JP6870011B2 - 酵素を用いたリン酸化エクオールの製造法 - Google Patents

Description

本発明は、新規なリン酸化エクオール、および酵素による当該リン酸化エクオールの製造方法に関する。

イソフラボン類は、たとえば大豆内では、糖と共有結合した配糖体の形、ダイジン(daidzin)、グリシチン（glycitin）、ゲニスチン(genistin)として存在しており、アグリコンの形ではごく少量存在しているのみである。これら配糖体はさらにマロニル化、アセチル化されているものも存在している。これらの配糖体は、ヒトや動物の体内に入ると消化酵素又は腸内細菌の産生する酵素であるβグルコシダーゼ等の働きにより、それぞれダイゼイン（daidzein）、グリシテイン（glycitein）、ゲニステイン（genistein）となる。さらに、ダイゼインは腸内細菌の働きにより、ジヒドロダイゼイン（dihydrodaidzein）を経て、O-デスメチルアンゴレンシン（O-desmethylangolensin：O-DMA）又はエクオール（equol）へと酵素的に変換されることが知られている。

エクオールは、これらの代謝産物の中で最もエストロゲン活性が高いことが知られている（非特許文献１及び２）。しかしながら人間の場合、イソフラボンの代謝には個人差があり、上記のようにダイゼインを発酵させてエクオールを産生する能力を有する腸内細菌を保有する人は少ない。当該腸内細菌の保有率は日本人で約５割、欧米人で約３割程度であることが明らかとなっている（非特許文献３及び４）。そのため、エクオール産生菌を保有しない人は、大豆等のマメ科食物を摂取してもエクオールを体内で産生することができないという問題点が存在していた。

これらの課題を克服するために、近年、乳酸菌等の嫌気性微生物を用いて体外的にエクオールを産生させる試みがなされている（特許文献１〜４）。しかしエクオールには、水への溶解度が低いという問題がある。水への溶解度を高めることができれば、エクオールの体内への摂取効率を高めることができるため、食品等へ含有させる場合に有効である。

水への溶解度を高められたエクオール化合物として、エクオール配糖体が知られている（特許文献５）。また、デヒドロエクオールを化学合成法によってリン酸化することや（特許文献６）、微生物由来のリン酸化酵素を用いてダイゼインやゲニステインをリン酸化すること（特許文献７）が知られている。また、７位の炭素がリン酸化されたエクオールや７位と４´位の２か所の炭素がリン酸化されたエクオールに関する報告もある（特許文献６）。しかし、７位の炭素がリン酸化されたエクオールについては、特許文献６には化合物のスペクトルデータが開示されておらず、実際にそのような化合物が合成された証拠は得られていない。
また、リン酸化エクオールを化学的に化学合成する場合、使用する触媒等に安全性の懸念もある。したがって、微生物学的手法によるリン酸化エクオールの製造方法の確立が求められていた。

特開２００６−２０４２９６ 特表２００６−５０４４０９ 特開２００８−６１５８４ 特開２０１０−１０４２４１ ＷＯ２００８／１２６７５２ 特表２００７−５１１５４２ 特開２００２−２３８５９４

Schmitt, E. et al., Toxicol. In Vitro, 15, 433-439 (2001) Sathyamoorthy, N. and Wang, T. T., Eur. J. Cancer, 33, 2384-2389 (1997) Arai, Y. et al., J. Epidemiol., 10, 127-135 (2000) Setchell, K. D. et al., J. Nutr., 133, 1027-1035 (2003)

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、４´位の炭素または７位の炭素のみがリン酸化された新規なリン酸化エクオール、および酵素を用いる当該リン酸化エクオールの製造方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。具体的には、本発明者らは、様々なリン酸化酵素の中から、エクオールの４´位の炭素のみまたは７位の炭素のみをリン酸化できる酵素の探索を試みた。その結果本発明者らは、株式会社耐熱性酵素研究所より入手したリン酸化酵素Ｔ、リン酸化酵素Ｑ、リン酸化酵素Ｓ、リン酸化酵素Ｎ、リン酸化酵素Ｌ[これらの酵素はそれぞれPhosphorylation Enzyme（耐熱性酵素研究所）T,Q,S,N,Lとして入手することができる。]を使用することにより、エクオールの４´位の炭素または７位の炭素を特異的にリン酸化することができることを見出した。すなわち本発明は、４´位の炭素または７位の炭素のみがリン酸化されたエクオール、および当該リン酸化エクオールの製造方法を提供するものであり、具体的には、以下の〔１〕〜〔１２〕を提供する。

〔１〕１つのリン酸基を有するリン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩。
〔２〕以下の化学式（１）で示されるリン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩；

ただし、式中、R1とR2のいずれか一方は水酸基であり、他方はリン酸基である。
〔３〕R1がリン酸基でありR2が水酸基である、〔２〕に記載のリン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩。
〔４〕R1が水酸基でありR2がリン酸基である、〔２〕に記載のリン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩。
〔５〕リン酸ドナーの存在下でエクオールにリン酸化酵素を接触させる工程を含む、１つのリン酸基を有するリン酸化エクオールの製造方法。
〔６〕リン酸化酵素がエクオールの４´位の炭素のみまたは７位の炭素のみを特異的にリン酸化するリン酸化酵素であり、１つのリン酸基を有するリン酸化エクオールが以下の化学式（１）で示されるリン酸化エクオールである、〔５〕に記載の方法。

ただし、式中、R1とR2のいずれか一方は水酸基であり、他方はリン酸基である。
〔７〕リン酸化酵素が耐熱性酵素研究所よりリン酸化酵素Ｔ、リン酸化酵素Ｑ、リン酸化酵素Ｓ、リン酸化酵素Ｎ又はリン酸化酵素Ｌの名称で入手可能な酵素のいずれかである、〔５〕または〔６〕に記載の方法。
〔８〕リン酸ドナーがポリリン酸、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸、クレアチンリン酸である、〔５〕から〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕R1がリン酸基でありR2が水酸基である、〔６〕から〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕R1が水酸基でありR2がリン酸基である、〔６〕から〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕〔５〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法によって得られるリン酸化エクオール。
〔１２〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のリン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩又は〔１１〕に記載のリン酸化エクオールを含む組成物。

本発明により、４´位の炭素または７位の炭素のみがリン酸化された新規なリン酸化エクオールおよびその製造方法が提供された。本発明によって提供されたリン酸化エクオールは、水溶性の向上に伴う体内への取り込み効率の向上、経口摂取における生物学的利用能の向上が期待される。また食品の苦みの低減を目的として使用することもできる。したがって、本発明のリン酸化エクオールは、食品分野などにおいて有用である。
また本発明のリン酸化エクオールは、エクオールが有している女性ホルモン作用や抗酸化作用を有していると考えられる。したがって、本発明のリン酸化エクオールは、更年期障害（更年期不定愁訴、骨粗繋症、高脂血症）、骨粗繋症、前立腺肥大、メタボリックシンドローム等の疾患や症状の予防及び／又は改善などにも有用である。

図１は、リン酸化酵素Ａ〜Ｇ、リン酸化酵素Ｉ、リン酸化酵素Ｊ、リン酸化酵素Ｌ〜Ｕによるリン酸化エクオールの生成量を示すグラフである。縦軸は生成量、横軸は実験に使用した酵素を示す。 図２は、リン酸化酵素Ｔを使用して得られた反応液のクロマトグラムを示す図である。 図３は、LC/MS分析におけるトータルイオンクロマトグラム（ESI-neg）を示す図である。 図４は、LC/MS分析におけるトータルイオンクロマトグラム（ESI-pos）を示す図である。 図５は、LC/MSのマススペクトル（ESI-neg）を示す図である。 図６は、LC/MSのマススペクトル（ESI-pos）を示す図である。 図７は、リン酸化エクオールの生成反応の推移を示すグラフである。 図８は、LC/MS/MS分析におけるトータルイオンクロマトグラム（ESI-neg）を示す図である。 図９は、LC/MS/MS分析におけるトータルイオンクロマトグラム（ESI-pos）を示す図である。 図１０は、LC/MS/MSのマススペクトル（ESI-neg、P-1）を示す図である。 図１１は、LC/MS/MSのマススペクトル（ESI-pos、P-1）を示す図である。 図１２は、LC/MS/MSのマススペクトル（ESI-neg、P-2）を示す図である。 図１３は、LC/MS/MSのマススペクトル（ESI-pos、P-2）を示す図である。 図１４は、LC/MS/MSのフラグメント解析パターン（P-1）を示す図である。 図１５は、LC/MS/MSのフラグメント解析パターン（P-2）を示す図である。 図１６は、フラグメント解析パターンから考えられるリン酸化エクオールを示す図である。

本発明は、１つのリン酸基を有するリン酸化エクオールに関する。具体的には、本発明は、以下の化学式（１）で示されるリン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩に関する。

化学式（１）中、R1とR2のいずれか一方は水酸基であり、他方はリン酸基である。

また本発明は、上の化学式（１）において、R1がリン酸基であり、R2が水酸基であるリン酸化エクオールに関する。あるいは本発明は、R1が水酸基であり、R2がリン酸基であるリン酸化エクオールに関する。前者のリン酸化エクオールは、４´位の炭素がリン酸化されたエクオール、あるいは4'-O-ホスホエクオールと言い表すことができる。一方後者のリン酸化エクオールは、７位の炭素がリン酸化されたエクオール、あるいは7-O-ホスホエクオールと言い表すこともできる。

４´位の炭素がリン酸化されたエクオール、あるいは4'-O-ホスホエクオールは以下の化学式（２）で示される。

７位の炭素がリン酸化されたエクオール、あるいは7-O-ホスホエクオールは以下の化学式（３）で示される。

本発明において、薬学的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩、金属塩、有機塩基付加塩等があげられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩があげられるこれらに限定されない。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられるこれらに限定されない。有機塩基付加塩としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、アニリン等の一級アミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン等の二級アミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピリジン等の三級アミン等とで形成される塩、アンモニウム塩等があげられるこれらに限定されない。

本発明のリン酸化エクオールは、リン酸ドナーの存在下で、エクオールとリン酸化酵素を接触させる工程を含む方法によって製造することができる。
本発明において、エクオールは、Rエクオール及びSエクオールの何れであってもよい。エクオールは、当業者に公知の方法によって製造することができる（例えば、エクオール生産能を有する嫌気性微生物によるエクオールの製造方法として、ダイゼインを嫌気性微生物により、水素を含む１種類以上の気体からなる気相下で発酵させ、エクオールを回収する方法がある（特許文献７／特開2002−238594）。あるいは、ＤＡＩＣＥＬ ＣＨＩＲＡＬ ＴＨＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（ＣＨＩＮＡ）ｃｏ．， ＬＴＤ．などのサプライヤーによって市販されているものを使用することもできる。

また本発明のリン酸化酵素は、エクオールの４´位の炭素のみまたは７位の炭素のみを特異的にリン酸化し得る酵素が好ましい。そのような酵素の例として、株式会社耐熱性酵素研究所より入手できるリン酸化酵素Ｔ、リン酸化酵素Ｑ、リン酸化酵素Ｓ、リン酸化酵素Ｎ、リン酸化酵素Ｌなど例示することができるがこれらに限定されない。株式会社耐熱性酵素研究所（住所：神戸市中央区港島南町五丁目5番2号、ホームページアドレス：http://www.tainetsu.com/）では、これらの酵素を、その名称と関連付けて管理、保管している。したがって、本発明のリン酸化酵素Ｔ、Ｑ、Ｓ、Ｎ、Ｌは、入手を希望する酵素の名称を耐熱性酵素研究所に伝えれば、取得することができる。

また本発明のリン酸化酵素には、これらのリン酸化酵素のホモログも含まれる。本発明において、リン酸化酵素Ｔ、リン酸化酵素Ｑ、リン酸化酵素Ｓ、リン酸化酵素Ｎ、リン酸化酵素Ｌのホモログとは、これらの酵素のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、エクオールの４´位の炭素のみ、または７位の炭素のみを特異的にリン酸化する活性を有するタンパク質を意味する。改変されるアミノ酸の数は、改変後のタンパク質が、前記理化学的性質を有している限り、特に制限はないが、一般的には、50アミノ酸以内、好ましくは30アミノ酸以内、より好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。あるいは、アミノ酸配列全体のうち、例えば20%以下、具体的には10%以下（例えば、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1%以下）のアミノ酸残基の改変は許容される。すなわち、リン酸化酵素Ｔ、リン酸化酵素Ｑ、リン酸化酵素Ｓ、リン酸化酵素Ｎ、リン酸化酵素Ｌのアミノ酸配列と、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上（例えば、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%以上）の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質も、本発明のリン酸化酵素に含まれる。

一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。

本発明においてリン酸ドナーとしては、ポリリン酸、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸、クレアチンリン酸などを利用することができるがこれらに限定されない。本発明においてポリリン酸とは、リン酸（ＰＯ_４）を基本単位とするポリマーをいう。本発明のポリリン酸には、直鎖構造のポリリン酸、環状構造のポリリン酸が含まれる。

本発明においては、エクオールとリン酸化酵素の反応条件として、以下の条件を示すことができるがこれらに限定されない。
・反応温度：好ましくは４〜６０℃、さらに好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは３６〜３８℃。
・ｐＨ：好ましくは２〜１２、さらに好ましくはｐＨ４〜６、より好ましくはｐＨ４.４〜４．６。
・エクオールの濃度：好ましくは１〜２０ｍＭ、さらに好ましくは４〜１０ｍＭ、より好ましくは４．５〜６．５ｍＭ。
・リン酸化酵素の濃度：好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１００〜７００μｇ／ｍＬ、より好ましくは３００〜５００μｇ／ｍＬ。
・リン酸ドナーの量：好ましくは１〜２０％、さらに好ましくは５〜１５%、より好ましくは８〜１２％。
本発明においては、「接触」を「混合」、「添加」などと言い換えることもできる。

本発明のリン酸化エクオールの製造方法においては、付加的に、生成したリン酸エクオールを回収する工程を含むことができる。リン酸化エクオールは、例えば次のような方法によって回収することができる。エクオールを酵素返納させた液を、例えば常法に従い、70度、30分間加熱した後、室温に戻し、不溶物を遠心分離により除去する。これにより、上清を回収できる。この上清をロータリーエバポレーターで減圧濃縮後、pHを3付近に調節後、等量のメタノールを加えて、よく混合する。この液をシリカゲルカラムに通液したのち、水／メタノール＝２／８を通液し、フラクション回収を行うことができる。リン酸化エクオールを含むフラクションの回収は、280nmのUV吸収およびHPLC分析結果を参考に行うことができる。さらに回収液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、乾固させ、固化物を得ることができる。

なお、当業者であれば、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＮＭＲ等の当業者に周知の分析化学の手法を用いて、４´位の炭素または７位の炭素のみがリン酸化されたエクオールを同定することができる。

さらに本発明は、上述のリン酸化エクオールの製造方法によって得られるリン酸化エクオールに関する。具体的には、エクオールとリン酸化酵素を接触させる工程を含む方法によって得られるリン酸化エクオールに関する。当該方法によって得られるリン酸化エクオールは、上述の通り、４´位の炭素のみまたは７位の炭素のみが特異的にリン酸化された、新規なリン酸化エクオールである。

また本発明は、リン酸化エクオール又はその薬学的に許容される塩を含む組成物（以下、リン酸化エクオール含有組成物）に関する。本発明の組成物は、医薬品、飲食物、化粧品等の素材として提供することができる。本発明のリン酸化エクオール含有組成物は、リン酸化されていないエクオール含有組成物と比較して、体内への取り込み効率の向上が期待される。リン酸化エクオールとしては、４´位の炭素がリン酸化されたエクオール（4'-O-ホスホエクオール）、７位の炭素がリン酸化されたエクオール（7-O-ホスホエクオール）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のリン酸化エクオール含有組成物を医薬品として提供する場合、その剤型は、予防または治療しようとする疾患や医薬品の使用形態、投与経路等に応じて選択することができる。例えば錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、浸剤、煎剤、チンキ剤等が挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に対して必要に応じて充填剤、増量剤、賦形剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、この医薬製剤中に着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させてもよい。
本発明のリン酸化エクオール含有組成物は、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、心疾患、更年期障害の予防や治療のために使用することができる。

本発明のリン酸化エクオール含有組成物を飲食物として提供する場合、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品、食品添加物、サプリメント等として使用することができる。食品の形態としては、本発明のリン酸化エクオール含有組成物を含む清涼飲料、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、グミ、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等を例示することができる。

本発明のリン酸化エクオール含有組成物には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、及びこれら加水分解物、バターなどが挙げられる。糖質としては糖類、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂、パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。

これらの食品中のリン酸化エクオール含有組成物の配合割合は、食品の種類、リン酸化エクオールの含量、摂取対象者の年齢や性別、期待される効果等に応じて、適宜設定することができる。一例として、食品100gに対して0.01-100g、好ましくはO.1-10g、更に好ましくはO.5-5gとなる割合を挙げることができるがこれらに限定されない。リン酸化エクオールを含む組成物を含む食品の一日当たりの摂取量については、組成物中のリン酸化エクオールの含量、摂取者の年齢や体重、摂取回数等によって異なるが、例えば成人1日当たり、O.1-10gに相当する組成物の量を挙げることができる。

また本発明のリン酸化エクオール含有組成物を化粧品として提供する場合、当該組成物等を水溶液、ローション、スプレー液、懸濁液および乳化液などの液状、粉末、顆粒およびブロック状などの固体状、クリームおよびペーストなどの半固体状、ゲル状等の各種所望の形態の化粧品に調製することができる。このような化粧品は、洗顔料、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック・マスク等の基礎化粧品、ファンデーション、口紅等のメーキャップ化粧品、口腔化粧品、芳香化粧品、毛髪化粧品、ボディ化粧品等の各種化粧料として有用である。
本発明のリン酸化エクオール含有組成物は、必要に応じて、瓶、袋、缶、スプレー缶、噴霧容器、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。

本発明のリン酸化エクオール含有組成物を含有する化粧品において、化粧品中の組成物の配合割合は特に限定されない。該化粧品の種類、リン酸化エクオールの含量等に応じて、適宜設定することができるが、一例を示せば、化粧料100gに対して、組成物(乾燥重量換算)が総量で0.01-10g、好ましくは0.1-5gとなる割合を挙げることができるがこれらに限定されない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
実施例１＜スクリーニング＞
ポリリン酸溶液（ＡＣＲＯＳ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社）に、水５ｍＬを冷却しながら加えた後、トリエチルアミン（和光純薬工業株式会社）を冷却しながら５ｍＬ加えた（Ａ液）。エクオール（ＤＡＩＣＥＬ ＣＨＩＲＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（ＣＨＩＮＡ）ＣＯ．， ＬＴＤ．、商品名「（Ｓ）‐ＥＱＵＯＬ」）を、トリエチルアミン（和光純薬工業株式会社）５ｍＬに溶解し、Ａ液と混合後、３５％ＮａＯＨ溶液を用いて、冷却しながらｐＨを４．５付近に調節し、水で全量を４７．５ｍＬにメスアップした（Ｂ液）。
Ｂ液０．９５ｍＬに、各種リン酸化酵素（株式会社耐熱性酵素研究所製のリン酸化酵素Ａ〜リン酸化酵素Ｕ、ホームページアドレス；http://www.tainetsu.com/document.php?pid=1）溶液を０．０５ｍＬ添加し、３７℃で２４時間反応した。反応後の溶液０．０５ｍＬにＨＰＬＣの移動相０．４５ｍＬを加え混合し、ＨＰＬＣサンプルとした。
以下に、反応組成液とＨＰＬＣの分析条件を示す。

・反応液組成
エクオール濃度 ：1.2mg/mL（5mM）
ポリリン酸濃度 ：3.75%
トリエチルアミン ：20％
酵素添加濃度 ：50μg/mL

・ＨＰＬＣ分析条件
カラム ：YMC-Pack ODS-A（150×4.6mm I.D.）
移動相 ：25mM ギ酸（pH 2.5）：メタノール＝55：45
流速 ：0.5mL/min
検出 ：UV（280nm）
オーブン温度 ：40℃
注入量 ：10μL

その結果、リン酸化酵素Ｔがもっとも反応性が高く、ついで、リン酸化酵素Ｑ、リン酸化酵素Ｓ、リン酸化酵素Ｎ、リン酸化酵素Ｌの順に反応性が高いことがわかった（図１）。また、リン酸化酵素Ｔによる反応液を以下に記載のHPLC分析条件でHPLC分析した結果、リン酸化エクオールと思われるピークが保持時間６．９１分に確認された（図２）。保持時間６．９１分のピークは反応後にのみ出現したピークであることからリン酸化エクオールと推定した。

実施例２＜エクオールリン酸の確認＞
実施例１で得られた反応液を使用し、保持時間６．９１分のピークがリン酸化エクオールであることの確認を行った。
ＬＣ／ＭＳによる分析の結果、化合物の分子量により、エクオールにリン酸基が1つついたリン酸化エクオールであることが示唆された。マススペクトルにおいて、ESI-negでは321.2に（図５）、ESI-posでは323.0に（図６）、ピークが認められたことから、分子量が322の化合物が存在することが判明した。この分子量はエクオールにリン酸基が１つついたリン酸化エクオールと一致した。
以下に、ＬＣ／ＭＳの分析条件を示す。

・LC/MS分析条件
＜HPLC分析条件＞
カラム ：InertSustain C18(GLサイエンス製) 2.1φ×150mm(C-50)
移動相 ：(A)0.1%ぎ酸水溶液 (B)HPLC用MeOH
グラジエント条件 ：(A)/(B)=80/20(5min)→15min→0/100(10min)
流速 ：0.2mL/min
オーブン温度 ：40℃
検出 ：PDA(シグナル280nm,バンド幅10nm、リファレンス off、
ピーク幅>0.05min、スリット4nm)
注入量 ：5μL

＜MS条件＞
質量分析装置 ：四重極トリプルステージLC/MS/MS装置(Micro Mass製)
イオン源 ：ESI-pos,neg
測定モード ：Scan分析(m/z50〜1050)
Capillary ：3.00kV(pos,neg)
Cone ：50(pos)、 80(neg)
RF Lens1 ：20.0(pos)、50.0(neg)
Desolvetion Temp. ：200℃
Source Temp. ：80℃
Cone Gas Flow ：66L/hr
Desolvation Gas Flow ：690L/hr

実施例３＜リン酸化物エクオールの製造（1Ｌスケール）＞
ポリリン酸溶液（和光純薬工業株式会社）に、水２００ｍＬを冷却しながら加えた後、トリエチルアミン（和光純薬工業株式会社）１５０ｍＬを冷却しながら加え、３５％NaOH溶液を用いて、冷却しながらｐＨを３．０付近に調整した（Ａ液）。エクオール（ＤＡＩＣＥＬ ＣＨＩＲＡＬ ＴＨＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（ＣＨＩＮＡ）ｃｏ．， ＬＴＤ．、商品名「（Ｓ）‐ＥＱＵＯＬ」）１．５ｇを、トリエチルアミン（和光純薬工業株式会社）５０ｍＬに溶解し、冷却しながら、Ａ液と混合後、３５％ＮａＯＨ溶液を用いて、冷却しながらｐＨを４．５付近に調整した。リン酸化酵素Ｔ１２８６Ｕ／ｍＬを３．９ｍＬ添加し、水で１０００ｍＬにメスアップした後、３７℃で２６時間反応した。

・反応液組成
エクオール濃度 ：1.5g/L（6.2mM）
ポリリン酸濃度 ：10%
トリエチルアミン ：20％
リン酸化酵素Ｔ ：5U/mL

UV検出によるHPLC分析の結果、反応終了後、1.2mM のリン酸化エクオールが生成していることが確認できた（図７）。

実施例４＜エクオールリン酸の再確認＞
実施例３で得た反応液を使用し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるリン酸化エクオールの確認を行った。
LC/MS/MSのマススペクトルよりフラグメント解析を行い、その解裂パターンから、実施例３の反応生成物の同定を試みた。まず、トータルイオンクロマトグラムにおいて、反応後に２つのピークが顕著に出現した（図８および図９）。それぞれP-1、P-2とし、マススペクトル解析を行った。
LC/MS/MSのフラグメント解析パターンから、P-1の特徴的なピークとして、123.0、187.0、213,0が得られた（図１４）。図１４と図１６に示すパターンを総合的に考慮すると、P-1は4'-O-ホスホエクオールに対応するピークであることが確認できた。
同様に、図１５に示すフラグメント解析パターンから、P-2の特徴的なピークとして107.0、186.7、202.9が得られた。図１５と図１６に示すパターンを総合的に考慮すると、P-2は7-O-ホスホエクオールに対応するピークであることが確認できた。
以上から、実施例３の反応生成物は、4'-O-ホスホエクオールおよび7-O-ホスホエクオールであることが確認できた。
なお、LC/MS/MSによる分析条件は以下の通りである。

・LC/MS/MS分析条件
＜HPLC条件＞
カラム ：SunShell PFP(クロマニックテクノロジーズ製)
2.1φ×150mm(C-54)
溶離液 ：(A)0.1%ぎ酸水溶液 (B)HPLC用MeOH
グラジェント条件 ：(A)/(B)=80/20(5min)→15min→0/100(10min)
流量 ：0.2mL/min
オーブン温度 ：40℃
検出 ：PDA(シグナル280nm,バンド幅10nm、リファレンス off、
ピーク幅>0.05min、スリット4nm)
注入量 ：5μL

＜MS条件＞
質量分析装置 ：四重極トリプルステージLC/MS/MS装置(Micro Mass製)
イオン源 ：ESI-pos,neg
測定モード ：Scan分析(m/z50〜1050)
Capillary ：3.00kV(pos,neg)
Cone ：50(pos)、 80(neg)
RF Lens1 ：20.0(pos)、50.0(neg)
Desolvetion Temp ：200℃
Source Temp. ：80℃
Cone Gas Flow ：75L/hr
Desolvation Gas Flow ：680L/hr

＜MS/MS条件(ESI-pos)＞
LM1 Resolution ：15.0
HM1 Resolution ：15.0
Ion Energy1 ：0.5
Entrance ：-2
Collision ：20
Exit ：0.1
LM2 Resolution ：15.0
HM2 Resolution ：15.0
Ion Energy2 ：2.0
Multiplier ：650V

本発明により、新規なリン酸化エクオールおよび当該リン酸化エクオールの製造方法が提供された。本発明のリン酸化エクオールは、リン酸化されていないエクオールと比較して、水への溶解度や体内への取り込み効率が向上している。また、苦みが低減している。したがって本発明のリン酸化エクオールは、特に食品分野において有用である。
また本発明のリン酸化エクオールは、エクオールが有している女性ホルモン作用や抗酸化作用を有していると考えられる。したがって本発明のリン酸化エクオールは、更年期障害（更年期不定愁訴、骨粗繋症、高脂血症）、骨粗繋症、前立腺肥大、メタボリックシンドローム等の疾患や症状の予防及び／又は改善などに有用である。

Claims (4)

1. リン酸ドナーの存在下でエクオールにリン酸化酵素を接触させる工程を含む、１つのリン酸基を有するリン酸化エクオールの製造方法であって、
   リン酸化酵素がエクオールの４´位の炭素のみを特異的にリン酸化するリン酸化酵素であり、１つのリン酸基を有するリン酸化エクオールが以下の化学式（１）で示されるリン酸化エクオールである、前記方法；
   

   

   ただし、式中、R1がリン酸基でありR2が水酸基である。
2. リン酸ドナーがポリリン酸、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸、またはクレアチンリン酸である、請求項１に記載の方法。
3. 以下の工程を含む、リン酸化酵素のスクリーニング方法；
   (a) リン酸ドナーの存在下で、エクオールを含む溶液に被験リン酸化酵素を接触させる工程、および
   (b) 被験リン酸化酵素の中から、１つのリン酸基を有するリン酸化エクオールを生成させたリン酸化酵素を選択する工程
   であって、
   １つのリン酸基を有するリン酸化エクオールが以下の化学式（１）で示されるリン酸化エクオールである、前記方法；
   

   

   ただし、式中、R1がリン酸基でありR2が水酸基である。
4. リン酸ドナーがポリリン酸、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸、またはクレアチンリン酸である、請求項３に記載の方法。

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