JP2018511043A - 試料中のセロトニンを測定するための方法およびシステム - Google Patents
試料中のセロトニンを測定するための方法およびシステム Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2015年3月3日に出願された米国仮出願番号第62/127,590号に基づく利益を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
本発明は、試料中のセロトニンの測定によってヘパリン起因性自己抗体を間接的に測定するための方法およびシステムに関する。ある特定の実施形態では、本発明は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法を使用して、ヘパリン起因性血小板減少症(HIT)を有することが疑われる患者からの検体で感作させた、ドナーの血小板から放出されたセロトニンまたは安定な標識されたセロトニンを測定するための方法およびシステムを提供する。
ヘパリン起因性血小板減少症(HIT)は、ヘパリンまたはその他のポリアニオンと複合体形成した血小板第4因子(PF4)に対する免疫化によって引き起こされた、ヘパリン療法の潜在的に重篤な抗体媒介性合併症である。HIT抗体は、血小板表面のPF4/ヘパリン複合体に結合し、その結果、血小板が活性化して、生命を脅かす血栓症を伴う可能性がある、血小板数の減少をもたらす。この血栓形成促進性障害は、虚血性四肢壊死、肺塞栓症、心筋梗塞、および卒中を含む、壊滅的な血栓塞栓性合併症をもたらす可能性がある。
本明細書では、試料中のセロトニンの測定によってヘパリン起因性抗体を間接的に測定するための方法およびシステムが記載される。
以下の記載は、本発明の様々な態様および実施形態を述べたものである。本発明の範囲を限定しようとする特定の実施形態はない。むしろ実施形態は、本発明の範囲内に少なくとも含まれる非限定的な例の様々な方法およびシステムを単に提供するものである。この記載は、当業者の観点から読み取られ、したがって当業者に周知の情報は必ずしも含まれない。
HPLC=高速液体クロマトグラフィー
LOQ=定量限界
LLOQ=定量下限
ELISA=酵素結合免疫測定法
ESI=エレクトロスプレーイオン化
ULOQ=定量上限
(LC)−MS/MS=液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法
下記の用語は、他に指示しない限り、以下の意味を有すると理解すべきである。
(試料中のセロトニンの存在または量を決定するための方法)
(試料の提供)
(ドナー血小板からのセロトニン放出)
(セロトニンのクロマトグラフ的分離)
(セロトニンの分析)
(報告を作成する方法)
(試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステム)
非限定的な実施形態は、下記を含む:
1.試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ;
ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法。
生体試料、ヘパリン、およびセロトニンと共にインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ;
血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法。
生体試料、ヘパリン、および安定な同位体で標識されたセロトニンと共にインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ;
血小板から安定な同位体で標識されたセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中の安定な同位体で標識されたセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離された安定な同位体で標識されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能な同位体標識セロトニンの総量に対する、試料中の放出された、安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するステップを含む方法。
(a)生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ;
(b)ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
(c)液体クロマトグラフィーを使用するステップであって、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;
(d)質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離したセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの量を決定するステップ;および
(e)試料中のセロトニンの放出パーセンテージを述べた報告を作成するステップを含む方法。
(a)生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション;
(b)ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション;
(c)液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション;および
(d)質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーションを含むシステム。
(実施例1)
ヘパリン起因性血小板減少症(HIT)の診断で使用されるセロトニン放出アッセイ(SRA)
(検体)
(設備および材料)
(試薬)
(秤量した量)×(U/mgの数(C of A))=単位の合計数
(単位の合計数)/1050IU/mL=XmLのOptima水
(較正)
(品質対照(QC))
(ドナー手順)
(ドナースクリーニングのための血小板洗浄プロトコール)
(マイクロタイタープレート用のドナー血小板試料の調製)
(患者手順)
(患者試料に関する血小板洗浄プロトコール)
(マイクロタイタープレート用の患者試料の調製)
(分析手順)
(マイクロタイタープレート用の生体QC試料の調製)
(結果の報告)
(結果の解釈)
(陰性結果)
(低陽性結果)
(陽性結果)
(未確定の結果)
(実施例2)
陽性HIT決定
(実施例3)
遷移比の評価
Claims (34)
- 試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ;
前記ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間にわたってインキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、前記クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、前記試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップ
を含む方法。 - 前記生体試料が、血清試料または血漿試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が、ヘパリンで処置した対象から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が、ヘパリン起因性血小板減少症を有することが疑われる対象から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記ドナー血小板が、少なくとも1名の健康と推定される対象から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記試料中の前記ドナー血小板が、洗浄され、部分的に精製される、請求項1に記載の方法。
- 前記インキュベートするステップが、室温で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記インキュベートするステップが、少なくとも30分間行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記提供するステップにおける前記ヘパリンが、0.001から1U/mLの量で存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記提供するステップにおける前記ヘパリンが、50から1000U/mLの量で存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーで分離するステップの前に、前記インキュベートされた試料を内部標準と接触させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記内部標準が、安定な同位体で標識された形のセロトニンである、請求項11に記載の方法。
- 前記安定な同位体で標識された形のセロトニンが、重水素標識セロトニン、炭素13標識セロトニン、窒素15標識セロトニン、酸素18標識セロトニン、またはこれらの組合せを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記内部標準がセロトニンd4である、請求項11に記載の方法。
- 前記提供するステップにおける前記ドナー血小板が、前記提供するステップの前にセロトニンと共にインキュベートされた、請求項1に記載の方法。
- 前記提供するステップにおける前記ドナー血小板が、前記提供するステップの前に、重水素標識セロトニン、炭素13標識セロトニン、窒素15標識セロトニン、酸素18標識セロトニン、またはこれらの組合せと共にインキュベートされた、請求項1に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーで分離するステップの前に、前記インキュベートされた試料を部分的に精製するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記部分的に精製するステップが、前記インキュベートされた試料を遠心分離することを含む、請求項17に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーを使用することが、分析液体クロマトグラフィーを使用することを含む、請求項1に記載の方法。
- 分析液体クロマトグラフィーを使用することが、逆相カラムを使用することを含む、請求項19に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーを使用することが、少なくとも1つのカラムを使用することを含む、請求項1に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーを使用することが、平行な2つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムを使用することを含み、前記2つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムが単一の質量分析計にインライン接続されている、請求項1に記載の方法。
- 平行な2つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムを使用することが、前記インキュベートされた試料を、前記2つまたはそれ超の液体クロマトグラフィーカラムに時間をずらして導入することを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記分析するステップが、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、および大気圧光イオン化からなる群から選択されるイオン化技法を使用して、セロトニンをイオン化することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分析するステップが、四重極質量分析計を使用してセロトニンを検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記四重極質量分析計が、三連四重極質量分析計である、請求項25に記載の方法。
- 前記分析するステップが、第1の四重極中のインタクトなセロトニンイオンを検出すること;第2の四重極中のインタクトなセロトニンイオンを断片化することであって、1つまたは複数のセロトニン断片イオンをもたらすこと;および第3の四重極中の1つまたは複数のセロトニン断片イオンを検出することを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記分析するステップが、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンをイオン化することであって、160.1±0.5の前駆体イオン、または115.1±0.5、132.1±0.5、105.1±0.5、もしくは89.1±0.5のプロダクトイオンの少なくとも1つを含む質量/電荷比を有する1つまたは複数のセロトニンイオンを生成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ヘパリン、およびセロトニンとインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ;
前記血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するステップ
を含む方法。 - 試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するための方法であって、
生体試料、ヘパリン、および安定な同位体で標識されたセロトニンとインキュベートされた血小板を含む試料を提供するステップ;
前記血小板から安定な同位体で標識されたセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
液体クロマトグラフィーを使用して、インキュベートされた試料中の安定な同位体で標識されたセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;および
質量分析法によって、クロマトグラフィーで分離された安定な同位体で標識されたセロトニンを分析するステップであって、ドナー血小板内の利用可能な同位体で標識されたセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出された安定な同位体で標識されたセロトニンの存在または量を決定するステップ
を含む方法。 - 前記提供するステップの前の前記安定な同位体で標識されたセロトニンが、重水素標識セロトニン、炭素13標識セロトニン、窒素15標識セロトニン、酸素18標識セロトニン、またはこれらの組合せである、請求項30に記載の方法。
- 異常な血小板活性化に関連した疾患または状態を診断するために有用な報告を作成する方法であって、
(a)生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するステップ;
(b)前記ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするステップ;
(c)液体クロマトグラフィーを使用して、前記インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するステップ;
(d)質量分析法によって、前記クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析するステップであって、前記ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出されたセロトニンの量を決定するステップ;および
(e)前記試料中のセロトニンの放出パーセンテージを述べた報告を作成するステップ
を含む方法。 - 前記疾患または状態が、ヘパリン起因性血小板減少症である、請求項32に記載の方法。
- 試料中のセロトニンの存在または量を決定するためのシステムであって、
(a)生体試料、ドナー血小板、およびヘパリンを含む試料を提供するためのステーション;
(b)前記ドナー血小板からセロトニンが放出されるように、前記試料を所定期間の間インキュベートするためのステーション;
(c)液体クロマトグラフィーを使用して、前記インキュベートされた試料中のセロトニンを他の成分からクロマトグラフィーで分離するためのステーション;および
(d)質量分析法によって、前記クロマトグラフィーで分離されたセロトニンを分析して、前記ドナー血小板内の利用可能なセロトニンの総量に対する、前記試料中の放出されたセロトニンの存在または量を決定するためのステーション
を含むシステム。
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