JP5866578B2 - 細胞培養装置および細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養に関する。

一般に、細胞の培養は、培地を用いて行われる。培地とは、多量の栄養物資が含まれる培養液である。培地の使用時間が長くなると、細胞の増殖に伴って生じる乳酸などの影響により、培地のｐＨが低下する。培地のｐＨが低下すると、細胞の培養に適したｐＨ範囲から外れて、細胞の培養が不活性になることがある。そこで、従来の細胞培養装置では、検出した細胞の種類に応じて一定時間間隔で培地の交換を行っている（例えば、特許文献１参照）。

図８に、特許文献１の細胞培養装置１０１を示す。細胞培養装置１０１は、検出手段１０４によって検出された細胞の種類に応じて、培養手段１０５に対して、交換手段１０２による培地の交換、又は添加手段１０３による被験物質の添加が行われる。培地の交換は、一般に、ピペットを用いて人手で行う。

特開２００７−０２４５７６号公報

従来の培地の交換は人手で実施することを前提としている。従って、細胞培養の活用性が高まるにつれて、多数の培養容器において培地の交換が必要となり、培地の交換を人手ですることが困難になる。本発明は、培地の交換を自動化できる細胞培養装置または細胞培養方向を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明における細胞培養装置は、培養容器内の培地を用いて細胞を培養する細胞培養装置であって、第１保持部で保持されたピペットに接続されるポンプと、前記第１保持部を移動させる第１移動部と、前記培養容器を保持する第２保持部と、前記培養容器を把持して移動させる第２移動部と、制御部と、を備え、前記制御部は、前記ピペットが、前記培養容器の液体を吸引、または、前記培養容器へ液体を吐出する時、前記培養容器の蓋を前記第２移動部によって水平方向に平行移動させることで蓋が開いた状態になるように前記第２移動部を制御し、前記制御部は、前記剥離液を前記培養容器内に２回吐出する時、１回目の吐出時と２回目の吐出時とで互いに逆方向に前記培養容器が傾くように前記第２保持部を制御する、ことを特徴とする。

上記目的を達成するために、本発明の細胞培養方法は、第１保持部で保持されたピペットに接続されるポンプと、前記第１保持部を移動させる第１移動部と、培養容器を保持する第２保持部と、前記培養容器を把持して移動させる第２移動部と、制御部と、を備えた細胞培養装置を使用し、前記培養容器内の培地を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、前記第１保持部が前記ピペットを保持し、前記第２移動部が前記培養容器を把持して移動させた後、前記培養容器の蓋が前記第２移動部によって水平方向に平行移動した状態で、前記第１保持部に保持された前記ピペットが前記培養容器の液体を吸引または前記培養容器へ液体を吐出し、剥離液を前記培養容器内に２回吐出する時、前記制御部が１回目の吐出時と２回目の吐出時とで互いに逆方向に前記培養容器が傾くように制御することを特徴とする。

本発明によれば、培地の交換を自動化することが可能な細胞培養装置および細胞培養方法を提供することができる。

図１は、本実施の形態における細胞培養装置の概要を示す図であり、 図２は、本実施の形態における培地交換のフローチャートであり、 図３は、本実施の形態におけるポンプの概要を示す図であり、 図４Ａは、本実施の形態における注液完了時の状態を示す図であり、 図４Ｂは、参考例における注液完了時の状態を示す図であり、 図５Ａは、本実施の形態における１回目の剥離液吐出時の平面概略図であり、 図５Ｂは、本実施の形態における１回目の剥離液吐出時の側面概略図であり、 図５Ｃは、本実施の形態における２回目の剥離液吐出時の平面概略図であり、 図５Ｄは、本実施の形態における２回目の剥離液吐出時の側面概略図であり、 図６は、本実施の形態におけるピペット取外しを説明するための図であり、 図７は、本実施の形態における培養容器の移動時の状態を説明するための図であり、 図８は、従来の細胞培養装置の概略図である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、同じ構成要素には同じ符号を付しており、説明を省略する場合もある。また、図面は、それぞれの構成要素を主体として、模式的に示されている。

（実施の形態）
図１は、本発明の実施の形態における細胞培養装置１の概要を示す図である。本実施の形態の細胞培養装置は、少なくとも、第１保持部３と、ポンプ４と、第１移動部５と、第２保持部１１と、第２移動部１６と、制御部１５とを有する。第１保持部３は、例えばピペット保持部であり、バネ等の弾性部材でピペット２（ピペットチップ）を固定して保持する。第１移動部５は、例えばピペット移動部であり、第１保持部３に保持されたピペット２を移動させる。第２保持部１１は、例えば培養容器保持部であり、複数の培養容器１０を突起により保持する。第２移動部１６は、例えばマニピュレータなどの培養容器移動部であり、培養容器１０を把持して移動させる。制御部１５は、装置内の各構成の動作を制御する。制御部１５による制御は、予め設定された条件、もしくは、タッチパネル等の操作部１３により入力された条件に従って行われる。

ピペット２は、第１保持部３を介してポンプ４と接続されている。ピペット２は、ポンプ４を動力源として、液体の吐出／吸込を行う。第１移動部５は第１保持部３を装置内において移動させる。第１保管部６は、例えば予備ピペット保管部であり、予備のピペット２を保管する。第２保管部７は、例えば廃棄ピペット保管部であり、その中に使用済みのピペット２が廃棄される。チューブ保持部９は、複数のチューブ８を保持する。チューブ８は、各種の液体を保管する容器である。１つのチューブ８には、交換用の培地が保存されており、また、別のチューブ８には、剥離液が保存されている。第２保持部１１は、培養容器１０を保持することができる。タンク１２は、例えば廃液タンクであり、使用済みの培地が廃棄される。第２移動部１６は、培養容器１０を把持して移動させることができる。なお、第２保持部１１は、複数の培養容器１０を保持することが可能である。また、第２保持部１１を回転させることにより、複数の培養容器１０の位置をそれぞれ変更することが可能である。

第１保管部６の鉛直上側には、予備ピペット用蓋である第１蓋６ａが設けられている。チューブ保持部９の鉛直上側には、チューブ用蓋である第３蓋９ａが設けられている。第２保管部７の鉛直上側には、廃棄ピペット用蓋である第２蓋７ａが設けられている。タンク１２の鉛直上側には、タンク用蓋である第４蓋１２ａが設けられている。

第１蓋６ａおよび第３蓋９ａは、周囲の埃や液体等が予備のピペット２またはチューブ８に入るのを防ぐために設けられている。一方、第２蓋７ａおよび第４蓋１２ａは、廃棄されるピペット２内の液体や廃液が周囲に飛び散るのを防ぐために設けられている。培養容器１０は、蓋１０ａを有する。

ピペット２が培養容器１０内の液体（培地や剥離液など）を吸引または培養容器１０へ液体（培地や剥離液など）を吐出する時、培養容器１０の蓋は、第２移動部１６によって一度鉛直上側に持ち上げられた後、水平方向に平行移動することで、開けられる。

さらに、細胞培養装置１は、遠心分離機１４、ヒータ１７、冷蔵庫１８、インキュベータ１９、第３保管部２０を有する。遠心分離機１４は、細胞を含有する培地を遠心分離することで、培地と細胞を分離する。ヒータ１７は、培地を加熱し、冷蔵庫１８はチューブ８等に入れられている培地等の試薬を低温下で保存する。インキュベータ１９は培養容器１０内の細胞を所定の条件下で培養する。第３保管部２０は予備の培養容器１０を保管する。第３保管部２０は、例えば培養容器保管部であり、空の培養容器１０を保管する。

冷蔵庫１８、インキュベータ１９および第３保管部２０は、第２移動部１６が培養容器１０を移動させるのを妨げない位置に配置されている。また、ヒータ１７および遠心分離機１４は、第１保持部３に保持されたピペット２、および、第２移動部１６の先端部が移動可能な位置に配置されている。

次に、本実施の形態の細胞培養装置１による培地を交換する動作について、図２を参照しながら説明する。なお、前述のように、細胞培養装置１の各種動作（図２に示す各フロー）は、制御部１５で制御される。

培地の交換を開始する指令が制御部１５から出されると、図２のステップＳ０１において、まず、第２移動部１６が、インキュベータ１９の扉を開ける。次に、第２移動部１６が、インキュベータ１９に保管されている複数の培養容器１０の中から対象の培養容器１０を取り出す。そして、第２移動部１６は対象の培養容器１０を第２保持部１１の上に移動させ、第２保持部１１で対象の培養容器１０を保持する。その後、インキュベータ１９に内蔵された開閉機構によりインキュベータ１９の扉を閉じる。

なお、本実施の形態では、培養中の細胞が入っている培養容器１０がインキュベータ１９内に保管されている例について説明したが、必要に応じて別の保管部（例えば、第３保管部２０など）から培養容器１０を取り出しても良い。

次に、ステップＳ０２において、第１移動部５は、第１保持部３を第１保管部６の上方に移動させる。そして、第１蓋６ａが開けられ、第１保持部３が、第１保管部６に保管されている複数のピペット２のうち１本目のピペット２を保持する。その後、第１保管部６に内蔵された開閉機構により第１蓋６ａは閉じられる。第１保持部３がピペット２に挿入されて固定されることで、第１保持部３はピペット２を保持する。

次に、ステップＳ０３において、第１移動部５は、第１保持部３を第２保持部１１の上方に移動させる。そして、第２移動部１６は、吸引または吐出の直前に、培養容器１０の蓋１０ａを水平方向に平行移動させる。蓋１０ａが水平方向に平行移動することで蓋１０ａが開いた状態で、ポンプ４を動力源とした吸引動作により、１本目のピペット２が培養容器１０内の交換前の培地を吸引する。その後、培養容器１０の蓋１０ａは、第１移動部５により元の位置に戻される。このように蓋１０ａを完全に開けずに吸引または吐出を行うことで、培養容器１０内の培地へ、埃などが混入する可能性を軽減できる。本実施の形態では、蓋１０ａを水平方向に平行移動させることで、蓋１０ａの内側に埃などが混入する可能性を軽減できる。

次に、ステップＳ０４において、第１移動部５は、第１保持部３をタンク１２の上方に移動させる。そして、タンク１２に内蔵された開閉機構により第４蓋１２ａは開けられた状態で、１本目のピペット２に吸引されていた交換前の培地が、ポンプ４を動力源とした吐出動作によりタンク１２に吐出され、廃棄される。その後、前述の開閉機構により第４蓋１２ａは閉じられる。

次に、ステップＳ０５において、第１移動部５は、第１保持部３を第２保管部７の上方に移動させる。そして、第２保管部７に内蔵された開閉機構により第２蓋７ａは開けられ、使用済みの１本目のピペット２は第２保管部７に廃棄される。その後、前述の開閉機構により第２蓋７ａは閉められる。ピペット２の廃棄動作は、次の通りである。ピペット２が第２保管部７のアクチュエータ７ｂ（図６に図示する）に把持された状態で、第１保持部３を左右に動かすと、ピペット２に回転モーメントが発生する。この回転モーメントを利用して第１保持部３からピペット２は取り外されて、第２保管部７に廃棄される。なお、ピペット２の取り外し方の詳細については、図６を参照しながら後述する。

次に、ステップＳ０６において、ステップＳ０２と同様の手順で、第１保持部３に２本目のピペット２を挿入して保持する。

次に、ステップＳ０７において、第１移動部５は、第１保持部３をチューブ保持部９の上方に移動させる。そして、チューブ保持部９に内蔵された開閉機構により第３蓋９ａが開けられ、ポンプ４を動力源とした吸引動作により、２本目のピペット２がチューブ８内の細胞の剥離液を吸引する。その後、前述の開閉機構により第３蓋９ａが閉じられる。細胞の剥離液は、培養容器１０上に付着した細胞を剥離するための液体である。細胞の剥離液には、例えば、トリプシンが用いられる。

次に、ステップＳ０８において、第１移動部５は、第１保持部３を第２保持部１１の上方に移動させる。そして、第２移動部１６は培養容器１０の蓋１０ａを水平方向に平行移動させる。蓋１０ａが平行移動した状態で、ポンプ４を動力源とした吐出動作により、２本目のピペット２が培養容器１０内に剥離液を吐出する。その後、培養容器１０の蓋１０ａは元に戻される。

次に、ステップＳ０９において、第２保持部１６に内蔵された揺動機構により培養容器１０を揺動し、培養容器１０から細胞を剥離する。

次に、ステップＳ１０において、第１移動部５は、第１保持部３を第２保管部７の上方に移動させる。そして、第２保管部７に内蔵された開閉機構により第２蓋７ａが開けられ、使用済みの２本目のピペット２は第２保管部７に廃棄される。その後、前述の開閉機構により第２蓋７ａは閉められる。

次に、ステップＳ１１において、ステップＳ０２と同様の手順で、第１保持部３が３本目のピペット２を保持する。

次に、ステップＳ１２において、第１移動部５は、第１保持部３をチューブ保持部９の上方に移動させる。そして、チューブ保持部９に内蔵された開閉機構により第３蓋９ａは開けられる。そして、ポンプ４を動力源とした吸引動作により、３本目のピペット２がチューブ８内の交換後の培地（新しい培地）を吸引する。その後、前述の開閉機構により第３蓋９ａが閉じられる。

次に、ステップＳ１３において、第１移動部５は、第１保持部３を第２保持部１１の上方に移動させる。そして、第２移動部１６は培養容器１０の蓋１０ａを水平方向に平行移動させる。蓋１０ａが平行移動した状態（蓋１０ａが開けられた状態）で、ポンプ４を動力源とした吐出動作により、ピペット２が培養容器１０内に交換後の培地（新しい培地）を吐出する。その後、第２移動部１６により培養容器１０の蓋１０ａは元に戻される。

なお、吐出動作中にピペット２を振動させると、培地の液切れが促進されることで液滴の発生が抑制され、より好ましい。

次に、ステップＳ１４において、第１移動部５は、第１保持部３を第２保管部７の上方に移動させる。そして、第２保管部７に内蔵された開閉機構により第２蓋７ａが開けられ、使用済みの３本目のピペット２は第２保管部７に廃棄される。その後、前述の開閉機構により第２蓋７ａは閉められる。

次に、ステップＳ１５において、インキュベータ１９に内蔵された開閉機構によりインキュベータ１９の扉が開けられた後に、第２移動部１６は、インキュベータ１９の中に培養容器１０を移動させて収納する。その後、前述の開閉機構によりインキュベータ１９の扉は閉じられる。

本実施の形態の細胞培養装置１においては、制御部１５による制御により、図２を参照しながら上述した各フローによって、培地が交換される。

なお、ステップＳ０１の後、ステップＳ０３の後、及びステップＳ１３の後の少なくともいずれかのタイミングで、培養容器１０内をカメラで撮像して観察することが好ましい。これらのタイミングで観察すると、交換前後の培地の量、及び、剥離液の種類や量を、観察結果に応じて調整することが可能となる。よって、細胞の培養の精度をより高くできる。

次に、本実施の形態の細胞培養装置１の各構成の一部、及び、図２に示す各フローの一部について、詳しく説明する。

図３を参照しながら、本実施の形態の細胞培養装置１のポンプ４について説明する。図３に示すように、本実施の形態のポンプ４は、例えばシリンジポンプであり、三方弁４ａ、シリンジ４ｂ、及び流路４ｃにより構成される。例えば、容量が２５ｍｌのシリンジ４ｂの原点位置は、０ｍｌの位置ではなく、５ｍｌの位置に設定している。原点位置を、図３にＸで示す。すなわち、本実施の形態では、シリンジ４ｂのプランジャ４ｄの原点位置は、吐出限界位置より、所定量だけ吸引方向にシフトした位置に設定されている。これは、吐出時に、ピペット２より液体を完全に吐出させるために、原点位置を超えて吐出方向へプランジャ４ｄを移動させることが好ましいためである。原点位置の設定は、制御部１５がポンプ４を制御することによって行っている。つまり、制御部１５は、ポンプ４の原点位置が吐出限界位置より吸引方向にシフトした位置に設定されるように、ポンプ４を制御する。

なお、シリンジ４ｂとピペット２とは、三方弁４ａを介して流路４ｃで配管されている。三方弁４ａを解放側（ピペット２側）に切り替えることで、シリンジ４ｂは原点位置に復帰する。本実施の形態では、ピペット２が液体（培地又は剥離液）を吸引する時は、ピペット２をチューブ８内に挿入した状態で、三方弁４ａが開放側に一旦切り替えられる。そして、ポンプ４が空気を吸引する。その後、三方弁４ａを開放側（ピペット２側）に切り替えてプランジャ４ｄを原点位置に戻した後に、チューブ８内の液体（培地又は剥離液）を吸引する。ピペット２の先端に液体（培地又は剥離液）が残留するとピペット２の先端に内膜が形成されるため、これらの動作は、内膜が形成されるのを防ぐ目的で行われる。

次に、図４Ａおよび図４Ｂを参照しながら、図２のステップＳ１３の吐出動作について詳しく説明する。本実施の形態では、図４Ａに示すように、液体（培地）の吐出は、ピペット２の先端が培地の液面に位置する状態で完了する。すなわち、液体の吐出の完了時、ピペット２の先端は、液体（培地）の液面に位置している。ピペット２の先端の位置は、制御部１５が第１移動部５を制御することで制御されている。ピペット２の先端の位置を培地の液面に位置させることにより、図４Ｂの参考例に示すように、液滴や培地内の泡の発生を抑制できる。

次に、図５Ａ〜図５Ｄを参照しながら、図２のステップＳ０８の吐出動作について詳しく説明する。本実施の形態では、剥離液の吐出を２回行うと共に、１回目の吐出時と２回目の吐出時で培養容器１０を互いに逆方向に傾けて、吐出開始時点は、鉛直上側の培養容器１０の内壁面に対して剥離液を吐出する。このように、培養容器の鉛直上側の内壁面を吐出の開始位置とすることで、吐出開始時に、いきなり細胞へ剥離液が吐出される可能性が低くなり、細胞へのダメージを低下することができる。

さらに、上述した通り、図５Ｂ、図５Ｄに示すように、１回目の吐出時（図５Ｂに示す）と２回目の吐出時（図５Ｄに示す）とでは、培養容器１０は逆方向に傾けられる。この培養容器１０の状態で、ピペット２は、培養容器１０の傾斜面の高い位置から低い位置に向かって動きながら、剥離液を吐出する。

このようなピペット２の動作によって、剥離液を培養容器１０内に流すことで、培養容器１０内の細胞へのダメージは抑えられる。

次に、図６を参照しながら、図２のステップＳ０５、Ｓ１０、Ｓ１４のピペット２の取外し動作について詳しく説明する。第１保持部３に保持されたピペット２が取り外される時、ピペット２は、第２保管部７に設けられているドーナツ状のアクチュエータ７ｂに把持される。その後、第１保持部３は、所定量だけ上方に引き上げられながら、ピペット２の軸に直交する方向（左右方向）に搖動する。このようにして、第１保持部３が上方に引き上げながら左右に動かされることで、ピペット２は、例えば瓶の蓋が取り外されるように取り外される。第１保持部３を左右に動かさずにピペット２を取り外す場合、ピペット２を取り外す力は、ピペット２を取付ける時よりも、大きな力が必要となる。また、この場合、ピペット２が抜けたときの衝撃で各種構造体の取り付け状態が、ずれる可能性がある。それに対し、本実施の形態の上述した方法では、ピペット２をスムーズに取り外すことができる。制御部１５は、第１保持部３からピペット２が取り外される時、第１保持部３が上方に移動しながら左右に動くように、第１移動部５を制御している。

更に、図７を参照しながら、第２移動部１６が培養容器１０を移動させる動作について詳しく説明する。第２保持部１１に対して培養容器１０が相対移動する場合、移動による反作用や慣性により、培養容器１０内の培地や細胞には一定方向の力がかかる。よって、この場合は、培養容器１０内の細胞が偏る可能性がある。そこで本実施の形態では、細胞が偏るのを防ぐために、図７に示すように、第２移動部１６は、培養容器１０を回転させながら移動させている。すなわち、本実施の形態では、培養容器１０の移動時に、移動軌跡に応じて培養容器１０の位相姿勢を動的に変化させている。制御部１５は、培養容器１０が第２保持部に対して相対的に移動し、かつ、培養容器１０が回転しながら移動するように、第２移動部１６を制御している。

好ましくは、第２移動部１６は、培養容器１０を、回転させるだけではなく、鉛直下方に向かって移動させる。下方に向かって培養容器１０を移動させることにより、さらに、細胞の偏りが発生する可能性を減少させることができると考えられる。制御部１５は、培養容器１０が第２保持部１１に対して相対的に移動する時、培養容器１０が、回転しながら移動し、かつ、鉛直下方に向かって移動するように、第２移動部１６を制御している。

本発明の細胞培養装置は、再生医療や創薬分野における細胞の培養において有用である。

１ 細胞培養装置
２ ピペット
３ 第１保持部
４ ポンプ
４ａ 三方弁
４ｂ シリンジ
４ｃ 流路
４ｄ プランジャ
５ 第１移動部
６ 第１保管部
６ａ 第１蓋
７ 第２保管部
７ａ 第２蓋
７ｂ アクチュエータ
８ チューブ
９ チューブ保持部
９ａ 第３蓋
１０ 培養容器
１０ａ 蓋
１１ 第２保持部
１２ タンク
１２ａ 第４蓋
１３ 操作部
１４ 遠心分離機
１５ 制御部
１６ 第２移動部
１７ ヒータ
１８ 冷蔵庫
１９ インキュベータ
２０ 第３保管部

Claims (9)

1. 培養容器内の培地を用いて細胞を培養する細胞培養装置であって、
   第１保持部で保持されたピペットに接続されるポンプと、
   前記第１保持部を移動させる第１移動部と、
   前記培養容器を保持する第２保持部と、
   前記培養容器を把持して移動させる第２移動部と、
   制御部と、を備え、
   前記制御部は、前記ピペットが、前記培養容器の液体を吸引、または、前記培養容器へ液体を吐出する時、前記培養容器の蓋を前記第２移動部によって水平方向に平行移動させることで蓋が開いた状態になるように前記第２移動部を制御し、
   前記制御部は、剥離液を前記培養容器内に２回吐出する時、１回目の吐出時と２回目の吐出時とで互いに逆方向に前記培養容器が傾くように前記第２保持部を制御する、
   細胞培養装置。
2. 前記制御部は、前記ピペットからの吐出開始時において前記培養容器の鉛直上側の内壁面を吐出の開始位置とするとともに、前記ピペットの先端が対向する位置が前記培養容器の傾斜面の高い位置から低い位置に向かって動くように、前記第１移動部を制御する、
   請求項１に記載の細胞培養装置。
3. 前記制御部は、前記培養容器が前記第２保持部に対して相対的に移動し、かつ、前記培養容器が回転しながら移動するように、前記第２移動部を制御する、
   請求項１または２に記載の細胞培養装置。
4. 前記制御部は、前記培養容器が前記第２保持部に対して相対的に移動する時、前記培養容器鉛直下方に向かって移動するように、前記第２移動部を制御する、
   請求項３に記載の細胞培養装置。
5. 前記制御部は、前記培養容器に対する前記液体の吐出が完了する時、前記ピペットの先端が前記培養容器内の培地の液面に位置するように、前記第１移動部を制御する、
   請求項１から４いずれか１項に記載の細胞培養装置。
6. 前記制御部は、前記第１保持部から前記ピペットが取り外される時、前記第１保持部が前記ピペットに対して相対的に上方に移動しながら左右に動くように、前記第１移動部を制御する、
   請求項１から５いずれか１項に記載の細胞培養装置。
7. 前記制御部は、前記ポンプの原点位置が吐出限界位置より吸引方向にシフトした位置に
   設定されるように、前記ポンプを制御する、
   請求項１から６いずれか１項に記載の細胞培養装置。
8. 予備ピペットを保管する第１保管部と、培地が入ったチューブを保持するチューブ保持
   部と、培地を廃棄するためのタンクと、廃棄ピペットを保管する第２保管部とを、さらに備え、
   前記第１保管部、前記チューブ保持部、前記タンク、及び、前記第２保管部は、それぞれ蓋を備える、
   請求項１から７いずれか１項に記載の細胞培養装置。
9. 第１保持部で保持されたピペットに接続されるポンプと、
   前記第１保持部を移動させる第１移動部と、
   培養容器を保持する第２保持部と、
   前記培養容器を把持して移動させる第２移動部と、
   制御部と、を備えた細胞培養装置を使用し、
   前記培養容器内の培地を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、
   前記第１保持部が前記ピペットを保持し、
   前記第２移動部が前記培養容器を把持して移動させた後、
   前記培養容器の蓋が前記第２移動部によって水平方向に平行移動した状態で、前記第１保持部に保持された前記ピペットが前記培養容器の液体を吸引または前記培養容器へ液体を吐出し、
   剥離液を前記培養容器内に２回吐出する時、前記制御部が１回目の吐出時と２回目の吐出時とで互いに逆方向に前記培養容器が傾くように制御する、
   細胞培養方法。

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