ES2733708T3 - Reducción selectiva de variantes alélicas - Google Patents

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C Frank Bennett
Susan M Freier
Sarah Greenlee
Eric E Swayze
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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido monocatenario modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos unidos dirigidos a un único sitio de polimorfismo nucleotídico en un alelo de huntingtina mutante que está asociado con la Enfermedad de Huntington, y capaz de reducir selectivamente la expresión del alelo de huntingtina mutante, en el que el oligonucleótido modificado comprende un motivo de ala de espacio de ala con una región de ala 5' posicionada en el extremo 5' de una brecha de desoxinucleósidos y una región del ala 3' se ubican en el extremo 3' de la brecha de desoxinucleósidos, en la posición 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 del oligonucleótido modificado, como se cuenta a partir de los término 5' del oligonucleótido modificado, o posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del oligonucleótido modificado, según se cuenta desde el extremo 5 'de la brecha, se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido.

Description

DESCRIPCIÓN
Reducción selectiva de variantes alélicas
Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere a compuestos y composiciones para reducir selectivamente la expresión de una variante alélica de un gen de la huntingtina que contiene un polimorfismo de nucleótido único (SNP). Dichos compuestos y composiciones son útiles para tratar, prevenir o mejorar enfermedades.
Antecedentes de la invención
[0002] Las enfermedades genéticas son causadas por anomalías en los genes o cromosomas. Tales anomalías pueden incluir inserciones, eliminaciones y expansiones. La enfermedad de Huntington (HD) es un ejemplo de una enfermedad genética causada por una expansión. La HD es un trastorno neurodegenerativo progresivo que se hereda de manera dominante y resulta de una mutación que expande el tracto del trinucleótido polimórfico (CAG) en el gen de la huntingtina (HTT). El tamaño promedio del tracto CAG en la población general es de 17 a 26 repeticiones (alelo de tipo salvaje), sin embargo, en pacientes con EH el tracto CAG se ha expandido a 36 repeticiones o más (alelo mutante) (Huntington's Disease Collaborative Research Group 1993. Cell 72 (6): 971-83). El gen HTT codifica la proteína HTT y el tracto CAG expandido da como resultado un aumento patológico en las repeticiones de poliglutamina cerca del extremo N-terminal de la proteína. Los individuos llevan dos copias del gen HTT y un alelo mutante es suficiente para producir HD.
[0003] La proteína HTT parece tener un papel durante el desarrollo del sistema nervioso y un papel protector en las células. En modelos de ratón, la desactivación constitutiva del gen HTT es letal durante el desarrollo embrionario (Nasir et al 1995. Cell 81 (5): 811-23), mientras que la inactivación del gen HTT en adultos conduce a una muerte celular progresiva en el cerebro y en los testículos. (Dragatsis et al 2000. Nat. Genet 26: 300-306). La reducción de la expresión de huntingtina del alelo de tipo salvaje puede, por lo tanto, tener consecuencias negativas.
[0004] Al igual que HD, hay trastornos para los que una estrategia de reducción selectiva de un alelo mutante sería beneficioso. Los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a alelos de huntingtina mutantes se mencionan en el documento WO2009/135322. Los oligonucleótidos antisentido ensanchados se mencionan en US2006/063730. Ostergaard. et al., Nucleic Acids ResearCH2013; 41; 9634-9650 describe el diseño de oligonucleótidos antisentido que se dirigen a polimorfismos de un solo nucleótido de Huntingtin mutante. Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad no satisfecha de reducir selectivamente la expresión de variantes alélicas mutantes como la de HTT, que son causantes de enfermedad, sobre la variante de tipo salvaje, que parece ser necesaria para los procesos celulares normales.
Resumen de la invención
[0005] En un primer aspecto, la invención proporciona un compuesto que comprende un cleotide oligonucleótido antisentido monocatenario modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlaces dirigidos a un solo sitio de polimorfismo de nucleótido en un alelo huntingtina mutada que está asociada con la enfermedad de Huntington, y capaz de reducir selectivamente la expresión del alelo de huntingtina mutante,
en donde el oligonucleótido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala con una región de ala 5' posicionada en el extremo 5' de una brecha de desoxinucleósido, y una región de ala 3' posicionada en el extremo 3' de la brecha de desoxinucleósido,
en la posición 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 del oligonucleótido modificado, contados desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, o posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del oligonucleótido modificado, según se cuenta desde el extremo 5' de la brecha, se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido.
[0006] En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto del primer aspecto de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0007] En un tercer aspecto, la invención proporciona el compuesto del primer aspecto o la composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington.
Resumen de la divulgación
[0008] En el presente documento se describen métodos, compuestos y composiciones para reducir selectivamente la expresión de una variante alélica de un gen que contiene un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Tales métodos, compuestos y composiciones son útiles para tratar, prevenir o mejorar enfermedades. Los SNP pueden estar asociados con un alelo mutante, cuya expresión causa enfermedad. En ciertos casos, el producto génico expresado de un alelo mutante da como resultado la agregación de las proteínas mutantes que causan la enfermedad. En ciertos casos, el producto génico expresado de un alelo mutante da como resultado una ganancia de función que causa enfermedad.
[0009] En ciertos casos, la reducción selectiva del ARNm y la expresión de proteínas de un alelo mutante se consigue mediante la orientación de un SNP localizado en el alelo mutante con un compuesto antisentido. En ciertos casos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
[0010] En ciertos casos, los compuestos antisentido diseñados para reducir selectivamente una variante alélica de un gen que contiene un SNP se crean basándose en la potencia y la selectividad del compuesto antisentido, así como la genética de poblaciones.
Descripción detallada
[0011] Ha de entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, según se reivindica. Aquí, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en este documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo" así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique lo contrario.
[0012] Los encabezados de sección usados en este documento son sólo para fines de organización y no deben interpretarse como limitantes del objeto descrito.
Definiciones
[0013] A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y farmacéutica descritos en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.
0014] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-O-metoxietilo" (también de 2'-MOE y 2'-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación O-metoxietil de la posición 2' de un anillo furosilo. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleótido 2'-O-metoxietilo" significa un nucleótido que comprende un resto de azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5'. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Agente farmacéutico activo" significa la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporcionan un beneficio terapéutico cuando se administran a un individuo. Por ejemplo, en ciertos casos, un oligonucleótido antisentido dirigido a una variante alélica es un agente farmacéutico activo.
"Región diana activa" o "región diana" significa una región a la que se dirige uno o más compuestos antisentido activos. "Compuestos antisentido activos" significa compuestos antisentido que reducen los niveles de ácidos nucleicos o niveles de proteínas. "Administrado concomitantemente" se refiere a la administración conjunta de dos agentes de cualquier manera en que los efectos farmacológicos de ambos se manifiestan en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo deben superponerse durante un período de tiempo y no tienen que ser coextensivos. "Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un individuo, e incluye, entre otros, la administración por parte de un profesional médico y la autoadministración.
"Alelo" es un miembro de un par de genes o un miembro de una serie de diferentes formas de secuencias de ADN que pueden existir en un solo locus o marcador en un cromosoma específico. Para un organismo o célula diploide o para cromosomas autosómicos, cada par alélico normalmente ocupará las posiciones correspondientes (loci) en un par de cromosomas homólogos, uno heredado de la madre y otro heredado del padre. Si estos alelos son idénticos, se dice que el organismo o célula es "homocigoto" para ese alelo; si difieren, se dice que el organismo o célula es "heterocigoto" para ese alelo. "Alelo principal" se refiere a un alelo que contiene el nucleótido presente en una proporción estadísticamente significativa de individuos en la población humana. "Alelo menor" se refiere a un alelo que contiene el nucleótido presente en una proporción relativamente pequeña de individuos en la población humana. "Alelo de tipo salvaje" se refiere al genotipo típicamente no asociado con enfermedad o disfunción del producto genético. "Alelo mutante" se refiere al genotipo asociado con una enfermedad o disfunción del producto genético.
"Variante alélica" se refiere a uno de los dos genes o secuencias de ADN que existen en un solo locus. Por ejemplo, una variante alélica puede referirse al alelo mayor o al alelo menor.
"Mejoría" se refiere a la disminución de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluidos, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, entre otros, monos y chimpancés.
"Anticuerpo" se refiere a una molécula caracterizada por reaccionar específicamente con un antígeno de alguna manera, donde el anticuerpo y el antígeno se define cada uno en términos del otro. El anticuerpo puede referirse a una molécula de anticuerpo completa o cualquier fragmento o región del mismo, como la cadena pesada, la cadena ligera, la región Fab y la región Fc.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En ciertos casos, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína diana codificado por dicho ácido nucleico diana.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de proteína diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana o niveles de proteína diana en ausencia del compuesto antisentido. "Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación a una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furosilo modificado por la unión de dos átomos del anillo. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado. "Nucleósido bicíclico" significa un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando así un sistema de anillo bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar.
"Estructura de la tapa" o "resto de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.
"cEt" o "etilo restringido" significa un nucleósido bicíclico que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'. "Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas. "Administración conjunta" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de la misma o diferentes vías de administración. La administración conjunta abarca la administración paralela o secuencial.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Polimorfismo de diferenciación" significa una variación en una secuencia de nucleótidos que permite la diferenciación entre un tipo salvaje y un alelo mutante de una secuencia de ácido nucleico. Los polimorfismos de diferenciación pueden incluir inserciones o deleciones de uno o unos pocos nucleótidos en una secuencia, o cambios en uno o unos pocos nucleótidos en una secuencia. Un polimorfismo o alelo polimórfico diferenciador puede estar en desequilibrio de ligamiento con uno o más polimorfismos diferentes o alelos polimórficos.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
"Dosis" significa una cantidad específica de un agente farmacéutico proporcionado en una sola administración, o en un período de tiempo específico. En ciertos casos, una dosis se puede administrar en uno, dos o más bolos, tabletas o inyecciones. Por ejemplo, en ciertos casos donde se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se puede acomodar fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertos casos, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período prolongado de tiempo o continuamente. Las dosis se pueden establecer como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes. "Cantidad efectiva" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad efectiva puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes. "Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertos casos, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
"Gápmero" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos de los nucleósidos o nucleósidos que comprenden Las regiones externas. La región interna puede denominarse "brecha" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Amplitud de brecha" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de brecha de 12 o más 2'-desoxirona-bonucleósidos contiguos posicionados entre e inmediatamente adyacentes a los segmentos de ala 5' y 3' que tienen de uno a seis nucleósidos.
"Producto génico" se refiere a un material bioquímico, como ARN o proteína, que resulta de la expresión de un gen. "Haplotipo" significa un conjunto de alelos de loci estrechamente vinculados en un cromosoma que generalmente se heredan juntos. Por ejemplo, se puede encontrar que un alelo polimórfico en un primer sitio en una secuencia de ácido nucleico en el cromosoma está asociado con otro alelo polimórfico en un segundo sitio en el mismo cromosoma, a una frecuencia distinta a la que se esperaría para un asociado aleatorio (por ejemplo, "equilibrio de enlace"). Estos dos alelos polimórficos pueden describirse como "desequilibrio de ligamiento". Un haplotipo puede comprender dos, tres, cuatro o más alelos. El conjunto de alelos en un haplotipo a lo largo de un segmento dado de un cromosoma generalmente se transmite a la progenie juntos a menos que haya habido un evento de recombinación.
"Modificación de azúcar de alta afinidad" es un resto de azúcar modificado que, cuando se incluye en un nucleósido y dicho nucleósido se incorpora a un oligonucleótido antisentido, aumenta la estabilidad (medida en Tm) de dicho oligonucleótido antisentido: el dúplex de ARN aumenta en comparación con la estabilidad de un dúplex ADN: ARN.
"Nucleósido modificado con azúcar de alta afinidad" es un nucleósido que comprende un resto de azúcar modificado que cuando dicho nucleósido se incorpora a un compuesto antisentido, aumenta la afinidad de unión (medida por Tm) de dicho compuesto antisentido hacia una molécula de ARN complementaria.. En ciertos casos, al menos uno de dichos azucareros nucleósidos modificados de alta afinidad confieren un ATm de al menos 1 a 4 grados por nucleósido contra un ARN complementario como se determina de acuerdo con la metodología descrita en Freier et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25, 4429-4443. En otro aspecto, al menos una de las modificaciones de azúcar de alta afinidad confiere aproximadamente 2 o más, 3 o más, o 4 o más grados por modificación. En el contexto de la presente invención, los ejemplos de nucleósidos de alta afinidad modificados con azúcar incluyen, entre otros, (i) ciertos nucleósidos modificados en 2', incluidos los nucleósidos bicíclicos sustituidos en 2' y de 4' a 2', y (ii) algunos otros nucleósidos no ribofuranosil que proporcionan un aumento por modificación en la afinidad de unión, como el tetrahidropirano modificado y
nucleósidos tricicloADN. Para otras modificaciones que son nucleósidos de alta afinidad modificados con azúcar, ver Freier et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25, 4429-4443.
"Hibridación" significa el recocido de moléculas de ácido nucleico complementarias. Las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes. "Individual" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre los nucleósidos.
"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes que están unidos entre sí.
"No coincidencia" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o diana.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico natural (es decir, un enlace internucleósido fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" se refiere a cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y la pirimidina bases de timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, un enlace internucleósido modificado o una nucleobase modificada. Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado o una nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende un enlace internucleósido modificado, un azúcar modificado o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" se refiere a una sustitución o cambio de un azúcar natural.
"Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.
"Enlace internucleosídico natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
"Razón de azúcar natural" significa un azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Modificación resistente a la nucleasa" significa una modificación de azúcar o un enlace internucleosídico modificado que, cuando se incorpora en un oligonucleótido, hace que dicho oligonucleótido sea más estable a la degradación bajo las nucleasas celulares (por ejemplo, exo o endo-nucleasas). Los ejemplos de modificaciones resistentes a las nucleasas incluyen, pero no se limitan a, enlaces internucleosídicos de fosforotioato, modificaciones de azúcares bicíclicos, nucleótidos modificados en 2' o enlaces del lado interno de neutrales.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye los ácidos ribonucleicos (ARN), los ácidos desoxirribonucleicos (ADN), los ácidos nucleicos monocatenarios, los ácidos nucleicos bicatenarios, los pequeños ácidos ribonucleicos interferentes (ARNsi) y los microARN (miARN).
"Nucleobase" significa un resto heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico. "Secuencia de nucleobase" significa el orden de las nucleobases contiguas independientemente de cualquier modificación de azúcar, enlace o nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar.
"Nucleósido mimético" incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico, como por ejemplo los miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, biciclo o miméticos del azúcar triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar no furanosa. El mimético de nucleótidos incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto del azúcar se superpone con el término mimético de nucleósidos, un término un poco más amplio, pero está destinado a indicar el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en este documento son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en el que el grupo de azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo de tetrahidropiranilo.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. "Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que es capaz de hibridar con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede ser modificado o no modificado, independientemente uno del otro.
"Administración parenteral" significa la administración por inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. "Péptido" significa una molécula formada al unir al menos dos aminoácidos mediante enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido parental y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo.
"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato (P = S) es un enlace internucleósido modificado.
"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, vinculadas) de un ácido nucleico. En ciertos casos, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertos casos, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" se refiere a retrasar o prevenir la aparición o el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección. "Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa dentro del cuerpo o las células del mismo por la acción de enzimas endógenas u otros químicos o condiciones.
"Reducción selectiva de la expresión de una variante alélica" significa la reducción de la expresión de un alelo más que el otro, diferenciando alelo entre un conjunto de alelos. Por ejemplo, un alelo mutante que contiene un polimorfismo de nucleótido único (SNP) puede reducirse más que un alelo de tipo salvaje que no contiene el SNP.
"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En ciertos casos, los efectos secundarios incluyen reacciones en el lugar de la inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías y malestar general. Por ejemplo, el aumento de los niveles de aminotransferasa en suero puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, el aumento de bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. "Polimorfismo de un solo nucleótido" o "SNP" significa una variación de un solo nucleótido entre los genomas de individuos de la misma especie. En algunos casos, un SNP puede ser una eliminación o inserción de un solo nucleótido. En general, los SNP aparecen con relativa frecuencia en los genomas y, por lo tanto, contribuyen a la diversidad genética. Se piensa que los SNP son mutativamente más estables que otros polimorfismos, prestando su uso en estudios de asociación en los que se usa el desequilibrio de ligamiento entre marcadores y una variante desconocida para mapear las mutaciones causantes de la enfermedad. La ubicación de un SNP generalmente está flanqueada por secuencias altamente conservadas. Un individuo puede ser homocigoto o heterocigoto para un alelo en cada sitio de SNP. Un alelo SNP heterocigoto puede ser un polimorfismo diferenciador. Un SNP puede apuntarse con un oligonucleótido antisentido, lo que significa que el SNP se acopla a (o se alinea con) las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 del oligonucleótido antisentido. El resto de las bases oligonucleotídicas antisentido debe tener suficiente complementariedad con el sitio SNP para facilitar la hibridación.
"Posición de polimorfismo de nucleótido único" o "posición SNP" se refiere a la posición de nucleótido del SNP en una secuencia de referencia.
"Sitio de polimorfismo de nucleótido único" o "sitio de SNP" se refiere a los nucleótidos que rodean un SNP contenido en un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido.
"Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no está hibridado con una cadena complementaria.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras que exhibe efectos mínimos o nulos sobre los ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Apuntar" o "apuntar" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcripción de ARN diana" se refieren a un ácido nucleico capaz de ser atacado por compuestos antisentido.
"Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido. Por ejemplo, para los fines de esta solicitud de patente, el segmento diana puede estar dentro del sitio de SNP. "Sitio objetivo 5'" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento diana. "Sitio objetivo 3'" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana.
"Cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases naturales, restos de azúcar y enlaces internucleósidos. En ciertos casos, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
Ciertas instancias
[0015] En el presente documento se describen compuestos y composiciones para inhibir selectivamente la expresión de ARNm y proteína de una variante alélica de un gen o secuencia de ADN. En ciertos casos, la variante alélica contiene un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). En ciertos casos, el SNP es un polimorfismo diferenciador. En algunos casos, un SNP está asociado con un alelo mutante. En ciertos casos, un SNP está en desequilibrio de enlace con otro polimorfismo que está asociado con o es causante de enfermedad. En ciertos casos, un alelo mutante está asociado con la enfermedad. En ciertos casos, la expresión de ARNm y proteína de un alelo mutante está asociada con la enfermedad.
[0016] En ciertos casos, el producto del gen expresado de un alelo mutante resulta en la agregación de las proteínas mutantes que causan la enfermedad. En ciertos casos, el producto génico expresado de un alelo mutante da como resultado una ganancia de función que causa enfermedad. En ciertos casos, los genes con una mutación autosómica dominante que resulta en una ganancia tóxica de la función de la proteína son el gen APP que codifica la proteína precursora de amiloide involucrada en la enfermedad de Alzheimer (Gene, 371: 68, 2006); el gen PrP que codifica la proteína priónica involucrada en la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y en el insomnio familiar fatal (Nat. Med. 1997, 3: 1009); el gen GFAP codifica la proteína ácida fibrilar glial implicada en la enfermedad de Alexander (J. Neurosci. 2006, 26: 111623); gen de alfa-sinucleína que codifica la proteína alfa-sinucleína implicada en la enfermedad de Parkinson (J. Clin. Invest. 2003, 111: 145); el gen SOD-1 que codifica la proteína SOD-1 involucrada en la esclerosis lateral amiotrófica (Science 1998, 281: 1851); gen atrofina-1 que codifica la proteína atrofina-1 involucrada en la atrofia dentato-rubral y palido-luysiana (DRPA) (Trends Mol. Med. 2001, 7: 479); el gen SCA1 que codifica la proteína ataxina-1 participa en la ataxia espino-cerebelosa-1 (SCA1) (Protein Sci. 2003, 12: 953); el gen PLP codifica la proteína proteolipídica involucrada en la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (NeuroMol Med. 2007, 4: 73); el gen DYT1 codifica la proteína torsina A implicada en la distonía de torsión (Brain Res. 2000, 877: 379); y el gen cristalino alfa-B que codifica la proteína cristalina alfa-B involucrada en las enfermedades de agregación de proteínas, incluida la miocardiopatía (Cell 2007, 130: 427); gen alfa1-antitripsina que codifica la proteína alfa1-antitripsina implicada en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad hepática y carcinoma hepatocelular (New Eng1 J Med. 2002, 346: 45); el gen Ltk que codifica la proteína tirosina quinasa de leucocitos participa en el lupus eritematoso sistémico (Hum. Mol. Gen. 2004, 13: 171); el gen PCSK9 codifica la proteína PCSK9 involucrada en la hipercolesterolemia (Hum Mutat. 2009, 30: 520); gen del receptor de prolactina que codifica la proteína receptora de prolactina implicada en tumores de mama (Proc. Natl. Assoc. Sci. 2008, 105: 4533); Gen CCL5 que codifica la quimiocina CCL5 involucrada en la EPOC y el asma (Eur. Respir. J. 2008, 32: 327); el gen PTPN22 codifica la proteína PTPN22 involucrada en la diabetes tipo 1, la artritis reumatoide, la enfermedad de Graves y el LES (Proc. Natl. Assoc. Sci. 2007, 104: 19767); gen del receptor de andrógenos que codifica la proteína receptora de andrógenos implicada en la atrofia muscular espinal y bulbar o la enfermedad de Kennedy (J Steroid Biochem. Mol. Biol. 2008, 108: 245); el gen CHMP4B codifica la proteína-4B modificadora de la cromatina involucrada en cataratas subcapsulares posteriores progresivas de la infancia (Am. J. Hum. Genet 2007, 81: 596); Gen FXR/NR1H4 que codifica la proteína del receptor Farnesoid X involucrada en la enfermedad de cálculos biliares del colesterol, la artrosclerosis y la diabetes (Mol. Endocrinol. 2007, 21: 1769); gen ABCA1 que codifica la proteína ABCA1 involucrada en la enfermedad cardiovascular (Transí. Res. 2007, 149: 205); el gen CaSR codifica la proteína receptora del sensor de calcio involucrada en la hipercalciuria primaria (Kidney Int.
2007, 71: 1155); gen de la alfa-globina que codifica la proteína alfa-globina involucrada en la alfa-tallasemia (Science 2006, 312: 1215); el gen httlpr codifica la proteína HTTLPR involucrada en el trastorno obsesivo compulsivo (Am. J. Hum. Genet. 2006, 78: 815); gen AVP que codifica la proteína de arginina vasopresina en trastornos relacionados con el estrés, como trastornos de ansiedad y depresión comórbida (CNS Neurol. Disord. Drug Targets 2006, 5: 167); Gen GNAS que codifica proteínas G involucradas en defectos visuales congénitos, hipertensión, síndrome metabólico (Trends Pharmacol. Sci. 2006, 27: 260); el gen APAF1 codifica la proteína APAF1 involucrada en una predisposición a la depresión mayor (Mol. Psychiatry 2006, 11: 76); gen TGF-beta1 que codifica la proteína TGF-beta1 involucrada en el cáncer de mama y cáncer de próstata (Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2004, 13: 759); el gen AChR codifica el receptor de acetilcolina involucrado en el síndrome miasténico congénito (Neurology 2004, 62: 1090); el gen P2Y12 que codifica la proteína receptora del difosfato de adenosina (ADP) participa en el riesgo de enfermedad arterial periférica (Circulation 2003, 108: 2971); gen LQT1 que codifica la proteína LQT1 involucrada en la fibrilación auricular (Cardiology 2003, 100: 109); el protooncogen RET codifica la proteína RET involucrada en el feocromocitoma esporádico (J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 88: 4911); gen de la filamina A que codifica la proteína filamina A involucrada en varias malformaciones congénitas (Nat. Genet. 2003, 33: 487); el gen TARDBP codifica la proteína TDP-43 involucrada en la esclerosis lateral amiotrófica (Hum. Mol. Gene.t 2010, 19: 671); el gen SCA3 codifica la proteína ataxina-3 involucrada en la enfermedad de Machado-Joseph (PLoS One 2008, 3: e3341); el gen SCA7 codifica la proteína ataxina-7 involucrada en la ataxia espino-cerebelosa-7 (PLoS One 2009, 4: e7232); y el gen HTT que codifica la proteína huntingtina involucrada en la enfermedad de Huntington (Neurobiol Dis. 1996, 3: 183); y el gen CA4 que codifica la proteína anhidrasa 4 carbónica, el gen CRX que codifica la proteína del factor de transcripción homeobox cónico, el gen FSCN2 que codifica la proteína homóloga 2 retinal fascinante, el gen IMPDH1 que codifica el Gen NRLE3 de proteína E3 monofosfato deshidrogenasa de inosina que codifica la proteína de la cremallera leucina de la retina neural, gen PRPF3 (RP18) que codifica la proteína del factor 3 de empalme de pre-ARNm, gen PRPF8 (RP13) que codifica la proteína del factor 8 de empalme de pre-ARNm, el gen p Rp F31 (r P11) codifica la proteína del factor 31 de empalme de pre-ARNm, gen RDS que codifica la proteína periferina 2, gen ROM1 que codifica la proteína 1 de la membrana externa de la varilla, gen RHO que codifica la proteína rodopsina, gen RP1 que codifica la proteína RP1, gen RPGR que codifica la proteína reguladora de la GTPasa de la retinitis pigmentaria, todos los cuales están involucrados en la retinitis autosómica dominante (Adv Exp Med Biol. 2008, 613: 203)
[0017] En ciertos casos, la reducción selectiva del ARNm y la expresión de proteínas de un alelo mutante se consigue mediante la orientación de un SNP localizado en el alelo mutante con un compuesto antisentido. En ciertos casos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido. En ciertos casos, el compuesto antisentido no es una ribozima, un ARNip de doble cadena o un ARNsh. En ciertos casos, el oligonucleótido antisentido puede tener uno o más azúcar(es), nucleobase(s) o enlace(s) internucleósido(s) modificado(s). En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es complementario al sitio SNP. En ciertos casos, el oligonucleótido antisentido es al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% complementario al sitio de SNP. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es 100% complementario al sitio SNP. En ciertas realizaciones, el sitio de SNP es 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud. En ciertos casos, el SNP recalienta en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 del oligonucleótido antisentido.
[0018] En ciertos casos, los compuestos antisentido diseñados para reducir selectivamente una variante alélica de un gen que contiene un SNP se crean basándose en la potencia y la selectividad del compuesto antisentido, así como la genética de poblaciones.
[0019] En ciertos casos, la reducción selectiva de ARNm y la expresión de proteínas de una variante alélica de un gen que contiene un SNP se produce en una célula o tejido. En ciertos casos, la célula o el tejido está en un animal. En ciertos casos, el animal es un humano.
[0020] En el presente documento se describen compuestos que comprenden un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos unidos dirigidos a un único sitio de polimorfismo de nucleótido, en el que el oligonucleótido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala con una región de ala 5' posicionada en la posición de 5' final de un espacio de desoxinucleósidos, y una región del ala 3' posicionada en el extremo 3' del espacio de desoxinucleósidos, en la posición 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 del oligonucleótido, como se cuenta desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, o posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del oligonucleótido modificado, como se cuenta desde el extremo 5' del espacio. Se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido.
[0021] En ciertos casos, el sitio de polimorfismo de nucleótido único es en un alelo mutante que está asociado con una enfermedad. En ciertos casos, el sitio de polimorfismo de un solo nucleótido contiene un polimorfismo diferenciador.
[0022] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido modificado consta de 12 a 20 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido modificado consta de 15 a 20 nucleósidos unidos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido modificado consta de 15 a 19 nucleósidos unidos.
[0023] En ciertas realizaciones, la posición 8, 9, o 10 del oligonucleótido modificado, como se ha contado a partir del término 5' del oligonucleótido modificado, o posiciones 4, 5, o 6 del oligonucleótido modificado, como se ha contado a partir del término 5' de la brecha, se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido.
[0024] En ciertas realizaciones, la región de brecha es 7-11 nucleósidos de longitud, la región 5' del ala es 1-6 nucleobases de longitud y la región 3' del ala es 1-6 nucleobases de longitud.
[0025] En ciertas realizaciones, el motivo ala-hueco-ala es uno cualquiera del grupo que consiste en 5-10-5, 2-9-6, 3-9-3, 3-9-4, 3-9- 5, 4-7-4, 4-9-3, 4-9-4, 4-9-5, 4-10-5, 4-11-4, 4-11-5, 5-7-5, 5-8-6, 5-9-3, 5-9-5, 5-10-4, 5-10-5, 6-7-6, 6-8-5 y 6-9-2. En ciertas realizaciones, el motivo del ala de la brecha es uno cualquiera del grupo que consiste en 2­ 9-6, 4-9-5, y 4-11-4.
[0026] En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleósido es un enlace internucleósido fosforotioato.
[0027] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5'-metilcitosina.
[0028] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido de al menos una de las regiones de ala comprende un azúcar o azúcar sustituto modificado. En ciertas realizaciones, cada uno de los nucleósidos de cada región del ala comprende un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertas realizaciones, el azúcar o el sustituto del azúcar es un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo.
[0029] En ciertas realizaciones, al menos una de las regiones de ala comprende un nucleósido 4' a 2' bicíclico y al menos uno de los nucleósidos ala restantes es un nucleósido 2'-modificado no bicíclico.
[0030] En ciertas realizaciones, el nucleósido 2'-modificado no bicíclico es un nucleósido de 2'-O-metoxietilo.
[0031] En ciertas realizaciones, el nucleósido bicíclico 4' a 2' es nucleósido bicíclico 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0032] En ciertos casos, el oligonucleótido antisentido modificado que consta de 17 nucleósidos enlazados y en el que la posición 9 del oligonucleótido modificado, contada desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo diferenciador. En ciertos casos, el motivo del ala-hueco-ala es 2-9-6.
[0033] En ciertos casos, se describe en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 18 nucleósidos y enlaces 90% complementaria a un polimorfismo de diferenciación, en el que el oligonucleótido modificado comprende un motivo ala-hueco-ala, en el que la posición 9 del oligonucleótido modificado, según se cuenta desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo de diferenciación; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; y en el que el motivo de ala-hueco-ala es 4-9-5.
[0034] En ciertos casos, se describe en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 19 nucleósidos y enlaces 90% complementaria a un polimorfismo de diferenciación, en el que el oligonucleótido modificado comprende un motivo ala-hueco-ala, en el que la posición 10 del oligonucleótido modificado, según se cuenta desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo de diferenciación; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; y en el que el motivo de ala-hueco-ala es 4-11-4.
[0035] En ciertos casos, descritos en este documento son compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 15 a 19 nucleósidos enlazados y totalmente complementarios de un polimorfismo de diferenciación, en el que el oligonucleótido modificado comprende un motivo ala-hueco-ala, en el que la posición 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 del oligonucleótido modificado, según se cuenta desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo diferenciador; y al menos una modificación de azúcar de alta afinidad. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado es 100% complementario al sitio del polimorfismo de un solo nucleótido.
[0036] En ciertos casos, al menos una de las regiones de ala comprende una modificación de azúcar de alta afinidad. En ciertos casos, la modificación del azúcar de alta afinidad es un azúcar bicíclico. En ciertos casos, el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0037] En ciertos casos, al menos una de las posiciones 2, 3, 6, 9, 10, 11, 13, o 14 del oligonucleótido modificado, tal como cuenta a partir de terminal 5' del oligonucleótido modificado, comprende al menos una modificación del azúcar de alta afinidad.
[0038] En ciertos casos, al menos una de las posiciones 2, 3, 13, y 14 del oligonucleótido modificado, como se ha contado a partir del extremo término 5' del oligonucleótido modificado, comprende al menos una modificación de azúcar de alta afinidad.
[0039] En ciertos casos, cada una de las posiciones de nucleósidos 2, 3, 13, y 14 del oligonucleótido modificado, como se ha contado a partir del extremo término 5' del oligonucleótido modificado, comprenden al menos una modificación de azúcar de alta afinidad.
[0040] En ciertos casos, la modificación de azúcar de alta afinidad es un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0041] En ciertos casos, el motivo ala-hueco-ala es cualquiera del grupo que consiste de 3-9-3, 4-9-4, y 5-9-5.
[0042] En ciertos casos, descritos en este documento son compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 15, 17, o 19 nucleósidos unidos y totalmente complementarios a un polimorfismo de diferenciación, en donde el oligonucleótido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en donde la posición 6, 8, 10 o 14 del oligonucleótido modificado, contada desde el término 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo diferenciador; y al menos una modificación de azúcar de alta afinidad.
[0043] En ciertos casos, al menos una de las posiciones 2, 3, 6, 9, 10, 11, 13, o 14 del oligonucleótido modificado, tal como se cuenta a partir de terminal 5' del oligonucleótido modificado, comprende al menos una modificación del azúcar de alta afinidad.
[0044] En ciertos casos, la modificación de azúcar de alta afinidad es un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0045] En ciertos casos, el motivo ala-hueco-ala es cualquiera del grupo que consiste de 3-9-3, 4-9-4, y 5-95.
[0046] En ciertos casos, descritos en este documento son compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 15 nucleósidos unidos y 90% complementarios a un polimorfismo de diferenciación, en donde el oligonucleótido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en donde la posición 8 del oligonucleótido modificado, contada desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo de diferenciación; y al menos una modificación de azúcar de alta afinidad. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es 100% complementario al polimorfismo de diferenciación.
[0047] En ciertos casos, cada una de las posiciones de nucleósidos 2, 3, 13, y 14 del oligonucleótido modificado, como se ha contado a partir del extremo término 5' del oligonucleótido modificado, comprenden al menos una modificación de azúcar de alta afinidad.
[0048] En ciertos casos, la modificación de azúcar de alta afinidad es un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0049] En ciertos casos, el motivo ala-hueco-ala es 3-9-3.
[0050] En ciertos casos, se describe en la presente memoria métodos para reducir selectivamente la expresión de una variante alélica de un gen que contiene un polimorfismo de un solo nucleótido en una célula, tejido o animal, que comprende administrar a la célula, tejido o animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado complementario de un polimorfismo diferenciador, en el que el oligonucleótido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala ancho y en donde la posición 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 del oligonucleótido modificado, contada desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo de diferenciación. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado es complementario al 90% del polimorfismo diferenciador único. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado es 95% complementario al sitio del polimorfismo de un solo nucleótido. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado es 100% complementario al sitio del polimorfismo de un solo nucleótido.
[0051] En ciertos casos, el sitio de polimorfismo de nucleótido único es de 12 a 30 nucleobases de longitud. En ciertos casos, el sitio del polimorfismo de un solo nucleótido es de 15 a 25 nucleobases de longitud. En ciertos casos, el sitio del polimorfismo de un solo nucleótido tiene una longitud de 17 a 22 nucleobases. En ciertos casos, el sitio de polimorfismo de un solo nucleótido tiene una longitud de 17 nucleobases. En ciertos casos, el sitio del polimorfismo de un solo nucleótido tiene una longitud de 18 nucleobases. En ciertos casos, el sitio del polimorfismo de un solo nucleótido tiene 19 nucleobases de longitud. En ciertos casos, el sitio del polimorfismo de un solo nucleótido tiene una longitud de 20 nucleobases.
[0052] En ciertos casos, la variante alélica se asocia con la enfermedad. En la invención, la variante alleílica está asociada con la enfermedad de Huntington.
[0053] El oligonucleótido modificado es un oligonucleótido monocatenario.
[0054] En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleósido es un enlace internucleósido fosforotioato.
[0055] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, al menos una nucleobase modificada es una 5'-metilcitosina.
[0056] En ciertos casos, al menos un nucleósido comprende un azúcar modificado. En ciertos casos, el azúcar modificado es una modificación del azúcar de alta afinidad. En ciertos casos, el azúcar de alta afinidad es un azúcar bicíclico. En ciertos casos, cada azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0057] En ciertas realizaciones, al menos una de las posiciones de nucleósidos 2, 3, 13, y 14 del oligonucleótido modificado, a contar desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, comprende un nucleósido que tiene un azúcar bicíclico en el que el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0058] En ciertas realizaciones, cada una de las posiciones de nucleósidos 2, 3, 13, y 14 del oligonucleótido modificado, a contar desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, comprende un azúcar bicíclico en el que el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0059] En ciertas realizaciones, al menos un azúcar modificado comprende un 2'-O-metoxietilo. En ciertas realizaciones, cada nucleósido posicionado en un segmento de ala del oligonucleótido modificado comprende una modificación 2'-O-metoxietilo.
[0060] En ciertas realizaciones, el motivo ala-hueco-ala es cualquiera del grupo que consiste de 2-9-6, 3-9-3, 3-9-4, 3-9-5, 4-7-4, 4-9-4, 4-9-5, 4-10-5, 4-11-4, 4-11-5, 5-7-5, 5-8-6, 5-9-3, 5 -9-5, 5-10-4, 5-10-5, 6-7-6, 6-8-5 y 6-9-2.
[0061] En ciertos casos, el oligonucleótido modificado no es una ribozima, un siARN de doble hebra, o un shARN.
[0062] En ciertos casos, el sitio de polimorfismo de nucleótido único es en un alelo mutante que se asocia con la enfermedad. En ciertos casos, el sitio de polimorfismo de un solo nucleótido contiene un polimorfismo diferenciador.
[0063] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido modificado consta de 12 a 20 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido modificado consta de 15 a 19 nucleósidos unidos.
[0064] En ciertas realizaciones, la región de brecha es de 7 a 11 nucleósidos de longitud, la región 5' del ala es de 1 a 6 nucleobases de longitud y región del ala 3' es de 1 a 6 nucleobases de longitud.
[0065] En ciertas realizaciones, en donde al menos un nucleósido de al menos una de las regiones de ala comprende un azúcar modificado o azúcar sustituto.
[0066] En ciertas realizaciones, cada uno de los nucleósidos de cada zona del ala comprende un azúcar o azúcar sustituto modificado. En ciertas realizaciones, el azúcar o el sustituto del azúcar es un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo.
[0067] En ciertas realizaciones, al menos una de las regiones de ala comprende un nucleósido bicíclico 4' a 2' y al menos uno de los nucleósidos ala restantes es un nucleósido 2'-modificado no bicíclico.
[0068] En ciertas realizaciones, el nucleósido 2'-modificado no bicíclico es un nucleósido de 2'-O-metoxietilo.
[0069] En ciertas realizaciones, un nucleósido bicíclico 4' a 2' es un nucleósido bicíclico 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0070] En ciertos casos, se describe en la presente memoria métodos para reducir selectivamente la expresión de una variante alélica de un gen que contiene un polimorfismo de un solo nucleótido en una célula, tejido o animal, que comprende administrar a la célula, tejido o animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado complementario de un polimorfismo diferenciador, en el que el oligonucleótido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala y en la posición 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 del oligonucleótido modificado, contado desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo diferenciador.
[0071] En ciertos casos, descritos en este documento son métodos para reducir selectivamente la expresión de una variante alélica de un gen que contiene un polimorfismo de nucleótido en una célula, tejido o animal, que comprende administrar a la célula, tejido o animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos unidos y complementario a un polimorfismo de diferenciación, en donde el oligonucleótido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala y en donde posición 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 del oligonucleótido modificado, según se cuenta desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo diferenciador; y en el que la variante alélica es un alelo mutante.
[0072] En ciertos casos, el alelo mutante está asociado con ninguna enfermedad del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, insomnio fatal familiar, enfermedad de Alexander, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, dentato-rubral y atrofia pallido-luysian DRPA, ataxia espinocerebelosa, distonía de torsión, cardiomiopatía, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad hepática, carcinoma hepatocelular, lupus eritematoso sistémico, hipercolesterolemia, cáncer de mama, asma, diabetes tipo 1, artritis reumatoide, enfermedad de Graves, ELE, atrofia espinal y muscular bulbar, enfermedad de Kennedy, cataratas subcapsulares posteriores de la infancia progresiva, enfermedad del cálculo biliar del colesterol, artrosclerosis, enfermedad cardiovascular, hipercalciuria primaria, alfa-tallasemia, trastorno obsesivo compulsivo, ansiedad, depresión comórbida, defectos visuales congénitos, hipertensión, síndrome metabólico, cáncer de próstata, síndrome miasténico congénito, arteria periférica d enfermedad, fibrilación auricular, feocromocitoma esporádico, malformaciones congénitas, enfermedad de Machado-Joseph, enfermedad de Huntington y enfermedad pigmentosa de retinitis autosómica dominante.
[0073] En ciertos casos, descritos en este documento son procedimientos de tratamiento de la enfermedad de Huntington, que comprende selectivamente la reducción de expresión de una variante alélica de un gen que contiene un polimorfismo de nucleótido en una célula, tejido o animal, que comprende administrar a la célula, tejido, o animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos unidos y complementario al polimorfismo de diferenciación, en donde el oligonucleótido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala y en donde posición 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14 o 15 del oligonucleótido modificado, según se cuenta desde el extremo 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo de diferenciación; y en el que la variante alélica está asociada con la enfermedad de Huntington.
[0074] En ciertas realizaciones, la posición 8, 9, o 10 del oligonucleótido modificado, como se ha contado a partir del término 5' del oligonucleótido modificado, o posiciones 4, 5, o 6 del oligonucleótido modificado, como se ha contado a partir del término 5' de la brecha, se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido.
Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)
[0075] Polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) son alteraciones individuales de pares de bases en la secuencia de ADN que representan una fuente importante de heterogeneidad genética (gen 1999, 234: 177). El genotipado de SNP es una herramienta importante con la que investigar estas variantes genéticas (Genome Res. 2000, 10: 895; Trends Biotechnol. 2000, 18:77). En ciertos casos, los compuestos antisentido diseñados para reducir selectivamente una variante alélica de un gen que contiene un SNP se seleccionaron según la potencia, la selectividad y la cobertura de la genética de la población.
Potencia
[0076] En ciertos casos, los compuestos antisentido diseñados para reducir selectivamente una variante alélica de un gen que contiene un SNP se crean basándose en potencia del compuesto antisentido. La potencia generalmente se refiere a lo susceptible que es el área de secuencia dirigida a la inhibición antisentido. En ciertos casos, los sitios SNP específicos pueden ser particularmente susceptibles a la inhibición antisentido. Ciertos de estos sitios SNP altamente susceptibles pueden ser atacados por compuestos antisentido para reducir selectivamente una variante alélica de un gen. La potencia se demuestra mediante el porcentaje de inhibición del ARNm mutante alcanzado por los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a un SNP en comparación con el porcentaje de inhibición del ARNm mutante logrado por el oligonucleótido de referencia.
Selectividad
[0077] En ciertos casos, los compuestos antisentido diseñados para reducir selectivamente una variante alélica de un gen que contiene un SNP se crean basándose en la selectividad del compuesto antisentido. La selectividad generalmente se refiere a compuestos antisentido que comprenden una secuencia particular, motivo y modificación(es) química(s) que se dirigen preferentemente a uno o más polimorfismos de diferenciación (SNP) en el ARN que codifica una proteína HTT mutante en comparación con el ARN que codifica una proteína HTT de tipo salvaje. En ciertos casos, las secuencias específicas, los motivos y las modificaciones químicas son particularmente selectivas para reducir una variante alélica de un gen que contiene un SNP. Ciertas secuencias, motivos y modificaciones químicas de este tipo se utilizan para reducir selectivamente una variante alélica de un gen. La selectividad se demuestra por la capacidad del oligonucleótido antisentido que se dirige a un SNP para inhibir la expresión del alelo principal o alelo mutante, en comparación con el alelo menor o alelo de tipo salvaje.
Genética de poblaciones
[0078] En ciertos casos, los compuestos antisentido diseñados para reducir selectivamente una variante alélica de un gen que contiene un SNP se crean basándose en la genética de poblaciones de una población afligida con la enfermedad. La genética de la población significa la frecuencia con la que aparece el SNP en el cromosoma de la enfermedad de los pacientes afectados por una enfermedad en particular. La enfermedad de la invención es la enfermedad de Huntington. Cuando la potencia y la selectividad entre los compuestos antisentido son iguales, los objetivos de SNP que tienen una mayor cobertura de genética de la población se favorecen sobre los SNP que tienen una asociación más débil con los cromosomas de la enfermedad.
Compuestos antisentido
[0079] Los compuestos oligoméricos pueden incluir, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNsi. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" a un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de someterse a hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
[0080] En ciertos casos, un compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido. En ciertos casos, el compuesto antisentido no es una ribozima, un ARNip de doble cadena o un ARNsh.
[0081] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana a la que está dirigido. En ciertas de tales realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.
[0082] En ciertos casos, los compuestos antisentido son de 12 a 30 subunidades de longitud. En otras palabras, tales compuestos antisentido son de 12 a 30 subunidades enlazadas. En otros casos, el compuesto antisentido es de 8 a 80, de 12 a 50, de 15 a 30, de 18 a 24, de 19 a 22, o de 20 subunidades enlazadas. En ciertos casos, los compuestos antisentido son 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28., 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 subunidades vinculadas en longitud, o un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En algunos casos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades enlazadas son nucleósidos.
[0083] En ciertos casos los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico se podrán reducir o truncar. Por ejemplo, una sola subunidad puede eliminarse del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3', del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
[0084] Cuando una sola subunidad adicional está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar situada en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando dos o más subunidades adicionales están presentes, las subunidades agregadas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades agregadas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades agregadas pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad agregada al extremo 5' y una subunidad agregada al extremo 3'.
[0085] Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases desajuste sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 7305-7309, 1992), una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud se ensayaron para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases no coincidentes cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían desajustes. De manera similar, la división específica de la diana se logró utilizando 13 oligonucleótidos antisentido de nucleobases, incluidos aquellos con 1 o 3 desapareamientos.
[0086] Gautschi et al (J. Natl Cancer Inst 93: 463-471, marzo de 2001) demostró la capacidad de un oligonucleótido que tiene 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 desajustes a la bcl-xL ARNm para reducir la expresión de bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
[0087] Maher y Dolnick (Nuc Acid Res 16: 3341-3358,1988) ensayaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobase tándem, y unos oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases se componen de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solos fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
[0088] Sin embargo, la reducción selectiva de la expresión de una variante alélica se optimiza cuando el SNP contenida en e nucleico diana se recuece a una base complementaria en el compuesto antisentido y no a una base no coincidente. Además, la selectividad en general aumenta cuando hay menos desajustes entre el sitio de SNP y el compuesto antisentido. Sin embargo, se puede tolerar un cierto número de desajustes.
Motivos compuestos antisentido
[0089] En ciertos casos, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a las propiedades de los compuestos antisentido tales como mejora de la actividad inhibidora, aumento de la afinidad de unión para un ácido nucleico diana, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
[0090] Compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente al menos una región modificada de modo que confieren una mayor resistencia a la degradación por nucleasas, aumento de la captación celular, aumento de la afinidad de unión para el ácido nucleico diana, y/o aumento de la actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como un sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que corta la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
[0091] Los compuestos antisentido que tienen un motivo gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En una brecha, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de la RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo hueco, el segmento hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos del ala comprenden nucleósidos modificados. En el caso de un oligonucleótido antisentido para reducir selectivamente la expresión de una variante alélica de un gen que contiene un SNP, el SNP se acopla a una nucleobase dentro del segmento hueco.
[0092] En ciertas realizaciones, el SNP hibrida o es complementario a una nucleobase en la posición 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 del oligonucleótido antisentido, en el que la posición se refiere a la orientación de una nucleobase dentro del oligonucleótido antisentido que cuenta desde el extremo 5' del oligonucleótido antisentido. Por ejemplo, la mayoría de las nucleobases 5' dentro del oligonucleótido antisentido está en la primera posición del oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el SNP se hibrida o es complementario a una nucleobase en la posición 6, 7, 8, 9 o 10 del oligonucleótido antisentido (contando desde el extremo 5'). En ciertas realizaciones, el SNP se hibrida o es complementario a una nucleobase en la posición 9 o 10 del oligonucleótido antisentido (contando desde el extremo 5').
[0093] En ciertos casos, el SNP se hibrida con una nucleobase en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 del segmento de hueco, en el que la posición se refiere a la orientación de una nucleobase dentro del segmento de intervalo que cuenta desde el extremo 5' del segmento de intervalo. Por ejemplo, la mayoría de nucleobases 5' dentro del segmento de brecha está en la primera posición del segmento de brecha. En ciertas realizaciones, el SNP se acopla a una nucleobase en la posición 4, 5, 6 o 7 contando desde el extremo 5' del segmento de separación. En ciertas realizaciones, el SNP se acopla a una nucleobase en la posición 4 o 5 comenzando desde el extremo 5' del segmento hueco.
[0094] En ciertas realizaciones, las regiones de un gápmero se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprende cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gápmero pueden en algunas realizaciones incluir p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE, y 2'-O-CH3 , entre otros), y nucleósidos modificados de azúcar bicíclicos (tales nucleósidos bicíclicos modificados en el azúcar pueden incluir los que tienen un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n=1 o n=2). El resto bicíclico puede ser un CET que tiene la fórmula 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0095] El motivo ala-hueco-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud de la región de ala 5', 'Y' representa la longitud de la región de hueco, y 'Z' representa la longitud de la región del ala 3'. Como se usa en este documento, un separador de brechas descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento de brecha se coloca inmediatamente adyacente a cada uno de los segmentos de ala 5' y el segmento de ala 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala 5' y el segmento de separación, o el segmento de separación y el segmento de ala de 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en el presente documento puede tener un motivo gápmero. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En ciertas realizaciones, Y está entre 8 y 15 nucleótidos. En ciertas realizaciones, Y está compuesto por desoxinucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los separadores de la presente invención incluyen, entre otros, por ejemplo 1-10-1, 1-18-1, 2-8-2, 2-9-6, 2-10-2, 2-13 -5, 2-16-2, 3-9-3, 3-9-5, 3-10-3, 3-14-3, 4-8-4, 4-9­ 5, 4-10-5, 4-11-4, 4-12-3, 4-12-4, 5-8-5, 5-9-5, 5-10-4, 5-10-5, o 6-8-6.
[0096] En ciertos casos, el compuesto antisentido tiene un motivo "wingmer", que tiene un ala-hueco o configuración de brecha de ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se describió anteriormente para la configuración de gápmero. Por lo tanto, las configuraciones de alero de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 o 6-8.
[0097] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 2-9-6 gápmero o un motivo 6-9-2 gápmero.
[0098] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 3-9-3 gápmero.
[0099] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 3-9-5 gápmero o motivo 5-9-3 gápmero.
[0100] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 4-9-5 gápmero o motivo 5-9-4 gápmero.
[0101] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 4-10-5 gápmero o un motivo 5-10-4 gápmero.
[0102] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 4-11-4 gápmero.
[0103] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 5-9-5 gápmero.
[0104] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 5-8-6 gápmero o un motivo 6-8-5 gápmero.
[0105] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 6-7-6 gápmero.
[0106] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 6-8-5 gápmero o un motivo 5-8-6 gápmero.
[0107] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 3-9-4 gápmero o un motivo 4-9-3 gápmero.
[0108] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 5-7-5 gápmero.
[0109] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 4-7-4 gápmero.
[0110] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen un motivo 5-10-5 gápmero.
[0111] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico tiene un motivo ensanchado por gápmero.
Ciertas alas mixtas
[0112] En ciertas realizaciones, la invención proporciona compuestos gápmero en donde al menos un nucleósido de una de las alas de manera diferente se modifica en comparación con al menos otro nucleósido de la misma ala. Dichos compuestos antisentido se denominan compuestos antisentido de ala mixta (véase el documento WO 2008/049085). En ciertas realizaciones, las modificaciones (o ninguna modificación) de uno o más nucleósidos del ala 3' son diferentes de las de uno o más nucleósidos del ala 3'. Dichos compuestos antisentido pueden denominarse agitadores de alas mixtas en 3'. En ciertas realizaciones, las modificaciones (o ninguna modificación) de uno o más nucleósidos del ala 5' son diferentes de las de uno o más nucleósidos del ala 5'. Dichos compuestos antisentido pueden denominarse agitadores de alas mixtas en 5'. En ciertas realizaciones, las modificaciones (o ninguna modificación) de uno o más nucleósidos del ala 3' son diferentes de las de uno o más otros nucleósidos del ala 3' y las modificaciones (o ninguna modificación) de uno o más nucleósidos del ala 5' son diferentes de los de uno o más nucleósidos del ala 5'. Dichos compuestos antisentido pueden denominarse agitadores de alas mixtas 3', 5'. En dicha realización, las modificaciones y la combinación de modificaciones en el ala 3' y en el ala 5' pueden ser las mismas o pueden ser diferentes.
[0113] En ciertas realizaciones, los compuestos de ala mixtos tienen propiedades deseables. Ciertas modificaciones de nucleósidos confieren al compuesto antisentido una propiedad deseable, por ejemplo, afinidad aumentada por un objetivo o resistencia a la nucleasa, pero también confieren una propiedad indeseable, por ejemplo, toxicidad aumentada. La incorporación de ciertas otras modificaciones de nucleósidos da como resultado compuestos antisentido con diferentes perfiles de propiedades. En ciertas realizaciones, se pueden combinar modificaciones en una o ambas alas para optimizar las características deseables y/o minimizar las características no deseables. En ciertas realizaciones, las alas de un compuesto antisentido de ala mixta comprenden uno o más nucleósidos que comprenden una primera modificación que aumenta la afinidad del compuesto antisentido por un ácido nucleico diana en comparación con un compuesto antisentido que comprende nucleósidos no modificados; y uno o más nucleósidos que comprenden una segunda modificación que resulta en una toxicidad reducida en comparación con un compuesto antisentido con alas que comprenden nucleósidos que comprenden la primera modificación.
[0114] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido comprende al menos un ala que comprende al menos un nucleósido sustituido con MOE y al menos una modificación de alta afinidad. En ciertas de tales realizaciones, al menos un nucleósido sustituido con MOE y al menos una alta afinidad están en el ala 3'. En ciertas de tales realizaciones, el al menos un nucleósido sustituido con MOE y al menos una alta afinidad están en el ala 5'.
[0115] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido comprende 1,2 o 3 modificaciones de alta afinidad en las alas 5' y/o 3'.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
[0116] En ciertas realizaciones, una variante alélica de huntingtina se reduce selectivamente. Las secuencias de nucleótidos que codifican la huntingtina incluyen, sin limitación, las siguientes: Número de acceso de GENBANK NT_006081.18, truncado desde los nucleótidos 1566000 a 1768000 (reemplazado por el Número de acceso de GENBANK NT_006051), incorporado aquí como SEQ ID NO: 1 y NM_002111.6, incorporado aquí como SEQ ID NO: 2.
[0117] Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en este documento es independiente de cualquier modificación de un resto azúcar, un enlace internucleosídico o una base nucleotídica. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a un resto de azúcar, un enlace de internucleósido, o nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el Número de Isis (Isis No) indican una combinación de secuencia de nucleobase y motivo.
[0118] En ciertas realizaciones, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede abarcar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificante, una región de iniciación de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones definidas estructuralmente para la huntingtina se pueden obtener mediante el número de acceso de las bases de datos de secuencias como NCBI.
En ciertos casos, una región de destino puede abarcar la secuencia desde un sitio de destino de 5' de un segmento de destino dentro de la región de destino a un sitio de destino de 3' de otro segmento de destino dentro de la misma región de destino.
[0119] La selección de dianas incluye la determinación de al menos un segmento diana con el que se hibrida un compuesto antisentido, de manera que se produce un efecto deseado. En ciertos casos, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico diana de ARNm de una variante alélica particular. En ciertos casos, el efecto deseado es la reducción de los niveles de la proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con una variante alélica particular.
[0120] Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Los múltiples segmentos de destino dentro de una región de destino pueden estar superpuestos. Alternativamente, pueden ser no superpuestos. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o es un rango definido por cualquiera de los dos valores precedentes. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En ciertos casos, los segmentos de destino son contiguos. Las regiones diana están definidas por un rango que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de los sitios diana 5' o sitios diana 3' listados aquí.
[0121] Segmentos diana adecuados se pueden encontrar dentro de un 5' UTR, una región codificante, una 3' UTR, un intrón, un exón, o una unión exón/intrón. Los segmentos de destino que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos de destino adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una determinada región estructuralmente definida, como el codón de inicio o el codón de parada.
[0122] La determinación de segmentos diana adecuados pueden incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con otras secuencias de todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST se puede usar para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de una manera no específica a secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o fuera de la diana).
Líneas celulares
[0123] En ciertas realizaciones, las líneas de células GM04281, GM02171, y GM02173B se utilizan en los experimentos descritos en este documento a continuación. La línea celular GM04281 tiene un alelo HTT de tipo salvaje que contiene 17 repeticiones y un alelo HTT mutante que contiene 69 repeticiones. La línea celular se derivó de un paciente cuyos padres también fueron afectados por la enfermedad. La línea celular GM02171 se eligió como un control de pantalla de contador para el GM04281. Esta línea celular se derivó de la hija de los padres, solo uno de los cuales tenía la enfermedad. La hija no había desarrollado HD, pero se consideraba que estaba en riesgo. La línea celular GM02173B también se derivó del paciente y se usó como control de prueba de haplotipos.
[0124] La Tabla 1 proporciona los SNP encontrados en las líneas celulares GM04281, GM02171 y GM02173B. También se proporcionan las variantes alélicas encontradas en cada posición de SNP, el genotipo para cada una de las líneas celulares y el porcentaje de pacientes con EH que tienen una variante alélica particular. Por ejemplo, las dos variantes alélicas para SNP rs6446723 son T y C. La línea celular GM02171 es homocigótica CC, la línea celular GM02173 es heterocigótica TC, y la línea celular GM04281 es homocigótica TT. El cincuenta por ciento de los pacientes con EH tienen una T en la posición SNP rs6446723.
Tabla 1
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algunos casos, la hibridación tiene lugar entre un compuesto antisentido descrito en este documento y un NP. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, Watson-Crick, Hoogsteen o enlaces de hidrógeno invertidos de Hoogsteen) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
[0126] La hibridación puede ocurrir bajo condiciones variables. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se hibridan.
[0127] En ciertos casos, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento son hibridables específicamente con el ácido nucleico de una variante alélica particular.
Complementariedad
[0128] Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido pueden unirse mediante enlaces de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de manera que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, reducción de un producto génico de una variante alélica).
[0129] Nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido sigue siendo capaz de hibridarse específicamente a un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido puede hibridar en uno o más segmentos de un ácido nucleico diana, de modo que los segmentos intermedios o adyacentes no están involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, una falta de coincidencia o una estructura de horquilla).
[0130] En ciertos casos, los compuestos antisentido proporcionados en este documento, o una porción específica de los mismos, son, o son, al menos, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementario a un ácido nucleico diana, una región diana, un segmento diana, un sitio de SNP o una porción específica en esto. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar usando métodos habituales.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarios de una región diana y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representaría una complementariedad del 90 por ciento. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 nucleobases con 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de completa complementariedad con el ácido nucleico diana tendría una complementariedad total del 77,8% con el ácido nucleico diana y, por lo tanto, estaría dentro del alcance de la presente invención. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria utilizando los programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y los programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482489).
[0131] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en este documento, o porciones especificadas de la misma, son totalmente complementarias (es decir, 100% complementarias) a un ácido nucleico diana, un sitio SNP, el objetivo de región, segmento diana, o una porción especificada de la misma. Como se usa en este documento, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejamiento preciso de bases con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. Completamente complementario también se puede usar en referencia a una porción específica del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria de la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 nucleobases correspondiente en la que cada nucleobase es complementaria de la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 nucleobases puede o no ser completamente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias de la secuencia diana.
[0132] La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo o 3' de la 5 final del compuesto antisentido. Alternativamente, las nucleobases o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, vinculadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento del ala de un oligonucleótido antisentido gápmero.
[0133] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que son, o son de hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementarias(s) en relación con un ácido nucleico diana, sitio SNP, o porción especificada de los mismos.
[0134] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido que son, o son de hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementarias(s) en relación con un ácido nucleico diana, sitio SNP, o porción especificada de los mismos.
[0135] Los compuestos antisentido proporcionados en este documento también incluyen los que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en este documento, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "parte" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan los compuestos antisentido que son complementarios a al menos una 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más porciones de nucleobases de un segmento diana, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores.
Identidad
[0136] Los compuestos antisentido proporcionados en este documento también pueden tener un porcentaje de identidad se define a una secuencia particular de nucleótidos, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o porción del mismo. Como se usa en este documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en este documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones abreviadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos aquí, así como compuestos que tienen bases no idénticas con relación a los compuestos antisentido proporcionados en este documento. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas en todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un par de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se está comparando.
[0137] En ciertos casos, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos 70%, 75%, 80%, 8 5 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, descritos en este documento.
[0138] En ciertas realizaciones, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de longitud igual del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
[0139] En ciertas realizaciones, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de longitud igual del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
Modificaciones
[0140] Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato covalentemente enlazado a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato se puede unir al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura del oligonucleótido, se hace referencia comúnmente a los grupos fosfato como formadores de los enlaces internucleósidos del oligonucleótido.
[0141] Las modificaciones de los compuestos antisentido comprenden sustituciones o cambios a internucleosídico vínculos, restos de azúcar, o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados son a menudo preferidos sobre las formas nativas debido a las propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad aumentada por la diana del ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas, o actividad inhibitoria incrementada.
[0142] Nucleósidos químicamente modificados también se pueden emplear para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortada o truncada por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
[0143] Nucleósidos químicamente modificados también se pueden emplear para aumentar la selectividad en la reducción de la expresión del producto génico de una variante alélica.
Enlaces intemudeosídicos modificados
[0144] El enlace internucleosídico natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no naturales, a menudo se seleccionan sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleósidos naturales, debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
[0145] Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleósidos modificados incluyen enlaces internucleósidos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleósidos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforos representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioato. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
[0146] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más enlaces internucleósido modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico fosforotioato.
Restos de azúcar modificados
[0147] Los compuestos antisentido de la invención pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir una mayor estabilidad de nucleasa, mayor afinidad de unión, mayor selectividad para una variante alélica, o alguna otra propiedad biológica beneficiosa para los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden unos restos de anillo de ribofuranosa modificados químicamente. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos los grupos sustituyentes 5' y 2', la unión de los átomos del anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S, N(R) o C(R1)(R)2 (R = H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (vea la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 Publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos sustituidos en 5', 2'-bis descritos o para reemplazar el átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con una sustitución adicional en la posición 2' (ver la publicación Solicitud de Patente de Estados Unidos US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente, sustitución en 5' de un BNA (ver Solicitud Internacional PCT Wo 2007/134181 Publicada el 22/11/07 en donde LNA se sustituye, por ejemplo, con un 5'- metilo o un grupo 5'-vinilo).
[0148] Ejemplos de nucleósidos que han modificado restos de azucar incluyen sin limitación nucleósidos que comprenden 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3 y 2'-O(CH2)2OCH3 grupos sustituyentes. El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
[0149] Como se usa en este documento, "nucleósidos bicíclicos" se refieren a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4 'y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos en los que el puente comprende un nucleósido bicíclico de 4 'a 2'. Ejemplos de tales 4' a 2' nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CHa)-O-2' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos véase la patente US 7.399.845, expedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y sus análogos se encuentran en la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y sus análogos se encuentran en la Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (ver la solicitud de patente estadounidense publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N (R)-O-2', en donde R es H, C1-C12 alquilo, o un grupo protector (véase la patente US 7.427.672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya, et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y sus análogos se encuentran en la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008). Ver, por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt y otros, Proc. Natl Acad Sci. EE.UU., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Medicine. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava y otros, J. Am.
Chem. Soc., 129 (26) 8362-8379 (4 de julio de 2007); Las patentes de EE.UU. n° 7.053.207; 6.268.490; 6.770.748; 6,794,499; 7,034,133; y 6.525.191; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch y col., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinión mol. Ther., 2001, 3, 239-243; y US 6,670,461; Solicitudes internacionales WO 2004/106356; WO 94/14226; WO 2005/021570; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2004-0171570; US2007-0287831; US2008-0039618; Las patentes de EE.UU. n° 7.399.845; Las patentes de EE.UU. números de serie 12/129,154; 60/989,574; 61/026,995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097.787; 61/099,844; Solicitudes internacionales PCT números PCT/US2008/064591; PCT/US2008/066154; PCT/US2008/068922; y solicitudes internacionales PCT publicadas WO 2007/134181. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones de azúcares estereoquímicos que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofananosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
[0150] En ciertas realizaciones, restos de azúcares bicíclicos de nucleósidos BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4' y la posición 2' del resto de azúcar pentofuranosil en el que dichos puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(= S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y -N(Ra)-;
En donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, heterociclo radical, heterociclo sustituido radical, heteroarilo, heteroarilo sustituido, C5-C7 alicíclico radical, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2 , SJ1, N3 , COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J-i), o sulfoxilo (S(=O)-J-i); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquilo, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
[0151] En ciertas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico, es decir, -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb) -N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(Ch2)3-2', 4'-CH2-O-2 ', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
[0152] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2'metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, -L-metilenoxi (4'-CH2-O-2')BNA de haber sido incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, desde 6365­ 6372).
[0153] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos que incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-Metilenoxi (4'-CH2-O-2')BNA, (B) p-D-Metilenoxi (4' -CH2-O-2')BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2')BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2')BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2')BNA, y (F) de metilo (metilenoxi) (4'-CH(CHa)-O-2')BNA, (G) de metileno-tio (4'-CH2-S-2')BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2')BNA, (I) carbocíclico de metilo (4'-CH2-CH(CH3)-2')BNA, (J) carbocíclico de propileno (4'-(CH2)3-2')BNA y (K) carbocíclico de etileno (4'- CH2-CH2-2 ') (carba LnA o "cLNA") como se muestra a continuación.
Figure imgf000023_0001
en donde Bx es el resto base y R es independientemente H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
[0154] En ciertas realizaciones, bicíclico nucleósido tiene la Fórmula I:
Figure imgf000023_0002
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
[0155] En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula II:
Figure imgf000023_0003
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
[0156] En una realización, cada uno de los grupos sustituidos, está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd , SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc .
[0157] En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula III:
Figure imgf000024_0001
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Z b es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido o acilo (C(=O)-) sustituido.
[0158] En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula IV:
Figure imgf000024_0002
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido;
cada qa , qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido, C1-C6 alcoxilo, C1-C6 alcoxilo sustituido, acilo, acilo sustituido, C1-C6 aminoalquilo o C1-C6 aminoalquilo sustituido;
[0159] En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula V:
Figure imgf000024_0003
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa , qb, qe , y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxi, C1-C12 alcoxi sustituido, OJj , SJj , SOJj , SO2Jj , NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj , C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son = C (qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
[0160] La síntesis y la preparación de los monómeros de metilenoxi (4'-CH2-O-2')BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y las propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos han sido descritos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y su preparación también se describen en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
[0161] Los análogos de metilenoxi (4'-CH2-O-2')BNA, metilenoxi (4'-CH2-O-2')BNA y 2'-tio-BNA, también han sido preparados (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para las polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel et al., Documento WO 99/14226). Además, la síntesis de 2'-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad comformacionalmente restringida, se ha descrito en la técnica (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino y 2'-metilamino-BNA y se ha informado previamente la estabilidad térmica de sus dúplex con ARN complementario y cadenas de ADN.
[0162] En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula VI:
Figure imgf000025_0001
en donde:
Bx es un resto base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj , qk y ql es, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxilo, C1-C12 alcoxilo sustituido, OJj , SJj , SOJj , SO2Jj , NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son = C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o C1-C12 alquilo sustituido.
[0163] Un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente analógico alquenilo 4'-Ch=CH-CH2-2' han sido descritos (Frier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). La síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y también se han descrito estudios bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).
[0164] Como se usa en este documento, "nucleósido bicíclico 4'-2' o “nucleósido bicíclico 4' a 2'" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa conecta el átomo de carbono 2' y átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.
[0165] Como se usa en este documento, "nucleósidos monocíclicos" se refieren a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcares bicíclicos. En ciertas realizaciones, el resto azúcar, o análogo de resto azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.
[0166] Tal como se usa en el presente documento, "azúcar modificado en 2'" significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, dichas modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados entre: un haluro, que incluye, pero no se limita a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquilo sustituido y no sustituido alquinilo. En ciertas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan entre los sustituyentes que incluyen, entre otros: O[(CH2)nO]mCH3 , O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 , OCH2C(=O)N(H)CH3 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes en 2' también pueden seleccionarse entre: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3 , SO2CH3, ONO2, NO2,
N3 , NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral
2'-Mo E (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, como 2'- O-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. Los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE también han demostrado ser inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para su uso in vivo (Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
[0167] Como se usa en este documento, un "nucleósido tetrahidropirano modificado" o "nucleósido THP modificado" significa un nucleósido que tiene un tetrahidropiran de seis miembros "azúcar" sustituido por el residuo pentofuranosil en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no se limitan a, lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico hexitol (HNA), ácido nucleico anitol (ANA), ácido nucleico manitol (MnA) (véase Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10: 841-854), flúor HnA (F-HnA) o aquellos compuestos que tienen Fórmula X:
Fórmula X:
Figure imgf000026_0001
en donde independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula X:
Bx es un resto base heterocíclico;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de T3 y
T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo 5' o 3' terminal;
q-i , q2, q3, q4, q5 , q6 y q7 son cada uno independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C alquenilo, sustituido C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido; y
uno de R 1 y R 2 es hidrógeno y el otro se selecciona de halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2,
SJ1, N3 , OC(=X)J-i , OC(=X)NJJ NJ3C(=X)NJJ2 y CN, en donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
[0168] En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos modificados THP de fórmula X en la que qm, qn, qp, qr, qs , qt y qu son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de qm , qn, qp, qr, qs , qt y qu es diferente de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de qm, qn, qp, qr, qs, qt y qu es metilo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de
THP de fórmula X se proporcionan en donde uno de R1 y R2 es F. En algunas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H;
R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
[0169] Como se usa en este documento, "modificado en 2' " o "2'-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituto en la posición 2' distinta de H u OH. Los nucleósidos modificados en 2' incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2' sin puente, tales como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, OC1-C10 alquilo, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm )(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2' pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
[0170] Como se usa en este documento, "2 '-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2'.
[0171] Como se usa en este documento, "2'-OMe" o "2'-OCH3" o "2'-O-metil" cada refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
[0172] Como se usa en este documento, "MOE" o "2'-MOE" o "2'-OCH2CH2OCH3” o "2'-O-metoxietilo" cada uno se
refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
[0173] Como se usa en el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertos casos, uno o más de la pluralidad de nucleósidos se modifica. En ciertos casos, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
[0174] Muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo también se conocen en la técnica que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver artículo de revisión de ejemplo: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854). Tales sistemas de anillos pueden sufrir varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
[0175] Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica.
[0176] En los nucleótidos que tienen restos azúcar modificados, los restos de nucleobases (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con una diana de ácido nucleico apropiada.
[0177] En ciertos casos, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados en 2'-MOE están dispuestos en un motivo de interferencia. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es un cEt. En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados con cEt están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gápmero.
Nucleobases modificados
[0178] Las modificaciones o sustituciones de la nucleobase (o base) son distinguibles estructuralmente de, pero funcionalmente intercambiables con, nucleobases sintéticas o naturales no modificadas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Dichas modificaciones de nucleobase pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de unión, selectividad incrementada para una variante alélica, o alguna otra propiedad biológica beneficiosa para compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticos y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobases, incluyendo sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido para un ácido nucleico diana. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de la 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0.6-1.2 ° C (Sanghvi, YS, Crooke, ST y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
[0179] Nucleobases modificadas adicionales incluyen citosina 5-hidroximetilo, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo en particular 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos 5-sustituidos y citosinas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
[0180] Restos de bases heterocíclicos también pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-aza-pirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluidas 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
[0181] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido ensanchados comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas
[0182] Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de varios criterios, entre los que se incluyen, entre otros, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis que se administrará.
[0183] Un compuesto antisentido puede ser utilizado en composiciones farmacéuticas por combinación del compuesto antisentido con un diluyente farmacéuticamente aceptable o portador adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para uso en composiciones para ser administradas por vía parenteral. Por consiguiente, en una realización, en los métodos descritos en el presente documento se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
[0184] Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualesquiera sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
[0185] Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinde por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
[0186] Los compuestos antisentido pueden unirse covalentemente a uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular, el aumento de la selectividad para una variante alélica o la captación celular de los oligo-nucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y tintes.
[0187] Los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que generalmente están unidos a uno o ambos extremos de compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Incluidas en los grupos estabilizadores están las estructuras de los casquetes. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de la exonucleasa, y pueden ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el término 5' (5'-tapa), o en el término 3' (3'-tapa), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de tapas son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapas abásicas deoxi invertidas. Otros grupos estabilizadores 3' y 5' que pueden usarse para cubrir uno o ambos términos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento de compuestos antisentido.
[0188] Los efectos de los compuestos antisentido en los ácidos nucleicos de nivel, actividad o expresión de destino pueden ser probados in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizados para tales análisis están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y se cultivan de acuerdo con el proveedor instrucciones que utilizan reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células HepG2, células Hep3B y hepatocitos primarios. Las líneas celulares ilustrativas incluyen células GM04281, GM02171 y GM02173B.
Ensayo in vitro de oligonucleótidos antisentido.
[0189] En este documento se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse de manera apropiada para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
[0190] En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente el 60-80% fluidez con- en cultivo.
[0191] Un reactivo comúnmente usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos de LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que típicamente oscila entre 2 y 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
[0192] Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LiPo FeCTAMINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINA en medio de suero reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINA que típicamente oscila entre 2 y 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
[0193] Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye electroporación.
[0194] Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por métodos de rutina. Las células se cosechan típicamente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótido antisentido, momento en el que los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana se miden mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos repetidos.
[0195] La concentración de oligonucleótido antisentido utilizado varía de línea celular a línea celular. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótido antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINA. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan en concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan utilizando electroporación.
Aislamiento de ARN
[0196] El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el Reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de inhibición de niveles diana o expresión.
[0197] La reducción, inhibición o expresión de un ácido nucleico diana puede ensayarse de una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana se pueden cuantificar, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se puede realizar convenientemente utilizando el Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900, disponible en el mercado, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y se usa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de los niveles de ARN diana
[0198] La cuantificación de los niveles de ARN diana se puede lograr mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
[0199] Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que se utiliza entonces como el sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. La RT y las reacciones de PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de RT en tiempo real de la PCR se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia.
[0200] Las cantidades diana del gen (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan utilizando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total utilizando RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de la ciclofilina A se cuantifica por PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con la diana, multiplexación o por separado. El ARN total se cuantifica utilizando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN se enseñan en Jones, LJ, et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN.
[0201] Las sondas y cebadores se diseñan para hibridar con los ácidos nucleicos diana. Los métodos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de software como el software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de los niveles de proteína
[0202] La reducción, inhibición o expresión de ácidos nucleicos diana pueden evaluarse midiendo los niveles de proteína diana. Los niveles de proteína diana pueden evaluarse o cuantificarse de varias formas bien conocidas en la técnica, como la inmunoprecipitación, el análisis de transferencia de Western (inmunotransferencia), el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), la proteína cuantitativa como se dice, los ensayos de actividad de proteínas. (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a un objetivo pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse a través de métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos útiles para la detección de proteínas de ratón, rata, mono y humanos están disponibles comercialmente.
Ensayos in vivo de compuestos antisentido.
[0202] Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se ensayan en animales para evaluar su capacidad para reducir o inhibir selectivamente la expresión del producto del gen diana y producir cambios fenotípicos, como la mejora de un síntoma de la enfermedad. Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos de enfermedades experimentales. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye las vías de administración parenteral, como la intraperitoneal, la intravenosa y la subcutánea. El cálculo de la dosis de oligonucleótido antisentido y la frecuencia de dosificación están dentro de las capacidades de los expertos en la materia, y dependen de factores tales como la vía de administración y el peso corporal del animal. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla ARN o proteína del tejido y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico o proteína diana.
Administración
[0204] En ciertos casos, los compuestos y composiciones descritos en el presente documento se pueden administrar en un número de maneras, dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área a ser tratada. La administración puede ser tópica (incluso oftálmica, vaginal, rectal, intranasal), oral, pulmonar (incluso por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica) o parenteral, por ejemplo, por goteo intravenoso, inyección intravenosa o inyección subcutánea, intraperitoneal, intraocular, intravítrea o intramuscular.
[0205] En ciertos casos, los compuestos y composiciones que se describen en el presente documento se administran parenteralmente.
[0206] En ciertos casos, la administración parenteral es por infusión. La infusión puede ser crónica o continua o corta o intermitente. En ciertos casos, los agentes farmacéuticos infundidos se entregan con una bomba. En ciertos casos, la administración parenteral es por inyección.
[0207] En ciertos casos, los compuestos y composiciones se suministran al SNC. En ciertos casos, los compuestos y las composiciones se administran al líquido cefalorraquídeo. En ciertos casos, los compuestos y las composiciones se administran al parénquima cerebral. En ciertos casos, los compuestos y composiciones se administran a un animal mediante administración intratecal o administración intracerebroventricular. La amplia distribución de compuestos y composiciones, descrita en el presente documento, dentro del sistema nervioso central se puede lograr con la administración intraparenquimatosa, la administración intratecal o la administración intracerebroventricular.
[0208] En ciertos casos, la administración parenteral es por inyección. La inyección se puede administrar con una jeringa o una bomba. En ciertos casos, la inyección es una inyección en bolo. En ciertos casos, la inyección se administra directamente a un tejido, como el estriado, el caudado, la corteza, el hipocampo y el cerebelo.
[0209] En ciertos casos, los métodos para localizar específicamente un agente farmacéutico, como la inyección en bolo, disminuyen la concentración efectiva media (CE50) en un factor de 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50. En ciertos casos, el agente farmacéutico en un compuesto antisentido como se describe adicionalmente en el presente documento. En ciertos casos, el tejido objetivo es el tejido cerebral. En ciertos casos, el tejido objetivo es el tejido estriado. En ciertos casos, la reducción de CE50 es deseable porque reduce la dosis requerida para lograr un resultado farmacológico en un paciente que lo necesite.
[0210] En ciertos casos, un oligonucleótido antisentido se suministra por inyección o infusión una vez cada mes, cada dos meses, cada 90 días, cada 3 meses, cada 6 meses, dos veces al año o una vez al año.
Ciertos compuestos e indicaciones
[0211] En este documento se describen compuestos y métodos que proporcionan una potente inhibición y una mayor selectividad para un alelo mutante. La potencia se demuestra mediante el porcentaje de inhibición del ARNm mutante alcanzado por los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a un SNP en comparación con el porcentaje de inhibición del ARNm mutante logrado por el oligonucleótido de referencia. La selectividad se demuestra por la capacidad del oligonucleótido antisentido que se dirige a un SNP para inhibir la expresión del alelo principal o alelo mutante, en comparación con el alelo menor o alelo de tipo salvaje. El uso de tres líneas celulares con diferentes genotipos en cada posición de SNP ha facilitado la determinación de las reglas de diseño que proporcionan un SNP potente y selectivo dirigido a oligonucleótidos antisentido.
[0212] En ciertos casos, los compuestos son oligonucleótidos antisentido como se describe adicionalmente en el presente documento. Los oligonucleótidos antisentido apuntan preferentemente a un SNP o polimorfismo de diferenciación. Se ensayaron oligonucleótidos de diversas longitudes y se determinó que ciertas longitudes son beneficiosas para la orientación de los SNP.
[0213] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que es 12-30 nucleobases en longitud. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que tiene una longitud de 12-25 nucleobases. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que tiene una longitud de 12-21 nucleobases. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que tiene una longitud de 12-20 nucleobases. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que tiene una longitud de 13-20 nucleobases. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que tiene una longitud de 14-20 nucleobases. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que tiene una longitud de 15-20 nucleobases. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que tiene una longitud de 12-19 nucleobases. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que tiene una longitud de 13-19 nucleobases. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que tiene una longitud de 14-19 nucleobases. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que es 15-19, nuceobases de longitud. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que es 16-19 nucleobases en lenth. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que tiene una longitud de 17-19 nucleobases. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que es 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleobases de longitud.
[0214] Para oligonucleótidos de varias longitudes, la posición del nucleósido complementario a la posición SNP se desplazó dentro del espacio y las alas y se ensayó el efecto. Ciertas posiciones dentro del oligonucleótido antisentido se muestran beneficiosas para apuntar a los SNP.
[0215] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17 al menos 18 o al menos 19 nucleobases de longitud y el SNP es complementario de las posiciones 6-15 contando desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido y/o las posiciones 1-9 contando desde el extremo 5' del espacio. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17 al menos 18 o al menos 19 nucleobases de longitud y el SNP es complementario a las posiciones 8 - 14 contando desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido y/o posiciones 1-9 contando desde el extremo 5' de la brecha. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17 al menos 18 o al menos 19 nucleobases de longitud y el SNP es complementario a las posiciones 8-14 contando desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido y/o posiciones 4-7 contando desde el extremo 5' de la brecha. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17 al menos 18 o al menos 19 nucleobases de longitud y el SNP es complementario a las posiciones 8 - 10 contando desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido y/o posiciones 4-6 contando desde el extremo 5' de la brecha.
[0216] En ciertas realizaciones, el SNP es complementario a la posición 8 , 9 o 10 contando desde el extremo 5' del oligonucleótido o posición 4, 5 o 6 , contando desde el extremo 5' del espacio. Para oligonucleótidos de varias longitudes, se ensayó el efecto de la longitud del espacio, el ala 5' y el ala 3'.
[0217] Ciertas combinaciones ala-hueco-ala mostraron ser beneficiosas para un oligonucleótido antisentido de orientación a SNP. En ciertas realizaciones, la brecha tiene una longitud de 7-11 nucleobases y cada ala tiene una longitud independiente de 1-6 nucleobases. En ciertas realizaciones, la brecha tiene una longitud de 7-11 nucleobases y cada ala tiene una longitud independiente de 2-6. En ciertas realizaciones, la brecha es de 8-11 nucleobases de longitud y cada ala tiene una longitud independiente de 2-6. En ciertas realizaciones, la brecha tiene una longitud de 9-11 nucleobases y cada ala tiene una longitud independiente de 2-6 nucleobases. En ciertas realizaciones, la brecha tiene una longitud de 9 nucleobases y cada ala tiene una longitud independiente de 2-6 nucleobases. En ciertas realizaciones, la brecha tiene una longitud de 10 nucleobases y cada ala tiene una longitud independiente de 2-6 o 4-5. En ciertas realizaciones, la brecha tiene una longitud de 11 nucleobases y cada ala tiene una longitud independiente de 2-6, o de 4-5. En ciertas formas de realización, la configuración de ala de separación es una de 4-7-4, 5-8-6, 6-8-5, 6-7-6, 5-7-5, 6-8-5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5­ 9 -5 , 4-11-4, 4-10-5 y 5-10-4.
[0218] Para oligonucleótidos de varias longitudes, se ensayó el efecto de ciertas químicas. Se demostró que ciertas modificaciones químicas son beneficiosas para un oligonucleótido antisentido dirigido a SNP. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de cada ala del oligonucleótido antisentido modificado tiene una modificación 2 '-MOE. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de cada ala del oligonucleótido antisentido modificado tiene una modificación de alta afinidad. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es un espaciador de alas mixtas. En dicha realización, las modificaciones y la combinación de modificaciones en el ala 3' y en el ala 5' pueden ser las mismas o pueden ser diferentes. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene una o más modificaciones 2'-MOE en las alas y/o una o más modificaciones de alta afinidad en las alas. En ciertas realizaciones, la modificación de alta afinidad es una modificación de cEt. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene una modificación de alta afinidad en las posiciones 2, 3, 13 y 14 del oligonucleótido antisentido (contando desde el extremo 5'). En ciertas realizaciones, el oligonucótido antisentido tiene una, dos, tres o cuatro modificaciones de alta afinidad en al menos una de las alas. En ciertas realizaciones, el oligonucótido antisentido tiene una, dos, tres o cuatro modificaciones de alta afinidad en cada una de las alas 5' y 3' independientemente. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene una modificación de alta afinidad en las posiciones 2 y 3 en una o ambas alas 5' y 3' (contando desde el extremo 5' del ala 5' y el extremo 3' del ala 3'). En ciertas realizaciones, el oligonucótido antisentido tiene una modificación de alta afinidad en las posiciones 2, 3 y 4 en una o ambas alas 5' y 3' (contando desde el extremo 5' del ala 5' y el extremo 3' del ala 3'). En ciertas realizaciones, el oligonucótido antisentido tiene una modificación de alta afinidad en las posiciones 1 de las alas 5' y/o 3' (contando desde el extremo 5' del ala 5' y el extremo 3' del ala 3'). En ciertas realizaciones, el oligonucótido antisentido tiene una modificación de alta afinidad en las posiciones 1 de las alas 5' y 3' (contando desde el extremo 5' del ala 5' y el extremo 3' del ala 3') y al menos otra posición en el ala. En ciertas realizaciones, el oligonucótido antisentido tiene una modificación de 2'-MOE y alta afinidad en al menos una de las alas 5' y 3'.
[0219] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido que incorpora una o más de las reglas de diseño proporcionados anteriormente.
[0220] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos unidos, totalmente complementarios a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala de ala, en donde el polimorfismo de nucleótidos se alinea con cualquiera de las posiciones 6-15 que comienzan desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido o las posiciones 1-9 que comienzan desde el extremo 5' de la brecha del oligonucleótido antisentido modificado; y en donde cada nucleósido de cada ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el sitio de polimorfismo de un solo nucleótido contiene un polimorfismo diferenciador. En ciertos casos, el sitio del polimorfismo de un solo nucleótido se encuentra en un alelo mutante. En ciertos casos, el alelo mutante está asociado con la enfermedad. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consisten en 4-7-4, 5-8-6, 6-8-5, 6-7-6, 5-7-5, 6-8-5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5-9-5, 4­ 11 -4 , 4 -10 - 5 y 5-10-4.
[0221] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 12 a 20 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en el que el polimorfismo de nucleótidos se alinea con cualquiera de las posiciones 6-15 que comienzan desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido o las posiciones 1-9 que comienzan desde el extremo 5' de la brecha del oligonucleótido antisentido modificado; y en donde cada nucleósido de cada ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consisten en 4-7-4, 5-8-6, 6-8-5, 6-7-6, 5-7-5, 6-8­ 5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5-9-5, 4-11-4,4-10-5 y 5-10-4.
[0222] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 12 a 20 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala de ala, en donde el polimorfismo de nucleótidos se alinea con cualquiera de las posiciones 8-14 que comienzan a partir del extremo 5' del oligonucótido antisentido o las posiciones 1-9 que comienzan desde el extremo 5' del hueco del oligonucleótido antisentido modificado; y en donde cada nucleósido de cada ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consisten en 4-7-4, 5-8-6, 6-8-5, 6-7-6, 5-7-5. 6-8­ 5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5-9-5, 4-11-4, 4-10-5 y 5-10-4.
[0223] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 12 a 20 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala de ala, en donde el polimorfismo de nucleótidos se alinea con cualquiera de las posiciones 8-14 que comienzan a partir del extremo 5' del oligonucótido antisentido o las posiciones 4-7 que comienzan desde el extremo 5' del hueco del oligonucleótido antisentido modificado; y en donde cada nucleósido de cada ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consisten en 4-7-4, 5-8-6, 6-8-5, 6-7-6, 5-7-5, 6-8­ 5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5-9-5, 4-11-4,4-10-5 y 5-10-4.
[0224] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 12 a 20 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala de ala, en donde el polimorfismo de nucleótidos se alinea con cualquiera de las posiciones 8-10 que comienzan desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido o las posiciones 4-6 que comienzan desde el extremo 5' del espacio del oligonucleótido antisentido modificado; y en donde cada nucleósido de cada ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consisten en 4-7-4, 5-8-6, 6-8-5, 6-7-6, 5-7-5, 6-8­ 5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5-9-5, 4-11-4, 4-10-5 y 5-10-4.
[0225] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 12 a 19 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo ala-espacio-ala, en donde el único el polimorfismo de nucleótidos se alinea con cualquiera de las posiciones 8-10 que comienzan desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido o las posiciones 4-6 que comienzan desde el extremo 5' del espacio del oligonucleótido antisentido modificado; y en donde cada nucleósido de cada ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consisten en 4-7-4, 5-8-6, 6-8-5, 6-7-6, 5-7-5, 6-8­ 5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5-9-5, 4-11-4, 4-10-5 y 5-10-4.
[0226] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 13 a 19 nucleósidos unidos, totalmente complementarios a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en el que el polimorfismo de nucleótidos se alinea con cualquiera de las posiciones 8-10 que comienzan desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido o las posiciones 4-6 que comienzan desde el extremo 5' del espacio del oligonucleótido antisentido modificado; y en donde cada nucleósido de cada ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consisten en 4-7-4, 5-8-6, 6-8-5, 6-7-6, 5-7-5, 6-8­ 5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5-9-5, 4-11-4, 4-10-5 y 5-10-4.
[0227] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 14 a 19 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un solo sitio de polimorfismo de nucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala de brecha, en el que el polimorfismo de un solo nucleótido se alinea con cualquiera de las posiciones 8-10 comenzando desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido o las posiciones 4-6 que comienzan desde el extremo 5' de la brecha del oligonucleótido antisentido modificado; y en donde cada nucleósido de cada ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consisten en 4-7-4, 5-8-6, 6-8-5, 6-7-6, 5-7-5, 6-8­ 5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5-9-5, 4-11-4, 4-10-5 y 5-10-4.
[0228] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 15 a 19 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en el que el polimorfismo de nucleótidos se alinea con cualquiera de las posiciones 6-15 que comienzan desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido o las posiciones 1-9 que comienzan desde el extremo 5' de la brecha del oligonucleótido antisentido modificado; y en donde cada nucleósido de cada ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consisten en 4-7-4, 5-8-6, 6-8-5, 6-7-6, 5-7-5, 6-8­ 5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5-9-5, 4-11-4, 4-10-5 y 5-10-4.
[0229] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 15 a 19 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala de espacio de ala, en donde el polimorfismo de nucleótidos se alinea con cualquiera de las posiciones 8-10 comenzando desde el extremo 5' del oligonucótido antisentido o desde las posiciones 4-6 que comienzan desde el extremo 5' del espacio del oligonucleótido antisentido modificado; y en donde cada nucleósido de cada ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consisten en 4-7-4, 5-8-6, 6-8­ 5, 6-7-6, 5-7-5, 6-8-5, 5-8-6, 3-9-4, 4-9-3, 2-9-6, 6,9,2,3-9-3, 3-9-5, 5-9-3, 5-9-4, 4-9-5, 5-9-5, 4-11-4, 4-10-5 y 5-10-4.
[0230] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 15 a 19 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un solo sitio de polimorfismo de nucleótido, en donde el oligonucleótido antisés modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en donde la posición 6, 8, 9, 10, 11 o 14 a partir del extremo 5' del oligonucleótido antisentido modificado se alinean con el polimorfismo de un solo nucleótido; y en donde cada nucleósido de cada segmento del ala modificó el azúcar o el sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4­ 11-4, y 5-10-4.
[0231] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 15 a 19 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un único sitio de polimorfismo de nucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo ala-espacio-ala, en donde la posición 1, 4, 5, 6, 7 o 9 del segmento de la brecha se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido; y en donde cada nucleósido de cada segmento del ala tiene un azúcar modificado o un sustituto del azúcar. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4, y 5-10-4.
[0232] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 15 a 19 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un único sitio de polimorfismo de nucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en donde la posición 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 del oligonucleótido antisentido modificado se alinean con el polimorfismo de un solo nucleótido; y las posiciones 2 y 3 de los segmentos de ala 5' y 3' comprenden un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4, y 5-10-4.
[0233] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consta de 15 a 19 nucleósidos enlazados y totalmente complementario a un único sitio de polimorfismo de nucleótidos, en el que el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo ala-hueco-ala, en el que la posición 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del segmento hueco se alinea con el polimorfismo de nucleótido único; y las posiciones 2 y 3 de los segmentos de ala 5' y 3' comprenden un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4, y 5-10-4.
[0234] En un ejemplo, un oligonucleótido antisentido modificado que consta de 15 a 19 nucleósidos unidos y completamente complementario a un único sitio de polimorfismo de nucleótido, en el que el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en el que la posición 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 del oligonucleótido antisentido modificado se alinean con el polimorfismo de un solo nucleótido; y las posiciones 2, 3, 13 y 14 del oligonucleótido antisentido comprenden un puente 4'-CH(CH3)-O- 2'. En ciertas realizaciones, el motivo alahueco-ala es uno cualquiera del grupo que consiste en de 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4 y 5-10-4.
[0235] Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consta de 15 a 19 nucleósidos enlazados y totalmente complementario a un único sitio de polimorfismo de nucleótidos, en el que el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo ala-hueco-ala, en el que la posición 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del segmento de la brecha se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido; y las posiciones 2, 3, 13, y 14 del oligonucleótido antisentido antisentido comprenden un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4, y 5-10-4.
[0236] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 17 a 19 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en donde la posición 8, 9, o 10 del oligonucleótido antisentido modificado se alinean con el polimorfismo de un solo nucleótido; y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4, y 5-10-4.
[0237] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 17 a 19 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un único sitio de polimorfismo de nucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala de ala, donde la posición 5, 6 o 7 del segmento de la brecha se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido; y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4, y 5-10-4.
[0238] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 17 a 19 nucleósidos unidos, completamente complementarios a un único sitio de polimorfismo de nucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en donde la posición 8, 9, o 10 del oligonucleótido antisentido modificado se alinean con el polimorfismo de un solo nucleótido; y las posiciones 2 y 3 de los segmentos de ala 5' y 3' comprenden un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4, y 5-10-4.
[0239] En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste en 17 a 19 nucleósidos unidos y completamente complementario a un sitio de polimorfismo de nucleótido único, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala de espacio de ala, en donde la posición 5, 6 o 7 del segmento de la brecha se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido; y las posiciones 2 y 3 de los segmentos de ala 5' y 3' comprenden un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4, y 5-10-4.
[0240] Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 17 a 19 nucleósidos unidos y completamente complementario a un único sitio de polimorfismo de nucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en donde la posición 8, 9 o 10 el oligonucleótido modificado se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido; y las posiciones 2, 3, 13 y 14 del oligonucleótido antisentido antisentido comprenden un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En ciertos casos, el motivo del ala-hueco-ala es uno cualquiera del grupo consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4 y 5-10-4.
[0241] Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consta de 17 a 19 nucleósidos unidos y completamente complementario a un único sitio de polimorfismo de nucleótido, en el que el oligonucleótido antisentido modificado comprende un motivo de ala-hueco-ala, en donde la posición 5, 6 o 7 el segmento de la brecha se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido; y las posiciones 2, 3, 13, y 14 del oligonucleótido antisentido comprenden un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En ciertos casos, el motivo del alerón del ala es cualquiera de los grupos que consiste en 2-9-6, 3-9-3, 3-9-5, 4-9-5, 4-11-4, y 5-10-4.
[0242] En ciertos casos, el oligonucleótido antisentido es de 11 a 20 nucleósidos enlaces de longitud y tiene, independientemente, de 2 a 5 nucleósidos vinculados en alas 5' y 3' y 7 a 11 nucleósidos vinculados en la brecha. El SNP es complementario a la posición 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 del oligonucleótido antisentido (contando desde el extremo 5' del oligonucleótido antisentido) o posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, contando desde el extremo 5' del segmento hueco.
[0243] En una cierta realización, el oligonucleótido antisentido es de 15 a 19 nucleósidos enlazados de longitud y tiene, de manera independiente, de 2 a 5 nucleósidos enlazados en alas 5' y 3' y 7 a 11 nucleósidos enlazados en la brecha. El SNP es complementario a la posición 6, 7, 8, 9 o 10 del oligonucleótido antisentido (contando desde el extremo 5' del oligonucleótido antisentido) o la posición 4, 5, 6 o 7 contando desde el extremo 5' del segmento de la brecha.
[0244] En una cierta realización, el oligonucleótido antisentido es de 17 nucleósidos enlaces de longitud y tiene, independientemente, de 2 a 5 nucleósidos enlaces en los segmentos y 3' de las alas 5' y 9 a 11 nucleósidos vinculados en el segmento de hueco. El SNP es complementario a la posición 8, 9 o 10 del oligonucleótido antisentido (contando desde el extremo 5' del oligonucleótido antisentido) o la posición 5, 6 o 7 (contando desde el extremo 5' del segmento hueco).
[0245] En una cierta realización, el oligonucleótido antisentido es de 18 nucleósidos enlaces de longitud y tiene, independientemente, de 2 a 5 nucleósidos enlaces en los segmentos y alas 3' y 5' y 9 a 11 nucleósidos enlazados en el segmento de hueco. El SNP es complementario a la posición 8, 9 o 10 del oligonucleótido antisentido (contando desde el extremo 5' del oligonucleótido antisentido) o la posición 5, 6 o 7 (contando desde el extremo 5' del segmento hueco).
[0246] En una cierta realización, el oligonucleótido antisentido es de 19 nucleósidos enlaces de longitud y tiene, independientemente, de 2 a 5 nucleósidos enlaces en los segmentos y 3' de las alas 5' y 9 a 11 nucleósidos enlazados en el segmento de hueco. El SNP es complementario a la posición 8, 9 o 10 del oligonucleótido antisentido (contando desde el extremo 5' del oligonucleótido antisentido) o la posición 5, 6 o 7 (contando desde el extremo 5' del segmento hueco).
[0247] En el presente documento se describen métodos para tratar a un individuo que comprende administrar una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertos casos, el individuo tiene una variante alélica asociada con una enfermedad o trastorno. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento se dirigen preferentemente a un SNP. En ciertos casos, el SNP es un polimorfismo diferenciador.
[0248] Se han descrito métodos para determinar si un SNP es específico de un alelo asociado a una enfermedad y más específicamente si una variante de SNP de un alelo de un paciente heterocigoto está en el mismo alelo que una mutación causante de la enfermedad en una región remota del ARNm del gen (WO 2008/147930 y WO 2008/143774).
[0249] Las enfermedades asociadas con los SNP se han descrito para ciertos genes. En ciertos casos, el gen y las enfermedades asociadas son cualquiera de los siguientes: el gen APP codifica la proteína precursora de amiloide involucrada en la enfermedad de Alzheimer (Gene, 371: 68, 2006); el gen PrP que codifica la proteína priónica involucrada en la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y en el insomnio familiar fatal (Nat. Med. 1997, 3: 1009); el gen GFAP codifica la proteína ácida fibrilar glial implicada en la enfermedad de Alexander (J. Neurosci. 2006, 26: 111623); gen de alfa-sinucleína que codifica la proteína alfa-sinucleína implicada en la enfermedad de Parkinson (J. Clin. Invest. 2003, 111: 145); el gen SOD-1 que codifica la proteína SOD-1 involucrada en la esclerosis lateral amiotrófica (Science 1998, 281: 1851); gen de la atrofina-1 que codifica la proteína atrofina-1 involucrada en la atrofia dentato-rubral y palidoluysiana (DRPA) (Trends Mol. Med. 2001, 7: 479); el gen SCA1 que codifica la proteína ataxina-1 participa en la ataxia espinocerebelosa 1 (SCA1) (Protein Sci. 2003, 12: 953); el gen PLP codifica la proteína proteolipídica involucrada en la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (NeuroMol Med. 2007, 4: 73); el gen DYT1 codifica la proteína torsina A implicada en la distonía de torsión (Brain Res. 2000, 877: 379); y el gen cristalino alfa-B que codifica la proteína cristalina alfa-B involucrada en las enfermedades de agregación de proteínas, incluida la miocardiopatía (Cell 2007, 130: 427); gen alfa1-antitripsina que codifica la proteína alfa1-antitripsina implicada en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad hepática y carcinoma hepatocelular (New Engl J Med. 2002, 346: 45); el gen Ltk que codifica la proteína tirosina quinasa de leucocitos participa en el lupus eritematoso sistémico (Hum. Mol. Gen. 2004, 13: 171); el gen PCSK9 codifica la proteína PCSK9 involucrada en la hipercolesterolemia (Hum Mutat. 2009, 30: 520); gen del receptor de prolactina que codifica la proteína receptora de prolactina implicada en tumores de mama (Proc. Natl. Assoc. Sci. 2008, 105: 4533); Gen CCL5 que codifica la quimiocina CCL5 involucrada en la EPOC y el asma (Eur. Respir. J. 2008, 32: 327); el gen PTPN22 codifica la proteína PTPN22 involucrada en la diabetes tipo 1, la artritis reumatoide, la enfermedad de Graves y el LES (Proc. Natl. Assoc. Sci. 2007, 104: 19767); gen del receptor de andrógenos que codifica la proteína receptora de andrógenos implicada en la atrofia muscular espinal y bulbar o la enfermedad de Kennedy (J Steroid Biochem. Mol. Biol. 2008, 108: 245); el gen CHMP4B codifica la proteína-4B modificadora de la cromatina involucrada en cataratas subcapsulares posteriores progresivas de la infancia (Am. J. Hum. Genet 2007, 81: 596); Gen FXR/NR1H4 que codifica la proteína del receptor Farnesoid X involucrada en la enfermedad de cálculos biliares del colesterol, la artrosclerosis y la diabetes (Mol. Endocrinol. 2007, 21: 1769); Gen ABCA1 que codifica la proteína ABCA1 involucrada en la enfermedad cardiovascular (Transl. Res. 2007, 149: 205); el gen CaSR codifica la proteína receptora del sensor de calcio involucrada en la hipercalciuria primaria (Kidney Int. 2007, 71: 1155); gen de la alfaglobina que codifica la proteína alfa-globina involucrada en la alfa-tallasemia (Science 2006, 312: 1215); el gen httlpr codifica la proteína HTTLPR involucrada en el trastorno obsesivo compulsivo (Am. J. Hum. Genet. 2006, 78: 815); Gen AVP que codifica la proteína de arginina vasopresina en trastornos relacionados con el estrés, como trastornos de ansiedad y depresión comórbida (CNS Neurol. Disord. Drug Targets 2006, 5: 167); el gen GNAS codifica proteínas G involucradas en defectos visuales congénitos, hipertensión, síndrome metabólico (Trends Pharmacol. Sci. 2006, 27: 260); el gen APAF1 codifica la proteína APAF1 involucrada en una predisposición a la depresión mayor (Mol. Psychiatry 2006, 11: 76); el gen TGF-beta1 que codifica la proteína TGF-beta1 involucrada en el cáncer de mama y cáncer de próstata (Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2004, 13: 759); el gen AChR codifica el receptor de acetilcolina involucrado en el síndrome miasténico congénito (Neurology 2004, 62: 1090); el gen P2Y12 que codifica la proteína receptora del difosfato de adenosina (ADP) participa en el riesgo de enfermedad arterial periférica (Circulation 2003, 108: 2971); Gen LQT1 que codifica la proteína LQT1 involucrada en la fibrilación auricular (Cardiology 2003, 100: 109); El protooncogen RET codifica la proteína RET involucrada en el feocromocitoma esporádico (J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 88: 4911); gen de la filamina A que codifica la proteína filamina A involucrada en varias malformaciones congénitas (Nat. Genet. 2003, 33: 487); el gen TARDBP codifica la proteína TDP-43 involucrada en la esclerosis lateral amiotrófica (Hum. Mol. Gene.t 2010, 19: 671); el gen SCA3 codifica la proteína ataxina-3 involucrada en la enfermedad de Machado-Joseph (PLoS One 2008, 3: e3341); el gen SCA7 codifica la proteína ataxina-7 implicada en la ataxia espinocerebelosa 7 (PLoS One 2009, 4: e7232); el gen HTT codifica la proteína huntingtina involucrada en la enfermedad de Huntington (Neurobiol Dis. 1996, 3: 183); y el gen CA4 que codifica la proteína anhidrasa 4 carbónica, el gen CRX que codifica la proteína del factor de transcripción homeobox cónico, el gen FSCN2 que codifica la proteína homóloga 2 retinal fascinante, el gen IMPDH1 que codifica la proteína E3 monofosfato deshidrogenasa de inosina Gen NRL que codifica la proteína de la cremallera leucina de la retina neural, gen PRPF3 (RP18) que codifica la proteína del factor 3 de empalme de pre-ARNm, gen PRPF8 (RP13) que codifica la proteína del factor 8 de empalme de pre-ARNm, el gen p Rp F31 (r P11) codifica la proteína del factor 31 de empalme de pre-ARNm, gen r Ds que codifica la proteína periferina 2, gen ROM1 que codifica la proteína 1 de la membrana externa de la varilla, gen RHO que codifica la proteína rodopsina, gen RP1 que codifica la proteína RP1, gen RPGR que codifica la proteína reguladora de la GTPasa de la retinitis pigmentaria, todos los cuales están involucrados en la retinitis autosómica dominante (Adv Exp Med Biol. 2008, 613: 203).
[0250] En ciertos casos, la enfermedad es un trastorno neurodegenerativo. En realizaciones de la invención, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Huntington. En ciertas formas de realización, el SNP seleccionado es uno o más de: rs6446723, rs3856973, rs2285086, rs363092, rs916171, rs6844859, rs7691627, rs4690073, rs2024115, rs11731237, rs362296, rs10015979, rs7659144, rs363096, rs362273, rs16843804, rs362271, rs362275, rs3121419, rs362272, rs3775061, rs34315806, rs363099, rs2298967, rs363088, rs363064, rs363102, rs2798235, rs363080, rs363072, rs363125, rs362303, rs362310, rs10488840, rs362325, rs35892913, rs363102, rs363096, rs11731237, rs10015979, rs363080, rs2798235, rs1936032, rs2276881, rs363070, rs35892913, rs12502045, rs6446723, rs7685686, rs3733217, rs6844859, rs362331, rs1143646, rs2285086, rs2298969, rs4690072, rs916171, rs3025849, rs7691627, rs4690073, rs3856973, rs363092, rs362310, rs362325, rs363144, rs362303, rs34315806, rs363099, rs363081, rs3775061, rs2024115, rs10488840, rs363125, rs362296, rs2298967, rs363088, rs363064, rs362275, rs3121419, rs3025849, rs363070, rs362273, rs362272, rs362306, rs362271, rs363072, rs16843804, rs7659144, rs363120 y rs12502045. En ciertas realizaciones, los compuestos son ISIS460065, ISIS 459978, ISIS 460028, ISIS 460209, ISIS 460208 e ISIS 460206.
Dosis Terapéuticamente Efectivas
[0251] En ciertos casos, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido al alelo huntingtina mutada se acompaña de monitorización de la expresión de un producto génico en un individuo, para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. En ciertos casos, el producto genético es ARNm o proteína de huntingtina. La respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido es utilizada por un médico para determinar la cantidad y la duración de la intervención terapéutica.
[0252] En ciertos casos, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico mutante da como resultado la reducción de la expresión de ARNm o proteína en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores. En ciertos casos, el ácido nucleico mutante es ácido nucleico de huntingtina, el ARNm es ARNm de huntingtina y la proteína es proteína de huntingtina.
[0253] En ciertos casos, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a un alelo mutante se usan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que sufre o es susceptible a cualquiera de la Enfermedad de Huntington, Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Crutzfeldt-Jakob, Insomnio Familiar Fatal, Enfermedad de Huntington, Enfermedad de Alexander, Enfermedad de Parkinson, Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS), Atrofia Dentato-Rubral y Pallido-Luysiana, Ataxia 1 Cerebelosa Spino, Enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, Distonía de Torsión, cardiomiopatía, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad hepática y carcinoma hepatocelular, LES, hipercolesterolemia, tumores de mama, asma, diabetes tipo 1, artritis reumatoide, enfermedad de Graves, atrofia muscular espinal y bulbar, enfermedad de Kennedy, cataratas subcapsulares posteriores progresivas de la infancia, enfermedad de cálculos biliares, artrosclerosis, enfermedad cardiovascular, hipercalciuria primaria, alfa-talasemia, TOC, trastorno relacionado con el estrés (incluyendo trastornos de ansiedad y depresión comórbida), defectos visuales congénitos, hipertensión, síndrome metabólico, depresión mayor, cáncer de mama, cáncer de próstata, síndrome miasténico congénito, síndrome arterial periférico, fibrilación auricular, feocromocitoma esporádico, malformaciones congénitas, NJD, SCA7, y retinitis pigmentosa autosómica adRP.
Ciertas terapias combinadas
[0254] En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención se coadministran con uno o más agentes farmacéuticos. En ciertos casos, tales uno o más agentes farmacéuticos están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección que la una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertos casos, tales uno o más agentes farmacéuticos están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente como una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertos casos, tales uno o más agentes farmacéuticos están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención se coadministran con otro agente farmacéutico para tratar un efecto no deseado de ese otro agente farmacéutico. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención se coadministran con otro agente farmacéutico para producir un efecto combinado. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención se coadministran con otro agente farmacéutico para producir un efecto sinérgico.
[0255] En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos se administran al mismo tiempo. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos se administran en diferentes momentos. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos se preparan juntos en una única formulación. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos se preparan por separado.
EJEMPLOS
Divulgación no limitativa e incorporación por referencia.
[0256] Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en el presente documento y no pretenden limitarlos.
Ejemplo 1: Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en la secuencia del gen de huntingtina (HTT)
[0257] La secuencia genómica HTT, designada aquí como SEQ ID NO: 1 (NT_006081.18 truncado de los nucleótidos 1566000 a 1768000) se alineó con el HTT ARNm, designado aquí como SEQ ID NO: 2 (NM_002111.6), utilizando el Base de datos de secuencias EMBL-EBI (ClustalW2, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Las posiciones de SNP (identificadas por Hayden et al, WO/2009/135322) asociadas con el gen HTT se asignaron a las dos secuencias y se determinaron por su número de identificación de SNP de referencia de la base de datos de Entrez SNP en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, http://www.ncbi.nlm.n¡h.gov/sites/entrez?db=snp). La Tabla 2 proporciona más detalles sobre cada SNP. El 'Número de identificación de SNP de referencia' o 'Número de RS' es el número designado para cada SNP de la base de datos de Entrez SNP en NCBI. "Posición de SNP" se refiere a la posición de nucleótidos del SNP en la SEQ ID NO: 1. "Polimorfismo" indica las variantes de nucleótidos en esa posición de SNP. 'Alelo principal' indica el nucleótido asociado con el alelo principal, o el nucleótido presente en una proporción estadísticamente significativa de individuos en la población humana. 'Alelo menor' indica el nucleótido asociado con el alelo menor, o el nucleótido presente en una proporción relativamente pequeña de individuos en la población humana.
Tabla 2
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Ejemplo 2: Diseño de oligonucleótidos antisentido dirigidos a los SNP del gen de la huntingtina e inhibición de ARNm de HTT en líneas celulares de fibroblastos de Coriell (GM04281, GM02171 y GM02173B)
[0258] Los oligonucleótidos antisentido que apuntan a los nucleótidos que se superponen a las posiciones de SNP presentadas en la Tabla 1 se diseñaron y ensayaron para determinar su potencia en tres líneas celulares de fibroblastos Coriell derivadas de pacientes de huntingtina, GM04281, GM02171 y GM02173B (del Instituto Coriell para Investigación Médica). Las células GM04281 cultivadas o las células GM02171 o las células GM02173B y una densidad de Ta de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con un oligonucleótido antisentido de 10.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de HTT mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el conjunto de sondas de cebador RTS2617 (secuencia directa CTCCGTCCGGTAGACATGCT, designada aquí como Se Q ID NO: 3; secuencia inversa GGAAATCAGAACCCTCAAATGG, designada aquí como SEQ ID NO: 4; secuencia de la sonda TGAGCACTGTTCAACTGTGGATATCGGGAX, designada en este documento como SEQ ID NO: 5). Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de HTT ARNm, en relación con las células de control no tratadas.
[0259] Se incluyeron ISIS 387916 (TCTCTATTGCACATTCCAAG, 5-10-5 MOE (SEQ ID NO: 6)) e ISIS 388816 (GCCGTAGCCTGGGACCCGCC, 5-10-5 MOE (SEQ ID NO: 7)) en cada estudio como puntos de referencia de oligonucleótidos contra los cuales se podría comparar la potencia de los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a los nucleótidos que se superponen en cada posición de SNP.
[0260] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en las Tablas 3 y 4 se diseñaron como espaciadores de 5-9-5 MOE. Los separadores de espacios tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento del hueco central consta de nueve desoxinucleótidos 2 'y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden cinco nucleótidos cada una. Cada nucleótido en el segmento de ala 5' y cada nucleótido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P = S). Todas las nucleobases de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas.
[0261] Los oligonucleótidos se describen adicionalmente en la Tabla 3. El porcentaje de inhibición de ARNm de HTT por los oligonucleótidos antisentido en cada línea celular se muestra en la Tabla 4. 'Alelo diana' indica si el gápmero está dirigido al alelo mayor o al menor en la posición de SNP. El número entre paréntesis indica la posición del nucleótido en el gápmero opuesto a la posición del SNP, a partir del extremo 5 'del oligonucleótido. 'Sitio de inicio' indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gápmero. "Sitio de detención" indica el nucleótido más 3' al que se dirige el gápmero. Cada gápmero listado en las Tablas 3 y 4 está dirigido a pre-ARNm de HTT humano, que es la SEQ ID NO: 1.
Tabla 3
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(co n tin ú a )
Figure imgf000041_0001
(co n tin ú a )
Figure imgf000042_0001
(co n tin ú a )
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Tabla 4
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(co n tin ú a )
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(continúa)
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(continúa)
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Ejemplo 3: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de huntingtina humana en líneas celulares de fibroblastos de Coriell
[0262] Los gápmeros del estudio descrito en el Ejemplo 2 se seleccionaron y ensayaron a diversas dosis en las líneas celulares GM04281, GM02171 y GM02173B. Cada línea celular se colocó en placas con una densidad de aTa de 25.000 células por pocillo y se transfectó usando electroporación con 750 nM, 1.500 nM, 3.000 nM, 6.000 nM y 12.000 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 5, 6 y 7. Después de período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de HTT se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador HTT humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de HTT ARNm, en relación con las células de control no tratadas. Los valores de IC50 también se proporcionan en las Tablas 5, 6 y 7.
Tabla 5
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Tabla 7
Figure imgf000048_0001
Ejemplo 4: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de huntingtina humana en líneas celulares de fibroblastos de Coriell
[0263] Se seleccionaron gápmeros del estudio descrito en el Ejemplo 2 y se ensayaron a diversas dosis en líneas celulares GM04281, GM02171 y GM02173B. Cada línea celular se colocó en placas con una densidad de 25.000 células por pocillo y se transfectó utilizando electroporación con 750 nM, 1.500 nM, 3.000 nM, 6.000 nM y 12.000 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en Tabla 8, 9 y 10. Después de período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de HTT se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador HTT humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de HTT ARNm en relación con las células de control no tratadas. Los valores de CI50 también se proporcionan en las Tablas 8, 9 y 10.
Tabla 8
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Tabla 9
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Tabla 10
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Ejemplo 5: Inhibición antisentido de HTT humana en células GM04281
[0264] Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales basados en los gápmeros seleccionados de los estudios descritos en el Ejemplo 4. Estos oligonucleótidos se diseñaron creando gápmeros desplazados ligeramente hacia arriba y hacia abajo (es decir, "microwalk") de gápmeros originales de las Tablas 8, 9 y los oligonucleótidos antisentido también se crearon con MOE uniforme, así como con diversos motivos, 2-9-6 m Oe , 3-9-3 MOE, 3-9-4 MOE, 3-9-5 MOE, 4-10-5 MOE, 4-11-4 MOE, 4-7-4 MOE, 4-9-4 MOE, 4-9-5 MOE, 5-10-4 MOE, 5-7-5 MOE, 5-8-6 MOE , 5-9-3 MOE, 5-9-5 MOE, 6-7-6 MOE, 6-9-2 MOE y 6-8-5 MOE.
[0265] Además, se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a SNP RS Nos. Rs2857936, rs12506200, rs762855 y rsl006798 (consulte la Tabla 2). Los oligonucleótidos fueron diseñados dirigidos al alelo mayor o al alelo menor, y con la posición SNP opuesta a la posición 8 o la posición 10 del gápmero.
[0266] Estos gápmeros fueron ensayados in vitro. Células GM04281 cultivadas a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 10.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de HTT mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan en las Tablas 11-19 como el porcentaje de inhibición de HTT ARNm, en relación con las células de control no tratadas.
[0267] Los gápmeros, ISIS 435869, ISIS 435870, ISIS 435874, ISIS 435879 e ISIS 435890, de los cuales se derivaron algunos de los gápmeros de nuevo diseño están marcados con un asterisco (*) en la tabla. ISIS 387916 se incluyó en el estudio como un oligonucleótido de referencia contra el cual se podría comparar la potencia de los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a los nucleótidos que se superponen en cada posición de SNP.
[0268] Los oligonucleótidos de MOE uniformes tienen una longitud de 15 nucleótidos.
[0269] Los gápmeros 2-9-6 tienen una longitud de 17 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central consta de nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en la dirección 5 'por un ala que comprende 2 nucleótidos y en la dirección 3' por un ala que comprende 6 nucleótidos.
[0270] Los gápmeros 3-9-3 tienen una longitud de 15 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central está compuesto por nueve desoxinucleótidos 2 'y está flanqueado en las direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una.
[0271] Los gápmeros 3-9-4 tienen una longitud de 16 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central consta de nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en la dirección 5' por un ala que comprende 3 nucleótidos y en la dirección 3' por un ala que comprende 4 nucleótidos.
[0272] Los gápmeros 3-9-5 tienen una longitud de 17 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central consta de nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en la dirección 5' por un ala que comprende 3 nucleótidos y en la dirección 3' por un ala que comprende 5 nucleótidos.
[0273] Los gápmeros 4-10-5 tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento central de la brecha comprende a menudo 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en la dirección 5' por un ala que comprende 4 nucleótidos y en la dirección 3' por un ala compuesta por 5 nucleótidos.
[0274] Los gápmeros 4-11-4 tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central consta de once 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambas direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 4 nucleótidos cada una.
[0275] Los gápmeros 4-7-4 tienen una longitud de 15 nucleótidos, en donde el segmento del hueco central está compuesto por siete desoxinucleótidos 2' y está flanqueado en las direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 4 nucleótidos cada una.
[0276] Los gápmeros 4-9-4 tienen una longitud de 17 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central está compuesto por nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambas direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 4 nucleótidos cada una.
[0277] Los gápmeros 4-9-5 tienen una longitud de 18 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central consta de nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en la dirección 5' por un ala que comprende 4 nucleótidos y en la dirección 3' por un ala que comprende 5 nucleótidos.
[0278] Los gápmeros 5-10-4 tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento central de la brecha se compone a menudo de 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en la dirección 5' por un ala que comprende 5 nucleótidos y en la dirección 3' por un ala compuesta por 4 nucleótidos.
[0279] Los gápmeros 5-7-5 tienen una longitud de 17 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central se compone de siete 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en las direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una.
[0280] Los gápmeros 5-8-6 tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central consta de ocho 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en la dirección 5' por un ala que comprende 5 nucleótidos y en la dirección 3' por un ala que comprende 6 nucleótidos.
[0281] Los gápmeros 5-9-3 tienen una longitud de 17 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central está compuesto por nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en la dirección 5' por un ala que comprende 5 nucleótidos y en la dirección 3' por un ala que comprende 3 nucleótidos.
[0282] Los gápmeros 5-9-5 tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central consta de nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambas direcciones 5 'y 3' por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una.
[0283] Los gápmeros 6-7-6 tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central está compuesto por siete desoxinucleótidos 2 'y está flanqueado en ambas direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 6 nucleótidos cada una.
[0284] Los gápmeros 6-9-2 tienen una longitud de 17 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central consta de nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en la dirección 5 'por un ala que comprende 6 nucleótidos y en la dirección 3' por un ala que comprende 2 nucleótidos.
[0285] Los gápmeros 6-8-5 tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central consta de ocho 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en la dirección 5' por un ala que comprende 6 nucleótidos y en la dirección 3' por un ala que comprende 5 nucleótidos.
[0286] Para cada uno de los motivos, cada nucleótido en el segmento del ala 5' y cada nucleótido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P = S). Todas las nucleobases de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas. Los oligonucleótidos se organizan en tablas de acuerdo con el SNP al que se dirigen. "Sitio de inicio" indica el nucleótido más 5 'al que se dirige el gápmero. "Sitio de detención" indica el nucleótido más 3 'al que se dirige el gápmero. “Alelo diana” indica si el gápmero está dirigido al alcalde o alelo menor. El número entre paréntesis indica la posición en el oligonucleótido opuesta a la posición SNP.
Tabla 11
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Tabla 12
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Tabla 13
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Tabla 14
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Tabla 15
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Tabla 16
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Tabla 17
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Tabla 18
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Tabla 19
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Ejemplo 6: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de huntingtina humana en líneas celulares de fibroblastos de Coriell
[0288] Se seleccionaron gápmeros de los estudios descritos en el Ejemplo 5 y se ensayaron a diversas dosis en líneas celulares GM04281, GM02171 y GM02173B. Cada línea celular se colocó en placas con una densidad de 25.000 células por pocillo y se transfectó usando electroporación con 750 nM, 1.500 nM, 3.000 nM, 6.000 nM y 12.000 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas 20, 21 y 22. Después de período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de HTT se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador HTT humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de HTT ARNm, en relación con las células de control no tratadas. Los valores de CI50 también se proporcionan en las Tablas 20, 21 y 22.
Tabla 20
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Tabla 21
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Tabla 22
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Ejemplo 7: Inhibición antisentido de HTT humana en células GM04281 y células GM02171
[0289] Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales en base a los gápmeros seleccionados de los estudios descritos en el Ejemplo 2. Estos oligonucleótidos se diseñaron creando gápmeros desplazados ligeramente hacia arriba y hacia abajo (es decir, "microwalk") de los gápmeros originales de la Tabla 4.
[0290] Los gápmeros se probaron en las líneas celulares GM04281 y GM02171. Células GM04281 o GM02171 cultivadas a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 10.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de HTT mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el conjunto de sondas de cebador RTS2617. Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de HTT ARNm, en relación con las células de control no tratadas.
[0291] Los gápmeros, de los cuales se derivaron los oligonucleótidos de nuevo diseño, también se incluyeron en el ensayo. Estos gápmeros padres, SIS 435294, ISIS 435295, ISIS 435301, ISIS 435303, ISIS 435304, ISIS 435305, ISIS 435308, ISIS 435330, ISIS 435331, ISIS 435337, ISIS 435339, ISIS 435340, ISIS 435341, ISIS 435344, ISIS 435862, ISIS 435863, ISIS 435864, ISIS 435866, ISIS 435867, ISIS 435868, ISIS 435871, ISIS 435873, ISIS 435875, ISIS 435876, ISIS 435878, ISIS 435880, ISIS 435881, ISIS 435882, ISIS 435884, ISIS 435890, and ISIS 435897 están marcados con un asterisco (*) en la tabla. ISIS 387916 se incluyó en el estudio como un oligonucleótido de referencia contra el cual se podría comparar la potencia de los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a los nucleótidos que se superponen en cada posición de SNP.
[0292] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en las Tablas 23-48 se diseñaron como gápmeros 5-9-5 MOE. Los gápmeros 5-9-5 tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central consta de nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambas direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Cada nucleótido en el segmento del ala 5' y cada nucleótido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P = S). Todas las nucleobases de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas.
[0293] Los gápmeros están organizados en las Tablas 23-48, de acuerdo con el sitio SNP al que se dirigen. "Sitio de inicio" indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gápmero. "Sitio de detención" indica el nucleótido más 3 'al que se dirige el gápmero. 'Alelo diana' indica si el gápmero está dirigido al alcalde o alelo menor. El número en paréntesis indica la posición en el oligonucleótido opuesta a la posición SNP.
Tabla 23
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Tabla 24
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Tabla 25
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Tabla 26
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Tabla 27
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Tabla 28
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Tabla 29
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Tabla 30
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Tabla 31
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Tabla 32
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Tabla 33
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Tabla 34
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Tabla 35
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Tabla 36
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Tabla 37
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Tabla 38
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Tabla 39
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Tabla 40
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Tabla 41
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Tabla 42
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Tabla 43
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Tabla 44
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Tabla 45
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Tabla 46
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Tabla 47
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Tabla 48
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Ejemplo 8: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de huntingtina humana en líneas celulares de fibroblastos de Coriell
[0294] Se seleccionaron gápmeros de los estudios descritos en el Ejemplo 7 y se ensayaron a diversas dosis en líneas celulares GM04281, GM02171 y GM02173B. Cada línea celular se sembró a una densidad de 25.000 células por pocillo y se transfectó usando electroporación con 750 nM, 1.500 nM, 3.000 nM, 6.000 nM y 12.000 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas 49, 50 y 51. Después de período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de HTT se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas HTTprimer humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de HTT ARNm, en relación con las células de control no tratadas. Los valores de CI50 también se proporcionan en las Tablas 49, 50 y 51.
Tabla 49
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Tabla 50
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Tabla 51
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Ejemplo 9: Inhibición antisentido de HTT humana en células GM04281 por oligonucleótidos diseñados por microwalk
[0295] Se diseñaron gápmeros adicionales basados en los gápmeros seleccionados de los estudios descritos en el Ejemplo 4. Estos gápmeros se diseñaron creando gápmeros desplazados ligeramente hacia arriba y hacia abajo (es decir, "microwalk") de los gápmeros originales de las Tablas 8, 9 y 10. Los gápmeros también se crearon con motivos 3-9-3 o 5-9-5, y con moléculas de ácido nucleico bicíclico (BNA) 6(S)-CH3 restringidas en varias posiciones de nucleósidos.
[0296] Estos gápmeros fueron ensayados in vitro. Células GM04281 cultivadas a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con 5.000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de HTT mediante pCr cuantitativa en tiempo real. Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de HTT ARNm, en relación con las células de control no tratadas.
[0297] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en las Tablas 52-56 se diseñaron como gápmeros 3-9-3 o 5-9-5. Los gápmeros principales, ISIS 435869, ISIS 435870, ISIS 435874, ISIS 435879 e ISIS 435890, de los cuales se derivaron los gápmeros de nuevo diseño están marcados con un asterisco (*) en la tabla. ISIS 387916 se incluyó en el estudio como un oligonucleótido de referencia contra el cual se podría comparar la potencia de los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a los nucleótidos que se superponen en cada posición de SNP.
[0298] Los gápmeros 3-9-3 tienen una longitud de 15 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central está compuesto por nueve desoxinucleósidos 2 'y está flanqueado en las direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 3 nucleósidos modificados con azúcar cada uno.
[0299] Los gápmeros 5-9-5 tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento central de la brecha está compuesto por nueve 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambas direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 5 nucleósidos modificados con azúcar cada una.
[0300] Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P = S). Todas las nucleobases de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas. Los nucleótidos en negrita y subrayados en las Tablas 52-56 indican las posiciones de las moléculas 6(S)-CH3-BNA (por ejemplo, moléculas de cEt) en cada gápmero. Los nucleótidos en cursiva son subunidades MOE.
[0301] "Sitio de inicio" indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gápmero. "Sitio de detención" indica el nucleótido más 3' al que se dirige el gápmero. 'Alelo diana' indica si el gápmero está dirigido al alcalde o alelo menor. El número entre paréntesis indica la posición en el oligonucleótido opuesta a la posición SNP.
Tabla 52
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Tabla 53
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Tabla 54
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Tabla 55
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Tabla 56
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Ejemplo 10: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de la huntingtina humana en líneas celulares de fibroblastos de Coriell
[0302] S e se le cc io n a ro n g á p m e ro s de los e s tu d io s d e s c r ito s en el E je m p lo 9 y se e n sa ya ro n a d ive rsa s do s is en las líne as ce lu la res G M 04281 , G M 02171 y G M 02173 B . C a da línea c e lu la r se se m b ró con una de ns idad de aT a de 25.000 cé lu la s po r po c illo y se tra n s fe c tó u sa n d o e le c tro p o ra c ió n con 312 ,5 nM, 625 nM , 1.250 nM , 2.500 nM , 5.000 nM y c o n ce n tra c io n e s de o lig o n u c le ó tid o 10.000 nM, com o se e sp e c ifica en las T ab las 75, 58 y 59. D espués de un pe río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 ho ras, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ro n los n ive les de H T T A R N m m e d ia n te P C R cu a n tita tiva en tie m p o rea l. El co n ju n to de so n d a s de c e b a d o r H T T h u m a n o R T S 2617 se u tilizó pa ra m e d ir los n ive les de A R N m . Los n ive le s de A R N m de H T T se a ju s ta ro n seg ún el co n te n id o de A R N to ta l, m ed id o po r R IB O G R E E N . Los resu ltad os se p re sen ta n com o po rcen ta je de in h ib ic ión de H T T A R N m , en re lac ión con las cé lu la s de con tro l no tra ta d a s . Los va lo re s de C I50 ta m b ié n se p ro po rc ion an en las T ab las 57, 58 y 59.
Tabla 57
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Tabla 58
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Tabla 59
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Ejemplo 11: Inhibición antisentido dependiente de las células humano en células GM04281 y GM02171 de HTT por oligonucleótidos diseñados por microwalk
[0303] Se diseñaron gápmeros adicionales basados en los gápmeros seleccionados de los estudios descritos en el Ejemplo 10. Estos gápmeros se diseñaron creando gápmeros desplazados ligeramente hacia arriba y hacia abajo (es decir, "microwalk") de los gápmeros originales de las Tablas 57, 58 y 59. Los gápmeros también se crearon con motivos 4-9-4 MOE o 5-9-5 MOE, y con moléculas de ácido nucleico bicíclico (BNA) 6 (S)-CH3 restringidas en varias posiciones de nucleótidos.
[0304] Estos gápmeros se probaron en las líneas celulares GM04281 y GM02171. Células GM04281 o GM02171 cultivadas a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido de 2.500 nM o 5.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de HTT mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de HTT ARNm, en relación con las células de control no tratadas.
[0305] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en las Tablas 60, 61 y 62 se diseñaron como gápmeros 3-9-3, 4­ 9-4 o 5-9-5 MOE. Los gápmeros principales, ISIS 435890, ISIS 460210, ISIS 435879, ISIS 460209, ISIS 435870 e ISIS 460207, de los cuales se derivaron los gápmeros de nuevo diseño están marcados con un asterisco (*) en la tabla. ISIS 387916 se incluyó en el estudio como un oligonucleótido de referencia contra el cual se podría comparar la potencia de los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a los nucleótidos que se superponen en cada posición de SNP.
[0306] Los gápmeros 3-9-3 tienen una longitud de 15 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central está compuesto por nueve desoxinucleótidos 2' y está flanqueado en las direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una.
[0307] Los gápmeros 4-9-4 tienen una longitud de 17 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central está compuesto por nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambas direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 4 nucleótidos cada una.
[0308] Los gápmeros 5-9-5 tienen una longitud de 19 nucleótidos, en donde el segmento de brecha central está compuesto por nueve 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambas direcciones 5' y 3' por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una.
[0309] Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P = S). Todas las nucleobases de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas. Los nucleótidos en negrita y subrayados en las Tablas 60, 61 y 62 indican las posiciones de las moléculas 6 (S)-CH3-BNA (por ejemplo, moléculas de cEt) en cada gápmero. Los nucleótidos en cursiva son subunidades MOE.
[0310] Los gápmeros están organizados en las Tablas 60, 61 y 62, según el sitio SNP al que se dirigen. "Sitio de inicio" indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gápmero. "Sitio de detención" indica el nucleótido más 3' al que se dirige el gápmero. 'Alelo diana' indica si el gápmero está dirigido al alcalde o alelo menor. El número entre paréntesis indica la posición en el oligonucleótido opuesta a la posición SNP.
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Ejemplo 12: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de huntingtina humana en líneas celulares de fibroblastos de Coriell
[0311] Se seleccionaron gápmeros de los estudios descritos en el Ejemplo 11 y se ensayaron a diversas dosis en líneas celulares GM04281, GM02171 y GM02173B. Cada línea celular se colocó en placas con una densidad de 25.000 células por pocillo y se transfectó usando electroporación con 625 nM, 1.250 nM, 2.500 nM, 5.000 nM y concentraciones de 10.000 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas 63, 64 y 65. Después de un tratamiento Durante aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de HTT ARNm mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador HTT humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de HTT ARNm, en relación con las células de control no tratadas. Los valores de CI50 también se proporcionan en las Tablas 63, 64 y 65.
Tabla 63
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Tabla 64
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Tabla 65
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Ejemplo 13: Estrategia para la selección de oligonucleótidos antisentido basada en la potencia y selectividad [0312] Se seleccionaron gápmeros de cada uno de los estudios descritos anteriormente para un análisis adicional basado en la potencia y selectividad.
[0313] La potencia se basó en el porcentaje de inhibición del ARNm de HTT alcanzado por los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un SNP en comparación con el porcentaje de inhibición del ARNm de HTT logrado por el oligonucleótido de referencia, ISIS 387916. La selectividad se basó en la capacidad del antisentido oligonucleótidos dirigidos a un SNP para inhibir la expresión del alelo Mayor y no del alelo Menor. El uso de las tres líneas celulares con diferentes genotipos en cada posición de SNP facilitó este proceso.
[0315] ISIS 460065 (5'-ATAAATTGTCATCACCAG-3' (SEQ ID NO: 199)) es un gápmero 4-9-5 MOE dirigido a SNP rs7685686 (alelo Mayor A, alelo Menor G) en la posición 9 del oligonucleótido. La línea celular GM04281 es homocigótica AA en la posición SNP rs7685686. La línea celular GM02173B es heterocigótica AG en la posición SNP rs7685686. La línea celular GM02171 es homocigótica GG en la posición SNP rs7685686. Por lo tanto, se muestra la selectividad si ISIS 460065 causa una inhibición potente de HTT ARNm en GM04281, una inhibición menos potente de HTT ARNm en GM02173 y poca o ninguna inhibición significativa de HTT ARNm en GM02171. Los valores de CI50 tomados de Tabla 20, 21 y 22, y presentados a continuación en Tabla 66, confirman diversos grados de inhibición en las tres líneas celulares, en donde la expresión fue más reducida en la línea celular homocigótica AA, moderadamente reducida en la línea celular heterocigótica AG, y menos reducida en la línea celular homocigótica GG. CI50 es la concentración de oligonucleótido antisentido requerida para la inhibición del 50 por ciento de ARNm HTT. Los valores de CI50 están en pM.
Tabla 66
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[0316] ISIS 459978 (5'-ACAGTGCTACCCAACCT-3 '(SEQ ID NO: 174)) es un gápmero de 2-9-6 MOE dirigido a SNP rs4690072 (alelo Mayor T, alelo Menor G) en la posición 9 del oligonucleótido. La línea celular GM04281 es homocigótica TT en la posición SNP rs4690072. La línea celular GM02173B es heterocigótica TG en la posición SNP rs4690072. La línea celular GM02171 es homocigótica GG en la posición SNP rs4690072. Por lo tanto, se muestra la selectividad si ISIS 459978 causa una inhibición potente de HTT ARNm en GM04281, una inhibición menos potente de HTT ARNm en GM02173, y poca o ninguna inhibición significativa de HTT ARNm en GM02171. Los valores de CI50 tomados de Tabla 20, 21 y 22, y presentados a continuación en Tabla 67, confirman diversos grados de inhibición en las tres líneas celulares, en donde la expresión fue más reducida en la línea celular TT homocigótica, moderadamente reducida en la línea celular TG heterocigótica, y menos reducida en la línea celular homocigótica GG. CI50 es la concentración de oligonucleótido antisentido requerida para la inhibición del 50 por ciento de ARNm HTT. Los valores de CI50 están en mM.
Tabla 67
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[0317] ISIS 460028 (5'-GAGCAGCTGCAACCTGGCA -3 '(SEQ ID NO: 149)) es un gápmero 4-11-4 MOE dirigido a SNP rs362306 (alelo Mayor G, alelo Menor A) en la posición 10 del oligonucleótido. La línea celular GM04281 es homocigótica GG en la posición SNP rs362306. Las líneas celulares GM02173B y GM02171 son GA heterocigotas en la posición SNP rs362306. Por lo tanto, se muestra la selectividad si ISIS 460028 causa una inhibición potente de HTT ARNm en GM04281 y una inhibición menos potente de HTT ARNm en GM02173 y GM02171. Los valores de CI50 tomados de Tabla 20, 21 y 22, y presentados a continuación en Tabla 68, confirman diversos grados de inhibición entre la línea celular GM04281 y las líneas celulares GM02173B y GM02171, en donde la expresión fue más reducida en la línea celular homocigótica GG y menos Reducido en la línea celular heterocigota AG. CI50 es la concentración de oligonucleótido antisentido requerida para la inhibición del 50 por ciento de ARNm HTT. Los valores de CI50 están en mM.
Tabla 68
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Ejemplo 14: Estrategia para la selección de oligonucleótidos antisentido con motivos cEt basados en la potencia y selectividad
[0318] Se seleccionaron gápmeros de cada uno de los estudios descritos anteriormente para un análisis adicional basado en la potencia y la selectividad.
[0319] La potencia se basó en el porcentaje de inhibición del ARNm de HTT alcanzado por los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un SNP en comparación con el porcentaje de inhibición del ARNm de HTT alcanzado por el oligonucleótido de referencia, ISIS 387916.
[0320] La selectividad se basó en la capacidad del antisentido oligonucleótidos dirigidos a un SNP para inhibir la expresión del alelo Mayor y no del alelo Menor. El uso de las tres líneas celulares con diferentes genotipos en cada posición de SNP facilitó este proceso.
[0321] ISIS 460209 (5'-TAAATTGTCATCACC-3' (SEQ ID NO: 203)) es un gápmero 3-9-3 con subunidades cEt en las posiciones 2, 3, 13 y 14, dirigido a SNP rs7685686 (alelo Mayor A, alelo menor G) en la posición 8 del oligonucleótido. La línea celular GM04281 es homocigótica AA en la posición SNP rs7685686. La línea celular GM02173B es heterocigótica AG en la posición SNP rs7685686. La línea celular GM02171 es homocigótica GG en la posición SNP rs7685686. Por lo tanto, se muestra la selectividad si ISIS 460209 causa una inhibición potente de HTT ARNm en GM04281, una inhibición menos potente de HTT ARNm en GM02173 y poca o ninguna inhibición significativa de HTT ARNm en GM02171. Los valores de CI50 tomados de la Tabla 57, 58 y 59, y presentados a continuación en la Tabla 69, confirman diversos grados de inhibición en las tres líneas celulares, en donde la expresión fue más reducida en la línea celular AA homocigótica, moderadamente reducida en la línea celular AG heterocigótica, y menos reducida en la línea celular homocigótica GG. CI50 es la concentración de oligonucleótido antisentido requerida para la inhibición del 50 por ciento de ARNm HTT. Los valores de CI50 están en pM.
Tabla 69
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[0322] ISIS 460208 (5'-CAGTGCTACCCAACC-3' (SEQ ID NO: 177)) es un gápmero 3-9-3 con subunidades cEt en las posiciones 2, 3, 13 y 14, dirigido a SNP rs4690072 (alelo mayor T, alelo menor G) en la posición 8 del oligonudeótido. La línea celular GM04281 es homocigótica TT en la posición SNP rs4690072. La línea celular GM02173B es heterocigótica TG en la posición SNP rs4690072. La línea celular GM02171 es homocigótica GG en la posición SNP rs4690072. Por lo tanto, se muestra la selectividad si ISIS 460208 causa una inhibición potente de HTT ARNm en GM04281, una inhibición menos potente de HTT ARNm en GM02173 y poca o ninguna inhibición significativa de HTT ARNm en GM02171. Los valores de CI50 tomados de la Tabla 57, 58 y 59, y presentados a continuación en la Tabla 70, confirman diversos grados de inhibición en las tres líneas celulares, en donde la expresión fue más reducida en la línea celular TT homocigótica, moderadamente reducida en la línea celular TG heterocigótica, y menos reducida en la línea celular homocigótica GG. CI50 es la concentración de oligonucleótido antisentido requerida para la inhibición del 50 por ciento de ARNm HTT. Los valores de CI50 están en pM.
Tabla 70
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[0323] ISIS 460206 (5'-GCAGCTGCAACCTGG-3 '(SEQ ID NO: 231)) es un gápmero 3-9-3 con subunidades cEt en las posiciones 2, 3, 13 y 14, dirigido a SNP rs362306 (alelo mayor) G, alelo menor A) en la posición 8 del oligonucleótido. La línea celular GM04281 es homocigótica GG en la posición SNP rs362306. Las líneas celulares GM02173B y GM02171 son GA heterocigotas en la posición SNP rs362306. Por lo tanto, se muestra la selectividad si ISIS 460206 causa una inhibición potente de HTT ARNm en GM04281 y una inhibición menos potente de HTT ARNm en GM02173 y GM02171. Los valores de CI50 tomados de la Tabla 57, 58 y 59, y presentados a continuación en la Tabla 71, confirman grados variables de inhibición entre la línea celular GM04281 y las líneas celulares GM02173B y GM02171, en donde la expresión fue más reducida en la línea celular homocigótica GG y menos reducida en la línea celular heterocigota AG. CI50 es la concentración de oligonucleótido antisentido requerida para la inhibición del 50 por ciento de ARNm HTT. Los valores de CI50 están en pM.
Tabla 71
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Ejemplo 15: Comparación de SNP en varias líneas celulares y modelos de ratón asociados con la enfermedad de Huntington
[0324] El genotipo en varias posiciones de SNP asociadas con la enfermedad de Huntington se comparó entre las tres líneas celulares de Corriell, utilizadas en los ejemplos anteriores, así como con el fibroblasto GM04022, el modelo de ratón BACHD y el modelo de ratón YAC18.
[0325] El paciente donante de la línea celular de fibroblastos GM04022 era heterocigoto en la posición SNP rs363125 (base de datos NCBI Entrez SNP), albergaba un alelo A (adenina) y un alelo C (citosina) en el nucleótido 5310 de la SEC ID NO: 2 (van) Bilsen, PHJ et al., Human Gene Therapy.19: 710-718, 2008). Los ratones YAC18 se desarrollaron con un transgén YAC que contiene el gen de la huntingtina humana (Hodgson, et al. Hum. Mol. Genet.
5: 1875-85, 1996). Se desarrollaron ratones BACHD que expresaban un gen de huntingtina mutante de longitud completa con 97 repeticiones de glutamina bajo el control de un cromosoma artificial bacteriano (Gray, M. et al., J. Neurosc. 28: 6182-95, 2008). El genotipo comparativo en las posiciones SNP indicadas en las cuatro líneas celulares y modelos de ratón se presenta en la Tabla 72.
Tabla 72
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Ejemplo 16: inhibición específica de alelo medida en neuronas corticales BacHD
[0326] Los oligonucleótidos antisentido, ISIS 460209 (5'-TAAATTGTCATCACC-3' (SEQ ID NO: 203)), dirigidos a SNP rs7685686 de HTT humano, e ISIS 387916 (TCTCTATTGCACATTCCAAG (SEQ ID NO: 6)), y sin personas. o sitio diana de SNP murino, se probaron para determinar su efecto sobre los niveles de proteína Htt in vitro. ISIS 387916 tiene reactividad cruzada con ARNm de Htt murino (número de acceso de GENBANK NM_010414.1, designado en este documento como SEQ ID NO: 286) en el sitio de inicio de datos 5763 con una falta de coincidencia. ISIS 460209 tiene reactividad cruzada con ARNm Htt murino en el sitio de inicio 6866 de destino con tres desajustes.
[0327] Las neuronas corticales de BacHD primarias, que expresan Htt humana y Htt murina, se aislaron de la siguiente forma: los embriones se diseccionaron de hembras E15.5-E17.5 embarazadas. Los cortices se diseccionaron en solución salina equilibrada de Hank libre de divalente (Invitrogen, 14025-134). Las cortezas se cortaron en trozos y se digirieron con tripsina-EDTA al 0,05% (Invitrogen, 25300-120) a 37°C durante 8 minutos. La digestión se detuvo mediante la adición de medios neurobasales completos (Invitrogen, 10888-022). Las células se resuspendieron en medio y se trataron con ADNasa I (Invitrogen, 18047-019). Después de la titulación a través de una punta de pipeta de 100 ul, las células se resuspenden en medios neurobasales con suplemento de B27 (Invitrogen, 17504-044) y se cuentan. Se sembraron 1,7 x 105 células / pocillo en placas de 24 pocillos previamente recubiertas con poli-D-lisina (BD Biosciences, 354210). Las neuronas se alimentaron con 200 ml de medio neurobasal con B27 en el segundo día in vitro.
[0328] Se añadió ISIS 460209 o ISIS 387916 al medio suplementario alimentado a las neuronas en la división 2 a concentraciones finales de 0,7 pM, 1,4 pM o 1,5 pM. Las células se recogieron después de 8 días con 1 ml de medio utilizando un raspador de células. Las células se centrifugaron a 2.500 rpm durante 5 minutos a 4°C y los sedimentos se resuspendieron en un tampón de Tris 50 mM, pH = 8.0, NaCl 150 mM, Igepal al 1%, p-glicerofosfato de 40 mM, NaF 10 mM, 1 x Roche inhibidor completo de la proteasa, orovanadato sódico 1 mM y PMSF 800 pM. Los lisados se centrifugaron después de 15 minutos de incubación y la concentración de proteínas se midió con el ensayo DC (BioRad).
[0329] Los lisados de proteínas se ejecutaron en geles bajos en bis para separar los alelos de la huntingtina (gel de resolución - 2001: acrilamida: BIS (acrilamida al 10%, BIS al 0,5%, pH 7,8 mMTris pH 8,8; gel de apilamiento -acrilamida al 4% - BIS (29: 1), Tris pH 156 mM 156 mM; tampón corriente Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS al 0,1% beta-mercaptoetanol 10 pM añadido fresco. Después de la electroforesis, las proteínas del gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Hybond-C Extra; GE Biociencias sanitarias) a 90 V durante 40' para permitir que las muestras penetren en el gel de apilamiento y luego a 190 V durante 2,5 h para resolver las proteínas.
[0330] Se usaron anticuerpos primarios específicos para la proteína Htt humana y calnexina murina a diluciones 1:10.000. Se utilizó el anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con HRP (1:10.000, Jackson ImmunoResearch Laboratories) para visualizar proteínas utilizando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Thermo Scientific). Las bandas de proteínas se cuantificaron utilizando el software ImageJ y se normalizaron a los niveles de calnexina. Las bandas de proteínas se cuantificaron utilizando el software ImageJ. Tabla 73 proporciona una estimación del porcentaje de inhibición con respecto a la muestra de control negativo. Se presentan los porcentajes de inhibición comparativos de la proteína Htt humana y la proteína Htt murina.
Tabla 73
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Ejemplo 17: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de huntingtina humana en líneas celulares de fibroblastos de Coriell
[0331] Se seleccionaron gápmeros de los estudios descritos en los ejemplos 3, 4, 10 y 12 y se ensayaron a diversas dosis en líneas celulares GM04281, GM02171 y GM02173B. Cada línea celular se sembró en placas con una densidad de 25.000 células por pocillo y se transfectó usando electroporación con concentraciones de 0,4747 nM, 1,5011 nM, 4,7463 nM, 15,0079 nM 45,455 nM, 150,0527 nM, 474,4673 nM, 1.500,27 nM, 4.743,833 nM, y 15.000 nM de oligonucleótidos antisentido, como se especifica en las Tablas 72, 73 y 74. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de HTT ARNm mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebador HTT humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de HTT se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de HTT ARNm, en relación con las células de control no tratadas. Los valores de CI50 también se proporcionan en las Tablas 72, 73 y 74.
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Ejemplo 18: Validación de la especificidad de los oligonucleótidos ISIS dirigidos a los SNP de la huntingtina humana mediante el ensayo de Baliza Molecular
[0332] Algunos de los gápmeros del estudio descrito en el Ejemplo 17 se probaron en fibroblastos GM04022 (del Instituto Coriell para la Investigación Médica).
[0333] Para verificar la supresión específica alélica de HTT ARNm en fibroblastos GM04022 por ISIS 435879, ISIS 460209 e ISIS 476333, el ensayo de Baliza Molecular, como se describe en la publicación de van Bilsen (van Bilsen, PHJ et al., Human). Gene Therapy.19: 710-718, 2008), se llevó a cabo utilizando oligonucleótidos sintéticos de “baliza molecular” unidos a un fluoróforo y un extintor. Los fibroblastos GM04022 fueron transfectados por electroporación con ISIS 435879, ISIS 460209 o ISIS 476333 a 0,06 pM, 0,19 pM, 0,56 pM, 1,67 pM, 5 pM y 15 pM de oligosnucleótidos antisentido, como se especifica en las Tablas 75-77. ISIS 387916 se incluyó en el ensayo como un oligonucleótido de referencia. El ensayo qRT-PCR para baliza molecular para el alelo A se realizó con la temperatura de hibridación a 56,5°C. El ensayo de qRT-PCR para balizas moleculares para el alelo C se realizó con la temperatura de hibridación a 62,0°C. Se usó el conjunto de sondas de cebado RTS2617 para medir la reducción total de ARNm de HTT. Los resultados del ensayo se presentan en las Tablas 77-79 como porcentaje de inhibición sobre el control de PBS. Los resultados demuestran que los oligonucleótidos ISIS específicos de SNP se dirigen específicamente al alelo C de rs7685686 en comparación con el alelo A (Tabla 80).
Tabla 77
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Tabla 78
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Tabla 79
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Tabla 80
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Ejemplo 19: Inhibición específica de alelo medida en neuronas corticales de ratones BACHD y YAC18.
[0334] Con el fin de identificar posibles SNP para la selección de oligonucleótidos ISIS específicos de alelo humanos, el ARNm de HTT de YAC18 y ratones BACHD se secuenciaron mediante el ensayo Goldengate 96SNP. Se determinó que los ratones BAC e YAC portaban diferentes alelos en varias posiciones clave de SNP (Tabla 72) y, por lo tanto, podían usarse como una herramienta de detección para la eliminación de alelos específicos. Cada una de las posiciones SNP elegidas para apuntar en las cepas de ratón también se compararon con los cromosomas humanos de HD. Para cada objetivo, aproximadamente el 50% de la población humana de HD es heterocigótica para el objetivo expresado en los ratones BACHD, pero no en los ratones YAC18.
[0335] Con el fin de verificar la especificidad alélica de los oligonucleótidos ISIS (descritos en los Ejemplos 2, 9, 17 y 18), los oligonucleótidos antisentido, ISIS 460207, dirigidos a SNP rs362331; ISIS 460209, dirigido a Sn P rs7685686; ISIS 435879, dirigido a SNP rs7685686; ISIS 476333, dirigido a SNP rs7685686; ISIS 460210, dirigido a SNP rs2298969; ISIS 435874, dirigido a SNP rs4690072; ISIS 460208, dirigido a SNP rs4690072; ISIS 435331, dirigido a SNP rs2024115; e ISIS 435871, dirigido a SNP rs363088, se evaluaron para determinar su efecto sobre los niveles de proteína HTT en las neuronas corticales BACHD y YAC18. ISIS 387916, que no tiene un sitio de destino de SNP humano o murino, se utilizó como punto de referencia. ISIS 387916 tiene reactividad cruzada con ARNm de HTT murino (número de acceso de GEn Ba NK NM_010414.1, designado en este documento como SEQ ID NO: 286) en el sitio de inicio de datos 5763 con una falta de coincidencia. Se esperaba que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido específicos de alelo causaría inhibición significativa de ARNm de HTT en las neuronas BACHD y no en las neuronas YAC18. También se esperaba que el tratamiento con ISIS 387916 causara inhibición de ARNm HTT en ambos conjuntos de neuronas.
[0336] Los cultivos de YAC18 se prepararon a partir de ratones E16.5 YAC18 hembra (línea 60, /+) embarazados que se habían criado con machos YAC18 (línea 60, /+). Toda la progenie es, por lo tanto, homocigótica YAC18 (línea 60), facilitando los cultivos corticales agrupados. Se aislaron embriones BACHD E16.5 de ratones embarazados BACHD (+/-) que habían sido criados con ratones machos embarazados BACHD (+/-), lo que requería cultivos de crías únicas y genotipado. Las corticales individuales se aislaron, con precaución para evitar la contaminación cruzada de las muestras. Cada corteza disociada se utilizó para sembrar 5 pocillos de una placa de 6 pocillos. Después de la genotipificación, solo se utilizaron cultivos BACHD (+/-) para el tratamiento con ASO. Los oligonucleótidos antisentido se agregaron a los medios suplementarios que se alimentaron a las neuronas en la división 2. Las células se recolectaron después de 8 días con 1 ml de medio usando un raspador de células. Las células se centrifugaron a 2.500 rpm durante 5 minutos a 4°C y los sedimentos se resuspendieron en un tampón de Tris 50 mM, pH = 8,0, NaCl 150 mM, Igepal al 1%, p-glicerofosfato de 40 mM, NaF 10 mM, 1 x Roche inhibidor completo de la proteasa, orovanadato sódico 1 mM y PMSF 800 pM. Los lisados se centrifugaron después de 15 minutos de incubación y la concentración de proteínas se midió con el ensayo DC (BioRad).
[0337] Los lisados de proteínas se ejecutaron en geles bajos en bis para separar los alelos de huntingtina (gel de resolución - 2001: acrilamida: BIS (10% de acrilamida, 0.5% de BIS, 375 mMTris pH 8,8; gel de apilamiento - 4% de acrilamida-BIS (29: 1), Tris pH 156 mM 156 mM; tampón corriente Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS al 0,1% betamercaptoetanol 10 mM añadido fresco. Después de la electroforesis, las proteínas del gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Hybond-C Extra; GE Healthcare Bio-Sciences) a 90 V durante 40' para permitir que las muestras penetren en el gel de apilamiento y luego a 190 V durante 2,5 h para resolver las proteínas.
[0338] Se usaron anticuerpos primarios específicos para HTT humana y proteína calnexina murina a diluciones 1:10.000. Se utilizó el anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con HRP (1:10.000, Jackson ImmunoResearch Laboratories) para visualizar proteínas utilizando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Thermo Scientific). Las bandas de proteínas se cuantificaron utilizando el software ImageJ y se normalizaron a los niveles de calnexina. Las tablas 81-91 proporcionan el porcentaje de inhibición con respecto a la muestra de control no tratada. Se presenta el porcentaje de inhibición de los niveles de proteína HTT humana en las neuronas BACHD y YAC18.
Tabla 81
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Tabla 82
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Tabla 83
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Tabla 84
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Tabla 85
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Tabla 86
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Tabla 87
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Tabla 88
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Tabla 89
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Tabla 90
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Tabla 91
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido monocatenario modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos unidos dirigidos a un único sitio de polimorfismo nucleotídico en un alelo de huntingtina mutante que está asociado con la Enfermedad de Huntington, y capaz de reducir selectivamente la expresión del alelo de huntingtina mutante,
en el que el oligonucleótido modificado comprende un motivo de ala de espacio de ala con una región de ala 5' posicionada en el extremo 5' de una brecha de desoxinucleósidos y una región del ala 3' se ubican en el extremo 3' de la brecha de desoxinucleósidos, en la posición 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 del oligonucleótido modificado, como se cuenta a partir de los término 5' del oligonucleótido modificado, o posición 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del oligonucleótido modificado, según se cuenta desde el extremo 5 'de la brecha, se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el sitio de polimorfismo de nucleótido único se selecciona del grupo que consiste en: rs362307, rs362331, rs2857936, rs12506200, rs762855, rs3856973, rs2285086, rs7659144, rs16843804, rs2024115, rs10015979, rs7691627, rs2798235, rs4690072, rs6446723, rs363081, rs363080, rs363075, rs363064, rs3025849, rs6855981, rs363102, rs11731237, rs4690073, rs363144, rs3025838, rs34315806, rs363099, rs363096, rs2298967, rs2298969, rs6844859, rs363092, rs7685686, rs363088, rs916171, rs362322, rs362275, rs362273, rs2276881, rs3121419, rs362272, rs362271, rs3775061, rs362310, rs362306, rs362303, rs362296, y rs1006798.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el único sitio de polimorfismo de nucleótido es rs362307.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el único sitio de polimorfismo de nucleótido es rs362331.
5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el oligonucleótido modificado es al menos 80%, al menos 90%, o 100% complementario al sitio del polimorfismo de un solo nucleótido.
6. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en el que el oligonucleótido antisentido modificado consiste en:
a. 15 a 20 nucleósidos unidos;
b. 12 a 20 nucleótidos unidos; o
c. 15 a 19 nucleósidos unidos.
7. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en el que la posición 12 o 13 del oligonucleótido modificado, como se cuenta a partir del extremo 5' del oligonucleótido modificado, se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido.
8. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la posición 7 u 8 del oligonucleótido modificado, como se cuenta a partir del término 5' de la brecha, se alinea con el polimorfismo de un solo nucleótido.
9. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en el que la región de la brecha tiene una longitud de 7-11 nucleósidos, la región del ala 5' es 1-6 nucleobases en longitud y la región del ala 3' es 1-6 nucleobases en longitud.
10. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en el que el motivo ala-hueco-ala es uno cualquiera del grupo que consiste en: 5-10-5, 2-9-6, 3-9-3, 3-9-4, 3-9-5, 4-7-4, 4-9-3, 4-9-4, 4-9-5, 4- 10-5, 4-11-4, 4-11-5, 5-7-5, 5­ 8-6, 5-9-3, 5-9-5, 5-10-4, 6-7-6, 6-8-5, y 6-9-2.
11. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en el que al menos un nucleósido de al menos una de las regiones del ala comprende un azúcar modificado o sustituto del azúcar, o cada uno de los nucleósidos de cada región del ala comprende un azúcar modificado o sustituto del azúcar, opcionalmente en donde el azúcar modificado o sustituto del azúcar es un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo.
12. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una de las regiones del ala comprende un nucleósido bicíclico de 4' a 2' y al menos uno de los nucleósidos del ala restante es un nucleósido modificado en 2' no bicíclico, por ejemplo un nucleósido 2'-ometoxietilo.
13. El compuesto de la reivindicación 12, en el que el nucleósido bicíclico 4' a 2' es un nucleósido bicíclico 4'-CH(CHa)-O-2'.
14. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en el que al menos un enlace internucleósido es un enlace internucleósido modificado, o cada enlace internucleósido es un enlace internucleósido fosforotioato.
15. El compuesto de la reivindicación cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un n u c le ós id o c o m p re n d e una nu c le o b a se m od ifica da , po r e jem p lo , una 5 '-m e tilc itos in a .
16. U na com p o s ic ió n fa rm a cé u tica que co m p re n d e el co m p u e s to de cu a lq u ie r re iv in d ica c ió n p receden te y un d ilu ye n te o p o rta d o r fa rm a c é u tic a m e n te acep tab le .
17. El c o m p u e s to de una cu a lq u ie ra de las re iv in d ic a c io n e s 1 -15 o la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a de la re iv in d ica c ió n 16 para uso en el tra ta m ie n to de la E n fe rm e da d de H unting ton .
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