JP2020099214A - レジオネラ属菌検出に用いるオリゴヌクレオチド及びその検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)レジオネラ属菌の23S rRNAもしくは23S rDNAの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号1に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する14塩基を含む特徴とするレジオネラ属菌を検出するためのオリゴヌクレオチド。
(2)前記オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識されたことを特徴とする(1)に記載のオリゴヌクレオチド。
(3)前記蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドが相補的な2本鎖を形成すると、蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする(2)に記載のオリゴヌクレオチド。
(4)前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする(3)に記載のオリゴヌクレオチド。
(5)レジオネラ属菌の23S rRNAもしくは23S rDNAの特定塩基配列またはその相補配列を検出する方法であって(1)〜(4)の何れかに記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするレジオネラ属菌の検出方法。
(6)一組のプライマーセットを用いて、特定塩基配列又はその相補配列を増幅する工程を含むことを特徴とする(5)に記載のレジオネラ属菌の検出方法。
(7)前記一組のプライマーセットが、配列番号11に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマー、および/または配列番号31に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第二のプライマー、からなることを特徴とする(6)に記載のレジオネラ属菌の検出方法。
(8)前記第一のプライマーが、配列番号11に記載の配列又は相補配列中、連続する16〜31塩基からなり、かつ第二プライマーが配列番号31に記載の配列又は相補配列中、連続する16〜31塩基からなることを特徴とする(7)に記載のレジオネラ属菌の検出方法。
すなわち本発明では、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が検出されることになる。
本発明のオリゴヌクレオチドを用いたレジオネラ属菌23S rRNAの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
(A)電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
(B)検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
(C)当該特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を、一組のプライマーセットを用いて増幅した増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いた方法、
などがあげられる。前記(C)の蛍光色素標識オリゴヌクレオチドの一例として、FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を利用した蛍光標識オリゴヌクレオチドや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドがあげられる。
(1)配列番号11記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがレジオネラ属菌23S rRNAにハイブリダイズし、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なcDNAを合成し、前記RNAとのRNA−DNA2本鎖を生成する工程、
(2)リボヌクレアーゼH(RNase H)活性を有する酵素により、前記RNA−DNA2本鎖のRNAを分解する工程(1本鎖DNAの生成)、
(3)該1本鎖DNAに、配列番号31記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし(ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその5’末端側にRNAポリメラーゼのプロモーターが付加される)、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のRNAを転写可能なプロモーターを含む2本鎖DNAを生成する工程、
(4)RNAポリメラーゼ活性を有する酵素により前記2本鎖DNAを鋳型とするRNA転写産物を生産する工程、
(5)該RNA転写産物が、前記(1)の反応におけるcDNA合成の鋳型となることで、連鎖的にRNA転写産物を生成する工程、
(6)配列番号1またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドであって、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列に対し、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドを用いて、前記RNA転写産物量を経時的に測定する工程。
後述の実施例で使用する、レジオネラ属菌の一種であるレジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)標準RNAを以下に示す方法で調製した。なお調製した標準RNAの定量は、260nmにおける吸光度を基に実施した。
(1)レジオネラ・ニューモフィラ標準RNA
レジオネラ・ニューモフィラ23S rRNA配列(GenBank No.AE017354.1の361720番目から364621番目までの塩基配列)に基づき人工的に23S rRNA遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、レジオネラ・ニューモフィラ標準RNAを調製した。
下記(A)に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド(以下、INAFプローブと記載する)を特開2000−316587号公報で開示の方法に基づき作製した。
(A)配列番号3に記載の塩基配列(GenBank No.AE017354.1の364493番目から364511番目までの塩基配列)またはその相補配列、配列番号5に記載の塩基配列(GenBank No.AE017354.1の364493番目から364509番目までの塩基配列)またはその相補配列、配列番号7に記載の塩基配列(GenBank No.AE017354.1の364501番目から364515番目までの塩基配列)またはその相補配列、配列番号9に記載の塩基配列(GenBank No.AE017354.1の364501番目から364514番目までの塩基配列)またはその相補配列、からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号3及び5においては5’末端から13番目のグアニンと14番目のアデニンとの間に、配列番号7及び9においては、5’末端から11番目のシトシンと12番目のグアニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。
表1に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびINAFプローブの組み合わせ(以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する)を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表1に記載のINAFプローブは実施例2で作製したプローブである。
(1)実施例1で調製した標準RNAのうち、レジオネラ・ニューモフィラ標準RNA(実施例1(1))は、RNA希釈液(10mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、1mM EDTA、0.02% コール酸ナトリウム)を用いて1000コピー/15μLになるように希釈し、これらをRNA試料として用いた。
(2)以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
60mM Tris−HCl緩衝液(pH8.35)
300mM トレハロース
各0.39mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.1mM ATP、CTP、UTP
1.5mM GTP
3.2mM ITP
0.2μM 第一のプライマー(各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの5’末端側にT7プロモータ(配列番号55)を付加したもの)
0.2μM 第二のプライマー
25nM INAFプローブ(実施例2で調製したもの)
0.025mg/mL 牛血清アルブミン
200 T7 RNAポリメラーゼ
6.4U AMV逆転写酵素
(3)上記の蒸発乾燥後にRNA試料を15μL添加後、46℃で5分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液15μLを添加し撹拌した。
9.00% ジメチルスルホキシド
20mM 塩化マグネシウム
130mM 塩化カリウム
(4)引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、46℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に20分間測定した。
レジオネラ属菌の検出(表2)及び交差反応性(表3)を実施した。
レジオネラ属菌の検出については、1CFU/testのレジオネラ属菌9種を検出し、交差反応性については、106CFU/testの肺炎起因性菌21菌種を検出せず、レジオネラ属菌に対して高い特異性を有しており、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、レジオネラ属菌の23S rRNAを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
Claims (8)
- レジオネラ属菌の23S rRNAもしくは23S rDNAの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号1に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する14塩基を含むことを特徴とするレジオネラ属菌を検出するためのオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識されたことを特徴とする請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドが相補的な2本鎖を形成すると、蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする請求項3に記載のオリゴヌクレオチド。
- レジオネラ属菌の23S rRNAもしくは23S rDNAの特定塩基配列またはその相補配列を検出する方法であって、請求項1〜4の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするレジオネラ属菌の検出方法。
- 一組のプライマーセットを用いて、特定塩基配列又はその相補配列を増幅する工程を含むことを特徴とする請求項5に記載のレジオネラ属菌の検出方法。
- 前記一組のプライマーセットが、配列番号11に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマー、および/または配列番号31に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第二のプライマー、からなることを特徴とする請求項6に記載のレジオネラ属菌の検出方法。
- 前記第一のプライマーが、配列番号11に記載の配列又は相補配列中、連続する16〜31塩基からなり、かつ第二のプライマーが配列番号31に記載の配列又は相補配列中、連続する16〜31塩基からなることを特徴とする請求項7に記載のレジオネラ属菌の検出方法。
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JP2000217600A (ja) * | 1999-01-29 | 2000-08-08 | Masao Karube | レジオネラ・ニューモフィラに由来する核酸の検出方法 |
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