JP2021185749A

JP2021185749A - 細胞培養装置および細胞培養方法

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Publication number: JP2021185749A
Application number: JP2020090633A
Authority: JP
Inventors: 久人中嶋; Hisato Nakajima
Original assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Current assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2021-12-13
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: JP7486160B2

Abstract

【課題】細胞の継代工程において、培養容器から効率よく細胞を剥離し、回収することができる細胞培養装置および細胞培養方法を提供すること。【解決手段】細胞培養装置は、細胞が培養されている培養容器を所定角度傾斜させる容器揺動部と、培養容器が傾斜した状態において、ピペットを移動させながらピペット内の薬液を培養容器に注入する薬液注入動作、および、培養容器から細胞が含まれた薬液をピペット内に吸引する薬液吸引動作を行うロボットと、を有し、薬液注入動作におけるピペットの軌跡を、所定角度と、培養容器に注入される薬液の量と、ピペットの吐出口の幅と、傾斜した培養容器の上面視において培養容器の底面と側面との境界となる円周上にあって、傾斜した培養容器の側面視において最も低い位置である第１教示点と、円周上にあって、円周と、培養容器の底面を分割する線分との交点である第２教示点および第３教示点と、に基づいて決定する。【選択図】図１

Description

本開示は、細胞を培養する細胞培養装置および細胞培養方法に関する。

例えば特許文献１には、細胞を培養するための作業を自動化した細胞培養システムが開示されている。

この細胞培養システムについて、図１３、図１４を用いて簡単に説明する。図１３は、特許文献１の細胞培養システムのロボットの一例を示す側面図である。図１４は、図１３に示したロボットが培地ボトルを把持して行う吸引操作の一例を示す側面図である。

特許文献１の細胞培養システムは、図１３に示すように、細胞を培養するための作業を行うロボット５を有する。図示は省略するが、ロボット５は、細胞の培養に用いられる複数の機器とともに、開閉可能な複数の扉を備えた収容部に収容されている。

例えば、細胞が培養されている培地ボトル４１に注入された薬液の吸引を行う場合、まず、ロボット５は、図１４に示すように、ピペット装置２１を固定台３１に固定する。ピペット装置２１は、予め設定された量の薬液の吸引および注入を行う装置である。

そして、ロボット５は、図１４に示すように、キャップが取り外された培地ボトル４１をハンド６により把持し、その培地ボトル４１をピペット装置２１の先端に移動させる。

この状態において、吸引ボタン２２が操作されると、培地ボトル４１からピペット装置２１に、剥離された細胞を含む薬液が吸引される。

特許第６３９９２１５号公報

本開示の一態様の目的は、細胞の継代工程において、培養容器から効率よく細胞を剥離し、回収することができる細胞培養装置および細胞培養方法を提供することである。

本開示の一態様に係る細胞培養装置は、細胞が培養されている培養容器を所定角度傾斜させる容器揺動部と、前記培養容器が傾斜した状態において、ピペットを移動させながら前記ピペット内の薬液を前記培養容器に注入する薬液注入動作、および、前記培養容器から前記細胞が含まれた前記薬液を前記ピペット内に吸引する薬液吸引動作を行うロボットと、を有し、前記薬液注入動作における前記ピペットの軌跡を、前記所定角度と、前記培養容器に注入される前記薬液の量と、前記ピペットの吐出口の幅と、傾斜した前記培養容器の上面視において前記培養容器の底面と側面との境界となる円周上にあって、傾斜した前記培養容器の側面視において最も低い位置である第１教示点と、前記円周上にあって、前記円周と、前記培養容器の底面を分割する線分との交点である第２教示点および第３教示点と、に基づいて決定する。

本開示の一態様に係る細胞培養方法は、ピペットを移動させながら前記ピペット内の薬液を細胞が培養されている培養容器に注入する薬液注入動作、および、前記培養容器から前記細胞が含まれた前記薬液を前記ピペット内に吸引する薬液吸引動作を行う装置が行う細胞培養方法であって、前記薬液注入動作および前記薬液吸引動作を、前記培養容器が所定角度傾斜された状態で行い、前記薬液注入動作における前記ピペットの軌跡を、前記所定角度と、前記培養容器に注入される前記薬液の量と、前記ピペットの吐出口の幅と、傾斜した前記培養容器の上面視において前記培養容器の底面と側面との境界となる円周上にあって、傾斜した前記培養容器の側面視において最も低い位置である第１教示点と、前記円周上にあって、前記円周と、前記培養容器の底面を分割する線分との交点である第２教示点および第３教示点と、に基づいて決定する。

本開示によれば、細胞の継代工程において、培養容器から効率よく細胞を剥離し、回収することができる。

本開示の実施の形態に係る細胞培養装置を示す斜視図本開示の実施の形態に係る細胞培養装置を示す正面図本開示の実施の形態に係る細胞培養装置を示す上面図本開示の実施の形態に係る培養容器把持ツールを示す概略図本開示の実施の形態に係る薬液吸引／注入ツールを示す概略図薬液注入動作の準備工程を示すフローチャート傾斜されたディッシュ内の剥離剤の液面高さの一例を示す概略図第１〜第３教示点の一例を示す概略図ピペットの先端の軌跡の一例を示す概略図ディッシュの底面における分割領域の一例を示す概略図薬液注入動作を示すフローチャートディッシュ底面の左半分の領域における走査奇跡の一例を示す概略図ディッシュ底面の右半分の領域における走査奇跡の一例を示す概略図特許文献１の細胞培養システムのロボットの一例を示す側面図図１３に示したロボットがハンドにより培地ボトルを把持して行う吸引操作の一例を示す側面図

（従来の課題）
細胞が培養されている培養容器（以下、単に容器ともいう）を移し替える継代工程において必要となる細胞の剥離動作を実施する場合、剥離させるための薬液を、細胞が接着している容器の底面の全面に勢いよく塗布する必要がある。

薬液の塗布の勢いは、薬液の注入速度またはピペットの移動速度のいずれかを上げることによって増すことができる。薬液の注入速度を上げると、容器に注入された薬液が跳ね返るおそれがあるため、ピペットの移動速度を上げる方が望ましい。

例えば特許文献１の構成では、上述したとおり、ロボットが容器（培地ボトル４１）を把持し、動かす。よって、相対的にピペットの移動速度を上げると、容器を素早く動かした際に薬液が容器からこぼれるおそれがある。特に、容器が、開口部が広く、深さが浅いディッシュである場合、特許文献１の構成では、薬液がこぼれる可能性が高くなる。よって、容器から効率よく細胞を剥離し、回収することができないおそれがある。

（実施の形態）
以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、各図において共通する構成要素については同一の符号を付し、それらの説明は適宜省略する。

まず、本実施の形態に係る細胞培養装置５０について、図１、図２Ａ、図２Ｂを用いて説明する。図１は、細胞培養装置５０の斜視図である。図２Ａは、細胞培養装置５０の正面図である。図２Ｂは、細胞培養装置５０の上面図（平面図）である。

細胞培養装置５０の全体は、図示しないカバーで覆われている。カバーは、開口部を有しており、密閉型ではないキャビネット構造である。

細胞培養装置５０は、ロボット５１を有する。ロボット５１（より具体的には、後述するツールチェンジャ５２）は、矢印Ｘで示す水平方向（以下、Ｘ軸という）、矢印Ｙで示す奥行き方向（以下、Ｙ軸という）、矢印Ｚで示す垂直方向（以下、Ｚ軸という）に移動することが可能な３軸の直行ロボットである。

ロボット５１は、Ｚ軸の先端にツールチェンジャ５２を備える。ツールチェンジャ５２は、培養容器把持ツール５３および薬液吸引／注入ツール５４のそれぞれに対して着脱可能である。これにより、ロボット５１は、細胞培養に必要なディッシュ（培養容器の一例）７１やピペット７６などを把持し、搬送することができる。すなわち、細胞培養装置５０は、培養容器の搬送や薬液の吸引／注入を自動で行うことができる。

ここで、図３を用いて、培養容器把持ツール５３について説明する。図３は、ツールチェンジャ５２および培養容器把持ツール５３の概略図である。

ツールチェンジャ５２は、フレーム５５、モータ５６、シリンダ５７、チャック爪５８ａ、５８ｂを有する。図３では、ツールチェンジャ５２と培養把持ツール５３とが接続されていない状態を示している。ツールチェンジャ５２は、図中の下方向に移動し、培養把持ツール５３と接続される。

なお、ツールチェンジャ５２が培養容器把持ツール５３と接続されている場合、フレーム５５に備えられているモータ５６およびシリンダ５７は動作しない。モータ５６、シリンダ５７の動作については、後述する。

培養容器把持ツール５３は、ディッシュ７１を把持／解放（切り離し）するツールである。培養容器把持ツール５３は、フレーム６１、シリンダ６２、チャック爪６３ａ、６３ｂを有する。フレーム６１にはシリンダ６２が接続されている。シリンダ６２にはチャック爪６３ａ、６３ｂが接続されている。

シリンダ６２は、ツールチェンジャ５２から送られてくる圧縮空気によってチャック爪６３ａ、６３ｂを開閉する。これにより、ディッシュ７１は、培養容器把持ツール５３によって把持されたり、培養容器把持ツール５３から解放されたりする。図中の両矢印は、チャック爪６３ａ、６３ｂの開方向および閉方向を示している。

次に、図４を用いて、薬液吸引／注入ツール５４について説明する。図４は、ツールチェンジャ５２および薬液吸引／注入ツール５４の概略図である。

薬液吸引／注入ツール５４は、使い捨てのピペット７６に対して着脱可能である、薬液の吸引／注入を行うツールである。薬液吸引／注入ツール５４は、フレーム６４、シリンダ６５、プランジャー６６、ピストン６７を有する。フレーム６４には、シリンダ６５、プランジャー６６、ピストン６７が設けられている。

図４では、ツールチェンジャ５２と薬液吸引／注入ツール５４とが接続されていない状態を示している。ツールチェンジャ５２は、図中の下方向に移動し、薬液吸引／注入ツール５４と接続される。

ツールチェンジャ５２が薬液吸引／注入ツール５４と接続されている状態において、モータ５６の駆動によりシリンダ５７が下降すると、圧縮空気によりチャック爪５８ａ、５８ｂが閉じる。これにより、プランジャー６６がチャック爪５８ａ、５８ｂに挟まれる。

その後、ピペット７６が薬液中に浸かっている状態において、モータ５６の駆動によりシリンダ５７が上昇すると、ピペット７６内に薬液が吸い上げられる。

その後、ピペット７６に薬液が吸い上げられている状態において、モータ５６の駆動によりシリンダ５７が下降すると、ピペット７６から薬液が吐出される。

薬液吸引／注入ツール５４をツールチェンジャ５２から解放する場合、圧縮空気によりシリンダ５７がチャック爪５８ａ、５８ｂを開いた後、モータ５６の駆動によりシリンダ５７を上昇させる。

以上、培養容器把持ツール５３および薬液吸引／注入ツール５４について説明した。以下、図１、図２Ａ、図２Ｂの説明に戻る。

容器揺動部８１は、モータを内蔵したステージである。容器揺動部８１は、モータの駆動によりステージに積載された培養容器であるディッシュ７１を揺動する。

薬液保存部８２は、薬液保存容器７７（例えば、遠沈管等）を保持するスタンドである。薬液保存部８２は複数の収容部を有し、各収容部には薬液保存容器７７が１つずつ挿入される。

容器入出庫部８３は、複数のディッシュ７１を保持する。容器入出庫部８３は、４つの棒状部材を有し、それら棒状部材により、段積みされる複数のディッシュ７１の位置決めを行う。

消耗品供給部８４は、ピペット７６を保持するスタンドである。消耗品供給部８４は複数の収容部を有し、各収容部にはピペット７６が１つずつ挿入される。

廃液部８５は、ピペット７６内に吸引された薬液が廃液される貯留部（図示略）に通じた開口部である。貯留部は、細胞培養装置５０の架台下に設置されている。

廃棄部８６は、廃棄ボックス（図示略）に通じた開口部である。廃棄ボックスは、使用済みのピペット７６やディッシュ７１の収容部であり、細胞培養装置５０の架台下に設置されている。廃棄部８６は、圧縮空気により開閉される。例えば、廃棄部８６は、ピペット７６やディッシュ７１の廃棄が行われるときのみ、開口する。これにより、廃棄ボックスで発生しうる雑菌による汚染を低減することができる。

以上、細胞培養装置５０について説明した。

次に、細胞培養装置５０が行う基本動作について説明する。この基本動作は、細胞が培養されているディッシュ７１に薬液を注入して細胞をディッシュ７１から剥離し、その細胞を含む薬液を回収する動作である。

まず、細胞培養装置５０の操作者（図示略）は、継代に必要な薬液を薬液保存部８２の各薬液保存容器７７にセットする。また、操作者は、ピペット７６を消耗品供給部８４にセットする。そして、操作者は、細胞が培養されている継代元（播種元）のディッシュ７１（以下、継代元ディッシュという）と、細胞を播種する継代先（播種先）のディッシュ７１（以下、継代先ディッシュという）とを容器入出庫部８３にセットする。これらのセットが終わった後、操作者は、細胞培養装置５０の操作部（図示略）において、ロボット５１に動作を開始させるための操作を行う。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２に培養容器把持ツール５３を接続する。その後、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を容器入出庫部８３に移動させる。

次に、ロボット５１は、培養容器把持ツール５３により継代元ディッシュを把持し、その継代元ディッシュを容器揺動部８１へ搬送し、容器揺動部８１に載置する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２から培養容器把持ツール５３を解放する。そして、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２に薬液吸引／注入ツール５４を接続する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を消耗品供給部８４に移動させる。そして、ロボット５１は、消耗品供給部８４に収容されているピペット７６を、薬液吸引／注入ツール５４に取り付ける。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を容器揺動部８１へ移動させる。そして、ロボット５１は、薬液吸引／注入ツール５４を用いて、容器揺動部８１に載置されている継代元ディッシュからピペット７６内へ薬液を吸引する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を廃液部８５へ移動させ、ピペット７６内の薬液を廃液する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を廃棄部８６へ移動させ、薬液吸引／注入ツール５４に取り付けられているピペット７６を廃棄する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を消耗品供給部８４へ移動させ、薬液吸引／注入ツール５４に新たなピペット７６を取り付ける。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を薬液保存部８２へ移動させる。そして、ロボット５１は、薬液吸引／注入ツール５４を用いて、細胞を剥離させるための薬液（以下、剥離剤ともいう）を薬液保存容器７７からピペット７６内へ吸引する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を容器揺動部８１へ移動させる。そして、ロボット５１は、薬液吸引／注入ツール５４を用いて、ピペット７６内の剥離剤を継代元ディッシュへ注入する。これにより、細胞は剥離剤中に浮遊した状態となる。すなわち、細胞の剥離が行われる。

次に、ロボット５１は、薬液吸引／注入ツール５４を用いて、細胞を含む剥離剤（以下、細胞含有剥離剤という）をピペット７６内へ吸引する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を薬液保存部８２へ移動させる。そして、ロボット５１は、薬液吸引／注入ツール５４を用いて、細胞含有剥離剤をピペット７６から薬液保存容器７７へ注入する。これにより、細胞が回収される。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２から薬液吸引／注入ツール５４を解放する。そして、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２に培養容器把持ツール５３を接続する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を容器揺動部８１へ移動させる。そして、ロボット５１は、培養容器把持ツール５３を用いて、容器揺動部８１に載置されている継代元ディッシュを把持する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を廃棄部８６へ移動させ、培養容器把持ツール５３に取り付けられている継代元ディッシュを廃棄する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を容器入出庫部８３に移動させる。そして、ロボット５１は、培養容器把持ツール５３により継代先ディッシュを把持し、その継代先ディッシュを容器揺動部８１へ搬送し、容器揺動部８１に載置する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を薬液保存部８２へ移動させる。そして、ロボット５１は、薬液吸引／注入ツール５４を用いて、細胞含有剥離剤を薬液保存容器７７からピペット７６内へ吸引する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を容器揺動部８１へ移動させる。そして、ロボット５１は、薬液吸引／注入ツール５４を用いて、ピペット７６内の細胞含有剥離剤を継代先ディッシュへ注入する。

次に、ロボット５１は、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２から薬液吸引／注入ツール５４を解放する。そして、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２に培養容器把持ツール５３を接続する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を容器揺動部８１へ移動させる。そして、ロボット５１は、培養容器把持ツール５３を用いて、容器揺動部８１に載置されている継代先ディッシュを把持する。

次に、ロボット５１は、ツールチェンジャ５２を容器入出庫部８３へ移動させ、培養容器把持ツール５３から継代先ディッシュを解放する。

以上、細胞培養装置５０の基本動作について説明した。

上述した基本動作では、より多くの細胞を剥離させ、効率よく細胞を回収する必要がある。そのためには、ディッシュ７１に薬液の注入が行われる際、ピペット７６から吐出される薬液がディッシュ７１の底面全体に行き渡るようにロボット５１を走査させることが望ましい。本実施の形態では、ロボット５１による走査を、複数の教示点（詳細は後述）を指定することにより実現する。なお、本実施の形態でいう走査とは、複数の教示点に基づいて設定される軌跡に基づいて、ディッシュ７１の底面に対してピペット７６から薬液を吐出させながらピペット７６（ツールチェンジャ５２と言ってもよい）を移動させることをいう。また、走査は、薬液注入動作と言ってもよい。

また、継代元ディッシュに注入された剥離剤は、継代元ディッシュに溜まる。よって、継代元ディッシュに一度に注入できる剥離剤の量（例えば、ピペット７６で決まる）で継代元ディッシュの底面全体を走査するためには、注入動作に要する時間を考慮して、剥離剤の吐出速度を決定することが重要である。その一方で、剥離剤の注入量がピペットの容積内に収まるように剥離剤の吐出速度を抑えて走査を行うと、剥離剤による細胞の剥離効果が十分に得られない場合もある。

そこで、本実施の形態の細胞培養装置５０は、薬液注入動作の準備工程により、例えば、走査時におけるピペット７６の軌跡を決定するための教示点や、剥離剤の吐出速度といった、動作パラメータを決定する。以下、図５を用いて、薬液注入動作の準備工程の流れについて説明する。図５は、薬液注入動作の準備工程を示すフローチャートである。

なお、以下の説明では、図５に示す各ステップの主体を細胞培養装置５０と記載するが、より具体的には、各ステップの主体は、細胞培養装置５０における各種動作を制御する制御部（図示略）である。制御部は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory）等により構成される。ＣＰＵがＲＯＭから読み出したプログラムを、ＲＡＭを用いて実行することにより、図５に示すフローが実現される。なお、これは、後述する図１０のフローの説明においても同様である。

まず、細胞培養装置５０は、容器揺動部８１により傾斜させられるディッシュ７１（継代元ディッシュ）の角度を決定する（ステップＳ１）。この角度を、以下「傾斜角度Ｄ」という。

上述した基本動作では、剥離剤をディッシュ７１に注入する前に、容器揺動部８１が、ディッシュ７１を傾斜させる。これにより、剥離剤がディッシュ７１の片側（傾斜により低くなった側）に集められるため、剥離剤を吸引し易くなる。ステップＳ１では、このときの傾斜角度Ｄが決定される。傾斜角度Ｄは、水平面に対する傾斜角度である（図６参照）。

次に、細胞培養装置５０は、継代元ディッシュに対する剥離剤の注入量を決定する（ステップＳ２）。

上述した基本動作において、継代元ディッシュへの剥離剤の注入量は多い方が好ましいが、継代元ディッシュに注入された剥離剤が継代元ディッシュに溜まり、また、剥離剤が収容されるピペット７６の容量に制限がある。そのため、ステップＳ２では、例えば、ピペット７６の容量が、継代元ディッシュへの剥離剤の注入量として決定される。

次に、細胞培養装置５０は、継代元ディッシュに溜まった剥離剤の液面高さを算出する（ステップＳ３）。ここでいう液面高さとは、決定された注入量の剥離剤を継代元ディッシュに注入し、その継代元ディッシュを、決定された傾斜角度Ｄだけ傾けたと仮定した場合の値である。

図６に、剥離剤の液面高さの一例を模式的に示す。ステップＳ２で決定された量の剥離剤がディッシュ７１に注入され、容器揺動部８１によりステップＳ１で決定された傾斜角度Ｄだけディッシュ７１が傾けられた場合、図６に示すように、剥離剤ａ（細胞含有剥離剤）は、ディッシュ７１の片側（図中の左側）に集まる。ステップＳ３では、このときの剥離剤ａの液面高さＨを算出する。

次に、継代元ディッシュ上においてピペット７６の先端が配置されるべき位置として、第１教示点、第２教示点、および第３教示点を決定する（ステップＳ４）。

第１教示点は、継代元ディッシュに溜まった剥離剤（細胞含有剥離剤）を吸引するときのピペット７６の位置である。第２教示点および第３教示点は、走査が開始されるときのピペット７６の位置である。第１教示点は、傾斜角度Ｄに基づいて決定される。例えば、第１教示点は、ディッシュ７１の底面と側面の境界上でＺ軸方向に一番低くなる点となる。第２教示点、第３教示点は、ディッシュ７１の（底面の）形状に基づいて決定される。ディッシュ７１の底面は円形状であるので、第２教示点および第３教示点は、ディッシュ７１の底面と側面の境界上にあって、それらを結ぶ直線がディッシュ７１の底面の円形状を半分に分割する点となる。

図７に、第１教示点、第２教示点、および第３教示点一例を模式的に示す。図７の上図は側面図であり、図７の下図は上面図である。

図７に示すように、第１教示点Ｐａは、傾けられたディッシュ７１の上面視においてディッシュ７１の底面とディッシュ７１の側面との境界となる円周ｂ（以下、単に円周ｂともいう）上にあって、傾けられたディッシュ７１の側面視において最も低い位置である。これにより、ピペット７６が剥離剤ａをより確実に吸い上げることができる。円周ｂは、ディッシュ７１の底面の円周と一致する。

図７に示すように、第２教示点Ｐｂおよび第３教示点Ｐｃは、ディッシュ７１の底面とディッシュ７１の側面との境界となる円周ｂ上にあって、その円周ｂと、ディッシュ７１の底面を半分に分割する仮想線分（図中の一点鎖線参照）とが交差する２点である。

詳細は後述するが、第１教示点Ｐａ、第２教示点Ｐｂ、第３教示点Ｐｃは、走査時におけるピペット７６の軌跡を決定するために用いられる。

次に、細胞培養装置５０は、ディッシュ７１の円周（すなわち、上記円周ｂ）を算出する（ステップＳ５）。

上述したとおり、ステップＳ４で決定された第１教示点、第２教示点、および第３教示点は、円周ｂ上にあるため、ステップＳ５では、ディッシュ７１の円周を算出することができる。すなわち、円周ｂは、第１教示点、第２教示点、および第３教示点を通る円として決定される。

次に、細胞培養装置５０は、ディッシュ７１の底面における剥離剤の塗布幅に基づいて、第１教示点、第２教示点、および第３教示点以外の複数の教示点を算出する（ステップＳ６）。

ここで算出される複数の教示点とは、円周ｂ上にあって、第１教示点と第２教示点との間および第１教示点と第３教示点との第における複数の位置である。

図８に、複数の教示点およびピペット７６の先端の軌跡の一例を模式的に示す。ピペット７６の先端（剥離剤の吐出口）と、ディッシュ７１の底面とは非常に近い。そのため、ディッシュ７１の底面において剥離剤が塗布される幅Ｗ（図８において、隣り合う黒丸間の距離）は、ピペット７６の吐出口の内径と等しい（なお、図８では、図示を明瞭にするため、幅Ｗがピペット７６の吐出口の内径よりも大きく図示している）。よって、ステップＳ６では、細胞培養装置５０にとって既知である幅Ｗと、ステップＳ５で算出された円周ｂとに基づいて、円周ｂ上における第１教示点Ｐａと第２教示点Ｐｂとの間の複数の教示点Ｐｆ、および、円周ｂ上における第１教示点Ｐａと第３教示点Ｐｃとの間の複数の教示点Ｐｇが算出される。

細胞培養装置５０は、複数の教示点Ｐｆ、Ｐｇ、第１教示点Ｐａ、第２教示点Ｐｂ、第３教示点Ｐｃに基づいて、走査時におけるピペット７６の軌跡（図８の下図における点線の各矢印参照）を決定する。

上述したとおり、薬液の塗布の勢いは、薬液の注入速度またはピペット７６の移動速度のいずれかを上げることによって増すことができる。薬液の注入速度を上げると、ディッシュ７１に注入された薬液が跳ね返るおそれがあるため、ピペット７６の移動速度を上げる方が望ましい。

そこで、ピペット７６を最高速度で動作させて、算出された全ての教示点を通過するのに要する時間を算出する。この時間内にピペット７６の容量分の剥離剤をディッシュ７１に注入することから、剥離剤の吐出速度が決定される。

次に、細胞培養装置５０は、ディッシュ７１の底面の領域を分割する（ステップＳ７）。

剥離剤は、傾斜角度Ｄ分傾けられたディッシュ７１の上方側から注入される。そのため、ディッシュ７１の下方側には、注入された剥離剤が溜まる。これにより、ディッシュ７１の底面には、剥離剤に浸かる領域（以下、浸漬領域という）と、剥離剤に浸からない領域（以下、非浸漬領域）とが形成される。浸漬領域では、注入される剥離剤の勢いが、溜まった剥離剤の液面で抑制されることにより、細胞を剥離させる効果が低下する。したがって、走査時においてピペット７６の先端が浸漬領域に到達した時点で、一度注入された剥離剤を回収し、その後、走査が行われていない領域（例えば、図９に示す浸漬領域Ａ）に対して走査を行うことが望ましい。

そこで、ピペット７６により走査が行われるディッシュ７１の底面の領域を、図９に示すように、浸漬領域Ａと、非浸漬領域Ｂとに分割する。浸漬領域Ａと非浸漬領域Ｂとの境界の位置は、ステップＳ３で算出された液面高さＨと、ステップＳ５で算出された円周ｂとに基づいて、算出することができる。ステップＳ７では、浸漬領域Ａと非浸漬領域Ｂとの境界の位置と、円周ｂとが交わる点が、交点Ｐｄ、Ｐｅとして決定される。

以上、薬液注入動作の準備工程について説明した。

細胞培養装置５０は、上述した薬液注入動作の準備工程の後、実際にディッシュ７１（継代元ディッシュ）に対して剥離剤を注入する動作（以下、薬液注入動作という）を行う。薬液注入動作では、細胞をディッシュ７１から剥離させるため、薬液注入動作の準備工程で求められた教示点に基づいて走査が行われる。

この薬液注入動作について、図１０を用いて以下に説明する。図１０は、薬液注入動作のフローチャートである。ここでは例として、図１０のフローは、ディッシュ７１が図９に示すように傾けられた状態で開始されるとする。

まず、細胞培養装置５０は、ロボット５１を用いて走査を行い、非浸漬領域Ｂ（図９の下図参照）に剥離剤を注入する（ステップＳ８）。

具体的には、ロボット５１は、教示点Ｐｂ、Ｐｃのいずれか一方を始点とし、交点Ｐｄ、Ｐｅのいずれか一方を終点とし、始点から、教示点Ｐｂ、Ｐｃのうち開始点ではない方、図５のステップＳ６で求められた複数の教示点（例えば、図９において、複数の教示点ＰｆのうちＰｂとＰｄの間の教示点、複数の今日時点ＰｇのうちＰｃとＰｅの間の教示点）、交点Ｐｄ、Ｐｅのうち終点ではない方を経由して終点に至る軌跡（図１１の下図における点線の各矢印参照）に沿って走査を行う。これにより、非浸漬領域Ｂに剥離剤が注入される。

次に、細胞培養装置５０は、ピペット７６の先端が終点（交点Ｐｄ、Ｐｅのいずれか）に到達したら、一旦剥離剤の注入を中断し、ピペット７６の先端を教示点Ｐａに移動させ、そこでディッシュ７１に溜まった細胞含有剥離剤（図９等に示した剥離剤ａ）をピペット７６内に吸引する（ステップＳ９）。このとき、注入量と同等の量の細胞含有剥離剤が吸い上げられる。

次に、細胞培養装置５０は、ロボット５１を用いて走査を行い、浸漬領域Ａ（図９の下図参照）に剥離剤を注入する（ステップＳ１０）。

具体的には、ロボット５１は、教示点Ｐａを始点とし、交点Ｐｄ、Ｐｅのいずれか一方を終点とし、始点から、図５のステップＳ６で求められた複数の教示点（例えば、図９において、複数の教示点ＰｆのうちＰａとＰｄの間の教示点、複数の教示点ＰｇのうちＰａとＰｅの間の教示点）、交点Ｐｄ、Ｐｅのうち終点ではない方を経由して終点に至る軌跡（図１１の下図における点線の各矢印参照）に沿って走査を行う。これにより、浸漬領域Ａに剥離剤（ステップＳ９で吸引された細胞含有剥離剤）が注入される。

次に、細胞培養装置５０は、ピペット７６の先端が終点（交点Ｐｄ、Ｐｅのいずれか）に到達したら、走査（剥離剤の注入）を終了し、ピペット７６の先端を教示点Ｐａに移動させ、そこでディッシュ７１に溜まった細胞含有剥離剤（図９等に示した剥離剤ａ）をピペット７６内に吸引する（ステップＳ１１）。

このステップＳ１１までは、図９の上図に示すように、ディッシュ７１の左側が右側よりも低くなるように、ディッシュ７１が傾斜角度Ｄ（図６参照）分傾けられた状態である。すなわち、ここまでは、図９の下図に示すディッシュ７１の左半分の領域のみにしか、剥離剤の注入が行われていないことになる。

そこで、細胞培養装置５０は、容器揺動部８１を動作させることにより、ディッシュ７１を逆側に傾ける（ステップＳ１２）。

具体的には、細胞培養装置５０は、ディッシュ７１の右側が左側よりも低くなるように、ディッシュ７を傾斜角度Ｄ分傾けた状態にする（図１２参照）。

その後、細胞培養装置５０は、ステップＳ８〜Ｓ１１の動作を実行する。このときの各教示点（Ｐａ、Ｐｂ、Ｐｃ、Ｐｆ、Ｐｇ）、交点Ｐｄ、Ｐｅ、および、それらに基づく走査の軌跡は、図１２に示すとおりである。これにより、ディッシュ７１の右半分の領域における浸漬領域および非浸漬領域（図示略）のそれぞれに対して剥離剤の注入が行われる。

以上、薬液注入動作について説明した。上述した薬液注入動作では、ディッシュ７１の底面の領域を分割し、分割された領域ごとに走査を行うので、ディッシュ７１の底面全体に満遍なく剥離剤を塗布することができ、細胞を効率良く剥離させることができる。

なお、傾斜角度Ｄおよび各教示点は、教示点Ｐｂと教示点Ｐｃとを結ぶ線分を基準として線対称に設定されることが好ましい。これにより、図５に示した薬液注入動作の準備工程は１度だけ行われればよく、処理を簡略化できる。

以上説明したように、本実施の形態の細胞培養装置５０は、細胞が培養されているディッシュ７１を所定角度傾斜させる容器揺動部８１と、ディッシュ７１が傾斜した状態において、ピペット７６を移動させながらピペット７６内の薬液をディッシュ７１に注入する薬液注入動作、および、ディッシュ７１から細胞が含まれた薬液をピペット７６内に吸引する薬液吸引動作を行うロボット５１と、を有する。細胞培養装置５０は、薬液注入動作におけるピペット７６の軌跡を、傾斜角度Ｄと、ディッシュ７１に注入される薬液の量と、ピペット７６の吐出口の幅と、傾斜したディッシュ７１の上面視においてディッシュ７１の底面と側面との境界となる円周ｂ上にあって、傾斜したディッシュ７１の側面視において最も低い位置である第１教示点Ｐａと、円周ｂ上にあって、円周ｂと、ディッシュ７１の底面を分割する線分との交点である第２教示点Ｐｂおよび第３教示点Ｐｃと、に基づいて決定する。第１教示点Ｐａは、ディッシュ７１から薬液が吸引されるときのピペット７６の位置であり、第２教示点Ｐｂまたは第３教示点Ｐｃは、薬液注入動作が開始されるときのピペット７６の位置である。

よって、本開示の細胞培養装置は、細胞の継代工程において、培養容器から効率よく細胞を剥離し、回収することができる。

なお、本開示は、上記実施の形態の説明に限定されず、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の変形が可能である。

本開示の細胞培養装置および細胞培養方法では、ピペットから吐出される薬液が培養容器の底面全体に行き渡るように薬液注入動作が行われるので、より多くの細胞を剥離させ、効率よく細胞を回収することができる。よって、多くの培養容器に播種することができるため、バイオ関連の培養工程において、細胞の継代工程に有用である。

５０細胞培養装置
５１ロボット
５２ツールチェンジャ
５３培養容器把持ツール
５４薬液吸引／注入ツール
５５フレーム
５６モータ
５７シリンダ
５８ａ、５８ｂチャック爪
６１フレーム
６２シリンダ
６３ａ、６３ｂチャック爪
６４フレーム
６５シリンダ
６６プランジャー
６７ピストン
７１ディッシュ
７６ピペット
７７薬液保存容器
８１容器揺動部
８２薬液保存部
８３容器入出庫部
８４消耗品供給部
８５廃液部
８６廃棄部

Claims

細胞が培養されている培養容器を所定角度傾斜させる容器揺動部と、
前記培養容器が傾斜した状態において、ピペットを移動させながら前記ピペット内の薬液を前記培養容器に注入する薬液注入動作、および、前記培養容器から前記細胞が含まれた前記薬液を前記ピペット内に吸引する薬液吸引動作を行うロボットと、を有し、
前記薬液注入動作における前記ピペットの軌跡を、
前記所定角度と、
前記培養容器に注入される前記薬液の量と、
前記ピペットの吐出口の幅と、
傾斜した前記培養容器の上面視において前記培養容器の底面と側面との境界となる円周上にあって、傾斜した前記培養容器の側面視において最も低い位置である第１教示点と、
前記円周上にあって、前記円周と、前記培養容器の底面を分割する線分との交点である第２教示点および第３教示点と、に基づいて決定する、
細胞培養装置。
前記薬液注入動作を行う前に、傾斜した前記培養容器の底面を、注入された前記薬液に浸かる浸漬領域と、注入された前記薬液に浸からない非浸漬領域とに分割し、
まず、前記非浸漬領域に対して前記薬液の注入を行い、該薬液が前記浸漬領域に溜まった後、該薬液を前記ピペットに吸引し、
次に、前記浸漬領域に対して前記薬液の注入を行い、該薬液が前記浸漬領域に溜まった後、該薬液を前記ピペットに吸引する、
請求項１に記載の細胞培養装置。
前記非浸漬領域に対する前記薬液の注入を前記第２教示点または前記第３教示点のいずれかから開始し、前記浸漬領域に溜まった前記薬液を前記第１教示点で吸引し、
前記浸漬領域に対する前記薬液の注入を前記第１教示点から開始し、前記浸漬領域に溜まった前記薬液を前記第１教示点で吸引する、
請求項２に記載の細胞培養装置。
前記薬液注入動作における前記ピペットの軌跡は、さらに、
前記円周上にあって、前記第１教示点と前記第２教示点との間の複数の教示点、および、前記円周上にあって、前記第１教示点と前記第３教示点との間の複数の教示点に基づいて決定される、
請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
ピペットを移動させながら前記ピペット内の薬液を細胞が培養されている培養容器に注入する薬液注入動作、および、前記培養容器から前記細胞が含まれた前記薬液を前記ピペット内に吸引する薬液吸引動作を行う装置が行う細胞培養方法であって、
前記薬液注入動作および前記薬液吸引動作を、前記培養容器が所定角度傾斜された状態で行い、
前記薬液注入動作における前記ピペットの軌跡を、
前記所定角度と、
前記培養容器に注入される前記薬液の量と、
前記ピペットの吐出口の幅と、
傾斜した前記培養容器の上面視において前記培養容器の底面と側面との境界となる円周上にあって、傾斜した前記培養容器の側面視において最も低い位置である第１教示点と、
前記円周上にあって、前記円周と、前記培養容器の底面を分割する線分との交点である第２教示点および第３教示点と、に基づいて決定する、
細胞培養方法。