JP2020054348A - Ｔ細胞を増殖させるプロセス - Google Patents

Abstract

【課題】自己Ｔ細胞などのＴ細胞を増殖させるための新規プロセス、それから得られる細胞集団、前記細胞集団を含む医薬組成物、ならびに治療、特に、たとえば免疫低下もしくは免疫適格ヒト患者におけるウイルス感染および／もしくはガンの治療または予防のための細胞および組成物の使用を提供する。【解決手段】本開示は、自己または同種抗原特異的Ｔ細胞のインビトロ増殖のための新規プロセスであって：ａ）自己ＰＣＭＢ細胞の集団を：ｉ）標的抗原に関連するペプチド／ペプチドミックスでパルスした樹状細胞または標的抗原に関連するペプチド／ペプチドミックス、およびｉｉ）少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと、ｂ）ステップａ）からのＴ細胞の集団を：ｉ）標的抗原に関連するペプチド／ペプチドミックスでパルスした樹状細胞または標的抗原に関連するペプチド／ペプチドミックスでパルスした自己抗原提示Ｔ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）細胞および人工の共刺激因子、ならびにｉｉ）場合によってサイトカインの存在下で培養するステップとを含み、プロセスが、生ウイルスおよび／もしくはウイルスベクターあるいはＤＮＡもしくはＲＮＡコード化抗原または組換え型標的抗原の使用を、関連するＴ細胞集団の増殖で使用しないことを特徴とするプロセスに関する。本開示はさらに、前記プロセスから得られる細胞集団、前記細胞集団を含む医薬組成物、ならびに治療、特にウイルス感染および／またはガンの治療または予防のための、例えば免疫低下もしくは免疫適格患者における細胞および組成物の使用にも及ぶ。【選択図】なし

Description

本願は、参照により援用される米国仮出願番号第６１／５６９，５７７号からの優先権を主張する。

本発明は、自己Ｔ細胞などのＴ細胞を増殖させるための新規プロセス、それから得られる細胞集団、前記細胞集団を含む医薬組成物、ならびに治療、特に、たとえば免疫低下もしくは免疫適格ヒト患者におけるウイルス感染および／もしくはガンの治療または予防のための細胞および組成物の使用に関する。

ウイルスは感染性疾患の原因として広く認識されているが、あるウイルスはヒトガンとも関連する。ヒト免疫系はウイルス感染、そしてさらに発癌ウイルスに関連することが示されている悪性腫瘍の制御に重要である。ヒト免疫系を構成する複雑な多くの細胞、抗体および免疫調節分子の中で、胸腺起源のリンパ球（Ｔ細胞）はウイルス感染およびガンを制御する中心的役割を果たす。したがって、ウイルス感染およびガンを予防または治療するための１つのアプローチは、これらの患者からＴ細胞を採取し、それらをインビトロで刺激および／または増殖させた後、患者に輸注で戻すことであった。

インビボＴ細胞活性化および抗原特異性増殖は、２つのシグナルプロセスからの結果と一般的に考えられ、この場合、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体と、ペプチド抗原を提示する主要組織適合性複合体クラスＩまたはクラスＩＩ分子（ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ）とのライゲーションによって第１シグナルが開始される。ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩおよびペプチド複合体は細胞（抗原提示細胞またはＡＰＣ）の表面上で発現される。ペプチド抗原は、内因性プロセッシングを受け、とりわけ、（１）体内で自然に発生する「自己」抗原；（２）ガンに関連する突然変異から生じる腫瘍抗原または（３）感染もしくはガンと関連するウイルス抗原であり得る、細胞内の分子に由来する。Ｔ細胞受容体による抗原の認識は第１のシグナルであると考えられ、第２のシグナルはＴ細胞上のさらなる表面分子とＡＰＣ上のさらなる分子とのライゲーションによって生じる共刺激に起因する。Ｔ細胞とＡＰＣとの間のこれらの共刺激分子の上方制御およびライゲーションはＴ細胞活性化の達成または増強に必要であり得る。なぜなら、第１シグナルはこれを達成するには単独では充分でない可能性があるからである。２つのシグナル活性化は、免疫応答を生じる病原体またはガンを制御するためにさらに多数の抗原特異性Ｔ細胞が利用可能であるようにＴ細胞の増殖をもたらし得る。この２つのシグナル活性化の標準的な理解は、共刺激が抗原認識と直接関連するように応答Ｔ細胞に対する第１シグナルおよび第２シグナルの両方を提供する同じＡＰＣに基づく。Ｔ細胞のインビトロ活性化および増殖は伝統的に長く複雑で資源消費型のプロセスであった。典型的なプロセスは、例えば８〜１２週間を要する可能性があり、多くの場合、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原提示を達成するために生「標的」ウイルスおよび／またはウイルスベクターを用いる。一般的に、Ｔ細胞活性化／増殖は、撹拌または物理的に撹拌された培養系よりもむしろ静的条件を要求する。

エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のＬＭＰ１およびＬＭＰ２抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞を培養する１つの先行技術の方法は以下のようにまとめることができる：

準備ステップ
・２つのシグナルＴ細胞活性化および増殖プロセスを制御された方法で達成するために、患者から採取したＢ細胞のトランスフェクションによって抗原提示細胞を作成することが有用である。このことは自己リンパ芽球様細胞系の確立と呼ばれ、細胞のＥＢＶでの感染（ＥＢＶ−ＬＣＬ）によって起こる。この細胞系の発現には約６〜８週間かかり、抗原提示のためにＥＢＶ−ＬＣＬに依存する培養プロセスの一部として開始しなければならない第１段階の１つである。それは、患者からのＢ細胞をＥＢＶウイルスとともに、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞成長およびＬＣＬの排除を阻害するためのシクロスポリンＡの存在下で培養するとによって調製される。

・ＥＢＶ−ＬＣＬでの増殖ステップの前に、培養系は、ウイルスベクターＡｄ５ｆ３５−ＬＭＰ１−ＬＭＰ２で形質導入された自己樹状細胞（ＥＢＶタンパク質ＬＭＰ１およびＬＭＰ２をコード化する）でのＬＭＰ−１およびＬＭＰ−２特異的Ｔ細胞の初期活性化および増殖を含む（０〜８日）。

・９〜１２日 細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を収集し、新鮮培地中に再懸濁させ、Ａｄ５ｆ３５−ＬＭＰ１−ＬＭＰ２で形質導入されたＥＢＶ−ＬＣＬで再刺激する。

・１３〜１６日 細胞溶解性Ｔリンパ球に新鮮培地および組換え型ヒトＩＬ−２を供給する。

・続いてＣＴＬ：ＬＣＬを用いて毎週再刺激し、ＩＬ−２を４〜８週間にわたって毎週２回添加する。

・プロセスで使用するための樹状細胞も、患者試料からＰＢＭＣを採取し、それらをＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで活性化して、接着性ＰＢＭＣを提供することによって調製されなければならない。これらの細胞を次いでウイルスベクターＡｄ５ｆ３５−ＬＭＰ１−ＬＭＰ２（すなわち、ＥＢＶタンパク質ＬＭＰ１およびＬＭＰ２をコード化する）で形質導入する。最後に、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ−１およびＴＮＦ−αの添加によって樹状細胞を成熟させる。

Ｔ細胞増殖ステップの概要
（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の調製とも称される）

・調製されたら、形質導入樹状細胞を患者由来の新鮮なＰＢＭＣとともに約１０日間の期間培養する。

・このステップから得られるＴ細胞を次いで形質導入されたＥＢＶ−ＬＣＬとともに約１週間培養する。

・その後、後者のステップから得られるＴ細胞を次いで形質導入ＥＢＶ−ＬＣＬとともにＩＬ−２の存在下でさらに１０日間培養して、自己Ｔ細胞抗原特異的産物を得る。

・このプロセスを充分なＴ細胞が増殖されるまで繰り返す。

J Immunother Vol 33, Number 3, April 2010は、Ｇ‐Ｒｅｘ（商標）システムとして知られるＷｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆからのシステムを用いて、２３日にわたって細胞を培養する、より高速かつより有効な方法を記載する。しかしながら、この迅速なプロセスは細胞に対して依然として伝統的なウイルス刺激を用いる。

先行技術戦略に関連してさまざまな問題がある：

（ｉ）ＥＢＶなどの生ウイルスおよびウイルスベクターの使用は、標的ウイルス特異的ＣＴＬの効率的発生を妨害し得るベクターに対する免疫優性応答を引き起こす可能性がある；

（ｉｉ）生ウイルスの使用は、安全性に対する懸念のために第３相試験への進行を妨げる障害である；

（ｉｉｉ）Ｂ細胞がＥＢＶ−ＬＣＬを製造する必要性は、今やリツキサン（Ｂ細胞を枯渇させる）がほとんどのリンパ腫患者の標準的治療になっているので、この技術を多くの患者のために用いることができないことを意味する；

（ｉｖ）製造期間（ＥＢＶ−ＬＣＬを確立するために最低６週間、そしてＣＴＬ増殖のためにさらに５〜７週間）が非常に不都合であり、非実用的であり、経済的に困難である；

（ｖ）細胞操作の複雑さは、産物の誤差および汚染の機会を多くもたらし、したがって、優良製造規範（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｓｅ：ＧＭＰ）の原則を順守するのは困難である、そして

（ｖｉ）Ｔ細胞増殖を刺激するために使用される自己抗原提示細胞は、標的抗原以外の抗原を発現する可能性があり、このことは、治療的Ｔ細胞産物に望ましい抗原特異性Ｔ細胞の純度を低下させる可能性がある。

それにもかかわらず、当業者は確立されたプロセスを変えることに消極的であった。なぜなら、各ステップは、インビボで、治療特性を有する生成物を生成させるために、特に生ウイルスに感染した細胞およびウイルス抗原を発現するガンを認識するために好適であるＴ細胞集団を生成させるために必要であると考えられていたためである。

本開示は、標的抗原に対する特異性を有する抗原特異的Ｔ細胞を迅速かつ効率的に産生するための方法を提供する。

本開示は、抗原特異的Ｔ細胞、たとえば自己抗原特異的Ｔ細胞のインビトロ増殖のためのプロセスであって：
ａ）自己ＰＢＭＣの集団を：
ｉ）標的抗原（複数可）に関連するペプチド／ペプチドミックスでパルスした樹状細胞または標的抗原（複数可）に関連するペプチド／ペプチドミックス、および
ｉｉ）少なくとも１つのサイトカイン
の存在下で培養するステップ、ならびに
ｂ）ステップａ）から得られる細胞の集団を：
ｉ）標的抗原（複数可）に関連するペプチド／ペプチドミックスでパルスした樹状細胞または標的抗原（複数可）に関連するペプチド／ペプチドミックスでパルスした自己抗原提示Ｔ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）細胞および人工の共刺激因子、ならびに
ｉｉ）場合によってサイトカイン
の存在下で培養するステップを含み、
プロセスが生ウイルスおよび／もしくはウイルスベクター、または関連するＴ細胞集団の増殖におけるＤＮＡもしくはＲＮＡでコード化された抗原の使用を用いないことを特徴とするプロセスを提供する。

１つの実施形態では、自己抗原特異的Ｔ細胞のインビトロ増殖のためのプロセスであって：
ａ）自己ＰＢＭＣの集団を：
ｉ）標的抗原（複数可）に関連するペプチドミックスでパルスした樹状細胞、および
ｉｉ）少なくとも１つのサイトカイン
の存在下で培養するステップ、ならびに
ｂ）ステップａ）から得られる細胞の集団を：
ｉ）標的抗原（複数可）に関連するペプチドミックスでパルスした自己抗原提示Ｔ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）細胞および人工の共刺激因子、
ｉｉ）サイトカイン
の存在下で培養するステップを含み、そして
生ウイルスおよび／もしくはウイルスベクターまたは関連するＴ細胞集団の増殖においてＤＮＡもしくはＲＮＡコード化抗原の使用を使用しないことを特徴とするプロセスが提供される。

本開示の方法では、ステップａ）におけるＰＢＭＣまたは樹状細胞およびステップｂ）の抗原提示細胞を一般的には標的抗原由来のエピトープを提示するように選択されたペプチドでパルス（ローディングとも称される）する。これらのペプチドはさらに詳細に後述する。

我々は：
・ＥＢＶ−ＬＣＬを生成させる必要性を排除し、したがって抗原提示のための生ウイルスの使用を回避すること（これにより、例えばリツキサン治療によって、あらかじめＢ細胞が除去された患者由来の抗原特異的Ｔ細胞の生成が可能になる）
・抗原提示細胞における抗原発現および提示を達成するための、ウイルスベクターコード化抗原、ＤＮＡコード化抗原、またはＲＮＡコード化抗原を使用する必要性を排除すること
・抗原提示のためのＤＣの使用を排除する選択肢を提供すること
・Ｔ細胞活性化のための方法であって、刺激性シグナルが自己細胞集団によって提供され、共刺激シグナルが組換え細胞系または人工の共刺激複合体によって提供される方法を提供すること
・効率的かつ着実な２段階培養プロセスを提供して、合計で例えば１０ｅ７超の好適な抗原特異性を有するＣＤ３Ｔリンパ球を３週間以内で生成させること
・例えば、他の方法では２型潜在腫瘍（リンパ腫およびＮＰＣ）で発現されない抗原が多数を占めるＥＢＶ抗原などの臨床的に関連するウイルス抗原に対する特異性を有するＴ細胞の刺激に集中すること
によって先行技術の問題を克服した。

本発明は、自己Ｔ細胞産物の製造の重要な利点を有し、潜在的に治療法をより広範囲にわたる患者集団に利用可能にする。本発明はさらに、治療薬品を製造するために必要な時間、介入および資源を最小限に抑え、また有利には汚染の機会も最小限に抑える。

さらに、得られる治療薬品の特異性および特性は、先行技術の方法によって製造される製品と少なくとも同等であり、多くの態様では改善された特性を有し得る。

ガン患者などのある患者由来の自己細胞は健常人から得られる細胞とは異なる。なぜなら患者細胞は多くの場合アネルギー性である、すなわち感染またはガンに関連する抗原に対する免疫応答をもたらすことができないことが判明している。免疫抑制は、多くの場合全身性であると考えられ、一方、アネルギーは、通常、抗原特異性基準で記載され、この場合、Ｔ細胞の特異的クローンはもはや標的抗原に対する免疫応答をもたらすことができない。ガン微小環境は、例えば、ガン抗原を認識するＴ細胞がもはや機能しないようなアネルギーを引き起こし得る。

免疫アネルギーまたは抑制の証拠は、例えばウイルス感染および／またはウイルスに関連するガン細胞の存在を一掃できないことである。健常人では、これらの細胞は免疫系によって一掃される（Teague, R. M., B. D. Sather, J. A. Sacks, M. Z. Huang, M. L. Dossett, J.Morimoto, X. Tan, S. E. Sutton, M. P. Cooke, C. Ohlen, and P. D. Greenberg. 2006. Interleukin-15 rescues tolerant CD8+ T cells for use in adoptive immunotherapy of established tumors. Nat. Med. 12:335-341 and Chemnitz, J. M., D. Eggle, J. Driesen, S. Classen, J. L. Riley, S. bey-Pascher, M. Beyer, A. Popov, T. Zander, and J. L. Schultze. 2007. RNA fingerprints provide direct evidence for the inhibitory role of TGF beta and PD-1 on CD4+ T cells in Hodgkin lymphoma. Blood 110:3226-3233）。

さらに、鼻咽頭がん（ＮＰＣ）の患者では、抗原特異性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）での自己Ｔ細胞免疫療法の結果は比較的効果が薄かった。一試行では、１１人の患者のうち１人だけが完全寛解に達し、そしてこのことは、これらの患者からＬＭＰ特異的Ｔ細胞を復活させることができないことによって説明することができる。実際、発明者らはＮＰＣがウイルス性腫瘍抗原に対する特異性を有するＴ細胞をアネルギー化すると仮定する。

したがって、ある患者では、先行技術の方法は適切な抗原特異的Ｔ細胞を適切に復活させることができなかった。

注入されたＴ細胞の有効性は、標的とされた腫瘍抗原を認識するそれらの能力だけでなく、それらの抗原内の複数のエピトープを認識して、エピトープ損失、ウイルス株変動およびＴ細胞主導突然変異（Ｔ ｃｅｌｌ ｄｒｉｖｅｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）による腫瘍回避を防止する能力に依存する。したがって、ＮＰＣおよびＥＢＶ陽性リンパ腫で発現されるＬＭＰ１−ＬＭＰ２−、ＥＢＮＡ１およびＢＡＲＦ１−などの抗原由来の広範囲のエピトープを認識するＣＴＬを再現性よく復活させ、増殖させる製造戦略を開発する必要がある。

当該技術分野における先導者である本発明者らによる研究の前には、ウイルス感染およびウイルスに関連するガンの予防および治療のために自己抗原特異的Ｔ細胞集団を生成させるためにペプチドを使用できるかどうかはわかっていなかった。本発明のプロセスで用いられる樹状細胞またはＴ−ＡＰＣを、前記ペプチドを用いる抗原提示細胞として有用にすることができることもわかっていなかった。さらには、ペプチドに対するＴ細胞応答は、免疫系によって認識される自然に処理されたペプチドに関連して重要であるようである。

本発明は、（自己）抗原特異的Ｔ細胞調製物の調製における非常に重大な進歩であり、これは患者および医師に対して実際的な利益をもたらす可能性が高い。

本開示の増殖させたＴ細胞集団で重要な因子は：
・認識される各エピトープに対するＴ細胞の親和性、
・各抗原内の認識されるエピトープの数、
・認識される抗原の数、
・Ｔ細胞の増殖倍率および所望の特異性を有するＴ細胞の発生頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）
である。

ＥＶＢ特異的Ｔ細胞を生成させるための先行技術プロセスの線図を示す。この方法は、１回目の活性化／増殖のために自己樹状細胞（ＤＣ）、そしてその後のラウンドの活性化／増殖のためにリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）の産生を必要とした。ＤｃおよびＬＣＬはどちらもＥＢＶ特異的Ｔ細胞の成長を刺激するために選択されるＥＢＶ抗原を含有するアデノウイルスベクターで形質導入された。 本発明の様々な実施形態の線図を示す。線図は、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２特異的Ｔ細胞を生成するためのペプチドの使用を示すことによる本発明のプロセスを示す。すべての新規方法では、抗原（複数可）を提供する方法としてのアデノウイルスベクターの使用を、外因性ペプチド（複数可）の添加と置換した。さらに、２回目の活性化／増殖のためのＬＣＬの使用をやめ、ペプチドをロードした自己ＤＣまたはペプチドをロードした抗原提示自己Ｔ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）およびａＫ５６２のいずれかと置換した。別の実施形態は、初回刺激がＤＣを使用せずに実施することができ、ＰＢＭＣ集団中に存在する抗原提示細胞を利用することを示す。ＰＢＭＣ、ＤＣおよびＴ−ＡＰＣの生成は、本文書中それぞれプロトコル１、２および３で記載されている。 この一連の図は、本発明の請求項１のステップｂ）でＴ−ＡＰＣを使用するａＫ５６２によるＴ細胞増殖の刺激を示す。それは、活性化／増殖の第２ラウンドのための強力な抗原特異的Ｔ細胞刺激を達成するための新規系の使用を示す。それは、第１（抗原特異的刺激性）シグナルおよび第２（共刺激）シグナルは２つの別個の成分によって提供され得るこという驚くべき発見に基づく。示された例では、第１シグナルはペプチドをロードしたＴ−ＡＰＣによって提供され、第２シグナルは、ＭＨＣではなく共刺激分子を提示するように修飾されたａＫ５６２細胞によって提供される。これは、本発明の請求項１のステップｂ）で説明されるとおりである。 本発明の請求項１のステップｂ）によるａＫ５６２およびＴ−ＡＰＣを使用するＴ細胞の増殖を示す。この図は、６人の正常なドナーにおけるプロセスの２回目の刺激の間に様々な比のＣＴＬ：Ｔ−ＡＰＣ：ａＫ５６２を使用する結果および結果としての細胞増殖を示す。１：１：５比は大部分のドナーにおいて最適であることが示された。 本発明の請求項１のステップｂ）におけるＴ細胞増殖について最適のＣＴＬ：ａＫ５６２；Ｔ−ＡＰＣ比を示す。結果は、（Ｃ）増殖倍率（図３Ａで個々に示されるとおり）、（Ｄ）培養物中のＣＤ５６＋、ＣＤ３−細胞のパーセンテージおよび（Ｅ）様々な細胞対細胞比を使用して生成させた最終細胞産物のインターフェロン−γ（ＩＦＮｇ）ＥＬＩＳＰＯＴにおける応答（ＳＣＦ＝スポット形成コロニー）を比較することによって得られた。 様々なＣＴＬ：Ｔ−ＡＰＣ：ａＫ５６２細胞比および異なる抗原を用いたＥＢＶ特異的Ｔ細胞の培養物中のインターフェロンガンマ分泌細胞の比較を示す。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＩＦＮｇを産生する最終培養物中の細胞の数を、異なる培養比での２回目の刺激後の２人の個々のドナーで示す。これは、関心対象の３つの別個のＥＢＶ抗原および抗原を含まない対照について示される。 Ｔ−ＡＰＣがＨＬＡクラスＩおよびＩＩ拘束性抗原の抗原提示細胞として作用することができることを示す。Ａ．ＰＢＭＣのＯＫＴ３およびＣＤ２８抗体（Ｔ−ＡＰＣ）での活性化により、Ｔ細胞は、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６および４−１ＢＢＬなどの共刺激分子同様にＨＬＡクラスＩＩの上方制御を開始するであろう。ＨＬＡクラスＩＩは１週間の終わりまでに１００％までに達するが、共刺激分子のレベルは一時的であり、依然として低い。Ｂ．ａＫ５６２は、安定かつ高レベルのＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６および４−１ＢＢＬを発現するように操作されたＨＬＡ（−）ｖｅ白血病細胞系である。 図４のこの一連の図は、健常ドナー由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。図４Ａは、先行技術プロセスおよび本発明の様々な実施形態のステップの略図およびそれらの術語である。この図は、先行技術を影付きボックス中で示し、初回および２回目の刺激に言及するために使用される術語を示す。ＡＰＣとして使用される細胞型をまず示し、次いで抗原が送達される方法を示す（Ａｄベクターまたはペプチド−Ｐｘ）。Ｔ−ＡＰＣおよびａＫ５６２＋ペプチドを使用する実施形態に関して、これはデータ中でＡＴＣと略記される。 図４のこの一連の図は、健常ドナー由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。図４Ｂは、先行技術および本発明の様々な実施形態を使用するＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖を示す。この図は、９人の健常なドナーから得られた結果の概要を示す。先行技術および図４Ａで概略を示した３つの他の方法を用いたＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖後に、細胞を９、１６および２３日に計数し、結果を１００万個単位の細胞として以下で示した。ａＫ５６２をＤＣまたはＴ−ＡＰＣと組み合わせて用いる両方法は先行技術よりも著しく良好な増殖を示す。 図４のこの一連の図は、健常ドナー由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。図４Ｃは、先行技術および本発明の様々な実施形態を使用したＥＢＶ特異的Ｔ細胞の培養物中のインターフェロンガンマ分泌細胞の比較を示す。先行技術の方法および本発明の様々な実施形態を使用して培養した後、細胞集団をＥＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチドで再刺激した。関心対象の３つの抗原（ＥＢＮＡ−１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２）由来のペプチドをアッセイで使用し、応答は、先行技術と比較した場合、同じであるか、または増強されたかのいずれかであった。（合計９人の健常なドナーの）１つの代表例を示し、続いてＡＴＣを使用する実施形態の全ての正常なドナーから得られる情報を照合するグラフを示す。 図４のこの一連の図は、健常ドナー由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。図４Ｄは、先行技術および本発明の様々な実施形態によって増殖させたＥＢＶ特異的Ｔ細胞に対するＴ細胞受容体親和性を示す。図４Ａで概要を記載した異なる方法を用いて細胞を１６日まで培養し、それらを次いでＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて希釈度を増加させたペプチドで再刺激して、本発明の新規実施形態がペプチドに対するＴ細胞受容体の親和性にとって有害であるかどうかを判定した。実際、新規方法は個々のＥＢＶペプチドに対して、類似した親和性を示し、ＥＢＮＡ１の場合には有意に増加した親和性を示す。 図４のこの一連の図は、健常ドナー由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。図４Ｅは、先行技術および本発明の様々な実施形態を用いて増殖させた細胞の様々なＴ細胞マーカーの分布を示す。１６日で、４つの異なる方法を用いて産生させたＴ細胞を収集し、フローサイトメトリーを用いて免疫表現型を決定した。これは、細胞産物の組成が先行技術の方法と本発明の実施形態との間で変わらないことを示す。先行技術と新規実施形態との間でＣＤ６２Ｌの発現に関して差がある。これは、ナイーブおよび中央記憶Ｔ細胞上で発現され、エフェクター記憶Ｔ細胞によって下方制御され、したがってこれはここでも本発明の実施形態の利点として見なすことができる。 図４のこの一連の図は、健常ドナー由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。図４Ｆは、先行技術を用いた細胞の培養が、リンパ腫およびＮＰＣ患者由来のＥＢＶ＋ガン細胞中に存在する潜在２型抗原上でよりもむしろＬＣＬ細胞中で発現される抗原に対する応答を歪ませることを示す。先行技術および本発明の実施形態を用いて細胞を生成させた。これらを次いでＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて様々なＥＢＶペプチドで再刺激した。これは、先行技術の方法が特異的ＬＣＬ優勢エピトープに対する応答を歪ませることを示し、一方、新規方法は、ＥＢＮＡ１などのガン関連抗原に対する活性の増加を示す。 図５のこの一連の図は、ＮＰＣ患者由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を用いた結果を示す。図５Ａは、先行技術プロセスおよび本発明の様々な実施形態のステップの略図およびそれらの術語である。この図は、先行技術を影付きボックス中に示し、１回目および２回目の刺激に言及するために使用される術語を示す。ＡＰＣとして使用される細胞型をまず示し、次いで抗原を送達した方法を示した（Ａｄベクターまたはペプチド−Ｐｘ）。Ｔ−ＡＰＣおよびａＫ５６２＋ペプチドを用いた実施形態に関して、これはデータ中でＡＴＣと略記される。 図５のこの一連の図は、ＮＰＣ患者由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を用いた結果を示す。図５Ｂは、先行技術および本発明の様々な実施形態を使用するＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖を示す。先行技術および図５Ａで概要を示された３つの他の方法を用いたＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖後、細胞を９、１６および２３日で計数し、結果を以下で１００万個の細胞または増殖倍率として示した。これはそれぞれ３人および４人のＮＰＣドナーの代表例である。ＤＣまたはＴ−ＡＰＣと組み合わせてａＫ５６２を用いる両方法は、先行技術よりも有意に良好な増殖を示す。 図５のこの一連の図は、ＮＰＣ患者由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を用いた結果を示す。図５Ｃは、先行技術および本発明の様々な実施形態を用いたＥＢＶ特異的Ｔ細胞の培養物中のインターフェロンガンマ分泌細胞の比較を示す。先行技術の方法およびさまざまな実施形態を用いた培養後、細胞集団をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチドで再刺激した。関心対象の３つの抗原由来のペプチドＥＢＮＡ−１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２を使用し、ＮＰＣ患者における応答は先行技術と比較した場合増強された。１つの代表例を示す。 図５のこの一連の図は、ＮＰＣ患者由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を用いた結果を示す。図５Ｄは、先行技術および本発明の様々な実施形態によって増殖させたＥＢＶ特異的Ｔ細胞に対するＴ細胞受容体親和性を示す。図５Ａで概要を記載した異なる方法を用いて細胞を１６日まで培養した。それらを次いでＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて希釈度を増大させたペプチドで再刺激して、本発明の新規実施形態がペプチドに対するＴ細胞受容体の親和性に対して有害かどうかを判定する。実際、新規方法は、個々のＥＢＶペプチドに対して同様の親和性を示し、ＥＢＮＡ１の場合には有意に増加した親和性を示す。 図５のこの一連の図は、ＮＰＣ患者由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を用いた結果を示す。図５Ｅは、先行技術および本発明の様々な実施形態を使用して増殖させた細胞の様々なＴ細胞マーカーの分布を示す。３１日に、図５Ａで記載される４つの異なる方法で産生されたＴ細胞を収集し、フローサイトメトリーを用いて免疫表現型を決定した。これは、細胞産物の組成が先行技術の方法と本発明の実施形態との間で変わらないことを示す。先行技術と新規実施形態との間でＣＤ６２Ｌの発現に関して相違がある。これは、ナイーブおよび中央記憶Ｔ細胞上で発現され、エフェクター記憶Ｔ細胞によって下方制御され、したがってこのことはここでも本発明の実施形態の利点とみなすことができる。図５Ａで概略を示した方法に関して若干の変更がある。これは、ＮＰＣ患者細胞が２つ以上の再刺激ステップを受けるためである。しかしながら、各刺激についての術語は同じままである。このデータは４人のＮＰＣ患者の代表例である。 図５のこの一連の図は、ＮＰＣ患者由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を用いた結果を示す。図５Ｆは、本発明の新規実施形態を用いて増殖させたＮＰＣ患者由来のＴ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ１９−）は、先行技術によって増殖させたＴ細胞のように４および１０日間共培養でより良好にＬＣＬ（ＥＢＶ＋ガン細胞系、ＣＤ３−／ＣＤ１９＋）を殺すことを示す。Ｔ細胞およびＬＣＬを１：１比でインキュベートした。 図６のこのシリーズ中の図は、リンパ腫患者由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。図６Ａは、先行技術プロセスおよび本発明の様々な実施形態のステップの略図ならびにそれらの術語である。この図は、影付きボックス中に先行技術を示し、第１および第２刺激に言及するために使用される術語を示す。ＡＰＣとして使用される細胞型がまず示され、次いで抗原が送達された方法が示される（Ａｄベクターまたはペプチド−Ｐｘ）。Ｔ−ＡＰＣおよびａＫ５６２＋ペプチドを使用する実施形態に関して、これはデータ中で以前のとおりＡＴＣと略記されるが、データのこの部分では別法としてＫＡＴｐｘおよびＡＴｐｋとも略記される。 図６のこのシリーズ中の図は、リンパ腫患者由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。図６Ｂは、先行技術および本発明の様々な実施形態を用いたＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖を示す。先行技術および図６Ａで概要を記載した３つの他の方法を用いたＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖後に、細胞を９および１６日で計数し、結果を１００万の細胞または増殖倍率として以下で示した。これは４人のリンパ腫患者由来の細胞での結果の代表例である。 図６のこのシリーズ中の図は、リンパ腫患者由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。図６Ｃは、先行技術および本発明の様々な実施形態を用いたＥＢＶ特異的Ｔ細胞の培養物中のインターフェロンガンマ分泌細胞の比較を示す。先行技術の方法およびさまざまな実施形態を用いた培養後、細胞集団をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチドで再刺激した。関心対象の３つの抗原由来のペプチド、ＥＢＮＡ−１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２を使用し、リンパ腫患者における応答は、先行技術と比較した場合に増強された。１つの代表例を示す。これらの結果は、ペプチドパルスしたＰＢＭＣまたはＤＣを第１の増殖のために使用した場合、抗原特異的Ｔ細胞の数は、先行技術を使用した培養と比較して９日後に有意に増加したことを示す。 図６のこのシリーズ中の図は、リンパ腫患者由来のＥＢＶ特異的細胞を増殖させために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。図６Ｄは、本発明の新規実施形態を用いて増殖させたリンパ腫患者由来のＴ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ１９−）はＬＣＬ（ＥＢＶ＋ガン細胞系、ＣＤ３−／ＣＤ１９＋）を先行技術によって増殖させたＴ細胞と同等またはより良好に共培養において２または４日間殺すことを示す。Ｔ細胞およびＬＣＬを１：１比でインキュベートした。 図７のこの一連の図は、健常なドナー由来のＶＺＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。ＰＢＭＣを、ＶＺＶタンパク質、ｇＥ、ＯＲＦ１０、ＩＥ６１、ＩＥ６２およびＩＥ６３に及ぶ重複するペプチドライブラリ（１１のアミノ酸で重複する１５ｍｅｒ）（ｐｅｐｍｉｘ）で、ＩＬ−４およびＩＬ−７の存在下でパルスした。９、１６および２３日に、それらを共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６および４−１ＢＢリガンドを発現するａＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ｃｓ）の存在下で、同じｐｅｐｍｉｘで１：１：５のＣＴＬ：Ｔ−ＡＰＣ：Ｋ５６２−ｃｓ比にてパルスした自己活性化Ｔ細胞（ＡＡＴＣ、Ｔ−ＡＰＣ）で再刺激した。計数することによってそれらの増殖速度を測定し、抗原特異性をガンマインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定した。図７Ａは、先行技術プロセスおよび本発明の様々な実施形態のステップの略図ならびにそれらの術語である。 図７のこの一連の図は、健常なドナー由来のＶＺＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。ＰＢＭＣを、ＶＺＶタンパク質、ｇＥ、ＯＲＦ１０、ＩＥ６１、ＩＥ６２およびＩＥ６３に及ぶ重複するペプチドライブラリ（１１のアミノ酸で重複する１５ｍｅｒ）（ｐｅｐｍｉｘ）で、ＩＬ−４およびＩＬ−７の存在下でパルスした。９、１６および２３日に、それらを共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６および４−１ＢＢリガンドを発現するａＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ｃｓ）の存在下で、同じｐｅｐｍｉｘで１：１：５のＣＴＬ：Ｔ−ＡＰＣ：Ｋ５６２−ｃｓ比にてパルスした自己活性化Ｔ細胞（ＡＡＴＣ、Ｔ−ＡＰＣ）で再刺激した。計数することによってそれらの増殖速度を測定し、抗原特異性をガンマインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定した。図７Ｂは、先行技術および本発明の様々な実施形態を使用するＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖を示す。前述のプロトコルを用いて増殖させたＴ細胞の成長速度。５００倍超の増殖を２２日にわたって達成することができる。 図７のこの一連の図は、健常なドナー由来のＶＺＶ特異的細胞を増殖させるために先行技術および本発明の様々な実施形態を使用した結果を示す。ＰＢＭＣを、ＶＺＶタンパク質、ｇＥ、ＯＲＦ１０、ＩＥ６１、ＩＥ６２およびＩＥ６３に及ぶ重複するペプチドライブラリ（１１のアミノ酸で重複する１５ｍｅｒ）（ｐｅｐｍｉｘ）で、ＩＬ−４およびＩＬ−７の存在下でパルスした。９、１６および２３日に、それらを共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６および４−１ＢＢリガンドを発現するａＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ｃｓ）の存在下で、同じｐｅｐｍｉｘで１：１：５のＣＴＬ：Ｔ−ＡＰＣ：Ｋ５６２−ｃｓ比にてパルスした自己活性化Ｔ細胞（ＡＡＴＣ、Ｔ−ＡＰＣ）で再刺激した。計数することによってそれらの増殖速度を測定し、抗原特異性をガンマインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定した。図７Ｃは、先行技術および本発明の様々な実施形態を使用するＥＢＶ特異的Ｔ細胞の培養物中のインターフェロンガンマ分泌細胞の比較を示す。０日にｐｅｐｍｉｘパルスしたＰＢＭＣまたはＤＣおよび９、１６および２３日にｐｅｐｍｉｘパルスした自己活性化Ｔ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）＋Ｋ−５６２−ｃｓ細胞で活性化した後にＶＺＶペプチドでの刺激に反応してガンマインターフェロンを分泌する６〜９人の健常なＶＺＶ−血清陽性のドナー由来のＴ細胞の発生頻度。各記号は１人のドナーを表す。第１増殖の間にペプチドパルスしたＰＢＭＣまたはＤＣのいずれかを使用し、その後の増殖のためにａＫ５６２と組み合わせたＴ−ＡＰＣを使用する本発明の実施形態の結果、使用されるさまざまなＶＺＶ抗原全体にわたって標的ＣＴＬの有意な増殖が得られる。

自己Ｔ細胞は、患者由来の細胞、すなわちドナー由来の細胞に対して患者生来の細胞である。ウイルス感染に関連するある腫瘍は、ウイルス特異的Ｔ細胞の存在にもかかわらず患者で成長する方法を獲得した。これは、Ｔ細胞に対して抑制性である分子の発現およびウイルス遺伝子発現の調節を含む。したがって、これらの患者におけるＴ細胞は、ガン細胞に対する機能が低下した可能性があり、これはアネルギーの形態として記載することができる。

自己Ｔ細胞療法では、エクスビボでの活性化および増殖のために患者からＴ細胞の試料を取り出す。抗原特異性Ｔ細胞集団が調製されたら、それを患者に注入し、ここでＴ細胞はさらに増殖し、直接的（細胞毒性）および間接的（免疫調節）機構によってそれらの標的抗原を提示する細胞を除去する。

「Ｔ細胞」は当該技術分野で一般的に用いられる用語であり、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球または活性化Ｔリンパ球を包含するものである。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。

本明細書中で用いられる抗原特異的Ｔ細胞は、特定の抗原を認識し、例えばそれに反応してサイトカインを増殖および／または産生することによってそれに反応するＴ細胞を指すものである。

１つ以上の実施形態において、プロセスは特異性を刺激するために組換え型標的抗原を用いない。本明細書中の組換え型抗原は、組換え型技術によって調製される抗原の全体または大きなフラグメントを指す。対照的に、用いられるペプチドは抗原の小さなフラグメントであり、一般的に合成のものである。

本発明は、細胞のエクスビボプロセッシングおよびそれから得られるＴ細胞産物に関する。通常、本発明は患者から試料を得るステップを含まない。

患者から試料を得るステップは、（処理することができ、場合によってアフェレーシス産物として提供することができる）血液試料を採取する日常的技術である。このプロセスは患者にほとんどリスクを与えず、そして医師が実施する必要はなく、適切に訓練されたサポートスタッフによって実施できる。１つの実施形態では、患者由来の試料は、約２００ｍＬ以下の血液、例えば１５０ｍｌ以下、たとえば１００〜１５０ｍｌの範囲である。一般的に、少なくとも約６０ｍｌの血液が必要である。

典型的に、Ｔ細胞増殖、ＤＣ生成およびＴ−ＡＰＣ生成のためのＰＢＭＣは、当業者に公知のＦｉｃｏｌｌ密度勾配分離により血液またはアフェレーシス産物から得られる。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配分離は、合成スクロースポリマーであって、その濃度が溶液中で変化する合成スクロースポリマーを使用して、沈殿の間の異なる細胞の分離を利用する。好適な試薬は、例えばＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。

１つの実施形態では、血液試料の採取または血液試料の輸送の責任を負うセンターが運搬前にＦｉｃｏｌｌ密度勾配分離によって試料を処理する。

１つの実施形態では、血液試料または処理された血液試料を周囲温度で、例えば４℃超および約３０℃未満で運搬する。

１つの実施形態では、２つのチャンバーを含み、その１つのチャンバーが防腐剤および／または抗凝固剤などの添加剤を含み、血液または処理された血液が第２のチャンバー中に充填されるバッグなどの容器中に血液試料または処理された血液試料を充填し、その後、第１および第２チャンバー間のシールを破り、２つのチャンバーの内容物を混合する。

本明細書中で用いられる細胞の培養とは、細胞をインビトロで活性化し、増殖および／または分化させることを指すものである。

Ｔ細胞の増殖は一般的に好適なＴ細胞増殖培地中で実施されることは当業者には知られている。一般的に、ステップａ）のプロセスは、培地を変えることなく実施することができる。一般的に、ステップｂ）のプロセスは、培地を変えることなく実施することができる。しかしながら、グルコメーターによって、例えば系中のグルコースが１００ｍｇ／ｄｌを下回る場合であることが示される場合には、培地を変えなければならない。したがって、本開示のプロセスはＴ細胞を増殖させるために必要な介入の量を最小限に抑えるのに有効である。

Ｔ細胞増殖は、生存可能はＣＤ３＋細胞を計数することによって評価することができる。

生存可能な細胞は、当業者に公知の技術を用いて、例えばＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ（および光学顕微鏡法）または７−アミノ−アクチノマイシンＤ、６７０ｎｍで発光する生体染色色素（またはＶｉａＰｒｏｂｅ、７ＡＡＤの市販のすぐに使える溶液）での細胞染色、およびフローサイトメトリーによって試験することができる。染料が細胞中に浸透する場合、その細胞は生存可能でないとみなされる。色素を吸収しない細胞は生存可能であるとみなされる。例示的方法は、約１００μＬの細胞懸濁液あたり約５μＬの７ＡＡＤおよび約５μＬのＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（アポトーシスの間露出する外部リン脂質ホスファチジルセリンと結合するリン脂質結合タンパク質）を利用し得る。この混合物を周囲温度で約１５分間、光の非存在下でインキュベートしてもよい。分析を次いで、フローサイトメトリーを使用して実施することができる。例えばMG Wing, AMP Montgomery, S. Songsivilai and JV Watson. An Improved Method for the Detection of Cell Surface Antigens in Samples of Low Viability using Flow Cytometry. J Immunol Methods 126: 21-27 1990を参照のこと。

Ｔ細胞増殖培地は、概して、関連する増殖ステップ（すなわち、ステップａ）またはステップｂ））で用いられる血清、培地および任意のサイトカインを含む。

１つの実施形態では、用いられる血清は、例えば１５％以下の血清、たとえば１０％の血清であり、特にヒト血清が用いられる。

１つの実施形態では、培地はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なアドバンストＲＰＭＩまたはＲＰＭＩ１６４０である。

１つの実施形態では、用いられるサイトカインを後述する。

１つの実施形態では、細胞増殖培地は、１０％のヒトＡＢ血清、２００ｍＭのＬ−グルタミン、４５％のアール・ハムのアミノ酸（Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｈａｍ’ｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）（ＥＨＡＡまたはＣｌｉｃｋ’ｓ培地）および４５％のアドバンスト（ａｄｖａｎｃｅｄ）ＲＰＭＩまたはＲＰＭＩ−１６４０を含む。

１つの実施形態では、用いられる培地は血清の使用を必要としない。

本明細書中で用いられる細胞増殖とは、細胞分裂の結果として細胞集団中の標的細胞の数が増加することを指す。

１つの実施形態では、ステップａ）で、ＰＢＭＣをペプチド／ペプチドミックスで直接処理する。自己ＰＢＭＣがＴ細胞をペプチドの存在下で、自己樹状細胞が存在する場合と同様の方法で活性化できることは非常に驚くべきことであった。特にその理由は、文献からの意図は、樹状細胞が最適の抗原提示細胞であるということであるからである。Chen ML, Wang FH, Lee PK, Lin CM. Immunol Lett. 2001 Jan 1; 75(2):91-6.

別の実施形態において、本発明のプロセスのステップａ）では、患者ＰＢＭＣから調製される樹状細胞を用いる。

血液試料は一般的には細胞の初回物理的選択、例えばアフェレーシス集団由来の細胞（またはＴ細胞）の亜集団の選択を受けない。

１つの実施形態では、１〜２×１０^７ＰＢＭＣを、Ｇ‐Ｒｅｘ（商標）４０中、３０ｍｌの培地中で、サイトカインの存在下、０．５〜１×１０^６ペプチドパルス化ＤＣで刺激する。９〜１４日の培養後、例えば５０〜８０×１０^７の抗原特異性レスポンダーＴ細胞の範囲の細胞の収集物。しかしながら、これはアネルギー性Ｔ細胞を有する患者におけるよりも低い可能性がある。

培地（４５％アドバンストＲＰＭＩ、４５％ＥＨＡＡ、１０％ＦＣおよび２００ｍＭのＬ−グルタミン）は、グルコースが（グルコメーターで）１００ｍｇ／ｄｌを下回る低下によって示される場合にのみ変える。

樹状細胞は多くの場合、当業者によってプロフェッショナル抗原提示細胞と称される。この用語は、樹状細胞が２つのシグナル活性化プロセスをＴ細胞に対して実施するのに最適であること、すなわち、細胞表面上に抗原を提示することに加えて、樹状細胞は、強力な共刺激シグナルも提供するという事実を指す。抗原提示による刺激と共刺激の両シグナルは、Ｔ細胞活性化を達成するために必要である。

本発明のプロセスで使用するための樹状細胞は、ペプチド混合物でパルス（またはローディング）することによって患者ＰＢＭＣの試料から生成させることができ、その詳細は後述する。

本明細書中で用いられるパルスまたはローディングは、関連する細胞、たとえばＰＢＭＣまたは樹状細胞を、適切な培地中のペプチドミックスに暴露することを単に指すものである。

プロセスで使用するための樹状細胞は、患者試料からＰＢＭＣを採取し、それらをプラスチックに付着させることによって調製することができる。一般的に、単球集団は付着し、他の全ての細胞は洗い流すことができる。付着した集団を次いでＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで分化させて、単球由来の樹状細胞を産生させる。これらの細胞は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ−１およびＴＮＦ−α（樹状細胞の表面上の重要な共刺激分子を上方制御する）の添加によって成熟させることができ、次いで本明細書中で記載されるペプチド混合物で形質導入して、必要とされる樹状細胞を提供する。

このような方法でのＤＣを生成および成熟させることについての言及は、Jonuleit H, Kuhn U, Muller G, et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur J Immunol. 1997;27:3135-3142で見いだされる。

ペプチドを１〜１００ｎｇペプチド／１５×１０^６ＰＢＭＣもしくはＡＴＣ（下記考察を参照のこと）または各ペプチドライブラリ／ｐｅｐｍｉｘについて２×１０^６ＤＣあたり１〜１００ｎｇペプチドで添加することができる。

１つの実施形態では、ＰＢＭＣをＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで３〜５日間刺激し、続いてＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１ｂ、ＰＧＥ−１またはＰＧＥ−２およびＩＬ−６で１もしくは２日成熟させ、続いて前記ペプチドでパルスする。

したがって、１つの実施形態では、ステップａ）における樹状細胞は自己由来である。

１つの実施形態では、生じる樹状細胞応答はＣＤ４およびＣＤ８応答である。

本明細書中で用いられるバランスの取れたＣＤ４およびＣＤ８応答は、ＣＤ４細胞またはＣＤ８が増殖プロセスで枯渇しないという事実を指すものである。しかしながら、本明細書中で用いられるバランスの取れた集団は、ＣＤ８細胞より多くのＣＤ４細胞が存在し得るか、またはその逆であることで依然として歪曲される可能性がある。

１つの実施形態では、それぞれ１０：１〜５０：１の範囲、例えば１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、たとえば約２０：１のステップａ）におけるＰＢＭＣ：樹状細胞比。

樹状細胞はＴ細胞の強力な活性化をもたらし、例えばステップａ）において、培養中の抗原特異性Ｔ細胞の発生頻度が低い（１００のＴ細胞中１未満が関心対象の抗原について特異的であり得る）場合、樹状細胞を用いるのが効率的である。しかしながら、抗原特異的Ｔ細胞の数および発生頻度が増大するにつれ、そして特異的Ｔ細胞：樹状細胞の比が増加するにつれ、樹状細胞の数が増加し得ない限り、樹状細胞の活性化の効率は減少する。抗原特異性Ｔ細胞はしばしば活性化後に樹状細胞に細胞毒性応答をもたらす。樹状細胞の殺滅は、次いで標的抗原特異性Ｔ細胞の活性化および増殖を継続させるために利用可能な活性化シグナルを減少させる。

樹状細胞はＴ細胞を刺激して増殖させて標的抗原に対して特異的な集団にするのに非常に有効であるが、大量の樹状細胞を生成させるのは困難である。したがって、ステップｂ）は樹状細胞を実際には用いることができるが、異なる抗原提示細胞および人工の共刺激因子をステップｂ）で用いる利点がある。Ｔ細胞に対して樹状細胞の数が非常に少ない数例では、Ｔ細胞の活性化は観察されない。このことは以下でさらに詳細に考察する。

有利には、樹状細胞は記憶Ｔ細胞およびナイーブＴ細胞の両方を活性化できると考えらえる。本発明による細胞集団中に記憶Ｔ細胞が存在することは重要であり得る。

本明細書中で用いられる小集団とは、その小集団中の細胞の絶対数が所望の集団中の細胞数よりも有意に低いこと、例えば全集団の３０パーセント以下であるという事実を意味するものである。

後述されるペプチド混合物を、樹状細胞のパルス化、抗原提示細胞のパルス化から選択される１つ以上の目的のために使用することができるか、またはステップａ）においてＰＢＭＣと直接用いることができる。

ペプチドミックスは、関連するウイルス抗原、例えばＥＢＶウイルス抗原由来である。エプスタイン・バーウイルスは、しばしばＥＢＶと称され、ヘルペスウイルス科の構成要素であり、世界人口の９５％超に慢性的に感染する。

１つの実施形態では、ペプチドは乳糖種ウイルスの抗原由来である。

１つの実施形態では、ペプチドはＣ型肝炎ウイルスの抗原由来である。

１つの実施形態では、ペプチドはワクシニアウイルス（ＶＶ）の抗原由来である。

１つの実施形態では、ペプチドは水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の抗原由来である。

１つの実施形態では、ペプチドはヒト免疫不全ウイルスの抗原由来である。

１つの実施形態では、ペプチドは、Ｂ型肝炎、ＨＨＶ−８、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ−１、ＳＶ４０および／またはメルケル細胞ウイルスの抗原由来である。

１つの実施形態では、ペプチドは、例えば本明細書中で記載される任意の２つ以上、たとえばＥＢＶとＶＺＶ、ＥＢＶとＶＶ、ＶＺＶとＶＶまたはＥＢＶとＶＺＶとＶＶなどのウイルスの組み合わせ由来である。

ＥＢＶなどの関連するウイルスで感染する細胞の存在下で、またはウイルスタンパク質をコード化するアデノウイルスベクターの存在下で自己Ｔ細胞を培養する代わりに、細胞をペプチドまたはペプチドの混合物でパルスした抗原提示細胞の存在下で培養する。これによって、最終産物の病原体での汚染の危険性が減少し、このことは、患者に注入されるＴ細胞産物を滅菌する方法はないので重要である。

１つの実施形態では、ペプチドミックスまたはミックス中のペプチドの一部は、抗原ＬＭＰ１（潜在性膜タンパク質１Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０３２３０）の配列の一部または全部を対象とする。

１つの実施形態では、ペプチドミックスまたはミックス中のペプチドの一部は、抗原ＬＭＰ２の配列（潜在性膜タンパク質２Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ１ＨＶＪ２）の一部または全部を対象とする。

１つの実施形態では、ペプチドミックスまたはミックス中のペプチドの一部は、抗原ＥＢＮＡ１、２、３、４、５もしくは６の配列またはその組み合わせの一部または全部、特にＥＢＮＡ１を対象とする。

エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）は、エプスタイン・バーウイルスに関連する多機能性二量体ウイルスタンパク質である。それは全てのＥＢＶ関連悪性腫瘍で見られるＥＢＶの唯一のウイルスタンパク質であり、したがって、標的に対する重要な抗原である。それは、細胞がＥＢＶに感染した場合に取る変化した状態の確立および維持に重要である。ＥＢＮＡ１はタンパク質をアミノ末端ドメインとカルボキシ末端ドメインとに分けるグリシン−アラニン反復配列を有する。この配列はまた、タンパク質を安定化させるようであり、プロテアソーム分解を防止し、同様に抗原プロセッシングおよびＭＨＣクラスＩ拘束性抗原提示を損なう。これは、それによってウイルスに感染した細胞に対するＣＤ８拘束性細胞毒性Ｔ細胞応答を阻害する。ＥＢＮＡ１転写領域は潜伏期ＩおよびＩＩの間にＱｐプロモーターで始まる。それは、第１潜伏期の間に発現される唯一のウイルスタンパク質である。ＥＢＮＡ１ｐｅｐｍｉｘはＨＬＡクラスＩＩ限定細胞毒性ＣＤ４Ｔ細胞を活性化する。

１つの実施形態では、ペプチドミックスまたはミックス中のペプチドの一部は、抗原ＢＡＲＦ１の配列（ＢａｍＨＩＡ右方向リーディングフレーム１、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ７７７Ａ５）の一部または全部を対象とする。

ＢＡＲＦ１は、ＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩ−Ａフラグメント中に位置するＢＡＲＦ１遺伝子によってコード化される２２１のアミノ酸タンパク質である。ＢＡＲＦ１は、様々なＥＢＶ関連類上皮悪性腫瘍で、例えばＮＫ／Ｔリンパ腫およびバーキットリンパ腫で発現される。

他の潜在的なＥＢＶ抗原としてはＬＰおよびＢＨＲＦ１が挙げられる。

ワクシニアウイルスの主なビリオン／エンベロープタンパク質は、PNAS January 7, 203 vol 100 no. 1 page 217-222 (Drexler et al)で記載されている。これらには、Ａ１０Ｌ（主要コアタンパク質ｐ４ａ）、Ｈ３Ｌ（ヘパリン結合タンパク質）、Ｃ７Ｌ（宿主域タンパク質２）、Ｄ８Ｌ（細胞表面結合タンパク質）、Ｂ２２Ｒ（未知の機能）およびＧ５Ｒ（未知の機能）が含まれる。

水痘帯状疱疹ウイルス免疫原としては、ｇＥ、ＯＲＦ１０、ＩＥ６１、ＩＥ６２およびＩＥ６３が挙げられる。

上述の特異的標的抗原の各自からのペプチドは、プロセスのステップａ）および／またはステップｂ）で独立して用いることができる。

一般的に、ステップａ）およびステップｂ）でのＴ活性化のための一次シグナルを提供する目的で使用または発現されるエピトープ／抗原／ペプチドの一部または全部は両ステップに共通している。

ペプチドは標的抗原の一部または全部を対照とすることができ、例えば重複して、免疫学的に関連した方法でエピトープのアミノ酸を提示する機会を増加させることができる。代替的または付加的に、既知エピトープのペプチドが含まれる可能性があり、必要に応じて過剰提示され得る。つまり、さらに有意なパーセンテージの提示されたペプチドであり得る。

ＨＩＶ中の抗原としては、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｇｐ１８０、ｇｐ１２０などが挙げられる。

本明細書中で用いられる「抗原の配列の一部または全部を対象とする」とは、ペプチドと完全長抗原の関連する部分との間には同一性または重要な類似性がある、例えばペプチドは抗原の隣接する領域と実質的に同一であるという事実を指すものである。

本明細書中で用いられるエピトープを提示するように選択されるとは、エピトープの直線状配列が既知であり、ペプチドミックスに含まれる（すなわち、ペプチドは既知エピトープをコード化するように選択される）または、例えば抗原配列がエピトープマッピングされていない場合は、ペプチドは重複する方法で配列の一部または全部を対象とし、１つ以上の適切なエピトープを提示する機会を最大にするように設計されるという事実を指すものである。もちろん、これらの２つの戦略の混成を所望により用いることができ、例えば既知エピトープはペプチド混合物中でさらに高度に反復し得る。

１つの実施形態では、ミックス中のペプチドは、１つ以上の、例えば１、２、３、４またはそれ以上の関連するウイルス抗原由来である。

１つの実施形態では、ペプチドミックスは、少なくともＬＭＰ１およびＬＭＰ２由来の配列を含むか、または少なくともＬＭＰ１およびＬＭＰ２由来の配列からなる。

加えて、１つの実施形態では、ＥＢＮＡ１および／またはＢＡＲＦ１を抗原混合物に添加して、ウイルス抗原の突然変異または下方制御による免疫回避の機会を減少させる。

本明細書中で用いられるペプチドは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短鎖ポリマーを指すものであり、この場合、ペプチドは少なくとも２であるが、一般的には５０以下のアミノ酸を含有する。

用いられるペプチドは、１つ以上の直線状エピトープを提示するために充分長く、例えば平均で７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長である。

１つの実施形態では、混合物のペプチドのいくつかは重複する（単一抗原の配列に関連して）、つまり、それらは単一抗原由来であり、フラグメントの一部または親配列由来のアミノ酸のおよびある配列がミックスの１より多いペプチドフラグメントで生じるように配置される。ペプチドの重複は、アミノ酸配列において重複があることを意味する。しかしながら、この方法は、適切な方法で、特にエピトープマッピング情報が親抗原に利用可能でない場合、親抗原由来のエピトープを提示する機会を最大にする。

１つの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸が各ペプチド中で重複する。

１つの実施形態では、各タンパク質のアリコート中のペプチドは１５アミノ酸長であり、１１のアミノ酸が重複するので、全ての潜在的なＨＬＡクラスＩエピトープがタンパク質から提示され得る。ペプチドはさらに長い可能性があり、例えば１５が重複する２０のアミノ酸または２５が重複する３０のアミノ酸であり得る。

好適なペプチド配列の例には、一緒に提出された配列表中のものが含まれる。

１つの実施形態では、ペプチドミックスは、２〜１０００個のペプチド、さらに詳細には２〜５００、例えば２〜４００、２〜３００、２〜２００または２〜１００、たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００またはそれ以上のペプチドを含むか、またはこれらのペプチドからなる。

ステップａ）のペプチド、あるいはステップａ）もしくはｂ）で抗原特異的樹状細胞を作成するために用いられるかまたはプロセスのステップｂ）の抗原提示細胞を調製するために用いられるペプチドは、独立して前記基準に基づいて選択される。しかしながら、用いられるペプチドあるいは用いられる樹状細胞および／もしくは抗原提示細胞などの材料の一部または全部またはが同じエピトープの一部または全部でパルスされるプロセスが最も効率的である。この状況で、ステップｂ）は次いでステップａ）で生じる応答を強化し、増大させる。

前述のペプチドミックスはさらに、プロセスのステップｂ）におけるいくつかの実施形態で用いられる抗原提示Ｔ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）を生成させるためにも用いることができる。抗原提示Ｔ細胞を調製するために、それらを後述するＰＢＭＣから生成させ、そして関連するペプチドミックスでパルスし、例えばペプチドを各ペプチドライブラリについて１〜１００ｎｇペプチド／１５×１０^６Ｔ−ＡＰＣで添加する。

本明細書中で用いられる各ライブラリは、各抗原について作成されるペプチドを指す可能性がある。

１つの実施形態では、抗原提示細胞は自己由来である。

活性化Ｔ細胞はＨＬＡクラスＩを発現し、クラスＩＩ抗原をＣＤ８０およびＣＤ８６（一時的）と同様に上方制御する。

１つの実施形態では、ペプチドでパルスして特異的Ｔ−ＡＰＣを提供した後、後者を照射して、それらがステップｂ）で用いられる場合にそれ以上増殖しないことを確実にする。

照射は、ガンマ放射線源またはＸ線源を用いて実施することができる。

１つの実施形態では、９〜１４日に、約５×１０^７のステップａ）からのレスポンダーＴ細胞を、５×１０^７の照射されたＴ−ＡＰＣおよび５×１０^７のａＫ５６２で、Ｇ‐Ｒｅｘ（商標）５００中ＩＬ−１５を含有する培地４００ｍｌ中で最高１４日まで刺激する。

ＵＳ２００３／０１４７８６９は、その中で記載されるａＫ５６２細胞を操作して、それらを抗原提示細胞にすることができることを開示している。これらの細胞は、理論的には相当数で発現させることができる。これらはステップｂ）のＴ−ＡＰＣの代替物として用いることができると考えることができる。しかしながら、これらのａＫ５６２抗原提示細胞はＨＬＡを発現せず、それらが発現したとしても、ＨＬＡ表現型はエフェクターＴ細胞制限パターンと一致せず、それらはアロ抗原特異性Ｔ細胞を活性化する。本発明者らはＨＬＡを発現する細胞の非存在下で、関連する標的Ｔ細胞集団の活性化は弱いことを見出した。理論的に、これらのａＫ５６２細胞はＨＬＡを発現するように操作することができるが、これはそれぞれの場合に患者に適合させる必要があり、それによってプロセスをいたずらに複雑かつ高価にする。

７，１９６のＨＬＡ対立遺伝子がある。これらは、（２つの染色体上の）それぞれについて６つのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子および６つのＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子に分けることができる。それらを任意の方法で混合し、適合させることができ、したがって、（１）すべての潜在的なＴ細胞を復活させ、そして（ｂ）アロ反応性を誘導しないようにＨＬＡ対立遺伝子の適切な組み合わせをａＫ５６２細胞に導入することは、現時点では不可能である。

本発明によるＴ−ＡＰＣは平均で少なくとも１つの標的抗原由来エピトープを提示し、例えば２、３、４、５、６またはそれ以上のエピトープを提示し得る。

１つの実施形態では、Ｔ−ＡＰＣは、１より多い標的抗原、例えば２、３、４またはそれ以上の標的抗原からエピトープを提示する。

１つの実施形態では、ステップａ）から得られる細胞：Ｔ−ＡＰＣの比は、４：１〜１：２の範囲内、例えば１：１である。高率のＴ−ＡＰＣは増殖の効率を最大にする。通常、樹状細胞をそのような高率で生成させることは困難であり、このことは、樹状細胞で関連するＴ細胞集団の増殖にかかる時間は、抗原提示細胞での増殖にかかる時間よりも長い可能性があることを意味する。樹状細胞の数が非常に低い数例では、増殖は全く起こり得ない。したがって、ステップｂ）で抗原提示細胞を用いるプロセスは、増殖にかかる時間がより短く、したがってより効率的なプロセスを提供する点で有利であり得る。

したがって、１つの実施形態では、Ｔ−ＡＰＣを本発明の方法のステップｂ）で用いる。

本発明のプロセスでのＴ−ＡＰＣの使用は、先行技術プロセスにおけるＬＣＬの使用に取って代わる。ＬＣＬ細胞系は生ＥＢＶウイルスでの感染によって不死化される。本発明のプロセスでＬＣＬの使用を回避することは大きな利点である。

アデノウイルスベクターでの感染によって他のウイルス抗原を提示するように操作されるか、またはペプチドでパルスしたＬＣＬは、有効な第２刺激を提供し得るが、弱い抗原については、それぞれベクターおよびＬＣＬからのアデノウイルスおよびＥＢＶタンパク質はどちらも熾烈な競争を生むので、最終ＣＴＬ産物の主成分が多くの場合、アデノウイルス、またはＬＣＬで発現されるが２型潜在腫瘍（リンパ腫およびＮＰＣ）では発現されない優性ＥＢＶ抗原について特異的である。

ステップｂ）での単純なペプチドの使用は実行可能とは思えない。なぜなら、本発明者らの経験では、ペプチドミックスをステップａ）から得られるＣＴＬに提示することは、単に細胞を「混同」し、結果としてそれらの表面上でそれらはペプチドを提示するからである。この結果、次いで、ＣＴＬは互いに標的となり、それらは自身を破壊し始める。これは、プロセスを実施する目的に明らかに望ましくなく、また目的に反する細胞枯渇を引き起こす。

１つの実施形態では、ステップｂ）は１回より多く、例えば充分な数の関連する抗原特異的Ｔ細胞集団が得られるまで、２、３、４、５回またはそれ以上実施される。

充分な数は、例えば標的ウイルス感染および／または標的関連ガンに対する患者の免疫応答をインビボで増殖させ続けるため、そして刺激するために充分な細胞であり得、たとえば１〜９０×１０^３、１〜９０×１０^４、１〜９０×１０^５、１〜９０×１０^６、１〜９０×１０^７、１〜９０×１０^８またはそれ以上の細胞、たとえば８０×１０^７の細胞であり得る。

１つの実施形態では、細胞がステップｂ）に充分に増殖しない場合、細胞が：
（１）ペプチドパルス化照射自己活性化Ｔ細胞および照射共刺激ａＫ５６２細胞、
（２）血液バンク承認同種異系ドナー由来の照射ＰＢＭＣおよび／または
（３）分裂促進量以下の抗ＣＤ３；１〜１００ｎｇ／ｍＬ、例えば５０ｎｇ／ｍＬ
でさらなる刺激を受け得るプロセスが提供される。

Ｔ−ＡＰＣはプロフェッショナル抗原提示細胞でない。したがって、Ｔ−ＡＰＣによって提供される抗原提示に加えて、Ｔ細胞増殖および分化を刺激するためには共刺激因子が必要である。

本明細書中で用いられる人工の共刺激因子は、例えば共刺激因子およびＴ−ＡＰＣ抗原提示シグナルが一緒になって特異的方法で増殖する自己Ｔ細胞を刺激または促進する場合、Ｔ細胞活性化シグナルを提供してＴ−ＡＰＣ抗原提示シグナルを補足するために培養物に添加される、すなわち、それらが標的抗原について特異的であるように増殖する際に細胞の標的集団を刺激する外因性因子であり、この場合、特異性態様はＴ−ＡＰＣによって誘導される。外因性因子は、添加しないと培養物中に存在しない、または細胞培養物中に存在する自然発生的量が少なく、外因性量の因子の添加によって増大させられる因子である。

ＣＤ８０／８６を有するビーズを補因子として用いることができる。抗ＣＤ２８（ＣＤ８０／８６のリガンド）および抗４−１ＢＢを有するビーズが利用可能であるが、それらは抗ＣＤ３も含有し、これは所望の抗原によって媒介される増殖の特異性を排除する。したがって、抗ＣＤ３の非存在下での抗ＣＤ２８（ＣＤ８０／８６のリガンド）および抗４−１ＢＢを有するビーズは、本開示の態様を形成する。

１つの実施形態では、人工の共刺激因子は、特定のタンパク質（複数可）をその表面上またはその表面と関連して発現するように操作された細胞または細胞系（細胞の表面上のある抗体の結合については、ＵＳ２００３／０１４７８６９を参照のこと）、例えばＨＬＡ陰性細胞系であり、共刺激分子を発現するように遺伝子操作されたもの、たとえばＵＳ７，７４５，１４０で開示されるａＫ５６２細胞系である。後者のような細胞系を本発明のプロセスで用いて、長期にわたる共刺激シグナルを得ることができる。

したがって、１つの実施形態では、ａＫ５６２などの細胞系はＨＬＡを発現しない。

したがって、１つの実施形態では、ａＫ５６２などの細胞系は抗原を発現しない。

本明細書中で用いられるａＫ５６２細胞は、ＵＳ７，７４５，１４０で記載される元の細胞系を指す可能性がある。しかしながら、本発明のプロセスの目的のために、一般的には、抗ＣＤ３抗体はその表面上のＦｃγ受容体上にロードされない。好ましくは、本明細書中で言及されるａＫ５６２細胞は、その表面上に、特に抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体および４−１ＢＢＬを含む群から独立して選択される、少なくとも１つ、たとえば１、２、３または４個の共刺激因子を含む元のａＫ５６２細胞系の誘導体である。

１つ以上の補因子は、Ｔ細胞のアポトーシスの減少および例えば約７〜１０の細胞分裂の増殖サイクルの誘発に関与し得る。

細胞は、その表面上で共刺激因子を発現するように操作され、共刺激因子はＴ細胞の刺激（活性化もしくは分化）または生存に重要であり、抗原提示細胞の表面上の抗原の提示によって生じるシグナルを補足するシグナルを提供する。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４−１ＢＢ−リガンドおよびそれらの組み合わせ、例えばその１、２、３、または４つを含む群から選択される細胞系表面上で発現され得る分子の例。４つの要素は、一緒になって強力な共刺激シグナルを提供する。

１つの実施形態では、ａＫ５６２細胞はＯＸ−４０リガンドをその表面上でさらに発現する。

これらの細胞は前述のＴ−ＡＰＣと一緒に作用して、Ｔ細胞活性化に必要なすべてのシグナルを提供する。

ＣＤ８０およびＣＤ８６は、ヒトにおいて約８０％の末梢Ｔ細胞上に存在する表面糖たんぱく質であるＣＤ２８と結合する。Ｔ細胞受容体の活性化と組み合わせて、この結合はＴ細胞の強力な刺激を提供する。さらには、Ｔ細胞受容体連結とあわせてそのリガンドに対するＣＤ２８（Ｔ細胞上）結合は、ＩＬ−２の産生を誘導する。

１つの実施形態では、ステップｂ）における培養は、内因性ＩＬ−２のみを含む。

別法として、人工の共刺激因子は、例えばＣＤ２８を標的とする抗体などの関連する受容体のアゴニスト抗体であり得る。これらの抗体は、培地中に直接もしくはビーズに結合させて提供され得るか、または細胞系（たとえばａＫ５６２）の表面に結合させることができる。これは、参照によって本明細書中に組み込まれるＵＳ２００３／０１４７８６９で詳細に記載される。

ビーズ上に補因子を提供することは、最も効率的な抗原特異的増殖を可能にすることに至らない。したがって、１つの実施形態では、補因子は、ａＫ５６２細胞などの細胞上または細胞と関連して発現される。

本発明のステップｂ）で用いられるこの人工の共刺激細胞（たとえばａＫ５６２）細胞は、新規で驚くべき機構によって作用するようである。本開示のプロセスは、抗原提示を細胞上に提供することができ、そして共刺激を異なる細胞によって提供してＴ細胞を刺激し、活性化することができることの初めての証拠である。抗原特異的Ｔ細胞を生成する関連で、これは非常に驚くべきことである。なぜなら、過去の慣例では、一般的に、ａＫ５６２細胞は、ＨＬＡ分子またはＴ細胞受容体を標的とする抗体を発現するように操作され、Ｔ細胞受容体によって媒介されるシグナルおよび共刺激シグナルが１つの細胞によって提供されるインビボ系をモデル化する（すなわち、接触は、２つの細胞間であり、例えば、ＴＣＲ連結とあわせたＴ細胞上のＣＤ２８ライゲーションはＩＬ−２の産生を誘導し、これは継続した増殖を誘発する；June et al 1994, Jenkins et al 1993 and Schwartz 1992）。したがって、ＭＨＣクラス１Ａ２およびＡ３を発現するあるａＫ５６２細胞系が確立された；Britten, C.M.; Meyer, R.G.; Kreer, T.; Drexler, I.; Wolfel, T.; Herr, W. (2002), "The use of HLA-A*0201-transfected aK562 as standard antigen-presenting cells for CD8(+) T リンパ球s in IFN-gamma ELISPOT assays", Journal of Immunological Methods 259 (1-2): 95-110, and Clark, R.E.; Dodi, I.A.; Hill, S.C.; Lill, J.R.; Aubert, G.; Macintyre, A.R.; Rojas, J.; Bourdon, A. et al. (2001), "Direct evidence that leukemic cells present HLA-associated immunogenic peptides derived from the BCR-ABL b3a2 fusion protein", Blood 98 (10): 2887-93。したがって、ある実施形態において、ａＫ５６２細胞などの共刺激細胞は、効果的には自律的共刺激因子（第三者共刺激因子）であり、これはＴ−ＡＰＣとあわせて標的Ｔ細胞集団の抗原特異的増殖を刺激する。理論的にはＦｃ受容体を発現し、抗ＣＤ３抗体（そのようなＯＫＴ３抗体）でロードすることができるａＫ５６２細胞は、抗原独立性活性化シグナルを提供するために、少なくとも１つの実施形態で本発明のプロセスにおいて用いることができるが、ａＫ５６２（または操作された細胞）は抗ＣＤ３抗体でロードされない。なぜなら、一般的に非特異的シグナルは望ましくないからである。

本開示はさらに、自己Ｔ細胞などのＴ細胞の増殖において抗原提示と無関係の人工の共刺激シグナルを提供するための、ａＫ５６２細胞などの操作された細胞系の使用にも及ぶ。

したがって、１つの実施形態では、プロセスは、ステップｂ）における細胞の集団を増殖させるプロセスが、（１）Ｔ−ＡＰＣ（２）後者をパルス／ロードするためのペプチドおよび（３）抗原特異性提示性質がない共刺激分子のみを発現するように形質導入されたａＫ５６２細胞だけに依存するという状況で驚くべきであることでさらに特徴づけられる。記載されるこのプロセスは、ａＫ５６２細胞が特異的抗原を提示するように操作されていないという事実にもかかわらず、抗原特異性（増殖プロセス中に抗原特異性Ｔ細胞の増加するパーセンテージによって測定される）に基づいて増殖を達成する。このステップで他のＡＰＣ（たとえばＤＣ）を添加しない場合、増殖プロセスはしたがって、標的抗原の提示に関して第１シグナル活性化を達成するためにＴ−ＡＰＣに依存する。これはまれである。なぜなら、Ｔ−ＡＰＣは抗原提示および共刺激の両方に関して準最適とみなされるからである。共刺激を提供するため、および増殖を増強するためのａＫ５６２細胞の役割を前述したが、先の証明は、ａＫ５６２細胞は特異的抗原を提示するように操作されなかったので、抗原特異性の減少という代償を払った一般的なＣＤ３＋Ｔ細胞増殖を示した。本発明では、抗原特異性は増殖とともに増加し、このことは、第１シグナル抗原認識ステップが、ａＫ５６２細胞からの第２シグナル共刺激と相乗的に作用するＴ−ＡＰＣによって達成されることを示す。抗原提示および共刺激シグナルのこの分岐は、第１シグナルおよび第２シグナルが同じＡＰＣから送達される抗原特異性Ｔ細胞増殖の現在受け入れられているパラダイムに反する。

１つの実施形態では、本発明は、第１細胞（または細胞の集団）および第２の異なる細胞である人工の共刺激因子上の抗原提示を用いる抗原特異的Ｔ細胞増殖を刺激および活性化する方法を提供する。

１つの実施形態では、ａＫ５６２細胞系などの操作された細胞系は、本開示の方法で使用する前に、例えばＸ線源のガンマ放射線源で照射される。

操作された細胞系、たとえばａＫ５６２細胞系は凍結形態で提供してもよく、この場合、細胞の照射は凍結後に実施してもよい。

１つの実施形態では、ＣＴＬ：共刺激因子の比（例えば補因子が細胞系である場合）は、それぞれ２：１〜１：１０比、たとえば１：５である。

ＣＴＬ：抗体：共刺激細胞の好適な比は、１：１：０．２〜１：１：１０の範囲内、たとえば１：１：５である。

有利には、Ｔ−ＡＰＣおよび人工の共刺激因子、たとえば操作された細胞を用いる方法は、先行技術の方法と比較して、抗原特異的Ｔ細胞増殖において改善されたレベルを提供し得る。

ステップａ）および場合によってステップｂ）で用いられるサイトカイン（複数可）はＴ細胞成長もしくは分化を刺激および／または活性化するために適切でなければならないか、あるいはＴ細胞生存などを促進するなど他の有用なある機能を果たさなければならない。

本開示のプロセスで用いることができるサイトカインとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５が挙げられる。

１つの実施形態では、本開示によるプロセスで用いられるサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−７およびＩＬ−１５、たとえばそれらの組み合わせから独立して選択される。

１つの実施形態では、ステップａ）において、用いられるサイトカインはＩＬ−４および／またはＩＬ−７である。理論によって拘束されることを望まないが、本発明者等はこれらのサイトカインがウイルス抗原特異的細胞の発生頻度、レパートリー、および増殖に関して役割を担うと考える。

１つの実施形態では、ＩＬ−２がステップａ）で用いられる場合、それははじめではなく約３日または４日の培養で添加される。

Ｔ細胞のレパートリーは、各ペプチドが２つのプールで独自に表されるように、プールに等分されたペプチドアリコートで刺激した後にＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定することができる（Kern, F., N. Faulhaber, C. Frommel, E. Khatamzas, S. Prosch, C. Schonemann, I. Kretzschmar, R. Volkmer-Engert, H. D. Volk, and P. Reinke. 2000. Analysis of CD8 T cell reactivity to cytomegalovirus using protein- spanning pools of overlapping pentadecapeptides. Eur J Immunol. 30:1676-1682 and Straathof, K. C., A. M. Leen, E. L. Buza, G. Taylor, M. H. Huls, H. E. Heslop, C. M. Rooney, and C. M. Bollard. 2005. Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma. J. Immunol. 175:4137-4147）。

１つの実施形態では、ステップｂ）において、用いられるサイトカインはＩＬ−１５である。理論によって拘束されることを望まないが、本発明者等は、ＩＬ−１５が関連するＴ細胞集団に対して生存促進性効果を有すると考える。

１つの実施形態では、ステップｂ）で用いられるサイトカインはＩＬ−１５である。

ＩＬ−１５などのサイトカインは培養の間、例えば毎週２回置換してもよい。

１つの実施形態では、本明細書中の実施形態のいずれか１つで記載される特定のサイトカインだけが用いられる。

ＩＬ−１２はＴｈ１集束（ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）で役割を担い、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２が望ましい場合には外因性ＩＬ−１２は除外することができる。１つの実施形態では、本開示のプロセスは外因性ＩＬ−１２を用いない。しかしながら、本発明のＴ細胞産物に関連して、ＣＤ４＋集団におけるＴｈ１応答が望ましいと考えられる。

外因性サイトカインは必要に応じて、細胞が培養系に移される時または所与のステップの最初で同時に添加するなど、プロセスの任意の段階で添加することができる。後者はステップａ）および／またはステップｂ）に当てはまる。

ステップａ）および／またはステップｂ）における外因性サイトカインの存在は、別法としてステップの途中で、例えばステップが開始された後１、２３、４日またはそれ以上で添加してもよい。

１つの実施形態では、本開示のプロセスを用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団、例えばＴｈ１集団を含む細胞集団を提供する。本明細書中で用いられるＴｈ１集団はＣＤ４＋集団を指すものであり、この場合、細胞の５％以上、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％またはそれ以上がＴｈ１と分類される。

Ｔｈ１細胞は、他の機能のなかでも、一般的にマクロファージの死滅効果および細胞毒性ＣＤ８＋細胞の増殖を最大にする。

記憶Ｔ細胞はＴｈ１細胞の下位範疇である。

１つの実施形態では、プロセスから得られる細胞の集団は、記憶Ｔ細胞の亜集団を含む。理論によって拘束されることを望まないが、我々は、プロセスから得られるＴ細胞の実質的な部分が出発集団の記憶部分から誘導されると考える。

１つの実施形態では、ＩＬ−２をステップ（ａ）では用いない。なぜなら、このサイトカインによって促進される増殖は非常に非特異的であり得、ＮＫ細胞、望ましくない機能／特異性のＴ細胞および細胞中である量のアネルギーを産生し得るＴ調節細胞の増殖をもたらし得るからである。したがって、１つの実施形態では、培養中に存在する唯一のＩＬ−２は内因性ＩＬ−２である、すなわちそれは細胞によって分泌される。

１つの実施形態では、ＩＬ−２はステップ（ｂ）で用いられない。なぜなら、それはＩＬ−１５よりもさらに分化された表現型を促進し得るからである。

本明細書中で用いられるアネルギーは、抗原刺激に対する細胞の反応性が無いことを指すものである。アネルギーは、機能分析、例えば関連する細胞集団によるインターフェロンガンマ分泌を用いて測定することができる。完全機能（非アネルギー性）細胞よりも低レベルのインターフェロンガンマ分泌はアネルギーの程度を示すものであり得る。もちろん、細胞におけるアネルギーの程度が大きいほど、特定の（マーカー）機能は低い。

上述のように、アネルギーは増殖された産物に関連して、１つ以上の関連した方法で低下した細胞機能を指す総称である。この用語は、細胞枯渇、例えば細胞がもはや分裂できない場合を包含する。細胞はその後老化現象を示すと見なされる。複製に必要な染色体の末端上のＤＮＡの保護的部分であるテロメアが短くなり、各コピーが最終的に消滅するので、細胞は分裂を停止する。

細胞の表面上に発現されるそのＰＤ−１（プログラムされた細胞死タンパク質１；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５１１６）はアネルギーのマーカーであると考えられる。１つの実施形態では、１０％未満、例えば９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５％以下の関連する増殖したＴ細胞集団、例えば約１％がＰＤ−１を発現する。

再発性ＮＰＣがある患者などのＴ細胞において高レベルのアネルギーを有する患者では、ＬＭＰ／ＥＢＮＡ１特異的Ｔ細胞の発生頻度は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１に対する遮断抗体、すなわち受容体に対するリガンド結合からのシグナル伝達を遮断する遮断抗体の存在下で増加し得る。

この現象は健常なドナーでは見られず、このことは２型潜在抗原特異的Ｔ細胞がＮＰＣ患者ではアネルギー性であり得ることを示唆する。

本明細書中で用いられる標的抗原は、特定のウイルス、例えばＥＢＶなどの治療標的に対してＴ細胞において特異性を生じさせるために用いられる抗原を指すものである。したがって、標的ウイルスまたはガン細胞によって感染した細胞は、通常、標的抗原を発現し、したがってそれら自体が免疫系によるクリアランスの標的になる。

１つの実施形態では、増殖させたＴ細胞の集団はバランスＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団である、すなわち、細胞集団はＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の両方を含むが、必ずしも等量で含む必要はない。本明細書の文脈でバランスがとれたとは、集団ＣＤ４＋またはＣＤ８＋の一方が増殖中に枯渇しないことを意味するために用いられる。

本開示のプロセスを用いて増殖させる細胞集団は、所望のＴ細胞集団を含み、一般的には所望の集団だけからなるものではない。患者に投与される最終製品は、プロセスがその増殖を標的としなかった多くの他の細胞を含み得る。１つの実施形態では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の所望の集団は、細胞の全集団の約６０％以下を含む。細胞集団の発生頻度はガンマ−ＩＦＮ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、または多量体（例えば４量体）染色を用いて測定することができ、どちらも当業者には知られている。

１つの実施形態では、プロセスから得られるＴ細胞集団はスペクトラタイピング（ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｉｎｇ）によって分析した場合、多様であるが、優性クローンの出現はない。つまり、出発試料中のＴ細胞多様性は増殖されたＴ細胞で実質的に表される。すなわち、増殖は一般的にモノクローナルまたはオリゴクローナル標的細胞集団を提供しない。

かなりの割合、例えば３０％〜６０％の増殖された細胞は、一般的に、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＤ４５ＲＯを含むエフェクター記憶マーカーを発現する。

本開示による抗原特異的Ｔ細胞の５０％以上、例えば６０、７０、８０、９０または９５％が、増殖プロセスで用いられた抗原を発現する標的細胞を殺すことができる可能性があると予想される。

我々は、ＡｄベクターおよびＬＣＬを使用する２８〜６３日のＬＭＰ−Ｔ細胞培養と比べて、１６〜２４日の範囲のＴ細胞培養を考慮する本開示の方法を用いる２つの刺激を用いて、患者の治療に必要な最高の細胞量に対してさえも充分な細胞を調製することができると考える。

その上、本発明のプロセスによって産生される細胞は、先行技術プロセスによって調製される細胞と比較して、より特異性である点、より高いレベルのガンマインターフェロンを産生する点、および／またはより低いレベルのアネルギーマーカーを発現する点で有利であり得る。

１つの実施形態において、ガン患者由来のアネルギー性Ｔ細胞は、成長が悪い可能性があり、３回の刺激を必要とする可能性がある。３回目の刺激は追加の刺激成分を含み得る。この時点で細胞の大部分は特異的であるはずなので、望ましくない細胞の増殖に関する懸念はない。

１つの実施形態では、第３の刺激培養物は、（１）ペプチドパルス化照射自己活性化Ｔ細胞、（２）ａＫ５６２細胞などの照射された共刺激細胞系、（３）血液バンク承認同種異系ドナー由来の照射されたＰＢＭＣおよび（４）分裂促進量以下の抗ＣＤ３；１〜１００ｎｇ／ｍＬ、例えば５０ｎｇ／ｍＬを含むであろう。

１つの実施形態では、１以上の試験、例えばインターフェロンガンマＩＣＳ（細胞内（ｉｎｔｒｅａｃｅｌｌｕｌａｒ）サイトカイン染色）および／またはインターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施して、治療法において用いられる細胞の適合性を立証する。

１つの実施形態では、適合性試験は単一のフローサイトメトリーアッセイに組み込まれる。

１つの実施形態では、非特異的死滅に関する^５１Ｃｒ放出アッセイを実施するが、これは一般的に適合性アッセイの一部を形成しない。

１つの実施形態では、バッチ放出試験を表１に提示する：

本開示のプロセスはウェルまたは容器中で実施することができるが、最も好適には、ガス透過性システム中で実施される。本明細書中で用いられる容器は、細胞、培地などを保持するために好適な任意の種類の容器、例えば注入型バッグ（ガス透過性部分を備える）などのバッグ、またはＧ‐Ｒｅｘ（商標）システムなどの硬質容器を指すものである。ガス透過性層は細胞の急速な増殖を促進し、必要とされる培地交換の回数を最小限に抑える。

１つの実施形態では、ステップａ）はＧ‐Ｒｅｘ（商標）１０システム中で実施される。Ｇ‐Ｒｅｘ（商標）１０システムは１×１０^８までのＴ細胞を培養するのに適している。

１つの実施形態では、ステップｂ）はＧ‐Ｒｅｘ（商標）１００システム中で実施される。

参照することによって本明細書中に組み込まれるＷＯ２００５／０３５７２８は、ガス透過性容器を調製する方法を記載する。１つの実施形態では、シリコーンガス透過性材料が用いられる。

１つの実施形態では、用いられるシステムは、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｏｌｆから得られるＧ‐Ｒｅｘ（商標）システムである。１つの実施形態では、システムは、参照することによって本明細書中に組み込まれる米国仮出願番号第６１／５５０，２４６で記載されるような無菌調製を提供するのに適している。

一般的に、システムに表面積１ｃｍ^２あたり約５０万細胞を播種する。１０ｃｍ^２の表面積を有するＧ‐Ｒｅｘ（商標）−１０で、最低５００万で２０００万までの細胞を播種する。

１つの実施形態では、ステップ（ａ）において、２０００万個の細胞をＧ‐Ｒｅｘ（商標）−１０中に播種し得る。ＰＢＭＣ内で、１％未満の細胞はペプチドについて特異的であり、したがって最大でも２０万の特異的細胞が播種される。残りのＰＢＭＣはフィーダー細胞として作用する。

１つの実施形態では、ステップ（ｂ）で、５０００万の照射されたａＫ５６２細胞＋１０００万個のペプチドパルス化活性化照射Ｔ細胞および１０００万個のエフェクターＴ細胞をＧ‐Ｒｅｘ（商標）−１００（１００ｃｍ^２）中に播種する。この場合、エフェクターＴ細胞だけが増殖する。

１つの実施形態では、本開示はプロセスから直接得られる細胞組成に及ぶ。

１つの実施形態では、本開示によるプロセスは、患者のために少なくとも２つの個別の用量を提供するために充分なＣＤ３＋細胞を生成する。

本発明はさらに、本明細書中で開示される方法によって調製される細胞集団の同じ望ましい特性を有する組成物にも及ぶ。

したがって、１つの態様において、本開示は、ウイルスなどの標的抗原に対して特異的なＴ細胞の集団を含むように、インビトロで増殖させた自己Ｔ細胞集団を提供し、この場合、集団は標的ウイルス汚染およびウイルスベクターに対する応答が実質的にない。

本発明のプロセスはさらに、ペプチドミックスでパルスした樹状細胞の調製および、特に本明細書中で記載される抗原特異的Ｔ細胞集団の増殖で使用するためのそれから得られる細胞集団にも関する。

本発明のプロセスはさらに、ペプチドミックスでパルスしたＴ−ＡＰＣを調製するプロセスおよびそれから得られる細胞集団にも関する。

本開示はさらに、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞の集団を含む本明細書中で記載される自己Ｔ細胞集団にも関し、この場合、抗原はウイルス感染細胞またはガン細胞に関連する。

１つ以上の実施形態において、本開示による細胞集団は、先行技術の方法によって調製される細胞と比較して１つ以上の有利な特性を有する。

１つの実施形態では、関連するＴ細胞集団中の細胞の平均細胞直径は１０〜１４μＭである。

有利には、本発明の細胞培養物は、注入後に一般的に低い毒性を起こし、例えば炎症応答、細胞損傷、インフルエンザ様症状、吐き気、脱毛などのごくわずかな毒性不耐性応答しか伴わない。

本開示に関連する細胞集団はさらに、有利な特性、例えば高レベルのインターフェロンガンマ発現も提供する。

本明細書中で用いられる高レベルのインターフェロンガンマ発現とは、平均で、現行の方法によって調製される細胞集団は、先行技術の方法によって調製される細胞よりも高レベルのインターフェロンガンマを発現する可能性があり、そして患者から得られるもとのアネルギー性細胞よりも高レベルのインターフェロンガンマを確実に発現するという事実を指すものである。

１つの実施形態では、本開示の細胞は、本明細書中で開示されるアッセイにおいて増強された抗原特異性を示し、例えば本開示の細胞は、先行技術の方法によって調製された細胞と比べて、抗原での刺激に反応してサイトカインを分泌するさらに高い発生頻度の細胞を含む。この図は、通常、集団について得られた値から誘導され、存在する細胞の数で割った、細胞あたりの値である平均値である。

１つの実施形態では、本開示の細胞集団は、先行技術の方法によって調製される細胞集団に対して相当する親和性（著しく異ならない）を示す。

親和性を決定するために、^５１クロムで標識され、標準的細胞毒性アッセイで標的として用いられるペプチドの希釈物で自己活性化Ｔ細胞をパルスしてもよい。最も親和性の高い（ｍｏｓｔ ａｖｉｄ）Ｔ細胞は、最低濃度のペプチドでパルスした標的細胞を殺すものである。別法として、ＩＦＮガンマ産生は、ペプチドの希釈物でのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いた基準であり得る。

１つの実施形態では、本開示の細胞集団は、先行技術の方法によって調製される細胞集団と比較して増大した標的細胞を殺す能力を示す。

１つの実施形態では、本開示によって提供されるＴ細胞集団は、標的ウイルスによって感染した細胞および／または標的ウイルスと関連するガン細胞に対する適切な免疫応答を提供するためのインビボでの増殖に有効である。

本発明はさらに、本発明による自己Ｔ細胞集団を含む組成物にも及ぶ。これらの組成物は、希釈剤、担体、安定剤、界面活性剤、ｐＨ調節または主なプロセスステップ後に細胞集団に添加される任意の他の薬剤的に許容される賦形剤を含み得る。賦形剤は一般的に、処方を安定化させる機能、半減期を延長する機能、組成物を患者のインビボ系とより適合性にする機能などを有する。

１つの実施形態では、例えば安定剤として作用し得るアルブミン、特にヒト血清アルブミンを製造後に、タンパク質安定剤を細胞培養物に添加する。処方で用いられるアルブミンの量は、１０〜５０％ｗ／ｗ、たとえば約１２．５％ｗ／ｗであり得る。

１つの実施形態では、処方はさらに、低温防腐剤、たとえばＤＭＳＯも含有する。ＤＭＳＯの量は、一般的に２０％以下、たとえば約１２％、特に１０％ｗ／ｗである。

実施形態において、本発明のプロセスは、薬剤的に許容される賦形剤、特に本明細書中で記載される賦形剤、例えば希釈剤、安定剤および／または防腐剤を添加することによって製剤処方を調製するさらなるステップを含む。

本明細書中で用いられる賦形剤は、生物学的または生理学的機能を有しないＴ細胞集団に添加されるすべての成分を対象にする総称である。

一旦、最終処方が調製されたら、それを好適な容器、例えば注入バッグまたは低温バイアル中に充填する。

１つの実施形態では、本開示によるプロセスは、Ｔ細胞集団またはその製剤処方を好適な容器、たとえば注入バッグ中に充填し、それを密封するさらなるステップを含む。

１つの実施形態では、本開示のＴ細胞集団またはそれを含む医薬組成物で満たされた容器を、保管および運搬のために凍結し、例えば例えば液体窒素の気相中で約−１３５℃にて保管する。

１つの実施形態では、本開示のプロセスは、本開示のＴ細胞集団またはこれを含む医薬組成物を凍結するステップをさらに含む。１つの実施形態では、「産物」を、制御された速度で凍結するプロセス、例えば温度を１分につき１℃低下させることによって凍結して、形成される結晶が小さく、細胞構造を破壊しないことを保証する。試料が約−１００℃に達するまでこのプロセスを続けることができる。

本開示による産物とは、培養された本開示の細胞集団またはこれを含む医薬組成物を指すものである。

１つの実施形態では、産物を凍結形態で患者の場所へ移動、輸送、運搬する。

１つの実施形態では、本開示による産物は、非経口投与に好適な形態、例えば注入、低速注射（ｓｌｏｗ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）またはボーラス注射で提供される。１つの実施形態では、処方は静脈内注入に好適な形態で提供される。

１つの態様において、本開示は、本開示による産物を製造場所、または都合のよい収集点から意図される患者の近辺まで運搬する方法を提供し、例えばこの場合、Ｔ細胞産物は輸送中０℃以下、たとえば−１３５℃で保管される。

１つの実施形態では、Ｔ細胞産物の温度の揺らぎを保管および／または運搬中にモニタリングする。

１つの実施形態では、治療、例えばウイルス関連疾患または悪性腫瘍、たとえばＥＢＶ感染、ＣＭＶ感染、アデノウイルス感染、ＨＩＶ感染、Ｃ型もしくはＢ型肝炎感染、パルボウイルス感染、インフルエンザウイルス感染、あるいはウイルス起源からのガン、例えばＥＢＶ関連リンパ腫またはガン腫、ＨＨＶ８関連肉腫、乳頭腫ウイルス関連ガン腫またはＳＶ４０関連ガンの治療で使用するための本開示の産物が提供される。

他のウイルス疾病としては、水痘帯状疱疹ウイルス感染、ワクシニアウイルス感染およびそのいずれかの合併症が挙げられる。

１つの実施形態では、治療は免疫抑制患者のものである。

１つの実施形態において、患者は免疫低下していない。

１つの実施形態では、患者を本開示による産物で治療する方法であって、治療有効量の本明細書中で定義される産物を投与するステップを含む方法が提供される。

治療有効量は、必ずしも直ちに治療上有効である量を意味するとは限らず、治療効果を提供するためにインビボでの増殖（投与後）が可能な用量を含む。

したがって、患者に、たとえば、所望の治療効果を提供するためにインビボでの増殖が可能な、増殖されたＴ細胞の治療量以下の用量である治療有効量を投与する方法が提供される。

１つの実施形態では、産生される抗原特異的Ｔ細胞集団は、ＥＢＶウイルスに対して特異的であり、ＥＢＶに感染した細胞および／またはそれに関連する臨床病理学、例えばＥＢＶ関連ガンを予防、改善または除去する。

感染の症状としては、熱、咽喉炎、およびリンパ腺の腫れが挙げられる。時には、脾臓の腫れまたは肝臓障害を呈し得る。心臓障害または中枢神経系障害が極めてまれに起こる。ＥＢＶは、個人の余生で血液中のわずかな細胞において依然として優性または潜在性であり、例えば免疫による制御が低下しているかまたは存在しない場合の免疫抑制患者で復活する可能性がある。感染は健常な免疫系を有する個体では致命的でないが、感染は免疫抑制患者では深刻な合併症および死に至る可能性がある。

ＥＢＶは感染性単核球症の原因として最もよく知られている。それは特定の形態のガン、特にホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、鼻咽頭がん、胃がんおよびＨＩＶと関連する中枢神経系リンパ腫とも関連する。最後に、ウイルスでの感染はある自己免疫疾患、特に皮膚筋炎、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、シェーグレン症候群、および多発性硬化症の高い危険性と関連するという証拠がある。

１つの実施形態では、治療の標的患者集団は鼻咽頭がんにかかっている。

１つの実施形態では、治療の標的患者集団は胃がんにかかっている。

したがって、本開示によるＥＢＶに対して特異的なＴ細胞集団は、前記状態の１つ以上の予防の治療で用いることができる。

１つの実施形態では、水痘帯状疱疹ウイルス感染および／または脳炎、肺炎、帯状疱疹後神経痛（ｐｏｓｔｈｅｒｅｐｔｉｃ ｎｅｕｒａｌｇｉａ）、帯状ヘルペス、多発性帯状疱疹（ｚｏｓｔｅｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）、脊髄炎、眼部帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ ｏｐｔｈａｌｍｉｃｕｓ）および無疱疹性帯状疱疹をはじめとするそれに関連する合併症の治療または予防の方法であって、治療有効量の、ＶＺＶに対して特異的なＴ細胞を含むＴ細胞集団を本開示にしたがって投与することを含む方法が提供される。

１つの実施形態では、ワクシニアウイルス感染および／またはそれに関連する合併症の治療または予防方法が提供される。

１つの実施形態では、少なくとも１×１０^７細胞／ｍ^２または２×１０^５／ｋｇの用量が用いられる。

１つの実施形態では、約２ｘ１０^７／ｍ^２の第１用量および２×１０^７または１×１０^８Ｔ細胞／ｍ^２の第２用量が用いられる。

１つの実施形態では、本開示は、自己抗原特異的Ｔ細胞の増殖での使用に好適な自己樹状細胞を生成させるためのウイルスまたはガン抗原（複数可）を対象とするペプチドミックスの使用を提供する。

１つの実施形態では、本開示は、抗原特異的Ｔ細胞の増殖での使用に好適な自己Ｔ−ＡＰＣを生成させるためのウイルスまたはガン抗原（複数可）を対象とするペプチドミックスの使用を提供する。

１つの実施形態では、本開示は、例えば抗原特異的Ｔ細胞、特に自己抗原特異的Ｔ細胞などの抗原特異的Ｔ細胞の増殖のためにＴ−ＡＰＣとあわせて用いられる、抗原特異的Ｔ細胞の増殖（特に、自己Ｔ細胞増殖）において付随的にその上に抗原を提示することなく共刺激因子として使用するためのａＫ５６２細胞または他の人工の共刺激因子の使用を提供する。

１つの実施形態では、ウイルスまたはガン抗原（複数可）を対象とするペプチドミックスと、人工の共刺激因子、たとえばａＫ５６２細胞とを含むキットであって、特にＴ細胞増殖、たとえば自己抗原特異的Ｔ細胞増殖で使用するためのキットが提供される。１つの実施形態では、キットはＩＬ−１５をさらに含む。

１つの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞、例えば自己抗原特異的Ｔ細胞の増殖を使用するためのウイルスまたはガン抗原（複数可）を対象とするペプチドミックスと、ＩＬ−４およびＩＬ−７とを含むキット。

プロトコルおよび実施例
略語
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＡＴＣ 活性化Ｔ細胞
ＣＴＬ 細胞溶解性Ｔリンパ球
ＤＣ 樹状細胞
ＥＢＶ エプスタイン・バーウイルス（ヘルペス科のウイルスからのウイルス）
ＬＣＬ リンパ芽球様細胞系
ＥＢＶ−ＬＣＬ ＥＢＶに感染したリンパ芽球様細胞系
ＬＭＰ１ 潜在性膜タンパク質１Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０３２３０
ＬＭＰ２ 潜在性膜タンパク質２Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ１ＨＶＪ２
ＢＡＲＦ１ ＢａｍＨＩ右方向リーディングフレームＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０３２２８によってコード化されたタンパク質
ＥＢＮＡ１ ＥＢＶ核抗原１Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０３２１１
ＰＢＭＣ 末梢血単核細胞
ＣＭＶ サイトメガロウイルス

プロトコル１：ＰＢＭＣを得るための試料のプロセッシング

以下のステップは、無菌技術を用い、安全上の普遍的注意事項にしたがって、認定を受けた生物学的安全キャビネット中で実施しなければならない。

血液試料またはアフェレーシス試料または軟膜試料（ほとんどの白血球および血小板を含有する密度勾配遠心分離後の抗凝固処理血液試料の一部である）を等体積のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはＲＰＭＩ培地（例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＲＰＭＩ１６４０）で、周囲温度（室温）にて希釈する。

５０ｍｌの遠心管中で、１５ｍｌのＬｙｍｐｈｏ−ｐｒｅｐに約３０ｍＬの希釈血液を注意深く重ねる。このステップを調節して、全ての利用可能な細胞を利用することができる。

材料を４００×Ｇで約４０分間、周囲温度にて遠心分離する。

アリコート、例えば３×１ｍｌの血漿アリコートを−８０℃にて保管してもよい。

ＰＢＭＣ界面を等体積のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはＲＰＭＩ培地（例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＲＰＭＩ１６４０）中に収集する。約４５０×Ｇで約１０分間、室温にて遠心分離し、次いで上清を吸引する。得られるペレットをほぐさなければならず、約２０ｍｌダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはＲＰＭＩ培地（例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁させなければならない。

プロセスが複数回実施される場合、細胞を１つの遠心管中に合わせ、そして充分に再懸濁させてもよい。一般的に、２０μＬの細胞を取り出し、２０μＬの５０％赤血球溶解緩衝液を添加し、そして製造業者の使用説明書にしたがって血球計を使用して計数することによって、細胞を計数する。

ＰＢＭＣを、増殖抗原特異的Ｔ細胞、ＣＤ３およびＣＤ２８活性化Ｔ細胞の増殖ならびに樹状細胞の調製で使用することができる。

注：調製されたＰＢＭＣ細胞は最終的に患者に注入されることを目的とするので、患者試料の同定および取扱いのための手順を忠実に守ることが必須である。一度に１つの患者試料しか取り扱うべきではない。一般的に、回復されるＰＢＭＣの数は０．５〜２．０×１０^６ＰＢＭＣ／ｍＬの血液の範囲内である。最高１×１０^９が軟膜から回収され得る。

参考文献：
Sili U et al Large-scale expansion of dendritic cell-primed polycolonal human cytotoxic T-リンパ球 lines using lymphoblastoid cells for adoptive immunotherapy. J. Immuother. 2003 May-Jun: 26(3): 241-56
Leen AM et al Contact-activated monocytes: efficient antigen presenting cells for the stimulation of antigen-specific T cells. J Immunother. 2007 Jan:30(1): 96-107.
Bollard CM et al The generation and characterization of LMP2-specific CTL for use as adoptive transfer from patients with relapsed EBV-positive Hodgkin disease J. Immunother.

プロトコル２：樹状ＤＥＮＴＲＩＴＩＣ細胞の生成
樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中の培養によってＣＤ１４選択されたＰＢ単核細胞（ＰＢＭＣ）の付着物（ａｄｈｅｒｅｎｔ）から分化し得る。樹状細胞を次いで、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ−１またはＰＧＥ−２（ＰＧＥ＝プロスタグランジンＥ）を用いて成熟させることができる。ペプチドをロードした樹状細胞は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子上のペプチドをＴＣＲによって抗原特異性Ｔ細胞に提示することができる。

接着性ＰＢＭＣの調製−ヘパリン添加末梢血、例えば３０ｍｌを等体積のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはＲＰＭＩ培地（例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＲＰＭＩ１６４０）中、周囲温度（室温）で希釈する。

別法として、あらかじめ凍結したＰＢＭＣを解凍し、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＤＣ培地中で２回洗浄し、そして細胞を計数する。

５０ｍｌ遠心管中で、１５ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐに約３０ｍＬの希釈血液を注意深く重ねる。このステップは全ての利用可能な細胞を利用するように調節することができる。

材料を４００×Ｇで約４０分間、周囲温度にて遠心分離する。

ＰＢＭＣ界面を等体積のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはＲＰＭＩ培地（例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＲＰＭＩ１６４０）中に収集する。約４５０×Ｇで約１０分間室温にて遠心分離し、次いで上清を吸引する。得られたペレットはほぐして約２０ｍｌのダルベッコのリン酸塩緩衝溶液中に再懸濁させなければならない。

上記ステップは実施例と同じであり、その後、材料を４００×Ｇで約５分間、室温にて遠心分離する。上清を除去し、ペレットを２０ｍＬのＤＣ培地中に再懸濁させる。

実施例１で定義されるとおり細胞を計数する。濃度が５×１０^６／ｍｌを上回る場合、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＤＣ培地を添加することによって５×１０^６／ｍｌに調節する。濃度が５×１０^６／ｍｌ未満である場合、ペレットを５×１０^６／ｍｌでＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＤＣ培地中に再懸濁させる。

７５ｃｍ^２フラスコにつき１０ｍＬの細胞または６ウェルプレートの１ウェルにつき２ｍＬの細胞を移す。

３７℃および５％二酸化炭素に約２時間移す。フラスコを１０ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはＲＰＭＩ培地で３回リンスし、ＰＢＭＣの非接着画分を含む上清を合わせた。

Ｔ−７５培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎから入手可能）については、１０００単位／ｍＬのＩＬ−４および８００単位／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含有する１０ｍＬのＤＣ培養培地を付着細胞に添加する。

６ウェルプレートについては、１０００単位／ｍＬのＩＬ−４および８００単位／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含有する２ｍｌのＤＣ培養培地を付着細胞に添加する。

フラスコを移すか、または３７℃および５％二酸化炭素のインキュベーターに蒔いた。
以前に凍結保存されていない場合、非付着細胞はレスポンダーＴ細胞の調製での将来使用のために凍結保存してもよい。

３または４日に、１０００単位／ｍＬのＩＬ−４および８００単位／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを添加する。

添加されたサイトカインの概要を表１に記載する：

培養物を次いで約２日間３７℃および５％二酸化炭素でインキュベートし、その後、樹状細胞は自己ＰＢＭＣの刺激物質として調製にすぐに使える。

樹状細胞を収集し、計数する。数回洗浄する場合は細胞が失わるので、樹状細胞数が限定される場合は、洗浄ステップを省略できることに留意すべきである。樹状細胞は分裂せず、照射の省略は重要ではない。

５×１０^５を上回る形質導入樹状細胞が回収される場合、非形質導入樹状細胞が入手可能ならば非形質導入樹状細胞とともに約１０^５を表現型決定のために送る。

５×１０^５未満の形質導入樹状細胞が回収される場合、ペプチドローディングに進む。

上清を遠心分離後吸引し、１×１０^６樹状細胞あたり５μｌ（５ｎｇ）の各ペプチドライブラリ（すなわち、各抗原について）を添加する。混合物を次いで３０〜６０分間、５％二酸化炭素インキュベーター中でインキュベートし、次いで３０Ｇｒａｙで照射する。

細胞を２０ｍｌの培地中に再懸濁させ、約５分間４００×Ｇで遠心分離する。細胞を１０^５／ｍｌにてＣＴＬ培養培地で再懸濁させる。樹状細胞はＰＢＭＣの刺激物質として今すぐ使える状態である。

実施例１と同様に、これらの細胞は患者に注入されるので、適切な手順に従わなければならない。

全樹状細胞の回収は出発集団の１〜８％でなければならない。

参考文献：
Gahn B et al Adenoviral Gene Transfer into Dendritic Cells Efficiently Amplifies the Immune Response to the LMP2A-Antigen; a potential treatment strategy for EBV virus-positive Hodgkin’s lymphoma. Int. J. Cancer 2001 Sep 1; 93(5): 706-13
Bollard CM etalThe generation and characterisation of LMP2-specific CTLs for use in adoptive transfer from patients with relapsed EBV-positive Hodgkin disease J. Immunother (1997). 2004 Jul-Aug; 27(4):317-327
Gottschalk S et al Generating CTLs against subdominant Epstein-Barr virus LMP1 antigen for the Blood 2003 Mar 1; 101(5): 1905-12.

プロトコル３：Ｔ−ＡＰＣの生成
１． 非組織培養処理された２４ウェルプレートまたはＴ−７５非組織培養処理されたフラスコをＣＤ３およびＣＤ２８抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）でコーティングする
１．１ ウェルあたり１×１０^６細胞で、またはＴ−７５フラスコあたり３０〜５０×１０^６細胞で蒔かれるＰＢＭＣ数に基づいてコーティングされるウェル／フラスコの数を算出する
１．２ ウェルについて、ウェルあたり１ｎｇのＣＤ３（０．２ｍｇ／ｍｌのストックの５μｌ／ｍＬのＨ_２Ｏ）および１ｇのＣＤ２８（０．５ｍｇ／ｍｌストックの２Ｌ／ｍＬのＨ_２Ｏ）を含有する０．５ｍＬのＨ_２Ｏを蒔く
１．３ Ｔ−７５フラスコについて、１８ｍＬのＨ_２Ｏで予洗後；フラスコあたり１８ｍｌのＨ_２Ｏ中９０μｌのＣＤ３（ストック０．２ｍｇ／ｍｌ）および３６μｌのＣＤ２８（ストック０．５ｍｇ／ｍｌ）を使用する
１．４ 少なくとも３時間、３７℃のインキュベーター中でインキュベートする
１．５ 任意に：ＣＤ３−ＣＤ２８でコーティングされたプレートを一晩４℃でインキュベートすることができる

２． ウェルまたはフラスコを洗浄する
２．１ ＣＤ３／２８溶液を取り出し、ウェルあたり１ｍＬのＰＢＳもしくは培地またはＴ−７５フラスコあたり１０ｍｌで１回リンスする

３． ３０ｍＬのＴ細胞培地（１０％ヒトＡＢ血清、４５％ＲＰＭＩ１６４０（またはアドバンストＲＰＭＩ）、４５％ＥＨＡＡおよび２００ｍＭのＬ−グルタミン）中２×１０^６でＰＢＭＣを再懸濁させる
３．１ ＣＤ３／２８でコーティングされたウェルあたり２ｍｌまたはＴ−７５フラスコに１５〜２５ｍｌに等分する
３．２ フラスコを横に倒してインキュベーターに２日間移す。

４． ２日に、１００単位／ｍＬのＩＬ−２を添加する。

５． ４日に、細胞に対して細胞を再懸濁し、計数する。

６． 得られた細胞数にしたがって細胞を分割する
６．１ ５×１０^６細胞／Ｇ‐Ｒｅｘ（商標）１０
６．２ ５×１０^７／Ｇ‐Ｒｅｘ（商標）１００。

７． ３〜４日後、細胞を収集し、計数する。
７．１ ステップ４においてと同様にさらに増殖させる
７．２ あるいは低温保存する

８． 低温保存
８．１ 細胞を遠心分離し、上清を吸引する
８．２ ペレットを軽打し、再懸濁させ、氷に１０〜３０分間移す。
８．３ １ｍＬの氷冷低温保存培地（１０％ＤＭＳＯ、５０％ヒトＡＢ血清、４０％ＲＰＭＩ１６４０）あたり５×１０^６〜１０×１０^６細胞で再懸濁させる
８．４ 低温容器（低温バッグまたは低温バイアル）に移す
８．５ 冷凍容器中、１分あたり約−１℃で少なくとも９０分間凍結させ、次いで液体窒素に移す

９ 抗原提示細胞で使用する前に、Ｔ細胞はステップ３においてと同様のＣＤ３／２８抗体でコーティングされたプレート上で２〜４日間再刺激して、共刺激分子を上方制御しなければならない。
９．１ このステップはＴ細胞が静止表現型を有するかのように、それらはＴ調節細胞を誘導し得るので重要である。

プロトコル４：本発明の好ましい実施形態を使用する自己抗原特異的Ｔ細胞の増殖

１． ＰＢＭＣを、ＩＬ−４およびＩＬ−７を含有するＴ細胞培地１ｍＬあたり２×１０^６で再懸濁させる。
Ｔ細胞培地は、１０％ヒトＡＢ血清、４５％アドバンストＲＰＭＩ、４５％ＥＨＡＡおよび２００ｍＭのＬ−グルタミンである。ＩＬ−４を２０ｎｇ／ｍＬ（１０ｎｇ／ｍｌの最終希釈度）で、ＩＬ７を３３３２単位／ｍＬ（１６６６Ｕ／ｍｌの最終希釈度）で添加する。

２． ペプチドでコーティングされた樹状細胞を１×１０^５〜２×１０^５／ｍｌで再懸濁させる。

３． ＰＢＭＣおよびＤＣを１：１比で混合する。

４． Ｇ‐Ｒｅｘ（商標）−１０あたり２０ｍｌ（２０×１０^６ＰＢＭＣ）を移し、ＩＬ−４（１６６６単位／ｍＬ）およびＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有するさらなる培地１０ｍＬを添加する。インキュベーターに７日間移す。

５． 第７日に２０ｍｌの培地を除去する。
細胞を再懸濁させ、計数する。
５０×１０^６細胞より多い場合、２つのＧ‐Ｒｅｘ（商標）−１０で分ける。５０×１０^６未満の場合、１つのＧ‐Ｒｅｘ（商標）−１０のままにする。
ＩＬ−４およびＩＬ−７を含有する培地を、各Ｇ‐Ｒｅｘ（商標）−１０中の３０ｍｌに添加する（ＩＬ−４の最終濃度は１６６６単位／ｍＬであり、ＩＬ−７の最終濃度は１０ｎｇ／ｍｌである）
インキュベーターに２〜３日以上移す。

６． 第９日または１０日に、ペプチドでコーティングされたＴ−ＡＰＣおよびａＫ５６２細胞で再刺激する。
レスポンダーＴ細胞をＧ‐Ｒｅｘ（商標）から収集し、計数する。
１×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁させる
インキュベーターに移す

６．１ ５：１のａＫ５６２−ＣＳ：Ｔ細胞比を提供するようにａＫ５６２−ＣＳ細胞を調製する
６．１．１ ａＫ５６２−ＣＳ細胞を１００ＧＹ（Ｇｒａｙｓ）で照射する
６．１．２ ５分間、４００Ｇで遠心分離する
６．１．３ 完全Ｔ細胞培地中に再懸濁させる
６．１．４ 計数し、必要なａＫ５６２−ＣＳ細胞の数を推定する
６．１．４．１ レスポンダーＴ細胞の数×５

６．２ ペプチドでパルスされ、照射され、活性化された自己Ｔ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）を調製する
６．２．１ 自己Ｔ細胞（ＡＴＣ）を使用の２〜４日前にＣＤ３／２８で刺激または再刺激しておかなければならない。
６．２．２ 刺激のために充分な数のＡＴＣ＋プロセッシング中の損失を考慮した約３０％を収集する
６．２．３ 細胞を４００Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引する
６．２．４ 指で軽打することによって細胞ペレットをほぐす
６．２．５ １０×１０^６ＡＴＣあたり１０ｎｇの各ペプチドを添加する
６．２．６ 空気中５％ＣＯ_２中、３７℃で３０〜９０分間インキュベートする
６．２．７ 約２０ｍＬの培地中に再懸濁させる
６．２．８ ３０ＧＹで照射する
６．２．９ ４００Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引する
６．２．１０ １０^６細胞／ｍＬで再懸濁させる

６．３． １×１０^７のレスポンダーＴ細胞をＧ‐Ｒｅｘ（商標）−１００あたり１×１０^７Ｔ−ＡＰＣおよび５×１０^７の照射されたａＫ５６２−ＣＳ細胞と組み合わせる。
６．３．１． 培地を添加して４００ｍＬにする
６．３．２． １０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７（２ｍｇ）および６．６×１０^５単位のＩＬ−４を添加する
６．３．３． インキュベーターに３〜４日移す

７． ＩＬ−２（５０〜１００単位／ｍＬ）またはＩＬ−１５ １０ｎｇ／ｍＬを添加する
７．１． 培養物に３〜４日間戻す
７．２． サイトカインを３〜４日ごとに添加する

８． 第７日からグルコースを測定する
８．１ １滴の培地を除去し、標準的携帯型グルコメーターで試験する
８．２ １００未満のグルコースレベルは、培地／サイトカインの変化を誘発するはずである。
８．３． レスポンダーＴ細胞は、充分な数が得られた場合は凍結保存しなければならない

９．不十分な細胞が得られる場合には、３回目の刺激（ステップ７、８および９）を実施することができる

実施例１：健常なドナーならびに鼻咽頭がん患者およびリンパ腫患者のＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２特異的Ｔ細胞の生成
副実験：リンパ腫患者１のＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２特異的Ｔ細胞の生成

Ｄ１ ＯＫＴ３／ＣＤ２８プレートをコーティングする
それぞれ５ｕｇのＯＫＴ３およびＣＤ２８抗体を５ｍＬの滅菌水に添加することによってＯＫＴ３およびＣＤ２８抗体を調製した。０．５ｍＬのこの混合物を非組織培養処理２４ウェルプレート（２４−ｗ−ｐ）の各ウェルに添加した。４℃で一晩インキュベートした。注：これは培養第（−）８日である。

Ｄ２ 非接着性ＰＢＭＣ集団からのＯＫＴ３芽細胞の付着および生成による凍結されたＰＢＭＣからの樹状細胞の生成−培養第（−）７日
ＧＭＰバンクから取得したリンパ腫患者１の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）凍結ストックおよびＰＩ（Ｃａｔｈ Ｂｏｌｌａｒｄ）の許可を得た追跡試料：４つのバイアルのＰＢＭＣは、すべて２０１０年２月〜３月で凍結し、バイアルごとに５００万、合計２０００万であった。ＰＢＭＣを４０ｍＬの温ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地の２つのバイアル中で解凍し、沈降させた。患者１のＰＢＭＣ数：２２５０万
患者１のＰＢＭＣを沈降させ、合計６ｍＬの温ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地中に再懸濁させ、次いでＰＢＭＣを２４−ｗ−ｐの３つのウェルに２ｍＬ／ウェルで蒔いた。３時間後、非接着性部分を無菌ＰＢＳで２回穏やかに洗浄し、培地をＩＬ４およびＧＭ−ＣＳＦを含むＣｅｌｌＧｅｎｉｘと置換した。３７℃でインキュベートした。非接着性部分を使用して、ＯＫＴ３芽細胞を生成させた。

ＯＫＴ３芽細胞生成：
前日にＯＫＴ３およびＣＤ２８でコーティングし、４℃で保管したプレートをウェルごとに０．５ｍＬのＴ細胞培地で１回洗浄した。ＰＢＭＣの非接着性部分を約１０ウェル中に蒔いた。３７℃でインキュベートした。

Ｄ３ ウェル中の培地の半分を、１００単位のＩＬ２／ｍＬを含むＣＴＬ培地と置換して５０単位／ｍＬの最終培養濃度にすることによって、ＯＫＴ３芽細胞にＩＬ２を供給した。

Ｄ４ ウェルあたり１ｍＬの培地を、ＩＬ４およびＧＭＰ−ＣＳＦを含む新鮮培地と置換することによって、ＤＣにＩＬ４およびＧＭＰ−ＣＳＦを供給した。
ＯＫＴ３芽細胞を新規組織培養処理２４−ｗ−ｐ中に移した。３７℃でインキュベートした。

Ｄ７ 掻き取ることで細胞を収集することによって、１ウェルの各患者ＤＣをＡｄ−ＬＭＰ１−ＬＭＰ２で形質導入し、計数し、沈降させ、次いでＡｄ−ＬＭＰ１−ＬＭＰ２を５０００のＭＯＩで添加した。
患者１：５０万のＤＣ、したがって０．５ｕｌのウイルスを５×１０＾１２ｖｐ／ｍＬ濃度で添加した。
３７^＊Ｃで１．５時間インキュベートしながら約１５分ごとに試験管を軽打した。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ４、ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、ＴＮＦａ、およびＰＧＥ２を含有する培地中に細胞を戻して再懸濁させ、２ｍＬの培地を有する２４−２−ｐのそれぞれの１つのウェル中に戻して蒔いた。
アデノウイルスベクターを含まない条件に関して、培地の半分を取り出し、次いで２ｘのＧＭＰ−ＣＳＦ、ＩＬ４、ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、ＴＮＦａおよびＰＧＥ２を含むＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地をウェルに戻して添加した。３７℃でインキュベートした。
培地を置換するかまたは細胞を追加のウェルに分割することによってＯＫＴ３芽細胞の供給を続けた。

Ｄ９ Ｄ０１回目の刺激のセットアップ。
樹状細胞を収集し、計数した：
患者１：非形質導入ＤＣ：２０万；形質導入ＤＣ：５万
刺激されるＧＭＰからの患者１のＰＢＭＣの凍結バイアル（２００９年に凍結した細胞）を取り出し、次いで３０％ＦＢＳを含む温ＣＴＬ培地を用いて細胞を解凍した：
患者１：バイアルあたり１０００万の凍結ＰＢＭＣ１つのバイアル、８００万を回収した。
ＤＣおよび全ＰＢＭＣをｐｅｐｍｉｘでパルスする：
・１ｕｌのストックｐｅｐｍｉｘ溶液（ＤＭＳＯ中）をそれぞれ２００ｕｌの無菌ＰＢＳ中に添加することによってＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２ｐｅｐｍｉｘを希釈した。
・両ドナー由来の全ての非形質導入ＤＣを沈降させ、約５０ｕｌの培地を除く全てを吸引した。チューブを軽打することによってペレットをほぐした。約１０ｕｌの希釈されたｐｅｐｍｉｘをペレットに添加し、時折軽打しながら３７^＊Ｃで３０分間インキュベートした。
・ドナー１由来の３００万のＰＢＭＣをそれぞれ新しい清浄なチューブに採取し、沈降させ、そして約５０ｕｌの培地を除く全てを吸引した。約３ｕｌの希釈されたｐｅｐｍｉｘをペレット中に添加した。時折軽打しながら３７^＊Ｃで３０分間インキュベートした。
患者１のＴ細胞培養第０日のセットアップ：
現行のＧＭＰ条件：インキュベーション後、ＤＣを沈降させ、０．５ｍＬの培地中に再懸濁させた；１００万のＰＢＭＣを取り出し、沈降させ、そして０．５ｍＬの完全ＣＴＬ培地中に再懸濁させた（２００万／ｍＬ）。両者を４８−ｗ−ｐのウェルに添加した。５ｕｇのＩＬ１５を添加して、５ｎｇ／ｍＬの最終濃度にした。この条件のＤＣ：ＰＢＭＣ比は１：２０であった。３７℃でインキュベートした。
条件ＤＣ（ｐｘ）：ｐｅｐｍｉｘでパルスしたＤＣを２０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。２ｍＬの完全ＴＬ培地で再懸濁させ、２４−ｗ−ｐのウェルあたり１ｍＬを蒔いた。４００万のＰＢＭＣを取り出し、沈降させ、２００万／ｍＬで再懸濁させた。ＩＬ４およびＩＬ７を２×濃度（２０ｎｇ／ｍＬ）でＰＢＭＣに添加した。１ｍＬをすでにＤＣを含んでいた各ウェル中に添加して、ＩＬ４およびＩＬ７の最終濃度を１０ｎｇ／ｍＬに低下させた。この条件のＤＣ：ＰＢＭＣ比は１：２０であった。３７℃でインキュベートした。
条件Ｐｘ：ＰＢＭＣペレットを２ｍＬの完全ＣＴＬ培地中に再懸濁させ、ＩＬ４およびＩＬ７を１０ｎｇ／ｍＬで添加し、２４−ｗ−ｐの１つのウェルに蒔いた。３７℃でインキュベートした。

Ｄ１０ 患者１のＯＫＴ３芽細胞を増殖させて２つの満杯２４−ｗ−ｐを得た。数：６５００万。４つのバイアル中で凍結させ、各バイアルは約１５００万細胞であった。

Ｄ１５ ＯＫＴ３／ＣＤ２８プレートをコーティングする
それぞれ５ｕｇのＯＫＴ３およびＣＤ２８抗体を５ｍＬの滅菌水に添加することによってＯＫＴ３およびＣＤ２８抗体を調製した。０．５ｍＬのこの混合物を非組織培養処理２４ウェルプレート（２４−ｗ−ｐ）の各ウェル中に添加した。４℃で一晩インキュベートした。

Ｄ１６ ＬＣＬをＡｄ−ＬＭＰ１−ＬＭＰ２で形質導入した
ドナー１培養物由来の約３００万のＬＣＬを採取し、沈降させ、次いで５０００のＭＯＩのために３ｕｌのウイルスを５ｘ１０＾１２ｖｐ／ｍＬの濃度で添加した。３７^＊Ｃで１．５時間インキュベートして、合間にチューブを軽打した。インキュベーション後、細胞を約５ｍＬの完全ＲＰＭＩ中に再懸濁させた。３７℃でインキュベートした。
活性化されたＯＫＴ３芽細胞：
バイアルあたり１０００万のドナー１由来のＯＫＴ３芽細胞のそれぞれのバイアルを、３０％ＦＢＳを含む温ＣＴＬ培地中で解凍した。細胞を沈降させ、２０ｍＬのＣＴＬ培地中に再懸濁させた。ＣＴＬ培地でコーティングされたＯＫＴ３およびＣＤ２８のプレートを洗浄し、次いで２４−ｗ−ｐの１０個のウェル中に細胞を蒔いた。３７℃でインキュベートした。

Ｄ１８ 培養第１０日
収集し、患者１由来の第１０日Ｔ細胞を計数した：
条件ＧＭＰ：２１３万
条件ＤＣ（ｐｘ）：２４０万
条件Ｐｘ：３０４万
患者１ＯＫＴ３芽細胞を収集し、３０Ｇｙで照射した。数：１３４０万
ａＫ５６２ｃｓを収集し、１００Ｇｙで照射した。数：４４０万。洗浄し、沈降させ、そして１１ｍＬ中に再懸濁させて、４０万／ｍＬの細胞濃度にした。
患者１の形質導入ＬＣＬを収集し、４０Ｇｙで照射した。数：５７０万
我々はリンパ球サブタイプについてＥＬＩＳｐｏｔまたは表現型決定によって抗原特異性を試験するために充分な細胞を有していなかったので、我々はこれらの培養物を刺激しただけであった。

２回目の刺激：
ＯＫＴ３芽細胞をｐｅｐｍｉｘでパルスする：
・１ｕｌのストックｐｅｐｍｉｘ溶液（ＤＭＳＯ中）をそれぞれ２００ｕｌの無菌ＰＢＳ中に添加することによってＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２ｐｅｐｍｉｘを希釈した
・ＯＫＴ３芽細胞を沈降させ、約５０ｕｌの培地を除く全てを吸引した。チューブを軽打することによってペレットをほぐした。約２０ｕｌの希釈されたｐｅｐｍｉｘをペレットに添加し、時折軽打しながら３７^＊Ｃで３０分間インキュベートした。２０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、沈降させた。
・１００万／ｍＬの濃度でＯＫＴ３芽細胞を再懸濁させた

条件ＧＭＰ：
ＬＣＬを沈降させ、１４．２５ｍＬのＣＴＬ培地中に再懸濁させて、４０万／ｍＬの濃度にした。２４−ｗ−ｐの４つのウェル中に０．５ｍＬまたは２０万のＬＣＬを蒔いた。
ＧＭＰ条件のＤ９Ｔ細胞を沈降させ、４ｍＬ中に再懸濁させて１ウェルあたり約６０万のＴ細胞にし、ＬＣＬを含む４つのウェルのそれぞれに１ｍＬを添加した。Ｔ細胞：ＬＣＬ比は約３：１であった。３７℃でインキュベートした。
条件ＤＣ（ｐｘ）：
ＤＣ（ｐｘ）第９日Ｔ細胞を沈降させ、２０ｎｇ／ｍＬの２×ＩＬ４およびＩＬ７濃度を有する４ｍＬのＴ細胞培地中に再懸濁させた。２４−ｗ−ｐのウェルあたり１ｍＬを蒔いた。ｐｅｐｍｉｘでパルスしたＯＫＴ３芽細胞０．５ｍＬを添加し、次いで０．５ｍＬのａＫ５６２ｃｓをウェルのそれぞれに添加して、２ｍＬ／ウェルの最終体積にし、１：１：１のＴ細胞：ＯＫＴ３芽細胞：ａＫ５６２ｃｓ比であった（利用可能な全ａＫ５６２ｃｓが低いためにａＫ５６２ｃｓ比が低い）。３７℃でインキュベートした。

条件Ｐｘ：
Ｐｘ第９日Ｔ細胞を沈降させ、２０ｎｇ／ｍＬの２×ＩＬ４およびＩＬ７濃度を有する６ｍＬのＴ細胞培地中に再懸濁させた。２４−ｗ−ｐのウェルあたり１ｍＬを蒔いた。ｐｅｐｍｉｘでパルスしたＯＫＴ３芽細胞０．５ｍＬを添加し、次いで０．５ｍＬのａＫ５６２ｃｓをウェルのそれぞれに添加して、２ｍＬ／ウェルの最終体積にし、１：１：１のＴ細胞：ＯＫＴ３芽細胞：ａＫ５６２ｃｓ比であった（利用可能な全ａＫ５６２ｃｓが低いためにａＫ５６２ｃｓの比が低い）。３７℃でインキュベートした。

Ｄ２１ 各ウェル中の１ｍＬの培地を１ｍＬあたり１００単位のＩＬ２を含む１ｍＬの培地と置換することによってＩＬ２を培養第１４日に添加して、最終ＩＬ２濃度を５０単位／ｍＬにした。

Ｄ２２ ＯＫＴ３／ＣＤ２８プレートをコーティングする
それぞれ５ｕｇのＯＫＴ３およびＣＤ２８抗体を５ｍＬの滅菌水に添加することによってＯＫＴ３およびＣＤ２８抗体を調製した。０．５ｍＬのこの混合物を非組織培養処理２４ウェルプレート（２４−ｗ−ｐ）の各ウェル中に添加した。４℃で一晩インキュベートした。

Ｄ２３ ２０００万の細胞を含む凍結したバイアルを解凍することによって、患者１のＯＫＴ３芽細胞を活性化し、次いでそれらをＯＫＴ３／ＣＤ２８でコーティングされたプレート上に蒔いた。
２００万のＬＣＬを沈降させることによって患者１のＬＣＬを形質導入し、約５０ｕｌの培地が残り、次いで５０００のＭＯＩになるように２ｕｌのＡｄ−ＬＭＰ１−ＬＭＰ２を５ｘ１０＾１２ｖｐ／ｍＬで添加した。チューブを約１５分ごとに軽打し、１．５時間後に５ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。

Ｄ２４ 培養第１６日：培地を、サイトカインを含まない新鮮培地と交換した。３７℃でインキュベートした。
Ｄ１７にＥＬＩＳｐｏｔアッセイのためにプレートをコーティングした：
・９６−ｗのイモビロン−Ｐ膜プレートを１ウェルあたり５０ｕｌの３５％ＥｔＯＨで前もって湿らせた。ＰＢＳで洗浄した。
１００ｕｇの精製マウス抗ヒトＩＦＮγ１−Ｄ１Ｋ抗体を１０ｍＬのコーティング緩衝液に添加することによってＩＦＮγ溶液を作成した。１００ｕｌ／ウェルを添加して、プレートをコーティングした。４℃で一晩保管した。

Ｄ２５ 培養第１７日
患者１の第１７日Ｔ細胞を収集し、計数した：
条件ＧＭＰ：８２０万
条件ＤＣ（ｐｘ）：５５０万
条件Ｐｘ：１５６０万
収集し、３０Ｇｙで照射し、計数したＯＫＴ３芽細胞：１３６０万
収集し、４０Ｇｙで照射し、計数した患者１のＬＣＬ：１２０万
収集し、１００Ｇｙで照射し、計数したａＫ５６２ｃｓ：２２５０万。
ＩＦＮγ放出を検出するためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイのセットアップ：
・９６−ｗ−プレート（前日からのＩＦＮγ一次抗体でコーティングされた膜を有する）をＴ細胞培地で１時間３７℃にて遮断した。
・レスポンダー細胞を調製した：約１５０万のＴ細胞をＧＭＰ条件から、８０万をＤＣ（ｐｘ）条件から、そして８０万をＰｘ条件から採取し、沈降させ、そして５０万／ｍＬで再懸濁させた。
・４ｕｌのＤＭＳＯ中ｐｅｐｍｉｘストック（０．２ｕｇ／ｕｌ）を、以下の抗原：ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２の８００ｕｌのＴ細胞培地中に添加することによってｐｅｐｍｉｘ溶液を調製し、そして１．５ｕｌのＤＭＳＯ中ｐｅｐｍｉｘストックを３００ｕｌの以下の抗原のＴ細胞培地に添加した：ＥＢＮＡ３ａ、ＥＢＮＡ３ｂ、ＥＢＮＡ３ｃ、Ｂｚｌｆ１、ＮＹ−ＥＳＯ１（負の対照の無関係な抗原）、黄色ブドウ球菌超抗原（正の対照）。約１００万の細胞を採取することによって患者１ＬＣＬを調製し、沈降させ、１００万／ｍＬ中に再懸濁させた。これらの抗原および標的をレスポンダーＴ細胞に次のとおり添加し、各欄は２つのウェルを表す（重複試験）：
・１００ｕｌまたは５０，０００細胞を各ウェル、ＧＭＰは２４ウェル、ＤＣ（ｐｘ）およびＰｘはそれぞれ１２ウェルで添加した。
・一晩３７℃でインキュベートした。

任意のステップ
３回目の刺激：
ＯＫＴ３芽細胞をｐｅｐｍｉｘでパルスする：
・１ｕｌのストックｐｅｐｍｉｘ溶液（ＤＭＳＯ中）をそれぞれ２００ｕｌの無菌ＰＢＳ中に添加することによってＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２ｐｅｐｍｉｘを希釈した。
・ＯＫＴ３芽細胞を沈降させ、約５０ｕｌの培地以外全てを吸引した。チューブを軽打することによってペレットをほぐした。約２０ｕｌの希釈されたｐｅｐｍｉｘをペレットに添加し、ときおり軽打しながら、３７^＊Ｃで３０分間インキュベートした。２０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、沈降させた。
・ＯＫＴ３芽細胞を１００万／ｍＬの濃度で再懸濁させ、次いで４０万／ｍＬにさらに希釈した。
条件ＧＭＰ：
照射されたＬＣＬを沈降させ、１２万／ｍＬの濃度にするために１０ｍＬのＣＴＬ培地中に再懸濁させた。２４−ｗ−ｐの６ウェル中にそれぞれ１０万または１ｍＬを蒔いた。
ＧＭＰ条件について３００万のＤ１７Ｔ細胞を沈降させ、６ｍＬ中に再懸濁させ、ＬＣＬを含む６つのウェルのそれぞれに１ｍＬを添加した。Ｔ細胞：ＬＣＬ比は約４：１であった。３７℃でインキュベートした。Ｔ細胞の残りを凍結させた。
条件ＤＣ（ｐｘ）：
２００万のＤＣ（ｐｘ）第１７日Ｔ細胞を沈降させ、２０ｎｇ／ｍＬの２×ＩＬ４およびＩＬ７濃度を有する１０ｍＬのＴ細胞培地中に再懸濁させた。２４−ｗ−ｐのウェルあたり１ｍＬで蒔いた。ｐｅｐｍｉｘでパルスしたＯＫＴ３芽細胞０．５ｍＬを添加し、次いで０．５ｍＬのａＫ５６２ｃｓをウェルのそれぞれに添加して、２ｍＬ／ウェルの最終体積にし、Ｔ細胞：ＯＫＴ３芽細胞：ａＫ５６２ｃｓ比は２：２：５であった。３７℃でインキュベートした。（２回目の刺激後の成長は大きくなかったので、Ｔ細胞およびＯＫＴ３芽細胞濃度を増加させた）。Ｔ細胞の残りを凍結させた。
条件Ｐｘ：
２００万のＰｘ第１７日Ｔ細胞を沈降させ、２０ｎｇ／ｍＬの２×ＩＬ４およびＩＬ７濃度を含む１０ｍＬのＴ細胞培地中に再懸濁させた。２４−ｗ−ｐのウェルあたり１ｍＬを蒔いた。ｐｅｐｍｉｘでパルスしたＯＫＴ３芽細胞０．５ｍＬを添加し、次いで０．５ｍＬのａＫ５６２ｃｓをウェルのそれぞれに添加して、２ｍＬ／ウェルの最終体積にし、２：２：５のＴ細胞：ＯＫＴ３芽細胞：ａＫ５６２ｃｓ比であった。３７℃でインキュベートした。（ＤＣ（ｐｘ）条件と適合させるためにＴ細胞およびＯＫＴ３芽細胞濃度を増加させた）。Ｔ細胞の残りを凍結させた。

Ｄ２９ ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγプレートを成長させた。
１０ｕｌの抗体を１０ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡに添加することによって二次ＩＦＮγ抗体（７Ｂ６−１ビオチン）を調製し、次いで０．２ｕｌフィルターを通して濾過して、接合抗体の塊を除去して、非特異的結合を防止した。プレートを６回、それぞれウェルあたり１００ｕｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄した。１００ｕｌのこの二次抗体溶液を各ウェルに添加した。３７℃で２時間インキュベートした。
１．５時間後、１０ｍＬのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ中アビジン−ペルオキシダーゼ複合体溶液を調製し、混合し、室温でインキュベートした。２時間の終わりに、プレートを６回、それぞれウェルあたり１００ｕｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄した。１００ｕｌのアビジン−ペルオキシダーゼ複合体溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。
インキュベーションの最後に、まずＡＥＣ錠剤を２．５ｍＬのジメチルホルムアミド中に溶解させることによってＡＥＣ基質を調製し、次いで４７．５ｍＬの酢酸塩緩衝液（４．６ｍＬの０．１Ｎ酢酸、１１ｍＬの酢酸ナトリウム、４７ｍＬの水）を添加し、次に２５ｕｌの３０％過酸化水素を添加し、混合し、そして０．４５ｕｌフィルターで濾過した。プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、３回繰り返し、ＰＢＳで洗浄し、３回繰り返し、ＡＥＣ基質を添加し、そして４分まで成長させた。水ですすぐことによって反応を停止させた。裏面をはがし、膜を乾燥させた。結果を穿孔採取し、計数のために送った。

Ｄ３１ 各ウェル中の１ｍＬの培地を１ｍＬあたり１００単位のＩＬ２を含む１ｍＬの培地と置換することによって、ＩＬ２を培養物第２０日に添加し、最終ＩＬ２濃度を５０単位／ｍＬにした。

Ｄ３２ ＯＫＴ３／ＣＤ２８プレートをコーティングする
それぞれ５ｕｇのＯＫＴ３およびＣＤ２８抗体を５ｍＬの滅菌水に添加することによってＯＫＴ３およびＣＤ２８抗体を調製した。０．５ｍＬのこの混合物を非組織培養処理された２４ウェルプレート（２４−ｗ−ｐ）の各ウェルに添加した。４℃で一晩インキュベートした。

Ｄ３３ ＯＫＴ３／ＣＤ２８でコーティングされたプレート上に蒔かれた約１００万／ウェルの進行中の患者１ＯＫＴ３芽細胞培養により、患者１ＯＫＴ３芽細胞を活性化させた。
２００万のＬＣＬを沈降させて約５０ｕｌの培地を残し、次いで５０００のＭＯＩにするために２ｕｌのＡｄ−ＬＭＰ１−ＬＭＰ２を５×１０＾１２ｖｐ／ｍＬで添加することによって、患者１のＬＣＬを形質導入した。チューブを約１５分ごとに軽打し、１．５時間後に５ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。

Ｄ３４ 培養第２３日：培地を、サイトカインを含まない新鮮培地と置換し、約４００万細胞を超えるウェルを分割した。３７℃でインキュベートした。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのためにプレートをコーティングした：
・９６−ｗイモビロン−Ｐ膜プレートをウェルあたり５０ｕｌの３５％ＥｔＯＨで前もって湿らせた。ＰＢＳで洗浄した。
・１００ｕｇの精製されたマウス抗ヒトＩＦＮγ１−Ｄ１Ｋ抗体を１０ｍＬのコーティング緩衝液に添加することによってＩＦＮγ溶液を調製した。ウェルあたり１００ｕｌを添加して、プレートをコーティングした。４℃で一晩保存した。

Ｄ３５ 培養第２４日
患者１の第２４日のＴ細胞培養物を収集し、計数した：
条件ＧＭＰ：２２２０万
条件ＤＣ（ｐｘ）：３９８０万
条件Ｐｘ：１６２０万
収集し、３０Ｇｙで照射し、計数したＯＫＴ３芽細胞：９８０万
収集し、４０Ｇｙで照射し、計数した患者１のＬＣＬ：２３０万
収集し、１００Ｇｙで照射し、計数したａＫ５６２ｃｓ：２０００万
ＩＦＮγ放出を検出するためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイのセットアップ：
・コーティングされた９６−ｗ−プレートをＴ細胞培地で１時間３７℃にて遮断した。
・レスポンダー細胞を調製した：それぞれ約２５０万のＴ細胞をＧＭＰ条件、ＤＣ（ｐｘ）条件、およびＰｘ条件から取り出し、沈降させ、１００万／ｍＬで再懸濁させた。
・４ｕｌのＤＭＳＯ中ｐｅｐｍｉｘストック（０．２ｕｇ／ｕｌ）を、以下の抗原：ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２のＴ細胞培地８００ｕｌの中に添加し、そして１．５ｕｌのＤＭＳＯ中ｐｅｐｍｉｘストックを、以下の抗原：ＥＢＮＡ３ａ、ＥＢＮＡ３ｂ、ＥＢＮＡ３ｃ、Ｂｚｌｆ１、ＮＹ−ＥＳＯ１（負の対照のための無関係な抗原）、黄色ブドウ球菌超抗原（正の対照）のＴ細胞培地３００ｕｌに添加することによってｐｅｐｍｉｘ溶液を調製した。約１００万の細胞を取り出すことによって患者１ＬＣＬを調製し、沈降させ、１００万／ｍＬ中に再懸濁させた。これらの抗原および標的をレスポンダーＴ細胞に以下のとおり添加し、各欄は２つのウェル（重複試験）を表す：

・１００ｕｌまたは５０，０００細胞を各ウェル中に、ＧＭＰ２４ウェル、ＤＣ（ｐｘ）およびＰｘはそれぞれ１２ウェルで添加した。
・一晩３７℃でインキュベートした。

リンパ腫患者１Ｔ細胞および自己ＬＣＬの共培養のセットアップ
条件について、Ｔ細胞およびＬＣＬを２４−ｗ−ｐのウェルに以下の比になるように添加した：

５０ｕ／ｍＬの最終濃度になるようにＩＬ２を培養物に添加し、ホールピペットで穏やかに混合した。２００ｕｌの各培養物を採取することによって第０日を表現型決定し、３ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳで洗浄し、沈降させ、上清を吸引し、そしてそれぞれ５ｕｌの以下の抗体を添加した：ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ５６−ＦＩＴＣ、およびＣＤ３−ＰｅｒＣＰ。４℃で１時間インキュベートした。３ｍＬのＰＢＳで洗浄し、沈降させ、上清を吸引し、そしてチューブあたり２５０ｕｌのｃｙｔｏｆｉｘおよび５０ｕｌのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを添加した。フローサイトメーターで分析した。

４回目の刺激：
ｐｅｐｍｉｘでＯＫＴ３芽細胞をパルスする：
・１ｕｌのストックｐｅｐｍｉｘ溶液（ＤＭＳＯ中）をそれぞれ２００ｕｌの無菌ＰＢＳ中に添加することによってＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２ｐｅｐｍｉｘを希釈した。
・ＯＫＴ３芽細胞を沈降させ、約５０ｕｌの培地を除くすべてを吸引した。チューブを軽打することによってペレットをほぐした。約２０ｕｌの希釈されたｐｅｐｍｉｘをペレットに添加し、時折軽打しながら、３７℃で３０分間インキュベートした。２０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、沈降させた。
・ＯＫＴ３芽細胞を１００万／ｍＬの濃度で再懸濁させ、次いで４０万／ｍＬにさらに希釈した。
・ａＫ５６２ｃｓを２００万／ｍＬで再懸濁させた。

条件ＧＭＰ：
照射したＬＣＬを沈降させ、１２万／ｍＬの濃度になるように１８．４ｍＬのＣＴＬ培地中に再懸濁させた。それぞれ１２万または１ｍＬを２４−ｗ−ｐの１０ウェルに蒔いた。ＧＭＰ条件の５００万のＤ２４Ｔ細胞を沈降させ、１０ｍＬ中に再懸濁させ、そしてＬＣＬを含む１０ウェルのそれぞれに対して１ｍＬを添加した。Ｔ細胞：ＬＣＬ比は約４：１であった。３７℃でインキュベートした。Ｔ細胞の残りを凍結した。

条件ＤＣ（ｐｘ）：
２００万のＤＣ（ｐｘ）第２４日Ｔ細胞を沈降させ、２０ｎｇ／ｍＬの２×ＩＬ４およびＩＬ７濃度を有する１０ｍＬのＴ細胞培地中に再懸濁させた。２４−ｗ−ｐのウェルあたり１ｍＬを蒔いた。ｐｅｐｍｉｘでパルスしたＯＫＴ３芽細胞０．５ｍＬを添加し、次いで０．５ｍＬのａＫ５６２ｃｓを２００万／ｍＬでウェルのそれぞれに添加して、２ｍＬ／ウェルの最終体積にし、１：１：５のＴ細胞：ＯＫＴ３芽細胞：ａＫ５６２ｃｓ比であった。３７℃でインキュベートした。Ｔ細胞の残りを凍結した。

条件Ｐｘ：
２００万のＰｘ第２４日Ｔ細胞を沈降させ、２０ｎｇ／ｍＬの２×ＩＬ４およびＩＬ７濃度を有するＴ細胞培地１０ｍＬ中に再懸濁させた。２４−ｗ−ｐのウェルあたり１ｍＬを蒔いた。ｐｅｐｍｉｘでパルスしたＯＫＴ３芽細胞０．５ｍＬを添加し、次いで０．５ｍＬのａＫ５６２ｃｓをウェルのそれぞれに添加して、ウェルあたり２ｍＬの最終体積にし、Ｔ細胞：ＯＫＴ３芽細胞：ａＫ５６２ｃｓ比は１：１：５であった。３７℃でインキュベートした。Ｔ細胞の残りを凍結させた。

Ｄ３６ ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγプレートを成長させた。
１０ｕｌの抗体を１０ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡに添加することによって二次ＩＦＮγ抗体（７Ｂ６−１ビオチン）を調製し、次いで０．２ｕｌフィルターを通して濾過して、接合抗体の塊を除去して、非特異的結合を防止した。プレートを６回、それぞれウェルあたり１００ｕｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄した。１００ｕｌのこの二次抗体溶液を各ウェルに添加した。３７℃で２時間インキュベートした。
１．５時間後、１０ｍＬのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ中アビジン−ペルオキシダーゼ複合体溶液を調製し、混合し、室温でインキュベートした。２時間の終わりに、プレートを６回、それぞれウェルあたり１００ｕｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄した。１００ｕｌのアビジン−ペルオキシダーゼ複合体溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。
インキュベーションの最後に、まずＡＥＣ錠剤を２．５ｍＬのジメチルホルムアミド中に溶解させることによってＡＥＣ基質を調製し、次いで４７．５ｍＬの酢酸塩緩衝液（４．６ｍＬの０．１Ｎ酢酸、１１ｍＬの酢酸ナトリウム、４７ｍＬの水）を添加し、次に２５ｕｌの３０％過酸化水素を添加し、混合し、そして０．４５ｕｌフィルターで濾過した。プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、３回繰り返し、ＰＢＳで洗浄し、３回繰り返し、ＡＥＣ基質を添加し、そして最高４分まで成長させた。水ですすぐことによって反応を停止させた。裏面をはがし、膜を乾燥させた。結果を穿孔採取し、計数のために送った。
共培養第２日の表現型決定
・１ｍＬの培地を、１００単位のＩＬ２を含む１ｍＬの新鮮なＴ細胞培地と置換した。
・２００ｕｌの各条件を採取することによって第２日に表現型決定し、３ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳで洗浄し、沈降させ、上清を吸引し、そしてそれぞれ５ｕｌの以下の抗体を添加した：ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ５６−ＦＩＴＣ、およびＣＤ３−ＰｅｒＣＰ。４℃で１時間インキュベートした。３ｍＬのＰＢＳで洗浄し、沈降させ、上清を吸引し、そして試験管あたり２５０ｕｌのｃｙｔｏｆｉｘおよび５０ｕｌのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを添加した。フローサイトメーターで分析した。

Ｄ３８ 共培養第４日の表現型決定
２００ｕｌの各条件を採取し、３ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳで洗浄し、沈降させ、上清を吸引し、それぞれ１０ｕｌの以下の抗体を添加した：ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ５６−ＦＩＴＣ、およびＣＤ３−ＰｅｒＣＰ（増加した細胞数と適合させるために抗体量を増加させた）。４℃にて１時間インキュベートした。３ｍＬのＰＢＳで洗浄し、沈降させ、上清を吸引し、チューブあたり２５０ｕｌのｃｙｔｏｆｉｘおよび５０ｕｌのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを添加した。フローサイトメーターで分析した。
各ウェル中の１ｍＬの培地を、１ｍＬあたり１００単位のＩＬ２を含む１ｍＬの培地と置換することによって第２０日培養物にＩＬ２を添加して、最終ＩＬ−２濃度を５０単位／ｍＬにした。コンフルエントなウェルを分割した。

Ｄ３９ 共培養第５日の表現型決定
２００ｕｌの各条件を採取し、３ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳで洗浄し、沈降させ、上清を吸引し、そしてそれぞれ１０ｕｌの以下の抗体を添加した：ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ５６−ＦＩＴＣ、およびＣＤ３−ＰｅｒＣＰ。４℃で１時間インキュベートした。３ｍＬのＰＢＳで洗浄し、沈降させ、上清を吸引し、そしてチューブごとに２５０ｕｌのｃｙｔｏｆｉｘおよび５０ｕｌのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを添加した。フローサイトメーターで分析した。

Ｄ４１ 培養第３０日：培地を、サイトカインを含まない新鮮培地と置換し、約４００万超の細胞であるウェルを分割した。３７℃でインキュベートした。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのためのプレートをコーティングした：
・９６−ｗイモビロン−Ｐ膜プレートを１ウェルあたり５０ｕｌの３５％ＥｔＯＨで前もって湿らせた。ＰＢＳで洗浄した。
・１００ｕｇの精製されたマウス抗ヒトＩＦＮγ１−Ｄ１Ｋ抗体を１０ｍＬのコーティング緩衝液に添加することによってＩＦＮγ溶液を調製した。１ウェルあたり１００ｕｌを添加して、プレートをコーティングした。４℃で一晩保存した。
Ｄ４２ 培養第３１日
患者１の第３１日Ｔ細胞培養物を収集し、計数した：
条件ＧＭＰ：１７２０万；条件ＤＣ（ｐｘ）：２０６０万；条件Ｐｘ：２６８０万

結果
表２：全培養増殖：現行の標準的プロトコル（ＧＭＰ）と比較して、ＫＡＴｐｘでセットアップされた培養は、４回目の刺激の最後までに、それ以上とは言わないまでも同程度に増殖した。

我々は新規抗原提示複合体であるＫＡＴｐｘを最適化し、これはリンパ腫患者においてＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２に対して同等以上に良好な増殖およびより高いＴ細胞抗原特異的度数をもたらした。これらの細胞は効率的に共培養中の腫瘍細胞を排除し、この殺滅はＨＬＡ特異的であった。さらに、このアプローチを使用して、我々はＬＣＬおよびアデノウイルスベクターの必要性を排除し、かくして世代時間を、ＬＣＬおよびアデノウイルスベクターによって発現されるバイスタンダー抗原について特異的なＴ細胞の活性化と同様に減少させる。

技術的に適切であるならば、本明細書中で記載される２以上の実施形態を組み合わせることができると考えられる。本明細書の文脈で、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されるべきである。ある要素を含む開示の態様はさらに、関連する要素「からなる」または関連する要素「から本質的になる」別の実施形態まで拡大されるものである。本明細書中で引用されるすべての参考文献は参照により特に援用される。

Claims (29)

1. 抗原特異的Ｔ細胞、たとえば自己抗原特異的Ｔ細胞のインビトロ増殖のためのプロセスであって：
   ａ）自己ＰＢＭＣ細胞の集団を：
   ｉ）標的抗原（複数可）に関連するペプチド／ペプチドミックスでパルスした樹状細胞または標的抗原（複数可）に関連するペプチド／ペプチドミックス、および
   ｉｉ）少なくとも１つのサイトカイン
   の存在下で培養するステップと、
   ｂ）ステップａ）からのＴ細胞の集団を：
   ｉ）標的抗原（複数可）に関連するペプチド／ペプチドミックスでパルスした樹状細胞または標的抗原（複数可）に関連するペプチド／ペプチドミックスでパルスした自己抗原提示Ｔ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）細胞および人工の共刺激因子、ならびに
   ｉｉ）場合によってサイトカイン
   の存在下で培養するステップとを含み、
   前記プロセスが、前記関連するＴ細胞集団の前記増殖において生ウイルスおよび／もしくはウイルスベクターまたはＤＮＡもしくはＲＮＡコード化抗原の使用を利用しないことを特徴とする、プロセス。
2. ステップｂ）を、充分な量の関連するＴ細胞集団が得られるまで、２回またはそれ以上（たとえば、３、４、５回またはそれ以上）実施する、請求項１記載のプロセス。
3. ステップａ）の前記培養を１２日以下実施する、請求項１または２記載のプロセス。
4. ステップｂ）の前記培養ステップを１２日以下実施する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
5. 培養を、ガス透過性培養表面を含む容器中で実施する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
6. 前記増殖させたＴ細胞がエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルス抗原（複数可）、たとえばＥＢＶに対して特異的である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
7. ステップａ）および／またはｂ）の前記ペプチドが、２〜１０００のペプチド、たとえば２〜５００のペプチド、２〜３００のペプチドまたは２〜１００のペプチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
8. ステップａ）および／またはｂ）の前記ペプチドが、たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上のアミノ酸で重複する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
9. ステップａ）および／またはｂ）の前記ペプチドが、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸の長さ、例えば１５アミノ酸の長さである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
10. パートａ）および／またはｂ）の前記ペプチドが前記抗原ＬＭＰ１の一部または全長を対象とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
11. パートａ）および／またはｂ）の前記ペプチドが前記抗原ＬＭＰ２の一部または全長を対象とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
12. パートａ）および／またはｂ）の前記ペプチドが前記抗原ＥＢＮＡ１の一部または全長を対象とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセス。
13. パートａ）および／またはｂ）の前記ペプチドが前記抗原ＢＡＲＦ１の一部または全長を対象とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
14. ステップａ）で存在する前記サイトカインがＩＬ−４である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
15. ステップａ）で存在する前記サイトカインがＩＬ−７である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
16. ステップｂ）で存在する前記サイトカインがＩＬ−１５である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
17. 人工の共刺激が、細胞表面上に存在する１つ以上の関連するタンパク質またはタンパク質フラグメントを有する操作された細胞系、たとえばａＫ５６２細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
18. タンパク質またはタンパク質フラグメントが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＯＸ−４０リガンドおよび４１ＢＢ−リガンドから独立して選択される、請求項１７記載のプロセス。
19. 前記タンパク質またはタンパク質フラグメントの全部が共刺激細胞の表面上に存在する、請求項１８記載のプロセス。
20. 前記プロセスがＧＲｅｘ（商標）システム中で実施される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
21. 請求項１〜２０のいずれか１項で定義されるプロセスから得ることができるかまたは得られる、増殖させた自己または同種Ｔ細胞産物。
22. １つ以上の標的細胞集団が、ウイルスベクターを用いて増殖させ、ある標的抗原を過剰発現するＥＢＶ−ＬＣＬで再刺激した細胞と比較して、相当する標的抗原特異性を有する、請求項２１記載の増殖させた自己または同種Ｔ細胞産物。
23. １つ以上の標的細胞集団が、ウイルスベクターを用いて増殖させ、ある標的抗原を過剰発現するＥＢＶ−ＬＣＬで再刺激した細胞よりも、所与の時点で高い標的抗原特異性を有する、請求項２１または２２記載の増殖させた自己または同種Ｔ細胞産物。
24. 請求項２１〜２３のいずれか１項で定義される増殖させたＴ細胞産物、および賦形剤、担体、安定剤、界面活性剤または他の非治療活性成分を含む医薬組成物。
25. 免疫抑制患者などの患者を、ウイルス感染またはウイルスにより誘発されるガンについて治療する方法であって、適切な用量の請求項２１〜２３のいずれか１項で定義される増殖させたＴ細胞産物または請求項２４で定義される医薬組成物を投与することによる、方法。
26. 人工の共刺激因子としてａＫ５６２細胞などの、その上で抗原が同時に提示されない、操作された細胞系の、自己Ｔ細胞などのＴ細胞の抗原特異的増殖における使用。
27. 抗原特異的Ｔ細胞の増殖のための抗原−ペプチド／ペプチドミックスでパルスした樹状細胞の使用。
28. 抗原特異的Ｔ細胞の増殖のため
    の抗原−ペプチド／ペプチドミックスでパルスしたＴ−ＡＰＣの使用。
29. 抗原特異的Ｔ細胞の増殖のための抗原−ペプチドミックスとＰＢＭＣの使用。