KR20210109623A - 다공질 지르코니아 입자 및 단백질 고정용 응집체 - Google Patents
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Abstract
특정 단백질을 고정시키는 특이성이 높은 다공질 지르코니아 입자를 제공한다. 단백질의 고정에 사용되는 다공질 지르코니아 입자이다. BET 법에 의해 측정된 공경 분포에 있어서, 누적 세공 용적이 전체 세공 용적의 50 ％ 가 되는 세공경 D50 이 3.20 ㎚ 이상 6.50 ㎚ 이하이고, 누적 세공 용적이 전체 세공 용적의 90 ％ 가 되는 세공경 D90 이 10.50 ㎚ 이상 100.00 ㎚ 이하이다. 전체 세공 용적은, 0.10 ㎤/g 보다 크다.
Description
본 발명은 다공질 지르코니아 입자 및 단백질 고정용 응집체에 관한 것이다.
특정한 단백질을 선택적으로 흡착시킴으로써, 특정 단백질을 분리 정제하는 칼럼이 검토되고 있다.
예를 들어, 특허문헌 1 에서는, 이 목적을 위해 다공질 지르코니아 입자를 채용한 기술이 개시되어 있다. 이 기술에서는, 다공질 지르코니아 입자의 표면에, 단백질을 흡착시키는 리간드로서의 프로테인 A 를 결합시킴으로써, 선택성 (특이성) 을 향상시키고 있다.
그러나, 특허문헌 1 의 기술은, 프로테인 A 를 사용하고 있기 때문에, 비용이 비싸다는 과제가 있었다.
본 발명은, 상기 실정을 감안하여 이루어진 것으로, 저렴하고, 게다가 특정 단백질을 고정시키는 특이성이 높은 다공질 지르코니아 입자를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 이하의 형태로서 실현하는 것이 가능하다.
〔1〕단백질의 고정에 사용되는 다공질 지르코니아 입자로서,
BET 법에 의해 측정된 공경 분포에 있어서,
누적 세공 용적이 전체 세공 용적의 50 ％ 가 되는 세공경 D50 이 3.20 ㎚ 이상 6.50 ㎚ 이하이고,
누적 세공 용적이 전체 세공 용적의 90 ％ 가 되는 세공경 D90 이 10.50 ㎚ 이상 100.00 ㎚ 이하임과 함께,
전체 세공 용적이 0.10 ㎤/g 보다 큰 것을 특징으로 하는 다공질 지르코니아 입자.
〔2〕상기 단백질은, 면역 글로불린인 것을 특징으로 하는〔1〕에 기재된 다공질 지르코니아 입자.
〔3〕상기 면역 글로불린은, IgG, IgE, 및 IgD 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 것을 특징으로 하는〔2〕에 기재된 다공질 지르코니아 입자.
〔4〕표면에, 킬레이트제가 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 〔1〕∼〔3〕중 어느 한 항에 기재된 다공질 지르코니아 입자.
〔5〕〔1〕∼〔4〕중 어느 한 항에 기재된 다공질 지르코니아 입자가 응집하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질 고정용 응집체.
본 발명의 단백질 고정용의 다공질 지르코니아 입자는, 리간드로서 프로테인을 사용하고 있지 않기 때문에, 저비용이다. 게다가, 본 발명의 다공질 지르코니아 입자는, D50, D90, 및 전체 세공 용적이 특정 범위 내에 있기 때문에, 선택성 (특이성) 이 높다.
본 발명의 다공질 지르코니아 입자는, 고정되는 단백질이, 면역 글로불린인 경우에는, 선택성이 매우 높다.
본 발명의 다공질 지르코니아 입자는, 고정되는 단백질이, IgG, IgE, 및 IgD 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 경우에는, 선택성이 매우 높다.
본 발명의 다공질 지르코니아 입자의 표면에, 킬레이트제가 담지되어 있으면, 선택성이 보다 높아진다.
본 발명의 다공질 지르코니아 입자가 응집하여 이루어지는 단백질 고정용 응집체는, 저렴하고, 게다가 선택성이 높다.
도 1 은, 에틸렌디아민테트라메틸렌포스폰산 (EDTPA) 의 추정 담지 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2 는, 실험예 3 (실시예) 의 공경 분포 (세공 분포) 를 나타내는 그래프이다.
도 3 은, 실험예 13 (비교예) 의 공경 분포 (세공 분포) 를 나타내는 그래프이다.
도 2 는, 실험예 3 (실시예) 의 공경 분포 (세공 분포) 를 나타내는 그래프이다.
도 3 은, 실험예 13 (비교예) 의 공경 분포 (세공 분포) 를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 또한, 본 명세서에 있어서, 수치 범위에 대해「∼」를 사용한 기재에서는, 특히 언급이 없는 한, 하한값 및 상한값을 포함하는 것으로 한다. 예를 들어,「10 ∼ 20」이라는 기재에서는, 하한값인「10」, 상한값인「20」중 어느 것도 포함하는 것으로 한다. 즉,「10 ∼ 20」은,「10 이상 20 이하」와 동일한 의미이다.
1. 다공질 지르코니아 입자
본 발명의 다공질 지르코니아 입자는, 단백질의 고정에 사용되는 단백질 고정용의 다공질 지르코니아 입자이다.
(1) D50, D90, 및 전체 세공 용적
다공질 지르코니아 입자는, BET 법에 의해 측정된 공경 분포에 있어서, 누적 세공 용적이 전체 세공 용적의 50 ％ 가 되는 세공경 D50 이 3.20 ㎚ 이상 6.50 ㎚ 이하이고, 누적 세공 용적이 전체 세공 용적의 90 ％ 가 되는 세공경 D90 이 10.50 ㎚ 이상 100.00 ㎚ 이하이다. 세공경 D50 은, 3.35 ㎚ 이상 6.30 ㎚ 이하인 것이 바람직하고, 3.50 ㎚ 이상 5.00 ㎚ 이하인 것이 보다 바람직하다. 세공경 D90 은, 10.80 ㎚ 이상 50.00 ㎚ 이하인 것이 바람직하고, 11.00 ㎚ 이상 30.00 ㎚ 이하인 것이 보다 바람직하다.
다공질 지르코니아 입자는, 전체 세공 용적이 0.10 ㎤/g 보다 크다. 전체 세공 용적은, 0.15 ㎤/g 보다 큰 것이 바람직하고, 0.30 ㎤/g 보다 큰 것이 보다 바람직하다. 또한, 전체 세공 용적의 상한값은, 특별히 한정되지 않지만, 통상적으로 10 ㎤/g 이다.
D50, D90, 및 전체 세공 용적이 상기 범위 내이면, 흡착하는 단백질의 선택성이 높아진다. 또한, D90 을 100.00 ㎚ 이하로 함으로써, 단백질의 단량체가 선택적으로 고정되기 쉬워진다. 단백질의 단량체는 10 ㎚ 정도의 크기이고, 한편, 단백질의 응집체는 100 ㎚ 정도의 크기이다. 따라서, D90 을 100.00 ㎚ 이하로 함으로써, 단백질의 응집체의 고정을 피하여, 단백질의 단량체만이 고정되기 쉬워진다.
(2) 측정 장치, 및 D50, D90 의 산출 방법
공경 분포와 세공 용적은, 예를 들어, 세공 분포 측정 장치 (마이크로메리틱스 자동 비표면적/세공 분포 측정 장치 (TriStarII 시마즈 제작소)) 를 사용하여 측정할 수 있다.
여기서, 이 산출 방법에 대해 설명한다.
D50 의 산출 방법을 설명한다. 먼저, 공경 분포의 데이터로부터, 누적 세공 용적 50 ％ 를 사이에 두고, 누적 세공 용적 50 ％ 에 가장 가까운 2 점인 A, B 의 누적 세공 용적 (X (％)) 및 세공경 (Y (㎚)) 을 판독한다. 구체적으로는, A (Xa (％), Ya (㎚)), B (Xb (％), Yb (㎚)) 를 판독한다 (단, Xa ＞ Xb, Ya ＞ Yb 이다). 그리고, 이들 값을 사용하여 하기 식 (1) 에 의해 D50 이 구해진다.
식 (1)
D50=log(Xb)+((log(Xa)-log(Xb))*[(50-(Yb))/((Ya)-(Yb))]
동일하게 하여, D90 을 구한다. 즉, 먼저, 공경 분포의 데이터로부터, 누적 세공 용적 90 ％ 를 사이에 두고, 누적 세공 용적 90 ％ 에 가장 가까운 2 점인 C, D 의 누적 세공 용적 (X (％)) 및 세공경 (Y (㎚)) 을 판독한다. 구체적으로는, C (Xc (％), Yc (㎚)), D (Xd (％), Yd (㎚)) 를 판독한다 (단, Xc ＞ Xd, Yc ＞ Yd 이다). 그리고, 이들 값을 사용하여 하기 식 (2) 에 의해 D90 이 구해진다.
식 (2)
D90=log(Xd)+((log(Xc)-log(Xd))*[(90-(Yd))/((Yc)-(Yd))]
(3) 입자경
다공질 지르코니아 입자의 입자경은 특별히 한정되지 않지만, 1 차 입자는, 통상적으로 10 ㎚ ∼ 100 ㎚ 이고, 바람직하게는 10 ㎚ ∼ 50 ㎚ 이고, 더욱 바람직하게는 10 ㎚ ∼ 30 ㎚ 이다. 1 차 입자경이 이 범위 내이면, 다공질 지르코니아 입자의 비표면적이 대폭 증대되기 때문에, 단백질의 고정량이 증가하는 경향이 있다.
2. 단백질
고정의 대상이 되는 단백질은, 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 다공질 지르코니아 입자는, 면역 글로불린, 특히, IgG, IgE, 및 IgD 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 선택적으로 고정시키는 것이 우수하다.
또한, 본 발명에 있어서,「고정」이란, 물리적 고정과, 화학적 고정을 포함한다. 본 발명의 다공질 지르코니아 입자는, 그 세공 내에서의 단백질의 고정에, 모세관 현상에 의해 단백질이 삽입되는 물리적 고정과, 지르코니아 표면에 공유 결합 등의 화학 결합을 이용한 화학적 고정을 이용하고 있으며, 높은 단백질 고정능을 갖고 있다.
3. 킬레이트제
다공질 지르코니아 입자의 표면에는, 킬레이트제가 담지되어 있어도 된다. 킬레이트제를 담지함으로써, 선택성이 보다 높아진다.
킬레이트제는, 특별히 한정되지 않는다. 킬레이트제로서, 하기 일반식 (1) 로 나타내는 화합물, 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민오아세트산 (DETPA), 디에틸렌트리아민펜타메틸렌포스폰산 (DETPPA), 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 것이 바람직하다. 또한, 염으로는, 예를 들어, 알칼리 금속 (나트륨 등) 의 염이 바람직하게 예시된다.
[화학식 1]
(일반식 (1) 중, R1 은 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기이다. 또, R2 ∼ R5 는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기이고, 서로 동일해도 되고 상이해도 된다.)
일반식 (1) 의 R1 에 있어서의 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기로는, 예를 들어, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 헥사메틸렌기, 이소부틸렌기 등이 예시된다.
또, R2 ∼ R5 에 있어서의 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기로는, 예를 들어, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 헥사메틸렌기, 이소부틸렌기 등이 예시된다.
킬레이트제로는, 면역 글로불린에 대한 선택성을 보다 높인다는 관점에서, 일반식 (1) 로 나타내는 화합물이 바람직하다. 일반식 (1) 로 나타내는 화합물 중에서도, 에틸렌디아민테트라메틸렌포스폰산 (EDTPA ; N,N,N',N'-Ethylenediaminetetrakis(methylenephosphonic Acid)) 이 특히 바람직하다.
킬레이트제의 담지량은, 특별히 한정되지 않는다. 킬레이트제의 담지량은, 면역 글로불린에 대한 선택성을 보다 높인다는 관점에서, 지르코니아 1 ㎎ 당, 0.01 ㎍ ∼ 10 ㎍ 인 것이 바람직하고, 0.02 ㎍ ∼ 5 ㎍ 인 것이 보다 바람직하고, 0.05 ㎍ ∼ 3 ㎍ 인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 킬레이트제의 담지량은, TG-DTA (열중량 시차열 분석) 의 중량 감소로부터 산출할 수 있다.
킬레이트제의 담지 양태는, 분명하지는 않지만, 지르코늄 원자에, 킬레이트 제에서 유래하는 배위자가 결합되어 있는 것으로 추측된다. 예를 들어, 킬레이트제가 에틸렌디아민테트라메틸렌포스폰산인 경우에는, 도 1 의 구조인 것으로 추측된다.
4. 단백질 고정용 응집체
단백질 고정용 응집체는, 다공질 지르코니아 입자가 응집하여 이루어진다. 단백질 고정용 응집체의 직경 (사이즈) 은, 특별히 한정되지 않는다.
응집체의 직경은, 통상적으로 50 ㎚ ∼ 20000 ㎚ 이고, 바람직하게는 100 ㎚ ∼ 15000 ㎚ 이고, 더욱 바람직하게는 500 ㎚ ∼ 10000 ㎚ 이다. 응집체의 직경이 이 범위 내이면, 원심법에 의한 침전 분리가 용이하고, 정제 프로세스 전체의 저비용화를 도모할 수 있다. 또, 칼럼으로서 사용하는 경우에는, 20 ㎛ ∼ 100 ㎛ 로 조립해도 된다.
5. 다공질 지르코니아 입자의 제조 방법
다공질 지르코니아 입자의 제조 방법은, 특별히 한정되지 않는다. 다공질 지르코니아 입자는, 예를 들어, 다음의 방법에 의해 제조할 수 있다. 지르콘을 원료로 하여, 옥시염화지르코늄 (ZrOCl2·8H2O) 용액을 얻는다. 그리고, 가수 분해 반응에 의해, Zr(OH)4 미립자로 하고, 이것을 소성하여, 다공질 지르코니아 입자로 한다.
실시예
실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
1. 실험 A
(1) 다공질 지르코니아 입자
다공질 지르코니아 입자에는, 표 1 에 기재된 다공질 지르코니아 입자를 사용하였다.
또한, 실험예 1 ∼ 9 가 실시예에 상당하고, 실험예 10 ∼ 17 은 비교예이다. 비교예에 대해서는, 표 1 에 있어서, 실험예의 번호를 나타내는 숫자 뒤에「10*」와 같이「*」를 붙였다.
표 1 에 있어서,「신닛폰 전공」은「신닛폰 전공 주식회사」,「다이이치 희원소」는「다이이치 희원소 화학 공업 주식회사」,「쿄리츠 머테리얼」은「쿄리츠 머테리얼 주식회사」,「마루미 도료」는「마루미 도료 주식회사」,「토소」는「토소 주식회사」,「Zir Chrom」는「Zir Chrom Seperations Inc.」,「알드리치」는「시그마 알드리치 재팬」,「신에츠 화학」은「신에츠 화학 공업 주식회사」를 각각 의미한다.
(2) 공경 분포와 세공 용적
공경 분포와 세공 용적 (전체 세공 용적) 은, 마이크로메리틱스 자동 비표면적/세공 분포 측정 장치 (TriStarII 시마즈 제작소) 를 사용하여 측정하였다. 각 다공질 지르코니아 입자를 50 ㎎ 정도 칭량하고, 80 ℃ 에서 3 시간 탈기 건조시킨 것을 시료로서 사용하였다. 각 값은, 질소 흡착 실험으로부터 BET 법에 의해 산출하였다.
D50, D90 은,「발명을 실시하기 위한 구체적인 내용」의 란에 있어서의「1. (1) D50, D90, 및 전체 세공 용적」에 기재된 방법으로 산출하였다.
(3) IgG 의 고정, 및 IgG 량의 측정
각 다공질 지르코니아 입자에 대해, 각각 다음과 같이 하여, IgG 를 고정시키고, 고정된 IgG 량을 구하였다.
다공질 지르코니아 입자에 대한 IgG 의 고정은, 이하와 같이 실시하였다. 스피츠에 500 ㎕ 의 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 을 넣고, 이 액에 다공질 지르코니아 입자 3 ㎎ 을 첨가하였다. 다공질 지르코니아 입자를 충분히 분산시킨 후, IgG (500 ㎍/500 ㎕) 를 500 ㎕ 첨가하여, 차광하, 4 ℃ 에서 하룻밤 교반하였다.
스피츠를, 12,000 회전으로 10 분간 원심하여, 다공질 지르코니아 입자를 침전 분리하였다. 상청 용액에 잔존하는 미고정의 IgG 량을, 프로테인 어세이 염색액 (BIO-RAD) 을 사용하여, 마이크로플레이트 리더 (InfiniteF200PRO, TECAN) 에 의해 정량하였다. 처음에 첨가한 IgG 량과, 미고정의 IgG 량의 차분을 고정된 IgG 량으로 하였다.
(4) 실험 결과
도 2 에 실험예 3 (실시예) 의 공경 분포 (세공 분포) 를 나타낸다. 도 3 에 실험예 13 (비교예) 의 공경 분포 (세공 분포) 를 나타낸다. 도 2 로부터 실험예 3 에서는, D50 이 3.20 ㎚ 이상 6.50 ㎚ 이하이고, 또한 D90 이 10.50 ㎚ 이상 100.00 ㎚ 이하인 것을 알 수 있다. 한편, 도 3 으로부터 실험예 13 에서는, D50 이 3.20 ㎚ 이상 6.50 ㎚ 이하이고, D90 이 10.50 ㎚ 미만인 것을 알 수 있다.
표 1 에 결과를 병기한다. 실시예인 실험예 1 ∼ 9 는, 다음의〔1〕∼〔3〕의 모든 요건을 만족하고 있다.
〔1〕세공경 D50 이 3.20 ㎚ 이상 6.50 ㎚ 이하이다.
〔2〕세공경 D90 이 10.50 ㎚ 이상 100.00 ㎚ 이하이다.
〔3〕전체 세공 용적이 0.10 ㎤/g 보다 크다.
이에 반해, 비교예인 실험예 10 ∼ 17 은 이하의 요건을 만족하고 있지 않다.
실험예 10 에서는,〔2〕〔3〕의 요건을 만족하고 있지 않다.
실험예 11 에서는,〔2〕〔3〕의 요건을 만족하고 있지 않다.
실험예 12 에서는,〔2〕〔3〕의 요건을 만족하고 있지 않다.
실험예 13 에서는,〔2〕〔3〕의 요건을 만족하고 있지 않다.
실험예 14 에서는,〔2〕〔3〕의 요건을 만족하고 있지 않다.
실험예 15 에서는,〔2〕의 요건을 만족하고 있지 않다.
실험예 16 에서는,〔1〕〔2〕의 요건을 만족하고 있지 않다.
실험예 17 에서는,〔2〕〔3〕의 요건을 만족하고 있지 않다.
실시예인 실험예 1 ∼ 9 는, 비교예인 실험예 10 ∼ 17 과 비교하여, 우수한 단백질 고정능을 나타냈다.
2. 실험 B
IgG 의 최대 고정량을 측정하기 위해, 실시예 A 와 동일한 조작으로, 투입하는 IgG 의 양을 늘린 IgG (750 ㎍/500 ㎕) 를 사용하고, 이것을 500 ㎕ 첨가하여, 실험 B 를 실시하였다. 실험 B 는, IgG 의 투입량 이외에는, 실험 A 와 동일하게 실시하였다.
표 2 에 실험 결과를 나타낸다.
전체 세공 용적이 0.2 ㎤/g 이상인 다공질 지르코니아 입자 (실험예 1, 2, 4, 5, 7) 에서는, IgG 의 주입량 (투입량) 이 500 ㎍ 인 경우보다, IgG 의 주입량 (투입량) 이 750 ㎍ 인 경우 쪽이, 보다 많은 IgG 를 고정시킬 수 있는 것을 알 수 있었다.
3. 실험 C
다음으로, 킬레이트제로서의 에틸렌디아민테트라메틸렌포스폰산 (EDTPA) 의 담지가, 단백질의 선택성에 주는 영향에 대해 검토하였다.
(1) 다공질 지르코니아 입자
다공질 지르코니아 입자에는, 표 3 에 기재된 다음의 다공질 지르코니아 입자를 사용하였다.
표 3 에 있어서,「RC100」은, 다이이치 희원소 화학 공업 주식회사 제조의 다공질 지르코니아 입자이고, 표 1 의 실험예 6 과 동일하다. 「UEP100」은, 다이이치 희원소 화학 공업 주식회사 제조의 다공질 지르코니아 입자이고, 표 1 의 실험예 2 와 동일하다.
표 3 에 있어서,「RC100-P (0.00125M)」는, 다이이치 희원소 화학 공업 주식회사 제조의 다공질 지르코니아 입자 (RC100, 원료) 를, 0.00125 M 의 EDTPA 용액으로 처리하여 얻어진 EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자이다.
표 3 에 있어서,「UEP100-P (0.00125M)」는, 다이이치 희원소 화학 공업 주식회사 제조의 다공질 지르코니아 입자 (UEP100) 를, 0.00125 M 의 EDTPA 용액으로 처리하여 얻어진 EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자이다.
또한,「RC100-P (0.00125M)」의 조제는 이하와 같이 실시하였다. 미리 100 ℃ 에서 2 시간 탈기 건조시킨 다공질 지르코니아 입자 (RC100) 250 ㎎ 에 대해, 0.00125 M 의 EDTPA 용액을 10 ㎖ 첨가하고, 15 분 탈기 후, 17 시간 교반 및/또는 진탕하였다. 그 후, 추가로, 4 시간 환류한 후, 순수로 세정하고, 동결건조시켜, RC100-P (0.00125M) 를 얻었다.
「UEP100-P (0.00125M)」의 조제도「RC100-P (0.00125M)」와 동일하게 실시하였다. 즉, 원료로서「RC100」대신에「UEP100」을 사용한 것 이외에는,「RC100-P (0.00125M)」의 경우와 동일하게 하여「UEP100-P (0.00125M)」를 조제하였다.
또, EDTPA 용액의 농도를 0.00125 M, 0.0025 M, 0.005 M, 0.01 M 으로 변화시킨 것 이외에는, RC100-P (0.00125M) 와 동일하게 실시하여, 합계 4 종의 PCS140(SD)P (EDTA 농도) 를 조정하였다.
또한, EDTPA 의 담지량은, TG-DTA (열중량 시차열 분석) 의 중량 감소로부터 산출하였다. 즉, EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자를 10 ㎎ 정도 칭량하고, 상온 ∼ 1000 ℃ 까지의 중량 변화를 측정하면서, 시차열 분석 (TG-DTA ; Thermo plus TG8120, 리가쿠) 을 실시하였다. 200 ℃ ∼ 600 ℃ 에서의 중량 감소량으로부터 산출한 결과, 다공질 지르코니아 입자 1 ㎎ 당 0.06 ㎍ ∼ 2.2 ㎍ 의 EDTPA 를 담지하고 있었다.
(2) 단백질의 선택성 시험
다공질 지르코니아 입자 (RC100, UEP100), EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자 (RC100-P, UEP100-P) 를 사용하여, 단백질의 선택성 시험을 실시하였다.
상기 4 종의 각 다공질 지르코니아 입자에 대해, IgG, HAS (Albumin from human serum), Trf (Transferrin human) 의 3 종의 단백질에 대해, 각각 다음의 시험을 실시하였다.
스피츠에 500 ㎕ 의 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 을 넣고, 이 액에 다공질 지르코니아 입자 3 ㎎ 을 첨가하였다. 다공질 지르코니아 입자를 충분히 분산시킨 후, 단백질 (500 ㎍/500 ㎕) 을 500 ㎕ 첨가하여, 차광하, 4 ℃ 에서 하룻밤 교반하였다.
스피츠를, 14,000 회전으로 5 분간 원심하여, 다공질 지르코니아 입자를 침전 분리하였다. 상청 용액에 잔존하는 미고정의 단백질의 양을, 프로테인 어세이 염색액 (BIO-RAD) 을 사용하여, 마이크로플레이트 리더 (InfiniteF200PRO, TECAN) 에 의해 정량 하였다. 처음에 첨가한 단백질의 양과, 미고정의 단백질의 양의 차분을 고정된 단백질의 양으로 하였다.
(3) 실험 결과
표 3 에 결과를 나타낸다.
먼저, 다공질 지르코니아 입자 RC100, 및 EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자 RC100-P 의 결과를 고찰한다.
다공질 지르코니아 입자 RC100 에는, IgG 외에도, HAS, Trf 가 고정되는 것이 확인되었다.
한편, EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자 RC100-P 에는, IgG 는 고정되지만, HAS, Trf 는 고정되지 않는 것이 확인되었다.
이 결과로부터, 다공질 지르코니아 입자 RC100 에 EDTPA 를 담지하여, EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자 RC100-P 로 함으로써, IgG 의 선택 특이성이 향상되는 것을 알 수 있다.
다음으로, 다공질 지르코니아 입자 UEP100, 및 EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자 UEP100-P 의 결과를 고찰한다.
다공질 지르코니아 입자 UEP100 에는, IgG 외에도, HAS, Trf 가 고정되는 것이 확인되었다. HAS 의 고정량은, 64.3 ㎍ 이고, Trf 의 고정량은, 28.5 ㎍ 이었다.
한편, EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자 UEP100-P 에는, IgG 외에 HAS 가 고정되지만, HAS 의 고정량은 4.1 ㎍ 이었다. 이 HAS 의 고정량 4.1 ㎍ 은, 다공질 지르코니아 입자 UEP100 의 경우의 64.3 ㎍ 보다 현격히 적어져 있었다. 또, EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자 UEP100-P 에는, Trf 는 고정되지 않는 것이 확인되었다.
이 결과로부터, 다공질 지르코니아 입자 UEP100 에 EDTPA 를 담지하여, EDTPA 담지의 다공질 지르코니아 입자 UEP100-P 로 함으로써, IgG 의 선택 특이성이 향상되는 것을 알 수 있다.
4. 실시예의 효과
D50, D90, 및 전체 세공 용적이 특정 범위 내에 있는 다공질 지르코니아 입자는, 단백질의 일례로서의 IgG 를 선택적으로 고정시킬 수 있다.
다공질 지르코니아 입자의 표면에, 킬레이트제의 일례로서의 EDTPA 가 담지되어 있으면, 선택성이 보다 높아진다.
＜다른 실시형태 (변형예)＞
또한, 이 발명은 상기의 실시예나 실시형태에 한정되는 것은 아니고, 그 요지를 일탈하지 않는 범위에서 여러 가지 양태에 있어서 실시하는 것이 가능하다.
산업상 이용가능성
본 발명의 다공질 지르코니아 입자는, 항체 분리 정제에 사용하는 경우에, 지르코니아 결정상이 갖는, 내약품성, 높은 구조 강도, 소성에 의한 재생 이용 가능성 등, 종래 기술에는 없는 유리한 효과를 발휘한다. 따라서, 항체 제품의 제조 프로세스의 저비용화에 크게 공헌할 것으로 기대된다. 항체 의약을 비롯한 항체의 정제와 분리에 이용되는 칼럼 제품으로서의 응용으로서뿐만 아니라, 식품 중 알레르겐 등의 특이적 단백질의 제거로의 이용도 생각할 수 있다.
Claims (5)
- 단백질의 고정에 사용되는 다공질 지르코니아 입자로서,
BET 법에 의해 측정된 공경 분포에 있어서,
누적 세공 용적이 전체 세공 용적의 50 ％ 가 되는 세공경 D50 이 3.20 ㎚ 이상 6.50 ㎚ 이하이고,
누적 세공 용적이 전체 세공 용적의 90 ％ 가 되는 세공경 D90 이 10.50 ㎚ 이상 100.00 ㎚ 이하임과 함께,
전체 세공 용적이 0.10 ㎤/g 보다 큰 것을 특징으로 하는 다공질 지르코니아 입자. - 제 1 항에 있어서,
상기 단백질은, 면역 글로불린인 것을 특징으로 하는 다공질 지르코니아 입자. - 제 2 항에 있어서,
상기 면역 글로불린은, IgG, IgE, 및 IgD 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 것을 특징으로 하는 다공질 지르코니아 입자. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
표면에, 킬레이트제가 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 다공질 지르코니아 입자. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 다공질 지르코니아 입자가 응집하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질 고정용 응집체.
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