JP2021080264A - 酵素を用いたリン酸化エクオールの製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
また、リン酸化エクオールを化学的に化学合成する場合、使用する触媒等に安全性の懸念もある。したがって、微生物学的手法によるリン酸化エクオールの製造方法の確立が求められていた。
〔2〕以下の化学式(1)で示されるリン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩;
〔3〕R1がリン酸基でありR2が水酸基である、〔2〕に記載のリン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩。
〔4〕R1が水酸基でありR2がリン酸基である、〔2〕に記載のリン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩。
〔5〕リン酸ドナーの存在下でエクオールにリン酸化酵素を接触させる工程を含む、1つのリン酸基を有するリン酸化エクオールの製造方法。
〔6〕リン酸化酵素がエクオールの4´位の炭素のみまたは7位の炭素のみを特異的にリン酸化するリン酸化酵素であり、1つのリン酸基を有するリン酸化エクオールが以下の化学式(1)で示されるリン酸化エクオールである、〔5〕に記載の方法。
〔7〕リン酸化酵素が耐熱性酵素研究所よりリン酸化酵素T、リン酸化酵素Q、リン酸化酵素S、リン酸化酵素N又はリン酸化酵素Lの名称で入手可能な酵素のいずれかである、〔5〕または〔6〕に記載の方法。
〔8〕リン酸ドナーがポリリン酸、ATP、ホスホエノールピルビン酸、クレアチンリン酸である、〔5〕から〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔9〕R1がリン酸基でありR2が水酸基である、〔6〕から〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔10〕R1が水酸基でありR2がリン酸基である、〔6〕から〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔11〕〔5〕〜〔10〕のいずれかに記載の方法によって得られるリン酸化エクオール。
〔12〕〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のリン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩又は〔11〕に記載のリン酸化エクオールを含む組成物。
また本発明のリン酸化エクオールは、エクオールが有している女性ホルモン作用や抗酸化作用を有していると考えられる。したがって、本発明のリン酸化エクオールは、更年期障害(更年期不定愁訴、骨粗繋症、高脂血症)、骨粗繋症、前立腺肥大、メタボリックシンドローム等の疾患や症状の予防及び/又は改善などにも有用である。
本発明において、エクオールは、Rエクオール及びSエクオールの何れであってもよい。エクオールは、当業者に公知の方法によって製造することができる(例えば、エクオール生産能を有する嫌気性微生物によるエクオールの製造方法として、ダイゼインを嫌気性微生物により、水素を含む1種類以上の気体からなる気相下で発酵させ、エクオールを回収する方法がある(特許文献7/特開2002−238594)。あるいは、DAICEL CHIRAL THCHNOLOGIES(CHINA)co., LTD.などのサプライヤーによって市販されているものを使用することもできる。
・反応温度:好ましくは4〜60℃、さらに好ましくは15〜40℃、より好ましくは36〜38℃。
・pH:好ましくは2〜12、さらに好ましくはpH4〜6、より好ましくはpH4.4〜4.6。
・エクオールの濃度:好ましくは1〜20mM、さらに好ましくは4〜10mM、より好ましくは4.5〜6.5mM。
・リン酸化酵素の濃度:好ましくは10〜1000μg/mL、さらに好ましくは100〜700μg/mL、より好ましくは300〜500μg/mL。
・リン酸ドナーの量:好ましくは1〜20%、さらに好ましくは5〜15%、より好ましくは8〜12%。
本発明においては、「接触」を「混合」、「添加」などと言い換えることもできる。
本発明のリン酸化エクオール含有組成物は、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、心疾患、更年期障害の予防や治療のために使用することができる。
本発明のリン酸化エクオール含有組成物は、必要に応じて、瓶、袋、缶、スプレー缶、噴霧容器、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例1<スクリーニング>
ポリリン酸溶液(ACROS Organics社)に、水5mLを冷却しながら加えた後、トリエチルアミン(和光純薬工業株式会社)を冷却しながら5mL加えた(A液)。エクオール(DAICEL CHIRAL TECHNOLOGIES(CHINA)CO., LTD.、商品名「(S)‐EQUOL」)を、トリエチルアミン(和光純薬工業株式会社)5mLに溶解し、A液と混合後、35%NaOH溶液を用いて、冷却しながらpHを4.5付近に調節し、水で全量を47.5mLにメスアップした(B液)。
B液0.95mLに、各種リン酸化酵素(株式会社耐熱性酵素研究所製のリン酸化酵素A〜リン酸化酵素U、ホームページアドレス;http://www.tainetsu.com/document.php?pid=1)溶液を0.05mL添加し、37℃で24時間反応した。反応後の溶液0.05mLにHPLCの移動相0.45mLを加え混合し、HPLCサンプルとした。
以下に、反応組成液とHPLCの分析条件を示す。
エクオール濃度 :1.2mg/mL(5mM)
ポリリン酸濃度 :3.75%
トリエチルアミン :20%
酵素添加濃度 :50μg/mL
カラム :YMC-Pack ODS-A(150×4.6mm I.D.)
移動相 :25mM ギ酸(pH 2.5):メタノール=55:45
流速 :0.5mL/min
検出 :UV(280nm)
オーブン温度 :40℃
注入量 :10μL
実施例1で得られた反応液を使用し、保持時間6.91分のピークがリン酸化エクオールであることの確認を行った。
LC/MSによる分析の結果、化合物の分子量により、エクオールにリン酸基が1つついたリン酸化エクオールであることが示唆された。マススペクトルにおいて、ESI-negでは321.2に(図5)、ESI-posでは323.0に(図6)、ピークが認められたことから、分子量が322の化合物が存在することが判明した。この分子量はエクオールにリン酸基が1つついたリン酸化エクオールと一致した。
以下に、LC/MSの分析条件を示す。
<HPLC分析条件>
カラム :InertSustain C18(GLサイエンス製) 2.1φ×150mm(C-50)
移動相 :(A)0.1%ぎ酸水溶液 (B)HPLC用MeOH
グラジエント条件 :(A)/(B)=80/20(5min)→15min→0/100(10min)
流速 :0.2mL/min
オーブン温度 :40℃
検出 :PDA(シグナル280nm,バンド幅10nm、リファレンス off、
ピーク幅>0.05min、スリット4nm)
注入量 :5μL
質量分析装置 :四重極トリプルステージLC/MS/MS装置(Micro Mass製)
イオン源 :ESI-pos,neg
測定モード :Scan分析(m/z50〜1050)
Capillary :3.00kV(pos,neg)
Cone :50(pos)、 80(neg)
RF Lens1 :20.0(pos)、50.0(neg)
Desolvetion Temp. :200℃
Source Temp. :80℃
Cone Gas Flow :66L/hr
Desolvation Gas Flow :690L/hr
ポリリン酸溶液(和光純薬工業株式会社)に、水200mLを冷却しながら加えた後、トリエチルアミン(和光純薬工業株式会社)150mLを冷却しながら加え、35%NaOH溶液を用いて、冷却しながらpHを3.0付近に調整した(A液)。エクオール(DAICEL CHIRAL THCHNOLOGIES(CHINA)co., LTD.、商品名「(S)‐EQUOL」)1.5gを、トリエチルアミン(和光純薬工業株式会社)50mLに溶解し、冷却しながら、A液と混合後、35%NaOH溶液を用いて、冷却しながらpHを4.5付近に調整した。リン酸化酵素T1286U/mLを3.9mL添加し、水で1000mLにメスアップした後、37℃で26時間反応した。
エクオール濃度 :1.5g/L(6.2mM)
ポリリン酸濃度 :10%
トリエチルアミン :20%
リン酸化酵素T :5U/mL
実施例3で得た反応液を使用し、LC/MS/MSによるリン酸化エクオールの確認を行った。
LC/MS/MSのマススペクトルよりフラグメント解析を行い、その解裂パターンから、実施例3の反応生成物の同定を試みた。まず、トータルイオンクロマトグラムにおいて、反応後に2つのピークが顕著に出現した(図8および図9)。それぞれP-1、P-2とし、マススペクトル解析を行った。
LC/MS/MSのフラグメント解析パターンから、P-1の特徴的なピークとして、123.0、187.0、213,0が得られた(図14)。図14と図16に示すパターンを総合的に考慮すると、P-1は4'-O-ホスホエクオールに対応するピークであることが確認できた。
同様に、図15に示すフラグメント解析パターンから、P-2の特徴的なピークとして107.0、186.7、202.9が得られた。図15と図16に示すパターンを総合的に考慮すると、P-2は7-O-ホスホエクオールに対応するピークであることが確認できた。
以上から、実施例3の反応生成物は、4'-O-ホスホエクオールおよび7-O-ホスホエクオールであることが確認できた。
なお、LC/MS/MSによる分析条件は以下の通りである。
<HPLC条件>
カラム :SunShell PFP(クロマニックテクノロジーズ製)
2.1φ×150mm(C-54)
溶離液 :(A)0.1%ぎ酸水溶液 (B)HPLC用MeOH
グラジェント条件 :(A)/(B)=80/20(5min)→15min→0/100(10min)
流量 :0.2mL/min
オーブン温度 :40℃
検出 :PDA(シグナル280nm,バンド幅10nm、リファレンス off、
ピーク幅>0.05min、スリット4nm)
注入量 :5μL
質量分析装置 :四重極トリプルステージLC/MS/MS装置(Micro Mass製)
イオン源 :ESI-pos,neg
測定モード :Scan分析(m/z50〜1050)
Capillary :3.00kV(pos,neg)
Cone :50(pos)、 80(neg)
RF Lens1 :20.0(pos)、50.0(neg)
Desolvetion Temp :200℃
Source Temp. :80℃
Cone Gas Flow :75L/hr
Desolvation Gas Flow :680L/hr
LM1 Resolution :15.0
HM1 Resolution :15.0
Ion Energy1 :0.5
Entrance :-2
Collision :20
Exit :0.1
LM2 Resolution :15.0
HM2 Resolution :15.0
Ion Energy2 :2.0
Multiplier :650V
また本発明のリン酸化エクオールは、エクオールが有している女性ホルモン作用や抗酸化作用を有していると考えられる。したがって本発明のリン酸化エクオールは、更年期障害(更年期不定愁訴、骨粗繋症、高脂血症)、骨粗繋症、前立腺肥大、メタボリックシンドローム等の疾患や症状の予防及び/又は改善などに有用である。
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