5H), 4,50 (dd, J = 8,4, 5,3 Hz, 1H), 4,19 - 3,93 (m, 7H), 2,90 (dd, J = 14,1, 5,3 Hz, 1H), 2,76 (ddd, J = 14,1, 8,4, 1,9 Hz, 1H), 2,69 - 2,47 (m, 4H), 2,25- 2,01 (m, 4H), 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3H) ppm. 13 C RMN (75 MHz, óxido de deutério) δ = 174,29, 172,82, 172,51, 172,08, 137,34, 128,95, 128,84, 127,95, 63,30, 63,20, 52,79, 52,60, 41,06, 33,90, 32,66, 31,37, 30,93, 25,58, 23,95, 15,38 (d, J = 6,5 Hz) ppm. 31 P RMN (122 MHz, Óxido de Deutério) δ 60,51 (d, J = 1,9 Hz) ppm.
HRMS (ESI): calc para C21H33N3O8PS [M+H+]: 550,1441; encontrado: 550,1451. Exemplo 15B: Procedimento para a Hidrotiolação de fosfonato de alqueno com glutationa Conjugado de (dietil-fosfonato)-S-glutationa
[266] Alquenofosfonato de dietila (20 mg, 0,147 mmol, 1,0 eq.) foi dissolvido em 1 ml de tampão (50 mM de NH4HCO3, 1 mM de EDTA, pH 8,0) e 1 ml de DMF. A isto, foi adicionada uma solução de glutationa (90,3 mg, 0,294 mmol, 2,0 eq.) em 9 ml do mesmo tampão (pH ajustado para pH 8,0 após dissolução de GSH) e a mistura foi agitada à r.t. 31 Quando a conversão total foi alcançada (avaliada por P-RMN), a mistura de reação foi congelada em nitrogênio líquido e subsequentemente liofilizada. O resíduo foi purificado por HPLC semipreparativa para produzir o composto do título como um pó incolor (41,6 mg, 0,0882 mmol, 60%). 1 H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ = 8,48 (t, J = 5 0,9 Hz, 1H), 8,38 - 8,25 (m, 4H), 4,49 (td, J = 8,9, 4,8 Hz, 1H), 4,07 - 3,90 (m, 5H), 3,76 (d, J = 5,8 Hz, 2H), 2,91 (dd, J = 13,8, 4,8 Hz, 1H), 2,71 - 2,55 (m, 3H), 2,45- 2,23 (m, 2H), 2,12- 1,89 (m, 4H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 6H) ppm. 13 C RMN (75 MHz, DMSO-d6) δ = 171,45, 171,39, 171,27, 171,01, 61,70, 61,62, 52,27, 52,07, 34,13, 31,09, 26,95, 26,50, 25,17, 24,82, 16,76, 16,69 ppm. 31 P RMN (122 MHz, DMSO-d6) δ = 28,58 ppm. HRMS: ESI-MS (modo positivo) m/z 472,1496 [(M+H)+; calcd para C16H31N3O9PS +: 472,1513].
Exemplo 16: Procedimento para Hidrotiolação de Fosfonotiolato de Alquino com glutationa Conjugado de (metil-S-benzil-P-etil-fosfonotiolato)-S-glutationa (composto 15)
[267] A uma mistura de glutationa (0,15 mmol, 23 mg) em solução aquosa tamponada (1 mM de EDTA, 50 mM de NH4HCO3, pH = 8,5), foi adicionado o composto 7 em DMF (0,75 mL, 100 mM) e a mistura agitada em vórtice durante 4 min. A mistura foi então liofilizada, o resíduo restante dissolvido em MeCN/H2O e purificado por meio de HPLC (5-45% MeCN em 50 min). A liofilização das frações contendo o produto deu o composto do título 15 como um pó incolor (16,4 mg, ca. 33%). 1 H-RMN (600 MHz, DMSO-d6) δ = 8,47 - 8,45 (1H, m), 8,39 - 8,37 (1H, m), 7,62- 7,51 (1H, ddd, J = 49,9 Hz, J = 12,3 Hz, J = 4,8 Hz), 7,37 - 7,25 (5H, m), 5,83 - 5,78 (1H, ddd, J = 21,3 Hz, J = 12,2 Hz, J = 6,4 Hz), 4,56 - 4,54 (1H, m), 4,01 - 3,91 (3H, m), 3,78 - 3,77 (2H, m), 3,77 - 3,53 (3H, m), 3,22- 3,19 (1H, m), 2,96 - 2,92 (1H, m), 2,38 - 2,31 (2H, m), 2,07 - 1,98 (2H, m) ppm. 13 C-RMN (151 MHz, DMSO-d6) δ = 171,07, 170,87, 170,75, 170,02, 137,80, 137,76, 128,87, 128,50, 127,32, 118,07, 116,09, 113,62, 112,63, 52,89, 51,63, 51,20, 51,17, 51,13, 40,77, 36,81, 33,37, 30,66, 30,62, 25,88 ppm. 31 P-RMN (122 MHz, DMSO-d6) δ = 41,6 ppm.
Exemplo 17: Procedimentos para a Síntese de Pares de Arrefecedor Dabcyl-EDANS para Estudo de EstabilidadeProcedimento Geral H para a síntese do par arrefecedor Dabcyl-EDANS
[268] O peptídeo contendo DABCYL foi sintetizado a partir de uma resina Rink-amida sob condições padrão de síntese de peptídeos em fase sólida (estratégia Fmoc). Dabcyl (como ácido carboxílico) foi acoplado ao N-terminal livre na resina usando HATU como reagente de acoplamento. Este peptídeo foi clivado da resina usando uma mistura de TFA/TIS/H2O/DTT = 95/2/2/1. O peptídeo foi purificado via HPLC semipreparativa.
[269] O peptídeo Dabcyl purificado (por exemplo, 2,35 μmol) foi dissolvido em tampão aquoso (50 mM de NH4HCO3, 1 mM de EDTA, pH 8,5) e misturado com o composto EDANS 20-23 (2,82 μmol), dissolvido em DMF (280 μL) em um tubo Eppendorf. A mistura de reação foi agitada à r.t. e a reação foi monitorada por UV-LC-MS. A mistura de reação foi então diluída com água (4,7 ml) e antes purificada via HPLC semipreparativa (10-50% de MeCN ao longo de 45 min, 0,1% de TFA, fluxo: 16 ml/min) e as frações contendo o produto puro foram combinadas e liofilizadas. Par EDANS-Dabcyl FRET (derivado de fosfonato de alquino) (composto 24)
[270] O composto 24 foi gerado de acordo com o procedimento geral H a partir do composto 20 de Edans (1,48 mg, 2,82 μmol) e peptídeo Dabcyl (2,5 mg, 2,35 μmol). O produto foi obtido após purificação por HPLC semipreparativa (10-50% MeCN, 0,1% TFA, 16 ml/min) e liofilização como um pó vermelho (3 mg, 2,01 μmol, 86%). Figura 12 mostra um traço de LC UV do composto 24 purificado Par EDANS-Dabcyl FRET (derivado de fosfonato de alqueno) (composto 25)
[271] O composto 25 foi gerado de acordo com o procedimento geral H a partir do composto 21 de Edans (1,49 mg, 2,82 μmol) e peptídeo Dabcyl (2,5 mg, 2,35 μmol). O produto foi obtido após purificação por HPLC semipreparativa (10-50% MeCN, 0,1% TFA, 16 ml/min) e liofilização como um pó vermelho (3 mg, 2,01 μmol, 86%). Figura 13 mostra um traço de LC UV do composto 25 purificado Par EDANS-Dabcyl FRET (derivado de fosfonotiolato de alquino) (composto 26)
[272] O composto 26 foi gerado de acordo com o procedimento geral H a partir do composto 22 de Edans (1,53 mg, 2,82 μmol) e peptídeo Dabcyl (2,5 mg, 2,35 μmol). O produto foi obtido após purificação por HPLC semipreparativa (10-50% MeCN, 0,1% TFA, 16 ml/min) e liofilização como um pó vermelho (3 mg, 1,87 μmol, 80%).
Figura 14 mostra um traço de LC UV do composto 26 purificado Par EDANS-Dabcyl FRET (derivado de fosfonotiolato de alqueno) (composto 27)
[273] O composto 27 foi gerado de acordo com o procedimento geral H a partir do composto 23 de Edans (1,53 mg, 2,82 μmol) e peptídeo Dabcyl (2,5 mg, 2,35 μmol). O produto foi obtido após purificação por HPLC semipreparativa (10-50% MeCN, 0,1% TFA, 16 ml/min) e liofilização como um pó vermelho (3 mg, 1,87 μmol, 80%). Figura 15 mostra um traço de LC UV do composto 27 purificado Exemplo 18: Procedimento para o Estudo de Estabilidade do Exemplo 6
[274] Uma solução estoque 0,20 mM do conjugado EDANS- DABCYL 24-27 foi preparada cada (PBS pH 7,4). A partir desta solução estoque, 5 μL foram misturados com 95 μL da respectiva matriz para teste (PBS pH 7,4, lisado preparado de células HeLa (1 mg/ml), soro humano) em uma placa de 96 poços (Corning, N° 3615) à temperatura ambiente (cerca de 25 °C). Para os experimentos em NaOH, os compostos (150 µL de uma solução estoque 200 µM em PBS) foram misturados com 150 µL de uma solução de NaOH a 1M em um tubo Eppendorf à temperatura ambiente (cerca de 25°C). Em um determinado ponto de tempo, 3 μL desta solução foram misturados com 5,6 μL de uma solução de HCl a 1 M e 91 μL de PBS para neutralização em uma placa de 96 poços. A fluorescência foi monitorada ao longo de 3 dias (para todas as condições exceto NaOH) usando um instrumento
Safire/Tecan (EDANS: λex = 360 nm, λem = 508 nm). As intensidades de fluorescência foram corrigidas pela medição de fundo (matriz sozinha) e os valores médios e desvios padrão de três experimentos independentes foram calculados (n = 3). Exemplo 19: Procedimento para o estudo cinético do Exemplo 5
[275] 2,5 μL de uma solução 20 mM do composto 20-23 de fósforo correspondente em DMF e 5 μL de uma solução 1 mM de EDANS não conjugado em DMF/Tampão (1:1) como padrão interno foram adicionados a 488 μL de tampão de conjugação (50 mM de NH4HCO3 e 1 mM de EDTA em água ultrapura, ajustada para pH 8,5 com solução aquosa de amônia). 5 μL de 10 mM de uma solução de glutationa em tampão foram adicionados para iniciar a reação. A reação foi realizada à temperatura ambiente (cerca de 25°C). A primeira amostra (t = 0) foi retirada antes da adição de glutationa. As seguintes amostras foram coletadas após 15, 30, 60, 120, 240 e 480 minutos. A amostra foi coletada em um volume de 20 μL e imediatamente diluída em 80 μL de tampão 50 mM de NaOAc em pH 3,5 para interromper a reação. Essas amostras foram submetidas a análises por HPLC com detector de fluorescência, injetando 20 μL cada. (Os resultados deste estudo são mostrados na figura 3.) Exemplo 20A: Procedimento para a Conjugação de BSA a Fosfonotiolatos
[276] Uma solução de 10 μM (100 μL) de albumina sérica bovina (BSA) em tampão (PBS, 1mM de EDTA, pH 7,4 ou 50 mM de NH4HCO3,
100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 8,5) foi misturada com 1 μL de um 100 mM (corresponde a 100 eq.) ou 1 μL de uma solução do composto 2 ou 7 (50 mM em DMF) a 4°C. A mistura de reação foi agitada durante 18 h a 4°C. O excesso de composto de composto foi então removido por meio de filtração giratória (7 kDa MWCO), alterando assim o tampão para PBS pH 7,4. 3 μL desta solução de proteína (10 μM) em PBS foram misturados com 27 μL de tampão Laemmli contendo mercaptoetanol, aquecido a 95°C por 10 min e executado em um SDS- Gel (12% acrilamida, 250 V, 40 min). A proteína foi então submetida a uma digestão em gel com quimotripsina e analisada por MS/MS. (Os resultados da análise MS/MS estão resumidos na tabela 6.) Exemplo 20B: Procedimento para a Conjugação de BSA a Fosfonatos
[277] Uma solução de 10 μM (100 μL) de albumina sérica bovina (BSA) em tampão (50 mM de NH4HCO3, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 8,5) foi misturada com 1 μL de 100 mM de uma solução de dietil alquenofosfonato em DMF em 4 °C. A mistura de reação foi agitada durante 18 h a 4 °C. O excesso de composto de fosfonato foi então removido por meio de filtração giratória (7 kDa MWCO), alterando assim o tampão para PBS pH 7,4. Posteriormente, 3 μL desta solução de proteína (10 μM) em PBS foram misturados com 27 μL de tampão Laemmli contendo mercaptoetanol, aquecido a 95°C por 10 min e executado em um SDS-Gel (12% acrilamida, 250 V, 40 min). A proteína foi então submetida a uma digestão em gel com quimotripsina e analisada por MS/MS. (Os resultados da análise de MS/MS estão resumidos na tabela 1.) Exemplo 20: Procedimento para a Conjugação de Anticorpo com Fosfonotiolatos
[278] 1,25 μL de 100 μM de uma solução de anticorpo Cetuximab (em PBS) foi misturado com 10 μL de borato contendo PBS (50 mM de borato, pH 8,0) e 1,25 μL de uma solução de DTT (100 mM de DTT no mesmo tampão de borato, pH 8,0). As amostras de controle foram preparadas de forma semelhante, sem adição de DTT. Estas misturas foram incubadas num agitador térmico durante 30 min a 37°C. O excesso de DTT foi então removido usando coluna de exclusão de tamanho (Thermo Scientific, Colunas Dessalinizantes ZebaTM Spin, 7 K MWCO, Produto No 89877). As colunas por exclusão de tamanho foram primeiro equilibradas (3 x 50 μL por 1 min a 1000 g) com o tampão de alquilação (50 mM de NH4HCO3, 1 mM de EDTA, pH = 8,5/8,0 ou PBS, 1 mM de EDTA, pH 7,4). A mistura anticorpo-DTT (12,5 μL) foi então aplicada na coluna equilibrada e o anticorpo foi coletado por meio de centrifugação (2 min, 1000 g) em um tubo Eppendorf fresco. A esta solução, foram adicionados imediatamente 0,25 μL de uma solução de biotina-PT (fosfonotiolato de alqueno ou alquino) (25 mM em DMSO) e as misturas foram incubadas a 4 °C durante a noite em um agitador térmico.
[279] 3 μL desta mistura foram misturados com 27 μL de tampão Laemmli contendo mercaptoetanol e aquecidos a 95°C por 10 min. Desse modo, 10 μL foram carregados em gel SDS de acrilamida a 12% e executados a 250 V por 35 min. O gel foi então submetido a um Western-blot, usando o conjugado Streptavidin-HRP comercialmente disponível para hibridização com os anticorpos modificados com biotina e detecção indireta de biotina via quimioluminescência. Exemplo 21: Modificação de eGFP com fosfonotiolatos de alquino
[280] Em um experimento de prova de princípio, os inventores usaram uma variante de eGFP com uma cisteína acessível a solvente e reagiram com uma pequena molécula de fosfonotiolato de alquino fluorescente NA1 (correspo Encontrando o composto 22 do Exemplo 14 acima) (Figura 16A) em pH fisiológico. A reação foi seguida por ESI-MS e quando verificada após 14 h, a conversão total foi observada sem qualquer formação de produto secundário detectável (Figura 16B). Este resultado demonstra que os fosfonotiolatos de alquino são adequados para a modificação de proteínas em condições suaves em pH fisiológico.
[281] Figura 16 mostra: Modificação de eGFP com derivado de fosfonotiolato de alquino-Edans NA1. A) Esquema de síntese, B) A conversão total de GFP no produto desejado foi observada por ESI-MS. O espectro mostrado aqui é retirado diretamente da mistura de reação sem qualquer purificação. PT = fosfonotiolato NA1. Exemplo 22: Síntese de Conjugados de Anticorpos Drogas (ADCs) com Fosfonotiolatos de Alquino
[282] Os inventores também desenvolveram uma síntese de um conjugado de droga de anticorpo ligado a fosfonotiolato (ADC) a partir do antimitótico muito eficiente, citotoxina monometil auristatina E de ligação à tubulina (MMAE) e o anticorpo de endereçamento de CD30 Brentuximab. Para facilitar a liberação da carga tóxica, ADCs com um lado de clivagem de catepsina B (ligante Valina-Citrulina VC) foram preparados entre o anticorpo e a toxina para gerar um análogo direto ao ADC comercializado Adcetris® (Brentuximab vedotina) (MA Stephen, Blood 2014, 124, 3197-3200.). Um construto fosfonotiolato-VC-PAB- MMAE NA3 foi sintetizado a partir de fosfonotiolato de alquino de ácido carboxílico NA2 e VC-PAB-MMAE por meio de um acoplamento de amida, conforme descrito no Esquema 12.
Esquema 12: Rota sintética para a construção de conjugado de monometil auristatina E clivável de catepsina B ligado a fosfonotiolato, NA3. VC: dipeptídeo valina-citrulina, PAB: p- aminobenzila.
[283] Em seguida, um conjugado de anticorpo-droga foi sintetizado pela conjugação de NA3 com Brentuximab. Os inventores primeiro realizaram uma triagem para encontrar condições de reação para gerar um ADC com uma razão de droga para anticorpo (DAR) entre 3-4, a fim de ser capaz de comparar a atividade de um ADC compreendendo o ADC ligado a fosfonotiolato com o ADC Adcetris® aprovado pela FDA. No caso de Adcetris, VC-PAB-MMAE é conjugado através de uma maleimida a cisteínas de Brentuximab com um DAR = 4 (M.A. Stephen, Blood 2014, 124, 3197-3200.). Os inventores primeiro reduziram as ligações dissulfeto intercadeia de Brentuximab com DTT a fim de gerar grupos sulfidrila livres, que podem então reagir com o fosfonotiolato de alquino NA3 (vide Figura 17A). O excesso de DTT foi removido por colunas de dessalinização Zeba™ Spin. Para a triagem, os inventores variaram a concentração de anticorpo Brentuximab (1 vs. 5 mg/ml), o pH na conjugação (pH 8,5 vs. 7,4) e o número de equivalentes do composto fosfonotiolato-droga NA3 (8,8-100 eq.) e analisou os ADCs resultantes por ESI-MS após desglicosilação com a enzima PNGase-F e redução. O DAR foi estimado com as intensidades de sinal de massa das espécies de cadeia pesada e leve com diferentes graus de modificação. Os resultados desta triagem são representados na Figura 17B. Concentrações mais altas de anticorpos e mais equivalentes de fosfonotiolato deram DARs mais altos. A conjugação com fosfonotiolatos de alquino também funcionou de forma eficiente em pH fisiológico 7,4. Isto pode ser uma vantagem dos fosfonotiolatos de alquino para a conjugação de proteínas ou anticorpos que requerem manipulação a pH fisiológico, por exemplo, por razões de estabilidade.
[284] A Figura 17 mostra: Modificação de Brentuximab com NA3 (Fosfonotiolato-VC-PAB-MMAE). A) Redução do esquema de reação e alquilação de dissulfetos intercadeias. B) Triagem das condições de reação. C) Espectro de MS exemplar dos fragmentos de anticorpo após desglicosilação com PNGase-F e redução com DTT. É mostrado o espectro deconvoluído, a inserção mostra os dados brutos. LC: Cadeia leve; HC: Cadeia pesada; mod: Fosfonotiolato-VC-PAB-MMAE NA3.
[285] Os inventores caracterizaram ainda um ADC com um DAR = 3,15 por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) (vide Figura 21). Este ADC foi então avaliado em um ensaio de resazurina padrão em que se usou uma linhagem celular com superexpressão de CD30 Karpas 299 (vide Figura 18A). O ADC Brentuximab-NA3 mostrou forte inibição do crescimento (curva azul) e é tão potente quanto o ADC Adcetris® (curva vermelha) usado clinicamente a um DAR ligeiramente inferior (3,15 vs. 4,0 para Adcetris®). Brentuximab sozinho (curva verde) não mostra inibição do crescimento. Como um controle para provar a seletividade de CD30, foi usada a linhagem celular HL 60 de não superexpressão de CD30 (Figura 18B). Nenhuma inibição da proliferação celular foi observada neste caso para todas os construtos. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que os fosfonotiolatos de alquino são ligantes adequados para gerar ADCs ativos que matam seletivamente as linhagens de células positivas para o antígeno.
[286] Figura 18 mostra: A) Inibição do crescimento aumentada de ADCs de Brentuximab ligados a MMAE seletivamente em uma linhagem celular com superexpressão de CD30 Karpas 299. Os gráficos representam a viabilidade celular após 96 horas de tratamento na dependência da concentração de anticorpo. Brentuximab sozinho (verde), Brentuximab-NA3 (azul) e Adcetris® (vermelho). Karpas 299: linhagem celular com superexpressão de CD30. B) Control. Brentuximab sozinho (verde), Brentuximab-NA3 (azul) e Adcetris® (vermelho). HL 60: linhagem celular com baixos níveis de expressão de CD30.
[287] Os conjugados fosfonotiolato-tiol são mais estáveis em comparação com os conjugados maleimida-tiol, particularmente na presença de excesso de tióis livres. Especialmente para ADCs, onde a liberação prematura da toxina devido à troca de tiol pode levar ao aumento da toxicidade fora do alvo, esta é uma vantagem importante do método e dos compostos descritos neste documento.
[288] Na modificação de anticorpos, como outra vantagem, os inventores observaram melhor seletividade de cisteína para fosfonotiolatos em comparação com maleimidas, usando o mesmo número de equivalentes em pH fisiológico, ver também Exemplo 7B acima. Exemplo 23: Introdução de Fosfonotiolatos em Peptídeo em Resina
[289] Os inventores observaram que os fosfonotiolatos aqui descritos são altamente estáveis em condições ácidas. Portanto, os fosfonotiolatos foram incorporados aos peptídeos via síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) em uma resina. Isso permite a introdução de um eletrófilo de uma maneira direta em um peptídeo durante a SPPS e a clivagem subsequente da resina em condições ácidas.
[290] Um peptídeo modelo foi acoplado ao ácido carboxílico NA2 por meio do N-terminal livre. Após clivagem com 95% de TFA durante duas horas, o produto pode ser isolado por HPLC semipreparativa. Portanto, este método permite a incorporação de um eletrófilo na resina durante a SPPS. Como uma vantagem, o fosfonotiolato não hidrolisou nas condições fortemente ácidas durante a clivagem da resina. Consequentemente, os fosfonotiolatos são altamente estáveis em condições ácidas (por exemplo, em > 90% de ácido trifluoroacético (TFA) durante a clivagem da resina).
[291] O fosfonotiolato de alquino-peptídeo foi analisado por UV- LC-MS e por 31P-RMN. Notavelmente, o peptídeo está presente em sua forma linear, conforme representado no Esquema 13 e não ciclizou por adição de tiol intramolecular através do resíduo de cisteína.
Esquema 13: Síntese de peptídeos em fase sólida usando fosfonotiolato de alquino. Exemplo 24: Procedimentos para a modificação de eGFP com osfonotiolato de alquinofNA1
[292] Para este experimento, um mutante eGFP foi usado (eGFP
C70MS174C). A proteína foi expressa como uma variante marcada com His com um sítio de clivagem de protease. Após a clivagem, a sequência completa é:
RGSHMGSIQMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGD ATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQMFSRYPDHMKQHDF FKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFK EDGNILGHKLEYNYNCHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLA DHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTA AGITLGMDELYK
[293] Figura 19 mostra o espectro ESI-MS de eGFP C70MS174C, que foi usado como material de partida para a conjugação com NA1. Procedimento para modificação de eGFP com NA1:
[294] A uma solução de eGFP em PBS pH 7,4 (50 μL, 1 mg/ml) em um tubo Eppendorf de baixa ligação foi adicionado fosfonotiolato de alquino NA1 (0,72 μL de uma solução estoque 25 mM em DMSO, 10 eq.) e a mistura foi mantida em um agitador térmico a 14 °C e 800 rpm por 14 h. A conversão total foi alcançada conforme avaliado por ESI- MS. Exemplo 25: Procedimentos para a geração de Conjugados Anticorpo Drogas (ADCs) com fosfonotiolatos de alquino Síntese de ácido 4-((2-((etóxi(etinil)fosforil)tio)etil)amino)-4- oxobutanóico (composto NA2) *número do composto da aplicação inicial
[295] O composto NA2 foi gerado em duas etapas a partir do precursor protegido com Boc (composto número 9 descrito no Exemplo 11 acima). 9 (94 mg, 0,321 mmol) foi dissolvido em um frasco de fundo redondo em TFA/H2O 95:5 (3 mL) e agitado à r.t. por 5 min. A mistura de reação foi então diluída com H2O (10 mL) e seca por congelamento. O produto bruto seco foi dissolvido em DMF (1 ml) e adicionado a uma mistura de ácido succínico (38 mg, 0,321 mmol), HATU (122 mg, 0,321) e DIPEA (167 ml, 0,962 mmol) em DMF (1 ml). A mistura resultante foi agitada à r.t. por 30 min. Os solventes foram então removidos sob pressão reduzida e o resíduo dissolvido em uma mistura de MeCN/H2O 1:4 contendo 0,1% de TFA e purificado por HPLC semipreparativa (20- 60% de MeCN em 60 min, fluxo = 10 mL/min). A liofilização do composto das frações contendo o produto deu NA2 como um pó liofilizado (34 mg, 0,116 mmol, 36%) de aproximadamente 90% de pureza com base em 1 H-RMN. O composto foi usado na reação subsequente sem purificação adicional. HR-MS para C10H17NO5PS1+ [M+1H]1+ calculado: 294,0560, encontrado 294,0614. 1 H-RMN (300 MHz, CDCl3) δH = 7,22- 7,13 (m, 1H), 4,25 (dq, J = 9,8, 7,1 Hz, 2H), 3,76-3,74 (m, 2H), 3,29 (d, J = 12,6 Hz, 1H), 3,25- 2,98 (m, 2H), 2,72-2,51 (m, 4H), 1,50-1,36 (m, 3H) ppm. 31 P-RMN (122 MHz, CDCl3) δP = 17,1 ppm. Síntese de Fosfonotiolato de alquino-Val-Cit-Pab-MMAE (composto NA3)
[296] Composto NA2 (1,88 mg, 6,41 mmols), HATU (2,44 mg, 6,41 mmols) e DIPEA (4,7 ml, 26,7 mmols) foram dissolvidos em DMF (100 ml) e adicionados a uma solução de H2N-Val-Cit-Pab-MMAE (6 mg, 5,34 mmols) em DMF (150 ml) em um tubo Eppendorf. Após 30 minutos, a mistura de reação foi diluída com H2O (4,5 mL), filtrada e purificada por HPLC semipreparativa (30-99% de MeCN em 50 minutos, fluxo = 5 mL/min). Após a liofilização, o produto NA3 descrito foi obtido como pó branco (3 mg, 2,14 mmols, 40%). HR-MS para C68H109N11O16PS1+ [M+1H]1+ calculado: 1398,7507, encontrado 1398,7201. Figura 20 mostra a pureza UPLC-UV de Fosfonotiolato-Val- Cit-Pab-MMAE NA3. Produção de brentuximab
[297] Expressão e purificação de Brentuximab foram executadas conforme publicado anteriormente (A. Stengl, D. Hörl, H. Leonhardt, J. Helma, SLAS Discov 2017, 22, 309-315.) com uma purificação final adicional por filtração em gel em um Superdex 200 Increase 10/300 da GE (GE life sciences, EUA) com PBS e taxa de fluxo de 0,75 ml/min. Procedimento para a modificação de Brentuximab por meio do protocolo de redução/alquilação
[298] Modificação de Brentuximab foi realizada incubando o Brentuximab (c = 5 mg/ml, 33,4 mM) em um tampão contendo 50 mM de borato de sódio e 34 mM de DTT em PBS (pH = 8,0) com um volume total de 300 μL a 37°C por 30 min em um tubo Eppendorf de baixa ligação. A remoção do excesso de DTT e a troca de tampão para PBS contendo 1 mM de EDTA (pH 7,4) foram conduzidas posteriormente usando 2 mL de Colunas de dessalinização Giratórias Zeba™ com 7K MWCO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Estados Unidos). Em seguida, 2,45 μL de uma solução contendo 36 mM de fosfonotiolato NA3 em DMSO foram adicionados rapidamente e a mistura foi agitada a 800 rpm e 14°C por 16 horas. O excesso de fosfonotiolato foi removido por cromatografia de exclusão de tamanho (Äkta FPLC, coluna Superose 6 Increase 10/300 GL, com PBS, 0,8 ml/min). As frações contendo produto foram reunidas e filtradas para esterilização. Para análise do ADC, 12 μL de uma solução de 1 mg/ml foram incubados com 1 μL de RapiGest por 30 min a 60°C em um agitador térmico. Em seguida, 1 μL de PNGaseF foi adicionado e incubado por mais duas horas a 37°C. Finalmente, 1 μL de uma solução 10 mM de DTT em PBS (pH 7,4) foi adicionado e a mistura agitada por 30 min a 37 °C. Desta mistura, 10 μL foram diluídos com 30 μL de H2O e submetidos a ESI-MS (resultado vide Fig. 2C). SEC de ADC
[299] Cromatografia por exclusão de tamanho analítica (A-SEC) foi conduzida em um sistema UHPLC Vanquish Flex com um detector DAD, Split Sampler FT (4°C), Compartimento de coluna H (25°C) e bomba binária F (Thermo Fisher Scientific, EUA) usando uma coluna MAbPac SEC-1 300 Å, 4 x 300 mm (Thermo Fisher Scientific, EUA) com uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min. A separação de diferentes populações de ADC/mAb foi alcançada durante um gradiente isocrático de 30 minutos usando um tampão de fosfato a pH 7 (20 mM de Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM de NaCl, álcool isopropílico a 5% v/v como fase móvel. 8 µg de ADC/O mAb foram carregados na coluna para análise A-SEC. Os cromatogramas de UV foram registrados a 220 e 280 nm. A quantificação do monômero e HMWS foi alcançada após integração da área do pico a 220 nm. Figura 21 mostra o cromatograma por exclusão de tamanho de Brentuximab-NA3 ADC.
Ensaios de antiproliferação baseados em células
[300] As linhagens celulares HL60 e Karpas foram cultivadas em RPMI-1640 suplementado com 10% de FCS e 0,5% de Penicilina- Estreptomicina. As linhagens celulares SKBR3 e MDAMB468 foram cultivadas em DMEM/F12 suplementado com 10% de FCS e 0,5% de penicilina-estreptomicina. As células foram semeadas a uma densidade de 5 * 10^3 células/poço (SKBR3, HL60 e Karpas) ou 1*10^3 células/poço (MDAMB468) em microplaca de cultura de células de 96 poços. Diluições em série de 1:4 de ADCs ou anticorpos foram realizadas em meio de cultura de células começando na concentração final de 3 µg/mL e transferidas em duplicatas para os respectivos poços na microplaca. As placas foram incubadas durante 96 h a 37°C, 5% de CO2. Subsequentemente, a resazurina foi adicionada a uma concentração final de 50 µM seguida de incubação durante 3-4 h a 37°C, 5% de CO2. A conversão metabólica da resazurina em resorufina é quantificada pelo sinal fluorescente da resorufina (λEX = 560 nm e λEM = 590 nm) em um leitor de microplacas Tecan Infinite M1000. A média e o desvio padrão foram calculados a partir de duplicatas, normalizados para o controle não tratado e representados graficamente contra a concentração de anticorpos. A análise dos dados foi realizada com o software MatLab R2016. Exemplo 26: Procedimentos para a introdução de fosfonotiolato no peptídeo na resina
[301] O peptídeo com a sequência AYRCAK foi sintetizado manualmente em uma resina de amida TentaGel S Rink com uma carga de 0,22 g/mol. Os acoplamentos foram realizados com 5 eq. de aminoácido, 5 eq. de HCTU, 5 eq. de Oxima e 10 eq. de DIPEA por uma hora em DMF (concentração: 0,1 M com base em 5 eq. de aminoácidos). Após cada acoplamento, grupos residuais de amina livre foram tampados com AC2O. A desproteção de Fmoc foi realizada com piperidina a 20% em DMF.
[302] A quantidade de resina correspondente a 10 μM de peptídeo AYRCAK com N-terminal livre foi usada para modificações adicionais com o bloco de construção de fosfonotiolato. O peptídeo foi, portanto, inchado em DMF (1 mL) em um reator de peptídeo por duas horas, antes de adicionar uma mistura de composto NA2 (120 μL de uma solução estoque de 250 mM de DMF, 30 μmol, 3 eq.), HATU (11,4 mg, 30 μmol, 3 eq.) e DIPEA (10,4 μL, 60 μmol, 6 eq.). Esta mistura foi agitada à r.t. por uma hora. A clivagem da resina foi realizada usando TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5; v:v:v, 2 ml) durante duas horas. A precipitação foi realizada em éter frio e seco. O produto em bruto foi purificado por HPLC C18 de fase reversa preparativa (10-60% de MeCN em H2O + 0,1% de TFA, fluxo: 10 ml/min). Após a liofilização, o produto NA4 foi obtido como um pó branco (2,44 mg, 2,48 μmol, 25%) e foi analisado por 31 P-RMN, UPLC analítico (5 a 95% de MeCN em H2O contendo 0,1% de TFA em 15 min em um RP-C18 coluna.) e ESI-MS. HR-MS para C40H66N12O11PS21+ [M+1H]1+ calculado: 985,4148, encontrado 985,4152. 31 P-RMN (243 MHz, DMSO-d6) δP = 14,6 (d, J = 6,5 Hz) ppm. Figura 22 mostra a pureza UPLC-UV do peptídeo fosfonotiolato NA4.
CONCLUSÃO
[303] Os inventores demonstraram aqui que os fosfonotiolatos e fosfonatos insaturados (fosfonotiolatos de alqueno e alquino, bem como fosfonatos de alqueno e alquino) são manipulações adequadas para reações de bioconjugação seletiva de cisteína. A adição de tiol é rápida em condições aquosas e os conjugados formados são estáveis em condições fisiologicamente relevantes. Os inventores mostraram que este método permite, por exemplo, a modificação seletiva de cisteína de proteínas (por exemplo, BSA) e anticorpos (por exemplo, Cetuximab, Brentuximab). Os resultados fornecidos neste documento mostram que o método de acordo com a invenção que usa fosfonotiolatos ou fosfonatos é superior às estratégias atuais de bioconjugação de cisteína, como por exemplo, a química da maleimida, uma vez que a reação é mais seletiva para tióis e os conjugados formados exibem melhor estabilidade.
[304] Deve-se notar que, conforme usado neste documento, as formas singulares "um", "uma" e "a/o" incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um reagente" inclui um ou mais desses reagentes diferentes e a referência a "o método" inclui a referência a etapas e métodos equivalentes conhecidos pelos versados na técnica que podem ser modificados ou substituídos pelo métodos aqui descritos.
[305] Todas as publicações e patentes citadas nesta divulgação são incorporadas por referência em sua totalidade. Na medida em que o material incorporado por referência contradiz, ou seja, inconsistente com esta especificação, a especificação substituirá qualquer um desses materiais.
[306] Salvo indicação em contrário, o termo "pelo menos" precedendo uma série de elementos deve ser entendido como referindo-se a todos os elementos da série. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Pretende-se que tais equivalentes sejam abrangidos pela presente invenção.
[307] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra
"compreender" e variações como "compreende" e "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro declarado ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de número inteiro ou etapa. Quando usado neste documento, o termo "compreendendo" pode ser substituído pelo termo "contendo" ou, às vezes, quando usado neste documento pelo termo "tendo".
[308] Quando usado aqui, "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado no elemento da reivindicação. Quando usado neste documento, "consistindo essencialmente em" não exclui materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e novas da reivindicação. Em cada caso aqui, qualquer um dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em" e "consistindo em" pode ser substituído por qualquer um dos outros dois termos.
[309] Vários documentos são citados ao longo do texto desta especificação. Cada um dos documentos citados neste documento (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, etc.), sejam supra ou infra, são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de anteceder tal divulgação em virtude da invenção anterior.

Claims (79)

REIVINDICAÇÕES
1. Processo para a preparação de um fosfonotiolato ou fosfonato caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de: reagir um composto de fórmula (I) (I) em que representa uma ligação dupla ou ligação tripla; X representa R3-C quando é uma ligação tripla; X representa (R3 R4)C quando é uma ligação dupla; Y representa S ou O; R1 representa ou resíduo aromático ou alifático opcionalmente substituído; R3 representa H ou C1-C8-alquila; R4 representa H ou C1-C8-alquila; e representa um resíduo aromático ou alifático; com um tiol contendo a molécula de fórmula (II) (II) em que representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída, ou um sistema heterocíclico de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído; resultando em um composto de fórmula (III)
(III) em que representa uma ligação se em um composto de fórmula (I) representa uma ligação dupla; ou representa uma ligação dupla se em um composto de fórmula (I) representa uma ligação tripla; e , , R1, X e Y são como definidos acima.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que representa uma ligação dupla, X representa (R3 R4)C, R3 e R4 independentemente representa H ou C1-C8-alquila e representa uma ligação.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que representa uma ligação tripla, X representa R3-C, R3 representa H ou C1-C8-alquila e representa uma ligação dupla.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que Y é S.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma preparação de um composto de fórmula (I), a referida preparação compreendendo: reagir um composto de fórmula (IV)
(IV) em que R1, X, Y, e são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes; com um oxidante, tal como, por exemplo, hidroperóxido de terc-butila (tBu-OOH), ácido meta-cloroperoxibenzoico (mCPBA), peróxido de hidrogênio (H2O2), iodo (I2), peroximonossulfato de potássio, ou oxigênio (O2), para formar o composto de fórmula (I).
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma preparação do composto de fórmula (IV), a referida preparação compreendendo: reagir, em ordem sequencial, um tri-haleto de fósforo (X), preferivelmente PCl3, com (i) R1–OH (XI), (ii) (XII), em que R2 independentemente representa C1-C8-alquila, (iii) (XIII), em que Hal representa o halogênio selecionado a partir do grupo consistindo em Cl, Br e I, preferivelmente Br, e (iv) (XIV) para formar o composto de fórmula (IV); em que R1, X, Y, e são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
7. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma preparação de um composto de fórmula (I), a referida preparação compreendendo: reagir um composto de fórmula (V)
(V) com um composto de fórmula (VIa) ou (VIb): ou (VIa) (VIb) para formar um composto de fórmula (I); em que EWG representa um grupo de retirada de elétron, o referido grupo de retirada de elétron preferivelmente sendo selecionado a partir do grupo consistindo em , , e , em que # indica a posição de S; Hal representa o halogênio selecionado a partir do grupo consistindo em Cl, Br e I, preferivelmente Cl, e em que R1, X, e são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é uma ligação dupla e X representa (R3 R4)C, em que R3 e R4 são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
9. Processo para a preparação de um fosfonotiolato ou fosfonato, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de: reagir um composto de fórmula (I*) (I*) em que
V representa C1-C8-alquila, preferivelmente metila, etila ou propila, mais preferivelmente metila; X representa (R3 R4)C; em que , Y, R1, R3 e R4 são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes, com um tiol contendo a molécula de fórmula (II) (II) em que é como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes; resultando em um composto de fórmula (III*) (III*) em que , ,V, R1, X e Y são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que Y é S.
11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma preparação de um composto de fórmula (I*), a referida preparação compreendendo: reagir um composto de fórmula (IV*) (IV*) em que X representa (R3 R4)C, e Y, R1, R3, R4, V e são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes; com um oxidante, tal como, por exemplo, hidroperóxido de terc-butila (tBu-OOH), ácido meta-cloroperoxibenzoico (mCPBA), peróxido de hidrogênio (H2O2), iodo (I2), peroximonossulfato de potássio, ou oxigênio (O2), para formar o composto de fórmula (I*).
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma preparação do composto de fórmula (IV*), a referida preparação compreendendo: reagir, em ordem sequencial, um tri-haleto de fósforo (X), preferivelmente PCl3, com (i) R1–OH (XI), (ii) (XII), em que R2 independentemente representa C1-C8-alquila, (iii) (XIII*), em que Hal representa o o halogênio selecionado a partir do grupo consistindo em Cl, Br e I, preferivelmente Br, e X representa (R3 R4)C, e (iv) (XIV) para formar o composto de fórmula (IV*); em que R1, R3, R4, V, Y e são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
13. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma preparação de um composto de fórmula (I*), a referida preparação compreendendo: reagir um composto de fórmula (V*) (V*) com um composto de fórmula (VIa) ou (VIb) ou (VIa) (VIb)
para formar um composto de fórmula (I*); em que EWG representa um grupo de retirada de elétron, o referido grupo de retirada de elétron preferivelmente sendo selecionado a partir do grupo consistindo em , , e , em que # indica a posição de S; Hal representa o halogênio selecionado a partir do grupo consistindo em Cl, Br e I, preferivelmente Cl; e em que X representa (R3 R4)C; e R1, R3, R4, V e são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que R1 representa C1-C8-alquila opcionalmente substituída por pelo menos um de (C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, F, Cl, Br, I, -NO2, -N(C1- C8-alquila)H, -NH2, -N3, -N(C1-C8-alquila)2, =O, C3-C8-cicloalquila, –S-S- (C1-C8-alquila), hidróxi-(C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, C2- C8-alquenila, C2-C8-alquinila; ou R1 representa fenila opcional e independentemente substituída por pelo menos um de C1-C8-alquila, (C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, F, Cl, I, Br, -NO2, -N(C1-C8-alquila)H, -NH2 ou -N(C1- C8-alquila)2; ou R1 representa um sistema heteroaromático de 5 ou 6 membros tal como piridila; preferivelmente, R1 representa C1-C8-alquila, C1-C8-alquila substituída por –S-S-(C1-C8-alquila), C1-C8-alquila substituída por (C1- C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, C1-C8-alquila substituída por fenila opcionalmente substituída; ou fenila; ou fenila substituída por –NO2.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que R1 representa metila, etila, propila ou butila, mais preferivelmente metila ou etila.
16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que R1 representa , em que R10, R11, R12 e R13 cada um independentemente representa hidrogênio ou C1-C8-alquila; e # representa a posição de O.
17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que R1 representa C1- C8-alquila substituída por fenila, a referida fenila sendo adicionalmente substituída por , em que Z é O ou NH, preferivelmente O, e em que # representa a posição da referida fenila.
18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que R1 representa C1- C8-alquila substituída por fenila, a referida fenila sendo adicionalmente substituída por , e em que # representa a posição da referida fenila.
19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que R1 representa com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; ; ou com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em que # representa a posição de O.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que representa uma molécula pequena tal como, por exemplo, uma C1-C8- alquila opcionalmente substituída, preferivelmente etila, -CH2-fenila, , , , , , , , , ou , em que # indica a posição do Y; ou representa uma fenila opcionalmente substituída; ou representa um nuclídeo radioativo ou não radioativo, biotina, uma enzima repórter, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, um aminoácido, um peptídeo, ou um sistema heteroaromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído; em que opcionalmente o ainda compreende um ligante que é ligado ao Y.
21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que representa: biotina; ou representa CY5 ou EDANS; ou representa fenila, opcionalmente substituída por um, dois, três, quadro ou cinco substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em C1-C8-alquila, C1-C8-alcóxi, halogênio, - CN, -NO2, -NH2, -N(C1-C8-alquila), -N(C1-C8-alquila)2 -COOH, -COO(C1- C8-alquila), -O-C(O)-(C1-C8-alquila), -C(O)N-(C1-C8-alquila), -N(H)- C(O)-(C1-C8-alquila) preferivelmente opcionalmente substituídos por um substituinte selecionado a partir do grupo consistindo em C1-C8-alcóxi, -COOH, -COO(C1-C8-alquila e NO2; ou representa C1-C8-alquila, opcionalmente substituída por pelo menos um substituinte selecionado a partir do grupo consistindo em C3-C8-cicloalquila; heterociclila com 3 a 8 membros do anel em que o heteroátomo(s) é selecionado a partir de N, O, S; C1-C8-alcóxi; halogênio; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-alquila); -N(C1-C8-alquila)2; -COOH; -COO(C1-C8-alquila); -O-C(O)-(C1-C8-alquila); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-alquila)2; -C(O)NH-(C1-C8-alquila); -N(H)-C(O)-(C1-C8- alquila), preferivelmente C1-C8-alcóxi, -COOH, -COO(C1-C8-alquila e NO2, fenila ou um sistema heteroaromático, um monossacarídeo, um polissacarídeo, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um polímero, um aminoácido, um fluoróforo, um marcador de proteína (substituinte de 1º geração), em que um substituinte de 1º geração pode novamente ser opcionalmente substituído por C3-C8-cicloalquila; heterociclila com 3 a 8 membros do anel em que o heteroátomo(s) é selecionado a partir de N, O, S; C1-C8- alcóxi; halogênio; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-alquila); -N(C1-C8-alquila)2; -COOH; -COO(C1-C8-alquila); -O-C(O)-(C1-C8-alquila); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-alquila)2; -C(O)NH-(C1-C8-alquila); -N(H)-C(O)-(C1-C8- alquila), preferivelmente C1-C8-alcóxi, -COOH, -COO(C1-C8-alquila e NO2, fenila ou um sistema heteroaromático (substituintes de 2º geração) e em que um substituinte de 2º geração pode ser substituído novamente por pelo menos um substituinte selecionado a partir do mesmo grupo e em que tal substituição por ir até a geração 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; ou representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída, ou um sistema heterocíclico de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y; ou representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que representa uma droga, um marcador de proteína, ou um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, uma proteína, um peptídeo, um anticorpo ou um oligonucleotídeo; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que representa um ligante ou um conjugado ligante-droga.
24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo.
25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que representa um anticorpo, preferivelmente um anticorpo IgG, mais preferivelmente um Cetuximab ou um Trastuzumab ou um Brentuximab;
uma proteína, preferivelmente uma proteína GFP ou proteína eGFP, uma albumina, um tripeptídeo, preferivelmente um peptídeo de fórmula (VIII) (VIII), ou de fórmula (IX) (IX) em que # representa a posição de S.
26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que: representa um anticorpo e representa um marcador de proteína, ou um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que: representa uma proteína e representa um marcador de proteína, ou um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, um anticorpo, uma proteína, um oligonucleotídeo, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que:
representa um peptídeo e representa um marcador de proteína, ou um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
29. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que: representa um aminoácido e representa um marcador de proteína, ou um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
30. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que: representa um anticorpo e representa um ligante, uma droga, ou um conjugado ligante-droga.
31. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que: representa um nucleotídeo e representa um peptídeo, uma proteína, um marcador de proteína, um anticorpo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
32. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que: representa um nucleotídeo e representa um ligante.
33. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que: representa um oligonucleotídeo e representa um peptídeo, uma proteína, um marcador de proteína, um anticorpo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
34. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que: representa um oligonucleotídeo e representa um ligante.
35. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, 26 a 29, 31 e 33, caracterizado pelo fato de que: representa um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, em que o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo é ligado a um suporte sólido, em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
36. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, 28 a 29, 31 a 34 e 35, caracterizado pelo fato de que representa um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, em que o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo é ligado a um suporte sólido.
37. Processo para a preparação de um composto de fórmula (I) ou fórmula (I*), caracterizado pelo fato de que compreende:: (I) reagir um composto de fórmula (Ia) (Ia); ou de fórmula (I*a)
(I*a), em que L representa um ligante adequado para ligação a um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo; e
, X, Y, V e R1 são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes, com um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, em que o aminoácido, o peptídeo, o nucleotídeo ou o oligonucleotídeo é ligado a um suporte sólido, resultando em um composto de fórmula (Ib) ou (I*b),
(Ib); ou
(I*b), em que Z representa o aminoácido, o peptídeo, o nucleotídeo ou o oligonucleotídeo, em que o aminoácido, o peptídeo, o nucleotídeo ou o oligonucleotídeo é ligado ao suporte sólido; e (II) clivar o composto de fórmula (Ib) ou fórmula (I*b) a partir do suporte sólido para dar o composto de fórmula (I) ou fórmula (I*):
(I); ou
(I*), em que representa o aminoácido, o peptídeo, o nucleotídeo ou o oligonucleotídeo ligado ao Y através do ligante L, e , X, Y, V e R1 são como definidos acima.
38. Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o ligante L é , em que # indica a posição do Y, e m e n são cada um, independentemente, um número inteiro de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1.
39. Processo de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula (Ia) ou (I*a) é reagido com um peptídeo ligado a um suporte sólido ou um oligonucleotídeo ligado a um suporte sólido, preferivelmente com um peptídeo ligado a um suporte sólido.
40. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que a clivagem é realizada sob condições ácidas.
41. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 40, caracterizado pelo fato de que ainda compreende reagir o composto de fórmula (I) ou fórmula (I*) com um composto de fórmula (II) como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.
42. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o eo estão na mesma molécula.
43. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o eo estão na mesma molécula.
44. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte fórmula (I): (I) em que , , R1, X e Y são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
45. Composto de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que representa uma ligação dupla, X representa (R3 R4)C, e R3 e R4 independentemente representa H ou C1- C8-alquila.
46. Composto de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que representa uma ligação tripla, X representa R3-C, e R3 representa H ou C1-C8-alquila.
47. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte fórmula (I*):
(I*) em que X representa (R3 R4)C, e R1, R3, R4, V, Y e são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
48. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte fórmula (III): (III) em que representa uma ligação e X representa (R3 R4)C, em que R3 e R4 independentemente representa H ou C1-C8-alquila; ou representa uma ligação dupla e X representa R3C, em que R3 representa H ou C1-C8-alquila; e , , R1, e Y são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
49. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte fórmula (III*): (III*) em que X representa (R3 R4)C, e , ,V, Y, R1, R3 e R4 são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
50. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 49, caracterizado pelo fato de que Y é S.
51. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 50, caracterizado pelo fato de que R1 representa C1- C8-alquila opcionalmente substituída por pelo menos um de (C1-C8- alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, F, Cl, Br, I, -NO2, -N(C1-C8-alquila)H, -NH2, -N3, -N(C1-C8-alquila)2, =O, C3-C8-cicloalquila, –S-S-(C1-C8- alquila), hidróxi-(C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, C2-C8- alquenila, C2-C8-alquinila; ou R1 representa fenila opcional e independentemente substituída por pelo menos um de C1-C8-alquila, (C1-C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, F, Cl, I, Br, -NO2, -N(C1-C8-alquila)H, -NH2 ou -N(C1- C8-alquila)2; ou R1 representa um sistema heteroaromático de 5 ou 6 membros tal como piridila; preferivelmente, R1 representa C1-C8-alquila, C1-C8-alquila substituída por –S-S-(C1-C8-alquila), C1-C8-alquila substituída por (C1- C8-alcóxi)n em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, C1-C8-alquila substituída por fenila opcionalmente substituída; ou fenila; ou fenila substituída por –NO2.
52. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 51, caracterizado pelo fato de que R1 representa metila, etila, propila ou butila, mais preferivelmente metila ou etila.
53. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 50, caracterizado pelo fato de que R1 representa , em que R10, R11, R12 e R13 cada um independentemente representa hidrogênio ou C1-C8-alquila; e # representa a posição de O.
54. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 50, caracterizado pelo fato de que R1 representa C1- C8-alquila substituída por fenila, a referida fenila sendo adicionalmente substituída por , em que Z é O ou NH, preferivelmente O, e em que # representa a posição da referida fenila.
55. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 50, caracterizado pelo fato de que R1 representa C1- C8-alquila substituída por fenila, a referida fenila sendo adicionalmente substituída por , e em que # representa a posição da referida fenila.
56. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 50, caracterizado pelo fato de que R1 representa com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; ; ou com n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em que # representa a posição de O.
57. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 56, caracterizado pelo fato de que representa uma molécula pequena tal como, por exemplo, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, preferivelmente etila, -CH2-fenila, , , , ,
, , , , ou , em que # indica a posição do Y; ou representa uma fenila opcionalmente substituída; ou representa um nuclídeo radioativo ou não radioativo, biotina, uma enzima repórter, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, um aminoácido, um peptídeo, ou um sistema heteroaromático de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
58. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 56, caracterizado pelo fato de que representa: biotina; ou representa CY5 ou EDANS; ou representa fenila, opcionalmente substituída por um, dois, três, quadro ou cinco substituintes independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em C1-C8-alquila, C1-C8-alcóxi, halogênio, -CN, -NO2, -NH2, -N(C1-C8-alquila), -N(C1-C8-alquila)2 -COOH, -COO(C1-C8-alquila), -O-C(O)-(C1-C8-alquila), -C(O)N-(C1-C8-alquila), -N(H)-C(O)-(C1-C8-alquila) preferivelmente opcionalmente substituídos por um substituinte selecionado a partir do grupo consistindo em C1-C8- alcóxi, -COOH, -COO(C1-C8-alquila e NO2; ou representa C1-C8-alquila, opcionalmente substituída por pelo menos um substituinte selecionado a partir do grupo consistindo em C3-C8-cicloalquila; heterociclila com 3 a 8 membros do anel em que o heteroátomo(s) é selecionado a partir de N, O, S; C1-C8-alcóxi; halogênio; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-alquila); -N(C1-C8-alquila)2; -COOH; -COO(C1-C8-alquila); -O-C(O)-(C1-C8-alquila); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-alquila)2; -C(O)NH-(C1-C8-alquila); -N(H)-C(O)-(C1-C8- alquila), preferivelmente C1-C8-alcóxi, -COOH, -COO(C1-C8-alquila e NO2, fenila ou um sistema heteroaromático, um monossacarídeo, um polissacarídeo, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um polímero, um aminoácido, um fluoróforo, um marcador de proteína (substituinte de 1º geração), em que um substituinte de 1º geração pode novamente ser opcionalmente substituído por C3-C8-cicloalquila; heterociclila com 3 a 8 membros do anel em que o heteroátomo(s) é selecionado a partir de N, O, S; C1-C8- alcóxi; halogênio; -CN; -NO2; -NH2; -N(C1-C8-alquila); -N(C1-C8-alquila)2; -COOH; -COO(C1-C8-alquila); -O-C(O)-(C1-C8-alquila); -CONH2; -C(O)N(C1-C8-alquila)2; -C(O)NH-(C1-C8-alquila); -N(H)-C(O)-(C1-C8- alquila), preferivelmente C1-C8-alcóxi, -COOH, -COO(C1-C8-alquila e NO2, fenila ou um sistema heteroaromático (substituintes de 2º geração) e em que um substituinte de 2º geração pode ser substituído novamente por pelo menos um substituinte selecionado a partir do mesmo grupo e em que tal substituição por ir até a geração 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; ou representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um sacarídeo, um polissacarídeo, um polímero, uma C1-C8-alquila opcionalmente substituída, uma fenila opcionalmente substituída, ou um sistema heterocíclico de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y; ou representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
59. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 56, caracterizado pelo fato de que representa uma droga, um marcador de proteína, ou um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, uma proteína, um peptídeo, um anticorpo ou um oligonucleotídeo; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
60. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 56, caracterizado pelo fato de que representa um ligante ou um conjugado ligante-droga.
61. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 60, caracterizado pelo fato de que representa um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo.
62. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 61, caracterizado pelo fato de que representa um anticorpo, preferivelmente um anticorpo lgG, mais preferivelmente um Cetuximab ou um Trastuzumab ou um Brentuximab; uma proteína, preferivelmente uma proteína GFP ou proteína eGFP, uma albumina, um tripeptídeo, preferivelmente um peptídeo de fórmula (VIII) (VIII), ou de fórmula (IX)
(IX) em que # representa a posição de S.
63. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que: representa um anticorpo e representa um marcador de proteína, ou um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
64. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que: representa uma proteína e representa um marcador de proteína, ou um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, um anticorpo, uma proteína, um oligonucleotídeo, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
65. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que: representa um peptídeo e representa um marcador de proteína, ou um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, um anticorpo, uma proteína, um oligonucleotídeo, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
66. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que:
representa um aminoácido e representa um marcador de proteína, ou um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, um peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
67. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que: representa um anticorpo e representa um ligante, uma droga, ou um conjugado ligante-droga.
68. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que: representa um nucleotídeo e representa um peptídeo, uma proteína, um marcador de proteína, um anticorpo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
69. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que: representa um nucleotídeo e representa um ligante.
70. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que: representa um oligonucleotídeo e representa a um peptídeo, uma proteína, um marcador de proteína, um anticorpo, um oligonucleotídeo, um fluoróforo tal como CY5 ou EDANS, biotina, ou uma molécula pequena; em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y.
71. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que:
representa um oligonucleotídeo e representa um ligante.
72. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 59, 61 a 66, 68 e 70, caracterizado pelo fato de que: representa um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, em que o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo é ligado a um suporte sólido, em que opcionalmente o adicionalmente compreende um ligante que é ligado ao Y, preferivelmente em que o composto é um composto de fórmula.
73. Composto de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto de fórmula (I) ou fórmula (I*).
74. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 62, 65 a 66, 68 a 71 e 72, caracterizado pelo fato de que representa um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo, em que o aminoácido, peptídeo, nucleotídeo ou oligonucleotídeo é ligado a um suporte sólido.
75. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um suporte sólido, e Um composto de fórmula (Ia) (Ia), e/ou um composto de fórmula (I*a) (I*a), em que L é um ligante adequado para ligação a um aminoácido, um peptídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo; e em que , R1, X, Y, e V são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
76. Kit de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o ligante L é , em que # indica a posição do Y, e m e n são cada um, independentemente, um número inteiro de 0 a 20, 0 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, ou 1, preferivelmente m é 1 e n é 1.
77. Kit de acordo com a reivindicação 75 ou 76, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais de um aminoácido, um ou mais de um peptídeo, um ou mais de um nucleotídeo, e/ou um ou mais de um oligonucleotídeo.
78. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte fórmula (IIIa): (IIIa), em que representa uma ligação e X representa (R3 R4)C; ou representa uma ligação dupla e X representa R3–C; e , , R1, X e Y são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
79. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte fórmula (III*a):
(III*a), em que X representa (R3 R4)C, e , ,V, Y, R1, R3, e R4 são como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
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