JP2020524498A5

JP2020524498A5 -

Info

Publication number: JP2020524498A5
Application number: JP2019567687A
Authority: JP
Filing date: 2018-06-06
Publication date: 2021-07-26

Claims

少なくとも１つの核酸配列で細胞をトランスフェクトする方法であって、
（ａ）細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液で製剤化された少なくとも１つの核酸と接触させるステップ；
（ｂ）前記細胞を、核酸及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液とともにインキュベート又は培養するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）の時点又は直後、又はステップ（ａ）から３時間以内までに、増強剤を加えて混合物を産生するステップ；並びに
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記混合物をインキュベートし、それにより前記細胞を核酸配列でトランスフェクトするステップ
を含む、方法。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する細胞を作製する方法であって、
（ａ）構成物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）：
（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミド；
（ｉｉ）タンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される導入遺伝子を含むプラスミド；並びに
（ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液
のＰＥＩ／プラスミド混合物を提供するステップ；
（ｂ）細胞を、ステップ（ａ）のプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液を産生するステップ；
（ｃ）増強剤を前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えて、第２の混合物を産生するステップ；並びに
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記第２の混合物をインキュベートし、それにより組換えｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクトされた細胞を作製するステップ
を含む、方法。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する細胞を作製する方法であって、
（ａ）構成物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）：
（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミド；
（ｉｉ）タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写される導入遺伝子を含むプラスミド；並びに
（ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液
のＰＥＩ／プラスミド混合物を提供するステップ；
（ｂ）細胞を、ステップ（ａ）のプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液を産生するステップ；
（ｃ）バルプロ酸、その塩又は誘導体を、前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えて、第２の混合物を産生するステップ；並びに
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記第２の混合物をインキュベートし、それにより組換えｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクトされた細胞を作製するステップ
を含む、方法。
ステップ（ｄ）で産生された前記トランスフェクトされた細胞及び／又はステップ（ｄ）で産生されたトランスフェクトされた細胞からの培養培地を収穫して、細胞及び／又は培養培地収穫物を産生するステップ（ｅ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記核酸又はプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、培養、拡張、単離又は選択するステップ（ｅ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｄ）で産生されたトランスフェクトされた細胞及び／若しくは培養培地から、並びに／又はステップ（ｄ）で産生されたトランスフェクトされた細胞から、組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製するステップ（ｅ）をさらに含む、請求項２に記載の方法。
ステップ（ｅ）で産生されたトランスフェクトされた細胞及び／又は培養培地収穫物からの組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製するステップ（ｆ）をさらに含む、請求項５に記載の方法。
前記導入遺伝子が、野生型又は機能的変異体の血液凝固因子、ａｐｏＥ２、ＴＰＰ１、アルギニノコハク酸合成酵素、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２、酸性α−グルコシダーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ又はＣ１阻害セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする、請求項１に記載の方法。
前記野生型又は機能的変異体の血液凝固因子が、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、又は因子ＩＸである、請求項８に記載の方法。
前記増強剤が、ステップ（ａ）の前、ステップ（ａ）の時点、又はステップ（ａ）の直後、又はステップ（ａ）の後３時間未満までに加えられる、請求項１に記載の方法。
前記増強剤が、ステップ（ａ）又は（ｂ）の後に２回以上加えられる、請求項１に記載の方法。
前記プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）が、約１：０．０１〜約１：１００のモル比範囲にあるか、又は約１００：１〜約１：０．０１のモル比範囲にあり、構成物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の混合物は、ステップ（ｂ）の前に約１０秒〜約４時間の期間にわたって任意選択でインキュベートされる、請求項２に記載の方法。
前記核酸又はプラスミドが、約０．１：１〜約５：１の範囲のＰＥＩ：核酸若しくはＰＥＩ：プラスミド重量比、又は約５：１〜約０．１：１の範囲のＰＥＩ：核酸若しくはＰＥＩ：プラスミド重量比である、請求項１に記載の方法。
前記核酸又はプラスミドが、約１：１〜約５：１の範囲のＰＥＩ：核酸若しくはＰＥＩ：プラスミド重量比、又は約５：１〜約１：１の範囲のＰＥＩ：核酸若しくはＰＥＩ：プラスミド重量比である、請求項１に記載の方法。
ステップ（ａ）若しくは（ｂ）の前、その時点若しくはその後に、又はステップ（ｃ）の前若しくはその時点若しくはその後に、遊離ＰＥＩを細胞に加えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記遊離ＰＥＩが、ＰＥＩ：核酸又はＰＥＩ：プラスミドの重量比が約０．１：１〜約５：１の範囲にあるように、又は約５：１〜約０．１：１の範囲にあるように加えられる、請求項１に記載の方法。
全ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）の核酸：ＰＥＩ及び／又はプラスミド：ＰＥＩ中のリン酸塩（Ｐ）に対するモル比が、約１：１〜約５０：１（Ｎ：Ｐ）の範囲にある、請求項１に記載の方法。
遊離ＰＥＩの量が、全ＰＥＩの約１０％〜約９０％である、請求項１５に記載の方法。
前記核酸配列及びＰＥＩが、ステップ（ａ）の前に互いに約１０秒〜約４時間インキュベートされている、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｄ）のインキュベーションが、少なくとも約４時間である、請求項３に記載の方法。
前記細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を含む、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
前記細胞が安定的に又は一時的にトランスフェクトされる、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、懸濁培養液中にある、請求項１に記載の方法。
前記細胞が接着性である、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、無血清培養培地で増殖又は維持される、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、前記核酸配列若しくは前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触したとき、及び／又は前記遊離ＰＥＩと接触したとき、約１×１０^５細胞／ｍＬ〜約１×１０^８細胞／ｍＬの範囲の密度である、請求項１に記載の方法。
前記１つ又は複数のプラスミドが、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１のプラスミド及びヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２のプラスミドを含む、請求項２に記載の方法。
コードされたＡＡＶパッケージングタンパク質が、ＡＡＶｒｅｐ及び／又はＡＡＶｃａｐを含む、請求項２に記載の方法。
コードされたヘルパータンパク質が、アデノウイルスＥ２及び／若しくはＥ４、ＶＡＲＮＡタンパク質、並びに／又は非ＡＡＶヘルパータンパク質を含む、請求項２に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが、イントロン、発現制御要素、１つ又は複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２に記載の方法。
前記細胞が、前記核酸配列又はプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触する前に、細胞密度が減少するまで継代培養される、請求項１に記載の方法。
継代培養後２日〜５日の期間の間、前記細胞を前記核酸配列又はプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させる、請求項１に記載の方法。
産生された組換えＡＡＶベクターの量が、遊離ＰＥＩをプラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えるステップを用いると、遊離ＰＥＩをプラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えない場合と比較して少なくとも５０％以上である、請求項２に記載の方法。
産生された組換えＡＡＶベクターの量が、増強剤、バルプロ酸、その塩又は誘導体を加えるステップを用いると、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に増強剤、バルプロ酸、その塩又は誘導体を添加しない場合と比較して１〜５、５〜８、８〜１０又は１０〜１５倍多い、請求項２に記載の方法。
前記増強剤が、バルプロ酸、その塩若しくは誘導体；イソ酪酸、その塩若しくは誘導体；又はイソ吉草酸、その塩若しくは誘導体を含むか又はからなる、請求項１に記載の方法。
前記バルプロ酸塩、イソ酪酸塩又はイソ吉草酸塩が、ナトリウム塩又はカリウム塩を含む、請求項３８に記載の方法。
前記バルプロ酸誘導体、イソ酪酸誘導体又はイソ吉草酸誘導体が、それに結合又はコンジュゲートされたアミノ酸を含む、請求項３８に記載の方法。