JP2020090506A - 抗体−リファマイシン複合体の製造プロセス - Google Patents

Abstract

【課題】菌血症等の治療に有用な抗体−ベンゾキサジノリファマイシン複合体の製造中間体である、Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンの新規製造方法の提供。【解決手段】下記式で表されるＦ−ベンゾキサジノリファマイシンの製造方法であって、リファマイシンＳと、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールと、酸化剤とを反応させる工程を含む、前記方法。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
３７ＣＦＲ§１．５３（ｂ）項に基づいて提出する本通常出願は、２０１６年３月４日に出願された米国仮出願第６２／３０３，５５６号の３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）項の利益を主張し、その全体を参照として本明細書に援用する。
本発明は、抗体−リファマイシン複合体化合物の製造方法に関する。

免疫複合体としても知られる抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、強力な細胞傷害性薬物を抗原発現腫瘍細胞に標的化することによって、抗体及び細胞傷害性薬物の両方の理想的な特性を組み合わせる標的化化学療法分子であり（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ９：９８２−１００４）、有効性を最大化し、非標的毒性を最小化することによって治療指数を向上させる（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ． ａｎｄ Ｓｅｎｔｅｒ Ｐ．Ｄ．（２００８）Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒ．１４（３）：１５４−１６９；Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．（２００８）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：９８−１０７。ＡＤＣは、リンカーユニットを介して細胞傷害性薬物部分に共有結合させた標的化抗体を含む。複合体化していない薬物の全身投与が、正常細胞及び排除しようとする腫瘍細胞に対して許容不能なレベルの毒性をもたらし得る場合に、免疫複合体は、薬物部分を腫瘍へ標的化送達し、腫瘍内に細胞内蓄積させることが可能である（Ｐｏｌａｋｉｓ Ｐ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３８２−３８７）。
がん治療におけるＡＤＣのコンセプトは、抗菌療法へ拡張されており、その場合には、薬物部分が抗生物質となり、抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）を生じる。抗ＷＴＡモノクローナル抗体を、１つ以上のリファマイシン型抗生物質部分（Ｌｅｈａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（２０１５）“Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ”Ｎａｔｕｒｅ ５２７（７５７８）３２３−３２８；Ｓｔａｂｅｎ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ（２０１６）“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｔｅｒｔｉａｒｙ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８（１２）：１１１２−１１１９；Ｚｈｏｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ（２０１６）“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＤＳＴＡ４６３７Ａ：Ａ ｎｏｖｅｌ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標） ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ”ＭＡＢＳ ８（８）：１６１２−１６１９；ＷＯ２０１４／１９４２４７）及び他の抗生物質（ＷＯ２０１４／１９３７２２）への共有結合リンカーによる結合によって複合体化した。マウスにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓの細胞内リザーバが、バンコマイシンの存在下でさえ感染を確立できる細菌の病原性サブセットを有することが示された。抗ＷＴＡリファマイシン複合体は、細胞内のＳ．ａｕｒｅｕｓを効果的に死滅させる新規治療薬である。この抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）は、有効性の高い抗生物質に複合体化したＳ．ａｕｒｅｕｓ標的化抗体からなり、ファゴリソソームのタンパク質分解環境中に放出された後にのみ活性化される。菌血症の治療に対して、この抗体−抗生物質複合体はバンコマイシンより優れており、細胞内Ｓ．ａｕｒｅｕｓが侵襲性感染症の重要な構成要素を代表するという直接的な証拠を提供する。

国際公開第２０１４／１９４２４７号 国際公開第２０１４／１９３７２２号

Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ９：９８２−１００４ Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ． ａｎｄ Ｓｅｎｔｅｒ Ｐ．Ｄ．（２００８）Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒ．１４（３）：１５４−１６９ Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．（２００８）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：９８−１０７ Ｌｅｈａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（２０１５）"Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ"Ｎａｔｕｒｅ ５２７（７５７８）３２３−３２８ Ｓｔａｂｅｎ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ（２０１６）"Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｔｅｒｔｉａｒｙ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ"Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８（１２）：１１１２−１１１９ Ｚｈｏｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ（２０１６）"Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＤＳＴＡ４６３７Ａ：Ａ ｎｏｖｅｌ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標） ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ"ＭＡＢＳ ８（８）：１６１２−１６１９

本発明は、抗体−リファマイシン複合体化合物の製造方法に関する：

本発明の一態様は、リファマイシンＳ ＩＩと、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩと、ＴＥＭＰＯ、ベンゾキノン、及び銅塩から選択される酸化剤とを反応させて、Ｉを形成することを含む、Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩの製造プロセスである。

本発明の別の態様は：
（ａ）１，３，５−トリフルオロ−２−ニトロベンゼンＶＩＩＩ及びベンジルアルコールと、リチウムビス（トリメチルシリルアミド）、リチウムジイソプロピルアミド、及びアルコキシド試薬から選択される塩基性試薬とを反応させて、（（（５−フルオロ−２−ニトロ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（メチレン））ジベンゼンＩＸを形成し、

；ならびに
（ｂ）ＩＸを水素ガス及び不均一系金属触媒と反応させてＩＩＩを形成することを含む、
２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩの製造プロセスである。

フローリアクター及びバッチ反応器を用いた半連続ループプロセスによって、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩによってリファマイシンＳ ＩＩを酸化的環化し、Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩを得るための一般的なプロセス（スキーム１）の概略図を示す。

定義
用語「キラル」とは、鏡像パートナーに対して重ね合わせ不可能な性質を有する分子を指し、用語「アキラル」とは、それらの鏡像パートナーに重ね合わせ可能な分子を指す。

用語「立体異性体」とは、同一の化学構造を有するが、空間中の原子または基の配置に関して異なる化合物を指す。

「ジアステレオマー」とは、２つ以上のキラリティー中心を有し、その分子が互いに鏡像ではない立体異性体を指す。ジアステレオマーは、異なる物理的性質、例えば、融点、沸点、スペクトル特性、及び反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動及びクロマトグラフィーなどの高分解能分析手順の下で分離し得る。

「エナンチオマー」とは、互いに重ね合わせ不可能な鏡像である化合物の２つの立体異性体を指す。

本明細書中で使用する立体化学的な定義及び慣習は、一般的にＳ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＥｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，“Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４に従う。本発明の化合物は、不斉またはキラル中心（立体中心）を含む場合があり、したがって、異なる立体異性型において存在する。ジアステレオマー、エナンチオマー及びアトロプ異性体、ならびにラセミ混合物などのそれらの混合物を含むがこれらに限定されない本発明の化合物のすべての立体異性型が本発明の一部を形成することが意図される。多くの有機化合物は、光学活性形態で存在し、すなわち、それらは、平面偏光の面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を記載する際に、接頭辞Ｄ及びＬ、またはＲ及びＳは、そのキラル中心（複数可）についての分子の絶対配置を示すために使用する。接頭辞ｄ及びｌまたは（＋）及び（−）は、化合物による平面偏光の回転の符号を示すために使用し、（−）または１は、化合物が左旋性であることを意味する。接頭辞が（＋）またはｄの化合物は右旋性である。所与の化学構造に関して、これらの立体異性体は、それらが互いに鏡像であることを除いて同一である。特定の立体異性体はエナンチオマーとも呼ばれる場合があり、そのような異性体の混合物は、多くの場合、エナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と呼ばれ、化学反応またはプロセスにおいて立体選択または立体特異性がない場合に生じ得る。用語「ラセミ混合物」及び「ラセミ体」とは、光学活性のない２つのエナンチオマー種の等モル混合物を指す。

用語「互変異性体」または「互変異性型」とは、低いエネルギー障壁を介して相互変換可能な、エネルギーの異なる構造異性体を指す。例えば、プロトン互変異性体（プロトトロピー互変異性体としても知られる）は、ケト−エノール異性化及びイミン−エナミン異性化などのプロトンの移動を介した相互変換を含む。原子価互変異性体には、いくつかの結合電子の再編成による相互変換が含まれる。

本明細書中で使用する語句「薬学的に許容可能な塩」とは、本発明の化合物の薬学的に許容可能な有機塩または無機塩を指す。例示的な塩として、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、「メシル酸塩」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩（すなわち、１，１′−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子を含んでもよい。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であってもよい。さらに、薬学的に許容可能な塩は、その構造中に１個よりも多い荷電原子を有していてもよい。複数の荷電原子が薬学的に許容可能な塩の一部である例では、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容可能な塩は、１つ以上の荷電原子及び／または１つ以上の対イオンを有することができる。

本発明の化合物が塩基である場合、所望の薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野で利用可能な任意の適切な方法、例えば、遊離塩基を無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸など、または有機酸、例えば酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、グルクロン酸もしくはガラクツロン酸などのピラノシジル酸、クエン酸もしくは酒石酸などのαヒドロキシ酸、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのアミノ酸、安息香酸もしくは桂皮酸などの芳香族酸、ｐ−トルエンスルホン酸もしくはエタンスルホン酸などのスルホン酸などで処理することによって調製し得る。

本発明の化合物が酸である場合、所望の薬学的に許容可能な塩は、任意の適切な方法、例えば遊離酸を無機または有機塩基、例えばアミン（第一級、第二級もしくは第三級）、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物などで処理することによって調製してもよい。適切な塩の実例として、グリシン及びアルギニンなどのアミノ酸由来の有機塩、アンモニア、第一級、第二級及び第三級アミン、ならびにピペリジン、モルホリン及びピペラジンなどの環状アミン、ならびにナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム及びリチウムから誘導される無機塩が挙げられるが、これらに限定されない。

「溶媒和物」とは、１つ以上の溶媒分子と本発明の化合物との会合体または複合体を指す。溶媒和物を形成する溶媒の例として、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。用語「水和物」とは、溶媒分子が水である錯体を指す。

本明細書中で使用する語句「薬学的に許容可能な塩」とは、本発明の化合物の薬学的に許容可能な有機塩または無機塩を指す。例示的な塩として、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシル酸塩」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩（すなわち、１，１′−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子を含んでもよい。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であってもよい。さらに、薬学的に許容可能な塩は、その構造中に１個よりも多い荷電原子を有していてもよい。複数の荷電原子が薬学的に許容可能な塩の一部である例では、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容可能な塩は、１つ以上の荷電原子及び／または１つ以上の対イオンを有することができる。

抗体−リファマイシン複合体の調製
本発明は：

として示される抗体−リファマイシン複合体化合物の合成のためのプロセス、方法、試薬、及び中間体を含み、
式中、Ａｂは抗ＷＴＡ（壁タイコ酸）抗体であり、ｐは１〜約４の整数である（Ｌｅｈａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（２０１５）“Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ”５２７（７５７８）３２３−３２８；ＷＯ２０１４／１９４２４７；ＷＯ ２０１４／１９３７２２、前記文献の各々の内容は参照として本明細書に援用する）。抗体は、生理学的に切断されるジペプチド（バリン−シトルリン）及びｐ−アミノベンジルスペーサーを含むリンカーを介してリファマイシン抗生物質部分に共有結合している（Ｃａｒｌ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９８１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４（５）：４７９−４８０；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：３３４１−３３４６；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：８５５−８６９）。リファマイシン部分の第三級アミン末端は、抗体−リファマイシン複合体化合物中に第四級アンモニウム塩を形成し、切断された場合に活性抗生物質を遊離させる。第四級アンモニウム基はまた、切断を調節し、溶解性を最適化し、複合体化合物の凝集を最小限にすることにも役立ち得る。

グラム陽性細菌の厚いペプチドグリカン層は、壁タイコ酸（ＷＴＡ）と呼ばれる病原体特異的ポリアニオン性グリコポリマーに結合している。具体的には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、それぞれＴａｒＭまたはＴａｒＳグリコシルトランスフェラーゼによって媒介されるα（アルファ）−またはβ（ベータ）−Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）糖修飾のいずれかによってさらに修飾されたホスホリビトール反復単位からなるＷＴＡを産生する（Ｗｉｎｓｔｅｌ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３０４，２１５−２２１）。タイコ酸（ＴＡ）は、ＳＡを含むグラム陽性細菌の細胞壁内に見出される細菌性多糖類である。壁タイコ酸（ＷＴＡ）は、細胞壁のペプチドグリカン（ＰＤＧ）層に共有結合したものであり；一方、リポタイコ酸（ＬＴＡ）は細胞質膜の脂質に共有結合したものである（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３００：１４８−５４）。これらのグリコポリマーは、不利な条件及び他の基本的な細胞プロセスにおいて、細菌の生存に重要な役割を果たす。公知のＷＴＡ構造は細菌種によって多様に異なる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＴＡは、リビトールリン酸またはグリセロールリン酸などの反復ポリオールリン酸サブユニットからなる。

用語「壁タイコ酸」（ＷＴＡ）とは、Ｎ−アセチルムラミン酸糖のＣ６ヒドロキシルへのホスホジエステル結合を介してペプチドグリカンに共有結合したアニオン性グリコポリマーを意味する。正確な化学構造は生物間で異なり得るが、一実施形態では、ＷＴＡは、２位にＤ−リビトール及びＤ−アラニルエステルの１，５−ホスホジエステル結合の反復単位、４位にグリコシル置換基を有するリビトールテタイコ酸である。グリコシル基は、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓに存在するＮ−アセチルグルコサミニルα（アルファ）またはβ（ベータ）であってもよい。アルジトール／糖アルコールリン酸リピートのヒドロキシルは、カチオン性Ｄ−アラニンエステル及びＮ−アセチルグルコサミンなどの単糖で置換される。一態様では、ヒドロキシル置換基は、Ｄ−アラニル及びアルファ（α）またはベータ（β）ＧｌｃＮＨＡｃを含む。特定の一態様では、ＷＴＡは、式：

の化合物を含み、式中、波線は、反復結合単位またはポリアルジトール−Ｐもしくはペプチドグリカンの結合部位を示し、式中、ＸはＤ−アラニルまたは−Ｈであり；Ｙはα（アルファ）−ＧｌｃＮＨＡｃまたはβ（ベータ）−ＧｌｃＮＨＡｃである。

Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいて、ＷＴＡはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）−１−Ｐ及びＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）からなる二糖と、それに続く２〜３単位のグリセロールリン酸を介してＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）の６−ＯＨに共有結合する。そういうわけで、実際のＷＴＡポリマーは、１１〜４０個のリビトールリン酸（Ｒｂｏ−Ｐ）反復単位からなる。ＷＴＡの段階的合成はＴａｇＯと呼ばれる酵素によって最初に開始され、ＴａｇＯ遺伝子を欠くＳ．ａｕｒｅｕｓ株（遺伝子の人為的欠失による）はＷＴＡを全く作らない。反復単位は、Ｃ２−ＯＨのＤ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）及び／またはα−（アルファ）またはβ−（ベータ）グリコシド結合を介したＣ４−ＯＨ位のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を用いてさらに適合させることができる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株または同細菌の増殖期に応じて、グリコシド結合はα−、β−、または２つのアノマーの混合物であり得る。

抗体重鎖及び軽鎖の同族対形成を保存するモノクローナル抗体発見技術を用いて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染後の患者由来の末梢Ｂ細胞から、抗β（ベータ）−ＧｌｃＮＡｃ ＷＴＡ ｍＡｂ及び抗α（アルファ）−ＧｌｃＮＡｃ ＷＴＡ ｍＡｂに対するヒトＩｇＧ抗体をクローニングした（Ｍｅｉｊｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ３５８：７６４−７７２）。個々の抗体クローンを、哺乳類細胞の形質移入によって発現させた（Ｍｅｉｊｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００９） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５２５：２６１−２７７，ｘｉｖ）。完全長ＩｇＧ１抗体を含有する上清を７日後に採取し、ＥＬＩＳＡによる抗原結合のスクリーニングに用いた。これらの抗体は、ＵＳＡ３００由来の細胞壁調製物への結合について陽性であった。次いで、２００ｍｌの一過性の形質移入によって抗体を産生し、プロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピスカタウェイ、ＮＪ）で精製した。

最高レベルの抗体結合は、ＷＴＡ上のβ（ベータ）−Ｏ−結合ＧｌｃＮＡｃ糖修飾を認識するヒトＩｇＧ_１で見出された（Ｌｅｈａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（２０１５）５２７（７５７８）３２３−３２８）。α（アルファ）−Ｏ−結合ＧｌｃＮＡｃを認識するモノクローナル抗体では、より低い結合が達成され；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｇＤタンパク質に対するアイソタイプ対照抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ由来Ｓ．ａｕｒｅｕｓ上にプロテインＡが発現しているために、いくらかの最小の反応性を示した。抗体の抗原特異性は、遺伝的手段によって決定したため、ＷＴＡ上のα（アルファ）−またはβ（ベータ）−ＧｌｃＮＡｃｓ糖修飾に対する抗体は、それぞれのグリコシルトランスフェラーゼを欠くＳ．ａｕｒｅｕｓ株に結合できなかった。

抗ＷＴＡ抗体は、米国特許第８２８３２９４号；Ｍｅｉｊｅｒ ＰＪ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３５８（３）：７６４−７２；Ｌａｎｔｔｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８５（４）：１８２０−３３に教示されている方法によって選択及び製造してもよい。

抗体の反応部位において、システインアミノ酸を改変してもよく、そしてそれは鎖内または分子間ジスルフィド結合を形成しない（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２；Ｄｏｒｎａｎ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（１３）：２７２１−２７２９；ＵＳ ７５２１５４１；ＵＳ ７７２３４８５；ＷＯ２００９／０５２２４９，Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３０（２）：１８４−１９１；Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３２：４１−５２）。改変システインチオールは、マレイミドまたはα−ハロアミドのようなチオール反応性求電子基を有する本発明のリンカー試薬またはリンカー−抗生物質中間体と反応して、システイン改変抗体（チオＭａｂ）及び抗生物質部分を有するＡＡＣを形成し得る。したがって、抗生物質部分の位置は、設計、制御可能であり、公知であり得る。改変システインチオール基は、通常、チオール反応性リンカー試薬またはリンカー−抗生物質中間体と高収率で反応するため、抗生物質の負荷率を制御することができる。抗ＷＴＡ抗体を改変し、重鎖または軽鎖上の単一部位での置換によってシステインアミノ酸を導入することは、対称テトラマー抗体上に２つの新規システインを与える。２に近い抗生物質の負荷率を達成することができ、そして複合体生成物ＡＡＣのほぼ均質性。

特定の実施形態では、抗体の１つ以上の残基をシステイン残基で置換したシステイン改変抗ＷＴＡ抗体、例えば「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。本明細書においてさらに説明するように、これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に位置し、これを用いて、抗体を、他の部分、例えば抗生物質部分またはリンカー−抗生物質部分に結合させ、免疫複合体を作製してもよい。特定の実施形態では、軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）を含む、上記残基のいずれか１つ以上をシステインで置換してもよい。非限定的な例示的なシステイン改変抗体は、抗ＷＴＡ抗体の重鎖Ａ１１８Ｃ及び軽鎖Ｖ２０５Ｃ変異体である。システイン改変抗ＷＴＡ抗体は、記載されているように生成してもよい（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２；ＵＳ７５２１５４１；ＵＳ−２０１１／０３０１３３４。

本発明の抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）のリファマイシン型抗生物質部分は、細胞傷害性または細胞増殖抑制効果を有する。リファマイシンは、細菌Ｎｏｃａｒｄｉａ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉにより天然に、または人工的に得られる抗生物質の群である。それらは細菌ＲＮＡポリメラーゼを阻害するより大きなアンサマイシンファミリーのサブクラスであり（Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１４８９−１４９２；Ｆｅｋｌｉｓｔｏｖ，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０５（３９）：１４８２０−５）、グラム陽性及び選択的なグラム陰性菌に対して効力を有する。リファマイシンは、マイコバクテリアに対して特に有効であり、したがって、結核、ハンセン病、及びｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＡＣ）感染の治療に使用される。リファマイシン型の群には、「古典的」リファマイシン薬ならびにリファマイシン誘導体リファンピシン（リファンピン、化学抄録登録番号１３２９２−４６−１）、リファブチン（化学抄録登録番号７２５５９−０６−９；ＵＳ２０１１／０１７８００１）、リファペンチン及びリファラジル（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ １２（２）：２５５−２７１；Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１１１８−１１２２；Ｙａｍａｎｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４０：２７０７；（ｂ）Ｙａｍａｎｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４１：１４８−１５５）が含まれる。多くのリファマイシン型抗生物質は、耐性発生の有害な特性を共有している（Ｗｉｃｈｅｌｈａｕｓ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７：１５３−１５６）。リファマイシンは、１９５７年にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉの発酵培養物から最初に単離された。リファマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｓ及びＳＶというおよそ７つのリファマイシンが発見された（米国特許第３１５００４６号）。リファマイシンＢは、商業的に最初に導入され、１９６０年代に薬剤耐性結核の治療に有用であった。多数の利用可能な類似体及び誘導体のために、リファマイシンは、一般的に使用される抗生物質に耐性になっている病原性細菌の除去に広く利用されている。

ベンゾキサジノリファマイシンは、リファマイシンの誘導体である。リファラジル（ＫＲＭ−１６４８、化学抄録登録番号１２９７９１−９２−０）は、アンサマイシンのクラスにおけるベンゾキサジノリファマイシンの一例であり、結核及び他の細胞内病原体を治療するために開発されたリファマイシン型抗生物質である（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ １２（２）：２５５−２７１；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ １５（６）：６０３−６２３；ＵＳ４９８３６０２；ＵＳ７３４２０１１；ＵＳ７６７８７９１）。リファマイシンのベンゾキサジノリファマイシン誘導体は、その抗菌特性が知られており（ＵＳ４６９０９１９；ＥＰ０１９０７０９；ＵＳ４９８３６０２）、アミノレゾルシノール化合物とリファマイシンＳの酸化的環化によって調製し得る（Ｙａｍａｎｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４０：２７０７；（ｂ）Ｙａｍａｎｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４１：１４８−１５５）。

ベンゾキサジノリファマイシン類似体ＩＶは、その高い効力、低いファゴリソソームｐＨにおけるその変化することのない殺菌活性、細胞内の傷害へのその耐性能力、及びそれが抗体に複合体化され得る容易さから選択された。

本発明の化合物は、非溶媒和形態、及び水、エタノールなどの薬学的に許容可能な溶媒との溶媒和形態で存在してもよく、本発明は、溶媒和形態及び非溶媒和形態の両方を包含することが意図される。

本発明の化合物はまた、異なる互変異性体の形態で存在してもよく、そのような形態はすべて本発明の範囲内に包含される。用語「互変異性体」または「互変異性型」とは、低いエネルギー障壁を介して相互変換可能な、エネルギーの異なる構造異性体を指す。例えば、プロトン互変異性体（プロトトロピー互変異性体としても知られる）は、ケト−エノール異性化及びイミン−エナミン異性化などのプロトンの移動を介した相互変換を含む。原子価互変異性体には、いくつかの結合電子の再編成による相互変換が含まれる。

本発明の化合物はまた、本明細書中で列挙したものと同一であるが、１つ以上の原子を、自然界に通常見出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子で置換した同位体標識化合物も含む。指定する任意の特定の原子または元素のすべての同位体が、本発明の化合物及びその使用の範囲内において意図される。本発明の化合物に組込み可能な例示的な同位体として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素及びヨウ素の同位体、例えば、^２Ｈ、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｎ、^１５Ｏ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、^３６Ｃｌ、^１２３Ｉ及び^１２５Ｉが挙げられる。本発明の特定の同位体標識化合物（例えば、^３Ｈ及び^１４Ｃで標識したもの）は、化合物及び／または基質組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム化（^３Ｈ）及び炭素−１４（^１４Ｃ）同位体は、それらの調製及び検出の容易さの点で有用である。さらに、重水素（すなわち、^２Ｈ）などのより重い同位体による置換は、より大きな代謝安定性に起因する一定の治療上の利点（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の増加または必要用量の低下）をもたらす場合があり、したがって、場合によっては好ましいことがある。^１５Ｏ、^１３Ｎ、^１１Ｃ及び^１８Ｆなどの陽電子放射同位体は、基質受容体占有率を調べるための陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）試験に有用である。本発明の同位体標識化合物は、非同位体標識試薬を同位体標識試薬に置換することにより、以下の実施例に開示されているものと類似の手順に従って一般に調製することができる。

抗体−リファマイシン複合体の中間体を調製するための出発材料及び試薬は、一般的に市販供給元から入手可能であるか、または当業者に周知の方法を用いて容易に調製される（例えば、Ｌｏｕｉｓ Ｆ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｙ Ｆｉｅｓｅｒ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｖ．１−２７，Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．（１９６７−２０１３ ｅｄ．）、または補足資料を含むＢｅｉｌｓｔｅｉｎｓ Ｈａｎｄｂｕｃｈ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ，４，Ａｕｆｌ．ｅｄ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎに一般的に記載される方法によって調製される（Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎのオンラインデータベースからも入手可能）。

以下のスキーム１〜３は、本発明の実施形態を形成する、式Ｉの合成のための化学反応、プロセス、方法、ならびに特定の中間体及び試薬を説明する。
スキーム１：

スキーム１は、Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩを得るための２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩを用いたリファマイシンＳ ＩＩの酸化的環化を示す。このプロセスの任意のメカニズムに限定するものではないが、推定イミン縮合中間体、またはその互変異性体は、Ｉ及びリファマイシンＳＶをもたらす（Ｋｕｍｐ，Ｗ．ｅｔ ａｌ（１９７３）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ５６：２３４８−２３７７）。周囲空気、酸素ガス、ベンゾキノン、酸化マンガン（ＭｎＯ_２）、ＰｈＩ（ＯＴｓ）ＯＨ、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）、クロラニル、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、Ｆｅ_２Ｏ_３、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_８、Ｃｏ（ａｃａｃ）_３、Ｍｎ（ａｃａｃ）_２、Ｃｕ（ＯＡｃ）_２、ＣｕＯ、ＣｕＢｒ_２、ＺｎＣｌ_２、ＩｎＣｌ_３、Ａｇ（ＯＴｆ）_２、Ｓｃ（ＯＴｆ）_３、及びＹｂ（ＯＴｆ）_３を含む、ＴＥＭＰＯ以外の他の酸化剤（Ｋａｉｚｅｒ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊｏｕｒ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ．１８０：９１−９６）は、リファマイシンＳ ＩＩを、Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩに、ＨＰＬＣ（実施例３）で計算した収率１６％〜８１％で変換した。４−アミノ、４−ベンジルオキシ、４−アセトアミド、及び４−ヒドロキシルＴＥＭＰＯ、２−アザアダマンタン−Ｎ−オキシル（Ａｚａｄｏ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびにシリカゲル上のＴＥＭＰＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む、ＴＥＭＰＯ類似体もまた、ＩＩからＩへの変換に有効である。酢酸エチル、トルエン、メタノール、及びテトラヒドロフランを含む、酢酸イソプロピル（ｉＰｒＯＡｃ）以外の他の溶媒を使用してもよい。

図１は、半連続ループプロセスによる、Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩを得るための２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩを用いたリファマイシンＳ ＩＩの酸化的環化のための一般的なプロセス（スキーム１）の概略図を示す。一実施形態は、酸化剤として酸素流及びＴＥＭＰＯを使用する（実施例３．３）。一実施形態では、酸素ガスは、反応ガス相の約１％〜約１００％を構成する。一実施形態では、酸素が前記ガスの５〜１００ｖ／ｖ％を構成する、酸素と窒素との混合物を酸化剤として使用する。別の実施形態は、酸化剤としてベンゾキノンを使用する（実施例３．１）。半連続系は、酸化剤とレゾルシノールＩＩＩを分離して保持し、ＩＩＩの非生産的酸化を避けることを保証する。２−アミノベンゼン−１，３−ジオールは、ＨＣｌ塩としては安定であるものの、遊離塩基としては、特に溶液中において酸素に対して安定ではない（Ｙａｍａｎｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４０：２７０７；（ｂ）Ｙａｍａｎｅ，Ｔ．；ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４１：１４８−１５５）。ＩＩＩとしての５位の２−アミノベンゼン−１，３−ジオールのフッ素化は、より大きな安定性を与える。ループシステムは、酸化中に生成するリファマイシンＳ ＩＩが、さらなるレゾルシノールＩＩＩとさらに反応するようにリサイクルされることを保証する。リファマイシンＳ ＩＩ及びレゾルシノールＩＩＩを、２０〜６０℃で酢酸イソプロピル（推定イミン中間体を提供する）などの溶媒中のバッチ反応器中で予混合し、これにより、Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩ及びリファマイシンＳＶが部分的に形成される（図１）。リファマイシンＳＶはＩＩの還元型である。次いで、混合物を０〜６０℃で酸化ループに供し、ＩＩ（リファマイシンＳＶ由来）を改質する。次いで、部分変換混合物をさらなるＩＩＩで処理し、改質したリファマイシンＳ ＩＩをより多く消費してＩ及びリファマイシンＳＶを得る。反応が完了したとみなされるまで、混合物を酸化ループ及びレゾルシノール添加に供する。レゾルシノールＩＩＩは段階的にまたは連続的様式で添加することができる。反応の終わりに、混合物をアスコルビン酸の水溶液で、次に水で抽出する。有機相をエバポレートして乾燥させ、残渣をＤＣＭ／ＭｅＯＨに溶解し、シリカゲルでクロマトグラフィーに供する。次いで、生成物をＭｅＯＨ／水から再結晶させる。

２つの反応セグメントを分離することにより、（ａ）連続攪拌タンク中でのＩＩ及びＩＩＩの中間体への効率的な変換、続いてＩ及びリファマイシンＳＶの形成を含む酸化還元ステップ、ならびにｂ）ＩＩＩの酸化的消費を避けるためのプラグフローカラム内でのリファマイシンＳＶのＩＩへの酸化が可能になる。複数のサイクルを経て反応を進行させ、ＩＩのＩへの変換を完了させる。

一実施形態では、静的混合要素（実施例３．４）を有するフローリアクターにＴ字接合部を介して二重ジャケットガラス反応器を接続する。Ｔ字接合部の第三の端部を、酸化剤溶液を投与するポンプに接続する。フローリアクターの出口は、二重ジャケットガラス反応器に接続する。試薬ＩＩ及びＩＩＩをガラス反応器中で約２０〜６０℃で一晩ｉＰｒＯＡｃと混合する。フローリアクターにわたって溶液を酸化剤溶液と一緒にポンプ輸送する。フローリアクターは、約−５〜５℃の出口温度に保持する。出口溶液を二重ジャケットガラス反応器にポンプで戻す（ループプロセス）。ループは約８時間にわたって実行する。次いで、レゾルシノールをガラス反応器に加え、一晩反応させる（サイクル１）。ループ処理を再開する。合計３サイクルを実行する。

別の実施形態では、バッチ連続ループプロセス反応において、ジャケット付きガラス容器を、Ｔ字接合部を介してフローリアクター及び酸化剤供給器に接続する（実施例３．３）。フローリアクターを、冷却コイルを介して気液分離フラスコに接続する。分離フラスコをジャケット付きガラス容器に接続する。分離フラスコとジャケット付き容器との間にフィルターを配置する。酸化ループの液体部分は、蠕動ポンプの補助により冷却容器にポンプで戻される。このポンプの直後にサンプリングバルブを配置する。レゾルシノール溶液をジャケット付きガラス反応器に供給する。酸素流を、ガスマスフローコントローラによって制御する。ジャケット付きガラス反応器中で、リファマイシンＳ ＩＩ及びＴＥＭＰＯを酢酸イソプロピル（ｉＰｒＯＡｃ）に溶解し、容器温度を約５０℃に設定する。酢酸イソプロピル中のレゾルシノールＩＩＩ溶液を混合しながら６０分間、容器に供給する。その後、混合物を酸素とともに６０℃でフローリアクターを通してポンプ輸送し、レゾルシノール供給を一定に保ちながらループプロセスを開始する。ループは約６〜８時間実行する。

スキーム２：

スキーム２は、アミノ−ベンゾキサジノリファマイシン類似体ＩＶを得るための、第２級アミンＲ_２ＮＨを用いたＦ−ベンゾキサジノリファマイシンＩからのフッ化物置換基の求核置換を示しており、式中、Ｒは、様々なアルキル及び環式置換基から独立して選択される。第二級アミンＲ_２ＮＨとして、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、１−メチルピペラジン、Ｎ１−イソブチルピペラジン、及びＮ，Ｎ−ジメチルピペリジン−４−アミンが挙げられるが、これらに限定されない。ベンゾキサジノリファマイシン類似体ＩＶは、Ｎ，Ｎ−ジメチルピペリジン−４−アミン（ＵＳ７２６５１０７；ＵＳ７２７１１６５；ＵＳ７８８４０９９）を含む第三級アミンで、５′位でリファラジルのＮ−イソブチルピペラジン基を置換する（ＵＳ７５４７６９２の欄１３の変換後に）。

スキーム３：

スキーム３は、リンカー−抗生物質ＶＩを得るための、第三級アミンリファラジル類似体ＩＶによるリンカー塩化物Ｖのアルキル化を示す。

実施例１ （（（５−フルオロ−２−ニトロ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（メチレン））ジベンゼン

ＴＨＦ（３００ｍｌ）中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（６６．５ｇ、５９３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、フェニルメタノール（ベンジルアルコール、６６．３ｇ、６１３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（６０ｍｌ）を２０分かけて滴下し、黄色の溶液を得た。他のアルコキシド試薬、例えばナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムイソプロポキシド、ナトリウムイソプロポキシド、カリウムエトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、及びナトリウムメトキシドを使用することができる。あるいは、２−メチルテトラヒドロフランまたはジイソプロピルエーテルなどの他のエーテル溶媒を使用することができる。あるいは、ＴＨＦ中のリチウムヘキサメチルジシラザン（ＬｉＨＭＤＳ）の１Ｍ溶液にフェニルメタノールを内部温度１〜４℃で２ｈ（２時間）かけて添加することができる。この黄色の溶液を、テフロン（登録商標）カニューレを介して２−Ｍｅ−ＴＨＦ（４００ｍｌ）中の化学抄録登録番号３１５−１４−０の１，３，５−トリフルオロ−２−ニトロベンゼン（５０．０ｇ、２８２ｍｍｏｌ）の透明な溶液に０〜１０℃の内部温度で１時間かけて滴下し、得られた橙赤色溶液を０〜５℃で１時間、攪拌した。あるいは、１，３，５−トリフルオロ−２−ニトロベンゼンをＴＨＦに溶解することができる。次に水（５００ｍｌ）及びＮａＣｌ溶液（３０ｍｌ、飽和）を加え、相を分離した。水相を２−Ｍｅ−ＴＨＦ（２５０ｍｌ）で抽出し、有機相をブライン（６００ｍｌ）で洗浄した。あるいは、水相をジクロロメタンで抽出することができる。有機相を合わせて、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、生成物の結晶化が始まるまで、黄色透明溶液を真空下で濃縮した。次に、２−Ｍｅ−ＴＨＦ（１５０ｍｌ）及びＥｔＯＨ（５００ｍｌ）を添加し、懸濁液を氷浴中で３時間撹拌した。結晶を濾別し、氷冷したｎ−ヘプタン（２００ｍｌ）で洗浄し、重量が一定になるまで真空下で乾燥して、化学抄録登録番号１６３９３５２−１８−３の（（（５−フルオロ−２−ニトロ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（メチレン））−ジベンゼン（９１．６ｇ、１，３，５−トリフルオロ−２−ニトロベンゼンを基準にして８９．９％）を淡黄色固体として得た。融点：１１７．８〜１１９．４℃。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ７．４４−７．２７ （， １０Ｈ）， ６．３７ （ｄ， Ｊ＝ １０．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．１８−５．０６ （ｍ， ４Ｈ）。ＭＳ （ＥＳＩ）： ３５２．１ ［Ｍ−Ｈ］⁻。Ｃ_２０Ｈ_１６ＦＮＯ_４の計算値：Ｃ ６７．９８、Ｈ ４．５６、Ｎ ３．９６；実測値Ｃ ６７．８９、Ｈ ４．５０、Ｎ ３．９４。

実施例２ ２−アミノ−５−フルオロ−ベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ

化学抄録登録番号１６３９３５２−１８−３の（（（５−フルオロ−２−ニトロ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（メチレン））−ジベンゼンＩＸ（３．０ｋｇ、８．４９ｍｏｌ）、Ｐｄ／Ｃ Ｅ１０１ Ｎ／Ｄ、５％Ｐｄ触媒（１５ｇ）及びｉＰｒＯＡｃ（８２９ｋｇ）を、５０Ｌのオートクレーブに連続的に充填し、オートクレーブをＡｒ、次いで水素ガス（Ｈ_２）でパージした。Ｐｄ／Ｃ触媒は、マトリックス活性化炭素、ｗｅｔ ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｄｅｇｕｓｓａ型Ｅ１０１ ＮＥ／Ｗ、Ｅ１０１ Ｎ／Ｄ、Ｅ１０５Ｒ／Ｗ（Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ）、タイプ１２８Ｍ（Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、５２０７ Ｅｓｃａｔ １６２（ＢＡＳＦ）、Ｎｏｂｌｙｓｔ（登録商標）Ｐ１０７０またはＮｏｂｌｙｓｔ（登録商標）Ｐ１０９０（Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）であってもよい。ベンジル及びニトロ基の還元には、炭素またはアルミナ担体上のパラジウム、白金またはルテニウムなどの他の不均質金属触媒を使用することができる。次いで、水素圧を２ｂａｒに調整し、反応混合物を攪拌しながら２８〜３２℃に加熱し、この温度で２１時間水素化した。反応混合物を周囲温度に冷却し、圧力を注意深く解放した。この反応を、２段階以上にわたって行ってもよく、部分的に還元されたニトロまたはベンジル中間体、例えば５−フルオロ−２−ニトロベンゼン−１，３−ジオールを単離し、さらに水素ガス及び不均一系金属触媒で処理してＩＩＩを得てもよい。

反応混合物をＡｒ下で濾過し、オートクレーブ及びフィルターをｉＰｒＯＡｃで洗浄し、粗水素化溶液を２つの類似の水素化作業の生成物溶液と合わせた。次いで、溶媒を真空下で部分的に除去し、その際、生成物が沈殿し始めた。次いで、ｎ−ヘプタン（４０ｌ）を加え、懸濁液を０〜５℃に冷却し、この温度で１８時間撹拌した。この懸濁液を、予め冷却した（０〜５℃）フィルター乾燥機に移し、結晶をｎ−ヘプタン（１５ｌ、冷却）で洗浄し、乾燥させて、２−アミノ−５−フルオロ−ベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ、化学抄録登録番号１６３９３４０６−５５−５（３．０ｋｇ、出発物質に基づいて８１．９％）をベージュ色固体として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ_６−ＤＭＳＯ）： δ １０．１８−７．５４ （ｍ， １Ｈ）， ６．０５ （ｄ， Ｊ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．９６ （ｂｒ ｄ， Ｊ＝ １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ （ｄ_６−ＤＭＳＯ）： δ １５４．６ （ｄ， Ｊ＝ ２３０．３ Ｈｚ， １Ｃ）， １４５．４， １４５．３， １２０．３， ９９．６， ９９．１。ＭＳ （ＥＩ^＋）： ｍ／ｚ １４３．０ （Ｍ^＋， １００％）。Ｃ_６Ｈ_６ＦＮＯ_２の計算値： Ｃ ５０．３５， Ｈ ４．２３， Ｎ ９．７９； 実測値 Ｃ ５０．３６， Ｈ ４．３３， Ｎ ９．７２。

あるいは、ＩＸの還元を停止することができ、脱ベンジル化されたニトロジオール中間体５−フルオロ−２−ニトロベンゼン−１，３−ジオール：

を、ほぼ定量的収率で、及びＧＣ分析による純度＞９５％の橙色固体として、単離することができる。^１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １１．２０ （ｓ， ２ Ｈ）， ６．２４ （ｄ， ２ Ｈ）。Ｃ_６Ｈ_４ＦＮＯ_４の分析計算値： Ｃ ４６．６３， Ｈ ２．３３， Ｎ ８．０９； 実測値 Ｃ ４１．５８， Ｈ ２．５２， Ｎ ８．０４。５−フルオロ−２−ニトロベンゼン−１，３−ジオールを、広範囲の炭素分散パラジウム、白金、白金−バナジウム、ならびにＰｔ／Ｃ、Ｐｔ．Ｖ／Ｃ、Ｒａ−Ｎｉ（ラネーニッケル）、及びＲａ−Ｃｏを含むニッケル不均一系金属触媒を用いた不均一水素化によってＩＩＩに還元した。

実施例３ Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩ
３．１ ベンゾキノンでの完全バッチプロセス
５００ｍｌのガラス反応器中で、ＣｈｅｍＳｈｕｔｔｌｅ Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳ７３４２０１１；ＵＳ７２７１１６５；ＵＳ７５４７６９２から市販されているリファマイシンＳ ＩＩ（１３．９２ｇ、２０ｍｍｏｌ）、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ（４．９ｇ、３４ｍｏｌ、１．６当量）及びベンゾキノン（２．３８ｇ、２４ｍｍｏｌ、１．２当量）をｉＰｒＯＡｃ（１８５ｍＬ）に溶解する。溶液を２５℃で４０時間撹拌する。溶液を研磨濾過し、次いで濾液をエバポレートして乾燥させて、２５．３ｇの粗製Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩを得る（収率２９．２％、分析値１８．９３％）。ＭＳ （ＥＩ^＋）： ｍ／ｚ ８１７．６ （Ｍ^＋， １５％）。ＨＰＬＣ （方法Ａ）： ５．３２分。
ＨＰＬＣ方法Ａ：
試料調製：１００ｍｌのアセトニトリル中の５０ｍｇの物質
システム：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００、バイナリ
溶離液Ａ：ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ ９：１＋０．２５％ＴＦＡ
溶離液Ｂ：ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ １：９＋０．２５％ＴＦＡ
カラム：ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ４．６×５０ｍｍ、２．５μｍ
流速：１．５ｍｌ／分
注入：１０μｌ
λ：２２０ｎｍ
カラム温度：４０℃
勾配：

ポストタイム：３分

３．２ ベンゾキノンでのバッチプロセス
５００ｍｌのガラス反応器中で、リファマイシンＳ ＩＩ（２０．０ｇ、２９ｍｍｏｌ）、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ（４．９ｇ、３５ｍｍｏｌ、１．２当量）をｉＰｒＯＡｃ（３００ｍＬ）に溶解する。溶液を２５℃で一晩撹拌する。次いで、溶液を−５．０℃に冷却し、ベンゾキノンのｉＰｒＯＡｃ溶液（４５ｍＬの溶媒中、１．８６ｇ、１７ｍｍｏｌ、０．６当量）を８時間かけて添加する。次いで、追加のレゾルシノール（２．５ｇ、１７ｍｍｏｌ、１．２当量）を２５℃で添加し、混合物を一晩反応させる。この時間後、ベンゾキノンのｉＰｒＯＡｃ溶液（０．９３ｇ、９ｍｍｏｌ、２２．５ｍＬ中０．３当量）を４時間かけて添加する。このレゾルシノールとベンゾキノンの逐次添加を、以下のように合計３サイクル繰り返す：

サイクルが完了したら、反応混合物をアスコルビン酸の水溶液（１００ｍｌ、１０％ｗ／ｗ）で抽出し、次いで水（１００ｍｌ）で３回抽出する。有機相をエバポレートして乾燥させて、３３．７ｇの粗製Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩ（収率７３．１％、分析値５１．０％）を黒色泡状物として得る。ＭＳ （ＥＩ^＋）： ｍ／ｚ ８１７．６ （Ｍ^＋， ８９％）。ＨＰＬＣ （方法Ａ）： ５．３４分。

３．３ 酸素ガスとＴＥＭＰＯでのバッチプロセス
１．５Ｌのガラス反応器中で、リファマイシンＳ ＩＩ（４０．０ｇ、５８ｍｍｏｌ）、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ（２０．６ｇ、１４４ｍｍｏｌ、２．５当量）をｉＰｒＯＡｃ（６００ｍＬ）に溶解する。混合物をアルゴン下、６０℃で２時間撹拌する。この時間の後、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、フリーラジカルＴＥＭＰＯ（Ｋａｉｚｅｒ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊｏｕｒ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ．１８０：９１−９６）（０．９０ｇ、５．８ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加し、アルゴンを酸素ガスＯ_２（Ｎ_２中５ｖ／ｖ％）流（４００ｍＬ／分）で置換する。反応混合物を６０℃で２２時間撹拌する。この混合物を室温に冷却し、その後、紙フィルターで濾過する。フィルターを酢酸エチル（３００ｍＬ）で洗浄する。濾液を集め、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３（１０％ｗ／ｗ、１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）の水溶液で抽出する。有機相を集め、エバポレートして乾燥させる。残渣を２％ｖ／ｖのＭｅＯＨを含むＤＣＭ（１５０ｍＬ）に溶解し、シリカゲル（２５０ｇ、溶離液：２％ｖ／ｖのＭｅＯＨを含むＤＣＭ）でクロマトグラフィーにかける。生成物を含む画分をエバポレートして乾燥させて、２２．３ｇのＦ−ベンゾキサジノリファマイシンＩ（収率４５％、分析値９５％）を暗赤色固体として得る。１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＣＨＣｌ_３）： δ １４．４２−１４．３３ （ｍ， １Ｈ）， １０．２９−１０．００ （ｍ， １Ｈ）， ６．７７−６．６２ （ｍ， １Ｈ）， ６．５８−６．４８ （ｍ， １Ｈ）， ６．３９−６．３５ （ｍ， １Ｈ）， ６．１０−４．６０ （ｍ， ４Ｈ）， ４．０４−３．９０ （ｍ， １Ｈ）， ３．６１ （ｓ， １Ｈ）， ３．５０ （ｓ， １Ｈ）， ３．３５ （ｓ， １Ｈ）， ３．１１ （ｓ， １Ｈ）， ２．３３ （ｓ， １Ｈ）， ２．２９ （ｓ， １Ｈ）， ２．２３ （ｓ， ２Ｈ）， ２．１６−２．１１ （ｍ， ６Ｈ）， ２．０５ （ｄ， Ｊ ＝ １８Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７８ （ｄ， Ｊ＝ １２ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８−１．５４ （ｍ， ６Ｈ）， １．３７−０．５１ （ｍ， １３Ｈ）。ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ８１８．３０６１ （質量の計算値： ８１８．３０６２）。ＨＰＬＣ （方法Ｂ）： ５．８６分。
ＨＰＬＣ方法Ｂ：
試料調製：アセトニトリル１ｍｌ中の２ｍｇの物質
システム：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００、バイナリ
溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ
溶離液Ｂ：ＡＣＮ
溶離液Ｃ：Ｈ_２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ
カラム：ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ４．６×５０ｍｍ、２．５μｍ
流量：１．５ｍｌ／分
注入：２μｌ
λ：２２０ｎｍ
カラム温度：４０℃
勾配：

３．４ ベンゾキノンでのループプロセス
二重ジャケットガラス反応器を、静的混合要素を有するフローリアクターにＴ字接合部を介して接続する。Ｔ字接合部の第三の端部を、酸化剤溶液を投与するポンプに接続する。フローリアクターの出口は二重ジャケットガラス反応器に接続する。１８Ｌのガラス反応器中で、リファマイシンＳ ＩＩ（２００．４ｇ、２８８ｍｍｏｌ）及び２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ（４９．５ｇ、３４７ｍｍｏｌ、１．２当量）をｉＰｒＯＡｃ（３．０Ｌ）に溶解する。溶液を２５℃で一晩撹拌する。あるいは、ＩＩ及びＩＩＩをガラス反応器中でｉＰｒＯＡｃと２０〜６０℃で一晩混合する。次いで、−５．０〜５．０℃で、構造化ミキサーフローリアクター（Ｖ＝１３０ｍｌ）上でｉＰｒＯＡｃ中のベンゾキノン溶液とともに、フローリアクターに溶液をポンプ輸送（５．２Ｌ／時）する（詳細は表を参照のこと）。次いで、得られる溶液を、２５℃に保たれるバッチ反応器にポンプで戻す。ループプロセスは、ベンゾキノン投与時間中に実施する（表参照）。その後、追加のレゾルシノール（２４．７ｇ、１７３ｍｍｏｌ、０．６当量）を２５℃で添加し、混合物を一晩反応させる。ベンゾキノンとレゾルシノールの逐次添加を、以下の表に従って合計３回繰り返す。

サイクルが完了したら、反応混合物をアスコルビン酸の水溶液（１．０Ｌ、１０％ｗ／ｗ）で抽出し、次に水（１．０Ｌ）で３回抽出する。有機相をエバポレートして乾燥させる。残渣を２％ｖ／ｖのＭｅＯＨを含むＤＣＭ（２．０Ｌ）に溶解し、シリカゲル（３．０ｋｇ、溶離液：２％ｖ／ｖのＭｅＯＨを含むＤＣＭ、３２Ｌ）でクロマトグラフィーにかける。生成物を含む画分をエバポレートして乾燥させる。１８６．４ｇの生成物（収率８１．５％、分析値８５．５％）が黒い泡として得られる。泡を４０℃でメタノール（８．０Ｌ）に溶解し、次いで水（４．８Ｌ）を４時間かけて添加する。懸濁液を４０℃で２時間保持し、次いで０℃に８時間冷却し、この温度で２時間保持する。懸濁液を濾過し、水（０．５Ｌ）及びメタノール（０．３Ｌ）の溶液で洗浄し、水（０．８Ｌ）で２回洗浄する。黒色の結晶を１０ｍｂａｒの真空コンパートメント乾燥機で４０時間乾燥する。１４８．８ｇのＦ−ベンゾキサジノリファマイシンＩを暗赤色結晶として得る（収率６３．４％、分析値９７．４％）。^１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＣＨＣｌ_３）： δ １４．４２−１４．３３ （ｍ， １Ｈ）， １０．２９−１０．００ （ｍ， １Ｈ）， ６．７７−６．６２ （ｍ， １Ｈ）， ６．５８−６．４８ （ｍ， １Ｈ）， ６．３９−６．３５ （ｍ， １Ｈ）， ６．１０−４．６０ （ｍ， ４Ｈ）， ４．０４−３．９０ （ｍ， １Ｈ）， ３．６１ （ｓ， １Ｈ）， ３．５０ （ｓ， １Ｈ）， ３．３５ （ｓ， １Ｈ）， ３．１１ （ｓ， １Ｈ）， ２．３３ （ｓ， １Ｈ）， ２．２９ （ｓ， １Ｈ）， ２．２３ （ｓ， ２Ｈ）， ２．１６−２．１１ （ｍ， ６Ｈ）， ２．０５ （ｄ， Ｊ ＝ １８Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７８ （ｄ， Ｊ＝ １２ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８−１．５４ （ｍ， ６Ｈ）， １．３７−０．５１ （ｍ， １３Ｈ）。ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ８１８．３０６９ （質量の計算値： ８１８．３０６２）。ＨＰＬＣ （方法Ａ）： ５．３５分。

３．５ ＴＥＭＰＯでのバッチプロセス
反応器にｉ−ＰｒＯＡｃ（３５５ｇ）、リファマイシンＳ ＩＩ（４０．０ｇ、５７．５ｍｍｏｌ）及び２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、フリーラジカル（ＴＥＭＰＯ）（９．０ｇ、 ５７．６ｍｍｏｌ）を窒素ガス下で添加した。反応器の内容物を１時間、６０℃に加温した後、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ（８．０ｇ、５５．９ｍｍｏｌ）をｉ−ＰｒＯＡｃ（２６６ｇ）中の溶液として１時間にわたってチャージした。さらにＴＥＭＰＯ（９．０ｇ、５７．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を６０℃で１時間撹拌した。追加の２−アミノ−５−フルオロ−ベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ（８．０ｇ、５５．９ｍｍｏｌ）を１時間、ｉ−ＰｒＯＡｃ（２６６ｇ）中の溶液としてチャージし、続いて温度で２時間撹拌した。さらにｉ−ＰｒＯＡｃ（１０ｇ）中のＴＥＭＰＯ（１．８ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を６０℃で１時間撹拌した。追加の２−アミノ−５−フルオロ−ベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ（１．６ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）をｉ−ＰｒＯＡｃ（６０ｇ）中の溶液として１時間にわたって添加し、続いて２時間混合した。ｉ−ＰｒＯＡｃ（６０ｇ）の溶液として、２−アミノ−５−フルオロ−ベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ（１．６ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）の最終チャージを１時間かけて加え、続いて６０℃で２時間混合した。

バッチを減圧蒸留下で体積の５０％まで濃縮した。２０〜２５℃に冷却した後、ヘプタン（４１０ｇ）をチャージし、シリカ（１６０ｇ）のパッドで混合物を濾過し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）（４０ｇ）のパッドで覆った。パッドを１：１ヘプタン／ｉ−ＰｒＯＡｃ（９４３ｇ）で洗浄し、合わせた濾液を濃縮して体積の５％にした。一旦２０〜２５℃に冷却すると、ｉ−ＰｒＯＡｃ（７１ｇ）、続いて１時間にわたってヘプタン（１２９ｇ）をチャージした。内容物を２０〜２５℃で３時間撹拌した後、スラリーを濾過した。ケーキを３：１ヘプタン／ｉ−ＰｒＯＡｃ（３９ｇ）で洗浄した後、新しい反応器に移した。湿った物質をｉ−ＰｒＯＡｃ（７３ｇ）に溶解し、２０〜２５℃で１時間攪拌した後、ヘプタン（１２９ｇ）を１時間にわたって添加した。内容物を２０〜２５℃で３時間撹拌した後、スラリーを濾過し、３：１ヘプタン／ｉ−ＰｒＯＡｃ（３９ｇ）でケーキを洗浄した。最終的な湿ったケーキを真空下で乾燥させて、Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩ（２３．５ｇ、収率５０．０％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ベンゼン−ｄ_６：クロロホルム−ｄ_１ ３：１， ６０ ℃） δ １４．５９ （ｓ， １Ｈ）， １０．４１ （ｓ， １Ｈ）， ７．７６ （ｓ， １Ｈ）， ７．１８ （ｐ，
Ｊ ＝ １．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．３， ２．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．２９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．０， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．２２ − ６．１３ （ｍ， １Ｈ）， ５．９４ （ｄ， Ｊ ＝ １０．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．５９ （ｓ）， ５．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１１ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．３， ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７６ − ３．６０ （ｍ， １Ｈ）， ３．４４ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．１３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．７， ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．０３ − ２．９４ （ｍ， １Ｈ）， ２．８９ （ｓ， ４Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１５ − ２．０６ （ｍ， １Ｈ）， ２．０４ （ｄ， Ｊ ＝ １．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．６５ （ｓ， ３Ｈ）， １．５７ （ｄｄｄｄ， Ｊ ＝ １４．１， １２．０， ６．９， ３．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．４３ （ｓ， ５Ｈ）， ０．４３ − ０．３２ （ｍ， ４Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ （１５１ ＭＨｚ， Ｃ_６Ｄ_６：ＣＤＣｌ_３ ３：１， ６０ ℃） δ １９３．８， １８４．４， １７４．３， １７１．８， １６８．９， １６８．３， １６６．６， １５８．１， １５８．０， １４４．９， １４４．８， １４３．４， １４１．８， １４０．６， １３３．３， １３１．６， １２６．４， １２０．１， １１５．６， １１４．８， １１３．２， １１２．７， １０８．１， １０７．８， ９９．７， ９９．５， ９４．９， ９４．７， ７９．１， ７８．４， ７３．８， ７３．４， ５６．３， ４１．３， ４０．２， ３７．３， ３３．２， ２２．２， ２０．８， ２０．４， １６．９， １１．２， １１．０， ７．７。

実施例４：ジメチルアミノピペリジルリファＩＶａ

乾燥ＴＨＦ（１３５ｇ）及びＦ−リファＩ（１０．０ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）をＮ_２下で反応器にチャージした。反応器の内容物を０〜５℃に冷却した後、内部温度を≦５℃に維持しながらＮ，Ｎ−ジメチルピペリジン−４−アミン（２．３ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）を０．５時間にわたってチャージした。添加後、反応器の内容物を２０〜２５℃に加温し、２時間保持した。ＥｔＯＡｃ（１３５ｇ）をチャージし、混合物を０．５時間撹拌した。内容物を濾過し、ＥｔＯＡｃ（２５ｇ）で洗浄した。合わせた濾液を真空下で２５ｍＬ体積まで蒸留した。２０〜２５℃に冷却した後、ＥｔＯＡｃ（１８５ｇ）、続いて７％ＮａＨＣＯ_３水溶液（４５ｇ）、２５％ＮａＣｌ水溶液（４５ｇ）、及び精製水（４５ｇ）をチャージした。相分離後、水層を除去し、２５％ＮａＣｌ水溶液（４５ｇ）及び精製水（４５ｇ）を有機相に添加した。水層を除去し、有機層を７％ＮａＨＣＯ_３水溶液（４５ｇ）、２５％ＮａＣｌ水溶液（４５ｇ）、精製水（４５ｇ）での処理に供した。相分離後、水層を除去し、２５％ＮａＣｌ水溶液（４５ｇ）及び精製水（４５ｇ）を有機相に添加した。有機相を濾過し、濾液を２５ｍＬ体積まで濃縮してから、ヘプタン（９０ｇ）で希釈した。さらに２５ｍＬの体積に濃縮した後、ヘプタン（９０ｇ）で希釈し、最終濃度を２５ｍＬ体積とした。懸濁液を濾過し、ヘプタン（２×２０ｇ）でケーキを洗浄して固体を得、これを一度減圧下で乾燥させてジメチルアミノピペリジルリファＩＶａ（１０．６ｇ、収率９３．５％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， トルエン−ｄ_８） δ １６．５３ （ｓ， １Ｈ）， １１．５９ （ｓ， １Ｈ）， ９．８６ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ （ｓ， １Ｈ）， ６．４７ − ６．３２ （ｍ， １Ｈ）， ６．２１ （ｄ， Ｊ ＝ １１．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．８７ （ｓ， １Ｈ）， ５．６２ （ｓ， １Ｈ）， ５．４４ （ｄ， Ｊ ＝ １１．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．３０ − ５．１８ （ｍ， １Ｈ）， ４．８７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．６， １０．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５８ （ｄ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．２６ − ３．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０３ （ｄ， Ｊ ＝ １０．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．９１ （ｄ， Ｊ ＝ １２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．７３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ２Ｈ）， ２．２４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０４ （ｓ， ６Ｈ）， ２．００ （ｓ， １Ｈ）， １．９７ − １．８９ （ｍ， １Ｈ）， １．７９ （ｄ， Ｊ ＝ ２８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６６ （ｓ， ３Ｈ）， １．６４ （ｓ， ５Ｈ）， １．１７ （ｄ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ６Ｈ）， ０．７８ （ｄ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．４９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ５Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ （１５１ ＭＨｚ， Ｔｏｌ） δ １９３．０， １８２．６， １７５．７， １７５．１， １７１．５， １７１．２， １５８．０， １５７．２， １４６．４， １４５．２， １４４．５， １４２．２， １３１．５， １３１．０， １３０．９， １２８．９， １２８．０， １１９．６， １１４．０， １１２．６， １１１．５， １０９．４， １０７．７， １０６．３， ９５．０， ９２．９， ７９．９， ７９．０， ７４．８， ７３．８， ６１．５， ５５．２， ４７．０， ４６．４， ４４．１， ４２．４， ４２．３， ３７．３， ３３．１， ２９．２， ２９．０， ２３．６， ２３．１， ２１．４， １６．４， １３．２， １３．０， １１．７， ８．５。

実施例５ Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（クロロメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミドＶ
乾燥Ｎ−メチルピロリドン、ＮＭＰ（５５ｇ）及び６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）ヘキサンアミド、ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＯＨ（１０．０ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）をＮ_２下で反応器にチャージした。

内容物を５０〜５５℃に１時間加温した後、０〜５℃に冷却した。塩化チオニル（２．６ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）を、≦５℃の温度で１時間にわたって反応器にチャージした。添加後、反応器の内容物を２０〜２５℃に加温し、１時間保持した。出発材料の残存をＬＣが示したため、バッチを０〜５℃に冷却し、塩化チオニル（０．２ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を１時間にわたって反応器に加えた。添加後、内容物を２０〜２５℃に加温し、１時間保持した。バッチを０〜５℃に冷却し、温度を≦５℃に維持しながら水（１７０ｇ）を添加した。得られたスラリーを濾過し、フィルターケーキを水（２×３０ｇ）で洗浄した。次いでケーキをＥｔＯＡｃ（３０ｇ）、ＣＨ_３ＣＮ（２×３０ｇ）、及びＭＴＢＥ（１×３０ｇ）で洗浄した。湿ったケーキを真空下で２０〜２５℃で乾燥させて、淡く着色した固体を得た（８．３ｇ、収率８０％）。^１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６， ２８ ℃） δ １０．０２ （ｓ， １Ｈ）， ８．０６ （ｄ， ７．５，
１Ｈ）， ７．７８ （ｄ ８．７， １Ｈ）， ７．６０ （ｄ， ８．６， ２Ｈ）， ７．３６ （ｄ， ８．６， ２Ｈ）， ６．９９ （ｓ， ２Ｈ）， ５．９８
（ｂｓ， １Ｈ）， ５．４０ （ｖｂｓ， １Ｈ）， ４．７１ （ｓ， ２Ｈ），
４．３８ （ｍ， １Ｈ）， ４．１９ （ｄｄ， ．５， ６．９， １Ｈ）， ３．３７ （ｔ， ７．１， ２Ｈ）， ３．０３ （ｍ， １Ｈ）， ２．９４ （ｍ，
１Ｈ）， ２．１８ （ｍ， １Ｈ）， ２．１２ （ｍ， １Ｈ）， １．９７ （ｍ， １Ｈ）， １．７０ （ｍ， １Ｈ）， １．６０ （ｍ， １Ｈ）， １．４８
（ｍ， ５Ｈ）， １．３７ （ｍ， １Ｈ）， １．１９ （ｐｅｎ， ７．７， ２Ｈ）， ０．８５ （ｄ， ６．８， ３Ｈ）， ０．８２ （ｄ， ６．８， ３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ （１５１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６， ２８ ℃） δ １７２．２， １７１．２， １７０．９， １７０．６， １５８．８， １３８．９， １３４．３， １３２．２， １２９．４， １１９．０， ５７．５， ５３．０， ４６．１， ３８．５， ３６．９， ３４．８， ３０．３， ２９．２， ２７．７，
２６．７， ２５．７， ２４．８， １９．１， １８．１。

実施例６ リンカー−抗生物質ＶＩ

反応器に、ＮＭＰ（４９５ｇ）、ジメチルアミノピペリジルリファＩＶａ（９０．０ｇ、９７．１ｍｍｏｌ）及びＮ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−クロロメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミドＶ（６０．０ｇ、１０１．５ｍｍｏｌ）をＮ_２下で加えた。内容物を５５〜６０℃に１２時間加熱した。冷却後、ＥｔＯＡｃ（１．２ｋｇ）をチャージし、内容物を４時間熟成させた。スラリーを濾過し、ケーキをＥｔＯＡｃ（１５８ｇ）で洗浄した。フィルターケーキを真空下で２０〜２５℃で乾燥させて、粗製リンカー−抗生物質ＶＩを暗青色固体として得た（１３７．１、収率９３％）。

精製：粗製リンカー−抗生物質ＶＩ（１１３．３ｇ）を０．０５％ギ酸（ＦＡ）（８．５Ｌ）を含む１：１アセトニトリル（ＡＣＮ）／水に溶解した。溶液をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）（２００ｇ）で濾過し、濾液を水中０．０５％ＦＡ（３４．０Ｌ）で処理した。希釈した溶液を予め平衡化したカラムにチャージし、続いて以下の移動相組成物で溶離した：

高度に架橋された水和ポリスチレンからなるＨＰ２０ＳＳ樹脂（ＤＩＡＩＯＮ（商標）ＨＰ２０ＳＳ、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）；３０〜７０％のベンゼン、エテニルベンゼンとエテニルエチルベンゼンとのジエテニル−ポリマーをカラムに充填した。濃縮ステップは、粗製リンカー−抗生物質ＶＩ溶液を水中０．０５％ＦＡ（１６５Ｌ）で最初に希釈することにより開始し、ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ／ＦＡ：１０／９０／０．０５の組成を得た。次いで、予め平衡化した樹脂（１０／９０／０．０５）に希釈溶液を０．８Ｌ／分の速度でチャージした。溶出は、９０／１０／０．０５で０．８Ｌ／分で３７分間続けた。ブルーバンドがカラムから溶出し始め、すべての青色物質が１つの画分に集められたときに、生成物を回収した。捕捉画分の純度は９４．４％（約１０Ｌ）であった。カラムを６０：４０のＭｅＯＨ／水（２２．４Ｌ）ですすいだ。

生成物のリンカー−抗生物質ＶＩを含む画分を、２５℃の最高温度で、溶媒（ＡＣＮ）が凝縮しなくなるまで減圧濃縮した。濃縮物を移し、蒸留フラスコを注射用水（ＷＦＩ、０．５Ｌ）ですすいだ。希釈した濃縮物を研磨濾過し、濾液を凍結乾燥して精製リンカー−抗生物質ＶＩを暗青色固体として得た（４５．６ｇ、収率４０．２％）。^１Ｈ ＮＭＲ
（６００ ＭＨｚ， ＣＤ_２Ｃｌ_２：ｄ４−ＭｅＯＨ ９：１， ４ ℃） δ ７．８０ （ｄ， ８．４， ２Ｈ）， ７．４２ （ｄ， ８．３， ２Ｈ）， ６．７４
（ｄｄ， １５．９， １１．２， １Ｈ）， ６．６９ ｓ， ２Ｈ）， ６．５２
（ｓ， １Ｈ）， ６．３９ （ｓ， １Ｈ）， ６．３４ （ｄ， １０．６， １Ｈ）， ６．１７ （ｄ， １２．８， １Ｈ）， ６．１５ （ｄｄ， １５．９， ７．５， １Ｈ）， ４．９６ （ｄｄ， １２．７， ７．５， １Ｈ）， ４．８６
（ｄ， １０．８， １Ｈ）， ４．４９ （ｄｄ， ９．６， ４．０， １Ｈ），
４．４６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２３ （ｍ， ４Ｈ）， ４．０８ （ｄ， ７．２， １Ｈ）， ３．７９ （ｍ， １Ｈ）， ３．６１ （ｄ， １０．４， １Ｈ）， ３．４５ （ｔ， ７．２， ２Ｈ）， ３．２５ （ｄ， ７．３， １Ｈ）， ３．１８ （ｍ， ５Ｈ）， ３．０７ （ｍ， １Ｈ）， ２．９３ （ｓ， ９Ｈ）， ２．０９ （ｍ， １Ｈ）， ２．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３３ （ｍ， １Ｈ）， ２．２７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１０ （ｓ，
３Ｈ）， ２．０２ （ｍ， ４Ｈ）， １．９４ （ｓ， ３Ｈ）， １．８６ （ｍ， １Ｈ）， １．８０ （ｓ， ３Ｈ）， １．６９ （ｍ， １Ｈ）， １．６０
（ｍ， ２Ｈ）， １．５４ （ｍ， ３Ｈ）， １．２７ （ｍ， ２Ｈ）， １．２２ （ｍ， １Ｈ）， ０．９２ （ｍ， ９Ｈ）， ０．８１ （ｄ， ６．６， ３Ｈ）， ０．７９ （ｍ， １Ｈ）， ０．０２ （ｄ， ６．８， ３Ｈ）， −０．４０ （ｄ， ６．６， ３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＣＤ_２Ｃｌ_２：ｄ４−ＭｅＯＨ ９：１， ４ ℃） δ １９３．９， １８３．２， １７５．３， １７４．７， １７３．１， １７２．０， １７１．９， １７１．８， １６９．８， １６１．２， １５８．０， １５６．１， １４７．０， １４５．４， １４３．９， １４１．６， １４０．１， １３４．６， １３４．１， １３３．６， １３２．４， １３２．０， １２６．５， １２１．７， １２０．７， １１９．３， １１８．９， １１２．５， １１２．１， １１０．６， １０８．８， １０８．１， ９６．０， ９１．５， ７７．０， ７６．８， ７４．７， ７４．１， ７１．２， ６５．９， ５９．８， ５７．０， ４７．４， ４６．６， ４６．５， ４０．３， ３８．２， ３８．０， ３７．４， ３６．２， ３３．３， ３１．０， ２９．４， ２８．８， ２６．９， ２６．１， ２５．７， ２２．５， ２１．１， ２０．５， １９．５， １８．６， １８．５， １０．６， ９．４， ８．３， ７．８。

実施例７ 抗ＷＴＡ抗体−抗生物質複合体の調製におけるリンカー−抗生物質ＶＩと抗体との複合体化
抗ＷＴＡ抗体のシステイン改変（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）変異体の構築及び産生を、以前に他の抗体について報告されたように行った（ＷＯ２０１４／１９４２４７、参照により援用する；Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２）。簡潔に述べると、システイン残基を抗ＷＴＡ重鎖のＡｌａ１１８位で改変し、そのｃｙｓ１１８ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）変異体（ＨＣ Ａ１１８Ｃ）を作製した。抗ＷＴＡ抗体−抗生物質複合体は、システイン改変した抗ＷＴＡ抗体をリンカー−抗生物質ＶＩ中間体に複合体化することによって調製した。複合体化の前に、その記載を本目的のために参照として援用するＷＯ２００４／０１０９５７に記載されている方法論による標準的な方法を用いて、システイン改変抗ＷＴＡ抗体をＴＣＥＰで部分的に還元した。部分的に還元した抗体を、例えばＤｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−７８４及びＵＳ２００５／０２３８６４９に記載されている方法による標準的な方法論を用いてリンカー−抗生物質ＶＩ中間体に複合体化した。簡潔に述べると、部分的に還元した抗体をＶＩと組み合わせて、リンカー−抗生物質中間体を、抗体の還元システイン残基へ複合体化できるようにした。複合体化反応を停止させ、ＡＡＣを精製した。各ＡＡＣの抗生物質負荷（抗体あたりの抗生物質部分の平均数）を測定したところ、単一のシステイン変異部位で改変した抗壁タイコ酸抗体について、約１〜約２の間であった。

複合体化のためのＴｈｉｏＭａｂの還元／酸化：ＣＨＯ細胞内で発現させた全長システイン改変モノクローナル抗体（ＴｈｉｏＭａｂｓ−Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２；Ｄｏｒｎａｎ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（１３）：２７２１−２７２９；ＵＳ７５２１５４１；ＵＳ７７２３４８５；ＷＯ２００９／０５２２４９，Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３０（２）：１８４−１９１；Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３２：４１−５２）を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリスｐＨ７．５中、約２０〜４０倍過剰のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩またはＤＴＴ（ジチオスレイトール）を用いて３７℃で３時間または室温で一晩還元した。（Ｇｅｔｚ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ２７３：７３−８０；Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。還元したＴｈｉｏＭａｂを希釈し、ｐＨ５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中のＨｉＴｒａｐ Ｓカラムに負荷し、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むＰＢＳで溶出した。あるいは１０％酢酸の１／２０体積を添加して抗体を酸性化し、ｐＨ５の１０ｍＭコハク酸塩で希釈し、カラムにロードし、次いで１０カラム体積のコハク酸緩衝液で洗浄した。カラムをｐＨ７．５の５０ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡで溶出した。

溶出した還元ＴｈｉｏＭａｂを１５倍モル過剰のＤＨＡＡ（デヒドロアスコルビン酸）または２００ｎＭ硫酸銅水溶液（ＣｕＳＯ_４）で処理した。鎖間ジスルフィド結合の酸化は約３時間以上で完了した。周囲空気による酸化も有効であった。再酸化した抗体をｐＨ５の２０ｍＭコハク酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡに透析し、−２０℃で凍結保存した。

Ｔｈｉｏ−Ｍａｂ抗体とリンカー−抗生物質中間体ＶＩとの複合体化：脱ブロックされ、再酸化した、チオ抗体（ＴｈｉｏＭａｂ）を標的とする壁タイコ酸（抗ＷＴＡ）は、ｐＨ８の５０ｍＭトリス中の６〜８倍モル過剰などの過剰のリンカー抗生物質中間体ＶＩ（ＤＭＳＯストックから約２０ｍＭの濃度で）と、反応混合物のＬＣ−ＭＳ分析での判定による反応完了（１６〜２４時間）まで、水性混合物中で反応させた。複合体化反応の水性混合物は、プロピレングリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される溶媒を含んでいてもよい。

その後、粗製抗体−抗生物質複合体（ＡＡＣ）を、２０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ５で希釈した後、カチオン交換カラムにアプライした。カラムを少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ５で洗浄し、抗体をＰＢＳで溶出した。ＡＡＣを、ゲル濾過カラムを用いて２４０ｍＭスクロースを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／酢酸、ｐＨ５中に製剤化した。タンパク質濃度を測定するためのＵＶ分光法、凝集分析のための分析ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、及びリジンＣエンドペプチダーゼ処理前及び後のＬＣ−ＭＳによって、ＡＡＣを特徴付けた。

サイズ排除クロマトグラフィーは、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ８０２．５カラムを用いて、０．２５ｍＭ塩化カリウム及び１５％ＩＰＡを含むｐＨ６．２の０．２Ｍリン酸カリウム中で、０．７５ｍｌ／分の流速で実施した。ＡＡＣの凝集状態は、２８０ｎｍにおける溶出ピーク面積吸光度の積分によって測定した。

ＬＣ−ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＱＴＯＦ ６５２０ ＥＳＩ機器を用いて行った。一例として、この化学を用いて生成したＡＡＣを、ｐＨ７．５のトリス中の１：５００ｗ／ｗのエンドプロテイナーゼＬｙｓ Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、３７℃、３０分間処理した。得られた切断断片を、８０℃に加熱した１０００Ａ、８ｕｍのＰＬＲＰ−Ｓカラムに充填し、５分間で３０％Ｂ〜４０％Ｂの勾配で溶出させた。移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡを含むＨ_２Ｏ。移動相Ｂ：０．０４％ＴＦＡを含むアセトニトリル。流速：０．５ｍｌ／分。エレクトロスプレーイオン化及びＭＳ分析の前に、タンパク質溶出を２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出によってモニタリングした。非複合体化Ｆｃフラグメント、残留非複合体化Ｆａｂ及び抗生物質−Ｆａｂのクロマトグラフィー分離が多くの場合に達成された。得られたｍ／ｚスペクトルをＭａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてデコンボリューションし、抗体断片の質量を計算した。

前述の発明は、理解を明確にするために、例示及び実施例によって幾分詳細に記載されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。したがって、すべての適切な改変及び均等物は、以下の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれるものと見なし得る。本明細書中に引用するすべての特許及び科学文献の開示は、その全体を参照として明示的に援用する。

本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、以下が提供される。
（項１）
Ｆ−ベンゾキサジノリファマイシンＩの製造プロセスであって、

リファマイシンＳ ＩＩ、２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩ、と、ＴＥＭＰＯ及びＴＥＭＰＯ類似体、周囲空気、酸素ガス、ベンゾキノン、酸化マンガン（ＭｎＯ _２ ）、（ＰｈＩ（ＯＴｓ）ＯＨ、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ _４ ）、クロラニル、過酸化水素、Ｆｅ _２ Ｏ _３ 、Ｎａ _２ Ｓ _２ Ｏ _８ 、Ｃｏ（ａｃａｃ） _３ 、Ｍｎ（ａｃａｃ） _２ 、Ｃｕ（ＯＡｃ） _２ 、ＣｕＯ、ＣｕＢｒ _２ 、ＺｎＣｌ _２ 、ＩｎＣｌ _３ 、Ａｇ（ＯＴｆ） _２ 、Ｓｃ（ＯＴｆ） _３ 、ならびにＹｂ（ＯＴｆ） _３ から選択される１つ以上の酸化剤とを反応させて、Ｉを形成することを含む、前記製造プロセス。

（項２）
前記酸化剤が、酸素ガスを含む、上記項１に記載のプロセス。
（項３）
前記酸素ガスが、反応ガス相の約５％〜約１００％を構成する、上記項２に記載のプロセス。
（項４）
前記酸化剤が、触媒量のＴＥＭＰＯを含む、上記項２に記載のプロセス。
（項５）
前記酸化剤が、触媒量の銅塩を含む、上記項２に記載のプロセス。
（項６）
前記銅塩が酸化銅である、上記項５に記載のプロセス。
（項７）
前記酸化剤が、半連続プロセスによりＩＩＩから分離され、ＩＩがループプロセスにより改質されリサイクルされる、上記項２に記載のプロセス。
（項８）
ＩＩ及びＩＩＩの反応を、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、トルエン、メタノール、及びテトラヒドロフランから選択される溶媒中で行う、上記項１に記載のプロセス。
（項９）
Ｆ−リファＩと、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、１−メチルピペラジン、Ｎ１−イソブチルピペラジン、及びＮ，Ｎ−ジメチルピペリジン−４−アミンから選択される第二級アミンＲ _２ ＮＨとを反応させ、ＩＶを形成することをさらに含む、上記項１に記載のプロセス。

（項１０）
前記第二級アミンがＮ，Ｎ−ジメチルピペリジン−４−アミンであり、ＩＶが構造ＩＶａ

を有する、上記項９に記載のプロセス。
（項１１）
前記第二級アミンがＮ１−イソブチルピペラジンであり、ＩＶが構造ＩＶｂ

を有する、上記項９に記載のプロセス。
（項１２）
ＩＶａ及びＶを反応させてリンカー−抗生物質ＶＩを形成することをさらに含む、上記項９に記載のプロセス。

（項１３）
ＶＩと抗体とを水性混合物中で反応させて抗体−リファマイシン複合体を形成することをさらに含む、上記項１２に記載のプロセス。
（項１４）
前記水性混合物が、プロピレングリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される溶媒を含む、上記項１３に記載のプロセス。
（項１５）
前記抗体が抗壁タイコ酸抗体である、上記項１３に記載のプロセス。
（項１６）
ＶＩＩ及び塩化チオニルを反応させてＶを形成することをさらに含む、上記項１２に記載のプロセス。

（項１７）
Ｖを水から単離する、上記項１６に記載のプロセス。
（項１８）
２−アミノ−５−フルオロベンゼン−１，３−ジオールＩＩＩの製造プロセスであって：

（ａ）１，３，５−トリフルオロ−２−ニトロベンゼンＶＩＩＩと、フェニルメタノールと、リチウムビス（トリメチルシリルアミド）、リチウムジイソプロピルアミド、及びアルコキシド試薬から選択される塩基性試薬とを反応させて、（（（５−フルオロ−２−ニトロ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（メチレン））ジベンゼンＩＸを形成し；

ならびに
（ｂ）ＩＸと、水素ガス及び不均一系金属触媒とを反応させてＩＩＩを形成することを含む、前記製造プロセス。
（項１９）
前記アルコキシド試薬が、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムイソプロポキシド、ナトリウムイソプロポキシド、カリウムエトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、及びナトリウムメトキシドから選択される、上記項１８に記載のプロセス。
（項２０）
前記アルコキシド試薬がカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドである、上記項１８に記載のプロセス。
（項２１）
前記不均質金属触媒が、炭素またはアルミナ担体上の、パラジウム、白金、またはルテニウムから選択される、上記項１８に記載のプロセス。
（項２２）
ＩＸと、水素ガス及び不均一系金属触媒とを反応させて、脱ベンジル化中間体である５−フルオロ−２−ニトロベンゼン−１，３−ジオールを形成し、これを単離し、続いて水素ガス及び不均一系金属触媒でさらに処理してＩＩＩを形成する、上記項１８に記載のプロセス。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。
   

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