JP2020116530A - 多孔質ジルコニア粒子及びタンパク質固定用凝集体 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、特許文献1では、この目的のために多孔質ジルコニア粒子を採用した技術が開示されている。この技術では、多孔質ジルコニア粒子の表面に、タンパク質を吸着させるリガンドとしてのプロテインAを結合させることで、選択性(特異性)を向上させている。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、安価であり、しかも、特定タンパク質を固定する特異性が高い多孔質ジルコニア粒子を提供することを目的とする。本発明は、以下の形態として実現することが可能である。
BET法により測定された孔径分布において、
累積細孔容積が全細孔容積の50%となる細孔径D50が3.20nm以上6.50nm以下であり、
累積細孔容積が全細孔容積の90%となる細孔径D90が10.50nm以上100.00nm以下であるとともに、
全細孔容積が0.10cm3/gより大きいことを特徴とする多孔質ジルコニア粒子。
本発明の多孔質ジルコニア粒子は、固定されるタンパク質が、免疫グロブリンである場合には、選択性が非常に高い。
本発明の多孔質ジルコニア粒子は、固定されるタンパク質が、IgG、IgE、及びIgDからなる群より選択される少なくとも1種である場合には、選択性が極めて高い。
本発明の多孔質ジルコニア粒子の表面に、キレート剤が担持されていると、選択性がより高まる。
本発明の多孔質ジルコニア粒子が凝集してなるタンパク質固定用凝集体は、安価であり、しかも選択性が高い。
本発明の多孔質ジルコニア粒子は、タンパク質の固定に用いられるタンパク質固定用の多孔質ジルコニア粒子である。
(1)D50、D90、及び全細孔容積
多孔質ジルコニア粒子は、BET法により測定された孔径分布において、累積細孔容積が全細孔容積の50%となる細孔径D50が3.20nm以上6.50nm以下であり、累積細孔容積が全細孔容積の90%となる細孔径D90が10.50nm以上100.00nm以下である。細孔径D50は、3.35nm以上6.30nm以下であることが好ましく、3.50nm以上5.00nm以下であることがより好ましい。細孔径D90は、10.80nm以上50.00nm以下であることが好ましく、11.00nm以上30.00nm以下であることがより好ましい。
多孔質ジルコニア粒子は、全細孔容積が0.10cm3/gより大きい。全細孔容積は、0.15cm3/gより大きいことが好ましく、0.30cm3/gより大きいことがより好ましい。なお、全細孔容積の上限値は、特に限定されないが、通常10cm3/gである。
D50、D90、及び全細孔容積が上記範囲内であると、吸着するタンパク質の選択性が高くなる。なお、D90を100.00nm以下とすることで、タンパク質の単量体が選択的に固定されやすくなる。タンパク質の単量体は10nm程度の大きさであり、他方、タンパク質の凝集体は100nm程度の大きさである。よって、D90を100.00nm以下とすることで、タンパク質の凝集体の固定を避けて、タンパク質の単量体のみが固定されやすくなる。
孔径分布と細孔容積は、例えば、細孔分布測定装置(マイクロメリティックス 自動比表面積/細孔分布測定装置(TriStarII 島津製作所))を用いて測定できる。
ここで、この算出方法について説明する。
D50の算出方法を説明する。まず、孔径分布のデータから、累積細孔容積50%を挟んで、累積細孔容積50%に最も近い2点であるA,Bの累積細孔容積(X(%))及び細孔径(Y(nm))を読み取る。具体的には、A(Xa(%)、Ya(nm))、B(Xb(%)、Yb(nm))を読み取る(但し、Xa>Xb,Ya>Ybである)。そして、これらの値を用いて下記式(1)によりD50が求められる。
式(1)
D50=log(Xb)+((log(Xa)-log(Xb))*[(50-(Yb))/((Ya)-(Yb))]
同様にして、D90を求める。すなわち、まず、孔径分布のデータから、累積細孔容積90%を挟んで、累積細孔容積90%に最も近い2点であるC,Dの累積細孔容積(X(%))及び細孔径(Y(nm))を読み取る。具体的には、C(Xc(%)、Yc(nm))、D(Xd(%)、Yd(nm))を読み取る(但し、Xc>Xd,Yc>Ydである)。そして、これらの値を用いて下記式(2)によりD90が求められる。
式(2)
D90=log(Xd)+((log(Xc)-log(Xd))*[(90-(Yd))/((Yc)-(Yd))]
多孔質ジルコニア粒子の粒子径は特に限定されないが、一次粒子は、通常10nm〜100nmであり、好ましくは、10nm〜50nmであり、さらに好ましくは10nm〜30nmである。一次粒子径が、この範囲内であると、多孔質ジルコニア粒子の比表面積が大幅に増大するため、タンパク質の固定量が増加する傾向にある。
固定の対象となるタンパク質は、特に限定されない。本発明の多孔質ジルコニア粒子は、免疫グロブリン、特に、IgG、IgE、及びIgDからなる群より選択される少なくとも1種を選択的に固定することに優れている。
なお、本発明において、「固定」とは、物理的固定と、化学的固定を含む。本発明の多孔質ジルコニア粒子は、その細孔内でのタンパク質の固定に、毛細管現象によりタンパク質が挿入される物理的固定と、ジルコニア表面に共有結合などの化学結合を利用した化学的固定を利用しており、高いタンパク質固定能を有している。
多孔質ジルコニア粒子の表面には、キレート剤が担持されていてもよい。キレート剤を担持することで、選択性がより高まる。
キレート剤は、特に限定されない。キレート剤として、下記一般式(1)で表される化合物、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DETPA)、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸(DETPPA)、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。なお、塩としては、例えば、アルカリ金属(ナトリウム等)の塩が好適に例示される。
(一般式(1)中、R1は炭素数1〜10のアルキレン基である。また、R2〜R5は炭素数1〜10のアルキレン基であり、互いに同一であっても異なっていてもよい。)
また、R2〜R5における炭素数1〜10のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、イソブチレン基等が例示される。
なお、キレート剤の担持量は、TG−DTA(熱重量示差熱分析)の重量減少から算出できる。
タンパク質固定用凝集体は、多孔質ジルコニア粒子が凝集してなる。タンパク質固定用凝集体の径(サイズ)は、特に限定されない。
凝集体の径は、通常50nm〜20000nmであり、好ましくは、100nm〜15000nmであり、さらに好ましくは500nm〜10000nmである。凝集体の径が、この範囲内であると、遠心法による沈殿分離が容易であり、精製プロセス全体の低コスト化が図れる。また、カラムとして使用する場合は、20μm〜100μmに造粒してもよい。
多孔質ジルコニア粒子の製造方法は、特に限定されない。多孔質ジルコニア粒子は、例えば、次の方法によって製造できる。ジルコンを原料として、オキシ塩化ジルコニウム(ZrOCl2・8H2O)溶液を得る。そして、加水分解反応により、Zr(OH)4微粒子とし、これを焼成して、多孔質ジルコニア粒子とする。
1.実験A
(1)多孔質ジルコニア粒子
多孔質ジルコニア粒子には、表1に記載の多孔質ジルコニア粒子を用いた。
なお、実験例1〜9が実施例に相当し、実験例10〜17は比較例である。比較例については、表1において、実験例の番号を示す数字の後に「10*」のように「*」を付している。
孔径分布と細孔容積(全細孔容積)は、マイクロメリティックス 自動比表面積/細孔分布測定装置(TriStarII 島津製作所)を用いて測定した。各多孔質ジルコニア粒子)を50mg程度秤量し、80℃で3時間脱気乾燥した物を試料として用いた。各値は、窒素吸着実験からBET法により算出した。
D50、D90は、「発明を実施するための形態」の欄における「1.(1)D50、D90、及び全細孔容積」に記載の方法で算出した。
各多孔質ジルコニア粒子に対して、それぞれ次のようにして、IgGを固定し、固定されたIgG量を求めた。
多孔質ジルコニア粒子へのIgGの固定は、以下のように行った。スピッツに500μLの10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を入れて、この液に多孔質ジルコニア粒子3mgを加えた。多孔質ジルコニア粒子を十分に分散させた後、IgG(500μg/500μL)を500μL加えて、遮光下、4℃で一晩撹拌した。
スピッツを、12,000回転で10分間遠心して、多孔質ジルコニア粒子を沈殿分離した。上澄み溶液に残存する未固定のIgG量を、プロテインアッセイ染色液(BIO−RAD)を用い、マイクロプレートリーダー(InfiniteF200PRO,TECAN)により定量した。始めに加えたIgG量と、未固定のIgG量との差分を固定されたIgG量とした。
図2に実験例3(実施例)の孔径分布(細孔分布)を示す。図3に実験例13(比較例)の孔径分布(細孔分布)を示す。図2から実験例3では、D50が3.20nm以上6.50nm以下であり、かつD90が10.50nm以上100.00nm以下であることが分かる。他方、図3から実験例13では、D50が3.20nm以上6.50nm以下であり、D90が10.50nm未満であることが分かる。
表1に結果を併記する。実施例である実験例1〜9は、次の〔1〕〜〔3〕の全ての要件を満たしている。
〔1〕細孔径D50が3.20nm以上6.50nm以下である。
〔2〕細孔径D90が10.50nm以上100.00nm以下である。
〔3〕全細孔容積が0.10cm3/gより大きい。
これに対して、比較例である実験例10〜17は以下の要件を満たしていない。
実験例10では、〔2〕〔3〕の要件を満たしてない。
実験例11では、〔2〕〔3〕の要件を満たしてない。
実験例12では、〔2〕〔3〕の要件を満たしてない。
実験例13では、〔2〕〔3〕の要件を満たしてない。
実験例14では、〔2〕〔3〕の要件を満たしてない。
実験例15では、〔2〕の要件を満たしてない。
実験例16では、〔1〕〔2〕の要件を満たしてない。
実験例17では、〔2〕〔3〕の要件を満たしてない。
実施例である実験例1〜9は、比較例である実験例10〜17と比べて、優れたタンパク質固定能を示した。
IgGの最大固定量を測定するため、実施例Aと同様の操作にて、投入するIgGの量を増したIgG(750μg/500μL)を用い、これを500μL加えて、実験Bを実施した。実験Bは、IgGの投入量以外は、実験Aと同様に実施した。
表2に実験結果を示す。
次に、キレート剤としてのエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸(EDTPA)の担持が、タンパク質の選択性に与える影響について検討した。
多孔質ジルコニア粒子には、表3に記載の次の多孔質ジルコニア粒子を用いた。
表3において、「RC100」は、第一稀元素化学工業株式会社製の多孔質ジルコニア粒子であり、表1の実験例6と同じである。「UEP100」は、第一稀元素化学工業株式会社製の多孔質ジルコニア粒子であり、表1の実験例2と同じである。
表3において、「RC100−P(0.00125M)」は、第一稀元素化学工業株式会社製の多孔質ジルコニア粒子(RC100、原料)を、0.00125MのEDTPA溶液で処理して得られたEDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子である。
表3において、「UEP100−P(0.00125M)」は、第一稀元素化学工業株式会社製の多孔質ジルコニア粒子(UEP100)を、0.00125MのEDTPA溶液で処理して得られたEDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子である。
なお、「RC100−P(0.00125M)」の調製は以下のように行った。予め100℃で2時間、脱気乾燥した多孔質ジルコニア粒子(RC100)250mgに対し、0.00125MのEDTPA溶液を10mL加え、15分脱気後、17時間、攪拌及び/又は振とうした。その後、更に、4時間還流した後、純水で洗浄し、凍結乾燥して、RC100−P(0.00125M)を得た。
「UEP100−P(0.00125M)」の調製も「RC100−P(0.00125M)」と同様に行った。すなわち、原料として「RC100」の代わりに「UEP100」を用いた以外は、「RC100−P(0.00125M)」の場合と同様にして「UEP100−P(0.00125M)」を調製した。
また、EDTPA溶液の濃度を0.00125M、0.0025M、0.005M、0.01Mに変化させた以外は、RC100−P(0.00125M)と同様に行い、計4種のPCS140(SD)P(EDTA濃度)を調整した。
なお、EDTPAの担持量は、TG−DTA(熱重量示差熱分析)の重量減少から算出した。すなわち、EDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子を10mg程度秤量し、常温〜1000℃までの重量変化を測定しつつ、示差熱分析(TG−DTA;Thermo plus TG8120,リガク)を行った。200℃〜600℃での重量減少量から算出した結果、多孔質ジルコニア粒子1mgあたり0.06μg〜2.2μgのEDTPAを担持していた。
多孔質ジルコニア粒子(RC100、UEP100)、EDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子(RC100−P、UEP100−P)を用いて、タンパク質の選択性試験を実施した。
上記4種の各多孔質ジルコニア粒子について、IgG、HAS(Albumin from human serum)、Trf(Transferrin human)の3種のタンパク質に対して、それぞれ次の試験を実施した。
スピッツに500μLの10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を入れて、この液に多孔質ジルコニア粒子3mgを加えた。多孔質ジルコニア粒子を十分に分散させた後、タンパク質(500μg/500μL)を500μL加えて、遮光下、4℃で一晩撹拌した。
スピッツを、14,000回転で5分間遠心して、多孔質ジルコニア粒子を沈殿分離した。上澄み溶液に残存する未固定のタンパク質の量を、プロテインアッセイ染色液(BIO−RAD)を用い、マイクロプレートリーダー(InfiniteF200PRO,TECAN)により定量した。始めに加えたタンパク質の量と、未固定のタンパク質の量との差分を固定されたタンパク質の量とした。
表3に結果を示す。
まず、多孔質ジルコニア粒子RC100、及びEDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子RC100−Pの結果を考察する。
多孔質ジルコニア粒子RC100には、IgGの他にも、HAS、Trfが固定されることが確認された。
他方、EDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子RC100−Pには、IgGは固定されるが、HAS、Trfは固定されないことが確認された。
この結果から、多孔質ジルコニア粒子RC100にEDTPAを担持して、EDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子RC100−Pとすることで、IgGの選択特異性が向上することが分かる。
次に、多孔質ジルコニア粒子UEP100、及びEDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子UEP100−Pの結果を考察する。
多孔質ジルコニア粒子UEP100には、IgGの他にも、HAS、Trfが固定されることが確認された。HASの固定量は、64.3μgであり、Trfの固定量は、28.5μgであった。
他方、EDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子UEP100−Pには、IgGの他にHASが固定されるが、HASの固定量は4.1μgであった。このHASの固定量4.1μgは、多孔質ジルコニア粒子UEP100の場合の64.3μgよりも格段に少なくなっていた。また、EDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子UEP100−Pには、Trfは固定されないことが確認された。
この結果から、多孔質ジルコニア粒子UEP100にEDTPAを担持して、EDTPA担持の多孔質ジルコニア粒子UEP100−Pとすることで、IgGの選択特異性が向上することが分かる。
D50、D90、及び全細孔容積が特定範囲内にある多孔質ジルコニア粒子は、タンパク質の一例としてのIgGを選択的に固定できる。
多孔質ジルコニア粒子の表面に、キレート剤の一例としてのEDTPAが担持されていると、選択性がより高まる。
なお、この発明は上記の実施例や実施形態に限られるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々の態様において実施することが可能である。
Claims (5)
- タンパク質の固定に用いられる多孔質ジルコニア粒子であって、
BET法により測定された孔径分布において、
累積細孔容積が全細孔容積の50%となる細孔径D50が3.20nm以上6.50nm以下であり、
累積細孔容積が全細孔容積の90%となる細孔径D90が10.50nm以上100.00nm以下であるとともに、
全細孔容積が0.10cm3/gより大きいことを特徴とする多孔質ジルコニア粒子。 - 前記タンパク質は、免疫グロブリンであることを特徴とする請求項1に記載の多孔質ジルコニア粒子。
- 前記免疫グロブリンは、IgG、IgE、及びIgDからなる群より選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求項2に記載の多孔質ジルコニア粒子。
- 表面に、キレート剤が担持されていることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の多孔質ジルコニア粒子。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の多孔質ジルコニア粒子が凝集してなることを特徴とするタンパク質固定用凝集体。
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