JP2020510702A

JP2020510702A - 選択的細胞死誘導酵素系

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Abstract

【課題】本発明は、ヒトおよび動物のがんおよび腫瘍の療法および／または治療に使用するための選択的細胞死誘導酵素系を含む融合タンパク質、プロセスおよびその使用に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、ヒトおよび動物のがんおよび腫瘍の療法および／または治療に使用するための選択的細胞死誘導酵素系を含む融合タンパク質、プロセスおよびその使用に関する。

がんは、体内での無制限な細胞増殖および変性細胞の播種を特徴とする疾患の類であり、転移の場合には最終的に患者を死に至らしめる。腫瘍およびがん疾患の治療は、発生する腫瘍のタイプに強く依存しており、今日では、治療は通例、侵襲的な手術に加えて放射線療法または化学療法の使用を含む。がん疾患は、外部要因（たばこ喫煙、感染性微生物またはウイルス、突然変異原および電離放射線）と内部要因（遺伝的素因、ホルモン、免疫系因子および自然体細胞突然変異）との両方によって引き起こされる。がんはまた、免疫療法、ホルモン療法によって、および標的療法によっても治療することができる。腫瘍細胞を殺すために化学療法を用いる利点は、細胞内ＤＮＡまたはＲＮＡに破壊的効果を発揮することによる、細胞分裂を阻止するその能力によって妥当性が明らかになる。腫瘍細胞は、もはや分裂することができなくなるとすぐに死ぬ。より急速に細胞が分裂すれば、化学療法剤によってそれらを死滅させることができる確率および、細胞死の誘導によって腫瘍が縮小する確率はより高くなる。その結果として、化学療法は、急速に分裂する細胞に対して最も効率よく作用する。しかしながら、化学療法は、がん細胞／腫瘍細胞と、急速に増殖している体内の正常細胞とを区別することができないため、脱毛、疲労、疼痛、血球数の変化および吐き気などの副作用が生じる。化学療法は、作用機構に基づいて５つの大きなクラス（アルキル化剤、植物アルカロイド、抗腫瘍性抗生物質および代謝拮抗剤）に類別される。

いわゆる標的療法は、がん細胞と正常な健康細胞との違いについての我々の知識を活用する。標的療法は、正常な健康細胞への損傷がないようにがん細胞の特定の特徴を活用することによってこれらのがん細胞を排除することを目的としている。これらの標的療法の活性成分は、特に、がん細胞を特異的に認識してがん細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体および、腫瘍に栄養供給する血管の成長を特異的に抑制する血管新生阻害薬を含む。標的療法は、ほとんどの場合、がん細胞膜を通過し、細胞代謝を妨げ、特にアポトーシスを引き起こして細胞を殺すことができる有機小分子を用いる。こうしたアポトーシスを引き起こす、細胞内シグナル経路を標的とする多くの活性成分が記載されている。他の活性成分は、細胞表面の腫瘍特異的受容体を認識して該受容体に結合する。

しかしながら、これらの療法は、免疫系に極端な負担をかけ、また、多くの場合、限られた範囲でしか使用することができない。さらに、ほとんどの場合、これらの形態の療法は、免疫系の再生のために個々の治療間で長い休止期を必要とする。したがって、近年、特に遺伝子治療アプローチまたは遺伝子ワクチン接種は、治療のために、またはこれらの古典的処置の補助において有望であることが判明している。

遺伝子治療および遺伝子ワクチン接種は、疾患の療法および予防におけるその一般的使用が医療にかなりの影響を有する分子医療である。どちらの方法も、患者の細胞または組織への核酸またはペプチドの導入および、それに続く、導入された核酸によってコードされる情報のこれらの細胞または組織でのプロセシング、すなわち所望のポリペプチドの発現に基づく。

既存の遺伝子治療法および遺伝子ワクチン接種法の通常のアプローチは、ＤＮＡを用いて所望の遺伝情報を細胞に導入することである。この点について、細胞にＤＮＡを導入するための様々な方法、たとえばリン酸カルシウムトランスフェクション、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびリポフェクションが記載されている。

特に遺伝子ワクチン接種のために提案されている別の方法は、ＤＮＡビヒクルとしてのＤＮＡウイルスの使用である。これらのウイルスは、それらの感染性が、大変高いトランスフェクション率の実現を可能にするという利点を有する。

アポトーシスの生理過程による疾患関連細胞の排除は、患者のために極めて有益である。他の形態の細胞死とは対照的に、アポトーシスは、いくつかの利点をもたらす高度に制御および調節されたプロセスである。アポトーシス細胞は大変急速に死に、アポトーシス小体と呼ばれる生成された細胞断片は食細胞によって除去される。これによって、周囲の細胞はどのような損傷からも保護される（非特許文献１）。

さらに、植物または細菌起源の免疫毒素などの他の死誘発剤は、しばしば、中和抗体の発生の問題に直面する。それらの薬剤の免疫原性は、その臨床的有用性に対する主な障壁と考えられている。

しかしながら、がん細胞はアポトーシス傷害に抵抗することが公知であり、それによって腫瘍のイニシエーションおよび進行が可能となる。不完全なまたは非効率的なアポトーシスシグナル伝達は、多くの場合、生存促進タンパク質のアップレギュレーションまたはアポトーシス促進性タンパク質の抑制をもたらす変異によって引き起こされる。

細胞のアポトーシスは、様々なアポトーシス促進機構およびタンパク質によって誘発することができる。これらの機構とタンパク質との共通点は、それらが、細胞を標的とする、カスパーゼと呼ばれるタンパク質分解性システインプロテアーゼのカスケードを活性化することである。このカスケードは、はじめに活性化されるカスパーゼ、たとえばカスパーゼ８およびカスパーゼ９などと、それによって活性化されるエフェクターカスケード、たとえばカスパーゼ３および６または７などとを含む。これらは、引き続いて一連の細胞基質を切断し、冒された細胞のアポトーシスを引き起こす。

本発明の文脈において、用語「プログラム細胞死」は、「アポトーシス」の同義語として用いることができる。本発明の定義によれば、「誘導細胞死」は、活性物質が、好ましくはカスパーゼにより、アポトーシスすなわちプログラム細胞死を引き起こす細胞死である。

しかしながら、たとえば特許文献１に開示されているように、腫瘍治療にカスパーゼを使用することができることは公知である。

カスパーゼ３、７、８または１０を送達することによるアポトーシスの誘導は、これらの酵素の上流のアポトーシス経路のすべての機能障害を回避することができる。カスパーゼ、特にカスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８またはカスパーゼ１０は、アポトーシス経路において主要な役割を有しており、それらは、細胞内の１００超のタンパク質標的を提供する。他のカスパーゼとは対照的に、カスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８またはカスパーゼ１０は、がん細胞に送達されると、単独でまたは一緒にアポトーシスを誘導することができる。

しかしながら、カスパーゼ３、７、８または１０抵抗性がん細胞もいくつか存在する。これらの細胞は、カスパーゼ依存アポトーシスを抑制する、天然に存在する細胞内タンパク質であるアポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）を高レベルで発現する。

特異的認識配列を有する基質タンパク質に対してのみ酵素的に活性な一連のプロテアーゼが存在する。以下の表にいくつかの例を挙げる。Ｐ１は、その後が切断されるアミノ酸の位置を示す。Ｐ４、Ｐ３およびＰ２は、制限部位Ｐ１の前のＮ末端位置である。Ｐ１’およびＰ２’は、Ｐ１の後のＣ末端位置である。これは、これらのプロテアーゼがＰ１とＰ１’ との間のポリペプチド鎖を切断することを意味する。

アミノ酸は１文字コードで示した
特に有効で特異的なカスパーゼ（表１参照）はカスパーゼ３、７、８および１０である。

米国特許出願公開第２００３／００５４０００号明細書

ＫｒｅｉｔｍａｎＲＪ：Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓｉｎｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１９９９，１１：５７０−５７８ＥａｒｎｓｈａｗＷＣ，ＭａｒｔｉｎｓＬＭ，ＫａｕｆｍａｎｎＳＨ：Ｍａｍｍａｌｉａｎｃａｓｐａｓｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓｄｕｒｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ１９９９，６８：３８３−４２４ＴｈｅＰ１’ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｏｂａｃｃｏｅｔｃｈｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅａｓｅ，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２９４（２００２）９４９−９５５ＤｏｕｇｈｅｒｔｙＷＧ，ＰａｒｋｓＴＤ，ＣａｒｙＳＭ，ＢａｚａｎＪＦ，ＦｌｅｔｔｅｒｉｃｋＲＪ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆｔｈｅｔｏｂａｃｃｏｅｔｃｈｖｉｒｕｓ４９−ｋＤａｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９８９，１７２：３０２−３１０ＫａｐｕｓｔＲＢ，ＷａｕｇｈＤＳ：ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙＴＥＶｐｒｏｔｅａｓｅ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒＰｕｒｉｆ２０００，１９（２）：３１２−３１８Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄ．），（１９８９）．ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍＭａｍｍａｌｉａｎＴｉｓｓｕｅ．Ｉｎ：ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＦｅｉｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ８４，７４１３；Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，６９８２；Ｆｅｉｇｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０またはＧａｏ，Ｘ．＆Ｈｕａｎｇ，Ｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１８９，１９５Ｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｂｙｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓａｎｄｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ．ＴｒｏｓｄｅＩｌａｒｄｕｙａＣ，ＳｕｎＹ，ＤｕｚｇｕｎｅｓＮ．ＥｕｒＪＰｈａｒｍＳｃｉ．２０１０Ｊｕｎ１４；４０（３）：１５９−７０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｐｓ．２０１０．０３．０１９．Ｅｐｕｂ２０１０Ｍａｒ３０；ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｂｙＥＧＦ−ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ，ＢｕｎｉｕａｌｅｓＭ，ＤｕｅｚｇｕｅｎｅｓＮ，ＺａｌｂａＳ，ＧａｒｒｉｄｏＭＪ，ｄｅＩｌａｒｄｕｙａＣＴ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．２０１１Ｊａｎ；６（１）：８９−９８．ｄｏｉ：１０．２２１７／ｎｎｍ．１０．１００；Ｇｅｎｅｔｉｃｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｂｙｔａｒｇｅｔｅｄｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ，ＤｕｅｚｇｕｅｎｅｓＮ，ｄｅＩｌａｒｄｕｙａＣＴ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２０１２；５０９：３５５−６７．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８−０−１２−３９１８５８−１．０００１８−６Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ，（２６６ｓｔｅｄｉｔｉｏｎ）２０１４，ｄｅＧｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ

この従来技術から出発して、活性成分を用いてがんまたは腫瘍細胞の誘導細胞死を引き起こすことが本発明者らの目標であった。

カスパーゼは不活性な酵素前駆体として発現され、活性化のためには特異的切断を必要とする。本発明によるカスパーゼ３、７、８、１０を特異的に活性化するために、それらの天然の切断部位は、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（以後、「ＴＥＶ」と略記する）によって一意的に切断されるアミノ酸配列（認識部位）によって置換されている。

通例、カスパーゼ３、７、８、１０は、（たとえばグランザイムＢによって）天然に切断される不活性な酵素前駆体として翻訳される。プロカスパーゼ３、７、８、１０遺伝子は、Ｎ末端プロドメインとそれに続く２つの成分、いわゆる小サブユニットと大サブユニットとからなる（非特許文献２）。プロセシング部位は、プロドメインと大サブユニットとの接合部および、２つのサブユニット間のサブユニット間リンカーに位置する。カスパーゼ成熟に必要なすべての天然切断は、アスパラギン酸残基のカルボキシル側（Ｐ１’残基と名付ける、表１参照）で生じる。

活性を誘導するには、サブユニット間リンカーの切断が必要であり、かつ十分であることが報告されている。したがって、本発明によって用いられる好ましいカスパーゼ３、７、８、１０バリアントは、該カスパーゼの小サブユニットと大サブユニットとの間のＰ１’位置に好ましくはセリン（Ｓ）を提示するＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有する。それにより、グランザイムＢによる切断に極めて重要な内因性Ｐ１’アスパラギン酸（Ｄ）が除去され、Ｐ１’としてＴＥＶプロテアーゼに好ましいセリン（Ｓ）が天然に提供される。

さらに、２つのドメイン間に認識部位を配置することによって、表面接触性が有利に確保される。

驚くべきことに、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型またはそれをコードする核酸ならびにＴＥＶ（配列番号１もしくは配列番号２）またはそれをコードする核酸を含む融合タンパク質であって、カスパーゼ３、７、８、１０が、ＴＥＶの少なくとも１つの認識部位（認識配列）ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３）および／またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）を含む改変体で提供される、融合タンパク質を含む細胞死誘導酵素系によって、腫瘍細胞は死ぬことが可能である。

本発明によれば、ＴＥＶは、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の改変体における認識部位（認識配列）ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）を認識し、ここで認識部位（認識配列）は、好ましくは、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の大サブユニットと小サブユニットとの間に連結されている（ライゲーションされている）。

このような配列は、次のように定義することができる：
ＴＥＶの認識部位（下線）を有する改変カスパーゼ３（配列番号５）：
ＭＥＮＴＥＮＳＶＤＳＫＳＩＫＮＬＥＰＫＩＩＨＧＳＥＳＭＤＳＧＩＳＬＤＮＳＹＫＭＤＹＰＥＭＧＬＣＩＩＩＭＴＳＲＳＧＴＤＶＤＡＡＮＬＲＥＴＦＲＮＬＫＹＥＶＲＮＫＮＤＬＴＲＥＥＩＶＥＬＭＲＤＶＳＫＥＤＨＳＫＲＳＳＦＶＣＶＬＬＳＨＧＥＥＧＩＩＦＧＴＮＧＰＶＤＬＫＫＩＴＮＦＦＲＧＤＲＣＲＳＬＴＧＫＰＫＬＦＩＩＱＡＣＲＣＴＥＬＤＣＧＩＥＴＥＮＬＹＦＱＳＧＶＤＤＤＭＡＣＨＫＩＰＶＥＡＤＦＬＹＡＹＳＴＡＰＧＹＹＳＷＲＮＳＫＤＧＳＷＦＩＱＳＬＣＡＭＬＫＱＹＡＤＫＬＥＦＭＨＩＬＴＲＶＮＲＫＶＡＴＥＦＥＳＦＳＦＤＡＴＦＨＡＫＫＱＩＰＣＩＶＳＭＬＴＫＥＬＹＦＹＨ
ＴＥＶの認識部位（下線）を有する改変カスパーゼ７（配列番号６）：
ＡＤＤＱＧＣＩＥＥＱＧＶＥＤＳＡＮＥＤＳＶＤＡＫＰＤＲＳＳＦＶＰＳＬＦＳＫＫＫＫＮＶＴＭＲＳＩＫＴＴＲＤＲＶＰＴＹＱＹＮＭＮＦＥＫＬＧＫＣＩＩＩＮＮＫＮＦＤＫＶＴＧＭＧＶＲＮＧＴＤＫＤＡＥＡＬＦＫＣＦＲＳＬＧＦＤＶＩＶＹＮＤＣＳＣＡＫＭＱＤＬＬＫＫＡＳＥＥＤＨＴＮＡＡＣＦＡＣＩＬＬＳＨＧＥＥＮＶＩＹＧＫＤＧＶＴＰＩＫＤＬＴＡＨＦＲＧＤＲＣＫＴＬＬＥＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＲＧＴＥＬＤＤＧＩＱＡＥＮＬＹＦＱＳＧＰＩＮＤＴＤＡＮＰＲＹＫＩＰＶＥＡＤＦＬＦＡＹＳＴＶＰＧＹＹＳＷＲＳＰＧＲＧＳＷＦＶＱＡＬＣＳＩＬＥＥＨＧＫＤＬＥＩＭＱＩＬＴＲＶＮＤＲＶＡＲＨＦＥＳＱＳＤＤＰＨＦＨＥＫＫＱＩＰＣＶＶＳＭＬＴＫＥＬＹＧＦＳＱ
ＴＥＶの認識部位（下線）を有する改変カスパーゼ８（配列番号７）：
ＭＤＳＥＳＱＴＬＤＫＶＹＱＭＫＳＫＰＲＧＹＣＬＩＩＮＮＨＮＦＡＫＡＲＥＫＶＰＫＬＨＳＩＲＤＲＮＧＴＨＬＤＡＧＡＬＴＴＴＦＥＥＬＨＦＥＩＫＰＨＤＤＣＴＶＥＱＩＹＥＩＬＫＩＹＱＬＭＤＨＳＮＭＤＣＦＩＣＣＩＬＳＨＧＤＫＧＩＩＹＧＴＤＧＱＥＡＰＩＹＥＬＴＳＱＦＴＧＬＫＣＰＳＬＡＧＫＰＫＶＦＦＩＱＡＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤＳＥＮＬＹＦＱＧＭＤＬＳＳＰＱＴＲＹＩＰＤＥＡＤＦＬＬＧＭＡＴＶＮＮＣＶＳＹＲＮＰＡＥＧＴＷＹＩＱＳＬＣＱＳＬＲＥＲＣＰＲＧＤＤＩＬＴＩＬＴＥＶＮＹＥＶＳＮＫＤＤＫＫＮＭＧＫＱＭＰＱＰＴＦＴＬＲＫＫＬＶＦＰＳＤ
ＴＥＶの認識部位（下線）を有する改変カスパーゼ１０（配列番号８）：
ＭＤＶＫＴＦＬＥＡＬＰＱＥＳＷＱＮＫＨＡＧＳＮＧＮＲＡＴＮＧＡＰＳＬＶＳＲＧＭＱＧＡＳＡＮＴＬＮＳＥＴＳＴＫＲＡＡＶＹＲＭＮＲＮＨＲＧＬＣＶＩＶＮＮＨＳＦＴＳＬＫＤＲＱＧＴＨＫＤＡＥＩＬＳＨＶＦＱＷＬＧＦＴＶＨＩＨＮＮＶＴＫＶＥＭＥＭＶＬＱＫＱＫＣＮＰＡＨＡＤＧＤＣＦＶＦＣＩＬＴＨＧＲＦＧＡＶＹＳＳＤＥＡＬＩＰＩＲＥＩＭＳＨＦＴＡＬＱＣＰＲＬＡＥＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＱＧＥＥＩＱＰＳＶＳＩＥＡＥＮＬＹＦＱＧＱＡＰＴＳＬＱＤＳＩＰＡＥＡＤＦＬＬＧＬＡＴＶＰＧＹＶＳＦＲＨＶＥＥＧＳＷＹＩＱＳＬＣＮＨＬＫＫＬＶＰＲＭＬＫＦＬＥＫＴＭＥＩＲＧＲＫＲＴＶＷＧＡＫＱＩＳＡＴＳＬＰＴＡＩＳＡＱＴＰＲＰＰＭＲＲＷＳＳＶＳ
したがって、本目標は、作成された特許請求の範囲によって全面的に達成される。

カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型ならびにＴＥＶがともに腫瘍細胞に導入され、発現される（適用可能な場合）とすぐに、ＴＥＶはカスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の活性型を放出し、アポトーシスすなわちプログラム細胞死を通じて細胞死を誘導する。

本発明に用いられるカスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０ならびに、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型を活性型にアンマスキングするために用いられる手段、すなわちＴＥＶという本発明の選択が特に有利である。これらの２つのポリペプチドが腫瘍細胞に含まれるとすぐに、完全に特異的かつ効率的にアンマスキングが進行する。ここで、プロカスパーゼもＴＥＶもヒトまたは哺乳動物に存在しないことが特に有利である。

ＴＥＶは、Ｋａｐｕｓｔらの文献（非特許文献３）で言及されている。ＴＥＶは、タバコエッチウイルス由来の核内封入体ａ（ＮＩａ）プロテアーゼの触媒活性を示す２７ｋＤａのＣ末端ドメインのことをいう（非特許文献４）。このプロテアーゼは、７残基の標的配列ＥＮＬＹＦＱ／Ｓ（式中、「／」は、切断されたペプチド結合を意味する）を認識する。このセリンＰ１’残基は、プロセシングの効率にほとんど影響を与えずにいくつかの他のアミノ酸によって置換されることができる。その非常に厳密な配列特異性のために、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて、ＴＥＶプロテアーゼは、融合タンパク質の調節された細胞内プロセシングのための有用な試薬となる。ヒトプロテオーム中にこの認識配列は存在しないことから、その用途はｉｎｖｉｖｏで比較的非毒性である（非特許文献５）。

したがって、本発明は、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型またはそれをコードする核酸ならびにＴＥＶ（配列番号１もしくは配列番号２）またはそれをコードする核酸を含む、薬物または融合タンパク質に関する。ＴＥＶは、配列番号５または配列番号６または配列番号７または配列番号８のような改変カスパーゼ３および／または改変カスパーゼ７および／または改変カスパーゼ８および／または改変カスパーゼ１０の不活性型における認識部位（認識配列）ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）を認識する。

本発明の好ましい実施形態において、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型は、改変「プロカスパーゼ」（配列番号５または配列番号６または配列番号７または配列番号８）またはそれをコードする核酸である。

本発明の別の好ましい実施形態において、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型は、融合タンパク質またはそれをコードする核酸であり、ここで、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６の群から選択される少なくとも１つの配列は、ＥＮＬＹＦＱ（配列番号３）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）におけるＴＥＶ（たとえば配列番号１または配列番号２）による切断によって得られるかまたは放出される。

したがって、本発明は、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型、すなわち配列番号５、６、７もしくは８を含む融合タンパク質またはそれをコードする核酸に関し、ここで、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６の群から選択される少なくとも１つの配列は、認識配列ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）におけるＴＥＶ（たとえば配列番号１または配列番号２）による切断によって放出される。

したがって、本発明は、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型、すなわち、ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）を含む配列番号５、６、７または８の群から選択される少なくとも１つの配列を含む融合タンパク質またはそれをコードする核酸に関する。任意の他の融合タンパク質を対応する方法で（たとえばＨＩＳタグなどによって）調製することができ、この試料タグは、任意のペプチド、たとえば５０〜１００アミノ酸に置き換えることができる。

当業者は、適切な融合タンパク質を製造および設計することができる（非特許文献６）。実施例も参照のこと。

本発明のさらに好ましい実施形態において、がん細胞のアポトーシス抵抗性は、特にＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ（配列番号１７）およびＸＡＦ１（配列番号１８）の群から選択される抗アポトーシスタンパク質のインヒビターと同時にこの融合タンパク質を送達することによって克服される。

Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯは、ＩＡＰ（前出）の活性に拮抗する、すなわちそれを阻害する機能を有する細胞内タンパク質である。さらに、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯは、プロカスパーゼのタンパク質分解活性化を促進することができるが、成熟カスパーゼの酵素活性も促進することができる。アポトーシス刺激を受けて、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯは、通例ミトコンドリアから放出される。いずれにせよ、この放出は、多くの場合、がん細胞においてＢｃｌ−２によってブロックされる。本発明の他の側面において、サイトゾルにおける直接発現を確実にするために、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯのミトコンドリア標的配列が除去された。

ＸＡＦ１は、正常組織において遍在的に発現されるが、多くのがんにおいて低レベルかまたは検出不能なレベルで存在する。それはＩＡＰを分解し、Ｂａｘの発現を誘導することができる。さらに、ＸＡＦ１は、カスパーゼを阻害することが公知である亜鉛と結合することができる。

さらに好ましい実施形態において、本発明による融合タンパク質は、限定するものではないが、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ（配列番号１７）またはＸＡＦ１（配列番号１８）などの抗アポトーシスタンパク質を含んでもよい。

まさにこのような抗アポトーシスタンパク質を放出するために、図１に説明的に示したように、融合タンパク質は１以上のＴＥＶ認識部位を含んでもよい。このような融合タンパク質の適切な例を配列番号１９に示すが、この例においては、１つのプラスミドにたとえばカスパーゼ３、カスパーゼ７、ＳＭＡＣ、ＸＡＦ１およびＴＥＶが配置され、異なるタンパク質間にＴＥＶ認識部位およびリンカー配列が挿入されている。

本発明の融合タンパク質または配合剤および薬物は、それらに追加される適切な賦形剤および添加剤を含むことができる。適切な添加剤および／または賦形剤は、たとえば生理食塩水、安定剤、プロテイナーゼ阻害薬、ヌクレアーゼ阻害薬などである。

したがって、本発明は、ヒトおよび動物、特に哺乳動物のがんまたは腫瘍性疾患の治療および／または予防における用途または使用のための前述の配合剤または薬物にも関する。

別の好ましい実施形態において、本発明の配合剤または薬物は、遺伝子治療プロセスによって投与される。

遺伝子治療プロセスは、たとえば本発明の核酸とリポソームとの複合体形成によって得ることができる。この目的に適した脂質混合物は、非特許文献７に記載されている。リポソームが生成されると、ＤＮＡはリポソームの表面に正の正味電荷が残存する比率でイオン結合し、ＤＮＡはリポソームと完全に複合体を形成する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）シェルで立体的に安定化されたリポソームは、単核食細胞系（ＭＰＳ）による摂取の明確な減少を示し、血液循環時間の大幅な延長、ＰＥＧ化小胞の凝集の低下およびリポソーム製剤の安定性の改善も示す。ＰＥＧと同様に、直鎖および多分岐ポリグリセロール（ｌＰＧおよびｈｂＰＧ）は優れた生体適合性を示すが、官能基の追加によってさらなる誘導体を形成することが可能である。多分岐ポリグリセロール、直鎖多分岐ＰＥＧ−ｈｂＰＧブロック共重合体およびＰＥＧ−ＰＧランダム共重合体に基づく新規脂質を、コレステロールまたは１，２−ビス−ｎ−アルキルグリセリルエーテルなどの親油性開始剤を用いて、様々なエポキシドモノマーの組み合わせのアニオン重合によって製造した。共脂質（ｃｏｌｉｐｉｄ）として１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ：１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）を用いて、リポソーム膜への新規両親媒性構造体の導入に成功した。

したがって、本発明は、ビヒクルを用いることによる標的細胞、好ましくは腫瘍細胞への送達を含む遺伝子治療プロセスにも関する。

別の実施形態において、このビヒクルは、リポソーム、ナノ粒子またはマイクロ粒子、ウイルス、リポプレックスなどの群から選択することができる（非特許文献８）。

特に好ましい実施形態において、本発明のビヒクルは、腫瘍マーカを認識する表面のリガンドを有する。このようなリガンドの例は、腫瘍マーカに結合することができるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体または共有結合形成性結合体（ｃｏｖａｌｅｎｔｂｉｎｄｅｒ）（アプタマー）である。

最後に、このような提示されている腫瘍マーカは、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原７２−４（ＣＡ７２−４）、がん抗原１２５、がん抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、扁平上皮がん抗原（ＳＣＣ）、サイトケラチンフラグメント（ＣＹＦＲＡ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒトサイログロブリン（ＨＴＧ）、ムチン様がん関連抗原（ＭＣＡ）などに限定されないか、または、特にこれらを含むことができる。図２は、腫瘍マーカの例と、それらが適しているがんとを示す。

したがって、本発明は、配列番号５、６、７または８をコードする核酸を含むカスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型ならびにタバコエッチウイルスプロテアーゼ（たとえば配列番号１または配列番号２）をコードする核酸、特に配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）から選択される少なくとも１つの配列を含む融合タンパク質をコードする核酸を含むカスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型ならびにタバコエッチウイルスプロテアーゼをコードする核酸が、
ｉ．）少なくとも１つのビヒクルに導入され、
ｉｉ．）腫瘍細胞に導入されてそこで発現され、
ｉｉｉ．）カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の活性型を生成し、腫瘍細胞の細胞死を誘導すること
を特徴とする、本発明の薬物または融合タンパク質を導入するためのプロセスにも関する。

このプロセスは、前述の他の実施形態に同様に対応させることができる。本発明の薬物、融合タンパク質および、特にそれらのビヒクルは、好ましくはヒトおよび動物に局所的に、たとえば皮下に、投与することができる。もちろん、本発明は腫瘍治療におけるすべての用途を含む。

本発明の定義によれば、用語「機能的バリアント」は、本発明のペプチドに機能的に関連するポリペプチドまたは核酸を意味すると理解される。用語「バリアント」は、また、対立遺伝子バリアント、または他の生物、細胞または組織由来のポリペプチドおよび核酸を意味すると理解される。

また、より広義には、配列相同性を有するポリペプチドまたは核酸、特に、指定された配列番号との約７０％、好ましくは約８０％、特に好ましくは約９０％、最も好ましくは約９５％の配列同一性を有するポリペプチドまたは核酸を意味すると理解される。

これは、約１〜５０、好ましくは約１〜３０、特に好ましくは約１〜１５、最も好ましくは約１〜６アミノ酸の範囲のポリペプチド欠失も含む。たとえば、最初のアミノ酸は、そのポリペプチドの機能を実質的に変化させることなくメチオニンを欠くことができる。

さらに、これは、本発明の上記ポリペプチドを含む融合タンパク質、すなわちそれぞれの配列番号の機能をすでに有する融合タンパク質それ自身または、融合体の一部分の排除後にのみ特定の機能を獲得することができる融合タンパク質も含む。とりわけ、これは、特に非ヒト配列の成分が約１〜５０、好ましくは約１〜３０アミノ酸である融合タンパク質を含む。非ヒトペプチド配列の例は、原核生物ペプチド配列、たとえば大腸菌ガラクトシダーゼ由来のペプチド配列または、いわゆるヒスチジンタグ、たとえばＭｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ６タグを有するペプチド配列である。いわゆるヒスチジンタグを有する融合タンパク質が適している特に有利な用途は、金属イオン含有カラム、たとえばＮｉ^２＋−ＮＴＡカラムによる発現タンパク質の精製である。ここで、「ＮＴＡ」はキレート剤ニトリロ三酢酸（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン）を表す。

特に、ポリペプチドの該部分は、古典的なペプチド合成（メリフィールド法）を用いて合成することもできる。それらは特に、本発明のポリペプチドの他の機能的バリアントを得るために適切な遺伝子発現ライブラリを検索するのに用いることができる、抗血清を得るのに適している。

好ましい実施形態において、各例において前述した本発明の核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡであり、好ましくは二本鎖ＤＮＡであるが、ＰＮＡまたはそれに類似したものも考えられる。

本発明の核酸は、（発現）ベクター、たとえば構成ＣＭＶプロモーターを備えるベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などによって腫瘍細胞に導入することもできる。

本発明の定義によれば、腫瘍、がん、がん細胞および腫瘍細胞という用語は同義語として解釈されるべきである。これらは、あらゆる良性腫瘍または悪性腫瘍を含み、特に、浮腫、急性および慢性の炎症、動脈瘤肥大（拍動性腫瘤）などによるあらゆる局所腫脹ならびに炎症性器官膨張（たとえばいわゆる脾臓腫瘍の場合）ばかりでなく、概して、様々な重症度の特定の細胞機能および組織機能の低下と関係している、様々な程度に抑制解除された身体自身の組織の自然な増殖、自律的増殖および不可逆的な過剰な増殖の形態での組織新生物（増殖、芽細胞腫、新形成）を含む、局所的に組織量が増加した増殖を含む。（非特許文献９を参照のこと）。
図面および説明：
これらの実施例は、本発明を説明するためだけのものであって、本発明をこれらの実施例に限定するものではない。
実施例：
実施例１
実験データ
カスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ１０、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＯＬＯおよびＸＡＦ１をコードする遺伝子を市販のＥＧＦＰプラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）にクローニングした。蛍光タンパク質ＥＧＦＰは、蛍光顕微鏡法によるタンパク質の可視化を可能にする。異なるタンパク質間にＴＥＶ認識部位（ＥＮＬＹＦＱ／ＳまたはＥＮＬＹＦＱ／Ａ）を挿入した。構造的柔軟性を提供し、それによって切断効率を高めるために、ＴＥＶ認識部位はグリシン／アラニンリンカー配列に隣接している。たとえば配列番号５〜８に示されるように、カスパーゼの天然の切断部位がＴＥＶ認識部位に交換された。

Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、得られたプラスミドを種々の細胞株、たとえばＨＥＫおよびＷＭ３５（黒色腫）にトランスフェクトした。トランスフェクションの１日前に、９６ウェルプレートの各ウェルに１×１０４細胞を播種し、トランスフェクションの日にはおおよそ８０％のコンフルエンスを達成した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスルーエ）を含むチューブにＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を加え、５分間インキュベートした。３：１の試薬対ＤＮＡ比を用いた。ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬／媒体にプラスミドＤＮＡ１００ｎｇを加え、直ちに混合した。室温で１５分間インキュベートした後に、８μｌのトランスフェクション試料を細胞培養培地に加えた。細胞を蛍光顕微鏡法によって分析した。

アポトーシスは、仮足の球形化および収縮、細胞膜破壊ならびにアポトーシス小体の形成によって証明される。
ＨＥＫ細胞：
アポトーシスは、Ｃａｓ３−ＴＥＶ−ＥＧＦＰ、Ｃａｓ７−ＴＥＶ−ＥＧＦＰ、Ｃａｓ３−Ｃａｓ７−ＴＥＶ−ＥＧＦＰ、ＸＡＦ１−Ｓｍａｃ−ＴＥＶ−ＥＧＦＰおよびＣａｓ３−Ｃａｓ７−Ｓｍａｃ−ＴＥＶ−ＥＧＦＰによって誘導される。

健康細胞において、Ｓｍａｃ−ＴＥＶ−ＥＧＦＰおよびＸＡＦ１−ＴＥＶ−ＥＧＦＰはアポトーシスを誘導することができない。
ＷＭ３５細胞：
単一のタンパク質ＴＥＶ構築物は部分的にアポトーシスを誘導することができる。

組み合わせの構築物であるＣａｓ３−Ｃａｓ７−ＴＥＶ−ＥＧＦＰ、ＸＡＦ１−Ｓｍａｃ−ＴＥＶ−ＥＧＦＰおよびＣａｓ３−Ｃａｓ７−Ｓｍａｃ−ＴＥＶ−ＥＧＦＰによって、より優れたアポトーシス誘導が起こる。

図１は、融合ペプチドの実施形態を示す図である。図２は、特定のがん疾患の腫瘍マーカを示す図である。図３は、特定のがん疾患の腫瘍マーカを示す図である。

Claims

がんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物であって、
カスパーゼ３由来の配列番号９、１０および／または
カスパーゼ７由来の配列番号１１、１２および／または
カスパーゼ８由来の配列番号１３、１４および／または
カスパーゼ１０由来の配列番号１５、１６および／または
の群から選択される少なくとも１つの配列を含む融合タンパク質もしくはそれをコードする核酸またはいずれかの機能的バリアントと、
少なくとも１つのタバコエッチウイルスプロテアーゼもしくはそれをコードする核酸またはいずれかの機能的バリアントと、
少なくとも１つの認識部位ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３）もしくはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）またはそれをコードする核酸と、を含む前記薬物において、
前記配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６またはその機能的バリアントが、タバコエッチウイルスプロテアーゼによる切断で放出されることを特徴とする、薬物。
前記融合タンパク質が、配列番号５、６、７もしくは８またはそれをコードする核酸またはいずれかの機能的バリアントを含むことを特徴とする、請求項１に記載のがんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物。
前記融合タンパク質が、配列番号１もしくは２またはそれをコードする核酸またはいずれかの機能的バリアントを含むことを特徴とする、請求項１に記載のがんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物。
前記タバコエッチウイルスプロテアーゼが、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の改変体における前記認識部位ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）を認識し、前記認識部位が、カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の大サブユニットと小サブユニットとの間に連結されている（ライゲーションされている）ことを特徴とする、請求項１に記載のがんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物。
前記融合タンパク質が、抗アポトーシスタンパク質、特にＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ（配列番号１７）またはＸＡＦ１（配列番号１８）を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のがんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物。
請求項１〜５のいずれか一項に記載のがんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物、ならびに場合により賦形剤および添加剤。
ヒトおよび動物の治療に使用するための、請求項６に記載のがんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物。
遺伝子治療プロセスによって投与されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のがんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物。
この遺伝子治療プロセスが、ビヒクルによって実施されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のがんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物。
このビヒクルが、リポソーム、ナノ粒子またはマイクロ粒子、ウイルスおよびリポプレックスの群から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のがんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物。
これらのビヒクルが、腫瘍マーカを認識するリガンドを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のがんまたは腫瘍性疾患の治療に使用するための薬物。
配列番号５、６、７または８をコードする核酸を含むカスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型ならびにタバコエッチウイルスプロテアーゼ（たとえば配列番号１または配列番号２）をコードする核酸、特に配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号３）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）から選択される少なくとも１つの配列を含む融合タンパク質をコードする核酸を含むカスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の不活性型ならびにタバコエッチウイルスプロテアーゼをコードする核酸が、
ｉ．）少なくとも１つのビヒクルに導入され、
ｉｉ．）腫瘍細胞に導入されてそこで発現され、
ｉｉｉ．）カスパーゼ３および／またはカスパーゼ７および／またはカスパーゼ８および／またはカスパーゼ１０の活性型を生成し、前記腫瘍細胞の細胞死を誘導すること
を特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬物を導入するためのプロセス。