CN113329974A - 多孔氧化锆粒子和蛋白质固定用聚集体 - Google Patents

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Abstract

提供将特定蛋白质固定的特异性高的多孔氧化锆粒子。其为用于蛋白质的固定的多孔氧化锆粒子。在利用BET法测定的孔径分布中，累积孔体积达到总孔体积的50％处的孔径D50为3.20nm以上且6.50nm以下，累积孔体积达到总孔体积的90％处的孔径D90为10.50nm以上且100.00nm以下。总孔体积大于0.10cm3/g。

Description

多孔氧化锆粒子和蛋白质固定用聚集体
技术领域
本发明涉及多孔氧化锆粒子和蛋白质固定用聚集体。
背景技术
正在研究通过选择性吸附特定的蛋白质来分离纯化特定蛋白质的柱。
例如，在专利文献1中公开了出于该目的而采用多孔氧化锆粒子的技术。该技术中通过在多孔氧化锆粒子的表面上结合蛋白质A(作为使蛋白质吸附的配体)，从而提高了选择性(特异性)。
现有技术文献
专利文献1：日本特开2017-47365号公报
发明内容
发明所要解决的问题
然而，专利文献1的技术由于使用了蛋白质A，因此存在成本高的问题。
本发明是鉴于上述实际情况而完成的，其目的在于提供一种廉价且将特定蛋白质固定的特异性高的多孔氧化锆粒子。本发明可以通过以下方式实现。
用于解决问题的手段
[1]一种多孔氧化锆粒子，用于蛋白质的固定，其特征在于，
在利用BET法测定的孔径分布中，
累积孔体积达到总孔体积的50％处的孔径D50为3.20nm以上且6.50nm以下，
累积孔体积达到总孔体积的90％处的孔径D90为10.50nm以上且100.00nm以下，并且
总孔体积大于0.10cm3/g。
[2]如[1]所述的多孔氧化锆粒子，其特征在于，所述蛋白质为免疫球蛋白。
[3]如[2]所述的多孔氧化锆粒子，其特征在于，所述免疫球蛋白为选自由IgG、IgE和IgD构成的组中的至少一种。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的多孔氧化锆粒子，其特征在于，在表面上负载有螯合剂。
[5]一种蛋白质固定用聚集体，其特征在于，由[1]～[4]中任一项所述的多孔氧化锆粒子聚集而成。
发明效果
本发明的蛋白质固定用多孔氧化锆粒子由于不使用蛋白质作为配体，因此成本低。而且，本发明的多孔氧化锆粒子的D50、D90和总孔体积在特定范围内，因此选择性(特异性)高。
在被固定的蛋白质为免疫球蛋白的情况下，本发明的多孔氧化锆粒子的选择性非常高。
在被固定的蛋白质为选自由IgG、IgE和IgD构成的组中的至少一种的情况下，本发明的多孔氧化锆粒子的选择性极高。
在本发明的多孔氧化锆粒子的表面上负载有螯合剂时，选择性进一步提高。
由本发明的多孔氧化锆粒子聚集而成的蛋白质固定用聚集体价格低廉，而且选择性高。
附图说明
图1为示出乙二胺四亚甲基膦酸(EDTPA)的推测的负载结构的示意图。
图2为示出实验例3(实施例)的孔径分布(孔分布)的图。
图3为示出实验例13(比较例)的孔径分布(孔分布)的图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细地说明。需要说明的是，在本说明书中，关于数值范围在使用“～”的记载中，只要没有特别说明，则包括下限值和上限值。例如，在“10～20”这一记载中，作为下限值的“10”、作为上限值的“20”均包括在内。即，“10～20”与“10以上且20以下”的意思相同。
1.多孔氧化锆粒子
本发明的多孔氧化锆粒子是用于蛋白质的固定的蛋白质固定用多孔氧化锆粒子。
(1)D50、D90和总孔体积
多孔氧化锆粒子在利用BET法测定的孔径分布中，累积孔体积达到总孔体积的50％处的孔径D50为3.20nm以上且6.50nm以下，累积孔体积达到总孔体积的90％处的孔径D90为10.50nm以上且100.00nm以下。孔径D50优选为3.35nm以上且6.30nm以下，更优选为3.50nm以上且5.00nm以下。孔径D90优选为10.80nm以上且50.00nm以下，更优选为11.00nm以上且30.00nm以下。
多孔氧化锆粒子的总孔体积大于0.10cm3/g。总孔体积优选大于0.15cm3/g，更优选大于0.30cm3/g。需要说明的是，总孔体积的上限值没有特别限定，但通常为10cm3/g。
当D50、D90和总孔体积在上述范围内时，吸附的蛋白质的选择性变高。需要说明的是，通过将D90设定为100.00nm以下，蛋白质的单体容易被选择性地固定。蛋白质的单体的大小为约10nm，另一方面，蛋白质的聚集体的大小为约100nm。因此，通过将D90设定为100.00nm以下，可以避免蛋白质聚集体的固定，容易仅固定蛋白质的单体。
(2)测定装置和D50、D90的计算方法
孔径分布和孔体积例如可以使用孔分布测定装置(Micromeritics自动比表面积/孔分布测定装置(TriStarII岛津制作所公司))进行测定。
在此，对其计算方法进行说明。
对D50的计算方法进行说明。首先，从孔径分布的数据中读取夹着累积孔体积50％的、最接近累积孔体积50％的两点A、B的累积孔体积(X(％))和孔径(Y(nm))。具体而言，读取A(Xa(％)、Ya(nm))、B(Xb(％)、Yb(nm))(其中，Xa>Xb，Ya>Yb)。并且用这些值通过下式(1)求出D50。
式(1)
D50＝log(Xb)+((log(Xa)-log(Xb))*[(50-(Yb))/((Ya)-(Yb))]
同样地求出D90。即，首先，从孔径分布的数据中读取夹着累积孔体积90％的、最接近累积孔体积90％的两点C、D的累积孔体积(X(％))和孔径(Y(nm))。具体而言，读取C(Xc(％)、Yc(nm))、D(Xd(％)、Yd(nm))(其中，Xc>Xd，Yc>Yd)。并且用这些值通过下式(2)求出D90。
式(2)
D90＝log(Xd)+((log(Xc)-log(Xd))*[(90-(Yd))/((Yc)-(Yd))]
(3)粒径
多孔氧化锆粒子的粒径没有特别限定，一次粒子通常为10nm～100nm，优选为10nm～50nm，进一步优选为10nm～30nm。一次粒径在该范围内时，多孔氧化锆粒子的比表面积大幅增大，因此蛋白质的固定量具有增加的倾向。
2.蛋白质
作为固定对象的蛋白质没有特别限定。本发明的多孔氧化锆粒子在以下方面是优异的：将免疫球蛋白，特别是选自由IgG、IgE和IgD构成的组中的至少一种选择性地固定。
需要说明的是，在本发明中，“固定”包括物理固定和化学固定。本发明的多孔氧化锆粒子在其孔内的蛋白质固定中，利用了通过毛细管现象插入蛋白质的物理固定和在氧化锆表面利用了共价键等化学键的化学固定，具有高的蛋白质固定能力。
3.螯合剂
多孔氧化锆粒子的表面上可以负载有螯合剂。通过负载螯合剂，选择性进一步提高。
螯合剂没有特别限定。作为螯合剂，优选选自由以下述通式(1)表示的化合物、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DETPA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DETPPA)以及它们的盐构成的组中的至少一种。需要说明的是，作为盐，例如优选例示碱金属(钠等)的盐。
Figure BDA0003166291060000051
(在通式(1)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基。另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此可以相同也可以不同。)
作为通式(1)的R1中碳原子数为1～10的亚烷基，例如可以例示：亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、六亚甲基、亚异丁基等。
另外，作为R2～R5中碳原子数为1～10的亚烷基，例如可以例示：亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、六亚甲基、亚异丁基等。
作为螯合剂，从进一步提高对免疫球蛋白的选择性的观点考虑，优选由通式(1)表示的化合物。在由通式(1)表示的化合物中，特别优选乙二胺四亚甲基膦酸(EDTPA；N,N,N’,N’-乙二胺四(亚甲基膦酸))。
螯合剂的负载量没有特别限定。从进一步提高对免疫球蛋白的选择性的观点考虑，螯合剂的负载量优选每1mg氧化锆为0.01μg～10μg，更优选为0.02μg～5μg，进一步优选为0.05μg～3μg。
需要说明的是，螯合剂的负载量可以由TG-DTA(热重量示差热分析)的重量减少计算出。
螯合剂的负载方式还不明确，推测锆原子上结合有源自螯合剂的配体。例如，在螯合剂为乙二胺四亚甲基膦酸的情况下，推测为图1的结构。
4.蛋白质固定用聚集体
蛋白质固定用聚集体由多孔氧化锆粒子聚集而成。蛋白质固定用聚集体的直径(尺寸)没有特别限定。
聚集体的直径通常为50nm～20000nm，优选为100nm～15000nm，进一步优选为500nm～10000nm。聚集体的直径在该范围内时，容易利用离心法进行沉淀分离，实现纯化工序整体的低成本化。另外，在作为柱使用的情况下，可以造粒为20μm～100μm。
5.多孔氧化锆粒子的制造方法
多孔氧化锆粒子的制造方法没有特别限定。多孔氧化锆粒子例如可以通过以下方法制造。以锆石为原料，得到氧氯化锆(ZrOCl2·8H2O)溶液。然后，通过水解反应，制成Zr(OH)4微粒，并且将其煅烧，从而制成多孔氧化锆粒子。
实施例
通过实施例对本发明更具体地进行说明
1.实验A
(1)多孔氧化锆粒子
多孔氧化锆粒子使用表1中记载的多孔氧化锆粒子。
需要说明的是，实验例1～9相当于实施例，实验例10～17为比较例。关于比较例，在表1中，在表示实验例编号的数字之后如“10*”那样标注“*”。
表1
实验例 制造商 型号 IgG固定量(μg) D50(nm) D90(nm) 总孔体积(cm<sup>3</sup>/g)
1 新日本电工 PCS 140(SD) 440.9 4.72 11.52 0.51
2 第一稀元素 UEP100 438.4 4.82 15.14 0.51
3 新日本电工 PCS 140 391.2 4.94 11.21 0.52
4 新日本电工 PCS 90 380.9 6.27 13.95 0.47
5 新日本电工 PCS 60 345.6 4.00 16.41 0.33
6 第一稀元素 RC100 267.5 6.23 11.72 0.36
7 新日本电工 PCS 30 256.0 3.37 11.37 0.21
8 共立材料 NF-S 208.3 3.52 11.82 0.15
9 东曹 TZ-3Y 183.5 3.52 11.48 0.16
10* 共立材料 CG 88.2 3.41 9.74 0.08
11* 丸美陶料 PSZ-C1 54.6 3.37 10.10 0.09
12* 第一稀元素 DK-3CH 52.9 3.33 9.51 0.08
13* ZirChrom Rhinophase-AB 40.3 3.41 10.18 0.07
14* 奥德里奇 ZrO2 32.9 3.34 9.04 0.06
15* 信越化学 YSZ25 20.9 4.09 10.45 0.10
16* 信越化学 YSZ55 6.7 3.15 5.57 0.10
17* 信越化学 YSZ-QU 3.5 3.45 9.19 0.05
在表1中，“新日本电工”表示“新日本电工株式会社”，“第一稀元素”表示“第一稀元素化学工业株式会社”，“共立材料”表示“共立材料株式会社”，“丸美陶料”表示“丸美陶料株式会社”，“东曹”表示“东曹株式会社”，“ZirChrom”表示“ZirChrom分离公司”，“奥德里奇”表示“西格玛奥德里奇日本公司”，“信越化学”表示“信越化学工业株式会社”。
(2)孔径分布和孔体积
孔径分布和孔体积(总孔体积)使用Micromeritics自动比表面积/孔分布测定装置(TriStarII岛津制作所)进行测定。称量约50mg各多孔氧化锆粒子，在80℃下脱气干燥3小时后作为试样使用。各值由氮吸附实验利用BET法计算。
D50、D90通过“具体实施方式”部分中的“1.(1)D50、D90和总孔体积”中记载的方法计算出。
(3)IgG的固定和IgG量的测定
对于各多孔氧化锆粒子，分别按照如下方式固定IgG，求出固定的IgG量。
在多孔氧化锆粒子上固定IgG以如下方式进行。在Spitz管中加入500μL的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)，向该液中加入3mg多孔氧化锆粒子。使多孔氧化锆粒子充分分散，然后加入500μL IgG(500μg/500μL)，在遮光、4℃的条件下搅拌一晚。
将Spitz管以12000rpm离心10分钟，沉淀分离多孔氧化锆粒子。使用蛋白质定量染色液(BIO-RAD)，用酶标仪(InfiniteF200PRO，TECAN公司)将上清液中残留的未固定的IgG量进行了定量。将最初加入的IgG量与未固定的IgG量的差作为固定的IgG量。
(4)实验结果
图2示出实验例3(实施例)的孔径分布(孔分布)。图3示出实验例13(比较例)的孔径分布(孔分布)。从图2可知，在实验例3中，D50为3.20nm以上且6.50nm以下，且D90为10.50nm以上且100.00nm以下。另一方面，从图3可知，在实验例13中，D50为3.20nm以上且6.50nm以下，D90小于10.50nm。
结果一并记载在表1中。作为实施例的实验例1～9满足以下[1]～3的所有要件。
[1]孔径D50为3.20nm以上且6.50nm以下。
[2]孔径D90为10.50nm以上且100.00nm以下。
[3]总孔体积大于0.10cm3/g。
与此相对，作为比较例的实验例10～17不满足以下要件。
在实验例10中，不满足[2][3]的要件。
在实验例11中，不满足[2][3]的要件。
在实验例12中，不满足[2][3]的要件。
在实验例13中，不满足[2][3]的要件。
在实验例14中，不满足[2][3]的要件。
在实验例15中，不满足[2]的要件。
在实验例16中，不满足[1][2]的要件。
在实验例17中，不满足[2][3]的要件。
作为实施例的实验例1～9与作为比较例的实验例10～17相比，显示出优异的蛋白质固定能力。
2.实验B
为了测定IgG的最大固定量，与实施例A同样地操作，使用增加了投入的IgG量的IgG(750μg/500μL)，将其添加500μL，实施了实验B。除了IgG的投入量以外，实验B与实验A同样地进行。
实验结果示于表2中。
表2
Figure BDA0003166291060000101
可知在总孔体积为0.2cm3/g以上的多孔氧化锆粒子(实验例1、2、4、5、7)中，与IgG的加入量(投入量)为500μg的情况相比，IgG的加入量(投入量)为750μg的情况下能够固定更多的IgG。
3.实验C
接着，研究了作为螯合剂的乙二胺四亚甲基膦酸(EDTPA)的负载对蛋白质选择性的影响。
(1)多孔氧化锆粒子
多孔氧化锆粒子使用表3中记载的以下的多孔氧化锆粒子。
在表3中，“RC100”为第一稀元素化学工业株式会社制造的多孔氧化锆粒子，与表1的实验例6相同。“UEP100”为第一稀元素化学工业株式会社制造的多孔氧化锆粒子，与表1的实验例2相同。
在表3中，“RC100-P(0.00125M)”为用0.00125M的EDTPA溶液处理第一稀元素化学工业株式会社制造的多孔氧化锆粒子(RC100，原料)而得到的负载EDTPA的多孔氧化锆粒子。
在表3中，“UEP100-P(0.00125M)”为用0.00125M的EDTPA溶液处理第一稀元素化学工业株式会社制造的多孔氧化锆粒子(UEP100)而得到的负载EDTPA的多孔氧化锆粒子。
需要说明的是，“RC100-P(0.00125M)”的制备以如下方式进行。对预先在100℃下脱气干燥2小时而得到的多孔氧化锆粒子(RC100)250mg加入0.00125M的EDTPA溶液10mL，脱气15分钟，然后搅拌和/或振荡17小时。然后，进一步回流4小时，然后用纯水清洗，冷冻干燥，从而得到RC100-P(0.00125M)。
“UEP100-P(0.00125M)”的制备也与“RC100-P(0.00125M)”同样地进行。即，除了作为原料使用“UEP100”代替“RC100”以外，与“RC100-P(0.00125M)”的情况同样地制备了“UEP100-P(0.00125M)”。
另外，除了将EDTPA溶液的浓度变更为0.00125M、0.0025M、0.005M、0.01M以外，与RC100-P(0.00125M)同样地进行，共计制备了4种PCS140(SD)P(EDTA浓度)。
需要说明的是，EDTPA的负载量是由TG-DTA(热重量示差热分析)的重量减少计算出的。即，称量负载EDTPA的多孔氧化锆粒子约10mg，在测定常温直至1000℃的重量变化的同时进行示差热分析(TG-DTA；Thermo plus TG8120，Rigaku公司)。由200℃～600℃的重量减少量计算出的结果可知，每1mg多孔氧化锆粒子负载了0.06μg～2.2μg的EDTPA。
表3
Figure BDA0003166291060000111
(2)蛋白质的选择性实验
使用多孔氧化锆粒子(RC100、UEP100)、负载EDTPA的多孔氧化锆粒子(RC100-P、UEP100-P)进行了蛋白质的选择性实验。
对上述4种多孔氧化锆粒子，分别对IgG、HAS(人血清白蛋白)、Trf(人转铁蛋白)这3种蛋白质进行了以下实验。
在Spitz管中加入500μL的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)，向该液中加入3mg多孔氧化锆粒子。使多孔氧化锆粒子充分分散，然后加入500μL蛋白质(500μg/500μL)，在遮光、4℃的条件下搅拌一晚。
将Spitz管以14000rpm离心5分钟，沉淀分离多孔氧化锆粒子。使用蛋白质定量染色液(BIO-RAD)，用酶标仪(InfiniteF200PRO，TECAN公司)将上清液中残留的未固定的蛋白质的量进行了定量。将最初加入的蛋白质的量与未固定的蛋白质的量的差作为固定的蛋白质的量。
(3)实验结果
结果示于表3中。
首先，考察多孔氧化锆粒子RC100、以及负载EDTPA的多孔氧化锆粒子RC100-P的结果。
确认了在多孔氧化锆粒子RC100上，除了IgG以外，还固定有HAS、Trf。
另一方面，确认了在负载EDTPA的多孔氧化锆粒子RC100-P上，固定有IgG，但HAS、Trf没有被固定。
由该结果可知，通过在多孔氧化锆粒子RC100上负载EDTPA，制成负载EDTPA的多孔氧化锆粒子RC100-P，提高了IgG的选择特异性。
接着，考察多孔氧化锆粒子UEP100和负载EDTPA的多孔氧化锆粒子UEP100-P的结果。
确认了在多孔氧化锆粒子UEP100上，除了IgG以外，还固定有HAS、Trf。HAS的固定量为64.3μg，Trf的固定量为28.5μg。
另一方面，在负载EDTPA的多孔氧化锆粒子UEP100-P上，除了IgG以外，还固定有HAS，但HAS的固定量为4.1μg。该HAS的固定量4.1μg明显少于多孔氧化锆粒子UEP100的情况下的64.3μg。另外，确认了Trf没有固定在负载EDTPA的多孔氧化锆粒子UEP100-P上。
由该结果可知，通过在多孔氧化锆粒子UEP100上负载EDTPA，制成负载EDTPA的多孔氧化锆粒子UEP100-P，提高了IgG的选择特异性。
4.实施例的效果
D50、D90和总孔体积在特定范围内的多孔氧化锆粒子能够选择性地固定作为蛋白质一例的IgG。
当多孔氧化锆粒子的表面上负载有作为螯合剂一例的EDTPA时，选择性进一步提高。
<其它实施方式(变形例)>
需要说明的是，本发明不限于上述的实施例、实施方式，在不脱离其主旨的范围中可以通过各种方式来实施。
产业实用性
本发明的多孔氧化锆粒子在用于抗体分离纯化的情况时，发挥了氧化锆晶相所具有的耐化学品性、高结构强度、通过煅烧的可再生利用性等现有技术所没有的有利效果。因此，预期对抗体制品的制造工序的低成本化做出巨大的贡献。不仅可以用作以抗体药物为首的抗体的纯化和分离中使用的柱制品，而且还可以考虑应用于食品中过敏原等特异性蛋白质的除去。

Claims (5)

1.一种多孔氧化锆粒子，用于蛋白质的固定，其特征在于，
在利用BET法测定的孔径分布中，
累积孔体积达到总孔体积的50％处的孔径D50为3.20nm以上且6.50nm以下，
累积孔体积达到总孔体积的90％处的孔径D90为10.50nm以上且100.00nm以下，并且
总孔体积大于0.10cm3/g。
2.如权利要求1所述的多孔氧化锆粒子，其特征在于，所述蛋白质为免疫球蛋白。
3.如权利要求2所述的多孔氧化锆粒子，其特征在于，所述免疫球蛋白为选自由IgG、IgE和IgD构成的组中的至少一种。
4.如权利要求1～3中任一项所述的多孔氧化锆粒子，其特征在于，在表面上负载有螯合剂。
5.一种蛋白质固定用聚集体，其特征在于，由权利要求1～4中任一项所述的多孔氧化锆粒子聚集而成。
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