JP2020089382A - 対立遺伝子多様体の選択的低減 - Google Patents
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- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
Abstract
Description
本願は、電子様式の配列リストと共に出願される。配列リストは2011年2月7日に作成され、容量が322KbのBIOL0124WOSEQ.txtと題したファイルとして提供される。電子様式による配列リストの本情報は、その全体を引用により本明細書に含めるものとする。
Group 1993、Cell、72(6):971−83)。HTT遺伝子はHTTタンパク質をコードし、CAGトラクト伸長の結果、タンパク質のN末端近接においてポリグルタミンリピート数が異常増加する。個体はHTT遺伝子を2つ保有するが、突然変異対立遺伝子が1つ存在するだけでHDを発症する。
前記の概要及び以下の詳細な説明は、単に典型例を示しかつ説明することのみを目的とするのであって、請求項に記載の本発明の範囲を制限するものではないと理解されるべきである。本明細書では、特段の記述がない限り、単数の使用には複数も含まれる。本明細書で使用される「又は」は、特段の記述がない限り「及び/又は」の意味である。さらに、「を含む(including)」という用語、並びに、「を含む(includes)」及び「に含まれる(included)」等のその他の表現の利用は、制限を意味しない。また、「要素(element)」又は「コンポーネント(component)」等の用語には、特段の記述がない限り、1つのユニットを含む要素及びコンポーネントと、2以上のサブユニットを含む要素及びコンポーネントの両方が包含される。
特定の定義が付与されない限り、本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、及び医薬・製薬化学との関連で利用される命名法、及び手順と技法は、当業者に周知であり、また当技術分野で一般に使用されている。化学合成及び化学分析には、標準的技法が用いられ得る。可能であれば、全ての特許文献、特許出願書類、公開特許出願書類及びその他の刊行物、GENBANKアクセッション番号及び国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)等のデータベースを通じて取得可能な関連する配列情報、並びに本明細書での開示全体にわたり言及されるその他のデータは、本明細書で論じる文献の部分並びにその全体を、引用により含めるものとする。
ーを含むがこれに限定されない非ヒト霊長類等のヒト又は非ヒト動物を指しているが、これに限定されない。
経路を通じて投与してもよい。併用又は連続投与も共投与に含まれる。
多型対立遺伝子は、「連鎖不均衡」として記載され得る。ハプロタイプには、2つ、3つ、4つ、又はそれ以上の対立遺伝子が含まれ得る。組み換えイベントが起こらない限り、染色体の所定のセグメント沿いのハプロタイプ中の対立遺伝子群は、一般的には共に子孫に継承される。
突然変異としては安定しており、そのため、マーカーと未知の多様体間の連鎖不均衡を用いて疾患の原因となる突然変異をマッピングする関連研究に利用される。SNPの位置は、一般に、高度に保存された配列に隣接している。個体は、各SNP部位の対立遺伝子に対してホモ接合的又はヘテロ接合的であり得る。ヘテロ接合的SNP対立遺伝子は識別用多型となり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドでSNPを標的対象とすることもできる。すなわち、SNPは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20とアニールする(又は、一致する)ということである。ハイブリダイゼーションを促進するためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドの残りの塩基も、SNP部位に対し十分な相補性を有していなければならない。
では、対立遺伝子多様体には、一塩基多型(SNP)が含まれる。ある実施形態では、SNPは識別用多型である。ある実施形態では、SNPが突然変異対立遺伝子と関連している。ある実施形態では、SNPは、疾患と関連しているか、又は疾患の原因である別の多型と連鎖不均衡にある。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子は疾患と関連している。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子のmRNA及びタンパク質発現が疾患と関連している。
J Med、2002、346:45)、全身性エリテマトーデスに関与する白血球チロシンキナーゼタンパク質をコードするLtk遺伝子(Hum.Mol.Gen.2004、13:171)、高コレステロール血症に関与するPCSK9タンパク質をコードするPCSK9遺伝子(Hum Mutat.2009、30:520)、乳癌に関与するプロラクチン受容体タンパク質をコードするプロラクチン受容体遺伝子(Proc.Natl.Assoc.Sci.2008、105:4533)、COPD及び喘息に関与するケモカインCCL5をコードするCCL5遺伝子(Eur.Respir J.2008、32:327)、1型糖尿病、関節リウマチ、グレーブス病、及びSLEに関与するPTPN22タンパク質をコードするPTPN22遺伝子(Proc.Natl.Assoc.Sci.2007、104:19767)、球脊髄性筋萎縮症又はケネディ病に関与するアンドロゲン受容体タンパク質をコードするアンドロゲン受容体遺伝子(J Steroid Biochem.Mol.Biol.2008、108:245)、進行性の小児後嚢下白内障に関与するクロマチン修飾タンパク質−4BをコードするCHMP4B(Am.J.Hum.Genet、2007、81:596)、コレステロール胆石症、関節硬化症、及び糖尿病に関与するファルネソイドX受容体タンパク質をコードするFXR/NR1H4遺伝子(Mol.Endocrinol.2007、21:1769)、心血管疾患に関与するABCA1タンパク質をコードするABCA1遺伝子(Transl.Res.2007、149:205)、原発性高カルシウム尿症に関与するカルシウム感知受容体タンパク質をコードするCaSR遺伝子(Kidney Int.2007、71:1155)、α−サラセミアに関与するα−グロビンタンパク質をコードする
α−グロビン遺伝子(Science、2006、312:1215)、強迫性障害に関与するHTTLPRタンパク質をコードするhttlpr遺伝子(Am.J.Hum.Genet.2006、78:815)、不安障害及び併発うつ病等のストレス性障害におけるアルギニンバソプレッシンタンパク質をコードするAVP遺伝子(CNS Neurol.Disord.Drug Targets、2006、5:167)、先天性の視覚的な欠陥、高血圧、メタボリックシンドロームに関与するGタンパク質をコードするGNAS遺伝子(Trends Pharmacol.Sci.2006、27:260)、大うつ病素因に関与するAPAF1タンパク質をコードするAPAF1遺伝子(Mol.Psychiatry、2006、11:76)、乳癌及び前立腺癌に関与するTGF−β1タンパク質をコードするTGF−β1遺伝子(Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.2004、13:759)、先天性筋無力症候群に関与するアセチルコリン受容体をコードするAChR遺伝子(Neurology、2004、62:1090)、末梢動脈疾患のリスクに関与するアデノシン二リン酸(ADP)受容体タンパク質をコードするP2Y12遺伝子(Circulation、2003、108:2971)、心房細動に関与するLQT1タンパク質をコードするLQT1遺伝子(Cardiology、2003、100:109)、散発性褐色細胞腫に関与するRETタンパク質をコードするRETプロトオンコジーン(J.Clin.Endocrinol.Metab.、2003、88:4911)、様々な先天性奇形に関与するフィラミンAタンパク質をコードするフィラミンA遺伝子(Nat.Genet.、2003、33:487)、筋萎縮性側索硬化症に関与するTDP−43タンパク質をコードするTARDBP遺伝子(Hum.Mol.Gene.t2010、19:671)、マチャド−ジョセフ病に関与するアタキシン−3タンパク質をコードするSCA3遺伝子(PLoS One 2008、3:e3341)、脊髄小脳失調症7型に関与するアタキシン−7タンパク質をコードするSCA7遺伝子(PLoS One、2009、4:e7232)、及びハンチントン病に関与するハンチンチンタンパク質をコードするHTT遺伝子(Neurobiol Dis.1996、3:183)であり、並びに、炭酸脱水酵素4タンパク質をコードするCA4遺伝子、円錐ロッドホメオボックス転写因子タンパク質をコードするCRX遺伝子、網膜ファスシンホモログ2タンパク質をコードするFSCN2遺伝子、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ1タンパク質をコードするIMPDH1遺伝子、核内受容体サブファミリー2グループE3タンパク質をコードするNR2E3遺伝子、神経網膜ロイシンジッパータンパク質をコードするNRL遺伝子、pre−mRNAのスプライシング因子3タンパク質をコードするPRPF3(RP18)遺伝子、pre−mRNAのスプライシング因子8タンパク質をコードするPRPF8(RP13)遺伝子、pre−mRNAのスプライシング因子31タンパク質をコードするPRPF31(RP11)遺伝子、ペリフェリン2タンパク質をコードするRDS遺伝子、ロッド外膜タンパク質1タンパク質をコードするROM1遺伝子、ロドプシンタンパク質をコードするRHO遺伝子、RP1タンパク質をコードするRP1遺伝子、その全てが常染色体優性網膜色素変性症の疾患に関与している、網膜色素変性症のGTPアーゼ調節タンパク質をコードするRPGR遺伝子である(Adv Exp Med Biol.、2008、613:203)。
%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、SNP部位に対し100%相補的である。ある実施形態では、SNP部位は、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30核酸塩基長である。ある実施形態では、SNPは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20とアニールする。
である。ある実施形態では、各ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である。
は、4’−CH(CH3)−O−2’ブリッジが含まれる。
一塩基多型(SNP)は、遺伝的異質性の主要なソースを表すDNA配列中における1塩基対の代替である(Gene.1999、234:177)。SNP遺伝子型同定は、このような遺伝的多様体を調べるのに重要なツールである(Genome Res.2000、10:895;Trends Biotechnol.2000、18:77)。ある実施形態では、SNPを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、有効性、選択性、及び集団遺伝学の適用内容に基づき選択された。
ある実施形態では、SNPを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の有効性に基づいて作成される。有効性とは、一般に、標的配列領域のアンチセンス阻害に対する感受性を指している。ある実施形態では、特定のSNP部位は、アンチセンス阻害に特異的に敏感であり得る。そのような感受性の高い特定のSNP部位は、遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するためのアンチセンス化合物の標的となり得る。有効性は、ベンチマークオリゴヌクレオチドによる突然変異体mRNAの阻害度と比較した、SNPを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる突然変異体mRNAの阻害度により示される。
ある実施形態では、SNPを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の選択性に基づき作成される。選択性とは、一般に、野生型HTTタンパク質をコードするRNAと比べ、突然変異体HTTタンパク質をコードするRNA中の1又は複数の識別用多型(SNP)を優先的に標的と
する特定の配列、モチーフ、及び化学修飾を含むアンチセンス化合物を指している。ある実施形態では、特定の配列、モチーフ、及び化学修飾は、SNPを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を低減するのに特異的に選択する。特定の配列、モチーフ、及び化学修飾は、遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するのに利用される。選択性は、マイナー対立遺伝子又は野生型対立遺伝子と比較した、メジャー対立遺伝子又は突然変異対立遺伝子の発現を優先的に阻害するSNPを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力により示される。
ある実施形態では、SNPを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、疾患を患う集団の集団遺伝学に基づき作成される。集団遺伝学とは、特定の疾患を患う患者の疾患染色体にSNPが現れる頻度を意味する。ある実施形態では、疾患はハンチントン病である。アンチセンス化合物の有効性及び選択性が等しい場合、集団遺伝学的により関連性のあるSNP標的の方が、疾患染色体との関連が弱いSNPよりも好ましい。
オリゴマー化合物には、限定されないが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、模倣オリゴヌクレオチド、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNAsが含まれてもよい。オリゴマー化合物は、標的核酸に対する「アンチセンス」でもよく、それはすなわち、水素結合により標的核酸をハイブリダイズできるということである。
ユニットを欠失させてもよく、又は代わりに、アンチセンス化合物の3’末端から2つのサブユニットをさせてもよい。その代替として、欠失ヌクレオシドをアンチセンス化合物内に分散させてもよく、例えば、1つのヌクレオシドを5’末端から欠失させ、もう1つのヌクレオシドを3’末端から欠失させたアンチセンス化合物でもよい。
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、阻害活性の強化、標的核酸への結合親和性の増加、又はin vivo核酸分解酵素による分解への耐性等の特性をアンチセンス化合物に付与するために、パターンやモチーフを調整した化学修飾サブユニットを有する。
メントの間に媒介ヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載の任意のアンチセンス化合物は、ギャップマーモチーフを有し得る。いくつかの実施形態では、X及びZは同じであり、他の実施形態では、それらは異なる。ある実施形態では、Yは8ヌクレオチドと15ヌクレオチドの間である。ある実施形態では、Yはデオキシヌクレオチドから成る。X、Y、又はZは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、又はそれ以上のヌクレオチドのいずれかであり得る。よって、本発明のギャップマーには、例えば、1−10−1、1−18−1、2−8−2、2−9−6、2−10−2、2−13−5、2−16−2、3−9−3、3−9−5、3−10−3、3−14−3、4−8−4、4−9−5、4−10−5、4−11−4、4−12−3、4−12−4、5−8−5、5−9−5、5−10−4、5−10−5、又は6−8−6が含まれるが、これらに限定されない。
モチーフ又は4−9−3ギャップマーモチーフを有する。
ある実施形態では、本発明は、1つのウィングの少なくとも1つのヌクレオシドに、同じウィングの少なくとも1つの他のヌクレオシドと比較して、異なる修飾が施されているギャップマー化合物を提供する。アンチセンス化合物は、混合ウィングアンチセンス化合物と称される(国際公開第2008/049085号を参照のこと)。ある実施形態では、3’ウィングの1又は複数のヌクレオシドの修飾(又は非修飾)は、3’ウィングの1又は複数の他のヌクレオシドの修飾(又は非修飾)とは異なる。アンチセンス化合物は、3’混合ウィングギャップマーと称され得る。ある実施形態では、5’ウィングの1又は複数のヌクレオシドの修飾(又は非修飾)は、5’ウィングの1又は複数の他のヌクレオシドの修飾(又は非修飾)と異なる。アンチセンス化合物は、5’混合ウィングギャップマーと称され得る。ある実施形態では、3’ウィングの1又は複数のヌクレオシドの修飾(又は非修飾)は、3’ウィングの1又は複数の他のヌクレオシドの修飾(又は非修飾)と異なり、5’ウィングの1又は複数のヌクレオシドの修飾(又は非修飾)は、5’ウィングの1又は複数の他のヌクレオシドの修飾(又は非修飾)とは異なる。アンチセンス化合物は、3’、5’混合ウィングギャップマーと称され得る。係る実施形態では、3’ウィングと5’ウィングにおける修飾及び修飾の組み合わせは、同じであってもよく、又は異なってもよい。
ある実施形態では、ハンチンチンの対立遺伝子多様体は選択的に低減される。ハンチンチンをコードするヌクレオチド配列には、以下が含まれるが、これらに限定されない。すなわち、1566000〜1768000のヌクレオチドから切断され(GENBANKアクセッション番号NT_006051と置換)、配列番号1として本明細書に組み入れられたGENBANKアクセッション番号NT_006081.18、及び配列番号2として本明細書に組み入れられたNM002111.6である。
は終止コドン等、構造的に定義される特定の領域を特異的に排除することもできる。
ある実施形態では、以下に記載の実験において、GM04281細胞株、GM02171細胞株、及びGM02173B細胞株が使われる。GM04281細胞株は、17リピートを含む野生型HTT対立遺伝子及び69リピートを含む突然変異HTT対立遺伝子を有する。細胞株は、両親もまた疾患を患う患者由来である。GM02171細胞株は、GM04281に対する対照群として選ばれた。この細胞株は、片親のみ疾患を有する娘由来である。この娘はHDを発症していないが、発症リスクありと考えられた。GM02173B細胞株も患者由来であり、ハロタイプ試験の対照として使用された。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示するアンチセンス化合物とSNP部位の間で起こる。ハイブリダイゼーションの最も一般的なメカニズムは、核酸分子の相補的核酸塩基間の水素結合(例えば、ワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティー
ン水素結合等)を含む。
所望の効果(例えば、対立遺伝子多様体の遺伝子産物の選択的低減)を生じるよう相当数のアンチセンス化合物の核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合し得る場合、アンチセンス化合物及び標的核酸は互いに相補的である。
う用語はまた、第1及び/又は第2の核酸の特異的部分に関連して用いられ得る。例えば、30核酸塩基アンチセンス化合物の20核酸塩基部分は、400核酸塩基長である標的配列に対して「完全に相補的」であり得る。もし標的配列が対応する20核酸塩基部分を有し、各核酸塩基がアンチセンス化合物の20核酸塩基部分に対し相補的であるなら、30核酸塩基オリゴヌクレオチドの20核酸塩基部分は完全に相補的である。同時に、30核酸塩基アンチセンス化合物全体が標的配列に対して完全に相補的であってもなくてもよいが、それは、アンチセンス化合物の残りの10核酸塩基も標的配列に対して相補的であるかどうかによる。
本明細書で提供されるアンチセンス化合物はまた、特定のヌクレオチド配列、配列番号、又は特定のIsis番号で表される化合物若しくはその部分により表される化合物に対し、定められた割合の同一性を有し得る。本明細書で使用されるように、アンチセンス化合物は、核酸塩基の対形成能が同じであれば、本明細書で開示する配列に対して同一である。例えば、開示されるDNA配列のチミジンの代わりにウラシルを含むRNAは、ウラシルとチミジン双方ともアデニンと対形成するため、DNA配列と同一であると考えられる。本明細書に記載のアンチセンス化合物の短縮版又は伸張版、並びに本明細書で提供されるアンチセンス化合物と関連する非同一塩基を有する化合物についても考察が行われる。非同一塩基は互いに隣接してもよく、又はアンチセンス化合物全体に分散してもよい。アンチセンス化合物の同一性割合は、比較対象の配列と関連する同一の塩基対形成を有す
る塩基数に従って算出される。
ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基(塩基ともいう)部分は、通常、ヘテロ環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合的に連結するリン酸基をさらに含んだヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の2’、3’又は5’ヒドロキシ部分と連結し得る。オリゴヌクレオチドは、互いに隣接するヌクレオシドを共有結合的に連結させて形成され、線状高分子オリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造において、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結を形成するものと称される。
RNA及びDNAの天然に発生するヌクレオシド間連結は、3’から5’へのホスホジエステル連結である。例えば、細胞取込みの向上、標的核酸への親和性向上、及び核酸分解酵素存在下での安定性向上等の所望の特性の故に、天然発生ヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物よりも、1又は複数の修飾ヌクレオシド間連結、すなわち、非天然発生のヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物が選ばれることが多い。
酸類、ホスホロアミド酸、及びホスホロチオ酸が含まれるが、これらに限定されない。リン含有及び非リン含有連結の製造方法は周知である。
本発明のアンチセンス化合物には、糖基が修飾された、1又は複数のヌクレオシドが任意選択的に含まれ得る。糖修飾ヌクレオシドは、アンチセンス化合物に対し、核酸分解酵素安定性の向上、結合親和性の増加、対立遺伝子多様体の選択性の向上、又はその他いくつかの有益な生物特性をもたらす可能性がある。ある実施形態では、ヌクレオシドには、化学的に修飾されたリボフラノース環部分が含まれる。化学的に修飾されたリボフラノース環の実施例として、置換基(5’及び2’置換基、二環式核酸(BNA)を形成する非ジェミナル環原子の架橋、リボシル環の酸素原子のS、N(R)又はC(R1)(R)2との置換(R=H、C1−C12アルキル又は保護基)及びそれらの組み合わせの挿入が含まれるが、これらに限定されない。化学修飾糖の実施例には、2’−F−5’−メチル置換ヌクレオシド(その他の開示された5’、2’−bis置換ヌクレオシドに関しては、2008年8月21日に公開されたPCT国際出願の国際公開第2008/101157号を参照のこと)又はリボシル環の酸素原子をSと、さらに2’位置換(2005年6月16日に公開された米国特許出願公開第2005−0130923号を参照のこと)又は、代替としてBNAの5’位置換(2007年11月22日に公開されたPCT国際出願の国際公開第2007/134181号では、LNAが、例えば、5’−メチル又は5’−ビニル基で置換されている)が含まれる。
特許第7,427,672号を参照のこと);4’−CH2−C(H)(CH3)−2’(Chattopadhyayaら、J.Org.Chem.、2009、74、118−134を参照のこと);及び4’−CH2−C(=CH2)−2’(及びその類似体;2008年12月8日に公開された国際公開第2008/154401号を参照のこと)である。例えば、Singhら、Chem.Commun.、1998、4、455−456;Koshkinら、Tetrahedron、1998、54、3607−3630;Wahlestedtら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、2000、97、5633−5638;Kumarら、Bioorg.Med.Chem.Lett.、1998、8、2219−2222;Singhら、J.Org.Chem.、1998、63、10035−10039;Srivastavaら、J.Am.Chem.Soc.、129(26)8362−8379(2007年7月4日);米国特許第7,053,207号;第6,268,490号;第6,770,748号;第6,794,499号;第7,034,133号;及び第6,525,191号;Elayadiら、Curr.Opinion Invens.Drugs、2001、2、558−561;Braaschら、Chem.Biol.、2001、8、1−7;及びOrumら、Curr.Opinion Mol.Ther.、2001、3、239−243;及び米国特許第6,670,461号;国際公開第2004/106356号;国際公開第94/14226号;国際公開第2005/021570号;米国特許出願公開第2004−0171570号;米国特許出願公開第2007−0287831号;米国特許出願公開第2008−0039618号;米国特許第7,399,845号;米国特許出願第12/129,154号;第60/989,574号;第61/026,995号;第61/026,998号;第61/056,564号;第61/086,231号;第61/097,787号;第61/099,844号;国際出願PCT/US2008/064591号;PCT/US2008/066154号;PCT/US2008/068922号;及びPCT国際出願の国際公開第2007/134181号を参照のこと。前記二環式ヌクレオシドは、例えば、α−L−リボフラノース及びβ−D−リボフラノース及びβ−D−リボフラノースを含む、1又は複数の立体化学糖配置を有するよう調製され得る(国際出願PCT/DK98/00393、1999年3月25日に国際公開第99/14226号として公開)。
式中、
xは0,1、又は2;
nは1、2、3、又は4であり;
Ra及びRbはそれぞれ、独立して、水素、保護基、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、置換C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、置換C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル、置換C2〜C12アルキニル、C5〜C20アリール、置換C5〜C20アリール、複素環基、置換複素環基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C5〜C7脂環式基、置換C5〜C7脂環式基、ハロゲン、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、CN、スルホニル(S(=O)2−J1)、又はスルホキシル(S(=O)−J1)であり;並びに
J1及びJ2はそれぞれ、独立して、水素、C1〜C12アルキル、置換C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、置換C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル、置換C2〜C12アルキニル、C5〜C20アリール、置換C5〜C20アリール、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、複素環基、置換複素環基、C1〜C12アミ
ノアルキル、置換C1〜C12アミノアルキル又は保護基である。
(A)α−L−メチレンオキシ(4’−CH2−O−2’)BNA、(B)β−D−メチレンオキシ(4’−CH2−O−2’)BNA、(C)エチレンオキシ(4’−(CH2)2−O−2’)BNA、(D)アミノオキシ(4’−CH2−O−N(R)−2’)BNA、(E)オキシアミノ(4’−CH2−N(R)−O−2’)BNA、及び(F)メチル(メチレンオキシ)(4’−CH(CH3)−O−2’)BNA、(G)メチレン−チオ(4’−CH2−S−2’)BNA、(H)メチレン−アミノ(4’−CH2−N(R)−2’)BNA、(I)メチル炭素環(4’−CH2−CH(CH3)−2’)BNA、(J)プロピレン炭素環(4’−(CH2)3−2’)BNA、及び(K)エチレン炭素環(4’−CH2−CH2−2’)(カルバLNA又は“cLNA”)が含まれるが、これらに限定されない。
式中、Bxは塩基部分であり、Rは独立して水素、保護基又はC1〜C12アルキルである。
であり、式中、
Bxは複素環塩基部分であり;
−Qa−Qb−Qc−は、−CH2−N(Rc)−CH2−、−C(=O)−N(Rc)−CH2−、−CH2−O−N(Rc)−、−CH2−N(Rc)−O−又は−N(Rc)−O−CH2であり;
RcはC1〜C12アルキル又はアミノ保護基であり;並びに
Ta及びTbはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着である。
であり、式中
Bxは、複素環塩基部分であり;
Ta及びTbはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり;
Zaは、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、置換C1〜C6アルキル、置換C2〜C6アルケニル、置換C2〜C6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール又は置換チオである。
であり、式中、
Bxは複素環塩基部分であり;
Ta及びTbはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり;
Zbは、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、置換C
1〜C6アルキル、置換C2〜C6アルケニル、置換C2〜C6アルキニル、又は置換アシル(C(=O)−)である。
であり、式中、
Bxは複素環塩基部分であり;
Ta及びTbはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり;
Rdは、C1〜C6アルキル、置換C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、置換C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル又は置換C2〜C6アルキニルであり;
qa、qb、qc及びqdはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、C1〜C6アルキル、置換C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、置換C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル又は置換C2〜C6アルキニル、C1〜C6アルコキシル、置換C1〜C6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1〜C6アミノアルキル又は置換C1〜C6アミノアルキルである。
であり、式中、
Bxは複素環塩基部分であり;
Ta及びTbはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり;
qa、qb、qe及びqfはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、C1〜C12アルキル、置換C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、置換C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル、置換C2〜C12アルキニル、C1〜C12アルコキシ、置換C1〜C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk又はN(H)C(=S)NJjJkであり;
又はqe及びqfは共に=C(qg)(qh)であり;
qg及びqhはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、C1〜C12アルキル又は置換C1〜C12アルキルである。
、国際公開第98/39352号及び第99/14226号)に記載されている。
であり、式中、
Bxは複素環塩基部分であり;
Ta及びTbはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり;
qi、qj、qk及びqlはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、C1〜C12アルキル、置換C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、置換C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル、置換C2〜C12アルキニル、C1〜C12アルコキシル、置換C1〜C12アルコキシル、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk又はN(H)C(=S)NJjJk;並びに
qi及びqj又はql及びqkは共にC(qg)(qh)であり、式中、qg及びqhはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、C1〜C12アルキル又は置換C1〜C12アルキルである。
分を含むヌクレオシドを指している。ある実施形態では、ヌクレオシドの糖部分、又は糖部分類似体は、任意の部位で修飾又は置換されてもよい。
式中、式Xの少なくとも1つのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体それぞれは独立して、
Bxは複素環塩基部分であり;
T3及びT4はそれぞれ、独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であるか、又はT3及びT4のうちいずれ
か一方が、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、かつT3及びT4のもう片方は、水素、ヒドロキシル保護基、連結結合基、若しくは5’若しくは3’末端基であり;
q1、q2、q3、q4、q5、q6及びq7はそれぞれ、独立して、水素、C1〜C6アルキル、置換C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、置換C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル又は置換C2〜C6アルキニルであり;並びに
R1及びR2のうちいずれか片方は水素であり、もう片方はハロゲン、置換又は非置換アルコキシ、式中XはO、S又はNJ1であり、J1、J2及びJ3はそれぞれ独立して水素又はC1〜C6アルキルであるNJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2及びCNから選択される。
)。環系は、活性向上のために様々な追加置換を行うことができる。
核酸塩基(又は塩基)の修飾又は置換は、天然発生又は合成未修飾の核酸塩基とは構造的に判別可能であるが、機能的には相互互換的である。天然及び修飾核酸塩基双方は、水素結合に関与し得る。核酸塩基修飾は、核酸分解酵素安定性、結合親和性、対立遺伝子多様体の選択性向上、又はアンチセンス化合物に対し有益なその他複数の生物特性を与えることができる。修飾核酸塩基には、例えば5−メチルシトシン(5−me−C)等の合成及び天然核酸塩基が含まれる。5−メチルシトシン置換を含む特定の核酸塩基置換は、特に、標的核酸のアンチセンス化合物の結合親和性を向上させるのに有益である。例えば、5−メチルシトシン置換は、0.6〜1.2℃の差で、核酸二本鎖の安定性を向上させることはすでに示されている(Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.及びLebleu,B.編 Antisense Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、1993、276−278)。
C−CH3)ウラシルとシトシン及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6−アゾウラシル、シトシン及びチミン、5−ウラシル(偽ウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル及び他の8−置換アデニン類とグアニン類、5−ハロ特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチル及び他の5−置換ウラシル類とシトシン類、7−メチルグアニン及び7−メチルアデニン、2−F−アデニン、2−アミノ−アデニン、8−アザグアニン及び8−アザアデニン、7−デアザグアニンと7−デアザアデニン及び3−デアザグアニンと3−デアザアデニンが含まれる。
る。ある実施形態では、各シトシンは5−メチルシトシンである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の調製又は製剤のために薬剤的に許容できる活性又は不活性物質と混合してもよい。医薬組成物製剤のための組成物及び製剤方法は、投与経路、疾患の度合い、又は投与量等、数多くの基準によるがこれらに限定されない。
アンチセンス化合物を、活性、細胞分布、対立遺伝子多様体の選択性、又は結果として得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞取込等を向上させる、1又は複数の部分又は共役体と共有結合的に連結させてもよい。典型的な共役基には、コレステロール部分及び脂質部分が含まれる。追加の共役基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が含まれる。
アンチセンス化合物が標的核酸のレベル、活性、又は発現に対してもたらす効果を、様々な種類の細胞でin vitroに試験することができる。解析に使用される細胞の種
類は、市販の業者(例えば、American Type Culture Collection社、バージニア州マナッサス;Zen−Bio社、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク;Clonetics社、メリーランド州ウォーカーズビル)から入手可能であり、市販の試薬(例えば、Invitrogen Life Technologies社、カリフォルニア州カールスバッド)を用いて、業者のマニュアルに従って培養する。細胞の種類には、例えば、HepG2細胞、Hep3B細胞、及び初代肝細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞株の例として、GM04281、GM02171、及びGM02173B細胞が含まれる。
本明細書に記載されるのは、他のアンチセンス化合物処理のために適切に修飾され得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを有する細胞の処理方法である。
RNA解析は、全細胞RNA又はポリ(A)+mRNAで行うことができる。RNA単
離法は、当技術分野で周知である。RNAは、当技術分野で周知の方法、例えば、TRIZOL試薬(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド)を用いて、製造者が推奨するプロトコルに従って調製される。
標的核酸の低減、阻害、又は発現を、当技術分野で既知の様々な方法でアッセイすることが可能である。例えば、標的核酸レベルを、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、又は定量的リアルタイムPCR等により定量化することができる。RNA解析は全細胞RNA又はポリ(A)+mRNAで行うことができる。RNA単離法は、当技術分野で周知である。ノーザンブロット解析もまた、当技術分野で日常的に行われている。定量的リアルタイムPCRは、PE−Applied Biosystems社(カリフォルニア州フォースター市)から購入可能なABI PRISM7600、
7700、又は7900配列検知システム(Sequence Detection System)を用いて、製造業者のマニュアルに従って従来通りに行うことができる。
標的RNAレベルの定量は、ABI PRISM7600、7700、又は7900配
列検知システム(Sequence Detection System)(PE−Applied Biosystems社、カリフォルニア州フォースター市)を用いた定量的リアルタイムPCRにより、製造業者のマニュアルに従って行うことができる。定量的リアルタイムPCR法は、当技術分野で周知である。
標的核酸の低減、阻害、又は発現は、標的タンパク質レベルを測定することによりアッセイ可能である。標的タンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析(免疫ブロット)、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、定量タンパク質アッセイ、タンパク
質活性アッセイ(例えば、カスパーゼ活性アッセイ)、免疫組織化学、免疫細胞化学又は蛍光活性化セルソーティング(FACS)等、当技術分野で周知の様々な方法で評価し又は定量化することができる。標的に向けられる抗体は、抗体のMSRSカタログ(Aerie社、ミシガン州バーミンガム)等、様々なソースで同定し、そこから取得することができ、或いは、当技術分野で周知の従来のモノクロナール又はポリクロナール抗体の生成方法を介して調製することもできる。マウス、ラット、サル、及びヒトタンパク質の検知に有益な抗体は、市販されている。
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子産物を選択的に低減又はその発現を阻害し、疾患症状の寛解等の表現型変異をもたらす能力を評価するために、動物で試験される。試験は、正常な動物、又は実験用疾患モデルで行ってもよい。動物への投与のために、リン酸緩衝生理食塩水等の薬剤的に許容できる希釈剤でアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製する。投与には、腹腔内、静脈内、及び皮下投与等の非経口投与経路が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチド用量及び投与回数の算出は、当業者であれば可能であり、投与経路及び動物の体重等の要因により決められる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの処理期間終了後、RNA又はタンパク質を組織から単離し、標的核酸又はタンパク質発現における変化を測定する。
ある実施形態では、本明細書に記載の化合物及び組成物の投与方法は多数存在し得るが、それは、局所的処理又は全身性処理が所望であるかどうか、また処理対象の領域次第である。投与は、局所的(眼部、膣部、直腸部、鼻腔内部を含む)、経口、肺(粉末の吸入もしくは吹込又はエアロゾルを含む、噴霧器、気管内、鼻腔内、表皮性、経皮性を含む)又は、点滴、静脈内注射、若しくは皮下、腹腔内、眼内、硝子体内や筋肉内注射等の非経口であり得る。
本明細書で提供されるのは、突然変異対立遺伝子の阻害有効性及び選択性向上を提供する化合物及び方法である。有効性とは、ベンチマークヌクレオチドによる突然変異mRNAの阻害度と比較した、SNPを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる突然変異mRNAの阻害度で表される。選択性とは、マイナー対立遺伝子又は野生型対立遺伝子と比較して、メジャー対立遺伝子又は突然変異対立遺伝子の発現を優先的に阻害する、SNPを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力により示される。各SNP位置に異なる遺伝子型を有する3つの細胞株を利用することで、アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的とする有効かつ選択的SNPを提供する設計ルールの決定が促進された。
ある。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、又は少なくとも19核酸塩基長であり、SNPは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から数えて8〜14番目のポジション、及び/又はギャップの5’末端から数えて4〜7番目のポジションに相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、又は少なくとも19核酸塩基長であり、SNPは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から数えて8〜10番目のポジション、及び/又はギャップの5’末端から数えて4〜6番目のポジションに相補的である。
飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5’ウィング及び3’ウィングのいずれか片方又は両方に、(5’ウィングの5’末端及び3’ウィングの3’末端から数えて)2、3及び4番目のポジションに高度親和性糖修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5’ウィング及び/又は3’ウィングの(5’ウィングの5’末端及び3’ウィングの3’末端から数えて)1番目のポジションに高度親和性糖修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5’ウィング及び3’ウィングの(5’ウィングの5’末端及び3’ウィングの3’末端から数えて)1番目のポジション及びウィングの他のポジションの少なくとも1つに高度親和性糖修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’ウィング及び3’ウィングの少なくともいずれかにおいて、2’−MOEと高度親和性糖修飾が交互に現れる。
5、5−9−3、5−9−4、4−9−5、5−9−5、4−11−4、4−10−5及び5−10−4から成る群の任意の1つである。
グメントの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、2−9−6、3−9−3、3−9−5、4−9−5、4−11−4、及び5−10−4から成る群の任意の1つである。
スオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション5、6又は7が一塩基多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドに2’−O−メトキシエチル糖が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、2−9−6、3−9−3、3−9−5、4−9−5、4−11−4、及び5−10−4から成る群の任意の1つである。
あり、独立して、5’及び3’ウィングに2〜5連結ヌクレオシド、ギャップに7〜11連結ヌクレオシドを有する。SNPは、(アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から数えて)アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション6、7、8、9、又は10に、又はギャップセグメントの5’末端から数えてポジション4、5、6、又は7に相補的である。
);脊髄小脳失調症1型(SCA1)に関与するアタキシン−1タンパク質をコードするSCA1遺伝子(Protein Sci.2003、12:953);ペリツェウスメルツバッハー病に関与するプロテオリピドタンパク質をコードするPLP遺伝子(NeuroMol Med.、2007、4:73);捻転ジストニアに関与するトーシンAタンパク質をコードするDYT1遺伝子(Brain Res.2000、877:379);及び心筋症を含むタンパク質凝集疾患に関与するα−Bの結晶タンパク質をコードするα−B結晶遺伝子(Cell、2007、130:427);慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肝疾患及び肝細胞癌に関与するα1−アンチトリプシンタンパク質をコードするα−1アンチトリプシン遺伝子(New Engl.J.Med.、2002、346:45);全身性エリテマトーデスに関与する白血球チロシンキナーゼタンパク質をコードするLtk遺伝子(Hum.Mol.Gen.2004、13:171);高コレステロール血症に関与するPCSK9タンパク質をコードするPCSK9遺伝子(Hum.Mutat.2009、30:520);乳房腫瘍に関与するプロラクチン受容体タンパク質をコードするプロラクチン受容体遺伝子(Proc.Natl.Assoc.Sci.2008、105:4533);COPD及び喘息に関与するケモカインCCL5をコードするCCL5遺伝子(Eur.Respir.J.2008、32:327);1型糖尿病、関節リウマチ、グレーブス病、SLEに関与するPTPN22タンパク質をコードするPTPN22遺伝子(Proc.Natl.Assoc.Sci.2007、104:19767);脊髄延髄筋萎縮又はケネディ病に関与するアンドロゲン受容体タンパク質をコードするアンドロゲン受容体遺伝子(J.Steroid Biochem.Mol.Biol.2008、108:245);進行性小児後嚢下白内障に関与するクロマチン修飾タンパク質−4BをコードするCHMP4B遺伝子(Am.J.Hum.Genet.、2007、81:596);コレステロール胆石疾患、関節硬化症、及び糖尿病に関与するファルネソイドX受容体タンパク質をコードするFXR/NR1H4遺伝子(Mol.Endocrinol.、2007、21:1769);心血管疾患に関与するABCA1タンパク質をコードするABCA1遺伝子(Transl.Res.2007、149:205);原発性高カルシウム尿症に関与するカルシウム感知受容体タンパク質をコードするCaSR遺伝子(Kidney Int.2007、71:1155);α−サラセミアに関与するα−グロビンタンパク質をコードするα−グロビン遺伝子(Science、2006、312:1215);強迫性障害に関与するHTTLPRタンパク質をコードするhttlpr遺伝子(Am.J.Hum.Genet.2006、78:815);不安障害及び併存するうつ病等のストレス関連障害に関与するアルギニンバソプレシンタンパク質をコードするAVP遺伝子(CNS Neurol.Disord.Drug Targets、2006、5:167);先天性の視覚的な欠陥、高血圧、メタボリックシンドロームに関与するGタンパク質をコードするGNAS遺伝子(Trends Pharmacol.Sci.、2006、27:260);大うつ病素因に関与するAPAF1タンパク質をコードするAPAF1遺伝子(Mol.Psychiatry、2006、11:76);乳癌及び前立腺癌に関与するTGF−β1タンパク質をコードするTGF−β1遺伝子(Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.2004、13:759);先天性筋無力症症候群に関与するアセチルコリン受容体をコードするAChR遺伝子(Neurology、2004、62:1090);末梢動脈疾患のリスクに関与するアデノシン二リン酸(ADP)受容体タンパク質をコードするP2Y12遺伝子(Circulation、2003、108:2971);心房細動に関与するLQT1タンパク質をコードするLQT1遺伝子(Cardiology、2003、100:109);散発性褐色細胞腫に関与するRETタンパク質をコードするRETプロトオンコジーン(J.Clin.Endocrinol.Metab.、2003、88:4911);様々な先天性奇形に関与するフィラミンAタンパク質をコードするフィラミンA遺伝子(Nat.Genet.、2003、33:487);筋萎縮性側索硬化症に関与するTDP−43タンパク質をコードするTARDBP遺伝子(Hum.Mol.Gene.t、2010、19:671);マチャド−ジョ
セフ病に関与するアタキシン−3タンパク質をコードするSCA3遺伝子(PLoS One、2008、3:e3341);脊髄小脳失調症7型に関与するアタキシン−7タンパク質をコードするSCA7遺伝子(PLoS One、2009、4:e7232);ハンチントン病に関与するハンチンチンタンパク質をコードするHTT遺伝子(Neurobiol Dis.、1996、3:183);及び、炭酸脱水酵素4タンパク質をコードするCA4遺伝子、円錐ロッドホメオボックス転写因子タンパク質をコードするCRX遺伝子、網膜ファスシン相同体2タンパク質をコードするFSCN2遺伝子、イノシン一リン酸脱水素酵素1タンパク質をコードするIMPDH1遺伝子、核受容体サブファミリー2グループE3タンパク質をコードするNR2E3遺伝子、pre−mRNAのスプライシング因子3タンパク質をコードするPRPF3(RP18)遺伝子、神経網膜ロイシンジッパータンパク質をコードするNRL遺伝子、pre−mRNAのスプライシング因子8タンパク質をコードするPRPF8(RP13)遺伝子、pre−mRNAのスプライシング因子31タンパク質をコードするPRPF31(RP11)遺伝子、ペリフェリン2タンパク質をコードするRDS遺伝子、ロッド外膜タンパク質1タンパク質をコードするROM1遺伝子、ロドプシンタンパク質をコードするRHO遺伝子、RP1タンパク質をコードするRP1遺伝子、網膜色素変性症のGTPアーゼ調節タンパク質で、そのすべてが常染色体優性網膜色素変性症疾患に関与する、RPGR遺伝子(Adv.Exp.Med.Biol.、2008、613:203)である。
ある実施形態では、突然変異ハンチンチン対立遺伝子を標的とするアンチセンス化合物の治療的有効量投与には、アンチセンス化合物投与に対する個体反応を測定するため、個体の遺伝子産物の発現をモニタリングすることを伴う。ある実施形態では、遺伝子産物は
ハンチンチンmRNA又はタンパク質である。アンチセンス化合物の投与に対する個体の反応により、医師は、治療的介入の量及び期間を決定する。
ある実施形態では、本発明の1又は複数の医薬組成物は、1又は複数の他の医薬剤と共投与される。ある実施形態では、係る1又は複数の他の医薬剤は、本発明の1又は複数の医薬組成物と同様、同じ疾患、障害又は状態を治療するよう設計される。ある実施形態では、係る1又は複数の他の医薬剤は、本発明の1又は複数の医薬組成物とは異なる疾患、障害又は状態を治療するよう設計される。ある実施形態では、係る1又は複数の他の医薬剤は、本発明の1又は複数の医薬組成物の所望でない副作用を治療するよう設計される。ある実施形態では、本発明の1又は複数の医薬組成物は、他の医薬剤の所望でない作用を処置するために、別の医薬剤と共投与される。ある実施形態では、本発明の1又は複数の医薬組成物は、併用効果を生じさせるために、別の医薬剤と共投与される。ある実施形態では、本発明の1又は複数の医薬組成物は、相乗効果を生じさせるために、別の医薬剤と共投与される。
本明細書に記載の特定の化合物、組成物及び方法は、特定の実施形態に従って具体的に記載したが、以下の実施例は、本明細書に記載の化合物を例示することのみを目的とし、それを制限することを意図しない。本明細書で言及する特許、出願、刊行物、及びその他の公開文献は、その全体を引用により本明細書に含めるものとする。
本明細書で配列番号1(ヌクレオチドの1566000〜1768000まで切断されたNT_006081.18)と指定したHTT遺伝子配列を、EMBL−EBI配列データベース(ClustalW2、http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)を用いて、本明細書で配列番号2(NM_002111.6)と指定したHTTmRNAと一致させ、その結果を図1に示した。HTT遺伝子と関連するSNP位置(Haydenら、国際公開第2009/135322号により同定)を2本の配列にマップし、図1では、本明細書に引用により含まれる、米国生物工学情報センター(NCBI、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp)のEntrez SNPデータベースから取得した参照SNPのID番号別に示した。表2では、各SNPのさらなる詳細を提供する。「参照SNPのID番号」又は「RS番号」は、本明細書に含まれるNCBIのEntrez SNPデータベースから取得した各SNPの指定番号である。「SNP位置」は、配列番号1のSNPのヌクレオチド位置を指している。「多型」は、SNP位置のヌクレオチド多様体のことである。「メジャー対立遺伝子」とは、メジャー対立遺伝子と関連するヌクレオチド、又はヒト集団の中の統計的に有意な割合の個体集団に存在するヌクレオチドのことである。「マイナー対立遺伝子」は、マイナー対立遺伝子と関連するヌクレオチド、又はヒト集団の中の比較的少数の個体集団に存在するヌクレオチドのことである。
表1に提示されたSNP位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、Coriell製の3つのハンチンチン患者由来繊維芽細胞株、GM04281、GM02171、及びGM02173B(Coriell Institute for Medical Researchより取得)における有効性を試験した。ウェルあたり20,000個の細胞密度のGM04281培養細胞又はGM02171培養細胞又はGM02173B培養細胞を、電気穿孔を用いて、10,000nMアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約24時間処理した後、RNAを細胞から単離し、プライマープローブセットRT2617(配列番号3として指定されている順方向配列CTCCGTCCGGTAGACATGCT;配列番号4として指定されている逆方向配列GGAAATCAGAACCCTCAAAATGG;配列番号5として指定されているプローブ配列TGAGCACTGTTCAACTGTGGATATCGGGAX)を用いて、定量リアルタイムPCRによりHTTmRNAレベルを測定した。RIBOGREENで測定したRNAの全内容物に従って、HTTmRNAレベルを調整した。結果は、未処理対照細胞に対するHTTmRNAの阻害度として提示されている。
実施例2に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、GM04281細胞株、GM02171細胞株、及びGM02173B細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり25,000個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表5、表6、及び表7に記載したように、750nM、1,500nM、3,000nM、6,000nM、及び12,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約16時間処理した後、RNAを細胞から単離し、HTTmRNAレベルを定量リアルタイムPCRで測定した。ヒトHTTプライマープローブセットRTS2617を用いて、mRNAレベルを測定した。HTTmRNAレベルは、RIBOGREENで測定したRNAの全内容物に従って調製された。結果は、未処理対照細胞に対するHTTmRNA阻害度として示した。IC50値も表5、表6、及び表7で提供されている。
実施例2に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、GM04281細胞株、GM02171細胞株、及びGM02173B細胞株において様々な用量で試験した。各細胞を、ウェルあたり25,000個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表8、表9、及び表10に記載されているように、750nM、1,500nM、3,000nM、6,000nM、及び12,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約16時間処理した後、RNAを細胞から単離し、HTTmRNAレベルを定量リアルタイムPCRで測定した。ヒトHTTプライマープローブセットRTS2617を用いて、mRNAレベルを測定した。HTTmRNAレベルは、RIBOGREENで測定したRNAの全内容物に従って調製された。結果は、未処理対照細胞に対するHTTmRNA阻害度として示した。IC50値も表8、表9、及び表10で提供されている。
追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、実施例4に記載の研究から選抜したギャップマーに基づき設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、表8、表9、表10に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流(すなわち「マイクロウォーク」)に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、MOEを共通とし、加えて様々なモチーフで、すなわち2−9−6MOE、3−9−3MOE、3−9−4MOE、3−9−5MOE、4−10−5MOE、4−11−4MOE、4−7−4MOE、4−9−4MOE、4−9−5MOE、5−10−4MOE、5−7−5MOE、5−8−6MOE、5−9−3MOE、5−9−5MOE、6−7−6MOE、6−9−2MOE、及び6−8−5MOEで作成された。
、rs12506200、rs762855、及びrs1006798であるものを標的とするよう設計された(表2を参照のこと)。オリゴヌクレオチドは、メジャー対立遺伝子又はマイナー対立遺伝子のいずれかを標的とし、SNP位置がギャップマーのポジション8又は10のいずれかと相対するよう設計された。
設計されたギャップマーの一部は、これらを元に設計されている。ISIS387916は、各SNP位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして本研究に含まれた。
実施例5に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、GM04281細胞株、GM02171細胞株、及びGM02173B細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり25,000個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表20、表21、及び表22に記載されているように、750nM、1,500nM、3,000nM、6,000nM、及び12,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約16時間処理した後、RNAを細胞から単離し、HTTmRNAレベルを定量リアルタイムPCRで測定した。ヒトHTTプライマープローブセットRTS2617を用いて、mRNAレベルを測定した。HTTmRNAレベルは、RIBOGREENで測定したRNAの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するHTTmRNA阻害度として示した。IC50値も表20、表21、及び表22で提供されている。
追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、実施例2に記載の研究から選抜されたギャップマーに基づき設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、表4に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流(すなわち「マイクロウォーク」)に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。
胞を、電気穿孔を用いて、10,000nMアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約24時間処置した後RNAを細胞から単離し、プライマープローブセットRT2617を用いて、定量リアルタイムPCRで測定した。HTTmRNAレベルを、RIBOGREENで測定したRNAの全内容物に従って調整した。結果は、未処理対照細胞に対するHTTmRNA阻害度として提供されている。
実施例7に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、GM04281細胞株、GM02171細胞株、及びGM02173B細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり25,000個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表49、表50、及び表51に記載されているように、750nM、1,500nM、3,000nM、6,000nM、及び12,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約16時間処理した後、RNAを細胞から単離し、HTTmRNAレベルを定量リアルタイムPCRで測定した。ヒトHTTプライマープローブセットRTS2617を用いて、mRNAレベルを測定した。HTTmRNAレベルは、RIBOGREENで測定したRNAの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するHTTmRNA阻害度として示した。IC50値も表49、表50、及び表51で提供されている。
追加のギャップマーを、実施例4に記載の研究から選択されたギャップマーに基づき設計した。これらギャップマーは、表8、表9、表10に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流(すなわち「マイクロウォーク」)に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。ギャップマーはまた、3−9−3又は5−9−5モチーフで、及び様々なヌクレオシド位置の拘束6(S)−CH3−二環式核酸(BNA)分子で作成された。
実施例9に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、GM04281細胞株、GM02171細胞株、及びGM02173B細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり25,000個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表75、表58、及び表59に記載されているように、312.5nM、625nM、1,250nM、2,500nM、5,000nM、及び10,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約16時間処理した後、RNAを細胞から単離し、HTTmRNAレベルを定量リアルタイムPCRで測定した。ヒトHTTプライマープローブセットRTS2617を用いて、mRNAレベルを測定した。HTTmRNAレベルは、RIBOGREENで測定したRNAの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するHTTmRNA阻害度として提示されている。IC50値も表57、表58、及び表59で提供されている。
追加のギャップマーを、実施例10に記載の研究から選抜されたギャップマーに基づき設計した。これらのギャップマーは、表57,表58、及び表59に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流(すなわち「マイクロウォーク」)に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。ギャップマーはまた、4−9−4MOE又は5−9−5MOEモチーフで、及び様々なヌクレオチド位置の拘束6(S)−CH3−二環式核酸(BNA)分子で作成された。
すなわちISIS435890、ISIS460210、ISIS435879、ISIS460209、ISIS435870、及びISIS460207は、新たに設計されたギャップマーの由来元であるが、表の中では*印を付した。ISIS387916は、各SNP位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして本研究に含まれた。
実施例11に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、GM04281細胞株、GM02171細胞株、及びGM02173B細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり25,000個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表63、表64、及び表65に記載されているように、625nM、1,250nM、2,500nM、5,000nM、及び10,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約16時間処理した後、RNAを細胞から単離し、HTTmRNAレベルを定量リアルタイムPCRで測定した。ヒトHTTプライマープローブセットRTS2617を用いて、mRNAレベルを測定した。HTTmRNAレベルは、RIBOGREENで測定したRNAの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するHTTmRNA阻害度として示した。IC50値も表63、表64、及び表65で提供されている。
上記の各研究由来のギャップマーを、有効性及び選択性に基づくさらなる解析のために選抜した。
3つの細胞株における阻害度の違いが確認された。IC50は、50%阻害HTTmRNAに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。IC50値の単位は、μMである。
ジャー対立遺伝子G、マイナー対立遺伝子A)を標的とする4−11−4MOEギャップマーである。GM04281細胞株は、SNP位置rs362306でホモ接合GGである。GM02173B細胞株及びGM02171細胞株は、SNP位置rs362306でヘテロ接合GAである。よって、ISIS460028は、GM04281においてHTTmRNAを阻害する可能性があり、GM02173及びGM02171においてはHTTmRNA阻害の可能性は低くければ、選択性が示されたことになる。表20、表21、及び表22から引用し、下記の表68に示したIC50値により、ホモ接合GG細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合AG細胞株においてあまり低減されなかったという、GM04281細胞株とGM02173及びGM02171細胞株の阻害度の違いが確認された。IC50は、50%阻害HTTmRNAに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。IC50値の単位は、μMである。
上記の各研究由来のギャップマーを、有効性及び選択性に基づくさらなる解析のために選抜した。
立遺伝子A、マイナー対立遺伝子G)を標的とし、ポジション2、3、13、及び14にcEtサブユニットを有する3−9−3ギャップマーである。GM04281細胞株は、SNP位置rs7685686でホモ接合AAである。GM02173B細胞株は、SNP位置rs7685686でヘテロ接合AGである。GM02171細胞株は、SNP位置rs7685686でホモ接合GGである。よって、ISIS460209は、GM04281においてHTTmRNAを阻害する可能性があり、GM02173においてはHTTmRNA阻害の可能性は低く、GM02171においては有意なHTTmRNA阻害はほとんど認められない若しくは皆無であれば、選択性が示されたことになる。表57、表58、及び表59から引用し、下記の表69に示したIC50値により、ホモ接合AA細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合AG細胞株において適度に低減され、ホモ接合GG細胞株ではあまり低減されなかったという、3つの細胞株における阻害度の違いが確認された。IC50は、50%阻害HTTmRNAに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。IC50値の単位は、μMである。
7))は、オリゴヌクレオチドのポジション8のSNPrs4690072(メジャー対立遺伝子T、マイナー対立遺伝子G)を標的とし、ポジション2、3、13、及び14にcEtサブユニットを有する3−9−3ギャップマーである。GM04281細胞株は、SNP位置rs4690072でホモ接合TTである。GM02173B細胞株は、SNP位置rs4690072でヘテロ接合TGである。GM02171細胞株は、SNPrs4690072のホモ接合GGである。よって、ISIS460208が、GM04281においてHTTmRNAを阻害する可能性があり、GM02173においてはHTTmRNA阻害の可能性は低く、GM02171においては有意なHTTmRNA阻害はほとんど認められない若しくは皆無であれば、選択性が示されたことになる。表57、表58、及び表59から引用し、下記の表70に示したIC50値により、ホモ接合TT細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合TG細胞株において適度に低減され、ホモ接合GG細胞株ではあまり低減されなかったという、3つの細胞株における阻害度の違いが確認された。IC50は、50%阻害HTTmRNAに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。IC50値の単位は、μMである。
ハンチントン病と関連する様々なSNP位置の遺伝子型を、上記実施例で使用された3つのCoriell製細胞株の間で、並びにGM04022繊維芽細胞、BACHDマウスモデル及びYAC18マウスモデルと比較した。
Entrez SNPデータベース)でヘテロ接合であり、A対立遺伝子(アデニン)及びC対立遺伝子(シトシン)を配列番号2のヌクレオチド5310に有していた(van Bilsen,P.H.J.ら、Human Gene Therapy.19:710−718、2008)。YAC18マウスは、ヒトハンチンチン遺伝子を含有するYAC導入遺伝子で開発した(Hodgson,ら、Hum.Mol.Genet.5:1875−85、1996)。BACHDマウスは、バクテリア人工染色体のコントロール下で、97グルタミン反復で全長突然変異ハンチンチン遺伝子を発現させて開発した(Gray,M.ら、J.Neurosc.28:6182−95、2008)。4つの細胞株及びマウスモデルにおける指定SNP位置の遺伝子型を比較できるよう表72に示した。
ヒトHTTのSNPrs7685686を標的とするISIS460209(5’−TAAATTGTCATCACC−3’(配列番号203))、及びISIS387916(TCTCTATTGCACATTCCAAG(配列番号6))で、非ヒト又はマウスSNP標的部位を有しないアンチセンスオリゴヌクレオチドのHttタンパク質レベルに対する効果について、in vitroで試験した。ISIS387916を、ミスマッチ1つを有する標的の開始部位5763で、ネズミHttmRNA(GENBANKアクセッション番号NM_010414.1、本明細書で配列番号286と指定)と相互反応させる。ISIS460209を、3つのミスマッチを有する標的開始部位6866で、ネズミHttmRNAと相互反応させる。
培地の中でB27サプリメント(Invitrogen社、17504−044)で再懸濁し、カウントした。ウェルあたり1.7×105細胞をポリ−D−リジン(BD Biosciences社、354210)でプレコートしたウェルプレート24枚に播種した。ニューロンは、2日目にin vitroで、B27を使い、200μlのneurobasal培地で培養した。
的アンチセンス阻害
実施例3、4、10,及び12に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、GM04281細胞株、GM02171細胞株、及びGM02173B細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり25,000個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表72、表73、及び表74に記載されているように、0.4747nM、1.5011nM、4.7463nM、15.0079nM、45.455nM、150.0527nM、474.4673nM、1,500.27nM、4,743.833nM、及び15,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約16時間処理した後、RNAを細胞から単離し、HTTmRNAレベルを定量リアルタイムPCRで測定した。ヒトHTTプライマープローブセットRTS2617を用いて、mRNAレベルを測定した。HTTmRNAレベルは、RIBOGREENで測定したRNAの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するHTTmRNA阻害度として提示されている。IC50値も表72、表73、及び表74で提供されている。
実施例17に記載の研究由来のギャップマーの一部をGM04022繊維芽細胞(Coriell Institute for Medical Research製)で試験した。
Gene Therapy.19:710−718、2008)に記載の分子ビーコンアッセイを、蛍光体及び消光剤と連結した「分子ビーコン」合成オリゴヌクレオチドを用いて行った。GM04022繊維芽細胞を電気穿孔で、表75〜77に記載されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を0.06μM、0.19μM、0.56μM、1.67μM、5μM及び15μMとし、ISIS435879、ISIS460209又はISIS476333で形質移入した。ベンチマークオリゴヌクレオチドとしてISIS387916をアッセイに含めた。アニーリング温度56.5℃でA対立遺伝子用の分子ビーコンのqRT−PCRアッセイを行った。アニーリング温度62.0℃でC対立遺伝子用の分子ビーコンのqRT−PCRアッセイを行った。プライマープローブセットRT2617を用いて、HTTmRNAの総低減量を測定した。アッセイの結果は、表77〜79に、PBS対照に対する阻害度として提示した。結果として、SNP特異的ISISオリゴヌクレオチドは、A対立遺伝子と比べて、rs7685686のC対立遺伝子を特異的に標的とすることが示された(表80)。
ヒト対立遺伝子特異的ISISオリゴヌクレオチドのスクリーニングに有望なSNPを同定するために、YAC18マウス及びBACHDマウスのHTTmRNAをGoldengate96SNPアッセイにより配列決定した。BACマウス及びYACマウスは、いくつかの主要SNP位置(表72)に異なる対立遺伝子を擁し、よって、対立遺伝子特異的ノックダウンのスクリーニングツールとして用いられ得ると判断した。マウス種における標的に選ばれた各SNP位置もヒトHD染色体と比較した。各標的に関して、ヒトHD集団の約50%は、YAC18マウスではなく、BACHDマウスで発現する標的に対しヘテロ接合である。
6.5の妊娠雌マウスYAC18(ライン60,+/+)から作成した。よって、子孫はすべてホモ接合型YAC18(ライン60)であり、プールド皮質培養を促進する。BACHDのE16.5胚を、妊娠BACHD(+/−)雄マウスと交配させた妊娠BACHD(+/−)マウスから単離し、マウス胎仔単独培養して遺伝子型同定を行った。試料の相互汚染防止のため、単一皮質を単離した。分離された各皮質を用いて、6ウェルプレートの5つのウェルに播種した。遺伝子型同定後、ASO処置にはBACHD(+/−)培養のみを用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、division2でニューロンへと培養された補足培地に加えた。8日後に、セルスクレーパーを用いて1mLの培地に細胞を収穫した。2,500rpmで5分間4℃で細胞を遠心分離し、50mMTris、pH=8.0、150mM Nacl、1%Igepal、40mMβ−グリセロリン
酸塩、10mM NaF、1×ロッシュ完全プロテアーゼ阻害(Roche compl
ete protease inhibitor)、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、及び800μM PMSFの緩衝液でペレットを再懸濁した。15分間インキュベート
した後、ライセートを遠心分離し、タンパク質濃度をDCアッセイ(BioRad)で測定した。
Claims (102)
- 一塩基多型部位を標的とする12〜30連結ヌクレオシドから成る修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドには、デオキシヌクレオシドギャップの5’末端に位置する5’ウィング領域、及びデオキシヌクレオシドの3’末端に位置する3’ウィング領域を有するウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15、又はギャップの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション1、2、3、4、5、6、7、8、又は9が一塩基多型と一致している化合物。
- 一塩基多型部位が疾患と関連する突然変異対立遺伝子上にある、請求項1に記載の化合物。
- 一塩基多型部位が識別用多型を含む、請求項1に記載の化合物。
- 修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが12〜20連結ヌクレオシドから成る、請求項1に記載の化合物。
- 修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが15〜20連結ヌクレオシドから成る、請求項1に記載の化合物。
- 修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが15〜19連結ヌクレオシドから成る、請求項1に記載の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション8、9、若しくは10、又はギャップの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション4、5、若しくは6が一塩基多型と一致する、請求項1、4、5、及び6のいずれか1項に記載の化合物。
- ギャップ領域が7〜11ヌクレオシド長であり、5’ウィング領域が1〜6核酸塩基長、及び3’ウィング領域が1〜6核酸塩基長である、請求項7に記載の化合物。
- ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが、5−10−5、2−9−6、3−9−3、3−9−4、3−9−5、4−7−4、4−9−3、4−9−4、4−9−5、4−10−5、4−11−4、4−11−5、5−7−5、5−8−6、5−9−3、5−9−5、5−10−4、5−10−5、6−7−6、6−8−5、及び6−9−2から成る群の任意の1つである、請求項8に記載の化合物。
- ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが、2−9−6、4−9−5、及び4−11−4から成る群の任意の1つである、請求項9に記載の化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシド間連結が修飾ヌクレオシド間連結である、請求項1に記載の化合物。
- 各ヌクレオシド間連結がホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である、請求項2に記載の化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項1に記載の化合物。
- 修飾核酸塩基が5’−メチルシトシンである、請求項5に記載の化合物。
- 少なくとも1つのウィング領域の少なくとも1つのヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれている、請求項1に記載の化合物。
- 各ウィング領域の各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている、請求項1に記載の化合物。
- 糖又は糖代用が2’−O−メトキシエチル修飾糖である、請求項16に記載の化合物。
- ウィング領域の少なくとも1つに4’〜2’二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングのヌクレオシドの少なくとも1つが非二環式2’−修飾ヌクレオシドである、請求項1に記載の化合物。
- 非二環式2’−修飾ヌクレオシドが2’−O−メトキシエチルヌクレオシドである、請求項16に記載の化合物。
- 4’〜2’二環式ヌクレオシドが4’−CH(CH3)−O−2’二環式ヌクレオシドである、請求項1に記載の化合物。
- 修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが、17連結ヌクレオシドから成り、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション9が識別用多型と一致する、請求項1に記載の化合物。
- ウィング−ギャップ−ウィングモチーフが2−9−6である、請求項21に記載の化合物。
- 18連結ヌクレオシドから成り、識別用多型部位と90%相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション9が識別用多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドに2’−O−メトキシエチル糖が含まれ、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが4−9−5である化合物。
- 19連結ヌクレオシドから成り、識別用多型部位に対し90%相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション10が識別用多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドに2’−O−メトキシエチル糖が含まれ、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが4−11−4である化合物。
- 15〜19連結ヌクレオシドから成り、識別用多型部位と相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション6、7、8、9、10、11、12、13、又は14が識別用多型と一致している修飾オリゴヌクレオチド;及び、
少なくとも1つの高度親和性糖修飾;
を含む化合物。 - 修飾オリゴヌクレオチドが一塩基多型部位と100%相補的である、請求項1に記載の
化合物。 - 少なくとも1つのウィング領域に高度親和性糖修飾が含まれる、請求項1に記載の化合物。
- 高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項27に記載の化合物。
- 二環式糖に4’−CH(CH3)−O−2’ブリッジが含まれる、請求項28に記載の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション2、3、6、9、10、11、13、又は14の少なくとも1つに、少なくとも1つの高度親和性糖修飾が含まれる、請求項25に記載の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、オリゴヌクレオチドのポジション2、3、13、及び14の少なくとも1つに、少なくとも1つの高度親和性糖修飾が含まれる、請求項25に記載の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、オリゴヌクレオチドのポジション2、3、13、及び14それぞれに、少なくとも1つの高度親和性糖修飾が含まれる、請求項31に記載の化合物。
- 高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項32に記載の化合物。
- 二環式糖に4’−CH(CH3)−O−2’ブリッジが含まれる、請求項33に記載の化合物。
- ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが3−9−3、4−9−4、及び5−9−5から成る群のいずれかである、請求項25に記載の化合物。
- 15、17、又は19連結ヌクレオシドから成り、識別用多型部位と完全に相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション6、8、10、又は14が識別用多型と一致している修飾オリゴヌクレオチド;及び
少なくとも1つの高度親和性糖修飾;
を含む化合物。 - 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション2、3、6、9、10、11、13、又は14の少なくとも1つに、少なくとも1つの高度親和性糖修飾が含まれる、請求項36に記載の化合物。
- 高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項37に記載の化合物。
- 二環式糖に4’−CH(CH3)−O−2’ブリッジが含まれる、請求項38に記載の化合物。
- ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが3−9−3、4−9−4、及び5−95から成る群のいずれかである、請求項36に記載の化合物。
- 15連結ヌクレオシドから成り、識別用多型と90%相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション8が識別用多型と一致している、修飾オリゴヌクレオチド;及び
少なくとも1つの高度親和性糖修飾;
を含む化合物。 - 修飾オリゴヌクレオチドが識別用多型と100%相補的である、請求項41に記載の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドポジション2、3、13、及び14それぞれに、少なくとも1つの高度親和性糖修飾を含む、請求項41に記載の化合物。
- 高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項43に記載の化合物。
- 二環式糖に4’−CH(CH3)−O−2’ブリッジが含まれる、請求項44に記載の化合物。
- ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが3−9−3である、請求項41に記載の化合物。
- 識別用多型部位に対し相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15が識別用多型と一致する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織、又は動物における一塩基多型を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドが一塩基多型に対し90%相補的である、請求項47に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドが一塩基多型に対し95%相補的である、請求項47に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドが一塩基多型に対し100%相補的である、請求項47に記載の方法。
- 一塩基多型部位が12〜30核酸塩基長である、請求項47に記載の方法。
- 一塩基多型部位が15〜25核酸塩基長である、請求項47に記載の方法。
- 一塩基多型部位が17〜22核酸塩基長である、請求項47に記載の方法。
- 一塩基多型部位が17核酸塩基長である、請求項47に記載の方法。
- 一塩基多型部位が18核酸塩基長である、請求項47に記載の方法。
- 一塩基多型部位が19核酸塩基長である、請求項47に記載の方法。
- 一塩基多型部位が20核酸塩基長である、請求項47に記載の方法。
- 対立遺伝子多様体が疾患と関連している、請求項47に記載の方法。
- 疾患がハンチントン病である、請求項58に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項47に記載の方法。
- 少なくとも1つのヌクレオシド間連結が修飾ヌクレオシド間連結である、請求項60に記載の方法。
- 各ヌクレオシド間連結がホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である、請求項61に記載の方法。
- 少なくとも1つのヌクレオシドに修飾核酸塩基が含まれる、請求項60に記載の方法。
- 少なくとも1つの修飾核酸塩基が5’−メチルシトシンである、請求項63に記載の方法。
- 少なくとも1つのヌクレオシドに修飾糖が含まれる、請求項60に記載の方法。
- 修飾糖が高度親和性糖修飾である、請求項65に記載の方法。
- 高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項66に記載の方法。
- 各二環式糖に4’−CH(CH3)−O−2’ブリッジが含まれる、請求項67に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドポジション2、3、13、及び14のうち少なくとも1つに、4’−CH(CH3)−O−2’ブリッジを含む二環式糖を有するヌクレオシドが含まれる、請求項60に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドポジション2、3、13、及び14のそれぞれに、4’−CH(CH3)−O−2’ブリッジを含む二環式糖が含まれる、請求項69に記載の方法。
- 少なくとも1つの修飾糖に2’−O−メトキシエチルが含まれる、請求項65に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドのウィングセグメントに位置する各ヌクレオシドに2’−O−メトキシエチル修飾が含まれる、請求項71に記載の方法。
- ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが、2−9−6、3−9−3、3−9−4、3−9−5、4−7−4、4−9−4、4−9−5、4−10−5、4−11−4、4−11−5、5−7−5、5−8−6、5−9−3、5−9−5、5−10−4、5−10−5、6−7−6、6−8−5、及び6−9−2から成る群のいずれかである、請求項47に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドはリボザイム、二本鎖siRNA、又はshRNAではない、請求項47に記載の方法。
- 一塩基多型部位が疾患と関連する突然変異対立遺伝子である、請求項47に記載の方法。
- 一塩基多型部位が識別用多型を含む、請求項47に記載の方法。
- 修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが12〜20連結ヌクレオシドから成る、請求項47に記載の方法。
- 修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが15〜19連結ヌクレオシドから成る、請求項47に記載の方法。
- ギャップ領域が7〜11ヌクレオシド長であり、5’ウィング領域が1〜6核酸塩基長であり、3’ウィング領域が1〜6核酸塩基長である、請求項47に記載の方法。
- 少なくとも1つのウィング領域の少なくとも1つのヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、請求項47に記載の方法。
- 各ウィング領域の各ヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、請求項47に記載の方法。
- 糖又は糖代用物が2’−O−メトキシエチル修飾糖である、請求項81に記載の方法。
- ウィング領域の少なくとも1つに4’〜2’二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングのヌクレオシドの少なくとも1つが非二環式2’−修飾ヌクレオシドである、請求項47に記載の方法。
- 非二環式−2’−修飾ヌクレオシドが2’−O−メトキシエチルヌクレオシドである、請求項81に記載の方法。
- 4’〜2’二環式ヌクレオシドが4’−CH(CH3)−O−2’二環式ヌクレオシドである、請求項47に記載の方法。
- 識別用多型に対し相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15が識別用多型と一致する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織、又は動物における一塩基多型を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法。
- 12〜30連結ヌクレオシドから成り、識別用多型と相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15が識別用多型と一致する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織、又は動物に一塩基多型を含む遺伝子の、突然変異対立遺伝子である対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法。
- 突然変異対立遺伝子が、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、アレキサンダー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPA)、脊髄小脳失調症、捻転ジストニア、心筋症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肝疾患、肝細胞癌、全身性エリテマトーデス、高コレステロール血症、乳癌、喘息、1型糖尿病、関節リウマチ、グレーブス病、SLE、球脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、進行性の小児期後嚢下の白内障、コレステロール胆石症、関節硬化症、心血管疾患、主要な高カルシウム尿症、α−サラセミア、強迫性障害、不安、併存するうつ病、先天性の視覚的な欠陥、高血圧、メタボリックシンドローム、前立腺がん、先天性筋無力症候群、末梢動脈疾患、心房細動、散発性褐色細胞腫、先天奇形、マチャド−ジョセフ病、ハンチントン病、常染色体優性網膜色素変性症から成る群の任意の疾患と関連している、請求項81に記載の方法。
- 12〜30連結ヌクレオシドから成り、識別用多型と相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15が識別用多型と一致する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織、又は動物に一塩基多型を含む遺伝子の、ハンチントン病と関連している対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減することを含む、ハンチントン病の治療方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション8、9、若しくは10、又はギャップの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション4、5、若しくは6が一塩基多型と一致する、請求項47、86、87、及び89のいずれか1項に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション6、7、8、9、10、11、12、13、又は14が識別用多型と一致し;及び
修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション2、3、6、9、10、11、13、又は14のうち少なくとも1つのヌクレオシドが高度親和性糖修飾を含む、
15〜19連結ヌクレオシドから成り、識別用多型部位に対し相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。 - 識別用多型と一致するヌクレオシドに高度親和性糖修飾が含まれる、請求項91に記載の化合物。
- 識別用多型と一致するヌクレオシドの5’側に直隣接する、及び5’末端に存在するヌクレオシドに高度親和性糖修飾が含まれる、請求項91又は92に記載の化合物。
- 識別用多型と一致するヌクレオシドの3’側に直隣接する、及び3’末端に存在するヌクレオシドに高度親和性糖修飾が含まれる、請求項91〜93のいずれか1項に記載の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドが一塩基多型部位と100%相補的である、請求項91に記載の化合物。
- 高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項91に記載の化合物。
- 二環式糖に4’−CH(CH3)−O−2’ブリッジが含まれる、請求項96に記載の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション2、3、13、及び14の少なくとも1つのヌクレオシドに高度親和性糖修飾が含まれる、請求項91に記載の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドの5’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション2、3、13、及び14の各ヌクレオシドに高度親和性糖修飾が含まれる、請求項98に記載の化合物。
- 高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項99に記載の化合物。
- 高度二環式糖に4’−CH(CH3)−O−2’ブリッジが含まれる、請求項100に記載の化合物。
- 請求項91〜101のいずれかに記載の化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織、又は動物中の一塩基多型を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法。
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