JP2021107827A - 試料中のセロトニンを測定するための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年3月3日に出願された米国仮出願番号第62/127,590号に基づく利益を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
本発明は、試料中のセロトニンの測定によってヘパリン起因性自己抗体を間接的に測定するための方法およびシステムに関する。ある特定の実施形態では、本発明は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法を使用して、ヘパリン起因性血小板減少症(HIT)を有することが疑われる患者からの検体で感作させた、ドナーの血小板から放出されたセロトニンまたは安定な標識されたセロトニンを測定するための方法およびシステムを提供する。
ヘパリン起因性血小板減少症(HIT)は、ヘパリンまたはその他のポリアニオンと複合体形成した血小板第4因子(PF4)に対する免疫化によって引き起こされた、ヘパリン療法の潜在的に重篤な抗体媒介性合併症である。HIT抗体は、血小板表面のPF4/ヘパリン複合体に結合し、その結果、血小板が活性化して、生命を脅かす血栓症を伴う可能性がある、血小板数の減少をもたらす。この血栓形成促進性障害は、虚血性四肢壊死、肺塞栓症、心筋梗塞、および卒中を含む、壊滅的な血栓塞栓性合併症をもたらす可能性がある。
本明細書では、試料中のセロトニンの測定によってヘパリン起因性抗体を間接的に測定するための方法およびシステムが記載される。
本発明の特定の態様では例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ;
前記ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間にわたってインキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、前記クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、前記試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップ
を含む方法。
(項目2)
前記生体試料が、血清試料または血漿試料である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記生体試料が、ヘパリンで処置した対象から得られる、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記生体試料が、ヘパリン起因性血小板減少症を有することが疑われる対象から得られる、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記ドナー血小板が、少なくとも1名の健康と推定される対象から得られる、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記試料中の前記ドナー血小板が、洗浄され、部分的に精製される、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記インキュベートするステップが、室温で行われる、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記インキュベートするステップが、少なくとも30分間行われる、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記提供するステップにおける前記ヘパリンが、0.001から1U/mLの量で存在する、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記提供するステップにおける前記ヘパリンが、50から1000U/mLの量で存在する、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記クロマトグラフィーで分離するステップの前に、前記インキュベートされた試料を内部標準と接触させるステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記内部標準が、安定な同位体で標識された形のセロトニンである、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記安定な同位体で標識された形のセロトニンが、重水素標識セロトニン、炭素13標識セロトニン、窒素15標識セロトニン、酸素18標識セロトニン、またはこれらの組合せを含む、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記内部標準がセロトニンd4である、項目11に記載の方法。
(項目15)
前記提供するステップにおける前記ドナー血小板が、前記提供するステップの前にセロトニンと共にインキュベートされた、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記提供するステップにおける前記ドナー血小板が、前記提供するステップの前に、重水素標識セロトニン、炭素13標識セロトニン、窒素15標識セロトニン、酸素18標識セロトニン、またはこれらの組合せと共にインキュベートされた、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記クロマトグラフィーで分離するステップの前に、前記インキュベートされた試料を部分的に精製するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目18)
前記部分的に精製するステップが、前記インキュベートされた試料を遠心分離することを含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
液体クロマトグラフィーを使用することが、分析液体クロマトグラフィーを使用することを含む、項目1に記載の方法。
(項目20)
分析液体クロマトグラフィーを使用することが、逆相カラムを使用することを含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
液体クロマトグラフィーを使用することが、少なくとも1つのカラムを使用することを含む、項目1に記載の方法。
(項目22)
液体クロマトグラフィーを使用することが、平行な2つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムを使用することを含み、前記2つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムが単一の質量分析計にインライン接続されている、項目1に記載の方法。
(項目23)
平行な2つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムを使用することが、前記インキュベートされた試料を、前記2つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムに時間をずらして導入することを含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記分析するステップが、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、および大気圧光イオン化からなる群から選択されるイオン化技法を使用して、セロトニンをイオン化することを含む、項目1に記載の方法。
(項目25)
前記分析するステップが、四重極質量分析計を使用してセロトニンを検出することを含む、項目1に記載の方法。
(項目26)
前記四重極質量分析計が、三連四重極質量分析計である、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記分析するステップが、第1の四重極中のインタクトなセロトニンイオンを検出すること;第2の四重極中のインタクトなセロトニンイオンを断片化することであって、1つまたは複数のセロトニン断片イオンをもたらすこと;および第3の四重極中の1つまたは複数のセロトニン断片イオンを検出することを含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記分析するステップが、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンをイオン化することであって、160.1±0.5の前駆体イオン、または115.1±0.5、132.1±0.5、105.1±0.5、もしくは89.1±0.5のプロダクトイオンの少なくとも1つを含む質量/電荷比を有する1つまたは複数のセロトニンイオンを生成することを含む、項目1に記載の方法。
(項目29)
試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ヘパリン、およびセロトニンとインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ;
前記血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップ
を含む方法。
(項目30)
試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ヘパリン、および安定な同位体で標識されたセロトニンとインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ;
前記血小板から安定な同位体で標識されたセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中の安定な同位体で標識されたセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離された安定な同位体で標識されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能な同位体で標識されたセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するステップ
を含む方法。
(項目31)
前記提供するステップの前の前記安定な同位体で標識されたセロトニンが、重水素標識セロトニン、炭素13標識セロトニン、窒素15標識セロトニン、酸素18標識セロトニン、またはこれらの組合せである、項目30に記載の方法。
(項目32)
異常な血小板活性化に関連した疾患または状態を診断するために有用な報告を作成する方法であって、
(a)生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ;
(b)前記ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
(c)液体クロマトグラフィーを使用して、前記インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;
(d)質量分析法によって、前記クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、前記ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出されたセロトニンの量を決定するステップ;および
(e)前記試料中のセロトニンの放出パーセンテージを述べた報告を作成するステップ
を含む方法。
(項目33)
前記疾患または状態が、ヘパリン起因性血小板減少症である、項目32に記載の方法。(項目34)
試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステムであって、
(a)生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション;
(b)前記ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション;
(c)液体クロマトグラフィーを使用して、前記インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション;および
(d)質量分析法によって、前記クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、前記ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーション
を含むシステム。
以下の記載は、本発明の様々な態様および実施形態を述べたものである。本発明の範囲を限定しようとする特定の実施形態はない。むしろ実施形態は、本発明の範囲内に少なくとも含まれる非限定的な例の様々な方法およびシステムを単に提供するものである。この記載は、当業者の観点から読み取られ、したがって当業者に周知の情報は必ずしも含まれない。
HPLC=高速液体クロマトグラフィー
LOQ=定量限界
LLOQ=定量下限
ELISA=酵素結合免疫測定法
ESI=エレクトロスプレーイオン化
ULOQ=定量上限
(LC)−MS/MS=液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法
下記の用語は、他に指示しない限り、以下の意味を有すると理解すべきである。
少なくとも1つの態様では、本発明は、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法を提供する。
これらの方法は、生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を、提供することを含む。この文脈において、「提供する」という用語は広く解釈される。この用語は、生体試料を提供する対象を排他的に指すものではない。例えば、現場から離れた臨床実験室の技術者は、例えば、試料がクロマトグラフィーによる精製のために調製されるとき、試料を「提供する」と言える。
本方法は、ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、インキュベートするステップは、室温で行われる。インキュベートするステップは、少なくとも30分間(例えば、少なくとも40分、少なくとも45分、少なくとも50分、少なくとも55分、または少なくとも60分)行うことができる。インキュベートするステップは、追加として、セロトニンの放出が容易になるように機械的動作を適用することを含むことができる。そのような機械的動作は、撹拌、振動、および振盪などを含むことができる。一部の実施形態では、インキュベートするステップは、セロトニンの放出反応を終わりにするために、試料に試薬を添加することをさらに含むことができる。反応を終わらせる試薬は、本明細書では、「停止試薬」と呼ぶことができる。一部の実施形態では、停止試薬は、カルシウム(Ca2+)などの2価のイオンを結合するキレート剤を含む。例えば、停止試薬はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むことができる。
本方法は、液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離することを含んでいてもよい。本発明は、液体クロマトグラフィーを行う任意の特定の手法に限定されない。一般に、クロマトグラフ分離ステップは、少なくとも1つの液体クロマトグラフィー(LC)カラムを使用することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、2つもしくはそれ超、または3つもしくはそれ超、または4つもしくはそれ超のLCカラムなど、多数のLCカラムを使用する。一部のそのような実施形態では、2、3、4、5、6、8、または10個のLCカラムが使用される。一部のそのような実施形態では、これらのLCカラムの2つまたはそれ超が互いに平行に配置構成され、同じ質量分析計にインライン接続される。
本方法は、質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析することにより、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、放出されたセロトニンの存在または量を決定することを含む。一部の実施形態では、LCカラムの2つまたはそれ超が、同じ質量分析計に流れ込む。一部のさらなる実施形態では、LCカラムの3つまたはそれ超が同じ質量分析計に流れ込む。一部の実施形態では、質量分析計が、合わせたLC−MSシステムの部分である。
別の態様では、本発明は、異常な血小板活性化に関連した疾患または状態を診断するのに有用な報告を作成する方法であって、(a)生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ;(b)ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ;(c)液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;(d)質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、試料中の放出されたセロトニンの量を決定するステップ;および(e)試料中のセロトニンの放出パーセンテージを述べた報告を作成するステッップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステムであって、(a)生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション;(b)ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション;(c)液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション;および(d)質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーションを含むシステムを提供する。
非限定的な実施形態は、下記を含む:
1.試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ;
ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法。
生体試料、ヘパリン、およびセロトニンと共にインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ;
血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法。
生体試料、ヘパリン、および安定な同位体で標識されたセロトニンと共にインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ;
血小板から安定な同位体で標識されたセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中の安定な同位体で標識されたセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離された安定な同位体で標識されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能な同位体標識セロトニンの総量に対する、試料中の放出された、安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法。
(a)生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ;
(b)ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
(c)液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;
(d)質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離したセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの量を決定するステップ;および
(e)試料中のセロトニンの放出パーセンテージを述べた報告を作成するステップを含む方法。
(a)生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション;
(b)ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション;
(c)液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション;および
(d)質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーションを含むシステム。
ヘパリン起因性血小板減少症(HIT)の診断で使用されるセロトニン放出アッセイ(SRA)
セロトニンを、同位体希釈およびクロマトグラフ分離の後に、質量分析検出によって測定した。セロトニンに関する安定標識同位体を、内部標準として試料アリコートに添加した。沈殿溶液中の内部標準を試料アリコートに添加した後、試料を混合し、遠心分離し、酢酸エチルでさらに希釈し、次いでLC−MS/MSシステムに注入した。陽イオンエレクトロスプレーイオン化モードで動作するMDS−Sciex API5500三連四重極質量分析計を、検出用に使用した。分析物および内部標準の定量を、選択反応モニタリングモード(SRM)で行った。各試料中のセロトニンの逆算量は、公知の量の精製済みセロトニンを、1〜1000ng/mLのブランクの活性炭処理血清にスパイクすることによって作成した較正曲線から決定した。セロトニン放出パーセントを、血小板中の総セロトニンと、患者血清およびドナー血小板の存在下でのセロトニン放出とを使用して計算した。
推奨される試料は、0.5mL〜1.0mLの血清または血漿であった。血漿を、クエン酸デキストロース(ACD)を含有するチューブを使用して、成人または小児のヒトドナーから収集した。血清を、標準サンプリングチューブを使用して、成人または小児のヒト患者から収集した。
下記の備品および機器を使用した:チップを備えたマニュアルピペットまたは有効自動化ピペット分取システム;クラスA容量ピペットおよびフラスコ;アソートガラス試薬ボトル;ボルテックスミキサー(VWR;Radnor、PA);マイクロプレートローターまたは均等物を備えた5804−R遠心分離(Eppendorf;Hamburg、ドイツ);穿孔容易なヒートシール箔(Fisher Healthcare;Waltham、MA);サーモマニュアルヒートシーラーALPS25または均等物(Thermo Scientific;Waltham、MA);96ウェルポリプロピレンディープウェルプレート(Phenomenex;Torrance、CA);API 5000タンデム質量分析計およびTurbo V(商標)イオン源、エレクトロスプレー付き(Sciex;Toronto、カナダ);8 1200SLシリーズ二元ポンプおよび4 1200シリーズ真空脱気装置からなるAria Transcend TX4システム(Thermo−Fisher;Waltham、MA);HTSツインPALシステムオートサンプラー(CTC Analytics AG、スイス);アナリストバージョン1.4またはそれ超(Applied Biosystems;Foster City、CA);Aria OSバージョン1.6またはそれ超(Thermo−Fisher;Waltham、MA);Ascentis Express HILICカラム、3cm×3.0mm、2.7μm(Sigma−Aldrich;St.Louis、MO);ヒートプレート(Fisher Scientific);ガラスPasteurピペット(Fisher Scientific;Waltham、MA);ポリスチレンマイクロタイタープレート(Thermo Scientific;Waltham、MA);タイタープレートシェーカー(Thermo Scientific;Waltham、MA);Big Shot IIハイブリダイゼーション炉(Boekel;Feasterville、PA);pH計(Metler Toledo;Columbus、OH);ならびに超音波処理機(Gen−Probe;San Diego、CA)。
下記の試薬を使用した:D4−セロトニン(CDN Isotopes;Quebec、カナダ);セロトニン塩酸塩(Sigma;St.Louis、MO);水酸化ナトリウム10N(Fisher Scientific;Waltham、MA);塩酸(Fisher Scientific;Waltham、MA);CSS Mass Spec Gold(Golden West Biologicals;Temecula、CA);アルファー−D−グルコース(Aldrich;St.Louis、MO);塩化カルシウム(Sigma;St.Louis、MO);塩化マグネシウム(Sigma;St.Louis、MO);塩化ナトリウム(Sigma;St.Louis、MO);HEPES(Sigma;St.Louis、MO);リン酸ナトリウム(モノ)(Sigma;St.Louis、MO);塩化カリウム(Sigma;St.Louis、MO);アピラーゼ(Sigma;St.Louis、MO);クエン酸デキストロース溶液(Sigma;St.Louis、MO);ヘパリンナトリウム塩(Sigma;St.Louis、MO);Optima Water HPLCグレード(Fisher Scientific;Waltham、MA);ギ酸、>95%(Sigma−Aldrich;St.Louis、MO);アセトニトリル、HPLCグレード(Fisher Scientific;Waltham、MA);メタノール、HPLCグレード(Fisher Scientific;Waltham、MA);酢酸エチル(Fisher Scientific;Waltham、MA);エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(Fisher Scientific;Waltham、MA);およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Sigma;St.Louis、MO)。
(秤量した量)×(U/mgの数(C of A))=単位の合計数
(単位の合計数)/1050IU/mL=XmLのOptima水
較正物質を、メタノールにセロトニン(1mg/mL)を溶かしたストック溶液から調製した。下記の濃度(単位ng/mL):活性炭処理血清中、1、2、10、25、100、250、および500を有する標準物質を調製した。標準物質を、−70℃で保存した場合、栓をしたチューブ内で最長1年保存した。
分析QC:活性炭処理血清およびプール血清を、品質対照調製の前にスクリーニングした。全てのQCの、サブアリコートを計量し、−70℃で保存した。QC1(約3ng/mL)を調製するために、上部ストック3 60μLをフラスコにピペット分取し、溶液を、活性炭処理血清(CSS)を使用して100mLの最終体積にした。QC2(約200〜400ng/mL)を調製するために、上部ストック4 100μLをフラスコにピペット分取し、溶液を、活性炭処理血清(CSS)を使用して100mLの最終体積にした。
(ドナースクリーニングのための血小板洗浄プロトコール)
血小板を、ドナースクリーニングのための下記のプロトコールに従い洗浄した:血液をドナーからACDチューブに引き出し、チューブを反転させて内容物を混合した(8〜10mlの血小板 プレート当たり約4チューブ)。チューブを1200rpmで10分間遠心分離した。血小板リッチの血漿(PRP)を、小型ピペットバルブを備えたガラスパスツールピペットを使用して取り出した。追加のACD(111μL)を、血漿mLごとに添加した。チューブを反転させて内容物を混合した。16×100ポリプロピレンチューブを使用して、プレートQC用のPRPチューブを合わせた。PRPを2400rpmで15分間遠心分離し、ラインをチューブの外に引き出して、血漿の液体レベルを示した。血小板に乏しい血漿を注ぎ出し、廃棄した。血小板ペレットを、チューブに予め引き出されたラインに洗浄緩衝液1を添加することにより、SRA洗浄緩衝液1に再懸濁した(室温で)。血小板ペレットを再懸濁するために、内容物を、使い捨てピペットを使用して穏やかに吸引し吐出させた。再懸濁した血小板を、37℃で15分間インキュベートし、チューブを2400rpmで15分間遠心分離した。得られた上澄みを注ぎ出し、廃棄した。血小板ペレットを、チューブ上に予め引き出されたラインに洗浄緩衝液を添加することによって、SRA洗浄緩衝液2に再懸濁した。チューブを反転させ、使い捨てのピペットを使用して穏やかに吸引し、吐出させて、血小板ペレットを再懸濁した。チューブを45分間、37℃でインキュベートした。血小板懸濁液を検査して、凝塊または凝集物の形成がないことを確認した。
予めスクリーニングした試料(2陰性および3陽性)(250μL)を、清浄なチューブ内に置き、チューブに栓をした。同じステップを、生体QC(陰性および高(High))に関して行った。試料体積250μLが、プレート当たりのものであった(例えば、2つのプレートは、患者試料500μLを必要とした)。チューブを56℃で30分間インキュベートし、3600rpmで10分間回転させた。
(患者試料に関する血小板洗浄プロトコール)
血小板を、ドナースクリーニングのための下記のプロトコールに従って洗浄した:血液を、ドナーからACDチューブに引き出し、チューブを反転させて内容物を混合した(8〜10mlの血小板 プレート当たり約4チューブ)。チューブを1200rpmで10分間遠心分離した。血小板リッチの血漿(PRP)を、小型ピペットバルブを備えたガラスパスツールピペットを使用して取り出した。追加のACD(111μL)を、血漿mLごとに添加した。チューブを反転させて、内容物を混合した。16×100ポリプロピレンチューブを使用して、PRPチューブを、ACDを添加した後に合わせた。PRPを2400rpmで15分間遠心分離し、ラインをチューブの外に引き出して、血漿の液体レベルを示した。血小板に乏しい血漿を注ぎ出し、廃棄した。血小板ペレットを、チューブに予め引き出されたラインに洗浄緩衝液1をラインに添加することによって、SRA洗浄緩衝液1に再懸濁した(室温で)。血小板ペレットを再懸濁するため、内容物を、反転および吸引することによって穏やかに混合した。再懸濁した血小板を、15分間37℃でインキュベートし、チューブを2400rpmで15分間遠心分離した。得られた上澄みを注ぎ出し、廃棄した。血小板ペレットを、チューブに予め引き出されたラインに洗浄緩衝液を添加することにより、SRA洗浄緩衝液2に再懸濁した。チューブを反転させ、穏やかに吸引し、吐出して、血小板ペレットを再懸濁した。チューブを、45分間、37℃でインキュベートした。血小板懸濁液を検査して、凝塊または凝集物の形成がないことを確かめた。血小板溶液は、2時間にわたりそのままの状態で、室温で安定であった。
患者血清(200μL)を得、清浄なチューブに入れた。チューブに栓をした。同じステップを、QC試料に行った。チューブを56℃で30分間インキュベートし、10分間、3600rpmで回転させた。
血小板溶液のチューブを、チューブを反転させることによって穏やかに混合した。ブランク、較正物質、品質対照、および血小板溶液(それぞれ100μL)を、適切なウェルにピペット分取した。試料(100μL)をマイクロタイタープレートから除去し、96ディープウェルプレートに添加した。二重ブランクでは、ブランクマトリックス100μLおよびアセトニトリル300μLを添加した。次いで200ng/mLのセロトニン−d4をアセトニトリルに加えたもの300μLを、添加した。内容物を2500rpmで10分間渦動させ、3700rpmで10分間遠心分離した。次いで内容物(150μL)を、清浄なプレートに移した。酢酸エチル(150μL)を全てのウェルに添加した。プレートを箔で封止し、2500rpmで10秒間渦動させ、3700rpmで15秒間遠心分離した。得られた試料(20μL)を、LC−MS/MS分析のためLC−MS/MSシステムに注入した。
患者試料(200μL)を得、清浄なチューブ内に入れ、チューブに栓をした。同じステップを、生体QC(陰性および高)に関して行った。チューブを56℃で30分間インキュベートし、3600rpmで10分間回転させた。ひと組の測定値を、3つのウェルを使用することによって同じ患者に関して作成した。ひと組のうちの第1および第2のウェルのそれぞれに、低濃度(2.1IU/mL)ヘパリン10μLをピペット分取した。ひと組のうちの第3のウェルのそれぞれに、高濃度(1050IU/mL)ヘパリン10μLをピペット分取した。次いで試料20μLを、各ウェルにピペット分取した。
このアッセイの単位は、放出パーセント(放出%)である。放出パーセントは、血小板中の総セロトニンと、患者血清およびドナー血小板の存在下でのセロトニン放出とを使用して計算する。特に、放出パーセントは、患者試料およびドナー血小板の存在下でのセロトニン放出を、アッセイで使用されたドナー血小板中のセロトニンまたは標識セロトニンの総量で割った比である。
結果を、低用量ヘパリンアッセイ(即ち、低ヘパリン放出パーセントまたは低放出)および高用量ヘパリンアッセイ(即ち、高ヘパリン放出パーセントまたは高放出)に関するセロトニン放出パーセント値に基づいて解釈した。低および高ヘパリン放出パーセントに基づく解釈は、表1における表形式で、および図2のグラフで表示される。
上述のように、低ヘパリン放出パーセントが0〜20%である場合、SRA結果は「陰性」であった。これらの結果はヘパリン起因性血小板減少症(HIT)の診断と相反するが、診断を完全に排除するものではない。結果は、その他のHITアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、先のヘパリン曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて解釈されるべきである。アッセイは、患者の血清およびヘパリンの存在下、ドナー血小板からのセロトニン放出を測定する。陽性結果は、低用量(0.2IU/mL)ヘパリンの存在下での>20%放出と、高用量(100IU/mL)ヘパリンの存在下でのセロトニン放出の阻害を必要とする。
低ヘパリン放出パーセントが21〜30%であり、かつ高ヘパリン放出パーセントが0〜20%である場合、SRA結果は「低陽性」であった。これらの結果は陽性であり、ヘパリン起因性血小板減少症(HIT)の診断を裏付けると考えられるが、それらはカットオフの直上にあり、その他のHITアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、以前のヘパリンの曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて解釈されるべきである。アッセイは、患者の血清およびヘパリンの存在下、ドナー血小板からのセロトニン放出を測定する。低陽性結果は、低用量(0.2IU/mL)ヘパリンの存在下での21〜30放出パーセントと、高用量(100IU/mL)ヘパリンの存在下でのセロトニン放出の阻害とからなる。
低ヘパリン放出パーセントが31〜40%であり、かつ高ヘパリン放出パーセントが0〜20%であった場合、SRA結果は「陽性」である。追加として、低ヘパリン放出パーセントが40%超(即ち、>40%)であり、かつ高ヘパリン放出パーセントが、低ヘパリン放出パーセントに0.5を乗じた値未満またはそれに等しい場合(即ち、≦(低ヘパリン放出パーセント×0.5))、SRA結果は「陽性」であった。患者の血清は、SRAによって陽性と判断され、ヘパリン起因性血小板減少症(HIT)の診断を裏付ける。アッセイは、患者の血清およびヘパリンの存在下、ドナー血小板からのセロトニン放出を測定する。陽性結果は、低用量(0.2IU/mL)ヘパリンの存在下で20%超の放出と、高用量(100IU/mL)ヘパリンの存在下での放出の阻害とを必要とする。結果は、その他のHITアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、以前のヘパリンの曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて解釈されるべきである。
低ヘパリン放出パーセントが21〜40%であり、かつ高ヘパリン放出パーセントが20%超(即ち、>20%)である場合、SRA結果は「未確定」であった。追加として、低ヘパリン放出パーセントが40%超(即ち、>40%)であり、かつ高ヘパリン放出パーセントが、低ヘパリン放出パーセントに0.5を乗じた値よりも大きい場合(即ち、>(低ヘパリン放出パーセント×0.5))、SRA結果は「未確定」であった。アッセイは、患者の血清およびヘパリンの存在下、ドナー血小板からのセロトニン放出を測定する。陽性結果は、低用量(0.2IU/mL)ヘパリンの存在下で20%超の放出と、高用量(100IU/mL)ヘパリンの存在下での放出の阻害とを必要とする。低用量ヘパリンの存在下で20%超のセロトニン放出があったが、この反応は、高用量ヘパリンによって適切に阻害されなかった。これらの結果はヘパリン起因性血小板減少症(HIT)の診断と一致しないが、診断を完全に排除するわけではない。結果は、その他のHITアッセイ、ならびに血小板数、投与されるヘパリンのタイプ、ヘパリン曝露の持続時間、以前のヘパリンの曝露、および任意の血栓症履歴を含む全ての臨床情報の文脈と併せて解釈されるべきである。この反応の複合体は、循環する免疫複合体、高力価HLAクラス1抗体および/またはその他の血小板活性化因子に起因すると考えられる。
陽性HIT決定
生体試料を、実施例1の手順に従い、HITに関して試験した。試料は、生体試料を添加していない本明細書に記載の方法による分析を通して決定された血小板内で利用可能な総セロトニン(100%)に対し、0.2U/mLヘパリンでの27%セロトニン放出と、100U/mLヘパリンでの放出の阻害を示した(図3参照)。図3の左上のパネルに示されるように、生体試料および緩衝液中の内因性セロトニンレベルは、1.2ng/mLである。図3の中上パネルは、生体試料および0.2U/mLヘパリンを示す。約60.4ng/mLのセロトニンを、試料中で測定した。図3の右上のパネルは、生体試料および100U/mLヘパリンを示す。約0.2ng/mLのセロトニンを、試料中で測定した。試料および0.2U/mLヘパリン中のセロトニン放出パーセントは27%であった。生体試料は、HITに関して陽性と決定された。
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- 明細書に記載の発明。
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